FI113539B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten puriinien ja pyrimidiinien tyydyttymättömien fosfonaattijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

113539

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten puriinien ja py-rimidiinien tyydyttymättömien fosfonaattijohdannaisten valmistamiseksi 5 Esillä oleva keksintö koskee menetelmää eräiden pu riinien ja pyrimidiinien tyydyttymättömien fosfonaattijoh-dannaisten valmistamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia an-tiviraalisina aineina, ja välituotteita, jotka ovat käyttökelpoisia mainittujen yhdisteiden valmistukseen. Yhdisteet 10 ovat antiviraalisia aineita, jotka ovat tehokkaita DNA-viruksia (herpesvirukset 1 ja 2, sytomegalovirus, varicella zoster -virus, Epstein-Barrin virus), retroviruksia (ihmisen immuunikatovirukset 1 ja 2 sekä visnavirus) ja kasvaimen muodostumiseen liittyviä viruksia vastaan.

15 Tekniikan taso

Eräillä puriini- ja pyrimidiiniemästen johdannaisilla on todettu antiviraalista ja antituumoriaktiivisuut-ta. Katso esimerkiksi julkaisut nro EP-0 173 624, EP-0 253 412, EP-0 353 955, WO-92/01 698, EP-0 481 214 ja jul-20 kaisu J. Orq. Chem. 57: 2320 - 2327 (1992). Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet ovat puriini- ja pyrimi- : ; : diiniemäksistä johdettuja uusia yhdisteitä.

·;··; Esillä olevan keksinnön yhteenveto . Yksityiskohtaisemmin esillä olevan keksintö koskee

25 menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen yhdisteen, jolla on kaava I tai II

• * · • * · :;i': χ2 N T 'h i o °-· ·,

X. N ' I

0 , O z

Il 1 II i r3-p t " w R3-P— t - w

1 I

; R4 r4 » i *

I II

2 113535 sen stereoisomeeristen muotojen ja niiden seosten, tauto-meeristen muotojen tai farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, joissa kaavoissa Xi on H tai NH2; 5 X2 on OH tai NH2; X3 on H tai CH3; ja X4 on NH2 tai OH; Z ei ole mikään tai on CH2, CH2CH2, CH2O tai CH2OCH2; W on 10

R, R

2 ili Rl^ /R2 s Γ P*-S. tai j t : · ! p

Wa Wc Wd 15 j oissa

Ri ja R2 ovat kumpikin toisistaan riippumatta H, F tai CH20H; T ei ole mikään tai on Τ' tai T", jolloin Τ' on 20 CH2CH2, CH=CH, CH2CH(OH), CH2CH(CH2OH) tai CH2CH(CH2F), ja T" on CH=CH-CH (OH) , CH=CH-CH (CH2OH) , CH2OCH2, CH2OCH (CH2OH) , CH2CH (CH2OH) CH2, CH2CH2CH (OH) , CH2CH2CH (CH2OH) tai CH2CH2CH- * ·· (CH2F) ; ja . *. R3 ja R4 ovat kumpikin toisistaan riippumatta OH, 25 OR5, OR5' tai -O-CH (Rö)-O-C (O) R5, ehdolla, että kun R3:sta tai R4:stä yksi on OH, niin toinen ei ole -0-CH(R6)-0-C(0)R5,· ja R5 ja R5' ovat kumpikin toisistaan riippumatta Ci-15-alkyyli tai bentsyyli, ja Rö on H tai Ci-io-alkyyli, ehdolla, että kun T on CH=CH tai CH2CH2, W on Wc ja Z on ., : 30 CH2, niin merkitykset Xi on NH2 ja X2 on OH eivät ole saman- ! ,·' aikaisesti; ehdolla, että kun T ei ole mikään, niin W ei ole Wc, ehdolla, että kun Z on CH2 ja W on Wa, niin T ei voi olla CH=CH, ja ·,· 35 ehdolla, että kun Z ei ole mikään ja W = Wc, niin T ei ole ' CH=CH.

3 113539

Esillä olevan keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet ovat pu-riinijohdannaisia (kaava I) tai pyrimidiinijohdannaisia (kaava II), joita kutsutaan tässä yhteydessä nukleiiniemäk-5 siksi, joissa on fosfonaattiyksikkö (pisteviiva kuvastaa kiinnittymistä molekyylin muuhun osaan): X2 X4 ΛΛ -

Fosfonaattiyksikön puriini- tai pyrimidiinijohdannaiseen 15 liittäviä yksikköjä ovat T-, W- ja Z-ryhmät. Eräs esimerkki, jossa nämä yksiköt muodostavat liitoksen muuhun molekyyliin, on sellainen, jossa T on T" ja on CH=CH-CH(CH2OH) , W on Wa, jossa Ri ja R2 ovat kumpikin H, ja Z on CH2O: 20 I /-O-emäs : ch2 ch* MM* I *

• · I

OH

* « · 25 Seuraavat yhdistelmät, jotka kuuluvat esillä olevan ; keksinnön mukaisista yhdisteistä pienikokoisten molekyylien • * · joukkoon, ovat edullisia: 1 « 1 • kun W = Wa ja T = T", niin Z ei ole CH2OCH2; kun W = Wc tai Wd ja T = Τ', niin Z ei ole CH2OCH2; 30 kun W = Wc tai Wd ja T = T", niin Z on CH2.

Muita edullisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa T

on Τ', ja erityisesti Τ' on CH=CH; joissa T on T", ja eri- ,*··, tyisesti T" on CH2OCH2; joissa Ri ja R2 ovat kumpikin H; • · ja/tai Z on CH2, CH2CH2 tai CH2O. Kaava I on edullisempi ’.· · 35 kaavaan II verrattuna. Edullisia pyrimidiintyypin emäksiä • 1 » 113539 4 ovat sytosiini, urasiili ja tyrniini. Edullisia puriiniemäk-siä ovat 2,β-diaminopuriini (DAP), guaniini ja adeniini.

Tässä yhteydessä käytettynä "kun T on CH=CH tai CH2CH2, W on Wc ja Z on CH2, niin merkitykset Xi on NH2 ja X2 5 on OH eivät ole samanaikaisesti" -ehdolla tarkoitetaan, että vaatimuksien ulkopuolelle jää tällaisista yhdisteistä ne, joissa emäs on guaniini (merkitykset Xi = NH2 ja X2 = OH ovat samanaikaisesti). Tämä ehto sulkee pois kaksi yhdistettä guaniinin ollessa emäksenä: (1) T on CH=CH, W on Wc 10 ja Z on CH2, ja (2) T on CH2CH2, W on Wc ja Z on CH2.

Termi Ci-10-alkyyli tai Ci-15-alkyyli tarkoittaa al-kyyliyksikköä, jossa on 1 - 10 hiiliatomia tai vastaavasti 1-15 hiiliatomia. Alkyyliyksikkö voi olla suoraketjuinen tai haaroittunut, esim. tert-butyyli. Ci-15-alkyyliyksikön 15 tapauksessa, Ci-10-alkyyli on edullinen, Ci-6 edullisempi ja C1-3 erityisen edullinen. Ci-10-alkyyliyksikön tapauksessa C1-6 on edullinen ja C1-3 erityisen edullinen.

"Farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" -termi tarkoittaa sekä happoadditiosuoloja että metalli- ja amii-20 nisuoloja, joiden tiedetään olevan ei-toksisia ja hyödyllisiä johdannaisia loppukäyttösovellutuksiin sopivien far- • t ‘ : maseuttisten valmisteiden valmistuksessa.

• t I · ·;··· Farmaseuttisesti hyväksyttäviin happoadditiosuoloi- ; hin kuuluvat kaavan I ja II mukaisten emäsyhdisteiden tun- 25 netut ei-toksiset orgaaniset tai epäorgaaniset happoaddi- ; tiosuolat. Havainnollistaviin orgaanisiin suoloihin, jotka muodostavat sopivia suoloja, kuuluvat mono-, di- ja trikar- t 1 * * boksyylihapot. Tällaisista hapoista havainnollistavia ovat esim. etikka-, glykoli-, maito-, palorypäle-, maloni-, me-30 ripihka-, glutaari-, fumaari-, omena-, viini-, sitruuna-, askorbiini-, maleiini-, hydromaleiini-, bentsoe-, hydroksi-bentsoe-, fenyylietikka-, kaneli-, salisyyli- ja 2-f enoksibentsoehapot. Muita sopivia suoloja muodostavia or- 1 » '·’ gaanisia happoja ovat sulfonihapot, kuten metaanisulfoni- V * 35 happo ja 2-hydroksietaanisulfonihappo. Voidaan muodostaa ·.'·· joko mono- tai dihapposuoloja ja tällaiset suolat voivat 113539 5 olla joko hydratoituneessa tai oleellisesti vedettömässä muodossa. Happosuolat valmistetaan standardimenetelmillä, kuten liuottamalla vapaa emäs vesipitoiseen tai vesi-alkoholiliuokseen tai muuhun sopivaan liuottimeen, joka si-5 sältää asianmukaista happoa, ja suorittamalla eristys liuoksen haihdutuksen avulla tai antamalla vapaan emäksen reagoida orgaanisessa liuottimessa, jolloin suola erottuu suoraan tai voidaan saada liuoksen konsentroinnin kautta. Yleensä esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden hap-10 poadditiosuolat ovat kiteisiä aineita, jotka ovat veteen ja erilaisiin hydrofiilisiin muotoihin liukoisia, niillä on korkeammat sulamispisteet ja lisääntynyt stabiilisuus.

Farmaseuttisesti hyväksyttäviä metalli- ja amii-nisuoloja ovat sellaisia, jotka ovat stabiileja vallitse-15 vissa olosuhteissa ja joissa kationilla ei ole oleellista vaikutusta suolan biologiseen aktiivisuuteen. Sopiviin me-tallisuoloihin kuuluvat natrium-, kalium-, kalsium-, barium-, sinkki- ja alumiinisuolat. Natrium- ja kaliumsuolat ovat edullisia. Sopivia amiinisuoloja valmistetaan amii-20 neista, jotka ovat riittävän emäksisiä aikaansaamaan stabiilin suolan, ja niihin kuuluvat edullisesti sellaiset • l amiinit, joita käytetään usein lääketieteellisessä kemias- ; · sa niiden alhaisen toksisuuden ja lääketieteelliseen käyt- ; töön soveltuvuuden vuoksi. Näihin kuuluvat trialkyyliamii- 25 nit, kuten trietyyliamiini, ja muut, kuten prokaiini, di-; ·, bentsyyliamiini, N-bentsyyli-beetafenetyyliamiini, efen- .* amiini ja N, N'-dibentsyylietyleenidiamiini, dehydroabi- * ♦ ‘ etyyliamiini, N-etyylipiperidiini, bentsyyliamiini ja di- sykloheksyyliamiini.

1 · •d 30 Kaavan I ja II mukaisten yhdisteiden "stereoisomee- ·,,,· riset muodot" on yleinen termi näiden yhdisteiden kaikille . ...j isomeereille, jotka poikkeavat ainoastaan niiden atomien /··, avaruudellisen orientoitumisen suhteen ja joihin kuuluvat » · peilikuvaisomeerit (enantiomeerit), geometriset (cis/ v * 35 trans) isomeerit ja lääkeaineisomeerit, joissa kiraliakes- ,‘‘i kuksia on useampia kuin yksi ja jotka eivät ole toistensa 113539 6 peilikuvia (diastereoisomeerit). Seokset voidaan erottaa tai eristää alalta tunnettujen konventionaalisten ja stan-darditoimenpiteiden mukaisesti, esim. voidaan suorittaa kromatografinen erotus, jakokiteytys, käyttää optisesti ak-5 tiivisia happoja, entsymaattista erotusta ja vastaavia. Tautomeeriset enoli-ketomuodot voivat sijaita puriinikes-kuksen 6-asemassa, ja pyrimidiinissä voi esiintyä amiini-imiinitautomeerisia muotoja. Vaikka "Wc"-yksikkö voi olla esitetty tässä yhteydessä cis-muotona, niin on ymmärrettä-10 vä, että sen tarkoitus on käsittää sekä cis- että trans-muodot.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) poistetaan suojaryhmä(t) yhdisteestä, jolla on 15 kaava (RO) 2P(=0)TPg-W-Z-EMÄS, jossa R on R5, Rs' tai -CH (Rg) -0-C (0) R5, jolloin R5, Rs', R6, T, W ja Z ovat kuten edellä on määritelty, Pg on suojaryhmä 20 ja EMÄS on mahdollisesti substituoituna ryhmä X2 χ4

: · N

N Y" N

. I ' tai I

v 25 A'/ Ί1

. X, N j- O N

jolloin

Xi, X2, X3 ja X4 ovat kuten edellä on määritelty, tai/ja haluttaessa ·· : 30 b) hydrolysoidaan yhdiste, jolla on kaava . ; (ro)2p(=o)t-w-z-emäs * 1 jossa R, T, W ja Z ovat kuten edellä on määritelty ja EMÄS * 35 on substituoimattomana edellä määritelty EMÄS, jolloin saa- */·: daan vastaava yhdiste, jolla on kaava 113539 7 (HO) 2P(=0)T-W-Z-EMAS.

Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa soveltamalla alalta tunnettuja analogisia kemial-5 lisiä reaktioita käyttäen reagensseja, jotka ovat jo tunnettuja tai jotka voidaan valmistaa alalta tunnettuja standardimenetelmiä ja -tekniikoita käyttäen. Yleinen menetelmä kaavan I ja II mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi voidaan periaatteessa kuvata seuraavalla reaktiokaaviolla I.

10 Ellei toisin mainita, seuraavat kaaviot sisältävät muuttujia, joilla on edellä määritellyn mukainen merkitys. "Pg" tarkoittaa tarkoituksenmukaista suojaryhmää. Tarkoituksenmukaisia suojaryhmiä voidaan löytää teoksesta "Protective groups in organic synthesis", 2. painos, Theodora 15 W. Greene, John Wiley and Sons, Inc., New York (1991), joka liitetään tähän hakemukseen viitteellä. Eräinä esimerkkeinä mainittakoon THP (tetrahydropyranyyli), TBDMS (tertiobutyy-lidimetyylisilyyli), TBDPS (tertiobutyylidifenyylisilyyli). Pg:n alaindeksejä käytetään erottamaan suojaryhmiä siten, 20 että tietyt suojaryhmät voidaan lohkaista selektiivisesti toisten jäädessä koskemattomiksi. "B" tai "EMÄS" tarkoittaa : : tässä yhteydessä määritellyn mukaista nukleiiniemästä.

*; ·* "DEAD" tarkoittaa dietyyliatsodikarboksylaattia. "TMS Br" . tarkoittaa trimetyylisilyylibromidia. "Ph" tarkoittaa fe- I. 25 nyyliä. "K2CO3" tarkoittaa kaliumkarbonaattia. "DMF" tar-; t> koittaa dimetyyliformamidia. M+ tarkoittaa farmaseuttisesti ’ hyväksyttävää alkalimetallikationia. "n" on 1 tai 2.

» * * ·

Kaavioissa I - III esitetään kaavion A mukaisten välituotteiden (3), (6) ja (9) valmistus. Kaavioissa IV - 30 VI esitetään synteesit lähtien välituotteista (3), (6) ja (9). Kaaviosta A nähdään yleiskatsaus, kuinka kaaviot on sovitettavissa yhteen. Kaavio B edustaa vaihtoehtoista syn- » teesiä kaavion A osalle, kun taas kaavio C on lisänä kaavi-oon A. Kaaviot D, E ja F koskevat R3- ja R4-paikoissa ole- \ · 35 via muuttujia.

* · * * ► · 8

11353P

Kaavio I

Välituotteen (3) valmistus (kun T on tyydyttynyt yksikkö)

X—CH2—Υχ— W— (CH2)n— OPgj^ (D

5 (RO)3P, Δ ^ Valhe a: Arbuzovin reaktio 0

10 I

(RO)2P— CH2— Yx— W- (CH2)n— OPg1 (2) (Vaihe b: Pg.-suojaryhmän selektiivinen poisto 15 (RO) 2P— CH2— Yj— W— (CH2) — OH (3) W = Wa, Wc tai Wd.

Yi = CH2, CH (OPg2) , OCH2, OCH (CH2OPg2) , CH (CH2OPg2) CH2, CH (CH2OPg2 tai CH2CH (CH2OPg2) .

20 n = 1 tai 2 X = halogeeni (Cl, Br, I).

[il R = Ci-15-alkyyli tai bentsyyli.

; · Tyypillisesti tyypin (3) mukaisten yhdisteiden kaa- ; vion I mukaisessa valmistuksessa vaiheessa a käytetään Ar- 25 buzovin reaktiota, jolloin kuumennetaan trialkyylifosfiit-; ti- tai triaryylifosfiittiyksikköä ja tyypin (1) mukaista sopivasti suojattua alkoholihalogenidia, Engel R. et ai., ‘ Chem Rev. 77: 349 (1977) ja Holy A. et ai., Collect. Czech.

Chem. Commun. 52: 2801 (1987). Hydroksin suojaryhmät Pgi ja ' 1 • 30 Pg2 valitaan siten, että ne ovat stabiileja reaktio- olosuhteissa ja jotka lisäksi voidaan lohkaista selektiivi- sesti reaktion mentyä loppuun vaiheessa b tyypin (3) mukai- ,···, sen yhdisteen saamiseksi.

« · » • 1 »

I I i I

1 » 113539 9

Kaavio II

Välituotteen (6) valmistus (kun T on tyydyttymätön yksikkö) 5 OHC-Y2-W-(CH2)n-OPg2 (4) [(R0)2P(0)]2CHeM® tai.

v I Vaihe a: Wittig-reaktio

(RO)2P(o)-CH = P-Ph3 I

10 n <R0>2P»^i\ N Y2-W— (CH2)n_OPgi (5) 1 Vaihe b: Pg^-suojaryhmän selektiivinen poisto

II

(R0>2P\^\ \γ2—W-(CH2)n-OH (6) 20 Y2 = ei mikään, tai on CH(0Pg2) tai CH2(CH2OPg2), ehdolla, että kun Y2 = 0, niin W ei ole Wc. W = sama kuin kaaviossa ·. A. R = C1.15-alkyyli tai bentsyyli.

| Kaaviossa II tyypin (6) mukaisia yhdisteitä saadaan

Wittig-tyyppisellä reaktiolla, jonka ovat esittäneet Jones 25 G. ja Moffat julkaisussa J. Org. Chem. (1968) ja Waszkuc I · W. et ai., julkaisussa Synthesis 1025 (1984), käyttäen : tyypin (4) mukaisia aldehydejä. Esimerkiksi asianmukaisen • aldehydin, joka on tyyppiä (4), annetaan reagoida tetra- etyleenibisfosfonaatin litiumsuolan kanssa, jota suolaa on ;· 30 hieman ylimäärin yhtä molaarista ekvivalenttia vastaavaan ; määrään nähden, aproottisessa liuottimessa, kuten tetra- ' . hydrofuraanissa. Reagoivia aineita sekoitetaan tyypilli- > · < · * ,,, sesti yhdessä aikajakso, joka vaihtelee 10 - 24 tunnin t t *;* välillä, lämpötilassa, n. -78 °C. Vastaava alkenyylifos- : I : 35 fonaatti (5) otetaan talteen reaktioseoksesta alalta hyvin » · • · > · 113539 10 tunnetuilla uuttomenetelmillä. Vaiheessa b hydroksin suo-jaryhmä Pgx lohkaistaan selektiivisesti, jolloin saadaan tyypin (6) mukaista alkoholia.

5 Kaavio III

Välituotteen (9) valmistus (kun T-yksikkö sisältää hapen) X—Y3 —W—(CH2)n-0Pgi (7)

10 O

11 I

(R0)2P—ch2o®m® Vaihe a

o T

II

15 (RO)jP—CH^O—Yj—W— (CH2) _ OPgj (8) I 'Vaihe b: Pg^-suojaryhmän selektiivinen poisto

II

2Q (RO)2P-CH20-Y3_f»_ (CHj)_ OH (9) I < ; Y3 = CH2 tai CH(CH2OPg2).

• » W = sama kuin kaaviossa A.

» I

' 25 X = lohkeava ryhmä, kuten mesylaatti, tosylaatti, trif- ;· ; laatti tai halogenidi (Cl, Br, I).

• · «* : R = Cj.ig-alkyyli tai bentsyyli.

’·. * Vaihtoehtoisesti 30 HO-Y3-W-(CH2)n_OPg2 (10)

O

ii .

I ! (RO) 2P*“ CH2*—“ X, emäs I Vaihe a O ▼

35 II

; . (ro)2p— ch2— o-y3— w- (CH2)n_opg2 (8) 11353? 11 X = tosylaatti tai mesylaatti.

W, Pg ja Y3 = edellä määritellyn mukaisia.

R = Ci.^-alkyyli tai bentsyyli.

Kaaviossa III tyypin (8) mukaisia yhdisteitä saa-5 daan vaiheessa a suorittamalla tyypin (7) mukaisen allyy-lisen, propargyylisen tai alleenisen halogenidin nukleo-fiilinen korvaus hydroksimetyylifosfonihapon diesterin alkoksidianionilla aproottisessa liuottimessa, kuten tet-rahydrofuraanissa tai dimetyyliformamidissa, lämpötilavä-10 Iillä -10 - 50 °C 6-24 tunnin ajan. Vaiheessa b hydrok-sisuojaryhmä Pg! lohkaistaan selektiivisesti, jolloin saadaan tyypin (9) mukaista alkoholia.

Vaihtoehtoisesti tyypin (8) mukaisia yhdisteitä voidaan saada suorittamalla tosyylioksimetyylifosfonihapon 15 diesterin nukleofiilinen korvaus tyypin (10) mukaisen alkoholin alkoksidianionilla samoissa reaktio-olosuhteissa kuin edellä on kuvattu.

Kaavio IV

20 Lähtöaineena kaavioista I, II ja III saadut välituotteet (3), (6) tai (9)

·* I

: 25 (R0)2p -tp9i -W-(CH2)n0H

r (3)/ (6), (9) : I Vaihe a: lohkeavan ryhmän (Lg) I muodostus il . ;· 30 (BO)jP—TPgj—W— (CH2)n—Lg (11) ‘ BPg3 | Vaihe b :: 35 > t

* I

113539 12

Kaavio IV jatkuu

O

II

(RO)2P—TPg^- W— (CH2)n— BPg3 (12) 5

Valhe c: erilaisten suojaryhmien Pgj» Pg3 poisto

TMSBr, CH3CN

10 A

Vaihe d: fosfonihapon diesterin hydrolyysi

O

15 (HO)2P—W- (CH2)— B (13)

Vaihtoehtoisesti 0 20 (R0)2P— TPgj — W— (CH2)n— OH (3)/(6),(9) I Vaihe b: Mitsunobun reaktio > » ‘ ‘ ‘ 25 0

II

j ! . (RO)2P-TPgi-W-(CH2)n—BPg3 (12) v : Lg = tosylaatti, mesylaatti, triflaatti, Cl, Br tai I.

Pg, B Ja W = edellä määritellyn mukaisia.

30 R = Ci.ij-alkyyli tai bentsyyli.

: " ; Kaavioissa IV, V, VI vastaaviin yhdisteisiin (3), (6) tai (9) liitetään tarkoituksenmukainen tämän hakemuksen yhteydessä määritelty puriini- tai pyrimidiiniemäs, jolloin saadaan toisistaan riippumatta yhdisteet (13), : : 35 (16) ja (19).

13 113535

Kaaviossa IV yhdisteiden (3), (6) tai (9) hydroksi-funktion korvautuminen nukleiiniemäksellä aikaansaadaan muuttamalla alkoholi lohkeavaksi ryhmäksi (vaihe a), jolloin saadaan yhdiste (11), jonka annetaan reagoida yhden 5 molaarisen ekvivalentin asianmukaista nukleiiniemästä (B) kanssa, joka nukleiiniemäs on suojatussa muodossa (BPg3), tarvittaessa emäksen, kuten kaliumkarbonaatin, läsnä ollessa orgaanisessa liuottimessa, kuten vedettömässä dime-tyyliformamidissa (vaihe b). Reagoivia aineita sekoitetaan 10 10 - 48 tuntia n. 0 °C:n ja huoneenlämpötilan välillä, jolloin saadaan yhdistettä (12). Sitten vaiheittain toteutettava emäksen suojaryhmän poisto ja fosfonihappodies-terin hydrolyysi trimetyylisilyylibromidilla voidaan suorittaa lukuisilla tavoilla yhdisteen (13) saamiseksi. Bro-15 nson J. et ai., J. Med. Chem. 32: 1457 (1989) ja Kim C. et ai., J. Med. Chem. 33: 1207 (1990). De-esteröinti- tai suojaryhmän poistovaiheet voidaan suorittaa päinvastaisessa järjestyksessä.

