FI121177B

FI121177B - Menetelmiä männyn somaattisten alkioiden synkronoidun populaation valmistamiseksi

Info

Publication number: FI121177B
Application number: FI20031639A
Authority: FI
Inventors: Bonnie Larson; Pramod K Gupta; Diane Holmstroem
Original assignee: Weyerhaeuser Co
Priority date: 2002-11-14
Filing date: 2003-11-11
Publication date: 2010-08-13
Also published as: NZ527348A; CA2435337A1; FI20031639A0; FI20031639A; CA2435337C; BR0303441A; SE0302963D0; US20040096970A1; SE527468C2; SE0302963L; US7888099B2

Description

Menetelmiä männyn somaattisten alkioiden synkronoidun populaation tuottamiseksi

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö koskee menetelmiä kasvialkioiden valmistami-5 seksi in vitro -olosuhteissa, ja mahdollisesti kasvien tuottamiseksi näistä kas-vialkioista.

Keksinnön tausta

Havupuiden, kuten mäntyjen ja kuusten, kysyntä puusta valmistettavien tuotteiden valmistamiseksi on yhä lisääntymässä. Tähän ongelmaan on 10 yhdeksi ratkaisuksi ehdotettu halutun ominaisuuden, kuten suuren kasvunopeuden, omaavien puuyksilöiden tunnistamista, ja ylivoimaisten puiden lukuisten geneettisesti identtisten kloonien tuottamista somaattisella kloonauksella.

Somaattinen kloonaus on menetelmä geneettisesti identtisten puiden valmistamiseksi muusta puukudoksesta kuin koiras- ja naaraspuolisista 15 sukusoluista. Yhdessä somaattisen kloonauksen lähestymistavassa kasviku-dosta viljellään aloitusalustalla, joka sisältää hormoneja, kuten auksiineja ja/tai sytokiniinejä, jotka käynnistävät sellaisten embryogeenisten solujen muodostumisen, jotka kykenevät kehittymään somaattisiksi alkioiksi. Tämän jälkeen embryogeenisiä soluja jatkoviljellään ylläpitoalustalla, joka edistää embryo-20 geenisten solujen moninkertaistumista. Tämän jälkeen moninkertaistuneita embryogeenisiä soluja viljellään kypsytysalustassa, joka edistää sellaisten havupuiden somaattisten alkioiden kehittymistä, jotka voidaan esimerkiksi asettaa keinosiemeniin ja istuttaa maahan, jossa ne itävät ja jossa niistä muodostuu havupuuntaimia. Taimet voidaan siirtää kasvatettavaksi kasvupaikkaan, jossa 25 ne sitten kasvavat ja josta ne lopulta korjataan puutavaran tai puusta valmistettujen tuotteiden aikaansaamiseksi.

Sellaisten somaattisten havupuualkioiden tehokkaan muodostumisen stimulointi, jotka kykenevät itämään ja muodostamaan havupuukasveja, muodostaa jatkuvan ongelman havupuiden alkioiden somaattisessa kloonauk-30 sessa. In vitro -olosuhteissa muodostetut havupuiden somaattiset alkiot ovat edullisesti fysikaalisesti ja fysiologisesti samanlaisia kuin havupuiden siemenissä in vivo -olosuhteissa muodostuneet havupuiden tsygoottiset alkiot tai ovat identtiset näiden suhteen. Yksi tietty nimenomainen ongelma, joka vaikuttaa havupuiden somaattiseen embryogeneesiin, on embryogeenisten solujen vil-35 jelmistä peräisin olevien somaattisten alkioiden epäsynkroninen kehittyminen.

2 Tämä kypsymisen epäsynkronisuus johtaa sellaisten viljelmien muodostumiseen, joissa alkiot ovat eri kehitysvaiheissa, mikä vähentää suuresti menetelmän kokonaistehokkuutta. Tarvitaan siten yhä edelleen menetelmiä havupuiden somaattisten alkioiden tuottamiseksi havupuiden embryogeenisistä soluis-5 ta. Esillä olevassa keksinnössä on saatu aikaan menetelmiä, joilla tämä tarve saadaan tyydytettyä.

Keksinnön yhteenveto

Yhdessä kohteessa esillä olevassa keksinnössä on saatu aikaan menetelmiä männyn somaattisten alkioiden synkronoidun populaation tuotta-10 miseksi. Kukin tämän keksinnön mukaisista menetelmistä sisältää vaiheen, jossa männyn embryogeenisiä soluja viljellään synkronointialustassa tai -alustalla, joka sisältää absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainet-ta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu abskisiinihaposta ja gibberelliinistä, jossa absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta on kon-15 sentraatiossa, jonka vaikutuksesta saadaan muodostettua männyn somaattisten alkioiden synkronoitu populaatio.

Joissakin suoritusmuodoissa synkronointialustassa käytettävä ab-sorbenttikoostumus on aktiivihiili. Absorbenttikoostumuksen konsentraatio voi olla noin 0,5 g/l - noin 50 g/l, kuten noin 0,5 g/l - noin 25 g/l tai noin 0,5 g/l -20 noin 5,0 g/l. Abskisiinihapon konsentraatio synkronointialustassa voi olla noin 1,0 mg/l - noin 500 mg/l, kuten noin 1,0 g/l - noin 50 g/l tai noin 0,5 g/l - noin 10 g/l. Yhden tai useamman gibberelliinin konsentraatio synkronointialustassa voi olla noin 0,5 mg/l - noin 500 mg/l. Joissakin suoritusmuodoissa männyn embryogeenistä kudosta viljellään synkronointialustassa tai -alustalla noin 0,5 -25 noin 5 viikon ajan.

Tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä on saatu aikaan männyn somaattisten alkioiden synkronoitu populaatio, jossa vähintään 50 % alkioista on samassa kehitysvaiheessa.

Tämän keksinnön mukaiset menetelmät tuottavat suuremman män-30 nyn somaattisten alkioiden saannon kuin vastaava menetelmä, jossa embryogeenisiä soluja ei viljellä synkronointialustassa. Siten tämän keksinnön mukaisten menetelmien joillakin suoritusmuodoilla saadaan vähintään 100% enemmän männyn somaattisia alkioita (kuten vähintään 150% enemmän männyn somaattisia alkioita, tai kuten vähintään 200 % enemmän männyn somaattisia 35 alkioita) kuin identtisellä menetelmällä männyn somaattisten alkioiden tuottamiseksi, joka ei sisällä vaihetta, jossa männyn embryogeenisiä soluja viljellään 3 synkronointialustassa tai -alustalla, joka sisältää absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu abs-kisiinihaposta ja gibberelliineistä.

Esillä olevan keksinnön mukaiset menetelmät ovat käyttökelpoisia 5 esimerkiksi sellaisten havupuiden somaattisten alkioiden valmistamiseen, joita voidaan luonnehtia edelleen, kuten esimerkiksi geneettisin tai biokemiallisin menetelmin, ja/tai voidaan idättää sellaisten havupuukasvien aikaansaamiseksi, joita voidaan haluttaessa kasvattaa täysikasvuisiksi havupuiksi. Siten tämän keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan esimerkiksi käyttää sellaisten yksittäis-10 ten havupuiden kloonien tuottamiseen, joilla on yksi tai useampi tavoiteltava ominaisuus, kuten suuri kasvunopeus tai aikaisempaa parempi puun laatu. Tämän keksinnön mukaisten somaattisten havupuualkioiden populaatiota voidaan esimerkiksi käyttää sellaisen havupuumetsikön tai -metsän tuottamiseen, jolla on yksi tai useampi tavoiteltava ominaisuus, kuten suuri kasvunopeus tai 15 aikaisempaa parempi puun laatu. Puita voidaan käyttää puutavarasta valmistettujen tuotteiden valmistamiseen.

