SE527468C2

SE527468C2 - Förfarande för framställning av somatiska barrträdsembryon

Info

Publication number: SE527468C2
Application number: SE0302963A
Authority: SE
Inventors: Pramod K Gupta; Diane Holmstrom; Bonnie Larson
Original assignee: Weyerhaeuser Co
Priority date: 2002-11-14
Filing date: 2003-11-11
Publication date: 2006-03-14
Also published as: NZ527348A; US7888099B2; CA2435337A1; SE0302963L; CA2435337C; US20040096970A1; SE0302963D0; FI121177B; BR0303441A; FI20031639A0; FI20031639A

Description

0 00 0 00 0 0 000 - 0 00 0 0 0 0 0 00 0000 00 nun: 00 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 l 0 C 00 0 10 15 20 25 30 35 växt och slutlig skörd för erhållande av timmer eller produkter erhållna fràn trä.

Ett kontinuerligt problem med somatisk kloning av barrträdsembryon är stimulering av effektiv bildning av somatiska barrträdsembryon i stånd att gro för erhållande av barrträdsplantor. Företrädesvis är in vitro bildade somatiska barrtrâdsembryon fysikaliskt och fysiologiskt likartade, eller identiska, med zygotiska barrtrâdsem- bryon som bildats in vivo i barrträdsfrön.

Ett särskilt problem som påverkar somatisk barrträds- embryogenes är den asynkrona utvecklingen av somatiska embryon från odlingar av embryogena celler. Denna asyn- krona tendens av utvecklingsresultaten hos odlingar, i vilka embryon är vid olika utvecklingsstadier, reducerar förferendete tetele effektivitet mycket. net föreligger därför ett fortsatt behov av förfaranden för framställ- ning av somatiska barrträdsembryon med utgångspunkt från embryogena barrträdsceller. Med föreliggande uppfinning tillhandahålls förfaranden som uppfyller detta behov.

Sammanfattning av uppfinningen I en aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfin- ning förfaranden för framställning av en synkroniserad population av somatiska barrträdsembryon. Förfarandena enligt uppfinningen inkluderar vart och ett steget att odla embryogena barrträdsceller i eller på ett synkroni- seringsmedium innefattande en absorbentkomposition och åtminstone ett synkroniseringsmedel, valt från den grupp som består av abskisinsyra och en gibberellin, varvid absorbentkompositionen och nämnda åtminstone ett synk- roniseringsmedium föreligger vid en koncentration som är effektiv för att framställa en synkroniserad population av somatiska barrtràdsembryon.

I vissa utföringsformer âr absorbentkompositionen i synkroniseringsmediet aktiverat trâkol. Absorbentkomposi- tionens koncentration kan vara från ca 0,5 g/l till ca 50 g/l, såsom från ca 0,5 g/l till ca 25 g/l eller från ca 0,5 g/l till ca 5,0 g/l. Koncentrationen abskisinsyra i .I IÛ-Ü O. OC .I II QIO' Û o o o o o o o o o o o o o o o o o o ooo ooo o 0000 0 o o o o o o o o o o noob oo oo oo oooo oo o o o 10 15 20 25 30 35 synkroniseringsmediet kan vara från ca 1,0 mg/l till ca 500 mg/l, såsom från ca 1,0 g/l till ca 50 g/1 eller från ca 0,5 g/l till ca 10 g/l. Koncentrationen av en eller flera gibberelliner i synkroniseringsmediet kan vara från ca 0,5 mg/l till ca 500 mg/l. I vissa utföringsformer är den embryogena barrträdsvävnaden odlad i eller på synkro- niseringsmediet under en tidsperiod från ca 0,5 veckor till ca 5 veckor.

Förfarandena enligt uppfinningen åstadkommer en synkroniserad population av somatiska barrträdsembryon.

Vissa utföringsformer av förfarandena enligt uppfinningen åstadkommer en synkroniserad population av somatiska barrträdsembryon i vilken minst 50% av embryona är i samma utvecklingsstadium.

Förfarandena enligt uppfinningen ger ett högre ut- byte av somatiska barrtràdsembryon än ett ekvivalent förfarande i vilket de embryogena cellerna inte odlas i ett synkroniseringsmedium. Några utföringsformer av för- farandena enligt uppfinningen ger sålunda åtminstone 100% fler somatiska barrtrådsembryon (såsom åtminstone 150% fler somatiska barrträdsembryon eller såsom åtminstone 200% fler somatiska barrtrådsembryon) än ett identiskt förfarande för framställning av somatiska barrträdsem- bryon som inte innefattar steget att odla somatiska embryogena celler i eller på ett synkroniseringsmedium som innefattar en absorbentkomposition och åtminstone ett synkroniseringsmedel, valt från den grupp som består av abskisinsyra och gibberelliner.

Förfarandena enligt föreliggande uppfinning âr an- vändbara för t ex framställning av somatiska barrträds- embryon som kan karaktäriseras ytterligare, såsom med hjälp av genetiska eller biokemiska medel, och/eller kan underkastas groning för erhållande av barrtrâdsplantor som, om så önskas, kan odlas till mogna barrtråd. Sålunda kan t ex förfarandena enligt uppfinningen användas för framställning av kloner av individuella barrträd med en eller flera önskvärda egenskaper, såsom hög tillväxt- 2 6 0 -ï C 3 ~ 0 n? .ll : -1 V : __!»IO0J.'§4.äf1.í Sat iønïf "xfELRH COMPANY FPiﬁSFI-INY' 'DEPARTFMEINT CH då? Wlixll-:ïfr Lbirafïarzxi 1j¿.*\_!=:E\2^ J. z) lift 94 I;\2 1 0 04 94 3 Applífreut iont extïoïrxrs :factor MWG 2 00 i-- G3 ~ 1 1 l . ' cc 0 0 0 0000 0 0 0 0000 0 0 00 00 000 00 00 g 000 000 C O I OO I 00 0000 00 00 0 00 0000 00 0 0 0 0 0 0 n 0 0 0 0 0 00 0 10 15 20 25 30 35 hastighet eller förbättrad träkvalitet. En population av somatiska barrträdsembryon enligt uppfinningen kan t ex användas för framställning av ett bestånd eller en skog av barrträd med en eller flera önskvärda egenskaper, så- som hög tillväxthastighet eller förbättrad träkvalitet.

Träden kan användas för framställning av träprodukter.

Detaljerad beskrivning av den föredragna utföringsformen Såvida inget annat specifikt definieras häri har samtliga här använda uttryck samma innebörd som de skulle ha för en fackman inom området för föreliggande upp- finning.

De häri använda uttrycken ”embryogena celler” avser vilken cell som helst, inbegripet celler som år anordnade för att bilda en vävnad eller ett organ som härletts från en växt av familjen Coniferales, som är i stånd att fram- ställa en eller flera somatiska barrträdsembryon vid be- handling med hjälp av förfarandena enligt uppfinningen.

Termen ”embryogena celler” inkluderar t ex embryonala barrträdssuspensormassor.

Det häri använda uttrycket ”hjärtbladsförsett embryo” avser ett embryo med åtminstone ett hjärtblad.

Uttrycket ”prehjärtbladsförsett embryo” avser ett embryo som inte har nägra hjärtblad.

Såvida inget annat anges är samtliga koncentrations- värden som uttrycks i procent (vikt/vol)%.

I en aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfin- ning förfaranden för framställning av synkroniserade populationer av somatiska barrträdsembryon. Förfarandena innefattar steget av odling av embryogena barrträdsceller i eller på ett synkroniseringsmedium innehållande en absorbentkomposition och åtminstone ett synkroniserings- medel valt från den grupp som består av abskisinsyra och en gibberellin, varvid absorbentkompositionen och nämnda åtminstone ett synkroniseringsmedel föreligger vid en koncentration som är effektiv för att framställa en synkroniserad population av somatiska barrträdsembryon.

