FI115826B

FI115826B - Terapeuttinen aine rasva-aineenvaihdunnan häiriöön

Info

Publication number: FI115826B
Application number: FI963312A
Authority: FI
Inventors: Hiroaki Masunaga; Kanji Higashio; Akira Shiota; Nobuaki Fujise
Original assignee: Daiichi Seiyaku Co
Priority date: 1994-12-27
Filing date: 1996-08-26
Publication date: 2005-07-29
Also published as: EP0754051B1; NZ298141A; DE69531608T2; HU220139B; ZA9510981B; TW480173B; KR100395695B1; NO963551D0; ATE247975T1; JPH08176007A; NO318099B1; HUT76085A; KR970701058A; FI963312A; DE69531608D1; ES2201128T3; FI963312A0; AU4355096A; CA2184248A1; AU710513B2

Description

1 1 C Q 0 f

Terapeuttinen aine rasva-aineenvaihdunnan häiriöön i o o λ ο Tämä keksintö koskee terapeuttista ainetta rasva-aineenvaihduntasairauden 5 hoitamiseksi, käsittäen TCF-ll:ta tehoaineena. Tämän keksinnön terapeuttinen aine on hyödyllinen rasva-aineenvaihdunnan häiriön, kuten liikakolesteroliveri-syyden, veren rasvaniukkuuden, veren suuren tiheyden rasva-valkuaisrunsau-den hoitoon, joita aiheuttavat sokeritauti, endokrinologiset sairaudet, kuten kilpirauhasen sairaus ja lisämunuaisen sairaus, krooninen aineenvaihduntasairaus, 10 krooninen munuaisvajaatoiminta, sisältäen nefroosin, uremian, syövän, neste- häiriön, kasvaintenvastaisen aineen haittavaikutukset, mahasuolihäiriön (sisältäen maksan ja haiman häiriöt) ja niin edelleen.

Enemmän kuin 60 % japanilaisten kuolinsyystä johtuu aikuisiän taudista, kuten 15 korkeasta verenpaineesta, verisuonten kalkkeutumasta, sokeritaudista jne. Yleisesti aikuisiän sairauden aiheuttaa pääasiassa sisäsyntyisen tekijän, kuten endokrinologisen toiminnan ja/tai rasva-aineenvaihdunnan toiminnan vaurioituminen, joiden ohjausmekanismeja ei vielä tiedetä monilta puolilta. Sen terapeuttisen aineen luokka, jota käytetään rasvaverisyyden hoitoon, esitettynä toiminta-20 mekanismin termeillä, luokitellaan kolesterolin tai sappihapon absorption esto-' " na, kolesterolin synteesin estona ja vaikutuksena hyvin alhaisen tiheyden prote- t i i i » ' ’ iiniaineenvaihduntaan (VLDL). Rasvaverisyys yhdistettynä suuren tiheyden proteiini(HDL)-kolesterolin alentumaan on merkittävä riskitekijä valtimonkovetus-' ; taudeille, jotka käsittävät verettömän sydäntaudin, korkean verenpaineen, veret- :25 tömän aivotaudin ja niin edelleen. On havaittu, että rasvaverisyyden hoitoon käytetyn terapeuttisen aineen farmakologinen teho ei vain alenna seerumin , lipidiä, vaan myös parantaa alentuneen HDL-kolesterolin, joka on rasvaverisyy- .': ·. den ja/tai alentuneen lesitiini-kolesteroliasyylitransferaasin (LCAT) progressiivi- i. ’. t nen tekijä, estääkseen rasvaverisyyden etenemisen valtimokovetustaudiksi 30 poistamalla aineenvaihdunnan salpaantumisen.

;: \ Kuitenkaan ei sellaista farmaseuttista ainetta rasva-aineenvaihdunnan paranta miseksi, joka parantaa rasva-aineenvaihdunnan pysyvästi, ole vielä kehitetty. Terapeuttisena aineena epänormaalin rasva-aineenvaihdunnan hoitamiseksi, 2 115826 jota ainetta käytetään nykyään kliinisesti Pravastatinin natriumsuola, joka estää 3-hydroksi-3-metyyliglutaryyli-CoA:a pelkistävän entsyymin tai klofibraatti, jolla on selkeyttävä vaikutus seerumin rasvaan, annetaan esimerkkeinä rasvaveri-syyttä varten ja ruokinta käyttäen suuren energiamäärän infuusiota on annettu 5 esimerkkinä veren rasvaniukkuudesta.

Erilaisia terapeuttisia aineita käytetään oireista riippuen välittämättä primääri-taudista. Täten ei ole ollut mitään farmaseuttista ainetta parantamaan ja/tai hoitamaan epänormaalia rasva-aineenvaihduntaa, jonka aiheuttaa endokrinolo-10 gisen häiriön epätasapaino, johon liittyy rasva-ja sokeriaineenvaihdunta. Eri syiden tuloksena on sokeritaudissa piirteitä, jotka johtuvat insuliinin ja glukago-nin ja endokrinologisen häiriön, sisältäen haiman häiriön, epätasapainosta, mikä johtaa maksan, rasvan, lihaksen, ihon, munuaisten jne. aineenvaihduntahäiriöön. Rasvakudoksen rooli on pitää varastoa rasva-aineena ylimääräisen energi-15 an tapauksessa ja hajottaa rasva-ainetta ja syöttää sitä elävään ruumiiseen energialähteenä tarvittaessa. Sokeritaudin tapauksessa on synteesi rasvakudoksessa estetty ja hajoaminen stimuloituu insuliinin puutteen ja ylimääräisen glukagonin takia. Se on, insuliinin vaikutuksen alenemisen takia alenee sukroo-sin otto rasvakudoksessa, mistä on tuloksena alenema a-glyserofosforihapon, 20 NADH:n ja NADPH:n tuotannossa ja alenema rasvahapon ja uudelleen esteröity-• misen synteesissä. Toisaalta insuliinin puute ja ylimääräinen glukagoni aktivoi vat hormoniherkän lipaasin hajottamaan rasva-ainetta. Rasvamaksan kehittymi-' ! sen mekanismin ajatellaan olevan sellainen, että häiriö esiintyy joko triglyseri- , , ·. disynteesin tai VLDL.n synteesin ja erityksen kulussa maksassa.

;T: 25

Rasvahapposynteesin stimuloituminen maksassa, rasvahapon liikkuvuuden :: lisääntyminen ääreisrasvakudoksesta maksaan, rasvahapon hapettumiskyvyn : aleneman ja lipoproteiinin synteesin ja erittymisen maksassa aleneman ajatel laan olevan esimerkkejä ylläolevasta mekanismista. Esimerkiksi lihavuuteen . 30 liittyvässä rasvamaksassa lisääntyy rasvahapon liikkuvuus ääreisrasvakudoksesta ääreisrasvakudoksen määrän lisääntymisen takia. Äskettäin on kohdistettu ; huomiota suhteeseen rasvamaksan kehittymisen ja rasvahapon lisääntymisen välillä porttilaskimossa johtuen sisäisen rasva-aineen kerääntymisestä. Lisäksi asetyyli CoA-karboksylaasin, joka on nopeuden määrävä entsyymi rasvahapon 3 115826 uudissynteesille maksassa, happamuus voimistuu lihavuudessa, mikä viittaa rasvahapon synteesin voimistumiseen maksassa. Toisaalta lihavuudessa indusoituu liian suuri insuliinin muodostus, jotta kompensoitaisiin insuliiniresistenssin lisääntyminen ääreisrasvakudoksessa.

5

Tiedetään, että rasvamaksa liittyy lihavuuteen liiallisen insuliinin suurella no-peudellatapahtuvan erityksen kanssa verrattaessa lihavuutta normaaliin insuliinin eritykseen. Täten toisiinsa liittyvän epänormaalin hiilihydraatti-ja rasva-aineenvaihdunnan suhteen ei ole ollut vielä mitään farmaseuttista ainetta, joka 10 parantaisi rasva-aineenvaihduntaa taktisesti stimuloimalla veressä rasva-ainetta kantavan seerumin lipoproteiinin synteesiä, parantaen sen liikkuvuuttaa rasva-koostumukseksi ja sen aineenvaihduntaa, vahvistaen LCAT-aktiivisuutta, joka liittyy esteröintiin, alentaen vapaan kolesterolin tasoa, lisäten HDL-kolesterolin tasoa, stimuloiden sapen eritystä, alentaen seerumin rasva-ainetasoa, poistaen 15 triglyseridiä, joka on kerääntynyt maksasoluihin ja parantaen rasvamaksan.

Nämä tilanteet mielessä pitäen ovat tämän keksinnön tekijät tutkineet innokkaasti terapeuttista ainetta epänormaalin toisiinsa liittyvän hiilihydraatti-ja rasva-aineenvaihdunnan hoitamiseksi ja havainneet, että TCF-II koskee erityi-20 sesti veressä rasva-ainetta kantavan seerumin lipoproteiinin liikkumista rasva- ; ainekoostumukseksi ja sen aineenvaihduntaa. Sen synteesin estoa, esteröintiin ‘ * .. . liittyvän LCAT-aktiivisuuden laskua, ja siihen liittyvän HDL-kolesterolin alene- ‘ maa pidetään vakavina riskitekijöinä aikuisten taudeissa, jotka liittyvät rasva- ' , ‘ t aineenvaihdunnan häiriöön, kuten rasvaverisyyteen, valtimon kovetustautiin ja , ·:, 25 niin edelleen. Tämän keksinnön tekijät havaitsivat, että TCF-II voimisti merkittävästi LCAT-aktiivisuutta in vivo, paransi alhaista suuren tiheyden lipoproteinemi-aa, edelleen se stimuloi liikkuvuutta lisäämällä seerumin lipoproteiinin määrääjä normalisoi seerumin rasva-ainetason. Tämän keksinnön tarkoitus on aikaansaada terapeuttinen aine, jolla on tehoa normalisoida epänormaali rasva-aineen-. 30 vaihdunta, käsittäen TCF-ll:ta tehoaineena.

Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada terapeuttinen aine rasva-aineenvaihdunnan häiriön hoitoon, käsittäen TCF-ll:ta tehoaineena.

115826 4

Keksinnön toinen tarkoitus on aikaansaada terapeuttinen aine hoitoa varten, jolla aineella on tehoa alentaa seerumin rasva-aineen korkeaa tasoa ja normalisoida veren rasvaniukkuus ja jolla on tehoa parantaa rasvamaksa.

5 Kuvio 1 esittää esimerkin 4 VLDL-fraktioiden fraktiointimenetelmää.

Kuvio 2 esittää esimerkin 4 seerumin HDL-fraktion ja HDL3-fraktion fraktiointimenetelmää.

10 Kuvio 3 esittää esimerkin 4 seerumin triasyyliglyserolin pitoisuutta.

Kuvio 4 esittää esimerkin 4 seerumin esterityyppisen kolesterolin ja vapaan kolesterolin pitoisuutta ja LCAT-aktiivisuutta veressä.

15 Kuvio 5 esittää esimerkin 5 antomenettelyä.

Kuvio 6 esittää triasyyliglyserolin pitoisuutta kudoksessa ja seerumin fosfolipidin ja seerumin kokonaiskolesterolin pitoisuutta esimerkissä 5.

. . 20 Kuvio 7 esittää seerumin albumiinin, seerumin HDL-kolesterolin, seerumin va-l paan kolesterolin ja seerumin kokonaiskolesterolin pitoisuutta esimerkissä 6.

, v. Kuvio 8 esittää esimerkin 7 antomenettelyä.

« 1 » 25 Kuvio 9 esittää LCAT-aktiivisuutta esimerkissä 7.

Kuvio 10 esittää antomenettelyä esimerkissä 8.

Kuvio 11 esittää seerumin HDL-kolesterolin, seerumin kolesterolin ja seerumin ’: 30 kokonaiskolesterolin pitoisuutta.

Tämän keksinnön terapeuttinen aine rasva-aineenvaihdunnan häiriön hoitoon, käsittäen TCF-ll:ta tehoaineena, on hyödyllinen terapeuttisen aineena hoitamaan rasva-aineenvaihdunnan häiriötä, jonka on aiheuttanut sokeritauti, endo- 115826 5 krinologiset taudit, kuten kilpirauhasen väärä toiminta ja lisämunuaisen väärä toiminta, krooninen aineenvaihduntahäiriö, krooninen munuaisen toiminnan vajaus, sisältäen nefroosin, uremian, syövän, nestehäiriön, kasvaintenvastaisen aineen haittavaikutuksen, mahasuolikanavan häiriö (sisältäen maksan ja haiman 5 häiriöt) jne. Ylläkuvattuina rasva-aineenvaihdunnan häiriöinä voidaan antaa esimerkkinä veren liiallinen kolesterolipitoisuus, veren rasvaniukkuus tai alhainen korkean tiheyden lipoproteinemia.

TCF-II tämän keksinnön tehoaineena on tunnettu proteiini, joka on peräisin 10 ihmisen sidekudosemosoluista ja sen ominaispiirteet on esitetty seuraavasti: i) molekyylipaino (SDS-elektroforeesi) ei-pelkistävissä olosuhteissa : 78000±2000 tai 74000±2000 pelkistävissä olosuhteissa : 52000±2000 (yhteinen nauha) 15 30000±2000 (nauha B) 26000±2000 (nauha C) ii) isoelektrinen piste : 7,4 - 8,6 iii) aminohapon pituus : 723 , , 20 Ylläkuvattu TCF-II voidaan saada konsentroimalla ihmisen sidekudosemosolujen I viljelynestettä, adsorboimalla se ioninvaihtajaan ja puhdistamalla eluoitu aine . . . affiniteettikromatografialla (W090/10651) tai geenimanipulaatiolla (WO92/01053).

, ; *. 25 TCF-ll:ta tämän keksinnön tehoaineena voidaan käyttää TCF-ll:ta, joka on peräisin ihmisen sidekudosemosoluista tai TCF-ll:ta, joka on tuotettu geenimanipu- : :laatiolla perustuen geenisekvenssiin, jota on kuvattu patentissa W090/10651 > «* käyttäen mikrobi- tai muuta solua. Lisäksi voidaan ylläolevassa tapauksessa v, myös käyttää TCF-ll:ta, joka on saatu geenimanipulaatiolla, jota on kuvattu t' ‘ . 30 patentissa WO92/01053. TCF-ll:ta, jossa on erilainen hiilihydraattiketju tai ilman ‘.t hiilihydraattiketjua, johtuen isäntäsolun tai mikrobiorganismin erosta.

»

Kuitenkin voidaan mieluummin käyttää TCF-ll:ta, jossa on hiilihydraattiketju, koska hiilihydraattiketju koskee aineenvaihduntanopeutta elävässä ruumiissa.

115826 6 Näillä menetelmillä saatu TCF-II voidaan konsentroida ja puhdistaa tavanomaisilla eristys-ja puhdistusmenetelmillä. Esimerkiksi annetaan esimerkkeinä saos-tusmenetelmä käyttäen orgaanista liuotinta, ulossuolaus, geelisuodatus, af-finiteettikromatografia käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta ja elektroforeesi.

5 Puhdistus affiniteettikromatografialla käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta voidaan suorittaa käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta, joka on kuvattu japanilaisessa julkaistussa, tutkimattomassa patenttihakemuksessa 97(1993). Saatu TCF-II voidaan pakastekuivata tai säilyttää pakastimessa. Terapeuttinen aine hoitamaan häiriötä rasvaan ja hiilihydraattiin liittyvässä aineenvaihdunnas-10 sa voidaan antaa suonensisäisesti, lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti ruiskeina. Nämä farmaseuttiset valmisteet voidaan tuottaa tunnetun farmaseuttisen valmistusmenetelmän mukaisesti. pH:n säätöainetta, puskuria, stabilaattoria ja niin edelleen voidaan lisätä siihen tarpeen vaatiessa. Tämän keksinnön farmaseuttisen valmisteen antoannos potilaaseen voi vaihdella potilaan oireiden, ter-15 veysolosuhteiden, iän tai ruumiin painon jne. mukaan. Voidaan antaa 0,6 mg -600 mg/aikuinen/päivä. Mieluummin voidaan antaa farmaseuttista valmistetta, joka käsittää 6 mg - 60 mg TCF-ll:ta kerran tai useammin päivässä.

Tätä keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkkejä antavin esimerkein, 20 mutta tämän keksinnön suojapiiri ei ole rajoitettu näihin esimerkkeihin.

EsimerkKU

: TCF-ll:n puhdistus ’25 r f * i » ·

Patentissa W090/10651 kuvatun menetelmän ja Higashio et. ai. menetelmän (Higashio, K. et. ai., B.B.R.C., voi. 170, ss. 397-404 (1990)) mukaisesti saatiin ; TCF-II soluviljelyllä. Ihmisen sidekudosemosoluja IMR-90 (ATCC CCL 186) 3 x 10® istutettiin pyöritettävään pulloon, joka sisälsi 100 ml DMEM-väliainetta, jossa i. ’·, 30 oli 5 % vasikan seerumia ja sitä viljeltiin pyörittäen pyörähdysnopeudella 0,5 - 2 * ( kertaa minuutissa 7 päivän ajan. Kun solujen kokonaismääräksi tuli 1 x 107, solut kerättiin pohjapinnalle trypsiinikäsittelyllä, 100 g 5-9 meshin steriloituja keraamisia kappaleita lisättiin siihen ja suoritettiin paikallaan pysyvää viljelyä 24 tuntia. Sitten siihen lisättiin 500 ml ylläolevaa viljelynestettä ja viljelyä jatkettiin. Koko 7 115826 viljelyväliaine kerättiin joka 7-10. päivä ja tuoretta väliainetta täydennettiin. Täten tuotantoa jatkettiin kaksi kuukautta ja 4 I viljelynestettä yhtä pulloa kohden kerättiin. Yllä kuvatulla tavalla saadun viljelynesteen ominaisaktiivisuus oli 32 μ/ml.

5 Viljelyneste (750 I) konsentroitiin ultrasuodatuksen avulla käyttäen membraa-nisuodatinta (Mp. 6000 rajana; Amicon) ja sarjapylväskromatografialla tapahtuvalla puhdistuksella käyttäen CM-Sephadex C-50 (Pharmacia), ConA-Sepharo-se (Pharmacia), Mono S-pylvästä (Pharmacia) ja Hepariini-Sepharosea (Pharmacia) antamaan puhdistettua TCF-ll:ta.

10

Esimerkki 2

Yhdistelmä-TCF-ll:n tuottaminen 15 Patenttijulkaisussa W092/01053 kuvatun menetelmän mukaisesti viljeltiin solu ja, jotka oli transformoitu TCF-ll-geenillä ja saatiin puhdistettua TCF-ll:ta. Viljeltiin transformoituja Namalwa-soluja ja saatiin 20 I viljelynestettä. Tämä viljelyneste puhdistettiin CM-Sephadex x C-50-kromatografialla (Pharmacia), ConA-Sepharose CL-6B-kromatografialla (Pharmacia) ja HPLC:llä, joka oli pakattu 20 Mono S:llä (Pharmacia) ja saatiin noin 11 mg aktiivista TCF-ll:ta.

;v> Esimerkki 3 i * t Farmaseuttisten valmisteiden tuottaminen 25

Alla esitetään injektioiden tuotantoesimerkkejä yhdistelmä-TCF-ll:lle, joka saatiin . ylläolevassa esimerkissä 2.

; V; 1 TCF-II 20 pg !" ’; 30 ihmisen seerumialbumiinia 100 mg , : Yllä oleva koostumus liuotettiin 0,01 M fosfaattipuskuriliuokseen, jonka pH oli 7,0 ja sen kokonaistilavuus asetettiin 20 ml:ksi. Steriloinnin jälkeen näyte jaettiin 2 ml ampulleihin ja pakastekuivattiin, mitä seurasi ampullin sulkeminen.

8 115826 2 TCF-II 40 pg

Tween 80 1 mg ihmisen seerumialbumiinia 100 mg 5 Yllä oleva koostumus liuotettiin fysiologiseen suolaliuokseen injektioita varten ja sen kokonaistilavuus asetettiin 20 ml:ksi. Steriloinnin jälkeen näyte jaettiin 2 ml ampulleihin ja pakastekuivattiin, mitä seurasi ampullin sulkeminen.

3 TCF-II 20 pg 10 Tween 80 2 mg sorbitolia 4 g

Yllä oleva koostumus liuotettiin 0,01 M PBS.ään, jonka pH oli 7,0 ja sen kokonaistilavuus asetettiin 20 ml:ksi. Steriloinnin jälkeen näyte jaettiin 2 ml ampullei-15 hin ja pakastekuivattiin, mitä seurasi ampullin sulkeminen.

4 TCF-II 40 pg

Tween 80 1 mg glysiini 2 g . . 20 * * # ' j Yllä oleva koostumus liuotettiin fysiologiseen suolaliuokseen injektioita varten ja ; · -1 sen kokonaistilavuus asetettiin 20 ml:ksi. Steriloinnin jälkeen näyte jaettiin 2 ml » a , ·. ·, ampulleihin ja pakastekuivattiin, mitä seurasi ampullin sulkeminen.

» * * ♦ ; 25 5 TCF-II 40 pg

Tween 80 1 mg : sorbitoli 2 g ’:' glysiini 1 g i “". 30 Yllä oleva koostumus liuotettiin fysiologiseen suolaliuokseen injektioita varten ja ’ ! » , ·, sen kokonaistilavuus asetettiin 20 ml:ksi. Steriloinnin jälkeen näyte jaettiin 2 ml ; ampulleihin ja pakastekuivattiin, mitä seurasi ampullin sulkeminen.

6 TCF-II 20 pg 9 115826 sorbitoli 4 g ihmisen seerumialbumiinia 50 mg

Yllä oleva koostumus liuotettiin 0,01 M PBS:ään, jonka pH oli 7,0 ja sen koko-5 naistilavuus asetettiin 20 ml:ksi. Steriloinnin jälkeen näyte jaettiin 2 ml ampulleihin ja pakastekuivattiin, mitä seurasi ampullin sulkeminen.

7 TCF-II 40 pg glysiini 2 g 10 ihmisen seerumialbumiinia 50 mg

Yllä oleva koostumus liuotettiin fysiologiseen suolaliuokseen injektioita varten ja sen kokonaistilavuus asetettiin 20 ml.ksi. Steriloinnin jälkeen näyte jaettiin 2 ml ampulleihin ja pakastekuivattiin, mitä seurasi ampullin sulkeminen.

15 8. TCF-II 40 pg ihmisen seerumialbumiinia 50 mg

Yllä oleva koostumus liuotettiin 0,01 M PBS:ään ja sen kokonaistilavuus asetet-, 4 20 tiin 20 ml:ksi. Steriloinnin jälkeen näyte jaettiin 2 ml ampulleihin ja pakaste- ' ! kuivattiin, mitä seurasi ampullin sulkeminen.

•" » * » 1 t » , , ’, Esimerkki 4

i I

i · » , y, 25 Lipoproteiinin erityksen ja plasman LCAT-aktiivisuuden stimuloiminen normaaleissa rotissa TCF-ll:lla > I ( I » Γ; Wistar-urosrottiin (8 viikkoa vanhoja, 300 g, 5 rottaa/ryhmä) injektoitiin suonen- y, sisäisesti kahdesti päivässä 500 pg/kg TCF-ll:ta (1000 pg/kg/pv) neljän päivän . 30 ajan. Kontrolliryhmän rottiin injektoitiin vain kantajaa. Kaksitoista tuntia viimeisen injektion jälkeen otettiin verta taaemmasta onttolaskimosta eetterinukutuksessa.

: ; Kerättiin seerumia ja plasmaa seuraavaa lipidin analyysiä varten lipoproteiinissa ja vastaavasti LCAT-aktiivisuutta varten. Lipoproteiinin analyysiä varten erotettiin VLDL Wilson et. ai. menetelmien mukaisesti (Clin. Chem., voi. 20, ss. 394- 115826 10 395, 1974) ja HDL2 ja HDL3 erotettiin Gidez et. ai menetelmien mukaisesti (J. Lipid Res., voi. 23, ss. 1206-1223, 1982). Ylläolevien menettelyjen kaaviolliset esitykset on kuvattu kuvioissa 1 ja 2. Triasyyliglyserolin, kokonaiskolesterolin ja vapaan kolesterolin pitoisuudet määritettiin entsymaattisesti kaupallisesti saata-5 villa koesarjoilla (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan). Esteröidyn kolesterolin pitoisuus laskettiin seuraavan suhteen perusteella {[kokonaiskolesterolin pitoisuus] - [vapaan kolesterolin pitoisuus]}. Plasman LCAT-aktiivisuus määritettiin Glomset-Wrightin menetelmien mukaisesti (Methods in Enzymology, voi. 15, 543, 1969).

10

Triasyyliglyserolin pitoisuus VLDL.ssä oli merkittävästi korkeampi TCF-ll-injek-toiduissa rotissa kuin kontrollirotissa (Kuvio 3). Tämä tulos viittaa siihen, että TCF-II stimuloi VLDL:n eritystä ja triasyyliglyserolin vapautumista vereen maksa-kudoksesta. Lisäksi oli plasman LCAT-aktiivisuus merkittävästi voimistunut ja 15 HDL-kolesterolin, erityisesti esteröidyn kolesterolin pitoisuus oli merkittävästi lisääntynyt TCF-ll-injektoiduissa rotissa (kuvio 4), mikä osoitti, että TCF-II stimuloi LCAT:n eritystä maksasta HDL:n tuottamiseksi.

Esimerkki 5 :M 20 :‘; Voimakkaasti kerääntyneen maksan triasyyliglyserolin alentaminen TCF-ll:lla alkoholilla aikaansaaduissa rasvamaksarotissa ’; Valmistettiin nestedieetti Liber et. ai (Trans. Assoc. Am. Physician, voi. 76, 289- ’ ‘ 25 301,1963) menetelmän mukaan. Ruokittiin Wistar-urosrottia (7 viikkoa vanhoja, . 280 g, 10-13 rottaa/ryhmä) nestedieetillä, joka sisälsi 5 % alkoholia, viiden vii- : j kon ajan ja aiheutettiin rasvamaksa. Kontrollirottia ruokittiin nestemäisellä kont- * · rollidieetilla, jossa oli sama määrä kaloreita. Rasvamaksarottiin injektoitiin suo-; ' nensisäisesti kahdesti päivässä 50 ja 500 pg/kg TCF-ll:ta (100 ja vastaavasti ': ’ ’ 30 1000 pg/kg/pv) alkoholiruokinnan 7 viimeisenä päivänä. Kontrolliryhmän rottiin '·:·*’ injektoitiin vain kantajaa.

» *

Kaksitoista tuntia viimeisen TCF-ll-injektion jälkeen eläimet tapettiin ja maksat leikattiin pois. Rasvamaksat uutettiin 30 tilavuudella kloroformia ja metanolia „ 115826 (2:1) ja triasyyliglyseroli, fosfolipidi ja kokonaiskolesteroli määritettiin kaupallisesti saatavilla koesarjoilla (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan). Antomenettely on esitetty kuviossa 5.

5 Voimakkaasti kerääntynyt maksan triasyyliglyseroli rasvamaksarotissa väheni annoksesta riippuvasti TCF ll-injektioilla. Maksan fosfolipidi-ja kolesterolitasot jäivät kuitenkin muuttumattomiksi (kuvio 6). Nämä tulokset viittasivat myös siihen, että TCF-II lisää triasyyliglyserolin eritystä maksasta ja parantaa rasvamaksan.

10

Esimerkki 6

Korkean seerumin kolesterolipitoisuuden alentuminen TCF-ll:lla a-naftyyli-iso-tiosyanaatilla (ANIT) aiheutetuissa sapensalpausrotissa 15

Annettiin Wistar-urosrotille (7 viikkoa vanhoja, 280 g, 10 rottaa/ryhmä) suun kautta 100 mg/kg ANITia viiden viikon ajan ja aiheutettiin sapensalpaus. Sapen-salpausrotille annettiin suonensisäisesti ruiskeena kahdesti päivässä 50, 150, 500 ja 1500 pg/kg TCF-ll:ta (100, 300, 1000 ja 3000 pg/kg/pv vastaavasti) 3 ’ ·.! 20 päivää välittömästi ANITin antamisen jälkeen. Kaksitoista tuntia viimeisen injekti-on jälkeen otettiin verta taaemmasta onttolaskimosta eetterinukutuksessa. Ke-rättiin seerumi seuraavia seerumin lipidi-ja albumiinipitoisuuden mittausta var-ten. Triasyyliglyserolin, vapaan kolesterolin, kokonaiskolesterolin ja albumiinin ‘ seerumipitoisuudet määritettiin Hitachi 7150-autoanalysaattorilla.

: 25

Triasyyliglyserolin, vapaan kolesterolin, kokonaiskolesterolin seerumipitoisuudet ; sapensalpausrotissa olivat merkittävästi korkeampia kuin normaaleilla rotilla.

• · TCF-ll-ruiske alensi seerumin lipidipitoisuuksi ja nosti seerumin albumiinipitoi-' suutta annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 7). Näistä tuloksista nähdään, että •;*' 30 TCF-II parantaa rasvaverisyyttä, johon liittyy sapensalpaus.

·: Esimerkki 7

Plasman LCAT-aktiivisuuden stimulointi koirilla TCF-ll:lla 12 1 1 5826

Narttu- ja urosbeagle-koirille (1-5 vuotta vanhoja, noin 10 kg, 5 koiraa/ryhmä) annettiin suonensisäisenä ruiskeena kahdesti päivässä 50,150 ja 500 pg/kg TCF-ll:ta (vastaavasti 100, 300 ja 1000 pg/kg/pv) seitsemän päivän ajan. Kontrolliryhmän koiriin ruiskutettiin vain kantajaa. Ennen TCF-ll-ruisketta ja sen aika-5 na otettiin verta etujalan laskimosta ja plasma kerättiin seuraavaa LCAT-aktiivi-suuden analyysiä varten. Antomenettely on esitetty kuviossa 8.

Plasman LCAT-aktiivisuus määritettiin Glomset-Wrightin menetelmän mukaan (Methods of Enzymology, voi. 15, 543,1969). TCF-ll:ta saaneiden eläinten 10 plasman LCAT-aktiivisuus lisääntyi merkittävästi (Kuvio 9), mikä osoitti, että TCF-II stimuloi LCAT.n erittymistä maksasta ja rasva-aineenvaihduntaa normaaleissa koirissa.

Esimerkki 8 15

Alhaisen seerumin HDL-kolesterolin nostaminen TCF-ll:lla dimetyylinitrosamiinil-la (DMN) aikaansaadussa kirroosissa rotilla

Wistar-urosrotille (8 viikkoa vanhoja, 300 g, 8-10 rottaa/ryhmä) annettiin vatsa-\ * ·: 20 kalvonsisäisesti kolme kertaa viikosssa 10 pg/kg DEM:ä neljän viikon ajan ja ’'' ‘: aiheutettiin näin kirroosi.

: Kirroosirotille annettiin ruiskeena suonensisäisesti kahdesti päivässä 5, 50 ja :;;’ 100 pg/kg TCF-ll:ta (10,100 ja vastaavasti 1000 pg/kg/pv) neljän viikon ajan 25 DMN:n annon aikana. Antomenettely on esitetty kuviossa 10. Kaksitoista tuntia . _ viimeisen ruiskeen jälkeen otettiin verta taaemmasta onttolaskimosta eette- , · | ·, rinukutuksessa. Seerumia kerättiin seuraavaa seerumin kolesterolipitoisuuden mittausta varten. HDL-kolesterolin, vapaan kolesterolin ja kokonaiskolesterolin ;seerumipitoisuudet määritettiin Hitachi 7150 Autoanalyzer-laitteella.Esteröity-’' 30 neen kolesterolin seerumipitoisuudet laskettiin esimerkissä 4 kuvatun yhtälön ;: ' mukaan.HDL-kolesterolin ja esteröityneen kolesterolin seerumipitoisuudet kir- roosirotilla olivat merkittävästi alempia kuin normaaleilla rotilla, mutta vapaan kolesterolin määri oli korkeampi. TCF-ll-ruiske nosti seerumin HDL-kolesterolin 115826 13 ja esteröidyn kolesterolin pitoisuuksia ja alensi seerumin vapaan kolesterolin pitoisuutta merkittävästi (Kuvio 11). Näistä tuloksista voidaan nähdä, että TCF-II parantaa kirroosiin liittyvää alhaista korkean tiheyden lipoproteinemiaa.

5 Teollinen käyttökelpoisuus Tämän keksinnön päämääränä on aikaansaada terapeuttinen aine rasva-aineenvaihdunnan häiriön hoitamiseksi, käsittäen TCF-II tehoaineena. Tämän keksinnön terapeuttinen aine normalisoi rasvaverisyyden ja veren rasvaniukkuu-10 den. Se myös parantaa rasvamaksan.