Edullisen suoritusmuodon yksityiskohtainen kuvaus

Ellei tässä keksinnössä nimenomaan ole määritelty, on kaikilla tässä keksinnössä käytetyillä termeillä sama merkitys kuin mitä sen alan ammattiko-20 kemuksen perusteella, johon esillä oleva keksintö kuuluu.

Tässä keksinnössä termi "embryogeeniset solut" tarkoittaa mitä tahansa soluja, mukaan lukien Coniferales-lahkoon kuuluvasta kasvista peräisin olevia soluja, jotka ovat järjestyneet siten, että ne muodostavat kudoksen tai elimen ja kykenevät tuottamaan yhden tai useamman männyn somaattisen al-25 kion tämän keksinnön mukaisten menetelmien mukaan suoritetun käsittelyn jälkeen. Siten termiin "embryogeeniset solut" sisältyvät esimerkiksi havupuun alkiosuspensorisolukkomassat.

Termi "sirkkalehdellinen alkio" tarkoittaa tässä keksinnössä alkiota, jossa on vähintään yksi sirkkalehti. Termi "varhaisalkio" tarkoittaa alkiota, jossa 30 ei ole yhtään sirkkalehteä.

Ellei toisin ole mainittu, ovat kaikki konsentraatioarvot, jotka on esitetty prosentteina, paino/tilavuus-prosentteja.

Esillä olevassa keksinnössä on yhdessä kohteessa saatu aikaan menetelmiä männyn somaattisten alkioiden synkronoitujen populaatioiden val-35 mistamiseksi. Menetelmät sisältävät vaiheen, jossa männyn embryogeenisiä soluja viljellään synkronointialustassa tai -alustalla, joka sisältää absorbentti- 4 koostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu abskisiinihaposta ja gibberelliinistä, ja jossa absorbenttikoostu-musta ja vähintään yhtä synkronointiainetta käytetään konsentraatiossa, jonka vaikutuksesta muodostuu männyn somaattisten alkioiden synkronoitu populaa-5 tio. Tämän keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan käyttää synkronoitujen somaattisten alkioiden tuottamiseen mistä tahansa Coniferales-lahkon jäsenestä, kuten Douglaskuusesta, kuusesta, Abies-suvun lajista (esimerkiksi aito-jalokuusesta) ja Pinus-suvun jäsenistä, kuten loblollymännystä (Pinus taeda).

Esimerkki embryogeenisistä soluista, jotka ovat käyttökelpoisia esillä 10 olevaa keksintöä käytettäessä, ovat alkiosuspensorisolukkomassat (ESM-soluk-komassat). ESM-solukkomassoja voidaan valmistaa esimerkiksi siemenestä irrotetuista varhaisalkioista. Tässä menetellään esimerkiksi aloittamalla siementen pinnan steriloinnilla, minkä jälkeen näistä poistetaan varhaisalkiot, joita sitten viljellään induktioalustalla tai -alustassa, joka edistää sellaisten ESM-15 solukkomassojen muodostumista, jotka ovat moninkertaistumassa muodostamalla tytärsoluja ja jakautumalla. Edustava esimerkki induktioalustasta on esillä olevan keksinnön esimerkissä 1 kuvattu BMi-alusta.

Jakautumispolyembryonia (alkiosuspensorisolukkomassan lisääntyminen) jatkuu viljelmissä sen jälkeen kun ne on maljattu kypsytysalustalle, ja 20 uusia alkioita alkaa kehittyä kypsytysalustalla jopa kahdeksasta kymmeneen viikon pituisen viljelyajan jälkeen. Tämän jatkuvan jakautumisen johdosta alkiot eivät yhdellä yksittäisellä maljalla ole vaiheeltaan, muodoltaan, kooltaan tai laadultaan yhdenmukaisia. Tällä yhdenmukaisuuden puuttumisella on heikentävä vaikutus havupuiden somaattisen kloonauksen tehokkuuteen. Esillä ole-25 vassa keksinnössä havupuun embryogeenisten solujen, mukaan lukien ESM-solukkomassojen, synkronoimattoman kypsymisen ongelmaa on ryhdytty ratkomaan viljelemällä alkiosoluja synkronointialustassa tai -alustalla, mikä saa aikaan sen, että suurin osa havupuiden somaattisten alkioiden populaation sisältämistä alkioista käy peräkkäiset kehitysvaiheet läpi yhdessä ja tuottaa 30 synkronoidun populaation, jossa koostuu havupuiden kypsistä somaattisista alkioista, joita voidaan idättää havupuukasvien muodostamiseksi.

Synkronointialusta sisältää absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu abskisiinihaposta ja gibberelliinistä, ja jossa absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synk-35 ronointiainetta käytetään konsentraatiossa, jonka vaikutuksesta saadaan syntymään männyn somaattisten alkioiden synkronoitu populaatio.

5

Synkronointialusta voi olla kiinteä alusta tai nestemäinen alusta. Synkronointialustan osmolaalisuus on tyypillisesti alueella 180 - 400 mM/kg. Synkronointialusta sisältää myös tyypillisesti embryogeenisten solujen kehittymistä ylläpitäviä ravinteita. On tavallisesti haluttua, vaikkakaan ei välttämätön-5 tä, että synkronointialustaan sisällytetään yksinomaiseksi tai pääasiallisimmak-si metaboloitavissa olevaksi sokerin lähteeksi maltoosia. Käyttökelpoiset maltoosi konsentraatiot ovat alueella noin 1 % - noin 2,5 %.

Synkronointialusta sisältää absorbenttikoostumusta. Absorbenttikoostumus voi olla mikä tahansa koostumus, joka ei ole toksinen embryogeenisille 10 soluille konsentraatioissa, joita käytetään esillä olevia menetelmiä käytettäessä, ja joka kykenee absorboimaan alustan sisältämiä kasvua edistäviä hormoneja ja tämän sisältämien kasvisolujen tuottamia toksisia yhdisteitä. Absor-boitunut(eet) hormoni(t) ei(vät) ole saatavilla alustassa tai tämän pinnalla olevien solujen embryogeenisen kasvun edistämiseen; eivätkä absorboituneet 15 toksiinit myöskään kykene vaikuttamaan haitallisesti kasvisoluihin. Tässä yhteydessä termi "absorboida" kattaa absorbenttikoostumuksen ja alustassa olevan yhden tai useamman kasvua edistävän hormonin ja/tai toksiinin väliset kaikenlaiset sellaiset kemialliset tai fysikaaliset vuorovaikutukset, joilla kasvua edistävä(t) hormoni(t) ja/tai toksiinit sitoutuvat absorbentti koostu m ukseen. 20 Tätä keksintöä rajoittamattomia esimerkkejä käyttökelpoisista ab- sorbenttikoostumuksista ovat aktiivihiili, liukoinen polyvinyylipyrrolidoni, liukenematon polyvinyylipyrrolidoni, aktivoitu alumiinioksidi ja silikageeli. Absorbenttikoostumusta voi olla mukana määrä, joka on esimerkiksi 0,1 g/l - 50 g/l. Joissakin suoritusmuodoissa absorbenttikoostumusta on mukana määrä, joka on 25 0,5 g/l - 5 g/l, tai noin 0,5 g/l - noin 1,0 g/l. Tämän keksinnön mukaisten mene telmien niissä suoritusmuodoissa, joissa synkronointialustassa on mukana useampi kuin yksi absorbenttikoostumus, tarkoittavat edellä olevat konsentraa-tioalueet absorbenttikoostumuksen kokonaiskonsentraatiota alustassa.

