FI114011B - Suonensisäiseen käyttöön tarkoitetun immunoglobuliinin käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi syöpäsairauksien hoitamiseksi - Google Patents

Description

1 114011

Suonensisäiseen käyttöön tarkoitetun immunoglobuliinin käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi syöpäsairauksien hoitamiseksi 5 Keksinnön ala

Keksintö liittyy syöpäterapiaan ja erityisesti gammaglobuliinien antamiseen etäpesäkkeiden muodostumisen in-hiboimiseksi ja tukemaan primaarituumorien hoitoa. Tämän keksinnön mukaisesti hoidetaan useita erilaisia syöpäsaira-10 uksia antamalla kokonaisia gammaglobuliineja tai näiden fragmentteja sisältävää valmistetta. Gammaglobuliinivalmis-tetta voidaan antaa parenteraalisesti, edullisesti käyttämällä suonensisäisiä, ruumiinontelonsisäisiä tai ihonalaisia annosteluteitä joko ainoana lääkeaineena tai yhdessä 15 muiden syövän hoitoon tavallisesti käytettävien aineiden tai menetelmien kanssa.

Keksinnön tausta

Yksi syövän vakavimmista seurauksista on primaari-tuumoreista lähtevien malignien tuumorietäpesäkkeiden muo-20 dostuminen primaarituumoriin nähden enemmän tai vähemmän loitolla sijaitseviin ruumiinosiin ja tämä on seuraus, johon ei nykyisin ole saatavilla tyydyttävää hoito-ohjelmaa.

I Useimmilla hoidoilla päädytään tätä sairautta hoidettaessa tuumorien etäpesäkkeiden muodostumisen johdosta epäonnistu- • 25 miseen potilaiden menehtyessä useiden tuumorien kasvuun.

: .* Etäpesäkkeiden muodostumislaajuus vaihtelee kunkin ‘ yksittäisen tuumorityypin mukaan. Melanooma, rintasyöpä, · keuhkosyöpä, koolonisyöpä ja eturauhassyöpä ovat niitä syöpätyyppejä, jotka muodostavat etäpesäkkeitä hyvin herkästi.

·· 30 Etäpesäkkeiden muodostuessa muodostuu useisiin eri paikkoi- hin ruumiissa sekundaarisia tuumoreita ja yleisimmät paikat , ovat keuhkot, maksa, aivot ja luut.

1 ·

Nykyisin saatavilla olevilla syövänhoitomenetelmil-'··* lä, kuten leikkaushoidolla, sädehoidolla, kemoterapialla : 35 ja muilla immunobiologisilla menetelmillä on joko jääty ilman suotuisia tuloksia etäpesäkkeiden muodostumisen eh- , 114011 Λ* käisemisessä tai näiden menetelmien käyttö on johtanut vakaviin ja haitallisiin sivuvaikutuksiin.

Monissa kliinisesti diagnosoiduissa kiinteissä tuumoreissa (tuumoreissa, joissa tuumori on paikallisesti 5 kasvava tuumori) katsotaan ensisijaisen hoitokeinon olevan tuumorin poisto kirurgisesti. Alkuperäisen tuumorin havaitaan kuitenkin monta kertaa leikkauksen jälkeen ja jonkin viiveen kuluttua muodostaneen etäpesäkkeitä, joten syövän leviämiseen liittyviä sekundaarisia kohtia on levinnyt 10 kauttaaltaan koko kehoon ja potilas kuolee tämän jälkeen sekundaarisen syövän kasvuun. Raporteista käy selville, että potilailla, joilla esiintyy leikattavissa olevia tuu-moreita, ei kuolinsyynä ole useinkaan primaarituumorin kasvu eikä sen paikallinen uusiutuminen. Sen sijaan nykyi-15 sin lähes 40 % syövän uhreista, joilla on leikattavissa olevia tuumoreita, menehtyvät lopulta leikkauksen jälkeen ilmaantuvaan metastasoivaan sairauteen.

Etäpesäkkeiden muodostumista tapahtuu joissakin tuumoreissa jatkuvasti. Monta kertaa etäpesäkkeiden muo-20 dostumisen laukaisee itse kirurginen toimenpide. Kirurgisen toimenpiteen aikana malignit solut voivat joutua pois paikoiltaan tuumorimassasta ja päästä verenkiertoon, mikä • a siten lisää etäpesäkkeiden muodostumisen todennäköisyyttä.

Vaikkakin kemoterapiaa käytetään laajalti syövän 25 hoidossa, se on systeeminen hoito, joka perustuu tavalli-sesti solujen lisääntymisen ehkäisyyn. Tämän mukaisesti kemoterapia on epäspesifinen hoitotapa, joka vaikuttaa • kaikkiin lisääntyviin soluihin, mukaan lukien normaaleihin soluihin, ja johtaa haitallisiin ja usein vakaviin sivu- :* 30 vaikutuksiin, kuten immunosupressioon, pansytopeniaan (luuytimen solujen kasvun inhiboitumiseen ja tämän yhtey- . \ dessä esiintyvään anemiaan, trombosytopeniaan ja leukope- • * · niaan), ripuliin, huonovointisuuteen ja alopesiaan (hius-’ ·; * ’ ten menetykseen).

114011 3

Tavallisesti olemassa olevat systeemiset hoidot ovat melko usein osoittautuneet sellaiseksi, että niillä on vähän vaikutusta tuumorista katsottuna etäällä olevissa elimissä (keuhkoissa, maksassa, luuytimessä tai aivoissa) 5 valmiiksi esiintyviin mikroetäpesäkkeisiin, eivätkä ne ole kovinkaan tehokkaita ehkäisemään tuumorin leviämistä muihin kudoksiin.

