FI121159B - Menetelmä sirkkalehtisten männynalkioiden tuottamiseksi gibberelliiniä hyödyntämällä - Google Patents
Menetelmä sirkkalehtisten männynalkioiden tuottamiseksi gibberelliiniä hyödyntämällä Download PDFInfo
- Publication number
- FI121159B FI121159B FI20030819A FI20030819A FI121159B FI 121159 B FI121159 B FI 121159B FI 20030819 A FI20030819 A FI 20030819A FI 20030819 A FI20030819 A FI 20030819A FI 121159 B FI121159 B FI 121159B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- gibberellin
- pine
- medium
- tissue
- embryogenetic
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H7/00—Gymnosperms, e.g. conifers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Menetelmiä sirkkalehtisten männynalkioiden tuottamiseksi gib-berelliiniä hyödyntämällä
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee menetelmiä kasvialkioiden tuottami-5 seksi in vitro ja valinnaisesti kasvien tuottamista näistä kasvialkioista. Erityisesti keksintö koskee menetelmiä sirkkalehtisten männynalkioiden tuottamiseksi gibberelliiniä hyödyntämällä.
Keksinnön tausta Mäntypuiden tarve puutuotteiden valmistamiseksi jatkaa kasvuaan. 10 Eräs tähän ongelmaan ehdotettu ratkaisu on sellaisten yksittäisten puiden identifioiminen, joilla on haluttuja ominaisuuksia, kuten esimerkiksi nopea kasvuvauhti, ja lukuisten, geneettisesti identtisten kloonien tuottaminen näistä laadukkaammista puista somaattisella kloonauksella. Näitä klooneja voidaan viljellä puuston tai kokonaisten metsien tuottamiseksi mäntypuista, joilla on halut-15 tu ominaisuus (ominaisuuksia).
Eräs menetelmä mäntypuiden kloonaamiseksi hyödyntää eristettyjen, elävien mäntysolukoiden in vitro -käsittelyä olosuhteissa, jotka edistävät männyn alkioiden, ja sen jälkeen kokonaisten kasvien, muodostumista käsitellystä solukosta. Eristettyä mäntysolukkoa voidaan kasvattaa yhden tai use-20 ämmän auksiinin ja/tai sytokiniinin läsnäollessa embryogeenisen solukon kehittymisen ja moninkertaistumisen edistämiseksi sirkkalehtisten männyn alkioiden muodostamiseksi. Alkiot voidaan sitten idättää ja kasvattaa tuottamaan mäntypuita.
Jatkuvana ongelmana kuitenkin on stimuloida sellaisten sirkkalehtis-25 ten männyn alkioiden tehokasta muodostumista, jotka pystyvät itämään tuottaakseen mäntykasveja. Edullisesti sirkkalehtiset männyn alkiot in vitro -muodostettuina ovat fyysisesti ja fysiologisesti samankaltaisia, tai identtisiä, kuin tsygoottiset männyn alkiot, jotka ovat muodostuneet männyn siemenissä in vivo. Sen vuoksi on tarvetta menetelmille sirkkalehtisten männyn alkioiden tuot-30 tamiseksi männyn embryogeenisestä solukosta. Esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmiä, jotka tyydyttävät tämän tarpeen.
Keksinnön yhteenveto 2
Keksintö koskee menetelmää sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa (a) viljellään embryogeenistä männyn solukkoa kiinteä ylläpitoela-5 tusaineen päällä, joka ei sisällä gibberelliiniä, (b) vaiheen (a) mukaisesti käsiteltyä embryogeenistä männyn solukkoa viljellään nestemäisessä ylläpitoelatusaineessa, joka ei sisällä gibberelliiniä, (c) vaiheen (b) mukaisesti käsiteltyä embryogeenistä männyn soluk-10 koa viljellään nestemäisessä ylläpitoelatusaineessa, joka sisältää vähintään yhtä gibberelliiniä sillä edellytyksellä, että gibberelliiniä sisältävä nestemäinen ylläpitoelatusaine ei sisällä abskissihappoa; ja vaiheen (c) mukaisesti käsiteltyä embryogeenistä männyn solukkoa viljellään kiinteän kehityselatusaineen päällä, joka ei sisällä gibberilliiniä, 15 sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi.
Yhdeltä osaltaan esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmiä sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi. Keksinnön mukaisista menetelmistä jokainen sisältää vaiheen, jossa embryogeenistä männyn solukkoa viljellään vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä elatusaineessa tai sen päällä, sirkka-20 lehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi. Joissakin suoritusmuodoissa embryogeenistä solukkoa viljellään sellaisessa elatusaineessa tai sen päällä, joka ei sisällä vähintään yhtä gibberelliiniä, sen jälkeen kun tätä embryogeenistä solukkoa on viljelty vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä elatusaineessa, tai sen päällä. Elatusaine, joka ei sisällä gibberelliiniä, voi soveltua edistämään 25 sirkkalehtisten männyn alkioiden kehittymistä ja kypsymistä gibberelliinikäsitel-lystä embryogeenisestä männyn solukosta.
Joissakin suoritusmuodoissaan esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmiä sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi, näistä menetelmistä jokaisen sisältäessä seuraavat vaiheet: (a) männyn embryonaalisten suspenso-30 rimassojen viljely sellaisen kiinteän ylläpitoelatusaineen päällä, joka ei sisällä gibberelliiniä; (b) vaiheen (a) mukaisesti käsiteltyjen männyn embryonaalisten suspensorimassojen viljely nestemäisessä ylläpitoelatusaineessa, joka ei sisällä gibberelliiniä; (c) vaiheen (b) mukaisesti käsiteltyjen männyn embryonaalisten suspensorimassojen viljely nestemäisessä ylläpitoelatusaineessa, joka si-35 sältää vähintään yhtä gibberelliiniä; ja (d) vaiheen (c) mukaisesti käsiteltyjen männyn embryonaalisten suspensorimassojen viljely sellaisen kiinteän kehi- 3 tyselatusaineen päällä, joka ei sisällä gibberelliiniä, sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi.
Tämän keksinnön mukaisista menetelmistä jokainen tuottaa enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita kuin identtinen menetelmä, joka ei hyödyn-5 nä gibberelliiniä. Jotkut keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodot tuottavat vähintään 50 % enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita (kuten esimerkiksi vähintään 75 % enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita, tai esimerkiksi vähintään 100 % enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita) kuin identtinen sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamismenetelmä, joka ei hyödynnä gibbe-10 relliiniä.
Esillä olevan keksinnön menetelmät ovat käyttökelpoisia sellaisten sirkkalehtisten männyn alkioiden valmistamiseksi, joita voidaan edelleen karakterisoida, esimerkiksi geneettisillä tai biokemiallisilla välineillä, ja/tai voidaan idättää sellaisten pienten mäntykasvien tuottamiseksi, jotka voidaan kasvattaa 15 täysikasvuisiksi mäntypuiksi, mikäli niin halutaan. Siten esimerkiksi tämän keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan käyttää tuottamaan klooneja yksittäisistä mäntypuista, joilla on yksi tai useampi haluttu piirre, kuten nopea kasvuvauhti tai parempi puulaatu. Esimerkiksi keksinnön mukaisten sirkkalehtisten männyn alkioiden populaatiota voidaan käyttää tuottamaan puustoa tai metsää mänty-20 puista, joilla on yksi tai useampia haluttuja piirteitä, kuten nopea kasvuvauhti tai parempi puulaatu. Puita voidaan hyödyntää puutuotteiden valmistamiseksi.
Edullisen suoritusmuodon yksityiskohtainen kuvaus
Ellei tässä spesifisesti määritetä, kaikilla tässä käytetyillä termeillä on sama merkitys kuin niillä olisi esillä olevan keksinnön alan asiantuntijalle.