Synkronointialusta sisältää myös abskisiinihappoa ja/tai vähintään 30 yhtä gibberelliiniä (toisin sanoen kumpaa hyvänsä tai kumpaakin edellä olevaa ainetta).

Abskisiinihappo on seskviterpenoidikasvihormoni, jonka katsotaan olevan osallisena useissa erilaisissa kasvien fysiologisissa ilmiöissä (tätä kysymystä on käsitelty esimerkiksi julkaisussa Milborrow (2001) J. Exp. Botany 52: 35 1145 - 1164; Leung & Giraudat (1998) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.

49: 199- 123). Tämän keksinnön mukaisten menetelmien joissakin suoritus- 6 muodoissa abskisiinihapon konsentraatio synkronointialustassa on väliltä 0,5 mg/l - 500 mg/l. Tämän keksinnön mukaisten menetelmien joissakin suoritusmuodoissa abskisiinihapon konsentraatio synkronointialustassa on väliltä 1 mg/l -100 mg/l. Tämän keksinnön mukaisten menetelmien joissakin suori-5 tusmuodoissa abskisiinihapon konsentraatio synkronointialustassa on väliltä 5 mg/l - 50 mg/l.

Gibberelliinit ovat tällä alalla hyväksyttyjä diterpenoidikasvihormoneja (tätä kysymystä on käsitelty esimerkiksi julkaisussa Krishnamoorthy (1975) Gibberellins and Plant Growth, John Wiley & Sons). Edustavia esimerkkejä 10 gibberelliineistä, jotka ovat käyttökelpoisia esillä olevaa keksintöä käytettäessä, ovat gibberelliinihappo, gibberelliini 4 ja gibberelliini 7, joita kutakin kuvataan esimerkiksi edellä mainitussa Krishnamoorthyn oppikirjassa. Esimerkki käyttökelpoisesta gibberelliinien seoksesta on gibberelliini 4:n ja gibberelliini 7:n seos (tästä käytetään nimitystä gibberelliini 4/7), kuten gibberelliini 4/7, jota myy Ab-15 bott Laboratories -yhtiö, Chicago, Illinois.

Tämän keksinnön mukaisten menetelmien joissakin suoritusmuodoissa gibberelliini(e)n konsentraatio synkronointialustassa on väliltä 0,5 mg/l -500 mg/l. Tämän keksinnön mukaisten menetelmien joissakin suoritusmuodoissa gibberelliini(e)n konsentraatio synkronointialustassa on väliltä 1 mg/l -20 1 00 mg/l. Tämän keksinnön mukaisten menetelmien joissakin suoritusmuodois sa gibberelliini(e)n konsentraatio synkronointialustassa väliltä 5 mg/l - 50 mg/l. Niissä tämän keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa, joissa synkronointialustassa käytetään useampaa kuin yhtä gibberelliiniä, tarkoittavat edellä olevat konsentraatioalueet synkronointialustan sisältämää gibberelliinien 25 kokonaiskonsentraatiota.

Esimerkki sopivasta synkronointialustasta on tämän keksinnön esimerkissä 1 esitetty BM3-alusta.

Tämän keksinnön mukaisten menetelmien joissakin suoritusmuodoissa embryogeenisiä soluja viljellään synkronointialustassa tai -alustalla, 30 joka sisältää absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta, 0,5 - 5 viikon pituinen aika, kuten yhdestä kolmeen viikkoa, tai kuten yhdestä kahteen viikkoa. Tämän keksinnön mukaisten menetelmien joissakin suoritusmuodoissa havupuiden embryogeenisiä soluja viljellään synkronointialustassa tai -alustalla, joka sisältää absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkro-35 nointiainetta, lämpötilassa, joka on 10-30 °C, kuten 15-25 °C, tai kuten 20 -23 °C.

7

Esillä olevassa keksinnössä on joissakin suoritusmuodoissa saatu aikaan menetelmiä männyn somaattisten alkioiden synkronoidun populaation muodostamiseksi, joista menetelmistä kukin sisältää vaiheet, jotka ovat: (a) viljellään embryogeenisiä soluja synkronointialustassa tai -alustalla, joka sisältää 5 absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu abskisiinihaposta ja gibberelliinistä, jossa absorbenttikoostumusta ja synkronointiainetta(ita) käytetään konsentraatiossa, jonka vaikutuksesta muodostuu männyn somaattisten varhaisalkioiden synkronoitu viljelmä; ja (b) viljellään vaiheessa (a) muodostuneita synkronoituja varhaisalkioi-10 ta kypsytysalustassa tai -alustalla männyn sirkkalehdellisten somaattisten alkioiden aikaansaamiseksi.

Embryogeenisiä soluja viljellään synkronointialustassa tai -alustalla yllä kuvatulla tavalla, mistä saadaan varhaisalkioiden synkronoitu populaatio. Synkronoidut varhaisalkiot siirretään kypsytysalustaan synkronoitujen sirkka-15 lehdellisten alkioiden kypsymisen aikaansaamiseksi. Kypsytysalusta on tyypillisesti kiinteä alusta, vaikkakin kypsytysalusta voi olla nestemäinen alusta. Kypsytysalusta sisältää tyypillisesti embryogeenisen kudoksen ylläpidossa tarvittavia ravinteita. Alustaan voidaan sisällyttää embryogeenisen kudoksen tärkeimmäksi tai ainoaksi sokerilähteeksi maltoosia. Käyttökelpoiset maltoosikon-20 sentraatiot ovat alueella noin 1 % - noin 2,5 %.

Sopivat kypsytysalustat eivät tyypillisesti sisällä kasvua edistäviä hormoneja, kuten auksiineja ja sytokiniinejä, mutta nämä voivat sisältää abski-siinihappohormonia. Kun kypsytysalustassa käytetään abskisiinihappoa, niin tätä käytetään tyypillisesti alueelta noin 1 mg/l - noin 200 mg/l olevassa kon-25 sentraatiossa. Kypsytysalusta voi sisältää gellaanihartsia, jota käytetään tyypillisesti korkeintaan noin 0,35-prosenttisessa konsentraatiossa. Kypsytysalusta n osmolaalisuus voidaan säätää halutulla alueella olevaan arvoon, kuten arvoon noin 250 mM/kg - noin 450 mM/kg. Edullinen osmolaalisuus on tyypillisesti 350 mM tai tätä suurempi. Esimerkki sopivasta kypsytysalustasta on tämän 30 keksinnön esimerkissä 1 esitetty BlVU-alusta.

Männyn embryogeenisiä soluja voidaan viljellä kypsytysalustassa tai -alustalla 9-14 viikon pituinen aika, kuten 10 -12 viikkoa, tai kuten noin 12 viikkoa, lämpötilassa, joka on 10-30°C, kuten 15-25°C, tai kuten 20-23 °C.

