JP3464481B2 - グルコースからのキナ酸の合成 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はグルコースのような炭素源の転換によるキノ
イド化合物、特にキナ酸（キナ酸塩）並びにその前駆体
及び誘導体の生成に関する。工業的に重要な有機化合物
であるヒドロキノン及びベンゾキノンはともに、キナ酸
の二酸化マグネシウム（IV）酸化により誘導され得る
（Woskrensensky,A.,Justus Liebigs Ann.Chem.,1838,2
7;257参照）。キナ酸は、その多くが生物学的に重要な
種々の合成試薬の合成のための鏡像体的に純粋な出発物
質として用いられる重要な分子である。例えばキナ酸
は、臓器移植拒絶反応を防止するのに有用な免疫抑制剤
であるFK−506の合成のための有用な出発物質である（R
ao,A.V.R.,et al.,Tetrahedron Lett.,1990,32（４）:5
47−50参照）。それは、別の方法では得るのが難しい多
数の天然物質（例えばマイコスポリン及びＤ−ミオ−イ
ノシトール−1,4,5−トリホスフェート。それぞれWhit
e,et al.,J.Am.Chem.Soc.,1989,111（24）:8970−２及
びFalck,et al.,J.Org.Chem.1989,54（25）:5851−２参
照）の合成に便利な供給源としても用いられる。さらに
キナ酸は食品添加分解剤として用いられるし、光学物質
中に実験的に用いられている。

キナ酸は従来天然供給源（例えばキナ皮、タバコの
葉、ニンジンの葉等）から単離されてきた。しかしなが
らこのような供給源からキナ酸を単離するコストが高い
ために、出発物質としてそれを用いると経済的に成り立
たない。さらにキナ酸は化学的にも合成されてきたが、
しかしこのような合成には溶媒、高反応性試薬及び危険
廃棄物を伴い、それ自体環境上望ましくない。それゆ
え、キナ酸の合成のための費用に見合った効果のある環
境的に望ましい方法が必要である。

したがって本発明の目的は、トウモロコシ、サトウダ
イコン、サトウキビ又はバイオマスのような再生可能な
供給源から得られる炭素源を出発物質として用いるキナ
酸の製造方法を提供することである。

発明の要約 本発明は、生体触媒的に３−デヒドロキネートに転換
され得る炭素源、例えばグルコースを用いる、宿主細胞
の一般芳香族経路（図１及び２に示すような）からのキ
ナ酸並びにベンゾキノン及びヒドロキノンのような関連
キノイド有機化合物の製造方法に関する。本発明に有用
な宿主細胞は、炭素源を３−デヒドロキネートに転換し
得るあらゆる微生物である。

本発明の１つの方法態様では、以下の： ａ）デヒドロキネートを合成し得る宿主細胞を選択し； ｂ）デヒドロキネートの異なる化合物への転換が防止さ
れるがしかしデヒドロキネートのキナ酸への酵素反応は
遮断されないように宿主細胞の経路における１つ又はそ
れ以上の酵素反応を遮断し； ｃ）任意にデヒドロキネートをキナ酸に転換する能力
を、このような能力が宿主細胞に存在しない場合には宿
主細胞中に導入し；そして ｄ）宿主細胞の経路中への炭素の流量を増大する 工程から成り、但し工程ｂ）,c）及びｄ）が任意の順序
で又は同時に実施されるキノイド化合物（即ちキナ酸）
の製造方法を記載する。

本発明の一態様においては、トランスケトラーゼをコ
ードする遺伝子、DAHPシンターゼのアイソザイムをコー
ドする遺伝子及び３−デヒドロキネートシンターゼをコ
ードする遺伝子を包含する組換え体DNAで宿主細胞を形
質転換することにより経路中への炭素の流量が増大され
る。プラスミドpKD136は、酵素トランスケトラーゼ、DA
HPシンターゼのチロシン感受性アイソザイム及び３−デ
ヒドロキネートシンターゼをそれぞれコードする遺伝子
tkt,aroF及びaroBを保持する。プラスミドpKD136の構築
及び大腸菌E.coliによるpKD136の発現はこれまでに記載
されている（Draths,K.M.;Frost,J.W.;J.Am.Chem.Soc.;
1990;112:9630参照。この記載内容は参照により本明細
書中に含めるものとする）。