25 Kuten tässä on käytetty, termi ’’sirkkalehtinen alkio” tarkoittaa alkio ta, jolla on yksi tai useampi sirkkalehti.
Kuten tässä on käytetty, termi ’’embryogeeninen solukko” viittaa mihin tahansa Pinacea-heimon kasvista peräisin olevaan solukkoon, joka pystyy tuottamaan yhden tai useampia sirkkalehtisiä männyn alkioita, kun sitä käsitel-30 lään tämän keksinnön menetelmien mukaisesti. Siten termi "embryogeeninen solukko” pitää sisällään esimerkiksi männyn embryonaaliset suspensorimas-sat.
Ellei toisin ole mainittu, kaikki prosentteina ilmoitetut konsentraatio-arvot ovat painoprosentteja suhteessa tilavuuteen.
4
Yhdeltä osaltaan esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmiä sirkkaleh-tisten männyn alkioiden tuottamiseksi. Keksinnön mukaisista menetelmistä jokainen sisältää vaiheen, jossa embryogeenistä männyn solukkoa viljellään vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä elatusaineessa, tai sen päällä, sirkka-5 lehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi. Joissakin tämän keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa gibberelliinikäsiteltyä embryogeenistä männyn solukkoa viljellään sitten vähintään yhdessä muussa elatusaineessa, tai sen päällä, sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi. Tämän keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan käyttää sirkkalehtisten alkioiden tuottamiseksi 10 mistä tahansa Pinecea-heimon jäsenestä, kuten Pinus-suvun jäsenistä, esimerkiksi Loblolly-männystä (Pinus taeda).
Esimerkki esillä olevan keksinnön piirissä käyttökelpoisesta embryo-geenisestä solukosta on embryonaaliset suspensorimassat (ESM:t). ESM:t voidaan valmistaa sirkkalehtisistä alkioista, jotka on poistettu männyn siemenes-15 tä. Siemenet tyypillisesti pintasteriloidaan ennen näiden sirkkalehtisten alkioiden poistamista, joita sitten viljellään ESM:ien muodostumisen mahdollistavassa elatusaineessa, tai sen päällä, ESM:ien sisältäessä silmikoitumalla tai jakautumalla tapahtuvassa monistumisprosessissa olevia varhaisvaiheen alkioita. Elatusaine voi haluttaessa sisältää hormoneja, jotka stimuloivat varhaisvai-20 heen alkioiden monistumista. Esimerkkejä hormoneista, joita elatusaineeseen voidaan sisällyttää, ovat auksiinit (esim. 2,4-dikloorifenoksietikkahappo (2,4-D)) ja sytokiniinit (esim. 6-bentsyyliaminopuriini (BAP)). Auksiineja voidaan hyödyntää esimerkiksi konsentraatioina 1 mg/ - 200 mg/l. Sytokiniinejä voidaan hyödyntää konsentraatioina 1 mg/l -10 mg/l. Esimerkki elatusaineesta, joka on 25 käyttökelpoinen männyn sirkkalehtisten alkioiden viljelyssä ESM:ien muodostumisen indusoimiseksi, on elatusaine BM1, joka esitellään esimerkissä 1.
Tämän keksinnön mukaisten menetelmien toteutuksessa embryogeenistä männyn solukkoa viljellään vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä elatusaineessa, tai sen päällä, olosuhteissa, jotka tuottavat sirkkalehtisiä män-30 nyn alkioita. Gibberelliinit ovat alalla tunnettujen diterpenoidisten kasvihormonien luokka (ks. esim. Gibberellins and Plant Growth, by Krishnamoorthy, John Wiley & Sons (1975), joka julkaisu sisällytetään tähän viittauksella kokonaisuudessaan). Tyypillisiä esimerkkejä gibberelliineistä, jotka ovat hyödyllisiä esillä olevan keksinnön toteutuksessa, ovat gibberelliinihappo, gibberelliini 4 ja 35 gibberelliini 7, joista jokainen on esitelty esimerkiksi edellä mainitussa Krishna-moorthyn oppikirjassa. Esimerkki hyödyllisestä gibberelliiniseoksesta on gibbe- 5 rellini 4:n ja gibberelliini 7:n seos (jota kutsutaan gibberelliini 4/7:ksi), kuten esimerkiksi gibberelliini 4/7, jota myy Abbot Laboratories, Chicago, Illinois.
Gibberelliini(e)n konsentraatio elatusaineessa on riittävä indusoimaan sirkkalehtisten männyn alkioiden muodostumista. Joissakin tämän kek-5 sinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa gibberelliini(e)n konsentraatio elatusaineessa on välillä 0,5 mg/l - 500 mg/l. Joissakin tämän keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa gibbereliini(e)n konsentraatio elatusaineessa on välillä 5 mg/l - 50 mg/l. Niissä tämän keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa, joissa enemmän kuin yhtä gibberelliiniä on läs-10 nä elatusaineessa, edellä mainitut konsentraatiorajat viittaavat koko gibberel-liinikonsentraatioon elatusaineessa.
Joissakin tämän keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa embryogeenistä männyn solukkoa viljellään vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä elatusaineessa, tai sen päällä, 0,5 - 5 viikon ajan, kuten esi-15 merkiksi yhdestä viikosta kolmeen viikkoon tai esimerkiksi yhdestä viikosta kahteen viikkoon. Joissakin tämän keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa embryogeenistä männyn solukkoa viljellään vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä elatusaineessa, tai sen päällä, lämpötilassa 10-30 °C, kuten esimerkiksi 15-25 °C:ssa tai esimerkiksi 20 - 23 °C:ssa.
20 Elatusaine, joka sisältää vähintään yhtä gibberelliiniä, voi olla nes temäinen elatusaine tai kiinteä elatusaine. Nestemäistä elatusainetta hyödynnettäessä embryogeeninen solukko voi olla täysin uponneena elatusainee-seen, jota voidaan ravistella sinä aikana, kun solukkoa viljellään siinä. Kun hyödynnetään kiinteää elatusainetta, embryogeeninen solukko voidaan asettaa 25 elatusaineen pinnalle ja se voi osittain läpäistä tämän kiinteän elatusaineen pinnan. Siten kiinteät elatusaineet käsittävät elatusaineita, jotka ovat osittain kiinteytettyjä ja sallivat embryogeenisen solukon tunkeutua huomattavasti elatusaineen rakenteeseen, ja ne käsittävät myös täysin kiinteytettyjä elatusaineita, jotka eivät salli embryogeenisen solukon tunkeutua kiinteytetyn elatusai-30 neen rakenteeseen. Nestemäinen elatusaine voidaan kiinteyttää täydellisesti tai osittain lisäämällä sopiva määrä geelitettä, kuten esimerkiksi agaria.
Vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävä elatusaine voi sisältää myös ravinteita, jotka ravitsevat inkuboitavaa kasvisolu kkoa, ja yhtä tai useampaa ainetta elatusaineen osmolaliteetin säätämiseksi halutulle välille. Elatusaineen 35 osmolaliteetti voi olla esimerkiksi 90 mM/kg - 300 mM/kg, kuten esimerkiksi 100 mM/kg - 200 mM/kg tai esimerkiksi 100 mM/kg -150 mM/kg. Elatusaineen 6 pH voidaan myös säätää haluttuun arvoon. Elatusaineen pH voi olla esimerkiksi 4,5 - 6,0 tai esimerkiksi 5,0 - 6,0. Maltoosia voidaan sisällyttää elatusai-neeseen pääasialliseksi tai ainoaksi metaboloituvaksi sokerilähteeksi embryo-geeniselle solukolle. Käyttökelpoiset maltoosikonsentraatiot ovat vaihteluvälillä 5 1-2,5 %.
Tämän keksinnön mukaisista menetelmistä jokainen tuottaa enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita kuin identtinen menetelmä, joka ei hyödynnä gibberelliiniä. Jotkut keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodot tuottavat vähintään 50 % enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita (kuten esimer-10 kiksi vähintään 75 % enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita, tai esimerkiksi vähintään 100% enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita, tai esimerkiksi vähintään 150 % enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita) kuin identtinen sirkka-lehtisten männyn alkioiden tuottamismenetelmä, joka ei hyödynnä gibberelliiniä. Siten esimerkiksi jotkut keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodot 15 tuottavat 50 - 200 enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita kuin identtinen sirk-kalehtisten männyn alkioiden tuottamismenetelmä, joka ei hyödynnä gibberelliiniä. Taas esimerkiksi jotkut keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodot tuottavat 50-150% enemmän sirkkalehtisiä männyn alkioita kuin identtinen sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamismenetelmä, joka ei hyödynnä gibbe-20 relliiniä.