8

Joissakin suoritusmuodoissa esillä olevassa keksinnössä on saatu aikaan menetelmiä männyn somaattisten alkioiden muodostamiseksi, joista menetelmistä kukin sisältää vaiheet, jotka ovat: (a) viljellään männyn somaattisia soluja induktioalustassa tai -alustalla embryogeenisten solujen aikaansaa-5 miseksi; (b) viljellään vaiheessa (a) valmistettuja embryogeenisiä soluja yl-läpitoalustassa tai -alustalla embryogeenisten solujen moninkertaistamiseksi ja männyn somaattisten varhaisalkioiden muodostamiseksi; (c) synkronoidaan vaiheessa (b) moninkertaistetut männyn somaattiset varhaisalkiot synk-ronointialustassa tai -alustalla, joka sisältää absorbenttikoostumusta ja vä-10 hintään yhtä synkronointiainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu abski-siinihaposta ja gibberelliinistä, ja jossa absorbenttikoostumusta ja synkro-nointiainetta(ita) on kutakin mukana konsentraatiossa, jonka vaikutuksesta saadaan muodostumaan männyn somaattisten varhaisalkioiden synkronoitu viljelmä; ja (d) viljellään vaiheessa (c) synkronoituja männyn somaattisia var-15 haisalkioita kypsytysalustassa tai -alustalla männyn sirkkalehdellisten somaattisten alkioiden synkronoidun populaation aikaansaamiseksi.

Induktioalusta sisältää tyypillisesti epäorgaanisia suoloja ja orgaanisia ravinnemateriaaleja. Induktioalustan osmolaalisuus on tyypillisesti noin 160 mg/kg tai vielä pienempi, mutta se voi olla jopa niinkin suuri kuin 170 mM/kg. 20 Induktioalusta sisältää tyypillisesti kasvuhormoneja. Esimerkkejä hormoneista, joita voidaan sisällyttää induktioalustaan, ovat auksiinit (esimerkiksi 2,4-dikloo-rifenoksietikkahappo (2,4-D)) ja sytokiniinit (esimerkiksi 6-bentsyyliaminopuriini (BAP)). Auksiineja voidaan käyttää esimerkiksi konsentraatiossa, joka on 1 mg/l - 200 mg/l. Sytokiniinejä voidaan käyttää esimerkiksi konsentraatiossa 25 0,1 mg/l -10 mg/l.

Induktioalusta voi sisältää absorbenttikoostumusta erityisesti erittäin suuria kasvuhormonipitoisuuksia käytettäessä. Absorbenttikoostumus voi olla mikä tahansa koostumus, joka ei ole toksinen embryogeenisille soluille kon-sentraatioissa, joita käytetään esillä olevia menetelmiä käytettäessä, ja joka 30 kykenee absorboimaan niitä kasvua edistäviä hormoneja ja kasvisolujen al-kiokehityksensä aikana tuottamia toksisia yhdisteitä, joita alustassa esiintyy. Tätä keksintöä rajoittamattomia esimerkkejä käyttökelpoisista absorbenttikoostumuksista ovat aktiivihiili, liukoinen polyvinyylipyrrolidoni, liukenematon poly-vinyylipyrrolidoni, aktivoitu alumiinioksidi ja silikageeli. Absorbenttikoostumusta 35 voi olla mukana määrä, joka on esimerkiksi noin 0,1 g/l - noin 5 g/l.

9

Esimerkki esillä olevaa keksintöä käytettäessä käyttökelpoisista induktioalustoista on tämän keksinnön esimerkissä 1 esitetty BMi-alusta.

Männyn somaattisia soluja viljellään tyypillisesti induktioalustassa tai -alustalla 6-12 viikon ajan, kuten 8-10 viikon tai kuten noin 8 viikon 5 ajan, lämpötilassa, joka on 10 - 30 °C, kuten 15 - 25 °C tai kuten 20 - 23 °C.

Ylläpitoalusta voi olla kiinteä alusta, tai se voi olla nestemäinen alusta, jota voidaan sekoittaa embryogeenisen kudoksen kasvun ja moninkertaistumisen edistämiseksi. Ylläpitoalustan osmolaalisuus on tyypillisesti induktioalustan osmolaalisuutta suurempi, ja se on tyypillisesti alueelta 180 - 400 mM/kg. Yllä-10 pitoalusta voi sisältää embryogeenisen kudoksen ylläpitoon tarvittavia ravinteita, ja se voi sisältää hormoneja, kuten yhtä tai useampaa auksiinia ja/tai syto-kiniinejä, jotka edistävät embryogeenisen kudoksen solunjakautumista ja kasvua. Hormonien konsentraatiot ylläpitoalustassa ovat tyypillisesti pienemmät kuin näiden konsentraatio induktioalustassa.

15 On yleensä haluttua, vaikkakaan ei välttämätöntä, sisällyttää ylläpi- toalustaan yksinomaiseksi tai pääasialliseksi metaboloitavissa olevaksi sokeri-lähteeksi maltoosia. Esimerkkejä käyttökelpoisista maltoosikonsentraatioista löytyy alueelta noin 1 % - noin 2,5 %. Esimerkki sopivasta ylläpitoalustasta on tässä keksinnössä esimerkissä 1 esitetty BM2-alusta.

20 Männyn embryogeenisiä soluja viljellään tyypillisesti ylläpitoalustas sa tai -alustalla korkeintaan 6 kuukauden ajan jatkoviljelemällä niitä viikoittain lämpötilassa, joka on 10 - 30 °C, kuten 15 - 25 °C tai kuten 20 - 23 °C.

Embryogeeniset solut siirretään ylläpitoalustasta synkronointialus-taan, joka sisältää absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainet-25 ta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu abskisiinihaposta ja gibberelliinistä, jossa absorbenttikoostumusta ja synkronointiainetta(ita) on kutakin mukana konsentraatiossa, jonka vaikutuksesta havupuiden somaattisten alkioiden synkronoitu viljelmä saadaan muodostumaan. Synkronointialustan koostumus voi olla sama kuin yllä olevan kuvauksen mukaisen ylläpitoalustan koostumus, 30 pois suljettuna kasvuhormonit, mutta johon on sisällytetty absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu abskisiinihaposta ja yhdestä tai useammasta gibberelliinistä.

Joissakin tämän keksinnön suoritusmuodoissa absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta voidaan lisätä suoraan ylläpito-35 alustaan, joka sisältää yhtä tai useampaa kasvua edistävää hormonia. Absor-benttikoostumu(k)s(et) sitoo(ovat) alustan sisältämiä kasvua edistäviä hormone- 10 ja niin, että embryogeenisten solujen monin kerta istumisnopeus pienenee, tai moninkertaistuminen pysähtyy kokonaan, ja gibberelliini(t) ja abskisiinihappo edistävät männyn somaattisten alkioiden synkronoidun populaation muodostumista. Siten embryogeenisten solujen moninkertaistuttua halutun määrän 5 voidaan ylläpitoalustaan lisätä absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointia inetta (minkä vaikutuksesta ylläpitoalusta muuttuu synkronointialus-taksi), tai embryogeeniset solut voidaan siirtää synkronointialustaan, joka sisältää absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta, synkronoitujen männyn somaattisten alkioiden muodostamiseksi. Männyn synkronoidut 10 somaattiset alkiot voidaan sitten siirtää kypsytysalustaan synkronoidun sirk-kalehdellisen alkion kehittymisen aikaansaamiseksi, yllä kuvatulla tavalla.

