FI111013B - Stabiileja purA-vektoreita ja niiden käyttö - Google Patents

Stabiileja purA-vektoreita ja niiden käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI111013B
FI111013B FI921940A FI921940A FI111013B FI 111013 B FI111013 B FI 111013B FI 921940 A FI921940 A FI 921940A FI 921940 A FI921940 A FI 921940A FI 111013 B FI111013 B FI 111013B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
pura
plasmid
gene
virus
vector
Prior art date
Application number
FI921940A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI921940A (fi
FI921940A0 (fi
Inventor
Robert Newton Brey Iii
Algis Anilionis
James Peter Fulginiti
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of FI921940A0 publication Critical patent/FI921940A0/fi
Publication of FI921940A publication Critical patent/FI921940A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI111013B publication Critical patent/FI111013B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)

Description

111013
Stabiileja purA-vektoreita ja niiden käyttö . Yhdysvaltain hallituksen tuki Tässä kuvattua työtä on osittain tuettu Yhdysval-v 5 tain terveysvirastolta saadulla apurahalla R43 AI 26995- 01. Hallituksella on määrättyjä oikeuksia keksintöön.
Keksinnön taustaa
Luonnossa esiintyvät plasmidit jaetaan jakautuville soluille siten, että tytärsolut saavat vähintään yhden ko-10 pion. Bakteeriplasmidijärjestelmät käyttävät erilaisia strategioita plasmidien oikean jakautumisen jälkeläisso-luille takaamiseksi. Plasmidien ylläpitäminen suurena kopiolukumääränä suurentaa todennäköisyyttä, että tytär-solut perivät vähintään yhden plasmidin satunnaisjakaan-15 tumisen avulla, niin että todennäköisyys, etteivät jälke-läissolut peri ollenkaan plasmideja, on äärimmäisen pieni. Vaikka satunnaisjakaantumisjärjestelmät voivat teoreettisesti toteuttaa plasmidien jakamisen jakautuville soluille, sellaisten plasmidien, joita ylläpidetään yhtenä ko-20 piona tai alhaisena kopiolukumääränä solua kohti, täytyy olla aktiivisten jakamismekanismien varassa. Esimerkiksi plasmidien, joita ylläpidetään alhaisena kopiolukumääränä tai yhtenä kopiona solua kohti kuten E. colin F-faktoria (incFl), plasmidiprofaagia P1 (incY) ja Rl ja NR1 (incF2), . 25 täytyy käyttää aktiivisia jakamisjärjestelmiä plasmidien säilyttämiseksi jakautuvien solujen populaatiossa, sillä plasmidin satunnais jakaantuminen ennustaisi menetysnopeut-ta 25 % sukupolvea kohti. Lisäksi jotkut korkeamman ko-pioluvun omaavat plasmidit ovat riippuvaisia paikkaspesi-30 fisten rekombinaasien suorittamasta multimeerien muodos-tuksen hajotuksesta, jotka multimeerit funktionaalisesti pienentävät plasmidien kopiolukumäärää soluissa ja kykyä jakautua summittaisesti vapaan diffuusion avulla.
On kuvattu useita aktiivisia jakamisjärjestelmiä 35 useita bakteeriplasmidiperheitä varten. Näillä järjes- 2 111013 telmillä on joitakin yhteisiä piirteitä. Plasmidien rep-likaatiotoiminnat voidaan tavallisesti järjestää selvästi erotettaville plasmidien alueille. Esimerkiksi Pl:n tai F:n plasmidireplikaatioalueet (rep) voidaan itsenäisesti 5 säilyttää soluissa. Kuitenkin miniF- tai miniPl-plasmi-dit, joilta puuttuvat jakamisalueet, ovat epästabiileja ja katoavat populaatiosta satunnaisjakautumisen perusteella ennustetuilla toistumistiheyksillä.