Förfarandena enligt uppfinningen kan användas för fram- 2 90-'193- O 8 l l :4 5 '-1 : YJOOïrfgar1.i.Sst íon ÅWETXTHIZHÅEUSEP. COMPANY lâÅTEklT DEPP-.IÉTFIENT CH 1J:7\?AIEwr\_Na?ami1§\ss\:1oo494s\:1nn4s43 Applica;ionnexufolnøtruccor Mss :Dn4~n2»i1 l .dump- 0 0 O l 0000 0 o" oc. c Iøn I I I I Û II OO o. .guy 00 00 00 00 0000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 I 0 I 0 0 I 00 0 10 15 20 A25 30 35 ställning av somatiska barrtràdsembryon med utgångspunkt från vilken medlem som helst av familjen Coniferales, såsom douglasgran, norsk gran, arter av släktet Abies (t ex ädelgran) och medlemmar av släktet Pinus, såsom sydstatsgultall (Loblollytall) Ett exempel på embryogena celler som är användbara (Pinus taeda). vid utövandet av föreliggande uppfinning är embryonala suspensormassor (ESM). ESM kan framställas med utgångs- punkt från prehjärtbladsförsedda embryon som avlägsnats fràn frön. Fröet ytsteriliseras t ex före avlägsnande av de prehjârtbladsförsedda embryona, som därefter odlas på eller i ett induktionsmedium som främjar bildning av ESM, vilket inkluderar tidiga stadier av embryon vid förfaran- det för förökning genom knoppning och klyvning. Ett rep- resentativt exempel pà ett induktionsmedium är medium BM1 som beskrivs i exempel 1 av föreliggande ansökan.

Polyembryoniklyvning (embryonal suspensormassaproli- feration) fortsätter i odlingar efter plantering på ut- vecklingsmedium och nya embryon börjar utvecklas även efter 8-10 veckors odling på utvecklingsmedium. Pà grund av denna fortsatta klyvning är embryon inte enhetliga med avseende på stadium, form, storlek eller kvalitet inom en enda platta. Denna brist på enhetlighet påverkar effekti- viteten av barrtrâds somatiska kloning ofördelaktigt.

Föreliggande uppfinning inriktar sig på problemet med icke synkroniserad utveckling av embryogena barrtrâds- celler, inkluderande ESM, genom odling av de embryogena cellerna i eller på ett synkroniseringsmedel som förmår majoriteten av embryon i en population av somatiska barr- trädsembryon att tillsammans fortskrida genom successiva utvecklingsstadier för att ge en synkroniserad population av mogna somatiska barrtrâdsembryon som kan underkastas groning för erhållande av barrträdsplantor.

Synkroniseringsmediet innehåller en absorbentkom- position och àtminstone ett synkroniseringsmedel valt fràn den grupp som består av abskisinsyra och en gibbe- rellin, varvid absorbentkompositionen och nämnda åtmin- 2004~03~08 11:45 U:ï_No0rganLsa:ion3wsïsRnAEussa COMPANY PATENT nspaammsnr CH LI:'iwirßærr\___z:f>ë'amil~,=\sß\2100494221210012 en: ßxpplicac iøm.excz'l'ornßv;rur~ MWG :0n4~02~11 . don;- 0 0 0 0000 0 0 i 0 0000 00 00 00 000 0 0 0 0 000 000 0 0 0 0 0 0 00 0000 00 00 00 0000 00 00 0 I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0 10 15 20 25 30 35 0 0 0000 I " ° 00 000. :II-z 2 °'.: O. g ' 'ﬂ z ::.I : 0 0 0 u 0 0 0 0 I I ° u 4 ' p :00',00 01""": 00 I " .I g l . n a, .I z '_ ,, .u 00 . a stone ett synkroniseringsmedel föreligger vid en koncent- ration som är effektiv för framställning av en synkroni- serad population av somatiska barrträdsembryon.

Synkroniseringsmediet kan vara ett fast medium eller ett flytande medium. Synkroniseringsmediets osmolalitet är typiskt i omrâdet 180-400 mM/kg. Synkroniseringsmediet innehåller typiskt också näringsämnen som upprätthåller de embryogena cellerna. Det är i allmânnhet önskvärt, men inte nödvändigt, att innefatta maltos som enda eller huvudsakliga källa av metaboliserbart socker i synkroni- seringsmediet. Användbara maltoskoncentrationer ligger i området fràn ca 1% till ca 2,5%.

Synkroniseringsmediet innehåller en absorbentkompo- sition. Absorbentkompositionen kan vara vilken komposi- tion som helst som inte är toxisk för de embryogena cellerna vid de koncentrationer som utnyttjas vid utövan- det av föreliggande förfaranden, och som är i stånd att absorbera tillvâxtbefrâmjande hormoner och i mediet närvarande toxiska föreningar som produceras av växt- cellerna. Sålunda är den eller de absorberade hormonerna inte längre tillgängliga för befrämjande av tillväxt av de embryogena cellerna i eller på mediet, och de absor- berade toxinerna kan inte skadligt påverka växtcellerna.

I detta sammanhang omfattar uttrycket ”absorption” vilken kemisk eller fysikalisk interaktion som helst mellan absorbentkompositionen och ett eller flera tillväxtbe- främjande hormoner, och/eller toxiner i mediet, så att den eller de tillväxtbefrämjande hormonerna och/eller toxinerna binds till absorbentkompositionen.

Icke-begränsande exempel pà användbara absorbentkom- positioner inkluderar aktiverat träkol, löslig poly- (vinylpyrrolidon), olöslig poly(vinylpyrrolidon), aktive- rad aluminiumoxid och silikagel. Absorbentkompositionen kan föreligga i en mängd t ex fràn 0,1 g/l till 50 g/l.

Vid vissa utföringsformer föreligger absorbentkompo- sitionen i en mängd fràn 0,5 g/l till 5 g/l eller fràn ca 0¿5 g/l till ca 1,0 g/l. Vid de utföringsformer av förfa- 2012-' "fš-“ÜB 11:45 V:°=____NOO3.';]»E1'!.É.SWIIÉOIIIEWÉIBïEEHÅEÉUSEÉ. COMPANY PATENT 'DEPÅI?.TY'IEÉN'F CH 14 --IÉNT\___N:>¥'FP1lYlíl3f\5äE\210lE-=i9flíš\.2ll)049f¿3 Applicat;iontsaxtïoïnsä;:fucks-r RING ﬁüil-l-lllš-»ll 00 00 0000 0 0 0 0 0 0 0 0 000 000 0 0000 0 0 0 0 0 0 0 0 0000 0000 00 00 00 0 00 0000 00 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 00 00 10 15 20 25 30 35 527 468 randena enligt uppfinningen där mer än en absorbentkompo- sition föreligger i synkroniseringsmediet, hänför sig föregående koncentrationsområden till den totala koncen- trationen absorbentkomposition i mediet.

Synkroniseringsmediet innefattar också abskisinsyra och/eller åtminstone en gibberellin (d v s antingen ett- dera eller båda de föregående medlen).

Abskisinsyra är ett seskviterpenoidväxthormon som inbegrips i en mängd fysiologiska växtförfaranden (Se t ex Milborrow (2001), J. Exp. Botany: 1145-1164; Leung & Giraudat (1998), Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol.

Biol. 49: 199-123). I vissa utföringsformer av förfaran- dena enligt uppfinningen är koncentrationen abskisinsyra i synkroniseringsmediet mellan 0,5 mg/l och 500 mg/l. I vissa utföringsformer av förfarandena enligt uppfinningen år koncentrationen abskisinsyra i synkroniseringsmediet mellan 1 mg/l och 100 mg/l. I vissa utföringsformer av förfarandena enligt uppfinningen är koncentrationen abskisinsyra i synkroniseringsmediet mellan 5 mg/l och 50 mg/1.