Joissakin suoritusmuodoissa tämän keksinnön mukaisten menetelmien mukaisesti tuotettuja männyn sirkkalehdellisiä somaattisia alkioita viljellään vähintään yhdessä maturaatioalustassa männyn kypsien somaattisten 15 alkioiden muodostamiseksi. Tämän keksinnön mukainen männyn kypsä somaattinen alkio tarkoittaa alkiota, joka kykenee itämään kasviksi.

Maturaatioalusta voi olla nestemäinen tai kiinteä alusta. Maturaatio-alusta voi myös sisältää inkuboitavien sirkkalehdellisten alkioiden ja/tai kypsyvien alkioiden ylläpidolle välttämättömiä ravinteita, ja yhtä tai useampaa ainet-20 ta, joka on tarkoitettu alustan osmolaalisuuden säätämiseen halutulle alueelle. Maturaatioalustan osmolaalisuus on tyypillisesti alueella 250 - 450 mM/kg, kuten noin 350 mM/kg. Alustan pH voidaan myös säätää haluttuun arvoon. Maturaatioalustan pH on tyypillisesti väliltä noin pH 5 - noin pH 8, kuten väliltä noin pH 5 - noin pH 6. Alustaan voidaan sisällyttää pääasiallisimmaksi tai yksinomai-25 seksi metaboloitavissa olevan sokerin lähteeksi maltoosia. Käyttökelpoiset maltoosikonsentraatiot ovat alueella noin 1 % - noin 2,5 %. Maturaatioalusta voi sisältää absorbenttikoostumusta, kuten aktiivihiiltä, yllä induktioalustan kyseessä ollessa kuvatulla tavalla.

Männyn sirkkalehdellisiä somaattisia alkioita viljellään maturaatio-30 alustassa tai -alustalla tyypillisesti 9-14 viikon ajan, kuten 10-12 viikkoa, tai kuten noin 12 viikkoa, lämpötilassa, joka on 10-30°C, kuten 15-25°C, tai kuten 20 - 23 °C.

Joissakin suoritusmuodoissa männyn somaattiset alkiot siirretään stratifikaatioalustaan kylmäkäsittelyn suorittamiseksi ennen idättämistä. Strati-35 fikaatioalusta on tyypillisesti samanlainen kuin kypsytysalusta, mutta siitä puut- 11 tuu abskisiinihappo, eikä se tyypillisesti sisällä polyetyleeniglykolia (PEG). Kuvaava esimerkki stratifikaatioalustasta on esimerkissä 1 esitetty BM5.

Männyn sirkkalehdellisiä somaattisia alkioita viljellään tyypillisesti stratifikaatioalustassa tai -alustalla pimeässä 3 - 6 viikon pituinen aika, kuten 5 noin 4 viikkoa, lämpötilassa, joka on 1 -10 °C, kuten 1 - 8 °C.

Joissakin suoritusmuodoissa tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä saadaan aikaan männyn somaattisten alkioiden synkronoitu populaatio, jossa vähintään noin 50 % alkioista on samassa kehitysvaiheessa. Joissakin suoritusmuodoissa tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä saadaan aikaan 10 synkronoitu männyn somaattisten alkioiden populaatio, jossa vähintään noin 80 % alkioista on samassa kehitysvaiheessa. Joissakin suoritusmuodoissa tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä saadaan aikaan männyn somaattisten alkioiden synkronoitu populaatio, jossa vähintään noin 90 % alkioista on samassa kehitysvaiheessa.

15 Tämän keksinnön mukaiset menetelmät tuottavat suuremman saan non somaattisia mäntyalkioita kuin vastaava menetelmä, jossa embryogeenisiä soluja ei viljellä synkronointialustassa. Esimerkiksi esimerkissä 1 esitetyn suoritusmuodon mukaisesti saanto on tyypillisesti noin 90 somaattista havupuualkio-ta kutakin maturaatioalustassa viljeltävää 100 mg:n suuruista (tuorepaino) kas-20 vikudoserää kohti. Tämä muodostaa jyrkän vastakohdan saannolle, joka on noin 40 somaattista havupuualkiota kutakin maturaatioalustassa viljeltävää 100 mg:n suuruista kasvikudoserää (tuorepaino) kohti, kun käytetään identtistä menetelmää, joka ei sisällä vaihetta, jossa männyn embryogeenisiä soluja viljellään synkronointialustassa tai -alustalla, joka sisältää absorbenttikoostumusta ja vä-25 hintään yhtä synkronointiainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu abskisii-nihaposta ja gibberelliineistä. Siten joissakin tämän keksinnön mukaisten menetelmien suoritusmuodoissa saanto on vähintään 100 % enemmän somaattisia havupuualkioita (kuten esimerkiksi vähintään 150% enemmän somaattisia havupuualkioita, tai kuten esimerkiksi vähintään 200 % enemmän somaattisia 30 havupuualkioita, tai kuten esimerkiksi 100%-200% enemmän somaattisia havupuualkioita) kuin identtisessä menetelmässä somaattisten havupuualkioi-den tuottamiseksi, joka ei sisällä vaihetta, jossa havupuun embryogeenisiä soluja viljellään synkronointialustassa tai -alustalla, joka sisältää absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta, joka on valittu ryhmästä, joka 35 koostuu abskisiinihaposta ja gibberelliineistä.

12 Tämän keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan käyttää esimerkiksi sellaisten yksittäisten männyn kloonien tuottamiseen, jotka omaavat yhden tai useamman tavoiteltavan ominaisuuden, kuten suuren kasvunopeuden. Siten esillä olevan keksinnön yhdessä kohteessa on saatu aikaan menetelmiä män-5 nyn geneettisesti identtisten, kypsien somaattisten alkioiden populaation tuottamiseksi. Tämän keksinnön tämän kohteen mukaisista menetelmistä sisältää kukin vaiheen, jossa embryogeenisiä soluja viljellään synkronointialustassa, joka sisältää absorbenttikoostumusta ja vähintään yhtä synkronointiainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu abskisiinihaposta ja vähintään yhdestä 10 gibberelliinistä. Mitä tahansa tässä keksinnössä kuvatuista menetelmistä voidaan käyttää männyn geneettisesti identtisten, kypsien somaattisten alkioiden populaatioiden tuottamiseen.

Vielä yhdessä tämän keksinnön kohteessa on saatu aikaan männyn kypsiä somaattisia alkioita, jotka on valmistettu käyttäen tämän keksinnön mu-15 kaisia menetelmiä. Männyn kypsiä somaattisia alkioita, jotka on tuotettu käyttäen tämän keksinnön mukaisia menetelmiä, voidaan haluttaessa mahdollisesti idättää havupuukasvien tuottamiseksi, joita voidaan kasvattaa havupuiksi. Vaihtoehtoisesti kypsiä alkioita voidaan sijoittaa keinosiemeniin niiden myöhempää idätystä varten. Männyn kypsiä somaattisia alkioita voidaan 20 idättää esimerkiksi kiinteän idätysalustan, kuten tässä keksinnössä esimerkissä 1 esitetyn alustan, BM6-alustan, pinnalla. Idätetyt kasvit voidaan siirtää maahan niiden kasvattamiseksi edelleen. Esimerkiksi idätettyjä kasveja voidaan istuttaa maahan kasvihuoneessa ja antaa kasvaa ennen siirtämistä ulkona sijaitsevaan kasvupaikkaan. Männyn kypsille somaattisille alkioille annetaan tyypil-25 lisesti itämisen stimuloimiseksi valoa. Tämän keksinnön mukaisten menetelmien kaikki vaiheet suoritetaan idätystä lukuun ottamatta tyypillisesti pimeässä.