Plasmidivektorien kehittämistä vieraasta lajista 10 peräisin olevien geenien ilmentämiseksi bakteereissa kaupallisia tarkoituksia varten on laajasti dokumentoitu. Lukuisia kloonauskantajia, jotka perustuvat erilaisiin plasmidireplikoneihin, on kuvattu ja käytetty proteiinien tuottamiseen E. colissa ja muissa bakteereissa. Kehitet-15 täessä kloonauskantajia, jotka ovat sopivia vieraiden proteiinien ilmentämistä varten, on tavallinen strategia ollut suunnitella plasmideja, joilla on alhainen molekyy-lipaino ja suuri tai säädelty kopioluku. Nämä strategiat ovat joskus johtaneet sellaisten jakamisfunktioiden pois-20 tamiseen, jotka muuten johtaisivat stabiiliin plasmidin periytymiseen. Suuren kopioluvun omaavat kloonausvektorit tuotanto-organismien kokoonpanemista varten osoittavat usein segregaatioepästabiiliutta.
Tavallisin strategia stabiilin plasmidin replikaa-. 25 tion ja periytymisen aikaansaamiseksi isäntäpopulaatiossa fermentaatiossa on ollut lääkeresistenssideterminanttien sisällyttäminen kloonauskantajaan. Vaikka lääkkeiden lisääminen kasvualustaan mahdollistaa plasmidin sisältävien solujen valinnan, on antibioottien lisäämistä monissa ta-30 pauksissa mahdoton hyväksyä kustannusten ja lopputuotteen mahdollisen saastumisen vuoksi.
On kehitetty useita vaihtoehtoisia strategioita stabiilin plasmidin säilyttämisen aikaansaamiseksi fermen-taation aikana. Esimerkiksi on Rl:n parB-lokus subkloonat-35 tu moniin erilaisiin tavallisiin plasmidikloonausvektorei- 3 111013 hin. Tulokseksi saadut plasmidit, jotka sisälsivät Rl-parB-alueen, osoittivat suurentunutta stabiiliutta, kun . niitä viljeltiin ilman valintapainetta. Samoin voi F:n sop-alue stabiloida epästabiileja oriC-plasmideja, ja Pl-i 5 par voi stabiloida mini-F-plasmidin, jolta puuttuvat omat jakamisfunktiot. Tryptofaanioperonigeenejä sisältävien kloonausvektorien stabiiliutta suurennettiin lisäämällä pSC101:n par-lokus ja pl5a:sta saatu epästabiili moniko-pioinen vektori (pACYC184) stabiloitiin pSC101-par-lokuk-10 sen avulla. Muita jakamisalueita kuten Salmonella typhi-murium -virulenssiplasmidista saatua jakamisaluetta on myös käytetty menestyksellisesti kloonauskantajien stabilointiin.
Vaikka kloonauskantajia voidaan oleellisesti sta-15 biloida lisäämällä stabiileista plasmideista saatuja jakamisalueita, käytetään lääkeresistenssideterminantteja vielä yleisesti fermentaation aikana. Lääkeresistenssimerkki-geenit sopivat hyvin plasmidien panemiseen i säntäbak teeri-soluihin. Vaihtoehtoisesti plasmideja voidaan panna vas-20 taanottajabakteerisoluihin täydentämällä isännän kromoso- mimutaatioita plasmidissa olevien geenien avulla. Täyden-tämisjärjestelmät ovat riippuvaisia erityisten isännän kromosomimutaatioiden aikaansaamisesta, mutta niitä käyttämällä voidaan luotettavasti välttää antibioottien sisäl-25 lyttäminen viljelyaineeseen. Esimerkiksi ravitsemuspuut- teiden täydentäminen voi johtaa plasmidin stabiloitune. -seen. Salmonella typhimuriumissa olevan asparagiinise-mialdehydidehydrogenaasia (asd) koskevan kromosomimutaa-tion tai Bacillus subtilis -bakteerissa olevan D-alaniini-30 rasemaasin mutaation (dal), jotka kummatkin johtavat vial-lisen soluseinän biosynteesiin, täydentäminen tuottaa sta- biilin plasmidin periytymisen valinnan puuttuessa kaikissa viljelmän elinkykyisissä soluissa. Sekä asd- että dal-mu-taatiot