Gibberelliner är en klass av typspecifika diterpe- noidväxthormoner (se t ex Krishnamoorthy (1975), Gibbe- rellins and Plant Growth, John Wiley & Sons). Represen- tativa exempel på gibberelliner som är användbara vid utövandet av föreliggande uppfinning inkluderar gibbe- rellinsyra, gibberellin 4 och gibberellin 7, som båda t ex beskrivs i ovannämnda verk av Krishnamoorthy. Ett exempel på en användbar blandning av gibberelliner är en blandning av gibberellin 4 och gibberellin 7 (benämnd gibberellin 4/7), såsom den gibberellin 4/7 som säljs av Abbot Laboratories, Chicago, Illinois.

I vissa utföringsformer av förfarandena enligt upp- finningen är koncentrationen gibberellin(-er) i synkroni- seringsmediet mellan 0,5 mg/l och 500 mg/1. I vissa ut- föringsformer av förfarandena enligt uppfinningen är kon- centrationen gibbere1lin(-er) i synkroniseringsmediet mellan 1 mg/l och 100 mg/l. I vissa utföringsformer av 2004 03-08 ll 2 4. 5 *f : ^'=.__'NOLï1^g-5|.n.Ií.ELit:ÃOHÄWEÅYEFIHAEUSEIQ. CöhíPiixﬂïi PATENT 'DEPÅPJIÜMPSNT CE 132 'ï\PÄPENI'\>___I=ïc>Fa1nily\E2E\2 1 0 íJ-f! 94 3 X2). (1 0494 3 Applícat ioxzt exr; ToInßtrurrt-Jr MWG 2 Ü 04 -- 02 - ll l .don OI 10 000 o I o toa 0 0 On 0000 oo lo o n o n n o n I o o 0 I n I o o u o n oo OI tona On 10 15 20 25 30 35 förfarandena enligt uppfinningen är koncentrationen gibberellin(-er) i synkroniseringsmediet mellan 5 mg/l och 50 mg/l. Vid de utföringsformer av förfarandena enligt uppfinningen där mer än en gibberellin föreligger i synkroniseringsmediet, hänför sig föregående koncentra- tionsomràden till den totala gibberellinkoncentrationen i synkroniseringsmediet.

Ett exempel på ett lämpligt synkroniseringsmedel är medium BM3, som beskrivs i exempel 1 häri.

Vid vissa utföringsformer av förfarandena enligt uppfinningen odlas embryogena barrträdsceller i eller pà ett synkroniseringsmedium som innefattar en absorbentkom- position och åtminstone ett synkroniseringsmedel under en period från 0,5 veckor till 5 veckor, såsom från 1 vecka till 3 veckor eller såsom från 1 vecka till 2 veckor. Vid vissa utföringsformer av förfarandena enligt uppfinningen odlas embryogena barrträdsceller i eller på ett synkroni- seringsmedium som innefattar en absorbentkomposition och åtminstone ett synkroniseringsmedel vid en temperatur från 10 till 30°C, såsom från 15 till 25°C, eller såsom från 20 till 23°C.

Vid vissa utföringsformer tillhandahålls med före- liggande uppfinning förfaranden för framställning av en synkroniserad population av somatiska barrträdsembryon, varvid förfarandena vart och ett inkluderar stegen av: (a) odling av embryogena celler i eller på ett synkro- niseringsmedium som innefattar en absorbentkomposition och åtminstone ett synkroniseringsmedel, valt från den grupp som består av abskisinsyra och en gibberellin, varvid absorbentkompositionen och synkroniseringsmedlet (eller -medlen) föreligger vid en koncentration som är effektiv för att framställa en synkroniserad odling av prehjärtbladsförsedda somatiska barrtrådsembryon; och (b) odling av de synkroniserade prehjårtbladsförsedda embryon som framställts i steg (a) i eller på ett utvecklings- medium för erhållande av hjärtbladsförsedda somatiska barrtrâdsembryon. 2004~ﬁ3~0s 11:45 V:äwwoorganisacionäwzïmnﬂnﬁusßn company Pafsuï nsaanrusur cs LJ 23 “i \ lßïfëïbïï"\__4ñ$ï>E'arf:ily\í \21 0 04 94 Ulf) IJ~=1 94 3 Appl ifran: iont; e:r MWG 3 0114 - G21 1 J. i det: 00 00 0000 0 0 n o 0 0 o 000 000 0 0000 0 I u 0 0 0 0 0 0000 000 00 00 00 0 00 0000 00 00 a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 00 00 0 10 15 20 25 30 35 527 468 ll OQO! I OI I . ... - ; --,; . . _- -g ; ::'. .noo- ..,,, .u ...,,. v '° '{ .. anna» I , , , .o q c o I 9 De embryogena cellerna odlas i eller på ett synkro- niseringsmedium, såsom beskrivs ovan, för erhållande av en synkroniserad population av prehjärtbladsförsedda embryon. De synkroniserade prehjärtbladsförsedda embryona överförs till ett utvecklingsmedium för utveckling av synkroniserade hjärtbladsförsedda embryon. Utvecklings- mediet är typiskt ett fast medium, men utvecklingsmediet kan även vara ett flytande medium. Utvecklingsmediet innehåller typiskt näringsämnen som upprätthåller den embryogena vävnaden. Maltos kan inkluderas i mediet som den huvudsakliga eller enda källan av socker för den em- bryogena vävnaden. Användbara maltoskoncentrationer ligg- er i området från ca 1% till ca 2,5%.

Lämpliga utvecklingsmedier inkluderar typiskt inte några tillväxtbefrämjande hormoner, såsom auxiner och cytokininer, men kan inkludera hormonet abskisinsyra. Då abskisinsyra används i utvecklingsmediet, utnyttjas det typiskt vid en koncentration i området från ca 1 mg/l till ca 200 mg/1. Utvecklingsmediet kan innehålla gellan- gummi, typiskt vid en koncentration upp till ca 0,35%.

Utvecklingsmediets osmolalitet kan justeras till ett värde som ligger inom ett önskat område, såsom från ca 250 mM/kg till ca 450 mM/kg. Typiskt är en osmolalitet av 350 mM eller mer fördelaktigt. Ett exempel pà ett lämp- ligt utvecklingsmedium är medium BM4, som beskrivs i exempel 1 häri.

Embryogena barrträdsceller kan odlas i eller pà ett utvecklingsmedium under en period från 9 veckor till 14 veckor, såsom från 10 veckor till 12 veckor, eller såsom ca 12 veckor, vid en temperatur från 10°C till 30°C, såsom från 15°C till 25°C, eller såsom från 20°C till 23°C.

Vid vissa utföringsformer tillhandahålls med före- liggande uppfinning förfaranden för framställning av somatiska barrträdsembryon, varvid förfarandena vart och ett inkluderar stegen av: (a) odling av somatiska barr- trädsceller i eller på ett induktionsmedium för erhål- lande av embryogena celler; (b) odling av de embryogena 2004-03-08 ll :45 “Vi 1 6 :f v' \ 'r».~'-;1'Exf1“,_ svan 1 _ rioc __NOO1fg-9ﬁ..1' eat íonïf-VEIYERBAE-'USI-JI-ï. CÛMPAN Y PXNFEHT DE.P.'G.P..I“T~¶EIJ'I' CH ,-'\1~3B\2 10114 9-4 :H2 1 I; 134 94 3 Applicai:icmtexätfrolnfst.ruct or MWG 3 00-'1- 013--11 n I o nano 0 I b Oona 0 0 n 0000 lo co anno on om av se one CC II O. IQ OO 0 0 .IC II no oo oo 10 15 20 25 30 35 10 cellerna som framställts i steg (a) i eller på ett under- hållsmedium för att föröka de embryogena cellerna och bilda somatiska prehjärtbladsförsedda barrträdsembryon; (c) synkronisering av de somatiska prehjärtbladsförsedda barrträdsembryona som förökats i steg (b) i eller på ett synkroniseringsmedium som innefattar en absorbentkompo- sition och åtminstone ett synkroniseringsmedel, valt från den grupp som består av abskisinsyra och en gibberellin, varvid absorbentkompositionen och synkroniseringsmedlet (eller -medlen) var för sig föreligger vid en koncentra- tion som är effektiv för att framställa en synkroniserad odling av somatiska prehjärtbladsförsedda barrträdsem- bryon; och (d) odling av de somatiska prehjärtbladsför- sedda barrträdsembryona som synkroniserats i steg (c) i eller på ett utvecklingsmedium för erhållande av en synkroniserad population av somatiska hjärtbladsförsedda barrträdsembryon.