Vaihtoehtoisesti yhdisteen (3), (6) ja (9) hydrok-20 siryhmän korvaaminen nukleiiniemäksellä on mahdollista suorittaa Mitsunobun reaktiolla, ks. julkaisu Jenny T., Tet. Lett. 32: 7029 (1991), välituotteen (12) saamiseksi, ! * * jota sitten käsitellään edellä kuvatun mukaisesti, jolloin saadaan tyypin (13) mukaisia yhdisteitä.

•·ί.: 25 t ti * · · I »

* I

* * • · k i4 113539

Kaavio V

Lähtöaineena välituotteet (3), <6) tai (9)i kun z _ ^ (3), (6), (9) g HCHO, HC1 -kaasu I Vaihe a [0 ” " Ί (R0)2P—ΤΡςλ— W—CHy-. q_ CEj— cJ (14) 2^q Silyloitu nukleiiniemäs I Vaihe b O t

II

(RO)2P—TPgx— W— CHj— O— CHy- BPg3 (15) 15 Vaihe c: Pg^Pg^Pg^ 0 1 su°jaryhmien poisto

Il * (RO)2P—T—W—CHj—O—CHy— B (16) 20 | TMS Br I Vaihe d: estereiden hydrolyysi O " : || (HO)jP—T— W— CHr-O-CHj- B (17) « 4 · 25 B, Pg, W ja T = edellä määritellyn mukaisia.

·· R = C1_15-alkyyli tai bentsyyli.

: Kaaviossa V yhdisteiden (17) nukleiiniemäkseen * liittynyt metoksimetyyliesterifunktio (Z = CH2OCH2) muodos tetaan käsittelemällä jonkin yhdisteistä (3), (6) tai (9) 30 (kun n = 1) ja paraformaldehydin seosta vetykloridikaasul-la 1,2-dikloorietaanissa kloorimetyylieetterivälituotteen (14) muodostamiseksi (vaihe a), ja happokloridiylimäärän poiston jälkeen käsittelemällä saatua välituotetta nukle-

1 I

iiniemäksen (BTMS) silyloidulla muodolla, joka on saatu : 35 käsittelemällä vastaavaa nukleiiniemästä ylimäärällä bis- t » · 113539 15 trimetyylisilyyliasetamidia (vaihe b). Vaiheittain toteutettava nukleiiniemäksen suojaryhmän poisto ja fosfoni-hapon diesterin hydrolyysi saadaan aikaan kaavion I yhteydessä kuvatulla tavalla (vaiheet c ja d), jolloin saa-5 daan yhdisteitä (17), Ogilvie K. et ai., Can. J. Chem. 60: 3005 (1982) ja Ogilvie K. et ai., Nucleosides and Nucleotides 2: 147 (1983).

Kaavio VI

10 Lähtöaineena välituotteet (3), (6) tai (9), kun Z = CH2-0 (3)/ (6), (9) BPg3-0H, PPh3 DEAD I a: Mitsunobun ' 3' I reaktio 0 * 15 il (R0)2P—TPg!—W—CHy-O-BPg3 (18) I Vaihe b: Pg^ ja Pg3~ suojaryhmän poisto

20 O

II

(R0)2P—TPg2— W—CHy- OB (19) i * mUe D I Vaihe c: fosfonihapon diesterin ™S ΒΓ hydrolyysi

‘ : ' 25 X

0 "

Il i (HO) 2P— T— W— CH^— OB (20) i i » r

Kaaviossa VI happi-nukleiiniemäsliitoksen sisältä-30 viä tyypin (20) mukaisia yhdisteitä muodostetaan Mitsu-nobu-tyyppisellä reaktiolla liittämällä sopivasti funktio-’, nalisoituja alkoholeja (3), (6) tai (9) 1-hydroksipyrimi- | ’ diineihin tai 9-hydroksipuriineihin, ks. julkaisu, Parkin ' A., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2983 (1991), käyttäen tri- ; : 35 fenyylifosfiinia, dietyyliatsodikarboksylaattia dimetyyli- 16 11353? formamldlssa (vaihe a). Nukleiiniemäksen ja fosfonihapon diesterin suojauksen poisto suoritetaan kaaviossa IV kuvatun mukaisesti.

5 Kaavio A

OHC-Y2-W-(CH2)nOPg2 Kaavio (II) XTPgi_W_ (CH2)nOPg2 Lg — Y3 — W— (CH2)nOPg2 10 Kaavio (I) Kaavio (III) \ I / (R0)2P(0)-TPgi-W-(CH2)n-0H (3), (6), tai (9)

Kaavio (IV)

Kaavio (V) Kaavio (VI) - .7 \.

: Il II

: (HO)2P~T—W— (CH2)n—B W (H0)2P—T—W—CH2OB

25 (13) O (20) (ho)2p—t— w_ ch2och2b « · i · 0'm· (17)

Lg = lohkeava ryhmä, kuten tosylaatti, mesylaatti, trif- ·· 30 laatti, Cl, Br tai I.

Β, W ja T = edellä määritellyn mukaisia.

X = halogeeni.

R = C1.15-alkyyli tai bentsyyli.

Erityistapauksessa, jossa yhdisteet sisältävät me-35 tyleenioksimetyylin liittyneenä fosforiatomiin (T = CH20- • t # 113539 17 CH2), on mahdollista käyttää symmetrisen dihalogenidin (kloridi) vaiheittaista alkylointia seuraavasti:

Kaavio B

5 Kaaviolle A vaihtoehtoinen synteesi, kun T - CH20CH2 ja Z = CH2

O

^ ö λ Kaavion IIL^ (RO)2PCH2OeM® + XCH2— W— CH,X (21) --> 1 2 1 2 I vaihe a 10 o

II

(RO)2PCH2OCH2—W—CH2X (22) kaavion IV

vaihe b 15

O

BPg, Il

Fco /DMF 1 (R°)2pCB2°CH2-W-CH2- BPg3 c Ja d» 2 3 suojauksen poisto (23) 20 0

II

• (HO)2PCH2OCH2— w— CH2B (24) · ·

"! 25 Erityistapauksessa, jossa käytetään kaaviossa B

;· kuvattua tyypin (21) mukaista symmetristä yksikköä, kaa- • 1 · · vion XII vaiheessa a ja kaavion IV vaiheessa b kuvatut ’ korvaukset on mahdollista aikaansaada vaiheittaisesti käyttäen samoja olosuhteita kuin on kuvattu erillisissä 30 tapauksissa, kaavion III vaiheen a mukaisesti, metoksifos-: : fonihappodiesterin liittämiseksi, jolloin saadaan yhdis- , tettä (22), ja kaavion IV vaiheen b mukaisesti, suojatun nukleiiniemäksen liittämiseksi, jolloin saadaan yhdistettä (23). Vaiheittain toteutettava nukleiiniemäksen suojauksen 18 11353? poisto ja fosfonihappodiesterin hydrolyysi tuottaa yhdistettä (24).

Kaavio C

5 Lisänä kaavioon A, kun W CH=CH=CH

O O

Il _ B II B

(RO)2P — TPg— =-/ -^ (RO)2P—TPg— —=/ (24) (25) 10

O

valmistettu kaavion (IV) || B

mukaisesti kaava (12), > (H0)2P—T— —-/ jossa n = l#W=—-C=G— (26) 15

Kun Z = nolla, W tarkoittaa aina allenyyliyksikköä ja tyypin (26) mukaiset yhdisteet saadaan etynyylijohdannaisista (24) (saadaan jollakin edellä kuvatuista menetelmistä T:stä riippuen) emäskäsittelyllä, jolloin etynyyli-20 funktio isomeroituu allenyylifunktioksi, kuten ovat kuvanneet Phadtar S. et ai., J. Am. Chem. Soc, 111: 5925 (19 -89).

* »

Kaavio D

• < I

' 25 (H0)2-p(0)-q (r50)2-p(0)-q —► {r5o)-p(0)-q-r (c)

(27) S02CI/R50H (28) (29) OH

uRsOH

30 (r5o)-p(0)-q (30) or5‘

;·’ Q = -T-W-Z-EMÄS, jossa T, W, ja Z ovat kaavojen I ja II

' 35 yhteydessä määritellyn mukaisia ja EMÄS tarkoittaa tässä t · 113539 19 yhteydessä määritellyn mukaisia nukleiiniemäksiä. R5 ja R5' ovat edellä määritellyn mukaisia.

Kaaviossa D, vaiheessa (a), dihydroksifosfonaatin (27) annetaan reagoida tionyylikloridin kanssa, jolloin 5 saadaan dikloorifosfonaattia, joka reagoi edelleen R5OH- alkoholin kanssa, jolloin saadaan disubstituoitua fos-fonaattia (28). Vaiheessa (b) disubstituoitu fosfonaatti (28) hydrolysoidaan saaden yhdistettä (29). Vaiheessa (c) monoasyylioksialkyylimonoalkyylifosfonaatin (29) annetaan 10 reagoida tionyylikloridin kanssa edellä kuvatun mukaisesti ja edelleen Rs'0H:n kanssa, jolloin saadaan epäsymmetrisesti disubstituoitua fosfonaattia, jossa R5 ja R5' ovat erilaisia.

15 Kaavio E

(HO)2-P(0)-Q _„ |R5-C(0)-0-CH(R6) 0] 2 P(0) Q

(27) R5-C(0)-0-CH(R6)-CI (32) 20 <31>

Kuten on määritelty kaaviossa D.

. Kaaviossa E esitetään dihydroksifosfonaatin (27) ; reaktio substituoidun kloorimetyylieetterin (31) kanssa orgaanisen emäksen, kuten substituoidun morfoliinin, läsnä 25 ollessa, jolloin saadaan disubstituoitua fosfonaattia ...V (32).

Kaavio F

3Q (R50)-P(0)-Q -► R5-C(0)-0-CH(R6)-0-P(0)-Q

/ : (29) OH R5-C(0)-0-CH(R6)-CI (32) OH

·: · (31)

Kuten on määritelty kaaviossa D.

113539 20

Kaaviossa F esitetään monoasyylioksialkyylimonoal-kyylifosfonaatin (29) reaktio kloorimetyylieetterin (31) kanssa edellä kuvatun mukaisesti, jolloin saadaan mono-asyylioksialkyylifosfonaattia (32).

5 Esimerkki 1

f <XjL

(ho)2p^^-^ n nnh2 10 " E-9-(5-dihydroksifosforyyli-3-metylideeni-4-pen-tenyyli)guaniini (Jossa Xx on NH2, X2 on OH, Z on CH2CH2, W on Wa, jossa R2 ja R2 ovat kumpikin H ja T on Ί", joka on CH=CH)

15 Vaihe A

4-t-butyylidimetyylioksi-2-metylideenibutanaali Seosta, joka sisältää 4-t-butyylidimetyylioksi-2-asetyylioksi-l-butanolia (14 g, 50 mmol), molekyyliseuloja jauheena, N-metyyli-morfoliinin N-oksidia (9,9 g, 75 mmol) 20 ja tetrapropyyliammoniumperrutenaattia (TPAP) (0,34 g, 2,5 mmol) vedettömässä dikloorimetäänissä (250 ml), sekoitetaan yön yli 20 °C:ssa. Sitten reaktioseos suodatetaan k ! celiten läpi, konsentroidaan in vacuo ja otsikon mukainen tuote puhdistetaan flash-kromatografialla käyttäen silika-‘25 geeliä (8,25 g, 77 %).

• - i Vaihe B

• » ! E-5-t-butyylidimetyylisilyylioksi-3-metylideeni-l- • pentenyyli-fosfonihapon dietyyliesteri

Liuos, joka sisältää 1,6 M n-butyylilitiumia hek- ·;· 30 saanissa (4,7 ml, 7,45 mmol), lisätään tetraetyylimetylee- > * « · nibifosfonaatin (2,14 g, 7,45 mmol) ja vedettämän tetra-• , hydrofuraanin (70 ml) seokseen -78 °C:ssa argonin alla.

|Yhden tunnin kuluttua joukkoon lisätään tipoittain liuos, t m '···’ jossa on 4-t-butyylidimetyylioksi-2-metylideenibutanaalia :T: 35 (1,14 g, 5,3 mmol) vedettömässä tetrahydrofuraanisssa (10 » * · 113539 21 ml). Reaktioseosta sekoitetaan 3 tunnin ajan -78 eC:ssa ja yön yli 20 °C:ssa, sitten se hydrolysoidaan kyllästetyllä ammoniumkloridiliuoksella ja uutetaan dietyylieetterillä. Otsikon mukainen tuote eristetään flash-kromatografialla 5 käyttäen silikageeliä (1,7 g, 91 %).