voidaan korjata fenotyypin tasolla lisäämällä li-35 säravinteita. Toisaalta isännän oleellisen geenin täyden- 111013 4 täminen, jota puutosta ei voida voittaa ravinnon täydentämisen avulla, voi myös stabiloida plasmideja. Esimerkiksi E. coli -geeni ssb vaaditaan DNA:n replikaatiota ja solun elinkykyisyyttä varten, ja se estää plasmidittomien solu-5 jen kertymisen fermentaation aikana bioreaktorissa, kun se sisällytetään plasmidiin, ja sitä voidaan käyttää täydentämään kromosomaalinen ssb-puutos. Vastaavasti plasmidissa oleva valyyli-tRNA-syntetaasin kopio stabiloi plasmideja E. colissa, joka sisältää kromosomaalisen lämmönherkän va-10 lyyli-tRNA-syntetaasin. Plasmideja voidaan myös stabiloida sisällyttämällä niihin bakteriofaagirepressorigeeni, jonka menetys johtaa isännän profaagin induktioon ja solun kuolemaan .
Keksinnön tiivistelmä 15 On kehitetty stabiili plasmidi- tai bakteriofaagi- vektorijärjestelmä valintaa ja säilyttämistä varten sellaisille bakteereille, joita käytetään vieraasta lajista peräisin olevien geenien tuotteiden tuottamiseen fermen-taation aikana, tai käytettäväksi antigeenin tuotannon 20 segregaatiostabilointiin elävissä heikennetyissä bakteerirokotteissa. Tämä järjestelmä perustuu kromosomaalisen de-leetiomutaation täydentämiseen ilmentämällä funktionaalista geeniä adenylosukkinaattisyntetaasia varten (purA-geenin tuote).
25 Keksinnön kohteena on vektori, jolle on tunnus omaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään, sekä menetelmä vektorin sisältävän isäntäsolun valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 5 esitetään. Keksintö tarjoaa edelleen menetelmän rokotteen 30 valmistamiseksi, joka käsittää heikennetyn bakteerin joka ;· sisältää stabiilin vektorin, joka sisältää adenylosukki- naattisyntetaasin koodaavan heterologisen purA-geenin ja vähintään yhden muun geenin, joka koodaa heterologisen geenin tuotteen, mutta ei sisällä antibioottiresistenssideter-35 minanttia. Menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 6 esitetään. Lisäksi keksintö kohdistuu mene- 111013 5 telmään kiinnostuksen kohteena olevien bakteeritransfor-manttien valitsemiseksi ja ylläpitämiseksi käyttäen ei-antibioottivalintakeinoa, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 11 esitetään.
5 Voidaan käyttää kolmea menetelmää funktionaalisen purA-geenin tuotteen (adenylosukkinaattisyntetaasi) aikaansaamiseksi valintaa ja säilyttämistä varten. Ensimmäisen menetelmän mukaan alhaisen kopioluvun omaavaa plasmi-dia voidaan käyttää vektorina, josta purA-geenin ilmenty-10 minen on riittävää täydentämään kromosomaalinen purA-puutos ylikuormittamatta solua purA-proteiinituotteen yli-runsaudella. Toinen menetelmä on tarjota purA-geeni suuren kopioluvun omaavassa plasmidissa, josta se ilmentyy tehottomasti. Tämä voidaan aikaansaada käyttämällä mitä tahansa 15 monista eri menetelmistä, jotka tunnetaan alalla geenin ilmentymisen säätämiseksi vähemmäksi, mukaan lukien promoottorin tai ribosomiinsitoutumissekvenssien kohdennettu mutageneesi transkription tehokkuuden ja siten purA-geenin ilmentymisen vähentämiseksi. Kolmas menetelmä on tarjota 20 funktionaalinen purA-geeni integroituvassa vektorissa kuten plasmidissa tai bakteriofaagissa, joka ei kykene replikoituinaan vastaanottaaa-purÄ-isännässä, ja valitsemalla siten purA-vektorin integraatio.