On huomattu, että absorboivan aineen sisällyttäminen elatusainee-seen, joka sisältää yhtä tai useampaa gibberelliiniä, tehostaa edelleen sirkkalehtisten männyn alkioiden tuotantoa. Absorboiva aine voi olla mikä tahansa koostumus, joka ei ole myrkyllinen embryogeeniselle solukolle konsentraatioi-25 na, joita esillä olevien menetelmien toteutuksessa hyödynnetään, ja joka pystyy absorboimaan kasvua edistäviä hormoneja ja kasvisolujen alkion kehityksen aikana tuottamia myrkyllisiä yhdisteitä, joita on elatusaineessa läsnä. Siten absorboitu hormoni (hormonit) ei/eivät enää voi edistää embryogeenisen solukon kasvua elatusaineessa, tai sen päällä; ja absorboidut myrkyt eivät voi 30 epäedullisesti vaikuttaa kasvisoluihin. Tässä yhteydessä termi ’’absorboiva” käsittää minkä tahansa kemiallisen tai fysikaalisen vuorovaikutuksen absorboivan yhdisteen ja yhden tai useamman kasvua edistävän hormonin, ja/tai myrkkyjen, välillä elatusaineessa niin että kasvua edistävä(t) hormoni(t) ja/tai myrkyt sitoutuvat absorboivaan koostumukseen.
7
Siten joissakin tämän keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa embryogeenistä solukkoa inkuboidaan sellaisessa elatusaineessa, tai sen päällä, joka sisältää kasvua edistäviä hormoneja, kuten auksiineja ja/tai sytokiniinejä, edistääkseen embryogeenisen solukon monistumista. Kun tar-5 peeksi embryogeenistä solukkoa on saatu, embryogeeninen solukko voidaan sitten siirtää elatusaineeseen, joka ei sisällä kasvua edistäviä hormoneja, mutta sisältää yhtä tai useampaa gibberelliiniä ja, valinnaisesti, yhtä tai useampaa absorboivaa koostumusta. Toisissa suoritusmuodoissa yhtä tai useampaa gibberelliiniä ja, valinnaisesti, yhtä tai useampaa absorboivaa koostumusta voi-10 daan lisätä suoraan elatusaineeseen, joka sisältää yhtä tai useampaa kasvua edistävää hormonia. Kummassa tahansa tilanteessa absorboiva koostumus (koostumukset) sitovat elatusaineessa läsnäolevia kasvua edistäviä hormoneja niin, että embryogeenisen solukon monistumisvauhti vähenee tai monistuminen lakkaa kokonaan, ja gibberelliini(t) indusoi sirkkalehtisten männyn alkioi-15 den populaation tuottoa embryogeenisestä solukosta.
Ei-rajoittavat esimerkit käyttökelpoisista absorboivista koostumuksista käsittävät aktiivihiilen, liukoisen poly(vinyylipyrrolidoni)n, liukenemattoman poly(vinyylipyrrolidoni)n, aktiivialumiinioksidin ja silikageelin. Absorboiva koostumus voi olla läsnä esimerkiksi määränä 0,1 - 5 g/l. Joissakin suoritusmuo-20 doissa absorboiva koostumus on läsnä määränä 0,5 -1 g/l. Niissä tämän keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa, joissa enemmän kuin yksi absorboiva koostumus on läsnä elatusaineessa, edellä mainitut konsentraa-tiorajat viittaavat absorboivien koostumusten kokonaiskonsentraatioon elatus-aineessa.
25 Joissakin tämän keksinnön suoritusmuotojen toteutuksessa embryo geenistä solukkoa viljellään perättäisesti sarjassa vähintään kahdessa elatus-aineessa, tai niiden päällä, joista vähintään toinen sisältää gibberelliiniä. Siten joissakin suoritusmuodoissaan esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmiä sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi, näistä menetelmistä jokainen sisäl-30 tää vaiheet, joissa (a) viljellään embryogeenistä männyn solukkoa vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä elatusaineessa, tai sen päällä, viljellyn embryogeenisen solukon tuottamiseksi ja sitten (b) edelleen viljellään tätä viljeltyä embryogeenistä solukkoa, joka on valmistettu vaiheen (a) mukaisesti sellaisessa elatusaineessa, tai sen päällä, joka ei sisällä vähintään yhtä gibberelliiniä, 35 sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi. Siten elatusaine, joka ei sisällä 8 gibberelliiniä, soveltuu edistämään sirkkalehtisten männyn alkioiden kehitystä ja kypsymistä gibberelliinikäsitellyistä embryogeenisistä solukoista.
Esimerkiksi joidenkin tämän keksinnön mukaisten menetelmien toteutuksessa embryogeenistä männyn solukkoa (kuten esimerkiksi ESM) viljel-5 lään sellaisessa ylläpitoelatusaineessa, tai sen päällä, joka soveltuu edistämään solujakautumista ja embryogeenisen solukon kasvua. Ylläpitoelatusaine voi olla kiinteä elatusaine tai nestemäinen elatusaine, jota voidaan ravistella siinä olevan embryogeenisen solukon kasvun ja monistumisen edistämiseksi. Ylläpitoelatusaine ei sisällä gibberelliiniä mutta voi sisältää ravinteita, jotka ra-10 vitsevat embryogeenistä solukkoa, ja voi sisältää hormoneja, kuten yhtä tai useampaa auksiinia ja/tai sytokiniiniä, jotka edistävät solujakautumista ja embryogeenisen solukon kasvua. Jos hyödynnetään auksiinia, auksiinikonsent-raatio ylläpitoelatusaineessa voi olla esimerkiksi 0,1 -10mg/l (kuten esimerkiksi 0,1 - 5 mg/l). Jos useampi kuin yksi auksiini on läsnä elatusaineessa, 15 edellä mainitut konsentraatiorajat viittaavat auksiinien kokonaiskonsentraati-oon elatusaineessa. Jos hyödynnetään sytokiniiniä, sytokiniinikonsentraatio ylläpitoelatusaineessa voi olla esimerkiksi 0,1-2 mg/l (kuten esimerkiksi 0,1-1 mg/l). Jos useampi kuin yksi sytokiniini on läsnä elatusaineessa, edellä mainitut konsentraatiorajat viittaavat sytokiniinien kokonaiskonsentraatioon ela-20 tusaineessa.
On yleisesti suotavaa, vaikkakaan ei välttämätöntä, sisällyttää mal-toosia ainoana, tai pääasiallisena, metaboloituvana sokerilähteenä ylläpi-toelatusaineeseen. Käyttökelpoiset maltoosikonsentraatiot ovat vaihteluvälillä 1 - 2,5 %, Ylläpitoelatusaineen osmolaliteetti voidaan säätää arvoon, joka on 25 halutulla vaihteluvälillä, kuten esimerkiksi 90 - 300 mM/kg, tai esimerkiksi 100 - 200 mM/kg, tai esimerkiksi 100 -150 mM/kg. Elatusaineen pH voidaan myös säätää haluttuun arvoon. Elatusaineen pH voi olla esimerkiksi 4,5 - 6,0. Embryogeenistä solukkoa inkuboidaan tyypillisesti elatusaineessa, tai sen päällä, lämpötilassa vaihteluvälillä 10-30 °C, kuten esimerkiksi 15-25 °C:ssa, 30 tai esimerkiksi 20 - 23 °C:ssa. Esimerkki sopivasta ylläpitoelatusaineesta on elatusaine BM2, joka esitellään esimerkissä 1. Embryogeenistä solukkoa inkuboidaan ylläpitoelatusaineessa kunnes embryogeeninen solukko on monistunut toivotussa määrin (joka määritetään esimerkiksi viljellyn embryogeenisen solukon pituuden mukaan).