Vaihe C

E- 5 -hydroks i - 3 -me ty 1 ideeni -1 -pentenyyl i f os f onihapon dietyyliesteri

Seosta, joka sisältää E-5-t-butyylidimetyylisilyy-10 lioksi-3-metylideeni-l-pentenyylifosfonihapon dietyy- liesteriä (1,7 g, 4,86 mmol) ja 1 M tetrabutyyliammonium-fluoridia tetrahydrofuraanissa (8 ml, 8 mmol) sekoitetaan kahden tunnin ajan 20 °C:ssa. Sitten reaktioseos konsentroidaan in vacuo ja otsikon mukainen tuote puhdistetaan 15 flash-kromatografialla käyttäen silikageeliä (1,1 g, 94 %).

Vaihe D

E-5-tosyy1ioksi-3-mety1ideeni-1-pentenyy1ifosfoni-hapon dietyyliesteri 20 Seosta, joka sisältää E-5-hydroksi-3-metylideeni-l- pentenyylifosfonihapon dietyyliesteriä (1,07 g, 4,6 mmol), trietyyliamiinia (0,7 ml, 5 mmol), tosyylikloridia (0,96 g, 5 mmol) ja dimetyyliaminopyridiiniä (0,005 g, 0,04 mmol) vedettömässä ja dikloorimetaanissa, sekoitetaan i · « ' 25 4 tuntia 20 °C:ssa, konsentroidaan in vacuo ja suoritetaan flash-kromatografointi käyttäen silikageeliä, jolloin saa-; daan otsikon mukaista yhdistettä (1,55 g, 87 %).

0': Vaihe E

E-9- (5-dietoksif osf onyyli-3-metylideeni-4-pentenyy-··· 30 li)-6-kloori-2-aminopuriini

Seosta, joka sisältää 6-kloori-2-aminopuriinia • , (0,74 g, 4,3 mmol), natriumhydridiä (0,175 g, 4,3 mmol, | * 60-prosenttinen, öljyssä) vedettömässä dimetyyliformami-

* I

dissa (10 ml), sekoitetaan 30 minuutin ajan 20 °C:ssa. 35 Sitten joukkoon lisätään liuosta, joka sisältää E-5-tosyy- » » * ♦ * * 22 113535 lioksi-3-metylideeni-l-pentenyylifosfonihapon dietyylies-teriä (1,5 g, 3,9 mmol) vedettömässä dimetyyllformamidlssa (5 ml), ja saatua seosta sekoitetaan yön yli 20 eC:ssa. Tämän jälkeen reaktloseos konsentroidaan in vacuo ja jään-5 nös puhdistetaan flash-kromatografialla käyttäen silika-geeliä, jolloin saadaan otsikon mukaista tuotetta (1,1 g, 73 %).

Vaihe F

E-9-(5-dihydroksifosfonyyli-3-metylideeni-4-pen-10 tenyyli)-6-kloori-2-aminopuriini

Seosta, joka sisältää E-9-(5-dietoksifosfonyyli-3-metylideeni-4-pentenyyli)-6-kloori-2-aminopuriinia (0,96 g, 2,5 mmol) ja trimetyylisilyylibromidia (1,3 ml, 10 mmol) vedettömässä asetonitriilissä (5 ml), sekoitetaan 15 yön yli 20 °C:ssa. Sitten reaktioseosta käsitellään meta-nolilla (5 ml) ja se konsentroidaan in vacuo. Raakatuote (0,8 g) käytetään ilman enempää puhdistamista seuraavassa vaiheessa.

Vaihe G

20 E-9-(5-dihydroksifosfonyyli-3-metylideeni-4-pen- tenyyli)guaniini

Seosta, joka sisältää raakaa E-9-(5-dihydroksifos-fonyyli-3-metylideeni-4-pentenyyli )-6-kloori-2-aminopurii-nia (0,8 g, n. 0,245 mmol) 1 N suolahapossa (5 ml), sekoi-

« I

25 tetaan yön yli 20 °C:ssa. Sitten reaktioseos konsentroi- * · ;11· daan in vacuo, laimennetaan absoluuttisella etanolilla, ja : seoksen jäähtyessä saadaan otsikon mukaista tuotetta 0’: (0,46 g, 60 %).

Esimerkki 2 ;:· 30

!··'. OH

Γ Ϊ < Tj i < · · I 1 · ' 1 23 113539 E-9-[(4-dihydroksifosforyyli-2-metylideeni-3-bu-tenyylioksi)metyyli]guaniini (Jossa X2 on NH2, X2 on OH, Z on CH2OCH2, W on Wa, jossa R2 ja R2 ovat kumpikin H ja T on Τ', joka on CH=CH).

5 Vaihe Ά 2-t-butyy1idifenyylisilyylioksimetyyli-2-propen-1- oli

Liuos, joka sisältää t-butyylidifenyylisilyyliklo-ridia (45 g, 165 mmol) vedettömässä dikloorimetaanissa 10 (60 ml), lisätään tipoittain sekoitettuun liuokseen, jossa

on 2-hydroksimetyyli-2-propen-l-olia (12 g, 165 mmol) tri-etyyliamiinia (27,5 ml) ja 4-dimetyyliaminopyridiiniä (2 g) vedettömässä dikloorimetaanissa (300 ml) 0 °C:ssa. Sitten seosta sekoitetaan 20 °C:ssa yön yli, pestään kyl-15 lästetyllä ammoniumkloridiliuoksella ja suolavedellä. Suoritetaan flash-kromatografointi käyttäen silikageeliä, jolloin saadaan otsikon mukaista tuotetta (19,4 g, 40 %). Vaihe B

2-t-butyylidifenyylisilyylioksimetyyli-2-propenaali 20 Seosta, joka sisältää 2-t-butyylidifenyylisilyyli- oksimetyyli-2-propen-l-olia (25,5 g, 86,7 mmol), molekyy-liseuloja jauheena (26 g), N-metyylimorfoliini-N-oksidia * » " | (15,3 g, 130 mmol) ja tetrapropyyliammoniumperrutenaattia • < * < * (1,5 g, 4 mmol) vedettömässä dikloorimetaanissa (400 ml), ‘ 25 sekoitetaan yön yli 20 °C:ssa. Sitten reaktioseos kon- ... sentroidaan in vacuo ja puhdistetaan flash-kromatografilla ; : · käyttäen silikageeliä, jolloin saadaan otsikon mukaista v tuotetta (21 g, 83 %).

Vaihe C

30 E-4-t-butyylidifenyylisilyylioksi-l,3-butadienyyli- fosfonidietyyliesteri

Liuos, joka sisältää 1,6 M n-butyylilitiumia hek-saanissa (70 ml, 120 mmol), lisätään liuokseen, jossa on t tetraetyylimetyleenibisfosfonaattia (34,5 g, 120 mmol) : ; 35 vedettömässä tetrahydrofuraanissa (150 ml) -78 °C:ssa. 30 • « 24 113535 minuutin jälkeen joukkoon lisätään tipoittain liuos, joka sisältää 2-t-butyylidifenyylisilyylioksimetyyli-2-pro-penaalia (21 g, 71,5 nunol) vedettömässä tetrahydrofu-raanissa. Reaktioseosta sekoitetaan 4 tunnin ajan 5 -78 °C:ssa ja yön yli 20 °C:ssa ja sitten hydrolysoidaan kyllästetyllä ammoniumkloridiliuoksella ja uutetaan di-etyylieetterillä. Suoritetaan flash-kromatografointi käyttäen silikageeliä, jolloin saadaan otsikon mukaista tuotetta (20 g, 55 %).

10 Vaihe D

E-4-hydroksi-l,3-butadienyylifosfonihapon dietyy-liesteri

Seosta, joka sisältää E-4-t-butyylidifenyylisilyy-lioksi-1,3-butadienyylifosfonihapon dietyyliesteriä (11 g, 15 26,4 mmol) ja tetrabutyyliammoniumfluoridin trihydraattia

(10 g, 31 mmol) tetrahydrofuraanissa (100 ml), sekoitetaan 2 tuntia 20 °C:ssa. Reaktioseos konsentroidaan in vacuo, laimennetaan etyyliasetaatilla ja pestään suolavedellä. Suoritetaan flash-kromatografointi käyttäen silikageeliä, 20 jolloin saadaan otsikon mukaista tuotetta (4,6 g, 80 %). Vaihe E

E-9-[ (4-dietoksifosforyyli-2-metylideeni-3-butenyy-lioksi )metyyli] -6- (2-trimetyylisilyylietyylioksi)-2-amino-puriini • 1 • ‘ 25 Vedetöntä suolahappoa kuplitetaan seokseen, joka ... sisältää paraformaldehydiä (0,17 g, 5,0 mmol) E-4-hydrok- * 1 : si-1,3-butadienyylifosfonihapon dietyyliesteriä (0,9 g, V · 4,5 mmol) vedettömässä 1,2-dikloorietaanissa (5 ml), 0 °C:ssa 15 minuutin ajan. Reaktioseosta sekoitetaan 2 ·;· 30 tuntia 20 °C:ssa, se konsentroidaan in vacuo ja laimen- netaan 1,2-dikloorimetaanilla (10 ml) ja lisätään 1 tunnin * t aikana liuokseen, joka sisältää bistrimetyylisilyyli-6-(2- trimetyylisilyylietyylioksi)-2-aminopuriinia, joka on saa- » tu kuumentamalla 60 °C:ssa 6-(2-trimetyylisilyylietyyliok-35 si)-2-aminopuriinia (1,3 g, 5 mmol) ja bistrimetyylisilyy- • i ) t • 113539 25 liasetamidia (2,5 g) 1,2-dikloorietaanissa (5 ml), sekä tetrabutyyliammoniumjodidia (0,19 g, 0,5 mmol). Reak-tioseosta sekoitetaan 3 tunnin ajan 20 °C:ssa, sitten 4 tuntia refluksoiden, jonka jälkeen suoritetaan hydrolyysi 5 kyllästetyllä ammoniumkloridiliuoksella ja uutto kloroformilla. Suoritetaan flash-kromatografointi käyttäen silika-geeliä, jolloin saadaan otsikon mukaista yhdistettä (0,37 g, 96 %) .

Vaihe F

10 E-9-[(4-dihydroksifosfonyyli-2-metylideeni-3-buten- yylioksi)metyyli]guaniini

Seosta, joka sisältää E-9-[(4-dietoksifosfonyyli-2-metylideeni-3-butenyylioksi)metyyli]-6-(2- trimetyylisilyylietyy-lioksi)-2-aminopuriinia (0,24 g, 0,5 15 mmol) ja trimetyylisilyylibromidia (0,26 ml, 2 mmol) vedettömässä asetonitriilissä (3 ml), sekoitetaan yön yli 20 °C:ssa. Reaktioseosta käsitellään metanolilla (2 ml), se konsentroidaan in vacuo ja otsikon mukaista tuotetta saadaan kiteytyksellä etanoli:vedestä (0,12 g, 65 %) .

2 0 Esimerkki 3

OH

i f ch2< Tji : : (HO)2p\^OvvJC.n n nh2 25 9-(3-dihydroksifosforyylimetoksi-2-metylideenipro-pyyli)guaniini (Jossa Xi on NH2, X2 on OH, Z on CH2, W on Wa, jossa Ri ja R2 ovat kumpikin H, ja T on T", joka on CH2OCH2)

; 30 Vaihe A

(2-kloorimetyyli-2-propenyylioksimetyyli)fosfoniha-pon dietyyliesteri t Seokseen, joka sisältää hydroksimetyylifosfonihapon dietyyliesteriä (0,84 g, 5 mmol), l-kloori-2-kloorimetyy- » % * » > 26 113539 li-2-propeenia (0,95 g, 7,6 mmol) ja tetrabutyyliammonium-jodia (0,18 g, 0,5 mmol) vedettömässä tetrahydrofuraanissa (10 ml), lisätään natriumhydridiä (0,24 g, 6 mmol, 60-prosentinen, öljyssä) 0 °C:ssa. Seosta sekoitetaan yön yli 5 20 °C:ssa. Reaktioseos hydrolysoidaan kyllästetyllä ammoni- umkloridiliuoksella, uutetaan etyyliasetaatilla ja suoritetaan flash-kromatografointi käyttäen silikageeliä, jolloin saadaan otsikon mukaista yhdistettä (0,35 g, 27 %).