Tämä järjestelmä tekee tarpeettomaksi valita bak-\ 25 teeritransformantteja antibioottiresistenssin avulla ja eläviin bakteerirokotevektoreihin sovellettaessa estää lääkeresistenssigeenien vapautuksen ympäristöön ja leviämisen muulle suolen flooralle tunnettujen geneettisten mekanismien avulla. Tämä keksintö on erityisen hyödyllinen 30 plasmidien tai integroituvien vektorien valinnassa ja säilyttämisessä elävissä heikennetyissä bakteerirokotekan-noissa, sekä kasvatuksessa ja rokotteen tuotannossa että antigeenintoimitusvaiheissa rokotetussa isännässä.
111013 6
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 esittää plasmidin pPX3001 kokoonpanemisen, joka plasmidi sisältää E. colin purÄ-qeenin lacZ-promoottorin säätelyn alaisena.
5 Kuvio 2 esittää plasmidin pPX3003 kokoonpanemisen, joka plasmidi sisältää E. colin purÄ-qeenin ja geenin, joka koodaa E. colin lämpöherkän enterotoksiinin (LT-B) si-toutumisalayksikön, IacZ-promoottorin säätelyn alaisena.
Kuvio 3 on graafinen esitys niiden S. dublin 10 SL5653 -solujen prosenttimäärästä, jotka omaavat purÄ- plasmidit selektiivisissä (ilman lisättyä adeniinia) ja ei-selektiivisissä olosuhteissa (adeniinia lisätty).
Kuvio 4A esittää SL5653/pPX3003:n viljelmistä, joita on kasvatettu adeniinia sisältävissä (+ad) tai ade-15 niiniä sisältämättömissä (-ad) elatusaineissa, saadun kokonais soluproteiinin SDS-pölyäkryyliamidigeeliä.
Kuvio 4B esittää western blot -analyysiä SL5653/pPX3003:n kokonaissoluproteiineista, joita on tutkittu vuohen anti-LT-B-antiseerumin avulla ja jotka on 20 tehty näkyviksi HRP:lla merkityn proteiini A:n avulla.
Kuvio 5 esittää kahden alhaisen kopioluvun omaavan plasmidivektorin kokoonpanemisen. Plasmidi pPX3005 sisältää koko LT-B:n koodaavan sekvenssin ja kanamysiiniresis-tenssideterminantin. Plasmidi pPX3006 sisältää purÄ-qeenin 25 IacZ-promoottorin säätelyn alaisena.
Kuvio 6 esittää kolmen sellaisen purA-plasmidi-vektorin kokoonpanemisen, jotka sisältävät LT-B:n koodaavan sekvenssin (pPX3010), malariaan liittyvää eläinitiötä ympäröivän (CS) proteiinin geenin (pPX3009) ja nukleoti-30 disekvenssin, joka koodaa LT-B/CS-fuusioproteiinin (pPX3007).
Kuvio 7 esittää tuloksia tutkimuksista, jotka koskevat Salmonella typhimurium -kantojen in vivo stabilointia purA-täydentämisen avulla. S. typhimurium otettu tal-35 teen A: pernoista, B: maksoista ja C: Peyerin laikuista.
111013 7
Kuvio 8 esittää tuloksia tutkimuksista, jotka koskevat S. typhi -kantojen in vivo stabilointia purÄ-täydentämisen avulla. S. typhi otettu talteen A: maksoista ja B: pernoista.
5 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Kuvataan stabiileja plasmidivektoreita purA-lokuk-sessa olevien kromosomaalisten deleetiomutaatioiden täydentämistä varten. Näitä vektoreita voidaan käyttää keinona valita klooneja, jotka omaavat ei-selektoitavia merkki-10 geenejä tai muita matkustajageenejä, kloonin kokoonpanemi-sen aikana. Tämän keksinnön mukaisia vektoreita voidaan myös käyttää näiden kloonien ylläpitämiseksi kasvatettaessa viljelmän laajentamista, rokotekannan tuottamista ja geenin tuotteen eristämistä varten.