9
Sen jälkeen kun embryogeeninen solukko on monistunut toivotussa määrin, yhtä tai useampaa gibberelliiniä voidaan lisätä ylläpitoelatusaineeseen (tai tämä embryogeeninen solukko voidaan siirtää toiseen yhtä tai useampaa gibberelliiniä sisältävään ylläpitoelatusaineeseen, tai saman ylläpitoelatusaineen 5 tuoreeseen alikvoottiin, joka sisältää yhtä tai useampaa gibberelliiniä) sirkka-lehtisten männyn alkioiden tuoton indusoimiseksi. Yhden tai useamman gibbe-relliinin lisäksi ylläpitoelatusaine voi lisäksi sisältää absorboivan koostumuksen.
Gibberelliiniä (gibberelliinejä) voi olla läsnä ylläpitoelatusaineessa 10 konsentraationa 0,5 - 500 mg/l, kuten esimerkiksi 1 -100mg/l tai esimerkiksi 5 - 50 mg/l. Absorboiva koostumus (koostumukset) voi olla läsnä ylläpitoelatusaineessa esimerkiksi konsentraationa 0,1 - 5 g/l, kuten esimerkiksi 0,5-1 g/l. Yhtä tai useampaa gibberelliiniä sisältävän ylläpitoelatusaineen osmolaliteetti voidaan säätää arvoon, joka on halutulla vaihteluvälillä, kuten esimerkiksi 15 90 - 300 mM/kg, tai esimerkiksi 100 - 200 mM/kg, tai esimerkiksi 100 mM/kg -150mM/kg. Ylläpitoelatusaineen pH voidaan myös säätää haluttuun arvoon. Ylläpitoelatusaineen pH voi olla esimerkiksi 4,5 - 6. Embryogeenistä solukkoa inkuboidaan tyypillisesti yhtä tai useampaa gibberelliiniä sisältävässä elatusai-neessa, tai sen päällä, lämpötilassa, joka on vaihteluvälillä 10-30°C, kuten 20 esimerkiksi 15-25 °C:ssa, tai esimerkiksi 20 - 23 °C:ssa.
Embryogeenistä solukkoa inkuboidaan tyypillisesti ylläpitoelatusaineessa yhden tai useamman gibberelliinin ja valinnaisesti yhden tai useamman absorboivan koostumuksen läsnäollessa 0,5 - 5 viikon ajan, kuten esimerkiksi yhdestä viikosta kolmeen viikkoon, tai esimerkiksi yhdestä viikosta kahteen 25 viikkoon.
Gibberelliinikäsitelty embryogeeninen solukko voidaan sitten siirtää kehityselatusaineelle, joka soveltuu edistämään sirkkalehtisten männyn alkioiden kehittymistä. Kehityselatusaine on tyypillisesti kiinteä elatusaine, vaikka kehityselatusaine voi olla nestemäinen elatusaine. Kehityselatusaine ei sisällä 30 gibberelliiniä (vaikkakin vähän gibberelliinijäämiä saattaa siirtyä kehityselatus-aineeseen embryogeenisen solukon mukana). Kehityselatusaine voi sisältää ravinteita, jotka ravitsevat embryogeenistä solukkoa. Maltoosia voidaan sisällyttää elatusaineeseen pääasiallisena tai ainoana sokerilähteenä embryogeeni-selle solukolle. Hyödylliset maltoosikonsentraatiot ovat vaihteluvälillä 1 - 2,5 %.
10
Soveliaat kehityselatusaineet eivät tyypillisesti sisällä kasvua edistäviä hormoneja kuten auksiineja ja sytokiniinejä, mutta voivat sisältää abskis-sihappohormonia. Kun abskissihappoa hyödynnetään kehityselatusaineessa, sitä tyypillisesti hyödynnetään konsentraatioina, jotka ovat vaihteluvälillä 5 1 - 200 mg/l, kuten esimerkiksi 1-100 mg/l. Kehityselatusaineen osmolaliteetti voidaan säätää arvoon, joka on halutulla vaihteluvälillä, kuten esimerkiksi 250 - 450 mM/kg tai esimerkiksi 250 - 350 mM/kg. Kehityselatusaineen pH voidaan säätää arvoon, joka on halutulla vaihteluvälillä, kuten esimerkiksi 4,5 - 6,5 tai esimerkiksi 5,0 - 6,0. Embryogeenistä solukkoa inkuboidaan tyypillisesti 10 kehityselatusaineessa, tai sen päällä, lämpötilassa, joka on vaihteluvälillä 20 - 24 °C, kuten esimerkiksi 21 - 24 °C:ssa. Esimerkki sopivasta kehitysela-tusaineesta on elatusaine BM3, joka esitellään esimerkissä 1. Joissakin tämän keksinnön mukaisissa suoritusmuodoissa embryogeenistä solukkoa inkuboidaan elatusaineessa, tai sen päällä, kuudesta viikosta kahteentoista viikon 15 ajan, kuten esimerkiksi kuudesta viikosta yhdeksään viikkoon.
Siten joissakin suoritusmuodoissaan esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmiä sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi, näistä menetelmistä jokaisen sisältäessä seuraavat vaiheet: (a) embryogeenisen männyn solukon (kuten esimerkiksi männyn embryonaalisten suspensorimassojen) viljely 20 kiinteän ylläpitoelatusaineen päällä; sitten (b) embryogeenisen männyn solukon viljely nestemäisessä ylläpitoelatusaineessa; sitten (c) embryogeenisen männyn solukon viljely nestemäisessä ylläpitoelatusaineessa, joka sisältää gibbe-relliiniä; (ja valinnaisesti absorboivaa koostumusta); ja sitten (d) embryogeenisen männyn solukon viljely kiinteän kehityselatusaineen päällä sirkkalehtisten 25 männyn alkioiden tuottamiseksi. Näiden tämän keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa vain nestemäinen ylläpitoelatusaine, jota hyödynnetään vaiheessa (c), sisältää gibberelliiniä. Keksinnön tämän osan menetelmät voivat valinnaisesti sisältää vaiheen, jossa männyn solukkoa viljellään aloi-tuselatusaineessa tai sen päällä, embryogeenisen solukon tuottamiseksi, jota 30 solukkoa viljellään sitten siinä ylläpitoelatusaineessa tai sen päällä, joka esitellään vaiheessa (a).
Sirkkalehtiset männyn alkiot, jotka on tuotettu käyttämällä tämän keksinnön mukaisia menetelmiä, voidaan valinnaisesti idättää sellaisten män-tykasvien muodostamiseksi, jotka voidaan kasvattaa mäntypuiksi, mikäli niin 35 halutaan. Sirkkalehtiset männyn alkiot voidaan idättää kiinteän idätyselatusai-neen päällä, kuten esimerkiksi elatusaine BM^IIä, joka esitellään esimerkis- 11 sä 1. Idätetyt kasvit voidaan siirtää multaan kasvun jatkamiseksi. Idätetyt kasvit voidaan esimerkiksi istuttaa multaan kasvihuoneessa ja niiden annetaan kasvaa ennen kuin ne siirretään ulos. Tyypillisesti sirkkalehtisiä männyn alkioita valaistaan itämisen stimuloimiseksi. Tyypillisesti tämän keksinnön mukaisten me-5 netelmien kaikki vaiheet, idätystä lukuun ottamatta, suoritetaan pimeässä.
Tämän keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan esimerkiksi käyttää kloonien tuottamiseen sellaisista yksittäisistä mäntypuista, joilla on yksi tai useampi haluttu ominaisuus, kuten esimerkiksi nopea kasvuvauhti. Siten yhdeltä osaltaan esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmiä geneettisesti identtisten 10 sirkkalehtisten männyn alkioiden populaation tuottamiseksi. Keksinnön tämän osan menetelmistä jokainen sisältää vaiheen, jossa geneettisesti identtistä embryogeenistä männyn solukkoa viljellään vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä elatusaineessa, tai sen päällä, sirkkalehtisten männyn alkioiden populaation tuottamiseksi. Mitä tahansa tässä esitetyistä menetelmistä voidaan käyt-15 tää geneettisesti identtisten sirkkalehtisten männyn alkioiden populaatioiden tuottamiseen.