Seuraavat esimerkit kuvaavat ainoastaan nykyisin ajateltua parasta tapaa keksinnön käyttämiseksi, mutta niiden ei ole katsottava rajoittavan kek-30 sintöä.

13

Esimerkki 1 Tämä esimerkki esittää edustavaa menetelmää somaattisten män-nynalkioiden valmistamiseksi loblollymännystä.

Naaraspuolisia gametofyyttejä sisältäviä tsygoottisia alkioita poistet-5 tiin siemenistä neljästä viiteen viikkoa hedelmöittymisen jälkeen. Siemenkuoret poistettiin mutta alkioita ei preparoitu irti ympäröivästä gametofyytistä muulla tavoin kuin nukelluspään irrottamiseksi. Käpyjä varastoitiin 4 °C:ssa siihen asti, kunnes niitä käytettiin. Välittömästi ennen epäkypsien alkioiden poistamista siemenet steriloitiin käyttäen esipesua ja detergenttikäsittelyä, minkä jälkeen 10 niitä steriloitiin kymmenen minuuttia 15-prosenttisessa hhC^ssa. Ympit pestiin huolellisesti steriilillä tislatulla vedellä kunkin käsittelyn jälkeen.

Taulukoissa 1 ja 2 esitetään männyn somaattisten alkioiden tuottamiseen käyttökelpoisten alustojen koostumukset.

14

Taulukko 1

Pinus taeda -perusalusta (BM)

Ainesosa__Konsentraatio (mg/l)_ NH4NO3 150,0 KNOs 909,9 KH2PO4 136,1

Ca(N03)2-4 H20 236,2

CaCI2-4 H20 50,0

MgS04-7 H20 246,5

Mg(N03)2-6 H20 256,5

MgCI2-6 H20 50,0

Kl 4,15 H3BO3 15,5

MnS04H20 10,5

ZnS04-7H20 14,4

NaMo04-2 H20 0,125

CuS04-5 H20 0,125 C0CI26H2O 0,125

FeS04-7 H20 27,86

Na2EDTA 37,36

Maltoosi 30 000 myoinositoli 200 kasaminohapot 500 L-glutamiini 1 000 tiamiini-HCI 1,00 pyridoksiini-HCI 0,50 nikotiinihappo 0,50

Glysiini 2,00

Gelrite+ 1 600 pH säädetty arvoon 5,7__ +käytetään, mikäli halutaan kiinteää alustaa.

15

Taulukko 2

Eri vaiheiden käsittelyihin tarkoitettujen alustojen koostumus_ BMrinduktioalusta BM + 2,4-D (15 μΜ) + kinetiini (2 μΜ) + BAP (2 μΜ).

BM2-ylläpitoalusta BM + 2,4-D (5 μΜ) + kinetiini (0,5 μΜ) + BAP (0,5 μΜ)

Haluttaessa kiinteää alustaa lisätään Gelriteä (1 600 mg/l).

BM3- BM + 250 mg/l aktiivihiiltä + 10 mg/l abskisiinihappoa + synkronointialusta 10 mg/l GA4/7:ää. Haluttaessa kiinteää alustaa lisätään

Gelriteä (1 600 mg/l).

BM4-kypsytysalusta BM + 25 mg/l abskisiinihappoa + 13% PEG-8000:a + 800 mg/l lisättyä myoinositolia + 0,1 % aktiivihiiltä. Lisätään seuraava aminohapposeos: L-proliini (100 mg/l), L-asparagiini (100 mg/l), L-arginiini (50 mg/l), L-alaniini (20 mg/l) ja L-seriini (20 mg/l). Haluttaessa kiinteää alustaa lisätään Gelriteä (2 500 mg/l).

BM5- BM4j jota on modifioitu jättämällä pois abskisiinihappo stratifikaatioalusta ja PEG-8000. Maltoosipitoisuus on nostettu arvoon 2,5 %. FeS04 (7 H20:n pitoisuutta on pienennetty arvoon 13,9 mg/l ja Na2EDTA:n pitoisuutta pienennetty arvoon 18,6 mg/l. Haluttaessa kiinteää alustaa lisätään Gelriteä (2500 mg/l).

BM6-idätysalusta BM, jota on modifioitu käyttämällä maltoosin tilalla 2- prosenttista sakkaroosia. Myoinositolin pitoisuus on laskettu arvoon 100,0 mg/l, glutamiinin ja kasaminohappo-jen pitoisuus on pienennetty arvoon 0,0 mg/l. FeS04 (7 H20:n pitoisuus on pienennetty arvoon 13,9 mg/l ja Na2EDTA:n pitoisuus pienennetty arvon 18,6 mg/l. Seokseen lisätään agaria pitoisuuteen 0,8 % ja aktiivi-_hiiltä pitoisuuteen 0,25 %._

Induktio: Steriilit gametofyytit, joissa alkiot olivat ehyet, asetettiin kiinteän BMi-viljelyalustan pinnalle ja pidettiin ympäristössä, jossa lämpötila oli 22 - 25 °C ja jossa fotoperiodina käytettiin 24 tunnin pitoa pimeässä 3 -5 5 viikon ajan. Kesto on riippuvainen viljeltävänä olevasta tietystä nimenomai sesta genotyypistä. Tämän ajan kuluttua umpeen on muodostunut alkuperäisiin ymppeihin assosioitunutta valkeaa limaista solukkomassaa. Mikroskopointi 16 paljastaa tyypillisesti useita solukkomassaan assosioituneena olevia varhaisalkioita. Näille on tavallisesti tunnusomaista, että niillä on pitkä ohutseinämäinen suspensori, johon assosioituu pieni alkiopää, jossa on tiheä sytoplasma ja suuret tumat.

5 Induktioalustan osmolaalisuus voi joissakin tapauksissa olla jopa niinkin suuri kuin 170 mM/kg. Se on tavallisesti noin 160 mM/kg tai jopa alhaisempi (kuten 150 mM/kg).

Ylläpito ja moninkertaistaminen: Induktiovaiheessa muodostuneista solukkomassoista poistetut varhaisalkiot asetettiin ensin geeliytetyn BM2-10 ylläpito-ja moninkertaistamisalustan pinnalle. Tämä poikkeaa induktioalustasta siinä suhteessa, että kasvuhormonien (sekä auksiinien että sytokiniinien) pitoisuuksia on pienennetty vähintään yhden kokonaisen kertaluokan verran. Tämän alustan osmolaalisuus kohotettiin tyypillisesti induktioalustan osmolaali-suudesta arvoon noin 180 mM/kg tai tätä korkeammaksi (tyypillisesti alueelle 15 noin 180 - 400 mM/kg Pinus taedan kyseessä ollessa) nostamalla myoinosito-lin konsentraatio arvoon 0,5 % paino/tilavuus. Lämpötila ja fotoperiodi olivat taaskin 22-25°C ja 24 tunnin pimeys. Alkioita viljeltiin ensin 12-14 päivää kiinteän BM2-alustan pinnalla, minkä jälkeen ne siirrettiin nestemäiseen alustaan jatkoviljeltäväksi edelleen. Tämän nestemäisen alustan koostumus on 20 sama kuin BM2:lla mutta siitä puuttuu geeliyttämisaine. Alkiot vastasivat kiinteällä alustalla suoritetun ylläpitovaiheen lopussa ulkonäöltään tyypillisesti induk-tiovaiheesta peräisin olevia alkioita. Nestemäiseen ylläpitoalustaan on 5 - 6 viikoittaisen jatkoviljelyn jälkeen muodostunut pitkälle edistyneitä varhaisalkioita. Näille ovat tunnusomaisia sileät alkiopäät, joiden on arvioitu sisältävän tyypilli-25 sesti yli 100 yksittäistä solua ja joissa on useita suspensoreita.