15 Keksinnön mukaiset stabiilit purA-vektorit tarjoa vat funktionaalisen purÄ-qeenin, joka kykenee ilmentämään adenylosukkinaattisyntetaasia, korjaten minkä tahansa puutoksen puriinibiosynteesissä ja mahdollistaen kasvun. Sitä vastoin kannoilla, joissa on puutteellinen purA-qeeni, pu-20 riinivaatimukset voidaan tyydyttää ainoastaan lisäämällä ravintona solunulkopuolista adeniinia tai adenosiinia. Siten purA-vektorin omaavien solujen kasvatus elatusainees-sa, josta puuttuu adeniini, takaa plasmidivektorin jatkuvan valinnan ja säilyttämisen. Isännän purÄ-qeenin delee-25 tiot ovat edullisia, koska nämä mutaatiot eivät palaudu. Laajat deleetiot ovat edullisempia, koska nämä poistavat plasmidi-purA:n ja kromosomin välisen laajan homologian, joka voisi johtaa plasmidin integroitumiseen kromosomiin ja purÄ-qeenin pelastamiseen merkkigeenin avulla kaksois-30 tekijöiden vaihdunta (crossover) -tapahtumassa sekä samal-. '* la ilmennetyn matkustajageenin menetykseen. Vieraslajises- ta bakteerilähteestä peräisin olevan täydentävän purA-geenin käyttö vähentää näiden mahdollisten epäsuotavien homologisten rekombinaatio -tapahtumien esiintymistiheyt-35 tä.
111013 8 Tämä järjestelmä perustuu kromosomaalisen delee-tiomutaation täydentämiseen ilmentämällä funktionaalista geeniä adenylosukkinaattisyntetaasia (purA-qeenin tuote) varten. purA-lokus on erityisen tärkeä elävän heikennetyn 5 Salmonellan ja vastaavien ohutsuoleen liittyvien rokotteiden vektorien suunnittelussa, koska purA-mutaatjoiden läsnäolo kromosomissa johtaa virulenssin heikkenemiseen. In vivo purA:n läsnäolo sellaisessa plasmidi- tai bakterio-faagivektorissa, joka myös koodaa vähintään yhden polypep-10 tidi-immunogeenin ilmentymisen, estää organismien, joilta puuttuu immunogeenin ilmentäminen, esiintymisen rokotetussa isännässä. Yhdistettynä muiden heikentävien lokusten kanssa kuten sellaisten, jotka määräävät auksotrofiavaati-muksia aromaattisten yhdisteiden suhteen, purA johtaa vi-15 rulenssin lisäheikkenemiseen. Näiden geenien kromosomaali-nen deleetio johtaa vähentyneeseen kykyyn replikoitua isännässä, mikä johtuu vapaiden puriinien (kuten adeniinin tai adenosiinin) tai vitamiiniedeltäjien (kuten fooliha-pon) , jotka ovat riippuvaisia aromaattisten yhdisteiden 20 biosynteesistä, saatavuuden puutteesta. Siten Salmonella typhimurjumit, joissa on deleetiomutaatioita sekä aroA:ssa että purA:ssa, ovat tehottomia bakteeria vastaan suunnatun merkittävän immuunivasteen aiheuttamisessa, kun taas bakteerit, joissa on ainoastaan puutoksia aromaattisten yh-. 25 disteiden biosynteesin geeneissä (kuten aroA), ovat tehok kaita immuunivasteiden aiheuttamisessa. Vaikka aroÄ-mutaatioita omaavat Salmonellat kykenevät replikoimaan rajoitetussa määrin solunsisäisesti, sellaiset, jotka sisältävät lisäksi purÄ-mutaation, ovat täysin kyvyttömiä rep-30 likoimaan isännässä. Tarjottaessa plasmidissa sijaitseva ·· E. colin purA-tuote aro-purÄ-isäntäbakteerille, on täyden netyllä rokotteella täysin samat in vivo kasvuominaisuudet kuin Aro-mutantilla.