Seuraavat esimerkit ainoastaan havainnollistavat parasta tapaa, jota nyt tarkastellaan keksinnön soveltamiseksi, mutta niitä ei pidä tulkita keksintöä rajoittaviksi.
20 Esimerkki 1 Tämä esimerkki esittää keksinnön mukaisen tyypillisen menetelmän Loblolly-männyn (Pinus taeda) sirkkalehtisten alkioiden tuottamiseksi.
Naaraspuoliset gametofyytit, jotka sisältävät tsygoottisia alkioita, poistetaan siemenistä neljästä viiteen viikkoa idätyksen jälkeen. Siemenkuoret 25 poistetaan, mutta alkioita ei leikellä enempää irti ympäröivästä gametofyytistä muuten kuin nukelluksen pään poistamiseksi. Kävyt säilytetään 4 °C:ssa siihen asti kunnes ne käytetään. Juuri ennen kypsymättömien alkioiden poistamista siemenet steriloidaan käyttäen alkupesua ja puhdistusainekäsittelyä, jota seuraa kymmenen minuutin sterilointi 15-prosenttisessa hhC^ssa. Eksplantaatit 30 pestään läpikotaisin steriilillä tislatulla vedellä jokaisen käsittelyn jälkeen.
Taulukot 1 ja 2 esittelevät elatusainekoostumukset, jotka ovat käyttökelpoisia loblollymännyn sirkkalehtisten alkioiden tuottamiseksi tämän keksinnön menetelmien mukaisesti.
Taulukko 1 12
Pinus taedan peruselatusaine (BM)
Ainesosa_Konsentraatio (mg/l)_ NH4NO3 150,0 KNOs 909,9 KH2PO4 136,1
Ca(N03)2.4H20 236,2
CaCI2.4H20 50,0
MgS04.7H20 246,5
Mg(N03)2.6H20 256,5
MgCI2.6H20 50,0
Kl 4,15 H2B03 15,5
MnS04.H20 10,5
ZnS04.7H20 14,4
NaMo04.2H20 0,125
CuS04.5H20 0,125
CoCI2.6H20 0,125
FeS04.7H20 13,9
Na2EDTA 18,65
Sakkaroosi 30 000 myo-lnositoli 100 cas-aminohapot 500 L-Glutamiini 1 000
Tiamiini, HCI 1,00
Pyridoksiini, HCI 0,50
Nikotiinihappo 0,50
Glysiini 2,00
Agar+ 6 000 pH säädetään 5,7:ään_ +käytetään mikäli halutaan kiinteä elatusaine
Taulukko 2 13 _Elatusaineen koostumus eri vaiheiden käsittelyille_ BMrindusointielatusaine BM+2.4-D (15 pM)+kinetiini (2 μΜ)+ΒΑΡ (2 μΜ) BM2-ylläpito- ja monis- BM+2.4-D (5pM)+kinetiini (0,5μΜ)+ΒΑΡ (0,5 μΜ)+ tuselatusaine lisäksi 4 900 mg/l myo-inositolia, maltoosia käyte tään sakkaroosin sijasta samanpainoisuuden perusteella. Agaria lisätään, kun halutaan kiinteä ela-tusaine.
BM3-sirkkalehtisten alki- BM+50 mg/l absikissihappoa+18 % PEG-4000 & oiden kehityselatusaine 8000 -seosta+2,5 % maltoosia+ lisäksi 900 mg/l myo-inositolia+1000 mg/l glutamiinia+0,125 % aktiivihiiltä. Ei geelitettä. Seuraava aminohapposeos lisätään: L-proliini (100 mg/l), L-asparagiini (100 mg/l), L-arginiini (50 mg/l), L-alaniini (20 mg/l) ja L-seriini (20 mg/l).
BM4-idätyselatusaine BM, joka on muokattu vähentämällä sakkaroosi 20 000 mg/l:aan, myo-inositoli 100,0 mg/l:aan, glu-tamiini ja cas-aminohapot 0,0 mg/l:aan + 0,6 % __agaria ja 0,25 % aktiivihiiltä._
Vaihe I - indusointi: Steriilit gametofyytit koskemattomine alkioi-neen asetetaan kiinteän BMi-viljelyelatusaineen päälle ja pidetään ympäröivissä olosuhteissa 22 - 25 °C:ssa 24 tunnin pimeävalojaksolla 3 - 5 viikon ajan.
5 Ajan pituus riippuu kyseisestä genotyypistä, joka on viljeltävänä. Tämän ajan lopulla valkoinen limainen massa muodostuu alkuperäisten eksplantaattien yhteyteen. Mikroskooppinen tarkastelu tyypillisesti paljastaa lukuisia varhaisvaiheen alkioita massaan liittyneenä. Näillä luonnehditaan yleisesti olevan pitkä ohutseinäinen suspensori liittyneenä pieneen päähän, jossa on tiheä sytoplas-10 ma ja suuria tumia. Indusointielatusaineen osmolaliteetti voi joissakin tapauksissa olla niinkin korkea kuin 170 mM/kg. Normaalisti se on noin 160 mM/kg tai jopa pienempi (kuten esimerkiksi 150 mM/kg).
Vaihe II - ylläpito, monistus, gibberelliinikäsittely: Indusointivai-heessa syntyneistä massoista erotetut varhaisvaiheen alkiot asetetaan ensin 15 hyytelöidyn BM2-ylläpito- ja monistuselatusaineen päälle. Tämä eroaa indusoin-tielatusaineesta siinä, että kasvuhormoneja (sekä auksiineja että sytokiniinejä) on vähennetty vähintään yhdellä kokonaisella suurusluokalla. Tämän elatusai- 14 neen osmolaliteetti on nostettu indusointielatusaineen osmolaliteetista noin 180 mM/kg:aan tai suuremmaksi (tyypillisesti vaihteluvälillä 180-400 mM/kg Pinus taedalle) kasvattamalla myo-inositolin konsentraatio 0,5-painoprosentti-seksi. Lämpötila ja valojakso ovat jälleen 22 - 25 °C ja 24 tuntia pimeässä. Al-5 kioita viljellään 12-14 päivää kiinteän BlV^-elatusaineen päällä ennen siirtoa nestemäiseen elatusaineeseen myöhempään alaviljelyyn. Tällä nestemäisellä elatusaineella on sama koostumus kuin BlV^lla mutta siitä puuttuu geelite. Kiinteän ylläpitovaiheen lopulla alkiot ovat tyypillisesti samanlaisia ulkonäöltään kuin vaiheen I alkiot. Myöhemmän varhaisvaiheen alkiot ovat muodostu-10 neet 5-6:n viikoittaisen alaviljelyn jälkeen nestemäisessä ylläpitoelatusainees-sa. Näitä luonnehtivat pehmeät embryonaaliset päät, joissa arvioidaan tyypillisesti olevan yli 100 yksittäistä solua, moninkertaisten suspensorien kanssa.
Myöhemmän varhaisvaiheen alkiot siirretään toiseen ylläpitoelatus-aineeseen, jolla on BM2:n koostumus mutta ilman 2,4-D:tä, kinetiiniä ja BAP:tä, 15 ja sisältäen GA 4/7:ää konsentraationa 2,5 -10,0 mg/l. Alkioita inkuboidaan tässä elatusaineessa seitsemästä neljääntoista päivän ajan.
Vaihe III - alkionkehitys: Myöhemmän varhaisvaiheen alkiot vaiheen Il viljelystä siirretään suodatinpaperialustalle, joka on sijoitettu nestemäisellä kehityselatusaineella kyllästetyn tyynyn päälle. Tästä elatusaineesta puut-20 tuu kasvihormonit joko kokonaan, tai niitä on läsnä vain hyvin pieninä määrinä, ja siinä on sama matalampi osmoottisten aineiden taso kuin vaiheissa I ja II. Abskissihappoa tyypillisesti sisällytetään helpottamaan myöhempää kehitystä. Edullista on sisällyttää lisäksi absorboiva koostumus tähän elatusaineeseen. Absorboiva koostumus voidaan valita useiden sellaisten kemiallisten materiaali-25 en joukosta, joilla on suuri pinta-alue ja/tai kontrolloitu huokoskoko, kuten esimerkiksi aktiivihiilellä, liukoisella ja liukenemattomalla poly(vinyylipyrrolidoni)lla, aktiivialumiinioksidilla ja silikageelillä. Absorboiva koostumus on normaalisti läsnä konsentraationa, joka on noin 0,1 - 5 g/l, yleisemmin noin 0,25 - 2,5 g/l.