さらに本発明は、宿主細胞の一般芳香族経路（図１に
示すような）における１つ又はそれ以上の酵素反応を遮
断し、したがって経路中のデヒドロキネートの他の化合
物への転換を妨げるが但しデヒドロキネートのキナ酸へ
の転換は遮断しない（図２に示すように）ことを包含す
る。このような遮断作用は、デヒドロキネートデヒドラ
ターゼをコードする遺伝子座（aroD）の（全部又は一部
の）突然変異又は欠失により実行される。欠失又は突然
変異によるこのような遮断作用は、経路中に最初に向け
られる炭素流量のほとんど又はすべてが確実にキナ酸の
合成に向けられるようにする。

さらに本発明は、デヒドロキネートをキナ酸に転換す
ることを包含する。宿主細胞はデヒドロキネートをキナ
酸に転換する内生的能力を有する（例えば宿主細胞はキ
ネートデヒドロゲナーゼをコードする内生的遺伝子を有
する）。あるいはこの能力はキネートデヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子（例えばqad遺伝子）を包含する組
換え体DNAにより宿主細胞の形質転換の結果であるかも
しれない。宿主細胞がこの転換を実行する能力を欠く本
発明の一態様は、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）
から単離されたqad遺伝子で宿主細胞を形質転換するこ
とを包含する。

本発明の好ましい態様において、宿主細胞は大腸菌
株、特に大腸菌AB2848aroD/pKD136/pTW8090A株（ATCC
＃69086）である。

図面の簡単な説明 図１は、芳香族生合成の一般経路の略図である。

図２は、一般芳香族経路の生成物としてのキナ酸を示
す略図である。

図3a,b及びＣは、肺炎杆菌（Klebsiella pneumonia
e）からqad遺伝子を単離してpTW8090Aを生じる地図であ
る。

本発明の詳しい説明 グルコースから出発する一般芳香族経路は、種々の芳
香族化合物の生成（例えばグルコースから出発して、経
路中で中間生成物又は前駆化合物を生じて最後にはコリ
スメートに至る経路を描いた図１参照）のための種々の
微生物に関して公知である。このような経路に包含され
る酵素としては、DAHPシンターゼ（aroF）、DHQシンタ
ーゼ（aroB）、DHQデヒドラターゼ（aroD）、シキメー
トデヒドロゲナーゼ（aroE）、シキメートキナーゼ（ar
oL）、EPSPシンターゼ（aroA）及びコリスメートシンタ
ーゼ（aroC）が挙げられる。この経路中にグルコース等
価物を送り込むために及び／又はこの経路が進行してそ
れによりデヒドロキネート（DHQ）が蓄積されるのを遮
断するために宿主細胞は導入され得ることが判ってい
る。

この発散経路又は一般芳香族経路酵素機能の導入を遂
行又は制御し得るタンパク質をコードする遺伝子の発現
増強は、宿主細胞中に伝達可能な遺伝体により仲介され
る。遺伝体としては、本明細書中に明記のように経路酵
素機能を遂行又は制御し得る物質、例えばタンパク質、
アポタンパク質又はアンチセンスRNAに対する発現性コ
ード配列を有する核酸（一般にDNA又はRNA）が挙げられ
る。発現タンパク質は酵素として機能し、酵素活性を抑
制又は脱抑制し、あるいは酵素の発現を制御し得る。こ
れらの発現性配列をコードする核酸は染色体性（例えば
相同性組換えにより宿主細胞染色体中に組み込まれる）
又は染色体外性（例えばプラスミド、コスミド等により
保持される）であり得る。さらに遺伝体は、タンパク
質、アポタンパク質又はアンチセンスRNAに対するコー
ド配列の発現又は脱抑制を制御するよう作用するプロモ
ーター、リプレッサー及びエンハンサーを含む任意の発
現制御配列を包含すると定義される。例えばこのような
制御配列は宿主細胞ゲノム中にすでにコードされた選択
酵素の過剰発現をプロモートするために野性型宿主細胞
中に挿入され得るか、あるいは染色体外でコードされる
酵素の合成を制御するために用いられる。