Tässä kuvataan useita yleisiä menetelmiä ilmentä-35 misen valintaa ja stabilointia varten käyttäen alhaisen kopioluvun omaavia plasmidikantajia, suuren kopioluvun 111013 9 omaavia plasmidikantajia ja vektoreita, jotka mahdollistavat yhden ainoan kopion kromosomiin intintegroitumisen tapausten talteenoton. Alhaisen kopioluvun omaavien vektorien tapauksessa purA- kromosomaalisten puutosten täydentä-5 minen voi tarjota lisästabiiliutta plasmideille, jotka sisältävät myös funktionaalisia jakamislokuksia.
Tämän keksinnön mukaisten suuren kopioluvun omaavien vektorien tapauksessa purA-qeenille edullisesti tuotetaan mutaatio geenin tuotteen ilmentymisen tehokkuuden vähentämi-10 seksi, jotta siten estettäisiin kasvun estyminen adenylosukkinaattisyntetaasi (purA) -entsyymin ylirunsau-den haitallisten vaikutusten johdosta.
purA-plasmidivektorien rakentaminen purÄ-plasmidien rakentamisessa käytettiin rekombi-15 nantti-DNA-teknologiaa. Rekombinanttitekniikkoihin sisältyy spesifisten DNA-sekvenssien liittäminen DNA-kantajaan (vektori) sellaisen yhdistelmä-DNA-molekyylin muodostamiseksi, joka kykenee replikoitumaan isäntäsolussa. Liitetty DNA-sekvenssi voi olla vastaanottavalle DNA-kantajalle 20 vieras, s. o. liitetty DNA-sekvenssi ja DNA-vektori ovat peräisin organismeista, jotka eivät vaihda geneettistä informaatiota luonnossa, tai liitetty DNA-sekvenssi voi olla kokonaan tai osaksi synteettisesti valmistettu. On kehitetty useita yleisiä menetelmiä, jotka mahdollistavat yh-*. 25 distelmä-DNA-molekyylien rakentamisen.
Riippumatta menetelmästä, jota käytetään rakentamiseen, yhdistelmä-DNA-molekyylin täytyy sopia yhteen isäntäsolun kanssa, s.o. kyetä autonomisesti replikoitumaan isäntäsolussa tai stabiilisti integroitua yhteen tai 30 useampaan isäntäsolun kromosomeista tai plasmideista. Yh- « distelmä-DNA-molekyylissä pitäisi edullisesti myös olla merkkifunktio, joka mahdollistaa halutun yhdistelmä-DNA-molekyyli(e)n valinnan. Lisäksi jos kaikki asianmukaiset replikaatio-, transkriptio- ja translaatiosignaalit jär-35 jestetään oikein rekombinanttivektoriin, vieras geeni ilmentyy oikein esim. transformoiduissa bakteerisoluissa 111013 10 bakteeri-ilmentämisplasmidien tapauksessa tai sallivissa solulinjoissa tai isännissä, jotka on infektoitu rekombi-nanttiviruksella tai jotka omaavat rekombinanttiplasmidin, jossa on sopiva replikaation aloituskohta.
5 Erilaiset geneettiset signaalit ja käsittelytapah tumat kontrolloivat geenin ilmentämistasoja kuten DNA:n transkriptiota ja lähetti-RNA:n (mRNA) translaatiota. DNA:n transkriptio on riippuvaista promoottorin läsnäolosta, joka on DNA-sekvenssi, joka ohjaa RNA-polymeraasin si-10 toutumisen ja sillä tavoin edistää mRNA:n synteesiä. Euka-ryoottipromoottorien DNA-sekvenssit eroavat prokaryootti-promoottorien sekvensseistä. Lisäksi eukaryoottipromoot-toreita ja niiden myötä seuraavia geneettisiä signaaleja ei ehkä tunnisteta tai ne eivät ehkä toimi prokaryootti-15 järjestelmässä, ja lisäksi prokaryoottipromoottoreita ei tunnisteta eivätkä ne toimi eukaryoottisoluissa.