Synkronointi: Varhaisalkiot siirrettiin synkronoitujen varhaisalkioiden muodostamiseksi induktioalustasta tai ylläpitoalustasta nestemäiseen tai kiinteään synkronointialustaan BM3 kahden viikon ajaksi. Synkronointialustan koostumus on sama kuin BM2:lla mutta siitä puuttuvat hormonit ja se sisältää 30 aktiivihiiltä, abskisiinihappoa ja gibberelliinejä.

Alkion kypsyminen: Synkronoidut varhaisalkiot siirrettiin kiinteän kyp-sytysalustan pinnalle. Kypsytysalusta on sellainen, että siinä joko ei ole lainkaan kasvuhormoneja tai niitä on ainoastaan hyvin pienissä konsentraatioissa. Alustaan sisällytetään jatkokypsymisen edistämiseksi tyypillisesti abskisiini-35 happoa. Tähän alustaan on lisäksi edullista sisällyttää absorbenttikoostumusta. Absorbenttikoostumus voidaan valita useiden pinta-alaltaan suurista ja/tai huo- 17 koskooltaan kontrolloiduista kemiallisista materiaaleista, kuten aktiivihiilestä, polyvinyylipyrrolidonin liukoisista ja liukenemattomista muodoista, aktivoidusta alumiinioksidista ja silikageelistä. Absorbenttikoostumusta on tavallisesti mukana konsentraatiossa, joka on noin 0,1 - 5 g/l, tavallisemmin noin 0,25-5 2,5 g/l. Gellaanihartsia sisällytettiin noin 0,25-prosenttiseen konsentraatioon.

Tämän kypsytysalustan osmoottista potentiaalia voidaan kohottaa huomattavasti ylläpitoalustan osmoottista potentiaalia korkeammaksi. On havaittu edulliseksi pitää osmolaalisuus jopa niinkin suurena kuin 350 mM/kg tai vielä tätäkin suurempana. Kypsymisen annetaan jatkua edullisesti täydellises-10 sä pimeydessä 22 - 25 °C:n lämpötilassa siihen asti, kunnes alustalle on kehittynyt pitkänomaisia sirkkalehdellisiä alkioita. Kypsytysaika on tyypillisesti useita viikkoja, kuten 10-12 viikkoa.

Stratifikaatio: Sirkkalehdelliset alkiot irtaannutettiin ja siirrettiin strati-fikaatioalustaan BM5. Tämä alusta on samanlainen kuin kypsytysalusta mutta 15 siitä puuttuvat abskisiinihappo, PEG-8000 ja gellaanihartsi. Alkioita viljeltiin stratifikaatioalustalla noin 1 °C:n ja noin 10 °C:n välillä pimeässä kolmesta kuuteen viikon välisen ajan.

Kuivaaminen: Kypsät alkiot, jotka olivat yhä suodatinpaperialustal-laan, nostettiin alustalta ja asetettiin suljettuun säiliöön kylläisen K2S04-liuok-20 sen päälle 97-prosenttiseen suhteelliseen kosteuteen noin kolmen viikon ajaksi.

Idätys: Kuivatut kypsät alkiot hydrattiin uudelleen asettamalla ne, samalla kun ne olivat vielä suodatinpaperialustalla, noin 24 tunnin ajaksi nestemäisellä idätysalustalla kyllästetylle alustalle. Tämän jälkeen alkiot asetettiin yksitellen kiinteälle BM6-alustalle niiden idättämiseksi. Tämä on perusalusta, 25 josta puuttuvat kasvuhormonit ja jota on modifioitu vähentämällä sakkaroosin, myoinositolin ja orgaanisen typen määrää. Alkioita inkuboitiin BM6-alustalla noin 6 - 8 viikkoa ympäristöolosuhteissa, joissa käytettiin 23 - 25 °C:n lämpötilaa ja valoperiodina 16 tuntia valossa - 8 tuntia pimeässä, kunnes tulokseksi saaduilla taimilla on hyvin kehittynyt alkeisjuuri ja sirkkavarsi ja vihreä sirkka-30 lehtirakenne ja epikotyyli.

Pienentyneen hiilihydraattikonsentraation johdosta idätysalustan osmoottinen potentiaali on pienentynyt vielä alle sen, mitä tämä on kypsytysalus-tassa. Tämä on tavallisesti alle noin 150 mM/kg (kuten noin 100 mM/kg).

18

Esimerkki 2 Tässä esimerkissä esitetään niitä vaikutuksia, joita ennen kypsytys-vaihetta suoritetuilla embryogeenisten solujen käsittelyillä, joissa käytettiin ab-sorbenttikoostumuksia, abskisiinihappoa ja/tai gibberelliinejä, oli loblollymän-5 nyn (Pinus taeda) somaattisten alkioiden kehittymisen synkronoitumiseen.

Naaraspuolisia gametofyyttejä sisältävät tsygoottiset alkiot poistettiin genotyypin B ja genotyypin A siemenistä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Induktio-ja ylläpitovaiheet olivat esimerkissä 1 kuvattujen vaiheiden mukaiset.

Absorbenttikoostumuksia, abskisiinihappoa ja/tai gibberelliinejä käyt-10 täen suoritettujen käsittelyjen vaikutusten tutkimiseksi suoritettiin 100mg:lle (tuorepaino) embryogeenisiä soluja kaksi viikkoa ennen niiden siirtoa kypsy-tysalustalle seuraavat käsittelyt, ja kehittymisen annettiin jatkua esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, ja nämä käsittelyt olivat: kontrolli: alkiot jäivät normaaliin ylläpitoalustaan, joka sisälsi hor-15 moneja (2,4-D, kinetiini ja BAP, katso esimerkki 1); käsittely 1: alkiot siirrettiin ylläpitoalustaan, jossa ei ollut hormoneja ja joka sisälsi 250 mg/l aktiivihiiltä (synkronointialusta 1); käsittely 2: alkiot siirrettiin ylläpitoalustaan, jossa ei ollut hormoneja ja joka sisälsi 1 mg/l abskisiinihappoa (synkronointialusta 2); 20 käsittely 3: alkiot siirrettiin ylläpitoalustaan, jossa ei ollut hormoneja ja joka sisälsi 250 mg/l aktiivihiiltä ja 5 mg/l abskisiinihappoa (synkronointialusta 3); käsittely 4: alkiot siirrettiin ylläpitoalustaan, jossa ei ollut hormoneja ja joka sisälsi 5 mg/l gibberelliiniä GA4/7 (synkronointialusta 4); 25 käsittely 5: alkiot siirrettiin ylläpitoalustaan, jossa ei ollut hormoneja ja joka sisälsi 10 mg/l gibberelliiniä GA4/7 (synkronointialusta 5); käsittely 6: alkiot siirrettiin ylläpitoalustaan, jossa ei ollut hormoneja ja joka sisälsi 250 mg/l aktiivihiiltä ja 10 mg/l gibberelliiniä GA4/7 (synkronointialusta 6); 30 käsittely 7: alkiot siirrettiin ylläpitoalustaan, jossa ei ollut hormoneja ja joka sisälsi 250 mg/l aktiivihiiltä, 10 mg/l abskisiinihappoa ja 10 mg/l gibberelliiniä GA4/7 (synkronointialusta 7, BM3).

Varhaisalkioiden viljelmiä käsiteltiin yhdellä kahdeksasta käsittelystä kahden viikon ajan ennen niiden siirtoa kypsytysalustaan esimerkissä 1 kuva-35 tulla tavalla.

19 Käsittelyjen vaikutukset alkioiden kehittymiseen määritettiin 2 viikon kuluttua. Kummankin tutkitun genotyypin osalta kontrolliviljelmissä tapahtui parhaillaan jakautumista useaan osaan, kasvua ja alkiosuspensorisolukko-massojen muodostumista. Viljelmät sisälsivät suuria kokkareita ja suuria al-5 kiopäitä. Alkioiden havaittiin olevan eri vaiheissa, eikä viljelmässä esiintynyt synkronoitumista.

Aktiivihiilen lisääminen ylläpitoalustaan käsittelyssä 1 (synkronoin-tialusta 1) hidasti jakautumispolyembryoniaa mutta teki silti mahdolliseksi joidenkin alkioiden irtaantumisen. Alkiot lähtivät kuitenkin kehittymään ennenai-10 kaisesti, erityisesti genotyypin B kyseessä ollessa. Pienen abskisiinihappokon-sentraation lisääminen ylläpitoalustaan (synkronointialusta 2) inhiboi alkioiden ennenaikaista kehittymistä, mutta ei edistänyt alkioiden irtaantumista. Alkioiden havaittiin olevan monissa eri kehitysvaiheissa. Sekä aktiivihiilen että abskisiini-hapon lisääminen (synkronointialusta 3) inhiboi alkioiden ennenaikaista kehit-15 tyrnistä ja vihertymistä, mutta teki mahdolliseksi alkioiden irtaantumisen, ja tällä käsittelyllä havaittiin alkioiden koon olevan viljelmissä yhdenmukaisempia.

Pienen gibberelliinikonsentraation lisääminen (synkronointialusta 4) inhiboi myös alkioiden ennenaikaista kehittymistä ja vihertymistä, mutta alkioiden havaittiin olevan monissa eri vaiheissa. Kun alustaa lisättiin suurempi gib-20 berelliinikonsentraatio (synkronointialusta 5), niin tämä johti alkioiden viherty-miseen.

Aktiivihiilen ja pienen gibberelliinikonsentraation lisääminen viljelmiin (synkronointialusta 6) inhiboi alkioiden ennenaikaista kehittymistä ja vihertymistä, ja johti kooltaan yhdenmukaisempiin alkioihin ja suurempaan irtaantu-25 misasteeseen kuin mitä havaittiin kontrolliviljelmissä. Lopuksi abskisiinihappoa, gibberelliinejä ja aktiivihiiltä sisältävän yhdistelmän lisääminen (synkronointialusta 7) inhiboi alkioiden ennenaikaista kehittymistä ja vihertymistä, edistäen irtaantumista ja viljelmien synkronoitumista. Näissä viljelmissä olevat alkiot olivat kooltaan erittäin yhdenmukaiset kontrollialkioihin verrattuna.

30 Nämä tulokset osoittavat, että varhaisalkiot on mahdollista saada ir taantumaan ja kasvamaan yhdenmukaisiksi ennen niiden siirtämistä kypsy-tysalustalle esikäsittelemällä viljelmiä synkronointialustassa, joka sisältää aktiivihiiltä ja vähintään toista abskisiinihapon ja gibberelliinin joukosta. Tämä käsittely synkronoi sirkkalehdellisen alkion kypsymisen ja maturaation.

Claims

1. Menetelmä männyn somaattisten alkioiden synkronoidun populaation valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa 5 a) varhaisalkioisia männyn embryogeenisiä soluja viljellään kypsy- tysalustassa tai -alustalla, joka sisältää männyn embryogeenisten solujen kehittymistä ylläpitäviä ravinteita, b) vaiheesta a) saatuja varhaisalkioisia männyn embryogeenisiä soluja viljellään noin 0,5 - noin 5 viikon ajan sykronointialustassa tai -alustalla, jo- 10 ka sisältää absorbenttikoostumusta ja abskisiinihappoa, tunnettu siitä, että absorbenttikoostumus ja abskisiinihappo ovat läsnä konsentraatiossa, jonka vaikutuksesta saadaan aikaan varhaisalkioisten männyn somaattisten alkioiden synkronoitu populaatio, jolloin vähintään 50 % varhaisalkioisista männyn somaattisista alkioista synkronoidussa populaatiossa on samassa kehitysvai-15 heessaja c) vaiheesta b) saatu varhaisalkioisten männyn somaattisten alkioiden synkronoitu populaatio siirretään kehitysalustalle synkronoidun sirkkaleh-dellisen alkion kehittämiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 20 että absorbenttikoostumus on valittu ryhmästä, joka koostuu aktiivihiilestä, liukoisesta polyvinyylipyrrolidonista, liukenemattomasta polyvinyylipyrrolidonista, aktivoidusta alumiinioksidista ja silikageelistä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että absorbenttikoostumus on aktiivihiili.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että absorbenttikoostumuksen konsentraatio synkronointialustassa on noin 0,5 g/l - noin 50 g/l.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että absorbenttikoostumus on aktiivihiili, ja aktiivihiiltä on mukana synkronoin- 30 tialustassa alueelta noin 0,1 g/l - noin 5 g/l olevassa konsentraatiossa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että absorbenttikoostumus on aktiivihiili, ja aktiivihiiltä on mukana synkronointialustassa alueelta noin 0,5 g/l - noin 1 g/l olevassa konsentraatiossa.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 35 että vaiheen b) synkronointialusta sisältää gibberelliiniä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että gibberelliiniä on mukana synkronointialustassa konsentraatiossa, joka on noin 0,5 mg/l - noin 500 mg/l.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 5 että gibberelliiniä on mukana synkronointialustassa konsentraatiossa, joka on noin 1,0 mg/l - noin 100 mg/l.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että abskisiinihappoa on mukana synkronointialustassa konsentraatiossa, joka on noin 1,0 mg/l - noin 500 mg/l.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että abskisiinihappoa on mukana synkronointialustassa konsentraatiossa, joka on noin 0,5 mg/l - noin 20 mg/l.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että varhaisalkioisia männyn embryogeenisiä soluja viljellään synkronointialus- 15 tässä tai -alustalla ajan, joka on noin 1 viikko - noin 3 viikkoa.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että varhaisalkioisia männyn embryogeenisiä soluja viljellään synkronointialustassa tai -alustalla ajan, joka on noin 1 viikko - noin 2 viikkoa.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 20 että synkronointialustan osmolaalisuus on noin 90 mM/kg - noin 300 mM/kg.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että synkronointialustan pH on noin 5 - noin 6.

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että loblollymännyn somaattisia alkioita valmistetaan loblollymännyn embryo- 25 geenisistä soluista.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että varhaisalkioisten männyn somaattisten alkioiden synkronoidussa populaatiossa vähintään 75 % alkiosta on samassa kehitysvaiheessa.