本発明の遺伝体は、宿主細胞中への遺伝体の転位を仲
介するプラスミド、コスミド、ファージ、酵母菌人工染
色体又は他のベクターにより宿主細胞中に導入され得
る。これらのベクターはベクター及びベクターに保持さ
れる遺伝体の複製を制御するシス作用制御体とともに複
製のオリジンを含み得る。選択性マーカーはベクター上
に存在して遺伝体が導入されている宿主細胞の同定の助
けとなる。例えば選択性マーカーは、特定の抗生物質、
例えばテトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェ
ニコール、カナマイシン又はネオマイシンに対する耐性
を付与する遺伝子である。

宿主細胞中に遺伝体を導入するための好ましい手段
は、本発明に従って遺伝体が挿入される染色体外性多複
写プラスミドベクターを用いる。宿主細胞中への遺伝体
のプラスミド保持導入は、本発明に従って、制限酵素に
よるプラスミドの初期開裂とその後のプラスミド及び遺
伝体の結紮とを伴う。結紮組換え体プラスミドの再環化
に際しては、プラスミド転移のための形質導入又は他の
メカニズムを用いてプラスミドを宿主細胞中に転移させ
る。宿主細胞中への遺伝子の挿入に適したプラスミドと
してはpKD136,p45,p135,pTW6135,pTW6264A,pKK223−３
及びpTW8090Aが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に用いるのに適した宿主細胞は、所望の芳香族
化合物の工業的生合成生産に用い得る属の成員である。
したがって、宿主細胞炭素源を３−デヒドロキネートに
転換し得る微生物を含み得る。好ましい宿主細胞は大腸
菌である。

コリスメート経路から発する経路から得られるキナ酸
及び他の代謝物質の工業的製造のために、代謝生合成経
路中の１つ又はそれ以上の酵素のフィードバック阻害を
欠く上記の属の脱調節突然変異体株を用いてもよい。

本発明の好ましい態様においては、キナ酸は大腸菌に
より合成される。大腸菌によるこの合成を図２で説明す
るが、この場合経路はaroD酵素活性（図２のｃ）を除去
し、qad遺伝子（図２のｄ）を宿主細胞中に導入してデ
ヒドロキネート（DHQ）をキナ酸に転換することにより
遮断される。この経路のこの変更は、芳香族アミノ酸及
び関連二次代謝物質の生体触媒的合成の設計において考
慮すべき重要な変数を構成する。特に変更経路はグルコ
ースのような炭素源をキナ酸に転換するのに有用な経路
であり、このキナ酸からは種々の薬剤、農薬、風味料及
び重合阻害剤が工業的に得られる。

宿主細胞（大腸菌）における一般経路又は芳香族アミ
ノ酸生合成に送られる炭素の流量を増大するための成功
した試みに基づいて、大腸菌中へのキネートデヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子の導入はシキメート経路中間
生成物デヒドロキネートからのキナ酸の生成が引き起こ
すと考えられた。

この期待は、キナ酸の方を選んで存在するキネートデ
ヒドロゲナーゼにより触媒されるデヒドロキネート及び
キネートの相互交換の平衡（Davis,B.D.;Gilvarg,C.;Mi
tsuhashi,S.;Meth.Enzymol.;1955;2:300）に基づいてい
た。それは大腸菌に固有のものではないため、キネート
デヒドロゲナーゼコードqad遺伝子は別の株から単離さ
れた。肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）突然変異体
株A170−40を用いた。肺炎杆菌のようないくつかの細菌
株はその唯一の炭素源としてキナ酸を用い得る。デヒド
ロキネート異化作用によって、これらの株はキネートデ
ヒドロゲナーゼにより触媒される反応の前述の平衡を熱
力学的に嫌われる方向に置き換える。