Samoin mRNA:n translaatio prokaryooteissa on riippuvaista oikeiden prokaryoottisignaalien läsnäolosta, jotka signaalit eroavat eukaryoottien signaaleista. mRNA:n 20 tehokas translaatio prokaryooteissa vaatii ribosominsitou-tumiskohdan, jota kutsutaan Shine-Dalgarno (S/D)-sekvenssiksi (J. Shine ja L. Dalgarno, Nature 254 (1975) 34 -38), mRNA:ssa. Tämä sekvenssi on lyhyt mRNA:n nukleotidise-kvenssi, jonka sijainti on ennen aloituskodonia, tavalli-\ 25 sesti AUG, joka koodaa proteiinin aminoterminaalisen (for- myyli-) metioniinin. S/D-sekvenssit ovat komplementaarisia 16S rRNA:n (ribosomi-RNA) 3'-päälle ja edistävät luultavasti mRNA:n sitoutumista ribosomeihin muodostamalla dup-leksin rRNA:n kanssa ribosomin oikean asennon mahdollista-30 miseksi.
.. Kloonatun geenin onnistunut ilmentäminen vaatii riittävää DNA:n transkriptiota, mRNA:n translaatiota ja joissakin tapauksissa proteiinin translaation jälkeistä muuntamista. Ilmentämisvektoreita on käytetty geenien il-35 mentämiseen aktiivisen promoottorin säätelyn alaisena sopivassa isännässä ja proteiinin tuotannon lisäämiseen.
111013 11
Voidaan käyttää erilaisia sääteleviä ilmentä-miselementtejä, jotka ovat mitä tahansa monista sopivista bakteereissa aktiivisista transkriptio- ja translaatioele-menteistä. Esimerkiksi promoottoreita, joita voidaan käyt-5 tää rekombinanttigeenisekvenssin ilmentämisen ohjaamiseen, ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta E. colin lak-toosioperonin promoottori, hybridi trp-lac UV-5 promoottori (tae) (H. DeBoer et ai., teoksessa Promoter Structure and Function, (1982); R.L. Rodriguez ja M.J. 10 Chamberlain, toimittajat, Praeger Publishing, New York), bakteriofaagi lambdan vasemmanpuoleinen (PL) ja oikeanpuoleinen (PR) promoottori, bakteriofaagi T7:n promoottorit, trp-operonin promoottori, lpp-promoottori (E. coli lipoproteiinigeenin promoottori, K. Nakamura ja I. Inouye, 15 Cell 18 (1979) 1109 - 1117) jne. Muita promoottoreita, jotka on tuotettu rekombinantti-DNA- tai synteesitekniik-kojen avulla, voidaan myös käyttää liitettyjen sekvenssien transkription aikaansaamiseksi.
Erityisiä aloitussignaaleja vaaditaan myös liitet-20 tyjen proteiinin koodaavien sekvenssien tehokasta translaatiota varten. Näitä signaaleja ovat ATG-aloituskodoni ja vierussekvenssit. Sellaisissa tapauksissa, joissa alkuperäiset geenisekvenssit, jotka koodaavat oman aloitusko-doninsa ja vierussekvenssinsä, liitetään sopiviin ilmentä-25 misvektoreihin, lisätranslaationsäätelysignaaleja ei ehkä tarvita. Kuitenkin tapauksissa, joissa alkuperäiset trans-laatiosignaalit eivät ole läsnä, täytyy tarjota eksogeeni-siä translaationsäätelysignaaleja mukaan lukien ATG-aloituskodoni. Aloituskodonin täytyy lisäksi olla proteii-30 nin koodaavien sekvenssien kanssa lukuvaiheistuksessa koko insertin translaation takaamiseksi. Nämä eksogeeniset translaationsäätelysignaalit ja aloituskodonit voivat olla alkuperältään monenlaisia, sekä luonnon että synteettisiä.