Tämän kehityselatusaineen osmoottinen potentiaali voidaan nostaa 30 huomattavasti yli ylläpitoelatusaineen osmoottisen potentiaalin. On huomattu edulliseksi, että osmolaliteetti on niin suuri kuin 350 mM/kg tai jopa suurempi. Kehittyminen toteutetaan edullisesti täydellisessä pimeydessä lämpötilassa 22 - 25 °C kunnes pidentyneet sirkkalehtiset alkiot ovat kehittyneet. Kehitty-misaika on tyypillisesti useita viikkoja, esimerkiksi 10-12 viikkoa.
15
Vaihe IV - kuivaus: Edelleen suodatinpaperialustallaan olevat alkiot nostetaan tyynyltä ja asetetaan suljettuun astiaan kyllästetyn K2S04-liuoksen päälle, 97 %:n suhteelliseen kosteuteen noin kolmen viikon ajaksi.
Vaihe V - idätys: Kuivatetut sirkkalehtiset alkiot vaiheesta IV rehyd-5 roidaan sijoittamalla ne edelleen suodatinpaperialustallaan noin 24 tunniksi tyynylle, joka on kyllästetty nestemäisellä idätyselatusaineella. Alkiot asetetaan sitten yksittäin kiinteän BM4-elatusaineen päälle idätystä varten. Tämä on pe-ruselatusaine, josta puuttuu kasvuhormonit, ja jota on muokattu vähentämällä sakkaroosia, myo-inositolia ja orgaanista typpeä. Alkioita inkuboidaan BM4-10 elatusaineen päällä noin 6 - 8 viikkoa ympäröivissä olosuhteissa 23 - 25 °C:ssa 16 tunnin valo- ja 8 tunnin pimeävalojaksolla kunnes tuloksena olevilla kasvualuilla on hyvin kehittynyt sirkkajuuri ja sirkkavarsi sekä vihreä sirkkalehtira-kenne ja epikotyyli.
Vähennetyn hiilihydraattikonsentraation vuoksi idätyselatusaineen 15 osmoottinen potentiaali on lisäksi pienentynyt alle kehityselatusaineen osmoottisen potentiaalin. Se on normaalisti alle noin 150mM/kg (kuten esimerkiksi noin 100 mM/kg).
Vaihe VI - siirtäminen: Vaiheen V kasvinalut siirretään idätyselatusai-neelta ja istutetaan multaan, joka sisältää yhtä suuren osan turvetta ja hienoja-20 koista perliittiä.
Esimerkki 2 Tämä esimerkki osoittaa, että gibberelliini edistää loblollymännyn somaattisten alkioiden muodostumista. Loblolly-männyn genotyyppien LP 7 ja LP 5 ESM:ien alikvootit siirrettiin ylläpitoelatusaineesta elatusaineeseen 8280 25 ja inkuboitiin elatusaineissa, jotka on esitetty taulukossa 3, ennen siirtoa kehi-tyselatusaineelle.
Taulukko 3 16
Elatusaineen nimi ja koostumus Viljelyaika ennen siirtämistä __kehityselatusaineelle_ 8280 (tavallinen ylläpitoelatusaine)__kolme viikkoa_ 8510 (8280 ilman hormoneja, plus 10 mg/l GA4/7) yksi viikko_ 8511 (8280 ilman hormoneja, plus 5,0 mg/l GA 4/7) kaksi viikkoa_ 8511 (8280 ilman hormoneja, plus 5,0 mg/l GA 4/7) yksi viikko_ 8520 (8280 ilman hormoneja, plus 2,5 mg/l GA 4/7) kaksi viikkoa_ Käsitelty ESM huuhdeltiin elatusaineella 8353 ennen siirtämistä ela-tusaineelle 8343 (sisältäen 50 mg/l abskissihappoa). 0,75 ml jokaista viljelyä (0,5 ml asettuneita soluja ja 0,25 ml huuhteluelatusainetta 8353) siirrettiin kehi-5 tyselatusaineelle.
Havainnot tehtiin siirtämishetkellä ja noin 12 viikkoa siirron jälkeen. Hyvälaatuiset sirkkalehtiset alkiot laskettiin viljelyastian kannen läpi ja alkion laatumääritykset, kuten alkion koko, pituus, väri ja muoto, tehtiin ennen alkioiden siirtämistä stratifikaatioelatusaineelle 8483 ennen kuivausta ja idätystä.
10 Taulukko 4 esittää keskimääräiset sirkkalehtisten alkioiden saannot jokaisen genotyypin ja käsittelyn osalta.
_ Käsittely__Genotyyppi 5__Genotyyppi 7
Viikko ravistelu kehitys keskiarvo keskivirhe keskiarvo keskivirhe 2 8280 8384 145__21A__121__20,7 2 8511 8384 211__16J)__221__14,7 2 8520 8384 147 14,4 140 11,1
Taulukko 5 esittää keskimääräiset sirkkalehtisten alkioiden saannot käsittelyä kohti.
Viikko__Ravistelukäsittely__Keskiarvo__Keskivirhe 2__8280 (ei GA:ta)__137__8,95 2__8511 (paljon GA:ta)__224__8,95 2 8520 (vähän GA:ta) 187 8,95 Nämä tiedot osoittavat, että Loblolly-männyn ESM:ien viljely gibbe-15 relliiniä (GA 4/7) sisältävässä ylläpitoelatusaineessa lisäsi niiden sirkkalehtisten alkioiden määrää ja paransi laatua, jotka muodostuivat sen jälkeen, kun ESM:t siirrettiin kehityselatusaineelle. Sirkkalehtiset alkiot olivat suurempia, pidempiä, symmetrisempiä ja organisoidumpia.
17
Kun tämän keksinnön edullinen suoritusmuoto on havainnollistettu ja kuvailtu, on ymmärrettävä, että siihen voidaan tehdä lukuisia muutoksia poikkeamatta keksinnön hengestä ja ulottuvuudesta.
Keksinnön mukaiset suoritusmuodot, joihin vaaditaan täysi omistus-5 oikeus tai etuoikeus, määritetään seuraavasti.
Claims (24)
1. Menetelmä sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi, mainitun menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa 5 (a) viljellään embryogeenistä männyn solukkoa kiinteä ylläpitoela- tusaineen päällä, joka ei sisällä gibberelliiniä, (b) vaiheen (a) mukaisesti käsiteltyä embryogeenistä männyn solukkoa viljellään nestemäisessä ylläpitoelatusaineessa, joka ei sisällä gibberelliiniä, 10 (c) vaiheen (b) mukaisesti käsiteltyä embryogeenistä männyn soluk koa viljellään nestemäisessä ylläpitoelatusaineessa, joka sisältää vähintään yhtä gibberelliiniä sillä edellytyksellä, että gibberelliiniä sisältävä nestemäinen ylläpitoelatusaine ei sisällä abskissihappoa; ja vaiheen (c) mukaisesti käsiteltyä embryogeenistä männyn solukkoa 15 viljellään kiinteän kehityselatusaineen päällä, joka ei sisällä gibberilliiniä, sirkkalehtisten männyn alkioiden tuottamiseksi.