Tästä syystä on olemassa tarvetta saada käyttöön tuumorien etäpesäkkeiden muodostumisen inhibointiin sovel-10 tuvia menetelmiä. Erityisesti halutaan saada käyttöön menetelmiä, jotka inhiboivat etäpesäkkeiden muodostumista vakavia sivuvaikutuksia aiheuttamatta.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö tarjoaa yleisesti tarkasteltuna rat-15 kaisun edellä tarkasteltuihin ongelmiin antamalla käyttöön suonensisäiseen käyttöön tarkoitetun immunoglobuliinin (IVIG) ja sen samat ominaisuudet omaavat fragmentit sellaisen farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu nisäkkäällä olevan tuumorin metastasoitumisen 20 inhiboimiseen. Erityisesti tässä keksinnössä annetaan käyttöön suonensisäiseen käyttöön tarkoitettu immunoglobuliini i .· (IVIG) ja sen samat ominaisuudet omaavat fragmentit sellai- ’ sen farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on : tarkoitettu nisäkkäällä olevan melanooman metastasoitumisen 25 inhiboimiseen. Tämän keksinnön mukainen IVIG-valmiste voi sisältää kokonaisia immunoglobuliinimolekyylejä tai immuno-globuliinien fragmentteja. Valmistetta annetaan parenteraa-lisesti, edullisesti suonensisäisiä, ruumiinontelonsisäisiä , tai ihonalaisia annosteluteitä käyttäen joko yksinään käy- 3O tettävänä aineena tai yhdessä muiden aineiden tai syövän i · hoidossa yleisesti käytettyjen menetelmien kanssa, j ! j Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on valokuva, joka esittää kontrollihiiristä ja IVIG:11a käsitellyistä hiiristä peräisin olevia edusta-35 via keuhkoja kokeessa, joka oli suunniteltu selvittämään ’* IVIG:n vaikutusta C57BL/6J-hiirissä esiintyvän metastasoi- 4 114011 van melanooman kehittymiseen. Kontrolliryhmässä esiintyy mustia metastasoivia fokuksia, ja pienempi määrä fokuksia esiintyy ryhmässä, jota oli käsitelty yhdellä IVIG-injek-tiolla eikä yhtään havaita keuhkoissa, jotka olivat peräi-5 sin kahdella tai kolmella IVIG-injektiolla käsitellyistä hiiristä.

Kuviot 2 ja 3 ovat valokuvia, joissa on esitetty kontrolliryhmän edustavia keuhkoja verrattuna sellaisista eläimistä peräisin oleviin keuhkoihin, joita oli käsitelty 10 IVIG:lla ja jotka olivat peräisin kokeesta, joka oli suunniteltu selvittämään IVIG:n vaikutusta 5 x 105 B16-F10-me-lanoomasoluinjektion saaneissa hiirissä esiintyvän metas-tasoivan melanooman kehittymiseen. Käsitellyissä hiirissä oli fokusten lukumäärä 90 % pienempi kuin kontrolliryhmäs-15 sä esiintyvien fokusten lukumäärä.

Kuvio 4 on kaavio, joka esittää IVIG:n antamisen vaikutusta melanoomaa sairastavien hiirten eloonjääntiin. IVIG:lla käsiteltyjen hiirten keskimääräinen eloonjäämis-aika oli merkittävästi pitempi.

20 Kuvio 5 on valokuva, joka esittää IVIG:n vaikutusta MCA-105-sarkooman kehittymiseen C57BL/6J-hiirissä. Vasem-, \ manpuoleinen keuhko on peräisin edustavasta kontrollieläi- ,··. mestä ja oikeanpuoleinen keuhko on peräisin IVIG:lla käsi- . tellystä edustavasta hiirestä. Kontrolliryhmästä peräisin " 25 olevat keuhkot ovat suurempia kuin IVIGrlla käsitellyistä • ; eläimistä peräisin olevat keuhkot ja nämä ovat metastaat- ;* tisten fokusten peitossa.

v * Kuvio 6 on valokuva, joka esittää IVIG:n perito- neaalisen antamisen vaikutusta tuumorin kehittymiseen vat-,,'j* 30 sakalvolla. Kontrollieläin on esitetty vasemmalla ja oi- : kealla esitettyä eläintä on käsitelty gammaglobuliinilla.

. Valokuvassa on näkyvissä kontrollieläinten vatsakalvolla sijaitsevat suurehkot tuumori fokukset kun taas IVIG:lla

• I

• I

*; käsitellyissä eläimissä esiintyy ainoastaan muutamia pie- 35 niä fokuksia.

» I

I i I

• · 5 114011

Kuviot 7 ja 8 ovat valokuvia, jotka esittävät aikuisen miespuolisen melanoomapotilaan maksasta tehtyjä tietokonekerroskuvaus (CT) -otoksia. Kuvio 7 on valokuva, joka esittää CT-otosta, joka on tehty ennen IVIG-hoitoa ja 5 kuvio 8 on valokuva, joka esittää viiden IVIG-hoitosyklin jälkeen tehtyä otosta. Mustat tiheät massat edustavat maksan etäpesäkkeitä.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Määritelmät 10 Tässä keksinnössä "gammaglobuliini" on se seerumi- globuliinifraktio, joka koostuu pääasiassa IgG-molekyy-leistä.

Tässä keksinnössä "IVIG" eli "suonensisäiseen käyttöön tarkoitetut immunoglobuliinit" tarkoittavat gammaglo-15 buliinivalmisteita, jotka soveltuvat suonensisäiseen käyttöön, kuten sellaiset IVIG-valmisteet, joita on saatavissa kaupallisesti useilta eri valmistajilta.

Tässä keksinnössä "IVIG:n tai gammaglobuliinin" fragmentit ovat ehjien immunoglobuliinien osia, kuten Fc, 20 Fab, Fab’, F(ab')2 ja yksiketjuiset immunoglobuliinit.

"Metastasoituminen" määritellään tässä keksinnössä malignien tuumorisolujen eli neoplasman siirtymiseksi ve- t ·. renkiertojärjestelmän tai lymfaattisen järjestelmän kautta tai luonnollisten ruumiinonteloiden kautta tavallisesti 25 primäärisestä neoplastisesta fokuksesta tästä kaukana olevaan kohtaan ruumiissa ja sekundaarituumorien tai pesäk-' keiden kehittymiseksi myöhemmässä vaiheessa tässä uudessa paikassa.

Tässä keksinnössä "etäpesäkkeet" tarkoittavat me-30 tastasoitumisen johdosta muodostuneita sekundaarituumorei-: : ta tai pesäkkeitä.

• [< Tässä keksinnössä "metastasoitumisen inhibitio" * * » II,* määritellään etäpesäkkeiden kehittymisen ehkäisemiseksi • * *;* tai tämän määrän pienentämiseksi.

* » * * » 114011 6 "Ruumiinontelonsisäinen antaminen" tarkoittaa tässä keksinnössä sitä, että ainetta annetaan suoraan nisäkkään ruumiinonteloon. Näitä ruumiinontelolta ovat vatsaontelo, keuhko-ontelo ja keskushermoston sisältämät ontelot.

5 Suonensisäiseen annosteluun soveltuvista gammaglo buliineista käytetään usein nimitystä suonensisäiseen käyttöön tarkoitetut immunoglobuliinit (IVIG) ja niitä on saatavilla kaupallisesti useilta eri toimittajilta, esimerkiksi yhtiöistä Miles Inc. (West Haven, Connecticut), 10 N.V. Baxter S.A. (Lessines, Belgia), Sandoz Phama Ltd. (Basel, Sveitsi), Instituto Sierovaccinogeno Italiano (Isiven) (Italia) ja Jackson Immunoresearch Laboratories,

Inc. (West Grove, Pennsylvania). Kaupallisesti saatavilla olevat IVIG-valmisteet sisältävät pääasiassa IgG-molekyy-15 lejä. IVIG:ja on käytetty korvaushoidossa primaarisissa immuunikato-oireyhtymissä ja sekundaarisissa immuunijärjestelmän toiminnanvajauksissa sekä infektiosairauksien ehkäisemisessä ja hoidossa. Lisäksi IVIG:ja on myös käytetty autoimmuunisairauksia ja immuunikompleksin sairauk-20 siä sairastavien potilaiden immuunimodulaatioon. Tätä kysymystä on käsitelty julkaisussa Eibl, Martha M., "Intra-. venous Immunoglobulin: A Review", Immunodeficiency News I

(Suppl. ) (1989) s. 1 - 42.

Laitoksen National Institutes of Health (NIH) Con-25 sensus Conference -raportin mukaisesti on niiden haitallisten sivuvaikutusten ilmaantuvuus, jotka liittyvät IVIG:n käyttöön ihmisillä, kun tätä on käytetty lääkeaine-' hoito-ohjelmissa, jotka ovat verrattavissa tässä keksin nössä käytettäväksi ajateltuihin lääkeainehoito-ohjelmiin, 30 tavallisesti alle 5 % ja useimmat näistä reaktioista ovat ( : "lieviä ja itsestään rajoittuvia". Tässä raportissa maini- ; ’ , taan lisäksi, että "vakavia reaktioita esiintyy hyvin har- « * » voin ja tavallisesti niissä ei ole kontraindikaationa » » w * » IVIG:n hoidon jatko". NIH:n raportissa on myös huomautet-35 tu, että "nykyisin Yhdysvalloissa käyttölisenssin saanei- I I f > » > · 114011 7 den tuotteiden käyttäjille ei ole siirtynyt HIV-infektiota eikä hepatiitti B -infektiota". NIH Consensus Conference, "Intravenous Immunoglobulin: Prevention and Treatment of

Disease", JAMA 264 (1990) s. 3189 - 3193.

5 Tämä keksintö perustuu sen tekijöiden tekemään ha vaintoon, että IVIG kokonaisena molekyylinä tai pelkkänä F (ab') 2-fragmenttina on erittäin käyttökelpoinen valmistettaessa farmaseuttista koostumusta syöpäsairauksien hoitoon hiirimalleissa.

10 Niitä gammaglobuliinivalmisteita, joiden käyttö voi tulla kysymykseen tämän keksinnön mukaisesti, ovat kaupallisesti saatavilla olevat kokonaista IVIG:a sisältävät valmisteet ja IVIG:n F (ab ') 2-fragmentteja sisältävät valmisteet. Tämän keksinnön mukaisesti voidaan myös käyttää yh-15 distelmä-DNA-tekniikalla valmistettuja gammaglobuliineja ja niiden fragmentteja. On myös katsottava mahdolliseksi käyttää yhdistelmä-DNA-menetelmillä valmistettuja yksiketjuisia vasta-aineita.

IVIG:n annos ja antomenetelmä vaihtelee tietyn ni-20 menomaisen hoidettavan sairauden vakavuuden, tyypin, hoidon keston, muun käytettävän hoidon, hoidettavan potilaan • /· iän ja fyysisen kunnon ja muiden näitä vastaavien sellais- ten tekijöiden mukaan, jotka kuuluvat hoitavan lääkärin erityistietojen ja taitojen piiriin. Yksittäiset suonensi-25 säistä ja ruumiinontelonsisäistä annostelua varten tarkoi-. .·. tetut annokset voivat tyypillisesti olla 400 milligrammas- φ·|·# ta 2 g:aan ruumiinpainokiloa kohti ja edullisesti 2 g/kg (ellei toisin ole mainittu, tässä keksinnössä käytetty yk-, sikkö, josta käytetään merkintää "mg/kg" tai "g/kg", tar- ·;;; 30 koittaa milligrammoja tai grammoja ruumiinpainokiloa koh-

• I

*··' ti) . Edullinen lääkeainehoito on 400 mg/kg päivässä viiden : peräkkäisen päivän aikana kuukaudessa tai 2 g/kg päivässä kerran kuukaudessa. Tämän keksinnön mukaisen IVIG:n havait-*. tiin olevan tehokas estämään metastasoitumisen eläinmal- ’*·' 35 leissa, silloin kun tätä annettiin käyttämällä suonen- • · » „ 114011

O

sisäistä tai vatsaontelonsisäistä injektiota ja annosta, joka oli alueella 500 - 1 000 mg/kg viikossa.

Toisessa tämän keksinnön sovellutusmuodossa IVIG-valmistetta annetaan ihonalaista annostelutietä käyttäen.

5 Tyypillinen ihonalaiseen annosteluun soveltuva annos voi olla 4 - 20 mg ruumiinpainokiloa kohti. Tämän keksinnön mukaisen IVIG:n havaittiin olevan tehokas metastasoitumisen ehkäisemisessä hiirissä, silloin kun sitä annettiin ihonalaisesti käyttäen annoksena 200 μg hiirtä kohti.

10 Tämän keksinnön mukaisesti voidaan IVIG:ja käyttää farmaseuttisena koostumuksena, joka sisältää farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta. Kantaja-aineen on oltava fysiologisesti siedettävissä olevaa ja sen on oltava yhteensopiva aktiivisen ainesosan kanssa. Sopivia kantaja-15 aineita ovat steriili vesi, fysiologinen suolaliuos, glukoosi, glyseroli ja muut näitä vastaavat aineet. Lisäksi koostumukset voivat sisältää pieniä määriä stabilointiaineita tai pH:ta puskuroivia aineita ja muita näitä vastaavia aineita. Koostumuksia annetaan tavanomaisesti parente-20 raalisia annosteluteitä käyttäen ja edullinen annostelutie on suonensisäinen, ruuminontelonsisäinen tai ihonalainen !.',· injektio.

Tämän keksinnön mukaisesti suonensisäisesti käytet-tävät immunoglobuliinit vaikuttavat antimetastaattisina ai-25 neina, mikä johtaa siihen, että tuumoripesäkkeiden lukumää-rä sekä tuumoripesäkkeen koko pienenevät. Ne voivat myös ^ vaikuttaa profylaktisesti, toisin sanoen estävät tuumorien etäpesäkkeiden muodostumisen. Tämän keksinnön mukaisia suonensisäisiä immunoglobuliineja voidaan myös käyttää pienen-;;; 30 tämään primaarituumorin kokoa.

'·.·* Tässä keksinnössä kuvattua farmaseuttista koostu- | musta voidaan myös käyttää joko ennen sellaista kirurgista » i t · toimenpidettä, jolla on tarkoituksena poistaa primaarituu- • · · ·_ mori, tai tämän jälkeen. Usein tuumorisolujen metastasoitu- • · t 35 9 114011 minen tapahtuu siitä syystä, että tuumoria käsitellään fysikaalisesti kirurgisen toimenpiteen aikana.

Haluamatta rajoittua mihinkään tiettyyn nimenomaiseen teoriaan tässä keksinnössä tehdään se ehdotus, että 5 suonensisäiseen käyttöön tarkoitetut immunoglobuliinit inhiboivat metastasoitumista yhden tai useamman seuraavan mekanismin mukaisesti.

On tunnettua, että tuumorien metastasoitumista tapahtuu sen jälkeen kun yksittäiset syöpäsolut ovat irron-10 neet tuumorista, kulkeutuneet vieressä sijaitsevaan tai kaukana sijaitseviin kudoksiin ja ovat alkaneet kasvaa ja muodostaa pesäkkeitä uudessa elimessä. Kulkeutumistapahtu-maan osallistuvat adheesiomolekyylit, joiden avulla tuumo-risolut kykenevät tarttumaan verisuonen seinämään, tunkeu-15 tumaan virtaavaan vereen ja ilmaantumaan toiseen kudokseen ja aloittamaan täällä kasvunsa. Tässä keksinnössä otaksutaan, että kokonaista IVIG:a tai IVIG:n F(ab')2- fragmentteja käytettäessä nämä voivat häiritä niiden adheesiomolekyylien sitoutumista, joiden johdosta tuumorisolu 20 kulkeutuu verisuoneen ja täältä pois ja siten estää tuumo-risolujen leviämisen muihin ruumiinkudoksiin.

Toinen mahdollinen mekanismi on IVIG-seoksessa : esiintyvät vasta-aineet tai anti-idiotyypit, jotka voivat : sitoutua tuumorisoluihin ja saada aikaan niiden hajoamisen ; 25 komplementin läsnä ollessa tai voimistamaan retikuloendote- liaalisen järjestelmän (RES) pinnalla esiintyvien , , Fc-reseptorien vaikutuksesta tapahtuvaa kiinnijäämistä.

Vielä yksi mahdollisuus on, että suonensisäisesti annettavat immunoglobuliinit vähentävät metastasoitumista ·;;; 30 tai estävät sen lisäämällä immuunijärjestelmän tehokkuutta < · ’···' sen välityksellä, että ne indusoivat sytokiinien, kuten : tuumorinekroositekijän ja gamma-interferonin, erittymistä.

• · · »at 10 114011 Tämän keksinnön tekijät ovat parhaillaan suorittamassa kokeita sen tarkan mekanismin selvittämiseksi, jolla IVIG-valmisteet saavat aikaan havaitut vaikutuksensa tuumorien metastasoitumiseen.

5 Seuraavat esimerkit osoittavat tämän keksinnön mu kaisen IVIG:n vaikutuksen tuumorien leviämiseen, joissa on käytetty hiiren melanooma- ja sarkoomamalleja. Tässä keksinnössä esitetään myös lisäksi kliinisiä koetuloksia IVIG:lla hoidetusta edustavasta humaanimelanoomapotilaasta.

10 Nämä esimerkit on esitetty siinä tarkoituksessa, että tämä keksintö tulisi paremmin ymmärretyksi eikä niiden ole katsottava rajoittavan sen suojapiiriä millään tavoin.

Esimerkit

Materiaalit ja menetelmät 15 Tuumorisolut: Esimerkeissä käytettiin hiirestä pe räisin olevia tuumorisolulinjoja. Hiiren solulinjoja olivat: MCA-105, joka on metyylikolantreenilla indusoituva C57BL/6J-soluista peräisin oleva sarkooma, ja B16-F10-melanoomasolut (nämä molemmat solulinjat hankittiin talle-20 tuslaitoksesta American Type Tissue Culture Collection,

Rockville, MD) . Soluja kasvatettiin päivittäin RPMI-: mediumissa, joka sisälsi 10 % fetaalista vasikanseerumia.

; : Solut siirrettiin tuoreeseen vasta valmistettuun mediumiin • kaksi kertaa viikossa.

;· . 25 Koe-eläinmallit: • * . , , Tässä tutkimuksessa käytettiin 2 - 3 kuukauden ikäisiä C57BL/6J-hiiriä. Gammaglobuliinin tehokkuuden tut-' kimiseksi in vivo -olosuhteissa indusoitiin C57BL/6J-hii- rissä kahdentyyppisiä kiinteitä tuumoreita, toisin sanoen 30 sarkoomaa (MCA-105) ja melanoomaa (B16-F10) . Tuumorisolut ·...’ johdettiin elimistöön joko injektoimalla suonensisäisesti • (IV) , joka johti siihen, että ne levisivät keuhkoihin ja » · » » » * f · » * * • · 114011 11 asettuivat sinne, tai ne johdettiin vatsakalvon sisään (IP), jossa syöpäsolut muodostivat paikallisia leesioita vatsakalvossa. Tietty osa hiiristä tapettiin 3-5 viikon kuluttua ja niistä tutkittiin keuhkoissa esiintyvät meta-5 staattiset fokukset tai tuumorien leviäminen vatsakalvolle. Toisessa hiirten ryhmässä tarkasteltiin eloonjäämistä. Hiiriä, joihin oli injektoitu tuumorisoluja suonensisäisesti, käsiteltiin infusoimalla niihin suonensisäisesti gammaglobuliinia, kun taas niillä eläimillä, joihin tuumo-10 reja oli aiheutettu suoraan vatsakalvolle, annettiin gam-maglobuliinivalmistetta injektoimalla sitä vatsaontelonsi-säisesti.

Gammaglobuliinivalmisteet:

Suonensisäiseen käyttöön soveltuvaa humaanigamma-15 globuliinia (IVIG) hankittiin yhtiöstä Miles Inc. (Biological Products Division, West Haven, Connecticut). Kaikkiin kokeisiin käytettiin 5-%:ista liuosta (5 g 100 ml:ssa laimenninta; tuoteluettelon nro 0640-12). Ellei toisin ole mainittu, niin kussakin hoidossa annetun IVIG:n tilavuus 20 oli 500 μΐ eläintä kohti, josta määräksi saatiin yhteensä 25 mg gammaglobuliinia eläintä kohti. Muita käytettyjä valmisteita olivat kokonainen humaanigammaglobuliinimole-kyyli tai F( ab1 )2-fragmentti, jotka molemmat hankittiin • · yhtiöstä Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., PA, !!*. 25 (tuotekoodinumerot 009-000-003 ja 009-000-006, mainitussa • > • järjestyksessä ilmoitettuna), riviä. Nämä viimeksi maini- » tut valmisteet poikkeavat Miles Inc. -yhtiöstä hankituista ' valmisteista siinä suhteessa, että ne valmistetaan 30 luo vuttajalta peräisin olevista yhdistetyistä verieristä, kun 30 taas Milesin valmiste on yhdistetty 3 000 tai tätä useammalta luovuttajalta peräisin olevista eristä.

Esimerkki 1

Gammaglobuliinin vaikutus metastasoivan melanooman kehittymiseen C57BL/6J-hiirissä • t* 35 Luotiin metastaattisen melanooman kokeellinen malli \: käyttäen hiiren B16-F10-melanoomasolulinjaa. Melanooman 114011 12 indusointi suoritettiin injektoimalla suonensisäisesti tuumorimelanoomasoluja, jotka tämän jälkeen leviävät hiiren keuhkoihin ja muodostavat mustia metastasoivia fokuksia. Hiiret kuolevat noin 24 päivän kuluttua tuumorin ymp-5 päyksestä.

Tässä kokeessa hiiriin injektoitiin joko 2 x 105 tuumorisolua tai 5 x 105 solua ja niitä käsiteltiin suonensisäisesti IVIGrlla (Miles). Hiiret tapettiin 18. päivänä ja hoidon tehokkuus määritettiin laskemalla eläinten keuh-10 koissa esiintyvien mustien metastasoivien fokusten lukumäärä .

A. 2 x 105 Bl6-Fl0-melanoomasolun ymppäys hiiriin

Kahteenkymmeneen hiireen injektoitiin suonensisäisesti 2 x 105 melanoomasolua ja eläimet jaettiin neljään 15 ryhmään: (a) kontrolliryhmä, hiiret, joihin oli ympätty ainoastaan tuumorisoluja; (b) hiiret, joita oli käsitelty yhdellä IVIG:n suonensisäisellä injektiolla päivänä 0 (tuumorin antamispäi- 20 vänä); (c) hiiret, joita oli käsitelty kaksi kertaa päivä- , ·. , nä 0 j a päivänä 4; , (d) hiiret, joita oli käsitelty kolme kertaa päivi- nä 0, 4 ja 9.

25 Hiiret tapettiin 18. päivänä ja keuhkoissa esiinty- • vien metastasoivien fokusten lukumäärä määritettiin. Tu- * lokset on esitetty yhteenvetona taulukossa I. Yksi käsittely vähensi metastaattisten fokusten lukumäärää 80 %:lla kun taas yhtään fokusta ei voitu havaita kahden tai kolmen 30 käsittelyn jälkeen. 1 I I ! i3 114011

Taulukko I

Metastaattisten fokusten lukumäärän pieneneminen sellaisten hiirten keuhkoissa, joihin oli injektoitu 2 x 10 5 B16-F10-melanoomasolua ja käsitelty tämän jälkeen 5 IVIG:lla.

Ryhmä Fokusten lukumäärä

Kontrolli 20 ± 4 1 käsittely 4 ± 2 10 2 käsittelyä 0 3 käsittelyä 0

Kuten kuviossa 1 on esitetty, havaitaan kontrolliryhmässä mustia metastaattisia fokuksia, yhdellä IVIG-in-15 jektiolla käsitellyssä ryhmässä vähemmän fokuksia eikä yhtään tällaista havaita niistä hiiristä peräisin olevissa keuhkoissa, joita oli käsitelty kahdella tai kolmella IVIG-injektiolla.

B. Hiiret, joihin oli ympätty 5 x 105 Bl6-Fl0-mela-.·, . 20 noomasolua I * i

Sen selvittämiseksi, kykenikö IVIG estämään metas- » ‘ * tasoitumisen suuremman melanoomamassan kyseessä ollessa, suoritettiin seuraava koe. Hiiriin injektoitiin suurempi tuumorisolumäärä (5 x 105) ja ne jaettiin kahteen ryhmään: 25 (a) kontrolliryhmä, johon oli ympätty ainoastaan tuumorisoluja; (b) hiiret, joita oli käsitelty kahdella IVIG-in-jektiolla suonensisäisesti päivänä 0 ja päivänä 8 tuumorin : ymppäyksen jälkeen.

: ] 30 Hiiret tapettiin päivänä 18. Kun keuhkojen metasta- • » soivia fokuksia tutkittiin, havaittiin niiden lukumäärän pienentyneen huomattavasti IVIG:11a käsitellyssä ryhmässä.

: : : Tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa II.

» > » 114011 14

Taulukko 11

Metastaattisten fokusten lukumäärän pieneneminen sellaisista hiiristä peräisin olevissa keuhkoissa, joihin oli injektoitu 5 x 105 B-16 F10 -melanoomasolua ja käsitel-5 ty tämän jälkeen IVIG:lla.

Ryhmä Fokusten lukumäärä

Kontrolli 165 ± 13,4

Kaksi käsittelyä 16,3 ± 3,9 10

Kuten kuvioista 2 ja 3 voidaan havaita, käsitellyissä hiirissä tapahtuu noin 90-%:inen fokusten lukumäärän pieneneminen verrattuna kontrolliryhmään. Nämä tulokset osoittavat, että IVIG kykenee inhiboimaan melanooman 15 metastaattisen leviämisen jopa suuremman tuumorimassan kyseessä ollessa.

C. Gammaglobuliinin vaikutus melanoomaa sairastavien hiirien eloonjäämiseen C57BL/6J-hiiriin injektoitiin 4 x 105 B16-F10-solua.

20 Hiiriä käsiteltiin päivinä 0 ja joka 7. päivä tämän jäl-keen 500 plrlla Milesin IVIG:a. Kontrolliryhmästä peräisin • * olevat hiiret alkoivat kuolla 24 päivää tuumorin ymppäyk- * : , , sestä. Tulokset on esitetty yhteenvetona kuviossa 4. Kun jv. kontrollihiiristä oli kuollut 26. päivänä 100 %, niin ‘ 25 IVIG:11a käsitellyistä hiiristä oli elossa 100 %. Päivänä • » > 40 oli 60 % käsitellyistä hiiristä vielä elossa.

Esimerkki 2

Gammaglobuliinin vaikutus MCA-105-sarkooman kehittymiseen C57BL/6J-hiirissä : 30 MCA-105-solut ovat peräisin hiiristä, jotka kehit tävät tuumoreita metylikolantreenin antamisen jälkeen.

’ Näitä soluja käyttäen suoritettiin kahdentyyppisiä kokei ta: t 1C 114011 15 1. Tuumorien indusointi ID-infuusiota käyttäen 2 x 105 MCA-105-solua injektoitiin suonensisäisesti C57BL/6J-hiirten häntälaskimoon. Yhtä ryhmää hiiriä käsiteltiin infusoimalla niihin suonensisäisesti IVIG:a päi-5 vinä 0, 7 ja 14 ja kontrolliryhmään kuuluviin hiiriin injektoitiin samoina päivinä fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta (PBS). Hiiret tapettiin 40 päivää myöhemmin ja niiden keuhkoista tutkittiin tuumorileesiot. Kontrolliryhmän hiirten keuhkot olivat paljon suurempia 10 kuin IVIG:lla käsiteltyjen eläinten keuhkot ja ne olivat valkoisina "rakkuloina" näkyvien metastasoivien fokusten peitossa. Edustavat keuhkot, jotka ovat peräisin käsitellyistä (oikealla) ja käsittelemättömistä (vasemmalla) hiiristä, on esitetty kuviossa 5.

15 2. Tuumorien indusointi intraperitoneaalista in- fuusiota käyttäen 2 x 105 MCA-105-solua injektoitiin vatsaontelonsa-säisesti C57BL/6J-hiiriin. Hiiriä käsiteltiin IVIG:lla päivästä 0 alkaen ja tämän jälkeen joka 7. päivä siihen 20 asti kunnes ne tapettiin päivänä 48. Kontrolliryhmän hiirten vatsakalvossa havaittiin suurehkoja tuumorifokuksia (kuvio 6, vasemmalla), kun taas käsitellyissä eläimissä . havaittiin ainoastaan muutamia pieniä fokuksia (kuvio 6, oikealla).

25 Esimerkki 3

Kokonaisen gammaglobuliinin ja F (ab' )2-fragmentin vaikutuksen vertaaminen toisiinsa B-16 melanooman kehittymiseen C57BL/6J-hiirissä

Hiiriin ympättiin suonensisäisesti 2 x 105 B16-F10-30 melanoomasolua. Hiiret jaettiin kolmeen ryhmään: : a) kontrolliryhmä; b) kokonaisella IVIG-molekyylillä (Jackson Immuno-research Laboratories Inc.) käsitellyt hiiret; 5 mg:n erä I’ 330 μ1:η tilavuudessa injektoitiin suonensisäisesti päivi- i!: 35 nä 0, 3, 7 ja 12; I > 16 114011 c) ryhmä hiiriä, jota käsiteltiin 5 mg:lla IVIG:n F(ab' )2-fragmenttia (Jackson) 500 μ1:η tilavuudessa samoina päivinä kuin kohdassa (b).

Hiiret tapettiin 17. päivänä ja keuhkoista lasket-5 tiin mustien metastaattisten fokusten lukumäärä. Kontrolliryhmästä laskettiin 160 ± 18 metastasoivaa fokusta, mitä voidaan verrata kokonaista IVIG:a sisältävällä valmisteella käsitellyssä ryhmässä laskettuun 68 ± 12 fokukseen ja IVIG:n F(ab' )2-fragmentteja sisältävällä valmisteella käsi-10 tellyissä hiirissä laskettuun 13 ± 4 fokukseen. Tämä tulos merkitsee sitä, että sekä kokonainen IVIG että niiden F(ab' )2-fragmentit ovat tehokkaita metastasoitumisen ehkäisemisessä. Havaittu kokonaisen IVIG:n ja F(ab' )2-valmisteen välinen ero johtuu todennäköisesti näiden kahden käytetyn 15 liuoksen ominaisaktiivisuuksien erosta. Se ero, joka havaitaan esimerkin 1, jossa metastasoivien fokusten lukumäärän keskiarvo oli 4 annettaessa kokonaista !VlG:a (taulukko 1), tulosten ja tämän esimerkin, jossa fokusten lukumäärän keskiarvo oli 68, tulosten välillä johtuu toden-20 näköisesti siitä seikasta, että esimerkissä 1 injektoitiin päivänä 0 25 mg kokonaista IVIG:a, kun taas tässä esimer-: kissä päivänä 0 injektoitiin ainoastaan 5 mg.

Esimerkki 4

Gammaglobuliinin vaikutus melanooman metastasoitu-25 misen inhibitiossa primaarituumorin kirurgisen poiston jälkeen C57BL/6J-hiirten polkuanturaan injektoitiin 2,5 x ΙΟ5 B16 F10 -melanoomasolua. Raaja, johon tuumori oli kehittynyt, amputoitiin 21 päivän kuluttua. Hiiret jaettiin 30 samana päivänä kahteen ryhmään, joista toista käsiteltiin injektoimalla suonensisäisesti 25 mg IVIG:a (Sandoz Pharma : Ltd, Basel, Sveitsi; valmistuserä - 4.372.256.0) ja toista ryhmää fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella suola-liuoksella (PBS). Hiiristä tutkittiin 10 päivää myöhemmin 35 merkkejä tuumorin kehittymisestä. 60 %:lle kontrolliryh- 17 114011 mästä oli kehittynyt tuumoreita, joiden koko oli keskimäärin 3 ± 0,8 cm. Nämä hiiret kuolivat ensimmäisen kuukauden kuluessa amputaatiosta. IVIGrlla käsitellyssä ryhmässä ainostaan 14 %:lle hiiristä kehittyi tuumori (koko keski-5 määrin 2,7 ± 1,2 cm). Myös nämä hiiret kuolivat ensimmäisen kuukauden kuluessa amputaatiosta. Jäljellä oleville 86 %:lle IVIG:lla käsitellyistä hiiristä ei kehittynyt tuumoreita ja ne olivat vielä elossa 45 päivää leikkauksesta.

10 Esimerkki 5

Pienenä annoksena ihonalaisesti annetun gammaglobuliinin vaikutus melanooman metastasoitumisen inhibitiossa C57B16J-hiiriin injektoitiin suonensisäisesti 2,5 x 105 B16-melanoomasolua hiirtä kohti. Välittömästi tämän 15 jälkeen hiirille annettiin rintakehän alueelle IVIG-val-misteita ihonalaista annostelutietä käyttäen. Neljälle ryhmälle hiiristä (20 hiirtä ryhmää kohti) annettiin 200 pg hiirtä kohti yhtä seuraavista kaupallisesti saatavilla olevaa IVIG-valmistetta, jotka oli hankittu yhtiöistä 20 Baxter (Gammagard S/D 2,5 %; valmistuserä - 93H23AB12C), Isiven (Isiven V.I. 2,5 %; valmistuserä - IS23SC6193V), Miles (Gamimmune N 5 %; valmistuserä - 640N023) ja Sandoz (valmistuserä - 4.372.256.0). Kontrolliryhmänä toimi vii-des ryhmä hiiriä, jolle annettiin suonensisäisesti PBS:ää.

* V 25 Hiiret tapettiin 18 päivää myöhemmin ja niiden keuhkoista tutkittiin metastaattisten fokusten esiintyminen. Tulokset on kuvattu seuraavassa taulukossa.

Taulukko III

30 Ryhmä Fokusten Inhibi- lukumäärä tio-%

Kontrolli 50

Baxter 18,6 62,8

Miles 28,5 43,0 : 35 Isiven 18,1 63,8 : Sandoz 27,9 44,2 18 114011

Kuten edellä olevan perusteella käy ilmi, inhiboi IVIG:n antaminen pienenä annoksena ihonalaisesti melanooman metastasoitumista keskimäärin 53,45 %:lla PBS:llä käsiteltyihin hiiriin verrattuna.

5 Esimerkki 6

Menettely gammaglobuliinin käyttämiseksi metasta-soitumisen inhiboimiseksi syöpäpotilaissa IVIG-valmisteita annetaan syöpäpotilaille parente-raalisesti käyttäen tavallisesti yhtä seuraavista suonen-10 sisäiseen tai ruumiinontelonsisäiseen annosteluun tarkoitetuista lääkeaineannosteluohjelmista: (1) 400 mg/kg päivässä viiden peräkkäisen päivän aikana kuukaudessa tai (2) 2 g/kg kerran kuukaudessa. Ihonalaista käyttöä varten voidaan IVIG-valmistetta antaa annoksena, jonka suuruus on 15 4 mg/kg päivässä viiden peräkkäisen päivän aikana kuukau dessa tai 20 mg/kg kerran kuukaudessa. Ehdotettuja hoito-ohjelmia voidaan kuitenkin muunnella potilaan iän ja fyysisen kunnon ja sairauden vakavuuden mukaan. Hoitava lääkäri määrittää tarkan menettelyn ottaen huomioon useita 20 eri tekijöitä sekä kunkin potilaan kohdalla vallitsevan tilanteen. Kun gammaglobuliinivalmistetta on annettu, niin potilaan tilan edistymistä seurataan tavallisten lääketieteellisten menettelytapojen mukaisesti. Potilaasta tutkitaan lisäksi tuumorien etäpesäkkeet tai niiden regressoi-25 tuminen.

Esimerkki 7

Edustavalle melanoomapotilaalle suoritetun gammaglobuliinin suonensisäisen antamisen vaikutus

Syyskuussa 1989 poistettiin 42-vuotiaalta miespuo-30 Useita potilaalta kirurgisesti vasempaan reiteen ilmaan- tunut maligni melanomaleesio (syvyys 1,3 mm). Toukokuussa : .·, 1991 potilaalle suoritettiin hyperterminen sisplatiiniper- fuusio, koska melanooma oli uusiutunut paikallisesti va-sempaan nivusten imusolmukkeeseen. Tällöin ei ollut todis-35 teitä taudin metastasoitumisesta potilaassa. Helmikuussa t » »

• * I

114011 19 1993 paljastivat rinnan ja vatsan tietokonekerroskuvaus (CT) -otokset tuumorimassaleesioita pernassa (yksi lee-sio), maksassa (viisi leesiota, joista suurin oli 3x3 cm) ja keuhkoissa (neljä leesiota, joista suurin oli 1,5 x 5 1,5 cm). Leesioista huolimatta potilas oli oireeton. Pian tämän jälkeen aloitettiin IVIG-hoito. Potilaalle annettiin suonensisäisesti IVIG:a (Miles) käyttäen annoksena 400 mg/ kg päivässä viiden peräkkäisen päivän aikana kuukaudessa. Viiden hoitosyklin jälkeen olivat kaikki pernan ja maksan 10 etäpesäkkeet hävinneet ja keuhkoleesioissa esiintyi vähäistä pienentymistä. Potilaan tila huononi tämän jälkeen uusien luihin tulleiden ja ihonalaisten leesioiden ilmaantuessa. Hänelle annettiin edelleen IVIG:a, jonka yhteydessä etäpesäkkeitä ilmaantui vähäisessä määrin uudelleen.

15 Potilas menehtyi saatuaan 12 IVIG-sykliä.

Kuten alan ammattikokemuksen perusteella on selvää, eivät suuret maksan ja pernan melanoomaetäpesäkkeet reg-ressoidu spontaanisti. Lisäksi on tunnettua, että tällaisten suurten etäpesäkkeiden havaitsemisen jälkeen potilas 20 ei tavallisesti elä muutamaa kuukautta pitempään.

Vaikkakin edellä on kuvattu tämän keksinnön erityi-Siä esimerkkejä, on syöpähoidon alan ammattikokemuksen pe- • · rusteella ilmeistä, että esitettyä perusmenetelmää voidaan : muuntaa tarpeen mukaan. Tästä syystä on selvää, että tämän • · i 25 keksinnön suojapiiriä rajoittavat siihen liitetyt patent-' tivaatimukset eivätkä niinkään edellä esitetyt esimerkin tarjoavat erityiset sovellutusmuodot.

I i t t I 1 *

Claims (6)

114011 20

1. Suonensisäiseen käyttöön tarkoitetun immunoglo-buliinin (IVIG) tai sen samat ominaisuudet omaavien frag- 5 menttien käyttö sellaisen farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu nisäkkäällä olevan tuumorin metastasoitumisen inhiboimiseen.

2. Suonensisäiseen käyttöön tarkoitetun immunoglo-buliinin (IVIG) tai sen samat ominaisuudet omaavien frag- 10 menttien käyttö sellaisen farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu nisäkkäällä olevan melanooman metastasoitumisen inhiboimiseen.

3. Suonensisäiseen käyttöön tarkoitetun immunoglo-buliinin (IVIG) F (ab 1 )2-fragmenttien käyttö sellaisen far- 15 maseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu nisäkkäällä olevan melanooman metastasoitumisen inhiboimiseen .

4. Suonensisäiseen käyttöön tarkoitetun immunoglo-buliinin (IVIG) tai sen samat ominaisuudet omaavien frag- 20 menttien käyttö sellaisen farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu nisäkkäällä olevan pri-määri tuumorin hoitoon. :: : 5. Suonensisäiseen käyttöön tarkoitetun immunoglo- • buliinin (IVIG) tai sen samat ominaisuudet omaavien frag- 25 menttien käyttö sellaisen farmaseuttisen koostumuksen val-. ,·. mistamiseksi, joka on tarkoitettu nisäkkäällä olevan mela- • ·# nooman hoitoon.

6. Suonensisäiseen käyttöön tarkoitetun immunoglo-, buliinin (IVIG) F (ab' )2-fragmenttien käyttö sellaisen far- * 30 maseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka on tarkoi- ·' tettu nisäkkäällä olevan melanooman hoitoon. 21 114011