プラスミドpKD136は芳香族アミノ酸生合成経路に送ら
れるグルコース等価物（炭素流量）の総数を有意に増大
することが示されている。このプラスミドはトランスケ
トラーゼコードtkt遺伝子（Draths,K.M.;Frost,J.W.;J.
Am.Chem.Soc.;1990;112:1657;Draths,K.M.;Pompliano,
D.L.,Conley,D.L.,Frost,J.W.,Berry,A.,Dishrow,G.,St
aversky,R.,Lievense,J.,未発表結果）、チロシン感受
性DAHPアイソザイムコードaroF遺伝子（Herrmann,K.M.,
Somerville,R.L.,Ed.,Addison−Wesley:Reading,1983,C
hapter 17;Pittard,A.J.,Escherichia coli and Salmon
ella typhimurium,Neidhardt,F.C.,Ed.,American Socie
ty for Microbiology,Washington,1987,Vol.1,Chapter
24;Cobett,C.S.,Morrison,S.,Pittard,J.,Bacteriol.,1
984,157:303;Garner,C.C.,Herrmann,K.M.,J.Biol.Che
m.,1985,260:3820;Cobett,C.S.,Delhridge,M.L.,J.Bact
eriol.,1987,169:2500;Ogino,T.,Garner,C.,Markley,J.
L.,Herrmann,K.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1982,79:58
28;Weaver,L.M.,Herrmann,K.M.,J.Bacteriol.,1990,17
2:6581）、及びデヒドロキネート（DHQ）シンターゼコ
ードaroB遺伝子（Draths,K.M.;Frost,J.W.;J.Am.Chem.S
oc.;1990;112:9630）を包含する。これらの酵素は芳香
族アミノ酸生合成のための一般経路（図１）における形
質転換を触媒する。

上記の工程により製造されたキナ酸はベンゾキノンの
ような他の誘導体に、そして次にヒドロキノンに転換し
得る。ベンゾキノンへの転換は、適切な条件下でキナ酸
を二酸化マンガン及び硫酸のような適切な酸と反応させ
ることにより達成できる。ベンゾキノンは、当業者に公
知の標準方法によりヒドロキノンに転換し得る。

実験的所見： 大腸菌AB2848aroD、即ちaroD株はいかなるデヒドロキ
ネートデヒドラターゼ活性をも示さない。芳香族アミノ
酸経路へのそのグルコース送入増大及び代謝遮断を示す
AB2848aroD/pKD136株はデヒドロキネートを蓄積する。
この構築物は、キネートデヒドロゲナーゼコードqad遺
伝子を含有するプラスミドpTW8090Aで形質転換した場
合、Ｄ−グルコース（80mM）から最高濃度のキナ酸（24
mM）を蓄積した。

qad遺伝子の単離 図３に示すように肺炎杆菌A170−40株からのqad遺伝
子の単離を達成した。標準プロトコール（Silhavy,T.
J.,Berman,M.L.,Enquist,L.W.,Experiments with Gene
Fusions,Cols Spring Harbor Laboratory Press,Box 10
0,Cold Spring Harbor,New York 11724,1984）によりゲ
ノムDNAを単離後、部分BamH Iで消化し、コスミドpLAFR
3中にクローニングした（Friedman,A.M.,Long,S.R.,Bro
wn,S.E.,Buikema,W.J.,Ansubel,F.M.,Gene,1982,18:28
9）。その結果生じたコンカテマーをラムダファージ中
にパッケージングし、その後大腸菌BJ502株に感染させ
ると、キナ酸を補充した最少培地上で正常成長速度を再
獲得した構築物を生じた。突然変異体BJ502は野性型株
のトランスケトラーゼ活性の85％を欠いている。その結
果生じるＤ−エリトロース４−リン酸利用可能性の制限
により、芳香族が補充されない最少培地上での成長が遅
くなる。グルコース上でのBJ502の成長は、キナ酸をデ
ヒドロキネートに転換し、次いで生合成的にBJ502が必
要とする芳香族アミノ酸に転換するキネートデヒドロゲ
ナーゼの能力により加速される。この選択計画を用いて
プラスミドp45を単離した。

pTW8090Aの構築 Hind IIIで消化し、発現ベクターpSU18に挿入するこ
とによりp45のサブクローニングを開始した（Martinez,
E.,Bartolome,B.,de la Cruz,F.,Gene,1988,68:159−6
2;Chang,A.C.Y.,Cohen,S.N.,J.Bacteriol.,1978,134
（３）:1141−56）。AB2847arobを形質転換したのち成
長／非成長選択して、プラスミドp135を得た。グルコー
ス及びキナ酸上でのAB2847aroB/p135の成長は、qad遺伝
子の存在及び発現を確証した。しかしAB2848aroD/pKD13
6/p135においてはデヒドロキネート又はキネートの蓄積
は検出されなかった。これはp135もデヒドロキネートデ
ヒドラターゼをコードする遺伝子（aroD）を保持するこ
とを示した。その結果、プラスミドp135を部分Kpn I消
化及び再環化によりサブクローニングしてqad⁺ aroD^-で
あるプラスミドpTW6135を得た。

その後pTW6135でAB2848aroD/pKD136を形質転換し、富
栄養培地で成長させて、細胞を採集し、これらの細胞を
56mMグルコースを含有するM9最少培地（Sambrook,J.,Fr
itsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laborat
ory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory P
ress,Box 100,Cold Spring Harbor,New York 11724,198
9）に再懸濁すると、デヒドロキネート（9.5mM）及びキ
ナ酸（7.5mM）が蓄積した。挿入物は約11kbで非常に大
きかったため、さらにサブクローニングを完成させた。
pTW6135を部分EcoR I消化し、次いで再環化して約8.1kb
を除去し、pTW6264Aを得た。十分に多いクローニングＶ
を再確立するために、pTW6264AをEcoR I消化し、挿入物
をpKK223−３中にクローニングした。その結果生じたqa
d⁺プラスミドqad−pKK223−３を次にEcoR Iで消化し、
挿入物をpSU19中にクローニングした。その結果生じた
プラスミドをpTW8090Aと名付けた。その後富栄養培地で
成長させ、最少培地でインキュベーションして生じた構
築物AB2848aroD/pKD136/pTW8090Aは今日までのところ最
高レベルのキナ酸（24mM）を蓄積した。培養上清中に最
初に存在したＤ−グルコース（80mM）はすべて消費さ
れ、デヒドロキネート生成は立証されなかった。

実施例１ AB2848aroD/pKD136/pTW8090Aを増殖させるために又は
キナ酸を蓄積させるために用いられる溶液は、M9培地
（１リットル当たり:Na₂HPO₄6g,KH₂PO₄ 3g,NaCl0.5g及
びNH₄Cl1g）及びLB培地（１リットル当たり:Bactoトリ
プトン 10g、Bacto酵母菌抽出物5g及びNaCl 10g）を
含んでいた。アンピシリン（40μg/mL）及びクロラムフ
ェニコール（40μg/mL）を含有するLB培地1Lを加えたエ
ーレンマイヤーErlenmeyer 4Lに同一培地で増殖させたA
B2848aroD/pKD136/pTW8090Aの一夜培養を接種した（0.5
容量％）。細胞を攪拌（200rpm）しながら37℃で12時間
培養した。細胞を採取し（10000g、10分、４℃）、上清
をデカントして、細胞ペレットをM9培地50mL中に再懸濁
した。細胞を再び採集し（10000g、10分、４℃）、上清
をデカントして、グルコース（80mM）、MgSO₄（1mM）、
チアミン（50μg/mL）、アンピシリン（40μg/mL）及び
クロラムフェニコール（40μg/mL）を含有するM9培地1L
を加えたエーレンマイヤーErlenmeyer 4L中に細胞を再
懸濁した。この蓄積培地を攪拌（200rpm）しながら37℃
で72時間培養した。72時間目に培養上清を分光分析（¹H
NMR）した結果、グルコースは存在せずそしてキナ酸（2
4mM）が合成されていたことが示された。培養上清中に
存在するキナ酸は、市販供給源から得られたキナ酸と分
光分析（¹HNMR）的に同一であることが確かめられた。

実施例２ AB2848aroD/pKD136/pTW8090A（0.5mL）の保存培養を
用いて、3LフェルンバッハFernbachフラスコ中の酵母菌
抽出物培地（酵母菌抽出物15g/L、K₂HPO₄ 24g/L、KH₂P
O₄9.5g/L、（NH₄）₂SO₄5.0g/L、アンピシリン0.1g/L）5
00mLに接種した。細胞を攪拌（150rpm）しながら35℃で
12時間培養した。次にフェルンバッハ培養を、最少培地
（グルコース5.0g/L,KH₂PO₄7.5g/L、クエン酸2.0g/L、H
₂SO₄ 1.2g/L、MgSO₄・7H₂O2.0g/L、クエン酸アンモニ
ウム第二鉄 0.32g/L、Na₂SO₄0.02g/L、MnSO₄・H₂O 0.
004g/L、ZnCl₂ 0.004g/L、CoCl₃・6H₂O0.004g/L、CuSO
₄・5H₂O0.006g/L、FeSO₄・7H₂O 0.32g/L、HCl 0.003g
/L、アンピシリン0.1g/L）5.5Lを含有する28％塩化アン
モニア水溶液を用いてpHを7.0に制御した。温度は35℃
に保った。攪拌速度を変えることにより溶解酸素濃度を
空気飽和状態の20％に制御した。必要な場合には消泡剤
を加えて発泡を防止した。初期量のグルコースが使い果
たされたならば、濃縮グルコース溶液（700g/L）を0.32
mL/mで開始して供給した。グルコース供給速度を指数関
数的に増大して次の12時間には1.44mL/mとし、その後1.
44mL/mで一定に保った。ブイヨン中のキナ酸濃度は発酵
器中での培養24時間後には10.7g/Lに達した。

実施例３ 細胞除去（10000g、10分、４℃）後、キナ酸（4.8g,2
5mmol）を含有する粗製培養上清を濃硫酸（25mL）及び
工業銘柄二酸化マンガン（200g,2.4mol）と一緒に還流
冷却器、頭上攪拌機及び温度計を装備した3L丸底フラス
コに加えた。フラスコ内容物の温度を100℃に挙げて、
この温度を１時間保持した。室温に冷却後、反応混合物
を濾過して酢酸エチルで抽出した。ガスクロマトグラフ
ィーによる分析に基づいて、収率40％のベンゾキノンを
得た。生成物ベンゾキノンは、¹HNMR及びガスクロマト
グラフィー同時注入に基づく真正物質と同一であること
が判明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ドレイス，カレン エム. アメリカ合衆国，インディアナ 47906, ウエスト ラファイエット，＃３エー, コートハウス ドライブ 3025 (56)参考文献 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．14（1981）ｐ．23 −32 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒ ｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．49，Ｎｏ．３ （1985）ｐ．338−358 Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏ ｌ．112（1990）ｐ．9630−9632 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 9/88 C12P 7/42 C12P 7/66 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】キナ酸（Quinic acid）の製造方法におい
   て、 ａ）デヒドロキネートを合成し得る宿主細胞を選択し； ｂ）前記宿主細胞における、デヒドロキネートからデヒ
   ドロシキメートへの転換の酵素反応を遮断し； ｃ）キナ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を前記
   宿主細胞中に導入し； ｄ）宿主細胞の経路中への炭素の流量を増大せしめ； 但し、上記工程ｂ）,c）及びｄ）を任意の順序で又は同
   時に実施し；そして ｅ）炭素源の存在下で前記細胞を培養する； ことを含んで成る方法。
2. 【請求項２】上記工程ｂ）における酵素反応の遮断を、
   宿主細胞中のデヒドロキネートデヒドラターゼ活性を排
   除し又は阻害することにより行なう、請求項１に記載の
   方法。
3. 【請求項３】前記デヒドロキネートデヒドラターゼ活性
   の排除又は阻害を、デヒドロキネートデヒドラターゼを
   コードする遺伝子を全部もしくは一部欠失せしめ、又は
   変異誘発することによって行なう、請求項２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】aroD遺伝子を全部又は一部欠失せしめ、又
   は変異誘発することを含んで成る、請求項３に記載の方
   法。
5. 【請求項５】前記宿主細胞が、大腸菌（Escherichia.co
   li）AB2848aroD/pKD136株である請求項４に記載の方
   法。
6. 【請求項６】qad遺伝子を含むプラスミドpTW6135又はpT
   W8090Aを前記宿主細胞に導入することにより、前記工程
   ｃ）を実施する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の
   方法。
7. 【請求項７】トランスケトラーゼをコードする遺伝子、
   DAHPシンターゼのアイソザイムをコードする遺伝子及び
   ３−デヒドロキネートシンターゼをコードする遺伝子を
   含む組換え体DNAで宿主細胞を形質転換することにより
   経路中への炭素の流量を増大せしめる請求項１〜６のい
   ずれか１項に記載の方法。
8. 【請求項８】tkt、aroF及びaroBにより前記宿主細胞を
   形質転換することを含んで成る、請求項７に記載の方
   法。
9. 【請求項９】プラスミドpKD136により前記宿主細胞を形
   質転換することを含んで成る、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】炭素源を３−デヒドロキネートに転換し
    得る微生物から成る群から前記宿主細胞を選択する、請
    求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記宿主細胞を大腸菌から選択する、請
    求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
12. 【請求項１２】前記大腸菌が、大腸菌株AB2848aroD/pKD
    136/pTW8090Aである請求項11に記載の方法。