2. Patenttivaatimukseni mukainen menetelmä, jossa embryogeeni-nen männyn solukko käsittää embryonaaliset suspensorimassat.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa embryogee- 20 ninen männyn solukko koostuu embryonaalisistä suspensorimassoista.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tuotettujen sirkkalehtisten männyn alkioiden määrä on vähintään 50 % suurempi kuin niiden sirkkalehtisten männyn alkioiden määrä, jotka on tuotettu toisella menetelmällä, joka on identtinen pa- 25 tenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän kanssa, paitsi että mainittu toinen menetelmä ei hyödynnä gibberelliiniä.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tuotettujen sirkkalehtisten männyn alkioiden määrä on vähintään 75 % suurempi kuin niiden sirkkalehtisten männyn al- 30 kioiden määrä, jotka on tuotettu toisella menetelmällä, joka on identtinen patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän kanssa, paitsi että mainittu toinen menetelmä ei hyödynnä gibberelliiniä.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tuotettujen sirkkalehtisten männyn alkioi- 35 den määrä on vähintään 100% suurempi kuin niiden sirkkalehtisten männyn alkioiden määrä, jotka on tuotettu toisella menetelmällä, joka on identtinen pa tenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän kanssa, paitsi että mainittu toinen menetelmä ei hyödynnä gibberelliiniä.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vähintään yhden gibberelliinin konsentraatio vaiheen (c) nestemäisessä elatusaineessa on 5 0,5 - 500 mg/l.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vähintään yhden gibberelliinin konsentraatio vaiheen (c) nestemäisessä elatusaineessa on 1,0-100 mg/l.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vähintään yh-10 den gibberelliinin konsentraatio vaiheen (c) nestemäisessä elatusaineessa on 5 - 50 mg/l.
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa embryo-geenistä männyn solukkoa viljellään vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä vaiheen (c) nestemäisessä elatusaineessa tai sen päällä, 0,5 - 5 viikon ajan.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa embryo- geenistä männyn solukkoa viljellään vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä vaiheen (c) nestemäisessä elatusaineessa tai sen päällä, 1 - 3 viikon ajan.
12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa embryo-geenistä männyn solukkoa viljellään vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävässä 20 vaiheen (c) nestemäisessä elatusaineessa tai sen päällä, 1 - 2 viikon ajan.
13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävän vaiheen (c) nestemäisen elatusaineen osmolali-teetti on 90 - 300 mM/kg.
14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vähintään 25 yhtä gibberelliiniä sisältävän vaiheen (c) nestemäisen elatusaineen pH on 4,5 - 6,0.
15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävän vaiheen (c) nestemäisen elatusaineen pH on 5,0 -6,0.
16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävä vaiheen (c) nestemäinen elatusaine sisältää lisäksi maltoosia, joka on läsnä konsentraationa 1 - 2,5 %.
17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vähintään yhtä gibberelliiniä sisältävä vaiheen (c) nestemäinen elatusaine sisältää lisäksi 35 absorboivaa koostumusta.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, jossa absorboiva koostumus on valittu ryhmästä, joka käsittää aktiivihiilen, liukoisen poly(vinyyli-pyrrolidoni)n, liukenemattoman poly(vinyylipyrrolidoni)n, aktivoidun alumiinioksidin ja silikageelin.
19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, jossa absorboiva koostumus on aktiivihiili.
20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, jossa absorboivan koostumuksen konsentraatio on 0,1 - 5 g/l.
21. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, jossa absorboi-10 van koostumuksen konsentraatio on 0,5 -1 g/l.
22. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa sirkkalehti-set Loblolly-männyn alkiot tuotetaan Loblolly-männyn embryogeenisestä solukosta.
23. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa: 15 (a) männyn embryogeeninen solukko koostuu oleellisesti männyn embryonaalisista suspensorimassoista. (b) vähintään yhden gibberelliinin konsentraatio vaiheen (c) nestemäisessä elatusaineessa on 0,5 - 500 mg/l; ja (c) vaiheen (c) nestemäinen elatusaine sisältää lisäksi absorboivaa 20 koostumusta, joka on läsnä konsentraationa 0,1 - 5 g/l.
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, jossa männyn embryogeeninen solukko koostuu edullisesti Loblolly-männyn embryonaalisista suspensorimassoista.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US38510202P | 2002-05-30 | 2002-05-30 | |
| US38510202 | 2002-05-30 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20030819A0 FI20030819A0 (fi) | 2003-05-30 |
| FI20030819A FI20030819A (fi) | 2003-12-01 |
| FI121159B true FI121159B (fi) | 2010-08-13 |
Family
ID=23520003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20030819A FI121159B (fi) | 2002-05-30 | 2003-05-30 | Menetelmä sirkkalehtisten männynalkioiden tuottamiseksi gibberelliiniä hyödyntämällä |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7381562B2 (fi) |
| AU (1) | AU2003203636B2 (fi) |
| BR (1) | BR0301695A (fi) |
| CA (1) | CA2424427C (fi) |
| FI (1) | FI121159B (fi) |
| NZ (1) | NZ525249A (fi) |
| SE (1) | SE526899C2 (fi) |
| UY (1) | UY27829A1 (fi) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2435337C (en) | 2002-11-14 | 2010-03-23 | Weyerhaeuser Company | Methods for producing conifer somatic embryos |
Family Cites Families (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4217730A (en) * | 1979-05-07 | 1980-08-19 | Weyerhaeuser Company | Embryogenesis of gymnosperm forest trees |
| US4801545A (en) * | 1983-05-19 | 1989-01-31 | Plant Genetics, Inc. | Enhanced somatic embryogenesis using maltose |
| US5821126A (en) * | 1986-11-19 | 1998-10-13 | The Regents Of The University Of California | Method for clonal propagation of gymnosperms by somatic polyembryogenesis |
| GB8717099D0 (en) | 1987-07-20 | 1987-08-26 | Univ Guelph | Induce desiccation tolerance in somatic embryos |
| US5238835A (en) * | 1987-07-20 | 1993-08-24 | University Of Guelph | Process to induce desiccation tolerance in somatic embryos |
| US5482857A (en) | 1989-03-09 | 1996-01-09 | Weyerhaeuser Company | Method for reproducing douglas-fir by somatic embryogenesis |
| US4957866A (en) | 1989-03-09 | 1990-09-18 | Weyerhaeuser Company | Method for reproducing coniferous plants by somatic embryogenesis |
| US5041382A (en) * | 1989-03-09 | 1991-08-20 | Weyerhaeuser Company | High concentration enrichment of conifer embryonal cells |
| US5236841A (en) * | 1989-03-09 | 1993-08-17 | Gupta Pramod K | Method for reproducing conifers by somatic embryogenesis using stepwise hormone adjustment |
| US5563061A (en) * | 1989-03-09 | 1996-10-08 | Weyerhaeuser Company | Method for reproducing conifers by somatic embryogenesis using a maltose enriched maintenance medium |
| US5294549A (en) * | 1989-03-09 | 1994-03-15 | Weyerhaeuser Company | Method for reproducing conifers by somatic embryogenesis using mixed growth hormones for embryo culture |
| US5034326A (en) * | 1989-10-23 | 1991-07-23 | Weyerhaeuser Company | Method for reproducing coniferous plants by somatic embryogenesis using adsorbent materials in the development stage media |
| US5036007A (en) * | 1989-03-09 | 1991-07-30 | Weyerhaeuser Company | Method for reproducing coniferous plants by somatic embryogenesis using abscisic acid and osmotic potential variation |
| US5183757A (en) * | 1989-08-01 | 1993-02-02 | British Columbia Research Corporation | Process for the production, desiccation and germination of conifer somatic embryos |