Induktionsmediet innefattar typiskt oorganiska sal- ter och organiska näringsämnen. Induktionsmediets osmola- litet är typiskt ca 160 mg/kg eller till och med lägre, men kan vara så högt som 170 mM/kg. Induktionmediet inne- fattar typiskt tillväxthormoner. Exempel pà hormoner som kan inkluderas i introduktionsmediet är auxiner (t ex 2,4-diklorofenoxiättiksyra (2,4-D)) och cytokininer (t ex 6-bensylaminopurin (BAP)). Auxiner kan också användas vid t ex en koncentration fràn 1 mg/1 till 200 mg/l. Cytoki- niner kan också användas vid t ex en koncentration från 0,1 mg/l till 10 mg/1.

Induktionsmediet kan innehålla en absorbentkomposi- tion, särskilt då mycket höga halter tillväxthormon an- vänds. Absorbentkompositionen kan vara vilken komposition som helst som inte är toxisk för de embryogena cellerna vid koncentrationerna som utnyttjas vid utövandet av föreliggande förfaranden, och som är i stånd att absor- bera tillväxtbefrämjande hormoner och i mediet närvarande toxiska föreningar som produceras av växtcellerna under embryoutveckling. Icke-begränsande exempel på användbara zoea~c3-os 11:45 V-ï_Noorgan1eacionäwsïsnunßussa COMPANY vATsur nspARTMsNT CH :3:7xvAtßwr\_N@?a1 ' “ f; _.,E'\210011 '=v-'¿3\2100=&9f43 Applicat iom;extToInsLtructoz' MWG ﬁüü-á--IILH- 11 l .dem 100.00 oool oo oooo oo oo o oo oooo o o o o o o o o o o Ü Û I I O CIO ICO I DÛOÛ o o o o o o o o o o o UI Û- IÛ ÜÜÜ. .I OI II 10 15 20 25 30 35 11 absorbentkompositioner inkluderar aktiverat träkol, lös- lig poly(vinylpyrrolidon), olöslig poly(vinylpyrrolidon), aktiverad aluminiumoxid och silikagel. Absorbentkomposi- tionen kan föreligga i en mängd t ex från ca 0,1 9/l till ca 5 g/l.

Ett exempel pà ett induktionsmedium som är använd- bart vid utövandet av föreliggande uppfinning är medium BM1, som beskrivs i exempel 1 hàri.

Somatiska barrträdsceller odlas typiskt i eller pà ett induktionsmedium under en period från 6 veckor till 12 veckor, såsom från 8 veckor till 10 veckor, eller såsom ca 8 veckor, vid en temperatur från 10 till 30°C, såsom från 15 till 25°C, eller såsom från 20 till 23°C.

Underhàllsmediet kan vara ett fast medium eller ett flytande medium, som kan omröras för befrämjande av till- växt och förökning av den embryogena vävnaden. Under- hällsmediets osmolalitet är typiskt högre än induktions- mediets osmolalitet och är typiskt i området 180-400 mM/kg. Underhållsmediet kan innehålla näringsämnen som upprätthåller den embryogena vävnaden och kan inkludera hormoner såsom en eller flera auxiner och/eller cytoki- niner för befrämjande av celldelning och tillväxt av den embryogena vävnaden. Hormonkoncentrationerna i under- hàllsmediet är typiskt lägre än deras koncentration i induktionsmediet.

Det är i allmännhet önskvärt, men inte nödvändigt, att innefatta maltos som den enda eller huvudsakliga källan av metaboliserbart socker i underhällsmediet.

Exempel pà användbara maltoskoncentrationer ligger i om- rådet från ca 1% till ca 2,5%. Ett exempel på ett lämp- ligt underhàllsmedium är medium BM2, som beskrivs i exem- pel 1 hàri.

Embryogena barrträdsceller odlas typiskt i eller pà ett underhållsmedium under en period upptill 6 månader med subodling varje vecka vid en temperatur från 10 till 30°C, såsom från 15 till 25°C, eller såsom från 20 till 23°C. 2 O 04.' 0 3 1- G B 1.1. : 4, *5 V: __NoO1-_,].anísent:íorLKWEIYl-EPRAEUSEIR. Cüfﬁläàtlfi PATENT DEWARTMENT CH 1J2 7 \PATEPH'\_"_4_NoI«'amily'\SE\31I)0 flE-Yá 3 X2 l 0 049143 Applícaionlïewxíïlfolnß trnciizzr MWG 220 04 ~ 02 »- 1 1 1 _ dar: 0 00 00 I I 000 han 0 o 0 0 0 0 00 0000 lo 00 0 0 0 oo 0000 00 to 0 0 u 0 0 0 0 0 0 0 0 0 In 0 10 15 20 25 30 35 12 Embryogena celler överförs från underhàllsmediet till ett synkroniseringsmedium innehållande en absorbent- komposition och åtminstone ett synkroniseringsmedel, valt från den grupp som består av abskisinsyra och en gibbe- rellin, varvid absorbentkompositionen och synkronise- ringsmedlet (eller -medlen) vart och ett föreligger vid en koncentration som är effektiv för att framställa en synkroniserad odling av somatiska barrträdsembryon. Syn- kroniseringsmediets komposition kan vara samma som under- hållsmediet, undantaget tillväxthormoner, men innefattan- de en absorbentkomposition och åtminstone ett synkronise- ringsmedel, valt från den grupp som består av abskisin- syra och en eller flera gibberelliner, som beskrivs ovan.

Vid nägra utföringsformer enligt uppfinningen kan en absorbentkomposition och åtminstone ett synkroniserings- medel sättas direkt till underhàllsmediet som inkluderar ett eller flera tillväxtbefrämjande hormoner. Absorbent- kompositionen (eller -kompositionerna) binder tillväxtbe- främjande hormoner närvarande i mediet så att så att förökningshastigheten hos de embryogena cellerna redu- ceras eller förökningen stoppas helt, och gibberellinen (eller gibberellinerna) och abskisinsyra främjar produk- tion av en synkroniserad population av somatiska embryon.

Efter det att de embryogena cellerna har förökats i en önskad omfattning, kan sålunda en absorbentkomposition och åtminstone ett synkroniseringsmedel sättas till underhàllsmediet (därigenom omvandlas underhàllsmediet till ett synkroniseringsmedel), eller så kan de embryo- gena cellerna överföras till ett synkroniseringsmedium innehållande en absorbentkomposition och åtminstone ett synkroniseringsmedel för erhållande av synkroniserade somatiska barrträdsembryon. De synkroniserade somatiska barrträdsembryona kan sedan överföras till ett utveck- lingsmedium för utveckling av synkroniserade hjärtblads- försedda embryon, som beskrivs ovan.

Vid några utföringsformer odlas somatiska hjärt- bladsförsedda barrträdsembryon framställda enligt för- ,Mnoorginisauionäws¥sRsAsUs3R CUMPANY PATENT Dßvasrmsnr cs :sz:\PsrENT\NN§Fﬂnl1y\sß\:iuu4943\:ico4s43 Application:extroxnßnrucnor Mwo :oa4~o2~11 3. . dos: 2ÛÛ-1~Û3~~~ 08 lfh-iiš V : °= 00 0000 0 0 0 0 000 0 0000 0 0 0 0 0 0000 0 00 0 0 0 O 000 00 0 0 O I 00 0 00 0000 00 00 00 0 O 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 10 15 20 25 30 35 527 468 13 farandena enligt uppfinningen i åtminstone ett mognads- medium för att åstadkomma mogna somatiska barrtrâds- embryon. Ett moget somatiskt barrtrådsembryo enligt uppfinningen hänför sig till ett embryo i stånd att gro till en planta.

Mognadsmediet kan vara ett flytande eller ett fast medium. Mognadsmediet kan också innefatta näringsämnen som upprätthåller de inkuberade hjärtbladsförsedda em- bryona och/eller mognande embryona, och ett eller flera medel för justering av mediets osmolalitet till inom ett önskat område. Mognadsmediets osmolalitet är typiskt i området 250 till 450 mM/kg, såsom ca 350 mM/kg. Mediets pH kan också justeras till ett önskat värde. Mognadsme- diets pH är typiskt mellan ca pH 5 och ca pH 8, såsom mellan ca pH 5 och ca pH 6. Maltos kan inkluderas i mediet som den huvudsakliga eller enda källan av metabo- liserbart socker. Användbara maltoskoncentrationer ligger i omrâdet ca 1% till ca 2,5%. Mognadsmediet kan innehålla en absorbentkomposition, såsom aktiverat trâkol, som beskrivs ovan för induktionsmediet.

Somatiska hjärtbladsförsedda barrträdsembryon odlas typiskt i eller på ett mognadsmedium under en period från 9 veckor till 14 veckor, såsom från 10 veckor till 12 veckor, eller såsom ca 12 veckor, vid en temperatur från 10°C till 30°C, såsom från 15°C till 25°C, från 20°C till 23°C.

Vid några utföringsformer överförs somatiska barr- eller såsom trädsembryon till ett stratifieringsmedium för en djup- kylning före groning. Stratifieringsmediet liknar typiskt utvecklingsmediet men saknar abskisinsyra och inkluderar typiskt inte polyetylenglykol (PEG). Ett typiskt strati- fieringsmedium är BM; som beskrivs i exempel 1.

Somatiska hjärtbladsförsedda barrträdsembryon odlas typiskt i eller på ett stratifieringsmedium i mörker under en period från 3 veckor till 6 veckor, såsom ca 4 veckor, vid en temperatur från l°C till l0°C, såsom från 1°c till a°c. i ÅÛO-'PWJJ-*ÛB 112-15 13'1ÉNNOOILTQ-ällíS-äEÃOXLÄWEYERHÄEUS-ÉR. COMPANY PATENT 'DEPÄRTMEÉBYY CH lJl"ï\PàïïšﬂF;mííoFenrnil3-'\53E\2lI)ß=19-=l3\2l0iJ=l9=!3 Pxpplicalïiontextïolzistru-'rtor MWG 200-11- Bil-ll liwc 00 00 0000 0 0 0 0 O 0 0 000 000 0 0000 0 0 0 c 0 0 0 0 0 0 0000 00 0000 00 00 00 0 00 00I0 00 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0 10 15 20 25 30 35 14 Vid vissa utföringsformer åstadkommer förfarandena enligt uppfinningen en synkroniserad population av soma- tiska barrtrådsembryon i vilken åtminstone ca 50% av embryona är i samma utvecklingsstadium. Vid vissa utför- ingsformer åstadkommer förfarandena enligt uppfinningen en synkroniserad population av somatiska barrtrâdsembryon i vilken åtminstone ca 80% av embryona år i samma utveck- lingsstadium. Vid vissa utföringsformer åstadkommer för- farandena enligt uppfinningen en synkroniserad population av somatiska barrtrâdsembryon i vilken åtminstone ca 90% av embryona är i samma utvecklingsstadium.

Förfarandena enligt uppfinningen ger ett högre ut- byte av somatiska barrtrådsembryon än ett ekvivalent förfarande i vilket de embryogena cellerna inte odlas i ett synkroniseringsmedium. Enligt utföringsformen som be- skrivs i exempel 1 är t ex utbytet typiskt ca 90 somati- ska barrträdsembryon per 100 mg (rå massa) odlad vâxtväv- nad i mognadsmediet. Detta står i kontrast till av ett utbyte av ca 40 somatiska barrtrâdsembryon per 100 mg (rå massa) odlad växtvävnad i mognadsmediet vid användning av ett identiskt förfarande som inte innefattar steget att odla embryogena barrträdsceller i eller på ett synkroni- seringsmedium som innefattar en absorbentkomposition och' åtminstone ett synkroniseringsmedel, valt från den grupp som består av abskisinsyra och gibberelliner. Några ut- föringsformer av förfarandena enligt uppfinningen ger sålunda åtminstone 100% fler somatiska barrträdsembryon (såsom åtminstone 150% fler somatiska barrträdsembryon, eller såsom åtminstone 200% fler somatiska barrträds- embryon, eller såsom från 100% till 200% fler somatiska barrtrådsembryon) ån ett identiskt förfarande för fram- ställning av somatiska barrträdsembryon som inte inne- fattar steget att odla embryogena barrträdsceller i eller på ett synkroniseringsmedium som innefattar en absorbent- komposition och åtminstone ett synkroniseringsmedel, valt från den grupp som består av abskisinsyra och gibberelli- ner. a z. Û G4 ~^ 03 - 0 8 .ll v15 '-1 : ï___'flüGi'g»ïn'ï. f-.Mâtï ïï OUÄWEYEIPHAEÜJSEEI. COMPÅIIY PFIETENT” DEPAF.I'ï-1EI=IT° CH l J 'J ?'\._ Fšﬂßlëï” “\_M_Noïauailj,=\I-'3E \_ E 1 0 ll-l 9-4 3 X2 100491! 3 Appl icat. ionr; extToInfs tnictor Mm; 2 u 0.4 - 031 1 "_ . dec: 10 15 20 25 30 35 527 468 15 Förfarandena enligt uppfinningen kan t ex användas för framställning av kloner av individuella barrträd med en eller flera önskvärda egenskaper, sàsom hög tillväxt- hastighet. I en aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning förfaranden för framställning av en population av genetiskt identiska mogna somatiska barrtrâdsembryon.

Förfarandena enligt denna aspekt av uppfinningen inklu- derar vart och ett steget av odling av embryogena celler i ett synkroniseringsmedium innehållande en absorbentkom- position och àtminstone ett synkroniseringsmedel, valt från den grupp som består av abskisinsyra och åtminstone en gibberellin. Vilket som helst av de hâri beskrivna förfarandena kan användas för framställning av popula- tioner av genetiskt identiska mogna somatiska barrträds- embryon.

I en annan aspekt av uppfinningen tillhandahålls mogna somatiska barrträdsembryon framställda med använd- ning av förfaranden enligt uppfinningen. De mogna soma- tiska barrträdsembryona framställda med användning av förfaranden enligt uppfinningen kan eventuellt under- kastas groning för bildning av barrtràdsplantor som, om sä önskas, kan växa till barrträd. De mogna embryona kan alternativt placeras i konstgjorda frön för efterföljande groning. De mogna somatiska barrtrâdsembryona kan under- kastas groning på t ex ett fast groningsmedium, såsom medium BMG, som beskrivs i exempel 1 hâri. De grodda plantorna kan överföras till jord för ytterligare till- växt. De grodda plantorna kan t ex planteras i jord i ett växthus och få växa innan de överförs till en plats utom- hus. Typiskt belyses de mogna somatiska barrträdsembryona för stimulering av groning. Typiskt utförs samtliga steg av förfarandena enligt uppfinningen i mörker, bortsett från groningen.

Följande exempel endast åskådliggör det för närva- rande betraktade bästa sättet att utöva uppfinningen, men bör inte tolkas som begränsande för uppfinningen.

, L! :4 *å lï: "'-.____l«loO'x.'g-ﬂ,nïï,s-äï É-.Onfalfinwïi-ïxïïl-ïàßllßfïlš COMPANY PATENT ïlåïPÅïiTïﬁfll-BTIT CH J' ______N-:>F¿~anxilj,=\SE\21f)m) 94 :H21 004943 Applical;iont;ez(f;l'oínrztruclïor MWG :IEC-i- u” - I “ ..-i 10 15 20 527 468 noen U "' «- ~- - - -~.: -'- - ~: : ::n° I °° °' ' ana I 0 ' n nu o 02.9: 0101000 z. :- :g 00 2.. ' : .o. . I. : .no nu oss nu 9 o 0 16 Exemgel 1 I detta exempel visas ett representativt förfarande för framställning av somatiska tallembryon av sydstats- gultall Hongametofyter innehållande zygotiska embryon av- lägsnades från frön fyra till fem veckor efter befrukt- ning. Fröhöljena avlägsnades, men embryona dissekerades inte vidare ut frän den omgivande gametofyten mer än att den nucellära änden skärs ut. Konerna förvarades vid 4°C fram till användningen. Omedelbart före avlägsnandet av de omogna embryona steriliserades fröna genom användning av en initial tvättnings- och detergentbehandling, följt av en sterilisering under 10 min i 15% Hﬁb. Explantaten tvättades noggrant med sterilt destillerat vatten efter varje behandling.

I tabell 1 och 2 beskrivs kompositionerna av medier som är användbara för framställning av somatiska tallem- bryon. šßEi:?3;ÉsH11e4§ viïmnoorganisacíonäwsxznﬂaßussa COMPANY PAIENT DEPARTMENT CH -S-,~PA;nNl\“NoFam1ly\5E\21UU4943\:1nna943 Applícaciontextroínßnrucrnr Nwg ~Q04m0~m11 i 13.06; ' _' ' " nunnan 527 468 u bl: och I Û ".: o I , .. nu I ,,, . n o OI " " ..- 0 neon u OI °": o 0 o I O' ' ' u 2 g o 0 0 ' n o ' ': ,: p' v 00 . | g 0 0 o c 0 I ° ' . , g n l . oc» nu i yo noen 17 Tabell 1 Basalmedium (BM) för Pinus Taeda Bestàndsdel Koncentration (mg/1) NH,N03 150, o KN03 909,9 KH2PO4 136,1 Ca(NOg2-4HﬂD 236,2 CaCl2-4H2O 50, O MgSO4"HbO 246,5 Mg(NO3)2-6H2O 256,5 Mgcl, - snzo so, o KI 4,15 H3BO3 15, 5 MnSO4 - H20 lO , 5 ZnSO4"HhO 14,4 NaMOO4~2H2O O, 125 CuSO., - 5H2O 0 , 125 CoCl2~6H2O O, 125 FeSO4"HhO 27,86 Na¿EDTA 37,36 Maltos 30 000.

Myoinositol 200 Kasaminosyror 500 L-glutamin 1000 Tiamin-HCl 1,00 Pyridoxin-HCl 0,50 Nikotinsyra 0,50 Glycin 2,00 Gelrite* 1 600 PH justerat till 5,7 *Används om ett fast medium är 2004- 0' 023 11:45 V : .få Eiﬂ* \__I~i1'.~}.-"azr!.il_¿, \ l _ dam: önskvärt. färg-im i 9151 t ísltï-.WEISÉEHHPEUSEE CONLPÅIIWÉ .PATENT DELLWAlïTME-ÉNH* .A5 KL! 1 U F; -iš 9-'1 3 \f.' 1 001194 3 Ixppl ica t 'iont exxzïolrus f. rue L fn: MWG cs :ua4wo:~11 I 0 0 O 0 oo 00 Inn I 0 0 OI Tabell 2 18 Komposition av medier för behandlingar vid olika steg BM1-induktionsmedium BM2-underhàllsmedium BM3-synkroniseringsmedium BM,-utvecklingsmedium BM;-stratifieringsmedium BMG-groningsmedium H M JJ u C 9 BM+2,4-D(l5pM)+kinetin(2pM)+ BAPQpM) .

BM+2,4-D(5pM)+kinetin(0,5pM)+ BAP (0,5uM). Gelrite(l600mg/l) till- sätts då ett fast medium önskas.

BM+250 mg/l aktiverat träkol+lO mg/l abskisinsyra+l0 mg/l GA4/7.

Gelrite(l600mg/l) tillsätts då ett fast medium önskas.

BM+25 mg/l abskisinsyra+13% PEG- 8000+800 mg/l extra myoinositol +0,l% aktiverat träkol. Följande aminosyrablandning tillsätts: L- prolin (100 mg/1), L-asparagin (100 mg/1), L-arginin (50 mg/l), L-alanin (20 mg/l) och L-serin (20 mg/1). Gelrite(2500mg/1) tillsätts då ett fast medium önskas.

BM4 modifierat genom att utelåmna abskisinsyra och PEG-8000. Maltos ökas till 2,5%. FeSO4"HﬁO redu- ceras till l3,9 mg/l och Na2EDTA reduceras till 18,6 mg/l. Gel- rite(2500mg/l) tillsätts då ett fast medium önskas.

BM modifierat genom att ersätta maltose med 2% sackaros. Myoino- sitol reduceras till 100,0 mg/1, glutamin och kasaminosyror redu- ceras till 0,0 mg/l. FeSO4”HﬁO reduceras till 13,9 mg/1 och Na¿EDTA reduceras till 18,6 mg/l.

Agar vid O,8% och aktiverat träkol vid 0,25% tillsätts. 9-1- 0 3- 08 if). : 45 *J : °'-,___!JO0,1.'g-šu'-_ís-äC íOﬂÄWFIYERRÅEUSI-IR COMPANY PATENT' IJEPAJÉIMENÄI' CH 2 'I \ I>Lf>I'Ef-II:\V_Å_I-It 5'a:nil*,»>\SE\2 3. 0 04 94 3\2 10 04 94 3 Appl icat iom:excfïoIxmtructcnz' MEVG 3 0 IX-fi -- 02 ~ E. l d : o I o b IIOI o 10; n :Ian Q 0 n on n coin 00 on nu o! 0000 0 o I l I Q O c I n o u u o 0 n o nl iQ Ino' nu o roa o o 0 o u.. 10 15 20 25 30 35 527 468 19 Induktion: Sterila gametofyter med intakta embryon placeras pà ett fast BM1-odlingsmedium och förvaras i en miljö vid 22-25°C med en fotoperiod i mörker under 24 h under en tidsperiod av 3-5 veckor. Tidsperiodens längd beror på den särskilda odlade genotypen. Vid slutet av denna tidsperiod bildas en vit slemaktig massa i associa- tion med de ursprungliga explantaten. Mikroskopisk under- sökning avslöjar typiskt ett flertal tidiga stadier av embryon associerade med massan. Dessa karaktäriseras allmänt som att ha en lång tunnvâggig suspensor associe- rad med ett litet huvud med tät cytoplasma och stora kärnor.

Induktionsmediets osmolalitet kan i vissa fall vara så hög som 170 mM/kg. Vanligtvis är den ca 160 mM/kg eller t o m lägre (såsom 150 mM/kg).

Underhåll och förökning: Tidiga stadier av embryon som avlägsnats från massorna som bildats vid induktions- steget placeras först på ett gelat underhålls- och förök- ningsmedium BM2. Detta skiljer sig från induktionsmediet i det att tillväxthormonerna (både auxiner och cytoki- niner) är reducerade med åtminstone en hel storleksord- ning. Osmolaliteten för detta medium ökas typiskt från det för induktionsmediet till ca 180 mM/kg eller mer (typiskt inom området ca 180-400 mM/kg för Pinus taeda) genom ökning av koncentrationen av myoinositol till 0,5 (vikt/vol)%. 25°C med 24 h i mörker. Embryon odlas 12-14 dagar på det fasta BM;-mediet före överföring till ett flytande medium Temperaturen och fotoperioden är åter 22- för vidare subodling. Detta flytande medium har samma komposition som BM2, men saknar gelningsmedlet. Embryona i slutet av steget med odling på fast underhållsmedium är typiskt likartade till utseendet i förhållande till de från induktionssteget. Efter 5-6 subodlingar per vecka på det flytande underhållsmediet har avancerade tidiga stadier av embryon bildats. Dessa kännetecknas av jämna embryonala huvuden med uppskattningsvis typiskt mer än 100 individuella celler med ett flertal suspensorer. 2eo«~o3-ce :1=4ß \ zwuoorganësæuionawsysanasussn company PATENT DEPARTMENT cs L- FäPATEHïxWN0Fﬂmily\sE\210049@3\21004943 Applicationsexnroxnßnrucuor Mws :ßn4~n2~11 141.0: 00 00 00 I! 00 coon I 0 I c I I 0 c I o 000 10 15 20 25 30 35 20 Synkronisering: Tidiga stadier av embryon överförs från induktionsmedium eller fràn underhàllsmedium till flytande eller fast synkroniseringsmedium BM; i 2 veckor för att ge synkroniserade tidiga stadier av embryon.

Synkroniseringsmediet har samma komposition som BM2, men som saknar hormonerna och innehåller aktiverat träkol, abskisinsyra och gibberelliner.

Embryoutveckling: Synkroniserade tidiga stadier av embryon överförs till ett fast utvecklingsmedium. Detta medium saknar antingen tillväxthormoner helt och hållet eller har dem närvarande i endast mycket làga halter.

Abskisinsyra är typiskt inkluderad för underlättande av vidare utveckling. Den ytterligare inklusionen av en absorbentkomposition i detta medium är fördelaktigt.

Absorbentkompositionen kan vara vald från ett antal kemi- ska material med stor ytarea och/eller en reglerad por- storlek, såsom aktiverat träkol, lösliga och olösliga former av poly(vinylpyrro1idon), aktiverad aluminiumoxid och silikagel. Absorbentkompositionen föreligger vanligt- vis vid en koncentration av ca O,1-5 g/1, mera allmänt ca 0,25-2,5 g/l. Gellangummi inkluderades vid en koncentra- tion av ca 0,25% Den osmotiska potentialen för detta utvecklings- medium kan ökas till betydligt över den för underhålls- mediet. Det har visat sig vara fördelaktigt med en så hög osmolalitet som 350 mM/kg eller t o m högre. Utvecklingen sker företrädesvis i fullständigt mörker vid en tempera- tur av 22-25°C tills làngsträckta hjärtbladsförsedda em- bryon har utvecklats. Utvecklingstiden är typiskt flera veckor, såsom 10-12 veckor.

Stratifiering= Hjärtbladsförsedda embryon separerades ett och ett och överfördes till stratifieringsmedium BM5.

Detta medium âr likartat utvecklingsmediet men saknar abskisinsyra, PEG-8000 och gellangummi. Embryon odlas pà stratifieringsmedium vid mellan ca 1°C och ca 10°C i mör- ker i mellan 3 och 6 veckor. 2oo4~c3~08 l1=4ß T ämnoowganisauionäwzxßauasusßa comvanï aafsuï nEpAsrMßuw CH 1J:1\PATENr\mu@Fami1y\ss\:Lunawas\21un4943 Applicationtextroznszrucuor Mwü :uni-u:«11 1 . dax: 0 I non 0000 I 00 n 0 0 0 0 0 0 o o o 0 0 o n 00 oo 00 0000 00 0 bo 0000 n 0 n n o 10 15 20 25 30 35 527 468 nnn nnn n n nn n u 0000 0 'I ° n n n n n n n n n n n nn n n nns n n n n n n n n n n n o n n o 0 0 000000 nn noononn I 0! I' 'O n o n n n n n n 0 o o 0 0 0 0 I n n n n n n nn nn nu nn 0 21 Torkning: De mogna embryona som fortfarande befinner sig på sin filterpapperbàrare lyfts av från underlâgget och placeras i en sluten behållare över en mättad lösning av K¿SO4 vid en relativ luftfuktighet av 97% och under en period av ca tre veckor. V Groning: De torkade mogna embryona áterhydratiseras genom placering av dem, medan de fortfarande befinner sig på filterpapperbâraren, under ca 24 h på ett underlägg mättat med flytande groningsmedium. Embryona placeras därefter individuellt pà fast BM6-medium för groning.

Detta är ett basalt medium som saknar tillväxthormoner som har modifierats genom reduktion av sackaros, myoino- sitol och organiskt kväve. Embryona inkuberas pà BM6- medium i ca 6-8 veckor vid omgivande betingelser av 23- 25°C och en fotoperiod av 16 h ljus och 8 h mörker tills de resulterande smàplantorna har ett välutvecklat rotämne och en hypokotyl samt en grön hjârtbladsstruktur och epi- kotyl. .

P g a den reducerade kolhydratkoncentrationen är den osmotiska potentialen för groningsmediet ytterligare re- ducerad till under den för utvecklingsmediet. Den år van- ligtvis under ca 150 mM/kg (sàsom ca 100 mM/kg).

Exempel 2 Detta exempel visar effekterna av behandling av embryogena celler med absorbentkompositioner, abskisin- syra och/eller gibberelliner före utvecklingsstadiet vid synkronisering av utvecklingen av somatiska embryon av sydstatsgultall (Pinus taeda).

Hongametofyter innehållande zygotiska embryon avläg- snades från frön av genotyp B och genotyp A, som beskrivs i exempel 1. Induktions- och underhàllsstadierna var som de beskrivna i exempel 1.

För att undersöka effekterna av behandling med abso- rbentkompositioner, abskisinsyra och/eller gibberelliner utsattes 100 mg (rà massa) embryogena celler för följande behandlingar i tvà veckor före överföring till utveck- 2 Û Û -Ä 03f 0 ß ll :45 V: 3. __I_*3OCI:_'4V=.'X1. ísât i.On^“=_WEÄ“iEI¿FI-'§EJUSHR COMPšUI .PATENT DEPÅRIIMBIJT CH. _-. \l*.~\l')¿1t~1'l*\__:àoläuni 17,* \ SE \2 11) 0-4 94 3 \ 21 C 0-19-4 3 àppl ical: s; u: ln a 0 I c O OQO Oil l Oil! n o I I o n nu :ann oo no nu 10 15 20 25 30 35 22 lingsmedium och fortsatt utveckling som beskrivs i exempel 1: Kontroll: Embryon förblev i uppehållsmediet av stan- dardtyp innehållande hormoner (2,4-D, kinetin och BAP, Se exempel 1); Behandling 1: Embryon överfördes till underhålls- mediet utan hormoner samt innehållande 250 mg/l aktiverat träkol (synkroniseringsmedium 1); Behandling 2: Embryon överfördes till underhålls- mediet utan hormoner samt innehållande 1 mg/1 abskisin- syra (synkroniseringsmedium 2); Behandling 3: Embryon överfördes till underhålls- mediet utan hormoner samt innehållande 250 mg/l aktiverat träkol och 5 mg/1 abskisinsyra (synkroniseringsmedium 3); Behandling 4: Embryon överfördes till underhålls- mediet utan hormoner samt innehållande 5 mg/l gibberellin GA4/7 (synkroniseringsmedium 4); Behandling 5: Embryon överfördes till underhålls- mediet utan hormoner samt innehållande 10 mg/l gibberel- lin GA4/7 (synkroniseringsmedium 5); Behandling 6: Embryon överfördes till underhålls- mediet utan hormoner samt innehållande 250 mg/l aktiverat trâkol och 10 mg/l gibberellin GA4/7 (synkroniseringsmedium 6); Behandling 7: Embryon överfördes till underhålls- mediet utan hormoner samt innehållande 250 mg/1 aktiverat tråkol, 10 mg/l abskisinsyra och 10 mg/1 gibberellin GA4/7 (synkroniseringsmedium 7, BM3); Odlingar av embryon i tidiga stadier utsattes för en av åtta behandlingar i två veckor före överförning till utvecklingsmedium, som beskrivs i exempel 1.

Efter 2 veckor utvârderades behandlingarnas effekter på embryoutvecklingen. Kontrollodlingarna klöv, växte och bildade embryonala suspensormassor för båda genotyperna som undersökts. Odlingarna innehöll stora klumpar och stora embryonala huvuden. Embryon syntes vid olika stadier, vilket visade ingen synkronisering av odlingen. 2004-GBMOS 11:45 V: _NOQygapj as:vxPArßmräWNosami1§\sE\; t I. .dne SäCiOnÄWEYERHÄEUSER COMPÄNY PATENT DEPÄRTMENY CH iëzf-lïﬂíšlflílàšï-'lïš Applicationt;exf;'IoI11rst.r'ucl:oz MW; 21901! 421311 .i 10 15 20 25 30 35 527 468 23 Tillsatsen av aktiverat träkol till underhàllsmediet i behandling 1 (synkroniseringsmedium 1) saktade ned polyembryoniklyvning men möjliggjorde fortfarande viss embryonal separering, ett och ett. Embryon började emel- lertid utvecklas tidigt, särskilt i genotyp B. Tillsatsen av en låg koncentration abskisinsyra till underhàllsme- diet (synkroniseringsmedium 2) håmmade tidig embryout- veckling men hjälpte inte för separering av embryona ett och ett. Embryon syntes vid många olika utvecklingssta- dier. Tillsatsen av både aktiverat träkol och abskisin- syra (synkroniseringsmedium 3) hâmmade tidig embryout- veckling och grönska men möjliggjorde för separering av embryon ett och ett, och mer enhetlighet i embryostorlek syntes i odlingar med denna behandling.

Tillsatsen av en låg koncentration gibberelliner (synkroniseringsmedium 4) hämmade också tidig embryout- veckling och grönska men embryon syntes i många olika stadier. Tillsatsen av en högre koncentration gibberel- liner (synkroniseringsmedium 5) resulterade i embryo- grönska. I Tillsatsen av aktiverat träkol och en låg koncentra- tion gibberelliner (synkroniseringsmedium 6) till odlin- gar hämmade tidig embryoutveckling och grönska och resul- terade i storleksmässigt mera enhetliga embryon och mer separering, ett och ett, än vad som syntes i kontroll- odlingar. Slutligen hämmade tillsatsen av en kombination av abskisinsyra, gibberelliner och aktiverat träkol (synkroniseringsmedium 7) tidig embryoutveckling och grönska, medan det främjade separering, ett och ett, och synkronisering av odlingarna. Embryona i dessa odlingarna varstorleksmässigt mycket enhetliga jämfört med kontroll- embryona.

Dessa resultat visat att separering, ett och ett, och enhetlig tillväxt av embryon i tidiga stadier före överföring till utvecklingsmedium kan uppnås genom att förbehandling av odlingarna i ett synkroniseringsmedium innehållande aktiverat träkol och åtminstone en av ÉÛÛ-i ~ 93" 08 1.1 : 45 W? : "'-.__”_TlOÜ:r.“g.3.Iïi 551?ÉOIIHWÉYYÉRHÅEUSÉR. COMPÅNY PATENT DEPÅRNÉFMEIIT CH. :(32 7 \l".¿\l"ßl\ï°í'l\g__l~ïa'ëlš'GIIIÉIyÅEÉYÜßIÛÛ-i 943 \2 ll) 114 9.113 Äppl ica; ioni- e_¿¿__»pfrolnß|_ïzucc_or MWg; 2 g 94 _ Q: 1 l l . dot; 24 abskisinsyra och en gibberellin. Denna behandling synkroniserade utvecklingen av hjärtbladsförsedda embryon och deras mognad. 290?-gg ge ;1=4s v;aWnoorgauißazi@nAwsYanaAsusER comßnnx PATENT nsæARrMsNr cs :Ja,1eAruw:aMw@Fami1y\sE\:1on4ø43\21øn494s Applicaciﬁnuexuwozn.nrucnvr Mwc :nu4-0:-11 l .dec '

Claims

10 15 20 25 30 527 468 25 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av en synkroniserad population av somatiska barrträdsembryon, varvid förfa- randet innefattar stegen av a) odling av embryogena barrträdsceller i eller pà ett synkroniseringsmedium innefattande en absorbentkompo- sition och ett synkroniseringsmedel i form av abskisin- syra, varvid absorbentkompositionen och synkroniserings- medlet föreligger i en koncentration som är effektiv för framställning av synkroniserade prehjärtbladsförsedda somatiska barrträdsembryon, och b) odling av de vid steget a) framställda synkroni- serade prehjärtbladsförsedda embryona i eller pá ett utvecklingsmedium för erhållande av hjärtbladsförsedda somatiska embryon.

2. Förfarande enligt krav 1, varvid absorbentkompo- sitionen är vald från den grupp som består av aktiverat träkol, löslig poly(vinylpyrrolidon), olöslig poly(vinyl- pyrrolidon), aktiverad aluminiumoxid och silikagel.

3. Förfarande enligt krav 2, varvid absorbentkompo- sitionen är aktiverat träkol.

4. Förfarande enligt krav 1, varvid koncentrationen av absorbentkomposition i synkroniseringsmediet är från ca 0,5 g/l till ca 50 g/l.

5. Förfarande enligt krav 1, varvid absorbentkompo- sitionen är aktiverat träkol och det aktiverade träkolet föreligger i synkroniseringsmediet i en koncentration i omrâdet från ca 0,1 g/l till ca 5 g/l.

6. Förfarande enligt krav 1, varvid absorbentkompo- sitionen är aktiverat träkol och det aktiverade träkolet föreligger i synkroniseringsmediet i en koncentration i omrâdet från ca 0,5 g/l till ca 1 g/l.

7. Förfarande enligt krav 1, varvid abskisinsyra föreligger i synkroniseringsmediet i en koncentration frán ca 1,0 mg/1 till ca 500 mg/1. 2005-10-28 14:48 V:\_No0rganisationWEYBRI-IAEUSER COMPANXWPATENT\_NOFan1ily\SE\2l0Ü4943\2lOü4943 New ciaiuls CBK 2005-10-28 Ldøc 10 15 20 25 527 468 26

8. Förfarande enligt krav 1, varvid abskisinsyra föreligger i synkroniseringsmediet vid en koncentration från ca 0,5 mg/l till ca 20 mg/1.

9. Förfarande enligt krav 1, varvid embryogena barrträdsceller odlas i eller på synkroniseringsmediet under en tidsperiod från ca 0,5 veckor till ca 5 veckor.

10. Förfarande enligt krav 1, varvid embryogena barrträdsceller odlas i eller på synkroniseringsmediet under en tidsperiod från ca 1 vecka till ca 3 veckor.

11. ll. Förfarande enligt krav 1, varvid embryogena barrträdsceller odlas i eller på synkroniseringsmediet under en tidsperiod från ca 1 vecka till ca 2 veckor.

12. Förfarande enligt krav 1, varvid synkronise- ringsmediets osmolalitet är fràn ca 90 mM/kg till ca 300 mM/kg.

13. Förfarande enligt krav 1, varvid synkronise- ringsmediets pH är från ca 5 till ca 6.

14. Förfarande enligt krav 1, varvid somatiska sydstatsgultallembryon framställs fràn embryogena celler av sydstatsgultall

15. Förfarande enligt krav 1, varvid åtminstone 50% av embryona i den synkroniserade populationen av soma- tiska barrträdsembryon är i samma utvecklingsstadium.

16. Förfarande enligt krav 1, varvid åtminstone 75% av embryona i den synkroniserade populationen av soma- tiska barrträdsembryon är i samma utvecklingsstadium. 3005-10-28 14 : 48 V: \_NoOrganisatiomívlßlfßlël-IAEIJSER '30MPANY\PnTENTktíoïaznily\SE\21004943\210U4943 New claims CBK 2005-10-28 1 doc