Vaihe B

10 9- (3-dietoksifosforyylimetoksi-2-metylideenipropyy- li)-6-kloori-2-aminopuriini

Seosta, joka sisältää (2-kloorimetyyli-2-propenyy-lioksimetyyli)fosfonihapon dietyyliesteriä (0,285 g, 1,1 mmol), 6-kloori-2-aminopuriinia (0,25 g, 1,5 mmol) ja ka-15 liumkarbonaattia (0,24 g, 1,5 mmol) vedettömässä dimetyyli-formamidissa, sekoitetaan 2 päivää 20 °C:ssa. Sitten reaktioseos konsentroidaan in vacuo ja suoritetaan flash-kromatografointi käyttäen silikageeliä, jolloin saadaan otsikon mukaista tuotetta (0,22 g, 51 %) .

20 Vaihe C

9-(3-dihydroksifosfonyylimetoksi-2-metylideenipro-.* : pyyli) guaniini ·;· · Seosta, joka sisältää 9-(3-dietoksifosforyylimetok- . , . si-2-metylideenipropyyli)-6-kloori-2-aminopuriinia (0,22 g, * « , . 25 0,56 mmol), trimetyylisilyylibromidia (0,43 g, 2,8 mmol) ja J" 2,6-lutidiinia (0,59 g, 5,5 mmol) vedettömässä asetonitrii- • · * ‘Il ‘ Iissä (2 ml), sekoitetaan 24 tunnin ajan 20 °C:ssa argonin • » »

• · I

alla. Sitten reaktioseos konsentroidaan in vacuo ja käsitellään 1 M natriumhydroksidilla (10 ml) 2 päivän ajan 30 20 °C:ssa. Otsikon mukaista yhdistettä saadaan saostamalla ’· etanolilla (0,11 g, 61 %) .

» » 27 113539

Esimerkki 4

OH

o < XX

5 Ϊ /——\ N N NH, (HO)2p^^o^y \/ Z-9 - (4-dihyroks i fosforyy 1 imetoks i - 2-butenyy 1 i) gua- niini 10 (Jossa X2 on NH2, X2 on OH, Z on CH2, W on Wc, jossa Rj ja R2 ovat kumpikin H, ja T on T", joka on CH2OCH2).

Vaihe A

Z-(4-kloori-2-butenyy1ioksi)metyy1i fos fonihapon dietyy1iesteri 15 Seokseen, joka sisältää hydroksimetyylifosfonihapon dietyyliesteriä (1,68 g, 10 mmol), Z-l,4-dikloori-2-butee-nia (1,9 g, 15 mmol) ja tetra-n-butyyliammoniumjodidia (0,36 g, 1 mmol) vedettömässä tetrahydrofuraanissa (15 ml), lisätään natriumhydridiä (0,48 g, 12 mmol, 60- 20 prosenttinen, öljyssä) 0 °C:ssa. Saatua seosta sekoitetaan yön yli 20 eC:ssa, hydrolysoidaan kyllästetyllä ammonium-kloridiliuoksella ja uutetaan dietyylieetterillä. Suorite-: taan flash-kromatografointi käyttäen silikageeliä, jolloin saadaan otsikon mukaista tuotetta (1,2 g, 45 %).

25 Vaihe B

1" Z-9-(4-dietoksifosforyylimetoksi-2-butenyyli)-6-

» T

kloori-2-aminopuriini

Seosta, joka sisältää Z-(4-kloori-2-butenyyliok-si)metyylifosfonihapon dietyyliesteriä (1,05 g, 4 mmol), 30 6-kloori-2-aminopuriinia (1 g, 6 mmol) ja kaliumkarbonaat-ί(ι : tia (0,92 g, 6 mmol) vedettömässä dimetyyliformamidissa ; (10 ml), sekoitetaan 2 päivää 20 eC:ssa. Reaktioseos kon sentroidaan in vacuo ja jäännös puhdistetaan flash-kroma-tografialla käyttäen silikageeliä, jolloin saadaan otsikon : 35 mukaista tuotetta (0,85 g, 55 %).

113539 28

Vaihe C

Z-9-(4-dihydroksifosforyylimetoksi-2-butenyyli)gu- aniini

Seosta, joka sisältää Z-9-(4-dietoksifosfonyylime-5 toksi-2-butenyyli)-6-kloori-2-aminopuriinia (0,78 g, 2 mmol), trimetyylisilyylibromidia (1,5 g, 10 mmol) ja 2,6-lutidiinia (2,15 g, 20 mmol) vedettömässä asetonitriilissä (10 ml), sekoitetaan 24 tuntia 20 °C:ssa argonin alla. Reaktioseos konsentroidaan in vacuo ja jäännöstä käsitel-10 lään 1 M natriumhydroksidilla (15 ml) 2 päivää 20 °C:ssa. Otsikon mukaisen tuotteen natriumsuola saadaan peräkkäisellä saostuksella etanoli:vedessä (0,55 g, 75 %). Esimerkki 5

OH

15 (Γΐ (Η0)2Ρ\^Ό>^_ _ c N N NH2 20 9-(4-dihydroksifosforyylimetoksi-2-butynyyli)guaniini : *. (Jossa Xx on NH2, X2 on OH, Z on CH2, W on Wd ja T on T", ’ joka on CH2OCH2).

Vaihe A

' 25 (4-kloori-2-butynyylioksi)metyylifos£onihapon di- etyyliesteri • Seokseen, joka sisältää hydroksimetyylifosfonihapon : dietyyliesteriä (3,35 g, 20 mmol), 1,4-dikloori-2-butyynia (3,8 g, 30 mmol) ja tetra-n-butyyliammoniumjodidia it j’ 30 (0,75 g, 2 mmol) vedettömässä tetrahydrofuraanissa (100 : ml), lisätään erissä natriumhydridiä (0,95 g, 24 mmol, 60- . prosenttinen, öljyssä) 0 °C:ssa. Saatua seosta sekoitetaan yön yli 0 °C:ssa. Sitten reaktioseosta sekoitetaan yön yli ';** 20 °C:ssa, hydrolysoidaan kyllästetyllä ammoniumkloridi- : 35 liuoksella ja uutetaan dietyylieetterillä. Suoritetaan 29 113535 flash-kromatografointi käyttäen silikageeliä, jolloin saadaan otsikon mukaista tuotetta (2,3 g, 30 %).

Vaihe B

9- (4-dietoksifosforyylimetoksi-2-butynyyli) -6-kloo-5 ri-2-aminopuriini

Seosta, joka sisältää (4-kloori-2-butynyylioksi)me-tyylifosfonihapon dietyyliesteriä (2,03 g, 8 mmol), 6-kloori-2-aminopuriinia (2 g, 12 mmol) ja kaliumkarbonaattia (1,85 g, 12 mmol) vedettömässä dimetyyliformamidissa 10 (15 ml), sekoitetaan 2 päivää 20 °C:ssa argonin alla.

Reaktioseos konsentroidaan in vacuo ja jäännös puhdistetaan flash-kromatografialla käyttäen silikageeliä, jolloin saadaan otsikon mukaista tuotetta (1,7 g, 65 %).

Vaihe C

15 9- (4-dihydroksifosforyylimetoksi-2-butynyyli)gua- niini

Seosta, joka sisältää 9-(4-dietoksifosforyylimetok-si-2-butynyyli)-6-kloori-2-aminopuriinia (1,5 g, 4 mmol), trimetyylisilyylibromidia (3 g, 20 mmol) ja 2,6-lutidiinia 20 (4,3 g, 40 mmol) vedettömässä asetonitriilissä (20 ml) sekoitetaan 1 päivä 20 °C:ssa argonin alla. Reaktioseos . konsentroidaan in vacuo ja jäännöstä käsitellään 1 M nat- ' I riumhydroksidilla (20 ml) 2 päivää 20 °C:ssa. Otsikon mu kaisen tuotteen natriumsuola saadaan peräkkäisellä saos-'· ' 25 tuksella etanoli:vedessä (1,05 g, 70 %).

* * * » # » • · I • · » t i * » I » so 113539

Esimerkki 6

OH

f j \? “X

5 I _|_£ N N ™2 9-(3-dipivaloyylimetoksifosfonyylimetoksi-2-metylideeni-10 propyyli)guaniini (Jossa Xx on NH2, X2 on OH, Z on CH2, W on Wa, jossa Rx ja R2 ovat kumpikin H, ja T on T", joka on CH2OCH2, ja R3 ja R4 ovat kumpikin -0-CH(R6)-0-C(0)R5, jossa R6 on H) N,N’-disykloheksyylikarbodi-imidiä (1,13 g, 0,4 15 mmol) ja kloorimetyylipivalaattia (1,8 g, 12 mmol) lisätään seokseen, jossa on 9-(3-dihydroksifosforyylimetoksi- 2-metylideenipropyyli)guaniinia (630 mg, 2 mmol) vedettömässä DMF:ssä (10 ml). Seosta sekoitetaan 20 °C:ssa yön yli, sitten liukenematon aines suodatetaan pois ja neste 20 konsentroidaan in vacuo. Jäännös laimennetaan tolueenilla ja pestään vedellä. Otsikon mukainen yhdiste puhdistetaan : . flash-kromatografiällä käyttäen silikageeliä ja eluoiden , ; 5-prosenttisella MeOH/CH2:lla.

Esimerkki 7 25 Nukleiiniemäksen modifiointi ; Adeniinijohdannaiset * » : Esimerkeissä, joissa on käytetty 6-kloori-2-amino- *·' * puriinia, on mahdollista käyttää adeniinia tuottamaan vas taava 9-substituoitu adeniini ja sitten voidaan poistaa 30 fosfonihapon diesterin suojaus suorittamalla käsittely : : trimetyylisilyylibromidilla.

; Sytosiinijohdannaiset

Esimerkkien mukaisissa menetelmissä, 4-N-asetyy- t lisytosiinia on mahdollista käyttää 6-kloori-2-aminopurii-> 35 nin tilalla. Suojauksen poisto voidaan toteuttaa 2 vai- ; heessa: 113539 31 (a) suoritetaan käsittely etanolisella ammoniakilla N-asetyyliryhmän poistamiseksi ja (b) suoritetaan käsittely trimetyylisilyylibromi-dilla fosfonaattihapon diesterin hydrolysoimiseksi.

5 Tymiinijohdannaiset

Esimerkkien mukaisissa menetelmissä tymiiniä voi daan käyttää 6-kloori-2-aminopuriinin tilalla. Fosfoniha-pon diesterin hydrolyysi voidaan toteuttaa suorittamalla käsittely trimetyylisilyylibromidilla.

10 2,6-diaminopuriini

Diaminopuriinianalogeja voidaan saada trimetyy-lisilyylibromidikäsittelyllä tai käyttämällä 2,6-diamino-puriinia 6-kloori-2-aminopuriinin tilalla vastaavien esimerkkien mukaisissa menetelmissä.

15 Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia lääketieteelliseen terapiaan ja erityisesti virusinfektioiden hoitoon ja ennaltaehkäisyyn, ja niitä voidaan käyttää esim. antiviraalisina aineina, jotka ovat tehokkaita DNA-viruksia (herpesvirukset 1 ja 2, sytomega-20 lovirus, varicella zoster -virus, Epstein-Barrin virus), retroviruksia (ihmisen immuunikatovirukset 1 ja 2 sekä visnavirus) ja vastaavia kliinisiä tiloja, kuten AIDS-re- * lated complex (ARC), vastaan sekä kasvaimien muodostumi- • · seen liittyviä viruksia vastaan. Esillä olevan keksinnön ‘ ·' 25 mukaisia antiviraalisia aineita voidaan käyttää sekä mono- : terapiaan tarkoitettuina aineina että muiden antiviraalis- • ten aineiden kanssa yhdessä käytettävinä aineina, jolloin ; : niitä voidaan käyttää esim. yhdistelmäterapiassa, joka kohdistuu retrovirusinfektioiden hoitoon, erityisesti ih-I· 30 misten retrovirusinfektioiden hoitoon, ja etenkin ihmisen immuunikatoviruksen hoitoon. Erityisen edullisia yhdistel- , mäterapiassa käytettäviä 2', 3 ’ -dideoksipuriininukleosideja ovat 2',3'-dideoksiadenosiini, 2',3'-dideoksiguanosiini, 2',31-dideoksitioinosiini ja 2’,3’-dideoksi-inosiini. Yh-35 distelmäterapiaan sopiviin muihin aineisiin kuuluvat vi- < t > 113539 32 rusinfektioiden tai niihin liittyvien tilojen hoitoon tai ennaltaehkäisyyn tehokaat aineet, kuten 3' -atsido-3' -deok-sitymidiini (tsidovudiini), 2', 3'-dideoksinukleosidit, kuten 2', 3'-dideoksisytidiini, 2', 3'-dideoksiadenosiini ja 5 2',3’-dideoksi-inosiini, asykliset nukleosidit (esim. asy- kloviiri), interferonit, kuten α-interferoni, munuaiseri-tystä estävät aineet, kuten probenisidi, nukleosidikulje-tuksen estäjät, kuten dipyridamoli, sekä immunomodulaatto-rit, kuten interleukiini II ja granulosyytti-makrofagien 10 pesäkkeitä stimuloivat aineet. Tällaisen yhdistelmätera-pian komponenttiyhdisteet voidaan antaa samanaikaisesti, joko erillisissä tai yhdistelmävalmisteissa, tai eriaikaisesta, esim. peräkkäisesti siten, että saavutetaan yhdistelmävaikutus .

15 Esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden anti- viraalinen vaikutus voidaan määrittää millä tahansa tarkoituksenmukaisella menetelmällä. Seuraavassa esitetään eräitä edustavia menetelmiä näiden yhdisteiden vaikutuksen testaamiseksi.

20 MTT-solunelinkykyisyysmääritys käyttäen ihmisen immuunikatovirusta (HIV) MTT-solunelinkykyisyysmäärityksen ovat alunperin ! kuvanneet Pauwels et ai., (J. Virol. Methods, 1988: 20, I » 309 - 321). Se on kalorimetrinen määritys, joka perustuu 1 ; 25 elinkykyisten, mutta ei kuolleiden, solujen kykyyn pelkis tää väriltään keltaista 3-(4,5-dimetyl-2-yyli)-2,5-di-' : fenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (Sigma Chemical Co.

V · Ltd.) siniseksi formatsaanituotteeksi. Tämän pelkistys reaktion suorittaa metabolisesti aktiivisten solujen mito-:* 30 kondriaaliset dehydrogenaasit. Määrityksen avulla voidaan arvioida nopeasti ja tarkasti yhtä aikaa sekä mahdollisten * , antiviraalisten aineiden anti-HIV-aktiivisuutta että nii den sytotoksisuutta ja siten määrittää selektiivisyysin-;*’ deksit (selectivity indices, S.I).

i » 1 * 113539 33 MT-4-soluja, jotka ovat erittäin herkkiä HIV-infek-tiolle, käytetään infektoitune HIV-I-kannalla RF. Muovisten 96-kuoppaisten tasapohjaisten mikrotiitterilevyjen 60:een keskellä olevaan kuoppaan lisätään 100 μΐ kasvatus-5 väliainetta, joka sisältää testiyhdisteiden laimennusar- jasta aina yhtä laimennusta pitoisuutena, joka on kaksinkertainen vaadittuun loppupitoisuuteen nähden. Reunaosan kuopat täytetään steriilillä tislatulla vedellä haihtumisen estämiseksi inkubointijakson aikana. Yhdisteen jo-10 kaista pitoisuutta kohti on kaksi kolmen kuopan sarjaa siten, että yhdisteen vaikutusta infektoituneisiin ja ei-infektoituneisiin soluihin voidaan arvioida samanaikaisesti. Eräät kuopat jätetään ilman lääkeainetta ja ne toimivat käsittelemättöminä kontrolleina sekä vale- (mock-) 15 että virus-infektoiduille soluille. Eksponentiaalisesti kasvavat MT-4-solut lasketaan ja solujen lukumäärä sovitetaan siten, että saadaan 5 x 104 solua kuoppaa kohti. Sitten solut pelletöidään ja jaetaan kahteen osaan. Toinen puoli soluja infektoidaan viruksella (100TCID50 per 5 x 104 20 solua) ja toinen puoli vale-infektoidaan. Virusadsorptio kestää yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut ·, pelletöidään ja pestään kerran RPMI:ssä ennen uudelleen- f suspensoimista väliainetilavuuteen siten, että mikrotiit- * · , terin kuhunkin kuoppaan voidaan lisätä 100 μΐ. Kasvatusle- • · ' 25 vyjä inkuboidaan 37 °C:ssa inkubaattorissa, joka sisältää - t · ;· ; 5 % C02:ta.

* 1 · ‘ : Kuuden päivän inkuboinnin j älkeen kuhunkin kuoppaan , ' lisätään 10 μΐ MTT:n (7,5 mg/ml) PBS-liuosta ja levyjä inkuboidaan vielä yhden tunnin ajan 37 °C:ssa. Format-;· 30 saanikiteet liuotetaan lisäämällä 100 μΐ 10-prosenttista (til./til.) Triton X-100:aa happamaksi tehdyssä isopro-panolissa (2 ml konsentroitua HC1:ää 500 ml liuotinta kohti) ja sekoitetaan. Lopuksi absorbanssi luetaan 540 nm:n '* aallonpituudella käyttäen Multiskan MCC -spektrofotometria : 35 (Flow Laboratories). Jokaisen yhdisteen tapauksessa muo- 34 113539 dostetaan kuvaaja sekä vale- että vlrus-infektoitujen solujen optisen tiheyden (optical density, O.D.) lukemien keskiarvosta lääkepitoisuutta vastaan. O.D.-arvo, joka edustaa 50-prosenttista päätekohtaa, josta voidaan määrit-5 tää koeyhdisteiden sekä 50-prosenttisen sytotoksisuuden annos (CD50) että 50-prosenttisen eston pitoisuus (IC50), lasketaan käyttäen seuraavaa kaavaa: keskitti. O.D. vale-infekt. - keskim. O.D. virus-infekt. 10 2

Yhdisteiden anti-HIV-aktiivisuuden toteaminen käyttäen C-8166:ta

Muovisten 96-kuoppaisten tasapohjaisten mikrotiit-15 terilevyjen 60:een keskellä olevaan kuoppaan lisätään 100 μΐ kasvatusväliainetta, joka sisältää testiyhdisteiden laimennusarjasta aina yhtä laimennusta pitoisuutena, joka on kaksinkertainen vaadittuun loppupitoisuuteen nähden. Reunaosan kuopat täytetään steriilillä tislatulla vedellä 20 haihtumisen estämiseksi inkubointijakson aikana. Yhdisteen jokainen pitoisuus testataan käyttäen kolmea kuoppaa.

•# Eräät kuopat jätetään ilman lääkeainetta käsittelemättö- a I miksi kontrolleiksi. Eksponentiaalisesti kasvavat C-8166- solut lasketaan ja solujen lukumäärä sovitetaan siten, ·'·’ 25 että saadaan 1 x 105 solua kuoppaa kohti. Solut pelletöi- dään ja infektoitaan HIV:llä, jolloin saadaan moninkertai- : nen infektio, joka on välillä 0,001 - 0,0001 infektoivaa v : yksikköä solua kohti.

Virusadsorptio kestää yhden tunnin ajan huoneenläm-·· 30 pötilassa. Sitten solut pelletöidään ja niitä pestään kol- me kertaa RPMI:llä ennen uudelleensuspensoimista väliaine-tilavuuteen siten, että mikrotiitterilevyn kuhunkin kuoppaan voidaan lisätä 100 μΐ. Kasvatuslevyjä inkuboidaan 37 °C:ssa inkubaattorissa, joka sisältää 5 % C02:ta. Kolmen 35 päivän kuluttua infektoituneet solut todetaan ja pisteyte- ' » 113535 35 tään solusitkon (syncytia) esiintymisen suhteen: +++ =

50 - 100 % cpe; ++ = 10 - 50 % cpe; + = <10 % cpe ja = = ei solusitkoa. Jokaisesta kuopasta otetaan sitten 100 μΐ supernatanttiliuosta ja siitä tutkitaan p24-viruskuoren 5 antigeenin taso käyttäen ELISA:aa. p24 ELISA

96-kuoppaisten 'U'-pohjaisten mikrotiitterilevyjen (Falcon, Becton Dickinson) keskellä olevat 60 kuoppaa päällystetään 100 pl:lla affiniteettipuhdistettua lampaan 10 anti-HIV-l-p24:ää (Aalto Bio-reagents, Rathfarnham,

Dublin, Irlanti, koodi D7320), jonka pitoisuus päällystys-puskurissa (100 mM NaHC03, pH 8,5) on 10 pg/ml. Tämä tuote valmistettiin immunoimalla lammas kolmella erilaisella synteettisellä peptidillä, jotka vastasivat HIV-l-kannan 15 BH-10 p24 gag-proteiinin aminohappoja 283 - 297 (LDIRQGP-

KEPFRDYV); 173 - 188 (SALSEGATPQDLNTML) ja 226 - 237 (GQM-REPRGSDIA). Vasta-aineiden annetaan kiinnittyä levyissä +4 °C:ssa yön aikana ja sitten levyjä pestään kahdesti Tris-puskuroidulla keittosuolaliuoksella (TBS) (0,144 M

20 NaCl, 25 mM Tris, pH 7,5) käyttäen mikrotiitterilevyn huuhtelulaitetta (Luminar Technologies) ennen blokkaamista 2-prosenttisella kuoritulla maidolla (Cadburys Marvel), » ! joka on tehty TBS:ään, 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (200 μΐ/kuoppa). Kaksi kertaa TBS:llä pesun jälkeen kuop-’·· ’ 25 piin lisätään 100 μ1:η tilavuus soluvapaata kasvatusliuos- ··· ta ja 10 μΐ 1-prosenttista (til./til.) kahtaisionisen i.i i Empigen-detergentin liuosta (Calbiochem). Riippuen p24:n v : oletetuista tasoista kasvatusliuokset seulotaan joko lai- mentamattomana tai 1:10- tai 1:100-laimennuksina. Näyttei-•’· 30 tä inkuboidaan huoneenlämpötilassa yön yli ja sitten kuop- pia pestään kolme kertaa ja inkuboidaan 100 μ1:η toista anti-p24-vasta-ainetta, EH12E1-AP, kanssa, joka on kon-jugoitu suoraan alkaliseen fosfataasiin (ADP 452) 1:3 000 pitoisuudessa, TBS:ssä, joka sisältää 20 % lampaanseerumia 35 (Seralab), 2 % kuorittua maitoa (Cadburys Marvel) ja 0,5 % 36 113 5 39

Tween 20:tä (Sigma Chemical Co.)· Tämä vasta-aine, joka on kohdistettu HIV-1 CBl-1 -eristystä vastaan Bridget Ferns, Richard Tedder ja kollegojen toimesta Middlessex Hospital Medical Schoolissa, on kartoitettu kompleksille epitoopil-5 le, joka käsittää kaksi erillistä peptidisekvenssiä. Nämä ovat GHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQ (aminohapot 193 -227) ja NPPIPVGEIYKRWII (aminohapot 253 - 267) ja ne säilyvät (conserved) HIV-l-kantojen välillä. EH12E1 (EH12E1-AP) -alkalinen fosfataasikonjugaatti valmistettiin Novo BioLab-10 silla, Cambridge, UK. Tämä konjugoitu vasta-aine saatiin ADP-reagenssipankin kautta. Levyjä inkuboidaan 37 °C:ssa 1 tunnin ajan käyttäen inkubaattori/ravistelijaa (Luminar Technologies) ja sitten kuoppia pestiin kolme kertaa TBS:ssä. Kuopat pestään lopuksi puskurilla, jota saadaan 15 kaupallisista alkalisen fosfataasin toteamis- ja monistus-kiteistä, AMPAK (IQ (Bio) Ltd.) ja niihin lisätään 50 μΐ AMPAK-substraattia valmistajan ohjeiden mukaisesti. Huoneenlämpötilassa 30 minuutin jälkeen lisätään 50 μΐ AMPAK-monistajaa ja purppuravärin voimakkuus luetaan 4 92 nm: n 20 aallonpituudella käyttäen Multiskan MCC/340 spektrofotomet-ria (Flow Laboratories) n. 10 minuutin kuluttua siitä, kun • reaktio on pysäytetty hapolla.

• * I · ... j Immunomääritys kalibroidaan käyttäen yhdistelmä- . , . HIV-lp24:ää (American Biotechnologies Inc.), joka on saatu ’’ 25 ADP:n kautta, käyttämällä kaksinkertaistuvien laimennuksien , sarjaa lähtien pitoisuudesta 100 ng/ml. Tämä määritys tuot- •y ' taa tavallisesti lineaarisen vasteen 300 - 10 000 pg/ml pi- **' * toisuusvälillä, vaikka päivittäistä vaihtelua esiintyy.

Yhdisteiden anti-herpes (HSV-1- ja HSV-2-) -aktii-, ’ 30 visuuden toteaminen : Määritystä varten HeLa (ihmisen kohdunkaulansyövän) -soluja (0,8 x 105/0,1 ml) tai Vero (African Green Monkey -apinan munuainen) -soluja (1,0 x 105/0,1 ml) sopivassa kasvatusväliaineessa siirrettiin tasapohjaisille 96-kuop-: 35 paisille (0,1 ml soluja/kuoppa) mikrotiitterilevyille (Fal- con) . Kosteutetussa CC>2:ta sisältävässä (5 % CC>2:ta, 95 % » 113535 37 ilmaa) inkubaattorissa 37 °C:ssa 24 tuntia kestävän inku-boinnin jälkeen viljelmät olivat valmiita käytettäväksi.

Jokaista määritystä varten väliainetta imettiin mikrotiitterilevyviljemistä ja lisättiin 100 μ1:η ylläpito-5 väliaineeseen (solu- ja viruskontrollit) tai yhdiste laimennettiin ylläpitoväliaineella kaksinkertaiseen pitoisuuteen testipitoisuudesta (toksisuuskontrollit, koekuopat). Kosteutetussa CC>2:ta sisältävässä inkubaattorissa 37 °C:ssa 3 tuntia kestävän inkuboinnin jälkeen jokaiseen viljelmään 10 lisättiin 100 μΐ ylläpitoväliainetta (solu- ja toksisuus-kontrollit) tai virusta [Herpes simplex -virus tyyppi 1 (HSV-1; kanta HF, ATCC VR-260) tai Herpes simplex -virus tyyppi 2 (HSV-2; kanta G, ATCC VR-734)] laimennettuna yllä- pitoväliaineeseen (viruskontrollit, testiyhdistekuopat). 15 Kaikkia viljelmiä inkuboitiin sitten 37 °C:ssa ja niistä tutkittiin mikroskooppisesti 48 ja 72 tunnin kohdalla (Herpes) tai 7, 10 ja 14 päivän kohdalla (CMV) viruksen ja yhdisteen indusoimaa sytopaattista vaikutusta (cytopathic effect, CPE). CPE luokiteltiin asteikolla, 0 (ei), 1+ (25 %), 20 3+ (75 %) tai 4+ (100 %) tuhoutuminen solujen yhdessä kerroksessa. Näitä tuloksia käytettiin sitten yhdisteiden 50- | prosenttisten eston pitoisuuksien (IC50) laskemiseen.

: Yhdisteiden anti-sytomegalovirusaktiivisuuden to- , ,', teaminen ' ' 25 Määritystä varten MRC-5-soluja (1,2 x 105/0,1 ml) I"; siirrettiin sopivassa kasvatusväliaineessa tasapohjaisiin : 96-kuoppaisille (0,1 ml soluja/kuoppa) mikrotiitterilevyil- » * · V * le (Falcon) . Kosteutetussa CChrta sisältävässä (5 % CC>2:ta, 95 % ilmaa) inkubaattorissa 37 °C:ssa 24 tuntia kestävän J 30 inkuboinnin jälkeen viljelmät olivat valmiita käytettäväk-: si.

113539 38

Jokaista määritystä varten väliainetta imettiin mikrotiitterilevyviljemistä ja lisättiin 100 μ1:η ylläpi-tovällaineeseen (solu- ja viruskontrollit) tai yhdiste laimennettiin ylläpitoväliaineella kaksinkertaiseen pitoi-5 suuteen testipitoisuudesta (toksisuuskontrollit, testikuo-pat). Kosteutetussa C02:ta sisältävässä inkubaattorissa 37 °C:ssa 3 tuntia kestävän inkuboinnin jälkeen jokaiseen viljelmään lisättiin 100 μΐ ylläpitoväliainetta (solu- ja toksisuuskontrollit) tai virusta [Ihmisen sytomegalovirus 10 (CMV, kanta AD-169, ATCC VR-538)) laimennettuna ylläpito-väliaineeseen (viruskontrollit, testiyhdistekuopat). Kaikkia viljelmiä inkuboitiin sitten 37 °C:ssa ja niistä tutkittiin mikroskooppisesti 48 ja 72 tunnin kohdalla (Herpes) tai 7, 10 ja 14 päivän kohdalla (CMV) viruksen ja 15 yhdisteen indusoimaa sytopaattista vaikutusta (cytopathic effect, CPE). CPE luokiteltiin asteikolla 0 (ei), 1+ (25 %), 3+ (75 %) tai 4+ (100 %) tuhoutuminen yhdessä so-lukerroksessa. Näitä tuloksia käytettiin sitten yhdisteiden 50-prosenttisten eston pitoisuuksien (IC50) laskemi-20 seen.

Guaniinin asyklonukleotidijohdannaisten fosforylaa- tion tehoa (määritettynä Vmax/Km-suhteena) guanylaatti- "I ] kinaasilla verrattiin vertailusubstraattina käytetyn GMP:n * * vastaavaan. Menetelmä, jota käytettiin parametrien Vmax ja 25 Km määrittämiseen, on kuvattu julkaisussa Nave et ai., Arch. Biochem. Biophys., 295 (1992) 253 - 257.

: Annettavan aktiivisen aineosan määrä voi vaihdella ·,· : laajasti riippuen käytetystä yksikköannoksesta, hoitoajan pituudesta, hoidettavan potilaan iästä ja sukupuolesta •· 30 sekä hoidettavan häiriön luonteesta ja laajuudesta. Annet- ; tava aktiivisen aineosan kokonaismäärä, joka on tehokas

antiviraalinen määrä, vaihtelee tavallisesti välillä n. 1 - 100 mg/kg ja on edullisesti 3-25 mg/kg. Yksikköannos voi sisältää 25 - 500 mg aktiivista aineosaa ja se voidaan : 35 ottaa kerran tai useita kertoja päivässä. Kaavan I tai II

113539 39 mukaista aktiivista yhdistettä voidaan antaa farmaseuttisen kantajan kanssa konventionaalisissa yksikköannosmuo-doissa joko oraalisesti, parenteraalisesti, topikaalisesti tai transdermaalisesti.

5 Tässä yhteydessä käytettynä termi "potilas" sisäl tää nisäkkäät, kuten hiiret, rotat, kissat, koirat, nautakarjan, lampaat, siat ja kädelliset mukaan lukien ihmiset.

Oraalista antoa varten yhdisteistä voidaan valmistaa kiinteitä tai nestemäisiä valmisteita, kuten kapselei-10 ta, pillereitä, tabletteja, troche- tai lozenge-tablette-ja, sulatteita, jauheita, liuoksia, suspensioita tai emul-sioiota. Kiinteä yksikköannosmuoto voi olla kapseli, joka voi olla tavanomaista kova- tai pehmytkuorista liivate-tyyppiä sisältäen esim. pinta-aktiivisia aineita, liuku-15 aineita ja inerttejä täyteaineita, kuten laktoosia, sakkaroosia, kalsiumfosfaattia ja maissitärkkelystä. Erään toisen sovellutuksen mukaisesti esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan tabletoida yhdistettynä konventionaalisiin tablettiperusmassoihin, kuten laktoosiin, 20 sakkaroosiin ja maissitärkkelykseen, sekä sideaineisiin, kuten akaasiaan, maissitärkkelykseen tai gelatiiniin, ha-jotusaineisiin, joiden tarkoitus on avustaa tabletin ha-) joamista ja liukenemista annon jälkeen ja joita ovat esim.

perunatärkkelys, algiinihappo, maissitärkkelys ja guarku-

* I

25 mi, liukuaineisiin, joiden tarkoitus on parantaa tabletti-·* * raemassojen liukumista ja estää tablettimateriaalin tart- : tumista tablettimuottien ja painimien pintoihin, ja joita ·.· : ovat esim. talkki, steariinihappo tai magnesium-, kalsium- tai sinkkistearaatti, pigmentteihin, väriaineisiin ja ma-**· 30 kuaineisiin, joiden tarkoitus on lisätä tabletin esteet- tistä laatua ja tehdä niistä potilaalle hyväksyttävämpiä.

’, Oraalisissa nestemäisissä annosmuodoissa käytettäviin so piviin apuaineisiin kuuluvat laimennusaineet, kuten vesi ··* ja alkoholit, esim. etanoli, bentsyylialkoholi ja polyety- 35 leenialkoholit, joihin laimennusaineisiin on tai ei ole • · » · 113539 40 lisätty farmaseuttisesti hyväksyttäviä pinta-aktiivisia aineita, suspensoivia aineita tai emulgoivia aineita.

Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan lisäksi antaa parenteraalisesti, so. subkutaanisesti, intravenoosisesti, 5 intramuskulaarisesti tai intraperitoneaalisesti, yhdisteen injektoitavina annoksina fysiologisesti hyväksyttävässä laimennusaineessa farmaseuttisen kantajan kanssa, joka voi olla steriiliä nestettä tai nesteiden seosta, kuten vettä, keittosuolaliuosta, dekstroosin vesiliuosta tai vastaavia 10 sokeriliuoksia, alkoholia, kuten etanolia, isopropanolia tai heksadekyylialkoholia, glykoleja, kuten propyleenigly-kolia tai polyetyleeniglykolia, glyseroliketaaleja, kuten 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia, eettereitä, kuten polyetyleeniglykoli 400:aa, öljyä, rasvahappoa, ras-15 vahapon esteriä tai glyseridiä tai asetyloitua rasvahapon glyseridiä, ja johon kantajaan on tai ei ole lisätty farmaseuttisesti hyväksyttävää pinta-aktiivista ainetta, kuten saippuaa tai detergenttiä, suspensoivaa ainetta, kuten pektiiniä, karbomeereja, metyyliselluloosaa, hydroksipro-20 pyylimetyyliselluloosaa tai karboksimetyyliselluloosaa, tai emulgoivaa ainetta ja muita farmaseuttisia adjuvantte-ja. Esimerkkejä öljyistä, joita voidaan käyttää esillä ! olevan keksinnön mukaisissa parenteraalisissa valmisteis sa, ovat kivi-, eläin-, kasvi- tai synteettistä alkuperää ·* 25 olevat öljyt, kuten maapähkinäöljy, soijapapuöljy, seesa- • miöljy, puuvillaöljy, maissiöljy, oliiviöljy, vaseliini ja i mineraaliöljy. Sopiviin rasvahappoihin kuuluvat öljyhappo, , : steariinihappo ja isosteariinihappo. Sopiviin rasvahap- poestereihin kuuluvat esim. etyylioleaatti ja isopropyyli-··· 30 myristaatti. Sopiviin saippuoihin kuuluvat rasva-alkalime- : talli-, ammonium- ja trietanoliamiinisuolat ja sopiviin ', detergentteihin kuuluvat kationiset detergentit, kuten dimetyylidialkyyliammoniumhalogenidit, alkyylipyridinium-halogenidit ja alkyyliamiinien asetaatit; anioniset deter-: 35 gentit, kuten alkyyli-, aryyli- ja olefiinisulfonaatit, * · « * 113535 41 alkyyli-, olefiini-, eetteri- ja monoglyseridisulfaatit, ja sulfosukkinaatit; ei-ioniset detergentit, kuten rasva-amiinioksidit, rasvahapon alkanoliamidit ja polyoksiety-leenipolypropyleenikopolymeerit; ja amfoteeriset detergen-5 tit, kuten alkyyli-beta-aminopropionaatit ja 2-alkyyli-imidatsoliinin kvaternaariset ammoniumsuolat, sekä näiden seokset. Esillä olevan keksinnön mukaiset parenteraaliset koostumukset sisältävät tyypillisesti n. 0,5 - 25 paino-% aktiivista aineosaa liuoksessa. Edullisesti voidaan käyt-10 tää myös säilöntäaineita ja puskuriaineita. Ärsytyksen minimoimiseksi tai eliminoimiseksi injektointikohdassa voivat tällaiset koostumukset sisältää ei-ionista pinta-aktiivista ainetta, jonka hydrofiili-lipofiilitasapaino (hy-drophile-lipophile balance, HLB) on n. 12 - 17. Pinta-ak-15 tiivisten aineiden määrä tällaisissa valmisteissa vaihte-lee n. 5 - 15 paino-%. Pinta-aktiivinen aine voi olla yksittäinen komponentti, jonka HLB on edellä mainitulla välillä, tai se voi olla kahden tai useamman komponentin seos, jolla on haluttu HLB. Esimerkkejä parenteraalisissa 20 valmisteissa käytettävistä pinta-aktiivisista aineista ovat polyetyleenisorbitaanirasvahappoestereiden luokkaan : kuuluvat aineet, kuten sorbitaanimono-oleaatti ja sellai- ) set etyleenioksidin suurimolekyylipainoiset adduktit hyd- t I · rofobisten emästen kanssa, jotka on muodostettu kondensoi- • » · ‘ ·’ 25 maila propyleenioksidia propyleeniglykolin kanssa.

« · · l Esillä olevan keksinnön mukaisia aineita voidaan f, : antaa myös topikaalisesti. Tämä voidaan toteuttaa yksin- <, · kertaisesti valmistamalla annettavan yhdisteen liuosta käyttäen edullisesti liuotinta, jonka tiedetään edistävän ··· 30 transdermaalista absorptiota, kuten etanolia tai dimetyy- ; lisulfoksidia (DMSO), yhdessä tai ilman muita apuaineita.

• t Topikaalinen anto toteutetaan edullisesti käyttäen laasta ria, joka on joko lääkeainesäiliön ja huokoisen kalvon * · tyyppinen tai kiinteän matriisin tyyppinen. Topikaalinen 35 anto käsittää myös esillä olevan keksinnön mukaisten yh- » > · 42 113539 disteiden sisällyttämisen silmään tai korvaan antoon soveltuviin liuoksiin tai suspensioihin.

Eräitä edullisia transdermaalisia laitteita on kuvattu US-patenttijulkaisuissa nro 3 742 951, 3 797 494, 5 3 996 934 ja 4 031 894. Nämä laitteet sisältävät tavalli sesti selkäosan, joka muodostaa yhden sen ulkopinnoista, aktiivista ainetta läpäisevän adhesiivikerroksen, joka muodostaa toisen sen ulkopinnoista, ja vähintään yhden lääkeainesäiliön, joka sisältää aktiivista ainetta ja si-10 jaitsee mainittujen ulkopintojen välissä. Aktiivinen aine voi olla vaihtoehtoisesti sisältyneenä lukuisiin mikrokap-seleihin, jotka on jaettu kaikkialle läpäisevään adhesii-vikerrokseen. Molemmissa tapauksissa aktiivista ainetta vapautuu jatkuvasti lääkeainesäiliöstä tai mikrokapseleis-15 ta membraanin läpi aktiivista ainetta läpäisevään adhesii-vikerrokseen, joka on kosketuksessa vastaanottajan ihon tai limakalvon kanssa. Mikäli aktiivinen aine absorboituu ihon läpi, vastaanottajalle luovutetaan kontrolloitu ja ennaltamäärätty aktiivisen aineen virta. Mikrokapselien 20 tapauksessa kapseloiva aine voi toimia myös membraanina.

Eräässä toisessa laitteessa, joka on tarkoitettu keksinnön mukaisten yhdisteiden transdermaaliseen antoon, ♦ ! farmaseuttisesti aktiivinen aine on sisällytetty matrii siin, josta se vapautuu halutulla vähittäisellä, vakiolla 25 ja kontrolloidulla nopeudella. Matriisi on läpäisevä ja " : vapauttaa yhdistettä diffuusioon tai mikrohuokosvirtauk- * t : seen perustuen. Vapautuminen on nopeutta kontrolloivaa.

\ : Tällainen järjestelmä, jossa ei tarvita membraania, on kuvattu US-patenttijulkaisussa nro 3 921 636. Näissä jär- ;· 30 jestelmissä on vapautuminen voi tapahtua vähintään kahdel- » · * · la eri tavalla. Vapautumista diffuusiolla tapahtuu, kun * . matriisi on ei-huokoista. Farmaseuttisesti tehokasta yh- • *« * · distettä liukenee ja diffundoituu itse matriisin läpi.

t *;·’ Vapautumista mikrohuokosvirtauksena tapahtuu, kun far- > ·

• · t I

11353P

43 maseuttisesti vaikuttava yhdiste kuljetetaan nestemäisen faasin läpi matriisin huokosissa.

Seuraavassa luettelossa esitetään eräitä edullisia keksinnön mukaisia yhdisteitä, joissa Rx ja R2 tarkoittavat 5 esiintyessään kumpikin vetyä ja R3 ja R4 tarkoittavat kumpikin OH:ta.

Xl ja X2 X3 ja X4 Z W T

10 NH2(OH GH2 CH = CH

NH2,OH CH2OCH2 Wa CH = CH

NH2,OH CH2 Wa CH2OCH2 NH2(OH CH2 Wc CH2OCH2 NH2,OH CH2 Wd ch2och2 ! R NH2, nh2 ch2 w£ ch2och2 NH2,NH2 CH2 Wc CH2OCH2 H, NH2 CH2 Wa CH2OCH2 H, NH2 CH2 Wc CH2OCH2 H, NH2 CH2 Wd CH2OCH2 9n nh2, nh2 ch2 Wd CH2OCH2 H, NH2 CH2 Wd CH2OCH2 H, NH2 CH2 Wa CH2OCH2 • H, NH2 CH2 Wb CH2OCH2 H, NH2 I CH2 I Wc CH2OCH2 25

Seuraavassa luettelossa esitetään edelleen eräitä • · edullisia keksinnön mukaisia yhdisteitä, joissa X3 ja X2 : ovat NH2 ja vast. OH, Z on CH2, W on Wa ja T on CH2OCH2. R5 ja R5’ ovat CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, CH2C(CH3)3 tai bentsyyli, .,;j’ 30 mutta R5 ja R5' eivät ole samanlaisia.

• I • · » « * ♦ • » * · · » « · t · · 113539 44 R3 R4 OH OR5 OR5 OR5' 5 OR5 OR5 OR5 0CH20C(0)R51 0CH20C(0)R51 0CH20C(0)R5'1 10 Näihin kuulvat myös tert-butyyli R5:nä tai R5':nä.

« • · * · t · » ! 1 « » » 1 * 1 1 1 < · • I ( ( · • * « » t · ! · » ·

Claims (19)

11353? 45

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen yhdisteen, jolla on kaava I tai II

5 X2 Λ"ν n"V T ^ 1 hv J-N / “ χ, » < ? 0. z R3-P —T - W Rj.p— T - W

1 I &4 R4 15 I II sen stereoisomeeristen muotojen ja niiden seosten, tauto-meeristen muotojen tai farmaseuttisesti hyväksyttävien suo-20 lojen valmistamiseksi, joissa kaavoissa Xi on H tai NH2; k • X2 on OH tai NH2 ; i X3 on H tai CH3; ja ; : X4 on NH2 tai OH; ;· 2 5 Z ei ole mikään tai on CH2, CH2CH2, CH20 tai CH2OCH2; W on * » 30 iXi k‘ .._^r2 , * : : -T > tai '} wa Wc wd » » » ’ · 35 113539 46 joissa Ri ja R2 ovat kumpikin toisistaan riippumatta H, F tai CH2OH; T ei ole mikään tai on Τ' tai T" , jolloin Τ' on 5 CH2CH2i CH=CH, CH2CH (OH) , CH2CH(CH2OH) tai CH2CH(CH2F), ja T" on CH=CH-CH(OH) , CH=CH-CH (CH2OH) , CH2OCH2, CH2OCH (CH2OH) , CH2CH(CH2OH)CH2i CH2CH2CH(OH) , CH2CH2CH(CH2OH) tai CH2CH2CH-(CH2F) ; ja R3 ja R4 ovat kumpikin toisistaan riippumatta OH, 10 OR5, OR5' tai -O-CH (R6)-O-C (O) R5, ehdolla, että kun R3:sta tai R4: stä yksi on OH, niin toinen ei ole -0-CH(R6)-0-C(0)R5; ja R5 ja R5' ovat kumpikin toisistaan riippumatta Cx-is-alkyyli tai bentsyyli, ja R6 on H tai Ci-10-alkyyli, ehdolla, että kun T on CH=CH tai CH2CH2, W on Wc ja Z on 15 CH2, niin merkitykset X3 on NH2 ja X2 on OH eivät ole samanaikaisesti; ehdolla, että kun T ei ole mikään, niin W ei ole Wc, ehdolla, että kun Z on CH2 ja W on Wa, niin T ei voi olla CH=CH, ja 20 ehdolla, että kun Z ei ole mikään ja W = Wc, niin T ei ole CH=CH, tunnettu siitä, että ; a) poistetaan suojaryhmä(t) yhdisteestä, jolla on •; ’* kaava : (RO) 2P (=0) TPg-W-Z-EMÄS, ;· 25 : *, jossa R on R5, R5' tai -CH (Rs)-O-C (O) R5, jolloin R5, R5' , R6, * · T, W ja Z ovat kuten edellä on määritelty, Pg on suojaryhmä t > » ja EMÄS on mahdollisesti substituoituna ryhmä ··:* 30 X2 *4 * » » N X3 N J N ,.. I I tai I y-N y

35 Xi - f ON * · ' » » 11353P 47 jolloin Xi, X2, X3 ja X4 ovat kuten edellä on määritelty, tai/ja haluttaessa b) hydrolysoidaan yhdiste, jolla on kaava 5 (R0)2P(=0)T-W-Z-EMÄS jossa R, T, W ja Z ovat kuten edellä on määritelty ja EMÄS on substituoimattomana edellä määritelty EMÄS, jolloin saadaan vastaava yhdiste, jolla on kaava 10 (HO) 2P(=0)T-W-Z-EMAS.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 15 kun W=WajaT=T", niin Z ei ole CH2OCH2; kun W = Wc tai Wd ja T = Τ', niin Z ei ole CH2OCH2; tai kun W = Wc tai Wd ja T = T", niin Z on CH2.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että W on Wa tai Wc.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että T on Τ' ja Τ' on CH=CH. : ,·. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että T on T" ja T" on CH2OCH2. , 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, » · 25 tunnettu siitä, että Z on CH2 tai CH20. • ·

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, * : tunnettu siitä, että valmistetaan E-9-(5-dihyd- • roksifosforyyli-3-metylideeni-4-pentenyyli)guaniini.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, -;· 30 tunnettu siitä, että valmistetaan E-9-[(4-dihydrok- ; 'sifosforyyli-2-metylideeni-3-butenyylioksi)metyyli]guanii-ni·

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ···1 tunnettu siitä, että valmistetaan 9-(3-dihydrok- ·’: 35 sifosforyylimetoksi-2-metylideenipropyyli) guaniini. • » 48 113535

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan Z-9-(4-dihyd- roksifosforyylimetoksi-2-butenyyli)guaniini.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että valmistetaan 9-(4-dihydroksi- fosforyylimetoksi-2-butynyyli)guaniini.

12. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 9-(3-dipivalo- yylimetoksifosfonyylimetoksi-2-metylideenipropyyli)guanii- 10 ni.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Xi on NH2 ja X2 on OH.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen 15 yhdiste.

15. Yhdiste, jolla on kaava (RO) 2P(=0)TPg-W-Z-EMÄS, 20 jossa R on R5, R5' tai -CH (R6) -O-C (O) R5, jolloin R5, Rs1, R6, T, W ja Z ovat kuten on määritelty patenttivaatimuksessa 1, • Pg on suojaryhmä ja EMÄS on mahdollisesti substituoituna ' · ’: ryhmä : : X2 X4 :· 25 , . n Nir% n\X3 Λ-J Xl N 0 N ' · : 30 1 jolloin Xx, X2, X3 ja X4 ovat kuten on määritelty patenttivaatimuksessa 1. , 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen yhdiste, 35 tunnettu siitä, että kun W = Wa ja T = T", niin Z ei ole CH2OCH2; 49 112539 kun W = Wc tai Wd ja T = Τ' , niin Z ei ole CH2OCH2; tai kun W = Wc tai Wd ja T = T", niin Z on CH2.

17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että W on Wa tai Wc.

18. Patenttivaatimuksen 15 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että T on T' joka on CH=CH, tai T on T", joka on CH2OCH2, ja/tai Z on CH2 tai CH20. * · ) » t • • · » ♦ 1 » 113539 50