| US5187092A (en) * | 1990-03-22 | 1993-02-16 | Institute Of Paper Science And Technology, Inc. | Somatic embryogenesis in gymnosperms |
| US5427593A (en) | 1990-10-26 | 1995-06-27 | Weyerhaeuser Company | Analogs of botanic seed |
| US5610051A (en) * | 1991-06-18 | 1997-03-11 | Westvaco Corporation | Method for production of coniferous isogenic cell lines |
| NZ241054A (en) * | 1991-12-18 | 1995-10-26 | Nz Forest Research Inst Ltd | Maturing of cotyledonary stage embryos on a solid medium: oxygen and vapour permeable filter which is impermeable to microbes placed over plant material |
| US6340594B1 (en) * | 1991-12-19 | 2002-01-22 | Cellfor, Inc. | Production of desiccation-tolerant gymnosperm embryos |
| US5565355A (en) * | 1991-12-19 | 1996-10-15 | New Zealand Forest Research Institute Limited | Growth medium |
| NZ246137A (en) * | 1991-12-19 | 1996-04-26 | Univ Saskatchewan | Mature desiccation tolerant gymnosperm somatic embryos and their production |
| US5850032A (en) * | 1992-04-01 | 1998-12-15 | Union Camp Corporation | Method for production of plant biological products in precocious neomorphic embryoids |
| US5501972A (en) * | 1992-06-10 | 1996-03-26 | Unilever Patent Holdings B.V. | Method of producing embryogenic callus of Norway spruce (Picea abies and regenerating plantlets therefrom |
| DK0608716T4 (da) | 1993-01-15 | 2003-11-24 | Syngenta Participations Ag | Forbedringer i somatisk embryogenese |
| BR9302220A (pt) | 1993-04-23 | 1995-01-10 | Nz Forest Research Inst Ltd | Meio de crescimento para capturar e sustentar o crescimento de tecido embriogênico, processo de crescimento de tecido embriogênico, processo de capturar tecido embriogênico e processo de crescimento de tecido embriogênico pós-captura |
| US5413930A (en) | 1993-10-21 | 1995-05-09 | Westvaco Corporation | Method for regeneration of coniferous plants by somatic embryogenesis |
| US5506136A (en) * | 1993-10-21 | 1996-04-09 | Westvaco Corporation | Method for regeneration of coniferous plants by somatic embryogenesis |
| DE69516505T2 (de) * | 1994-01-13 | 2000-12-14 | Inotec International B.V., Enkhuizen | Verfahren zur erzeugung von pflanzenembryoiden mit austrocknungstoleranz und verfahren zur keimung von embryoiden mit austrocknungstoleranz |
| US5491090A (en) * | 1994-02-09 | 1996-02-13 | Westvaco Corporation | Embryogenic coniferous liquid suspension cultures |
| NZ272210A (en) * | 1995-05-25 | 1997-10-24 | Carter Holt Harvey Ltd | Treatment of somatic embryos to provide viable embryos after storage periods |
| US6417001B2 (en) * | 1995-05-25 | 2002-07-09 | Carter Holt Harvey Limited | Embryogenesis process for initiation |
| US5534434A (en) * | 1995-06-02 | 1996-07-09 | Westvaco Corporation | Basal nutrient medium for in vitro cultures of loblolly pines |
| US5534433A (en) * | 1995-06-02 | 1996-07-09 | Westvaco Corporation | Basal nutrient medium for in vitro cultures of loblolly pines |
| US5840581A (en) * | 1996-03-29 | 1998-11-24 | International Paper Company | Process for somatic embryogenesis of sweetgum |
| US5677185A (en) | 1996-05-14 | 1997-10-14 | Westvaco Corporation | Method for regeneration of coniferous plants by somatic embryogenesis in culture media containing abscisic acid |
| US5731203A (en) * | 1996-06-14 | 1998-03-24 | Westvaco Corporation | Method for regeneration of coniferous plants by somatic embryogenesis |
| US5731191A (en) * | 1996-12-20 | 1998-03-24 | Westvaco Corporation | Method for regeneration of coniferous plants by somatic embryogenesis employing polyethylene glycol |
| US5731204A (en) * | 1996-12-20 | 1998-03-24 | Westvaco Corporation | Method for regeneration of coniferous plants by somatic embryogenesis employing polyethylene glycol |
| AU739097B2 (en) | 1997-04-21 | 2001-10-04 | Weyerhaeuser Company | Method for inducing and determining maturity in conifer somatic embryos |
| US6134830A (en) * | 1997-11-20 | 2000-10-24 | Weyerhaeuser Company | Method for storing and improving the survival rate of conifer somatic embryo germinants |
| US6150167A (en) * | 1998-02-19 | 2000-11-21 | Weyerhaeuser Company | Method of determining conifer embryo maturity using sugar alcohol content |
| DE69814173T2 (de) * | 1998-03-17 | 2004-02-26 | Silvagen Inc., Vancouver | Reifen von somatischen embryonen |
| DE69903734T2 (de) * | 1998-06-12 | 2003-07-17 | Silvagen Inc., Vancouver | Verfahren zur herstellung und anschliessender (ex vitro) aussaat und vermehrung von vorgekeimten pflanzlichen somatischen embryos |
| EP1217884B1 (en) | 1999-09-21 | 2007-02-21 | Woody Plant Biotech APS | Method for maturation of conifer somatic embryos |
| US6492174B1 (en) * | 2000-06-19 | 2002-12-10 | Institute Of Paper Science & Technology | Methods of initiating embryogenic cultures in plants |
| US20020092037A1 (en) | 2000-10-10 | 2002-07-11 | Connett-Porceddu Marie Bernice | Use of membrane supports in plant tissue culture processes |
| AU1308102A (en) | 2000-10-10 | 2002-04-22 | Westvaco Corp | Enhanced transformation and regeneration of transformed embryogenic pine tissue |
| US6893873B2 (en) * | 2002-01-25 | 2005-05-17 | Georgia Tech Research Corporation | Methods for improving conifer embryogenesis |
-
2003
- 2003-04-01 US US10/405,819 patent/US7381562B2/en active Active
- 2003-04-03 CA CA2424427A patent/CA2424427C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-10 AU AU2003203636A patent/AU2003203636B2/en not_active Ceased
- 2003-04-10 NZ NZ525249A patent/NZ525249A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-05-20 SE SE0301461A patent/SE526899C2/sv not_active IP Right Cessation
- 2003-05-20 BR BR0301695-1A patent/BR0301695A/pt not_active Application Discontinuation
- 2003-05-29 UY UY27829A patent/UY27829A1/es not_active Application Discontinuation
- 2003-05-30 FI FI20030819A patent/FI121159B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ525249A (en) | 2004-08-27 |
| CA2424427A1 (en) | 2003-11-30 |
| FI20030819A0 (fi) | 2003-05-30 |
| CA2424427C (en) | 2013-12-10 |
| FI20030819A (fi) | 2003-12-01 |
| US7381562B2 (en) | 2008-06-03 |
| BR0301695A (pt) | 2004-08-24 |
| US20030226165A1 (en) | 2003-12-04 |
| SE526899C2 (sv) | 2005-11-15 |
| SE0301461D0 (sv) | 2003-05-20 |
| AU2003203636A1 (en) | 2003-12-18 |
| AU2003203636B2 (en) | 2008-01-24 |
| SE0301461L (sv) | 2003-12-01 |
| UY27829A1 (es) | 2003-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Maruyama et al. | Efficient plant regeneration of Hinoki cypress (Chamaecyparis obtusa) via somatic embryogenesis | |
| US7452722B2 (en) | Methods for developing conifer somatic embryos | |
| FI121210B (fi) | Menetelmiä havupuiden embryogeenisen solukon lisäämiseksi sekä sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi | |
| CA2470303C (en) | Media and methods for promoting maturation of conifer somatic embryos | |
| FI121159B (fi) | Menetelmä sirkkalehtisten männynalkioiden tuottamiseksi gibberelliiniä hyödyntämällä | |
| Taha et al. | Somatic Embryogenesis and Production of Artificial Seeds in Saintpaulia ionantha Wendl. | |
| JP4303509B2 (ja) | マツの子葉胚を発生させる方法 | |
| FI121177B (fi) | Menetelmiä männyn somaattisten alkioiden synkronoidun populaation valmistamiseksi | |
| Maruyama et al. | Somatic embryogenesis in Japanese black pine (Pinus thunbergii Parl.) | |
| CA2473012C (en) | Development and stratification of pine somatic embryos using a liquid system | |
| AU2003231584B2 (en) | Methods for producing conifer somatic embryos | |
| AU2004202738B2 (en) | Use of abscisic acid in somatic embryogenesis of pine trees | |
| RU2333633C2 (ru) | Способ получения высоких урожаев зиготоподобных семядольных зародышей сосны с использованием сред, содержащих дисахарид и глюкозу (варианты) | |
| NZ533575A (en) | Use of abscisic acid in somatic embryogenesis of pine trees |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 121159 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |