FI115636B - Kiniinihapon synteesi glukoosista - Google Patents

Description

1 *\ 5636

Kiniinihapon synteesi glukoosista Keksinnön tausta

Keksintö koskee kinoidiyhdisteiden, erityisesti 5 kiniinihapon (kinaatin) ja sen esiastemuotojen ja johdannaisten, tuotantoa siten että muutetaan hiilenlähde kuten glukoosi. Sekä hydrokinoni että bentsokinoni, jotka ovat teollisesti tärkeitä orgaanisia yhdisteitä, voidaan johtaa kiniinihapon magnesium(IV)dioksidin hapettamisesta. (Katso 10 Woskresensky, A. Justus Liebigs Ann. Chem., 1838, 27:257.) Kiniinihappo on tärkeä molekyyli, jota käytetään hyödyksi enantiomeerisesti puhtaana lähtömateriaalina erilaisten synteettisten reagenssien synteesiä varten, joista monet ovat biologisesti tärkeitä. Kiniinihappo on esimerkiksi 15 hyödyllinen lähtömateriaali syntetoitaessa FK-506:ta, joka on immuunijärjestelmää suppressoiva aine ja hyödyllinen elinsiirrännäisen hylkimisen estäjänä. Katso Rao, A.V.R. ym., Tetrahedron Lett., 1990, 32(4):547-50. Sitä käytetään myös hyödyksi mukavana lähteenä monen luonnol-20 listen tuotteiden synteesissä, jotka ovat muuten vaikeita hankkia (esim. mykosporiini ja D-myo-inositoli-1,4,5-tri-fosfaatti, katso White ym., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111(24):8970-2 ja vastaavasti Falck, ym. , J. Org. Chem., 1989, 54(25):5851-2). Lisäksi kiniinihappoa käytetään hyö-" 25 dyksi ruuan lisäaineena, erottavana aineena ("resolving agent") ja sitä käytetään kokeellisesti optisissa materi- • aaleissa.

· Kiniinihappoa on eristetty aikaisemmin luonnolli sista lähteistä (esim. kiinankuori, tupakanlehdet, porkkain : 30 nanlehdet jne.). Kiniinihapon eristämisen kustannukset .sellaisista lähteistä estävät sen käytön taloudellisesti käyttökelpoisena lähtömateriaalina. Lisäksi kiniinihappo '1 voidaan syntetisoida kemiallisesti, sellainen synteesi käyttää kuitenkin hyödyksi liuottimia, hyvin reaktiivisia : 35 reagensseja ja ongelmajätettä, eikä se näin ollen ole ym- 115636 2 päristöä ajatellen suotavaa. Niinpä on olemassa tarve tuottavalle, ympäristömielessä suotavalle menetelmälle kiniinihapon synteesiä varten.

Niinpä tämän keksinnön tarkoitus on tarjota mene-5 telmä kiniinihapon tuottamiseksi, joka menetelmä käyttää hyödyksi lähtömateriaalina hiilenlähdettä, joka voi olla peräisin uusiutuvasta lähteestä, kuten maissi, sokerijuurikkaat, sokeriruoko tai biomassa.

Keksinnön yhteenveto 10 Tämä keksintö koskee menetelmää, jolla voidaan tuottaa kiniinihappoa ja sille sukua olevia orgaanisia kinoidiyhdisteitä, kuten bentsokinonia ja hydrokinonia, isäntäsolun tavallisesta aromaattisesta reitistä (kuten kuvioissa 1 ja 2 esitetään), siten että käytetään hyödyksi 15 hiilenlähteitä, jotka voidaan muuttaa biokatalyyttisesti 3-dehydrokinaatiksi, esimerkiksi glukoosia. Tässä keksinnössä hyödylliset isäntäsolut voivat olla mitä tahansa mikrobeja, jotka pystyvät muuttamaan hiilenlähteen 3-dehydrokinaatiksi .

20 Tämän keksinnön menetelmäsuoritusmuodossa kuvataan menetelmä, jolla voidaan tuottaa kinoidiyhdiste (se on: \ kiniinihappo), joka menetelmä käsittää seuraavaa: ·, a) valitaan isäntäsoluorganismi, joka kykenee syn- tetisoimaan dehydrokinaattia, 25 b) estetään yksi tai useampi entsymaattinen reaktio < « > I < isäntäsolun reitillä, niin että dehydrokinaatin muuttumi-; : nen eri yhdisteiksi reitillä estyy, edellyttäen kuitenkin V ’ että ei estetä entsymaattista reaktiota joka muuttaa de hydrokinaatin kiniinihapoksi, • · ·,· j 30 c) mahdollisesti tuodaan isäntäsoluun kyky muuttaa : ’ dehydrokinaatti kiniinihapoksi, jos sellaista kykyä ei jo ole läsnä isäntäsolussa, ja d) lisätään hiilen kulkua isäntäsolujen reitille, t » ;· edellyttäen että vaiheet b), c) ja d) voidaan suo- j 35 rittaa missä tahansa järjestyksessä tai samanaikaisesti.

115636 3 Tämän keksinnön suoritusmuodossa reitille tuotua hiilen kulkua lisätään transformoimalla isäntäsolut yhdis-telmä-DNA:11a, joka käsittää geenin joka koodittaa trans-ketolaasia, geenin joka koodittaa DAHP-syntaasin isotsyy-5 miä ja geenin joka koodittaa 3-dehydrokinaattisyntaasia. Plasmidi pKD136 sisältää geenit tkt, aroF ja aroB, jotka koodattavat entsyymejä transketolaasi, DAHP-syntaasin ty-rosiiniherkkä isotsyymi ja vastaavasti 3-dehydrokinaatti-syntaasi. Plasmidin pKD136 muodostaminen ja pKD136:n eks-10 pressio E. colissa on kuvattu aikaisemmin. (Katso Draths, K.M.; Frost, J.W.; J. Am. Chem. Soc♦; 1990; 112:9630; joka esitys liitetään tähän viitteenä.) Tämä keksintö käsittää lisäksi sen että estetään yksi tai useampi entsymaattinen reaktio isäntäsolujen ta-15 vallisessa aromaattisessa reitissä (kuten kuviossa 1 esitetään), ja näin estetään dehydrokinaatin muuttuminen muiksi yhdisteiksi reitillä, paitsi että dehydrokinaatin muuttamista kiniinihapoksi ei estetä (kuten kuviossa 2 esitetään). Sellainen estävä toimenpide voidaan suorittaa 20 siten, että tehdään mutaatio tai deleetio (kokonaan tai osittain) genomiseen lokukseen (aroD) joka koodittaa de-hydrokinaattidehydrataasia. Sellainen estävä toimenpide, jossa tehdään aroD:n deleetio tai mutaatio, varmistaa sen että suurin osa tai kaikki hiilen kulkeutumisesta joka 1 * · ·_ 25 alunperin suuntautuu reitille, suuntautuu kiniinihapon synteesiin.

: Lisäksi tämä keksintö käsittää sen että dehydroki- v ’ naatti muutetaan kiniinihapoksi, Isäntäsolulla voi olla sisäsyntyinen kyky muuttaa dehydrokinaatti kiniinihapoksi ; 30 (esimerkiksi isäntäsolulla on sisäsyntyinen geeni, joka koodittaa kinaattidehydrogenaasia). Tämä kyky voi vaihtoehtoisesti johtua siitä, että isäntäsolut transformoidaan ;· rekombinantti-DNA:11a joka koodittaa geeniä joka koodittaa kinaattidehydrogenaasia (kuten qrad-geeni ). Tämän keksinnön ! : 35 suoritusmuoto, jossa isäntäsolulta puuttuu kyky suorittaa 115636 4 tämä muuttaminen, käsittää sen että isäntäsolut transformoidaan gad-geenillä joka on eristetty Klebsiella pneumoniae -bakteerista.

Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa isän-5 täsolu on E. coli -kanta, ja erityisesti E. coli -kanta AB2848aroD/pKD136/pTW809A, ATCC # 69086.

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on kaavakuva aromaattisen biosynteesin tavallisesta reitistä.

10 Kuvio 2 on kaavakuva, joka esittää kiniinihapon tavallisen aromaattisen reitin tuotteena.

Kuviot 3a, b ja c ovat karttoja gad-geenin eristyksestä Klebsiella pneumoniae -bakteerista, mikä tuotti pTW8090A:n.

15 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Glukoosista lähteviä yleisiä aromaattisia reittejä tunnetaan useiden mikro-organismien tapauksessa silmälläpitäen useiden aromaattisten yhdisteiden tuotantoa, katso esimerkiksi kuvio 1 joka kuvaa reittiä joka alkaa glukoo-20 sista ja johtaa lopulta korismaattiin jolloin reitissä on monia välituotteita tai esiasteyhdisteitä. Sellaiseen reittiin sisältyviin entsyymeihin kuuluvat DAHP-syntaasi (aroF), DHQ-syntaasi (aroB), DHQ-dehydrataasi (aroD), si-kimaattidehydrogenaasi (aroE), sikimaattikinaasi (aroL), 25 EPSP-syntaasi (aroA) ja korismaattisyntaasi (aroC). On havaittu, että isäntäsolut voidaan indusoida syöttämään !·: glukoosin ekvivalentteja tälle reitille ja/tai estämään * tämän reitin eteneminen, jolloin dehydrokinaattia (DHQ) kasaantuu.

« » : 30 Isäntäsoluun siirrettävissä olevat geneettiset ele- mentit välittävät sellaisten geenien tehostunutta ekspressiota, jotka koodittavat proteiineista, jotka pystyvät suorittamaan tai säätelemään tämän eriävän reitin tai yleisen aromaattisen reitin entsymaattisten toimintojen .* : 35 induktiota. Tässä määriteltynä geneettisiin elementteihin 115636 5 kuuluvat nukleiinihapot (yleensä DNA tai RNA), joissa on ekspressoitavissa olevia koodittavia sekvenssejä tuotteille kuten proteiinit, apoproteiinit, tai "antisense"-RNA, jotka voivat suorittaa tai säädellä reitin entsymaattisia 5 toimintoja. Ekspressoidut proteiinit voivat toimia entsyymeinä, repressoida tai derepressoida entsyymiaktiivisuutta, tai säädellä entsyymien ekspressiota. Näitä ekspres-soitavissa olevia sekvenssejä koodittavat nukleiinihapot voivat olla joko kromosomaalisia (esimerkiksi integroituja 10 isäntäsolun kromosomiin homologisella rekombinaatiolla) tai kromosomin ulkoisia (esimerkiksi plasmidien, kosmidien jne. sisältämiä). Lisäksi geneettiset elementit sisältävät määritelmän mukaan mahdollisesti ekspressiota sääteleviä sekvenssejä, joihin kuuluvat promoottorit, repressorit ja 15 tehostajat, jotka toimivat siten että ne säätelevät sellaisten koodittavien sekvenssien ekspressiota tai derep-ressiota, jotka koodittavat proteiineja, apoproteiineja tai "antisense"-RNA:ta. Sellaiset säätelysekvenssit voidaan sijoittaa esimerkiksi villityyppisiin isäntäsoluihin, 20 jolloin ne edistävät sellaisten valikoitujen entsyymien yliekspressiota, joita isäntäsolun genomi jo koodittaa, ;·. tai niitä voidaan käyttää vaihtoehtoisesti säätelemään , kromosomin ulkoisesti kooditettujen entsyymien synteesiä.

Tämän keksinnön mukaiset geneettiset elementit voi-”"t 25 daan tuoda isäntäsoluun plasmideilla, kosmideilla, faa- geilla, hiivan keinotekoisilla kromosomeilla tai muilla M : vektoreilla, jotka välittävät geneettisten elementtien v · siirtymistä isäntäsoluun. Nämä vektorit voivat sisältää replikaation aloituskohdan samoin kuin säätelyeleraenttejä, : 30 jotka vaikuttavat "cis"-tapaan ja säätelevät vektorin ja vektorin sisältämien geneettisten elementtien replikaatio-ta. Vektorissa voi olla läsnä selektoitavissa olevia mark-;;; kereita, jotka auttavat niiden isäntäsolujen tunnistami- >··' sessa, joihin on tuotu geneettiset elementit. Selektoita- 35 vissa olevat markkerit voivat olla esimerkiksi geenejä, 115636 6 jotka antavat resistenssin tietyille antibiooteille, kuten tetrasykliini, ampisilliini, kloramfenikoli, kanamysiini tai neomysiini.

Edullinen keino tuoda geneettisiä elementtejä isän-5 täsoluun käyttää hyödyksi kromosomin ulkoista monikopiois-ta plasmidivektoria, johon sijoitetaan geneettiset elementit tämän keksinnön mukaisesti. Geneettisen elementin tuominen isäntäsoluihin plasmidin avulla käsittää plasmidin katkaisun aluksi restriktioentsyymillä, jota seuraa plas-10 midin ja geneettisten elementtien ligaatio keksinnön mukaisesti. Sen jälkeen kun ligoitu rekombinanttinen plasmi-' di on saatettu jälleen rengasmaiseksi, käytetään hyödyksi transduktiota tai muuta mekanismia plasmidin siirtämiseksi, jotta plasmidi saataisiin siirrettyä isäntäsoluun.

15 Plasmideihin, jotka soveltuvat geneettisten elementtien sijoittamiseen isäntäsoluun, kuuluu, näihin rajoittumatta, pKD136, p45, pl35, pTW6135, pTW6264A, pKK223-3 ja PTW8090A.

Soveliaita isäntäsoluja tässä keksinnössä käytettä-20 väksi ovat niiden sukujen jäsenet, joita voidaan käyttää hyödyksi haluttujen aromaattisten yhdisteiden teolliseksi biosynteettiseksi tuottamiseksi. Isäntäsoluihin voi vas-taavasti kuulua mikrobeja, jotka kykenevät muuttamaan hii-lenlähteen 3-dehydrokinaatiksi. Edullisia isäntäsoluja on 25 Escherichia coli.

» * * « »

Korismaattireitistä haarautuvasta reitistä peräisin : olevien kiniinihapon ja muiden aineenvaihduntatuotteiden v teolliseksi tuottamiseksi voidaan käyttää edellä mainittu jen sukujen dereguloituja mutanttikantoja, joista puuttuu i 30 palauteinhibitio yhden tai useamman entsyymin suhteen me- tabolisella biosynteettisellä reitillä.

Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa ;;; E. coli tuottaa kiniinihappoa. Tämä E. colin synteesi esi- ;·’ tetään havainnollisesti kuviossa 2, jossa reitti estetään 35 eliminoimalla aroD-entsyymiaktiivisuus (c kuviossa 2) ja 115636 7 tuomalla isäntäsoluihin gad-geeni (d kuviossa 2) dehydro-kinaatin (DHQ) muuttamiseksi kiniinihapoksi. Tämä reitin modifikaatio muodostaa tärkeän muuttujan, joka pitää ottaa huomioon aromaattisten aminohappojen ja niihin liittyvien 5 sekundääristen aineenvaihduntatuotteiden biokatalyyttisten synteesien suunnittelussa. Modifioitu reitti voi spesifisesti olla hyödyllinen reitti hiilenlähteen kuten glukoosin muuttamiseksi kiniinihapoksi, molekyyliksi josta monet erilaiset farmaseuttiset tuotteet, maatalouskemialliset 10 tuotteet, makuaineet ja polymerisaation inhibiittorit teollisesti johdetaan.

Pohjautuen menestyksekkäisiin yrityksiin lisätä sen hiilen kulkeutumista, joka oli sitoutunut yleiselle reitille tai aromaattisten aminohappojen biosynteesiin isän-15 täsoluissa (E. coli), ajateltiin että kinaattidehydroge- naasia koodittavan geenin tuominen E. coliin voisi saada aikaan kiniinihapon syntymisen sikimaattireitin välituotteesta, dehydrokinaatista.

Tämä odotus pohjautui kinaattihydrogenaasin kataly-20 soiman dehydrokinaatin ja kinaatin toisikseen muuttumisen tasapainoon (Davis, B.D.; Gilvarg, C.; Mitshuhashi, S.; Meth. Enzymol.; 1955; 2:300) joka on kiniinihapon puolel-la. Koska se ei ole syntyperäinen Escherichia colissa, kinaattidehydrogenaasia koodittava gad-geeni eristettiin ·· : 25 toisesta kannasta. Käytettiin Klebsiella pneumoniae -mu- ' ' tanttikantaa A170-40. Jotkin bakteerikannat, kuten Kleb- : siellä pneumoniae, voivat käyttää kiniinihappoa yksinomai- V · sena hiilenlähteenään. Dehydrokinaatin katabolismin an siosta nämä kannat muuttavat edellä mainitun kinaattide-30 hydrogenaasin katalysoiman reaktion tasapainon termodynaa- • » · misesti epäsuotuisaan suuntaan.

·, Plasmidin pKDl36 on osoitettu lisäävän merkittäväs- ti glukoosiekvivalenttien lukumäärää (hiilen kulkeutumis- ta) joka on sitoutunut aromaattisten aminohappojen biosyn-35 teettiselle reitille. Tämä plasmidi sisältää transketolaa- 115636 8 siä koodittavan tkt-geenin (Draths, K.M., Frost, J.W., J. Am. Chem. Soc., 1990; 112:1657; Draths, K.M., Pompliano, D.L., Conley, D.L., Frost, J.W., Berry, A., Disbrow, G., Staversky, R., Lievense, J. julkaisemattomia tuloksia), 5 tyrosiiniherkkää DAHP-isotsyymiä koodittavan aroF-geenin (Herrmann, K.M., Amino Acids: Biosynthesis and Genetic

Regulation, toim. Herrmann, K.M., Somerville, R.L., Addi-son-Wesley: Reading, 1983, kappale 17; Pittard, A.J.,

Escherichia coli and Salmonella typhimurium, toim. Neid-10 hardt, F.C., American Society for Microbiology, Washington, 1987, Voi. 1, kappale 24, Cobbett, C.S., Morrison, S., Pittard, J. J. Bacteriol., 1984, 157:303; Garner, C.C., Herrmann, K.M., J. Biol. Chem., 1985, 260:3820;

Cobbett, C.S., Delbridge, M.L., J. Bacteriol., 1987, 15 169:2500; Ogino, T., Garner, C., Markley, J.L., Herrmann, K. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79:5828; Weaver, L. M., Herrmann, K.M., J. Bacteriol., 1990, 172:6581) ja dehydrokinaattisyntaasia (DHQ) koodittava aroB-geeni (Draths, K.M., Frost, J.W., J. Am. Chem. Soc., 1990, 20 112:9630). Nämä entsyymit katalysoivat transformaatioita aromaattisten aminohappojen biosynteesin yleisellä reitillä ( kuvio 1).

; ( Kuvatulla menetelmällä tehty kiniinihappo voidaan

« I

’ ’ muuttaa muiksi johdannaisiksi, kuten bentsokinoniksi ja ·.: 25 vastaavasti hydrokinoni ksi. Bentsokinoniksi muuttaminen t * "· voidaan saada aikaan siten että kiniinihappo saatetaan ;,· · reagoimaan mangaanidioksidin ja soveliaan hapon kanssa, ;:: kuten rikkihapon kanssa, soveliaissa olosuhteissa. Bentso- kinoni voidaan muuttaa hydrokinoniksi sinänsä tunnetulla : 30 tavalla.

Kokeellinen ’ Escherichia coli AB2848aroD:11a, aroD-kannalla, ei ole mitään dehydrokinaattidehydrataasiaktiivisuutta. Kanta ,,,· AB2848aroD, jossa on lisääntynyt glukoosin sitoutuminen .. 35 aromaattiselle aminohapporeitille ja metabolinen este, » 115636 9 kasaa dehydrokinaattia. Tämä konstruktio, transformoituna plasmidilla pTW8090A, joka sisältää kinaattidehydrokinaa-sia koodattavan gad-geenin, on kasannut korkeimmat kinii-nihapon konsentraatiot (24 mM) D-glukoosista (80 mM).

5 qad-geenin eristys gad-geenin eristys Klebsiella pneumoniae -kannasta A170-40 saatiin aikaan kuviossa 3 havainnollisesti esitetyllä tavalla. Genomisen DNA:n eristystä standardinomai-sella menetelmällä (Silhavy, T.J., Berman, M.L., Enquist, 10 L.W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Box 100, Cold Spring Harbor, New York 11724, 1984) seurasi osittainen BamHI-digestio ja kloonaus kosmidiin pLAFR3 (Friedman, A.M., Long, S.R., Brown, S.E., Buikema, W.J., Ansubel, F.M., Gene, 1982, 18:289). Tulok-15 sena olevien konkatemeerien pakkaus lambda-faagiin ja tätä seuraava Escherichia coli -kannan BJ502 infektointi tuotti konstruktion, joka hankki uudelleen normaalit kasvuvauhdit minimielatusaineissa, johon oli lisätty kiniinihappoa. Mutantti BJ502:sta puuttuu 85 % villityyppisen kannan 20 transketolaasiaktiivisuudesta. Tuloksena oleva rajoitus D-erythroosi-4-fosfaatin saatavuudessa saa aikaan hitaan kasvun minimielatusaineissa, joihin ei ole lisätty aromaattista aminohappoa. BJ502:n kasvua glukoosissa kiihdytti kinaattidehydrogenaasin kyky muuttaa kiniinihappo de-25 hydrokinaatiksi, joka muutettiin sitten biosynteettisesti • ’ BJ502:n tarvitsemiksi aromaattisiksi aminohapoiksi. Plas- : \ midi p45 eristettiin tätä selektiosuunnitelmaa käyttäen.

; ;: pTW8090A:n muodostaminen p45:n subkloonaus alkoi Hindlll-digestiolla ja si-j 30 joittamisella ekspressiovektoriin pSU18 (Martinez, E., .*··, Bartolome, B., de la Cruz, F., Gene, 1988, 68:159-62; ·' Chang, A.C.Y., Cohen, S.N., J. Bacteriol., 1978, 134(3):1141-56). AB2847aroB:n transformaatio, jota seurasi * i t kasvu/ei-kasvu-selektio, tuotti plasmidin pl35. AB2847- 35 aroB/pl35:n kasvatus glukoosilla ja kiniinihapolla vahvis- 115636 10 ti gad-geenin läsnäolon ja ekspression. Ei kuitenkaan havaittu dehydrokinaatin tai kinaatin kasaantumista AB2848-aroD/pKD136/pl35:ssä. Tämä viittasi siihen, että pl35 sisälsi myös geenin joka kooditti dehydrokinaattidehydrataa-5 siä (aroD). Tämän johdosta plasmidi pl35 subklonaattiin osittaisella Kpnl-digestiolla ja saatettiin uudestaan rengasmaiseksi, jolloin saatiin plasmidi pTW6135, joka oli gad+aroD-.

Tämän jälkeinen AB2848aroD/pKDl36:n transformaatio 10 pTW6135:lla, ja kasvatus rikkaassa elatusaineessa, jota seurasi solujen keräys ja näiden solujen resuspensointi M9-minimielatusaineeseen, joka oli 56 mM glukoosin suhteen (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. laitos, Cold Spring 15 Harbor Laboratory Press, Box 100, Cold Spring Harbor, New York 11724, 1989) johti dehydrokinaatin (9,5 mM) ja kinii-nihapon (7,5 mM) kasaantumiseen. Koska insertti oli edelleen varsin suuri, noin 11 kb, saatettiin loppuun jatko-subkloonaus. pTW6135:n osittainen EcoRI-digestio, jota 20 seurasi saattaminen uudestaan rengasmaiseksi, poisti noin

8,1 kb ja tuotti pTW6264A:n. Jotta saataisiin uudelleen aikaan riittävä moninkertainen kloonauskohta, pTW6264A

i- I

digestoitiin EcoRI:llä ja insertti kloonattiin pKK223-

E I

' ' 3:een. Tuloksena oleva gad+-plasmidi gad-pKK223-3 di- * ' * ··'· 25 gestoitiin sitten EcoRl:llä ja insertti kloonattiin • pSU19:ään. Tuloksena olevalle plasmidille annettiin nimek- ,; · si pTW8090A ja tätä seuraava konstruktio AB2848aroD/- : :: pKD136/pTW8090A, kasvatettuna rikkaissa elatusaineissa, jota seurasi inkubointi minimielatusaineissa, kasasi kor-• ./; 30 keimmat kiniinihapon tasot (24 mM) tähän mennessä. Kaikki ··, D-glukoosi (80 mM) joka oli alun perin läsnä viljelmän • supernatantissa, kulutettiin ja ei ollut havaittavissa ·· mitään ilmeistä dehydrokinaatin muodostumista.

Esimerkki 1 35 Liuokset, joita käytettiin kasvattamaan AB2848- aroD/pKD136/pTW8090A, tai kasaamaan kiniinihappoa, käsit- 115636 11 tivät M9-elatusaineen (per litra: 6 g Na2HP04, 3 g KH2P04, 0,5 g NaCl ja 1 g NH4C1) ja LB-elatusaineen (per litra: 10 g Bacto-tryptonia, 5 g Bacto-hiivauutetta, ja 10 g NaCl). 4 1 erlenmeyer, jossa oli 1 1 LB-elatusainetta, 5 joka sisälsi myös ampisilliinia (40 pg/ml) ja kloramfeni-kolia (40 pg/ml) ympättiin (0,5 tilavuusprosenttia), yli yön vljelmällä samassa elatusaineessa kasvatettua AB2848-aroD/pKD136/pTW8090A:ta. Soluja viljeltiin 37 °C:n lämpötilassa ravistellen (200 rpm) 12 tunnin ajan. Solut kerät-10 tiin (10 000 g, 10 min, 4 °C), supernatantti dekantoitiin ja solusakka resuspensoitiin 50 ml:aan M9-elatusainetta. Solut kerättiin uudelleen (10 000 g, 10 min, 4 °C), supernatantti dekantoitiin ja solut resuspensoitiin 4 1 erlen-meyer-pulloon, jossa oli 1 1 M9-elatusainetta, joka sisäl-15 si glukoosia (80 mM), MgS04:ää (1 mM), tiamiinia (50 pg/ml), ampisilliinia (40 pg/ml) ja kloramfenikolia (40 pg/ml). Tätä kasaamiselatusainetta viljeltiin 37 °C:n lämpötilassa ravistellen (200 rpm) 72 h ajan. 72 tunnin kuluttua viljelmän supernatantti analysoitiin spektroskoop-20 pisesti (ΧΗ NMR:ssä), joka viittasi siihen että glukoosia ei ollut läsnä ja että kiniinihappoa (24 mM) oli syntetisoitu. Viljelmän supernatantissa läsnä olevan kiniinihapon * määritettiin spektroskooppisesti (*Η NMR) olevan identtinen kaupallisista lähteistä hankitun kiniinihapon kanssa.

25 Esimerkki 2 t ’ Varastoitua viljelmää kannasta AB2848aroD/pKDl36/- j pTW8090A (0,5 ml) käytettiin ympättäessä 500 ml hiivauute- elatusainetta (15 g/1 hiivauutetta, 24 g/1 K2HP04:ää, 9,5 g/1 KH2P04:ää, 5,0 g/1 (NH4)2S04:ää, 0,1 g/1 ampisilliinia) * ; 30 3 l:n Fernbach-pullossa. Soluja viljeltiin 35 °C:n lämpö- \ tilassa ravistellen (150 rpm) 12 tunnin ajan. Fernbach- ‘ viljelmä siirrettiin sitten 14 l:n ravisteltuun, ilmastet- ;;; tuun fermenttoriin, joka sisälsi 5,5 1 minimisuolaelatus- ainetta (5,0 g/1 glukoosia, 7,5 g/1 KH2P04, 2,0 g/1 sitruu-35 nahappoa, 1,2 g/1 H2S04, 2,0 g/1 MgS04*7H20, 0,32 g/1 rau- 115636 12 ta(III )ammoniumsitraattia, 0,02 g/1 Na2S04, 0,004 g/l

MnS04·H20 , 0,004 g/l ZnCl2, 0,004 g/l CoC13-6H20, 0,006 g/l CuS04 · 5H20, 0,32 g/l FeS04-7H20, 0,003 g/l HC1, 0,1 g/l ampisilliinia). Fermentointia ilmastettiin 10 1/min. pH 5 säädettiin 7,0:ksi 28 % ammoniumhydroksidin vesiliuoksella. Lämpötila pidettiin 35 °C:n lämpötilassa. Liuenneen hapen pitoisuutta säädeltiin pitämällä nesteen ilmapitoi-suus 20 %:ssa vaihtelemalla ravistelunopeutta. Vaahdones-toainetta lisättiin tarvittaessa vaahtoamisen estämiseksi. 10 Kun glukoosin alkuperäinen määrä kulutettiin loppuun, syötettiin konsentroitu glukoosiliuos (700 g/l) alkaen nopeudesta 0,32 ml/min. Glukoosin syöttönopeutta lisättiin eksponentiaalisesti arvoon 1,44 ml/min seuraavien 12 tunnin ajan ja sitten se pidettiin vakiona 1,44 ml/min. Kiniini-15 hapon konsentraatio elatusaineliemessä saavutti arvon 10,7 g/l (58 mM) 24 tunnin fermenttoriviljelyn jälkeen.

Esimerkki 3

Solujen poiston jälkeen (10 000 g, 10 min, 4 °C) epäpuhdas viljelmäsupernatantti, joka sisälsi kiniinihap-20 poa (4,8 g, 25 mmol) lisättiin yhdessä väkevän rikkihapon (25 ml) ja teknisen laadun mangaanidioksidin (200 g, 2,4 mol) kanssa 3 l:n pyöreäpohjaiseen kolviin, johon oli so-vitettu palautusjäähdytin, yläpuolella sijaitseva sekoit- * * * taja ja lämpömittari. Kolvin sisällön lämpötila kohotet-‘ 25 tiin 100 °C:ksi ja sitä pidettiin tässä lämpötilassa . , 1 tunnin ajan. Sen jälkeen kun oli jäähdytetty huoneenläm- pötilaan, reaktioseos suodatettiin ja uutettiin etyyliase- tr· ’·’ ' taatilla. Kaasukromatografia-analyysin perusteella saatiin 40-prosenttinen bentsokinonin saanto. Bentsokinonituotteen .; · 30 havaittiin olevan identtinen autenttisen materiaalin kans sa, perustuen XH NMRrään ja kaasukromatografia-koinjektoon.

i »

Claims (11)

1. Menetelmä kiniinihapon tai sen johdannaisten, joihin kuuluvat bentsokinoni ja hydrokinoni, tuottamisek- 5 si, tunnettu siitä, että: a) valitaan isäntäsolu, joka kykenee syntetisoimaan dehydrokinaattia, b) estetään isäntäsolun reitillä dehydrokinaatin muuttaminen dehydroshikimaatiksi, 10 c) mahdollisesti tuodaan isäntäsoluun kyky muuttaa dehydrokinaatti kiniinihapoksi, jos isäntäsolulla ei ole sellaista kykyä sisäsyntyisesti, d) lisätään hiilen kulkeutumista uusiutuvasta hii-lenlähteestä isäntäsolun reitille, 15 edellyttäen että vaiheet b) , c) ja d) voidaan suo rittaa missä tahansa järjestyksessä tai yhtaikaa, ja e) kasvatetaan soluja uusiutuvan hiilenlähteen läsnäollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että reitti estetään dehydrokinaatin muodostumisen jälkeen seurauksena dehydrokinaattidehydra-taasin puuttumisesta isäntäsolussa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dehydrokinaattidehydrataasia koo-25 dittava geeni isäntäsolussa on poistettu kokonaan tai . . osittain tai on mutatoitu. • » ·

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, • > · • ’ tunnettu siitä, että poistettu geeni on aroD.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, * I : 30 tunnettu siitä, että isäntäsolukanta on Escherichia co- » » » ’,,,· li -kanta AB2848aroD/pKD136, ATCC talletusnumero 69086.

,!. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, »Ml ,···, tunnettu siitä, että kyky muuttaa dehydrokinaattia ki- I I T niinihapoksi on seurausta Klebsiella pneumoniaen kinaatti- : 35 dehydrogenaasia koodaavan isäntäsolulle endogeenisen gee- 115636 nin viemisestä isäntäsoluun, jossa isäntäsolu on Escheria -suvusta.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuodaan gad-geeni.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että gad-geeni tuodaan plasmidissa pTW6135 (kuvio 3B) tai pTW8090A (kuvio 3C), jotka kykenevät ekspressoimaan gad-geeniä, jolloin mainitut plasmidit ovat saatavilla suorittamalla kuvioissa 3A-3C esitetty me-10 netelmä.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään hiilen kulkua reitille transformoimalla isäntäsolut yhdistelmä-DNA:11a, joka käsittää transketolaasia koodittavan geenin, DAHP-syntaasin 15 isotsyymiä koodittavan geenin ja 3-dehydrokinaattisyntaa-sia koodittavan geenin.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geenit ovat tkt, aroF ja aroB.

11. Kromosomaalinen tai kromosomin ulkoinen ge-20 neettinen elementti, joka sisältää yhden tai useamman Klebsiella pneumoniaesta eristetyn gad-geenin kopion. t « * > 1 · » · » * » · t « · * » I · * 1 » • · · · 115636