Menetelmiä sopivien ilmentämisvektorien rakentami-35 seksi voivat olla in vitro rekombinantti-DNA- ja syn- 111013 12 teesi-tekniikat ja in vivo -rekombinaatiot (geneettinen rekombinaatio) .
Katsauksia geenin ilmentämisen maksimoimisesta löytyy julkaisuista Roberts ja Lauer, Meth. Enzymol. 68 5 (1979) 473 ja W. Reznikoff ja M. Gold, Maximizing Gene Ex pression, Plenum Press, New York (1986).
Cohenille ja Boyerille kuuluvassa US-patentissa 4 237 224 kuvataan rekombinanttiplasmidien tuottaminen käyttäen menetelmiä, joissa pilkotaan restriktioentsyy-10 meillä ja yhdistetään DNA-ligaasin avulla käyttäen tunnettuja ligaatiomenetelmiä. Nämä rekombinanttiplasmidit viedään sitten sisään transformaation avulla ja replikoidaan yksisoluisten viljelmissä, mukaan lukien prokaryoottior-ganismeja ja eukaryoottisoluja, joita kasvatetaan kudos-15 viljelmässä.
Toisen menetelmän rekombinantti-DNA-molekyylien viemiseksi yksisoluisiin organismeihin ovat kuvanneet Collins ja Hohn US-patentissa 4 304 863. Tässä menetelmässä käytetään pakkaus/transduktiojärjestelmää bakteriofaagi-20 vektorien (kosmideja) avulla.
Ilmentämisvektori, joka sisältää rekombinantti-geenisekvenssin, pitäisi sitten siirtää bakteeri-isäntä-soluun, jossa se voi replikoitua ja ilmentyä tai tulla ehdollisesti replikoiduksi. Tämä voidaan suorittaa käyttäen 25 mitä tahansa monista alalla tunnetuista menetelmistä mukaan lukien, mutta mainittuihin rajoittumatta, transformaatio (esim. eristetyn plasmidi-DNA:n transformaatio heikennettyyn bakteeri-isäntään) , faagitransduktio (Schmei-ger, Mol. Gen. Genetics 119 (1972) 75), baktee- 30 ri-isäntälajien välinen konjugaatio, elektroporaatio jne.
·; Ilmentäminen heikennetyissä tunkeutuvissa baktee reissa Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa purA-geenin sisältävä ilmentämisvektori siirretään heikennet-35 tyyn tunkeutuvaan bakteeriin, jossa se ilmentyy, tuottaen 111013 13 siten bakteerikanta, joka sopii käytettäväksi elävänä rokotteena.
Mitä tahansa monista erilaisista heikennetyistä tunkeutuvista bakteereista voidaan käyttää kantajana re-5 kombinanttigeeni(e)n ilmentämiseksi, niin että vieraalta lajilta peräisin oleva antigeeni tulee tehokkaasti tarjotuksi isännän immuunijärjestelmälle, tämän keksinnön mukaisissa rokotevalmisteissa. Bakteerit säilyttävät tunkeu-tumisominaisuutensa, mutta menettävät suurelta osin viru-10 lentit ominaisuutensa, niin että niiden on mahdollista lisääntyä isännässä rajoitetussa määrin muttei riittävästi aiheuttaakseen merkittävän taudin tai häiriön. Esimerkkejä tunkeutuvista bakteereista, joita heikennetyissä muodoissa voidaan käyttää keksinnön mukaisesti valmistetuissa roko-15 tevalmisteissa, ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Salmonella-lajit, tunkeutuva E. coli (EIEC) ja Shigel-la-lajit. Edullisessa suoritusmuodossa käytetään tunkeutuvia bakteereja, jotka oleskelevat imukudoksissa kuten pernassa (esim. Salmonella-lajeja) . Tällaiset bakteerit voi-20 vat tunkeutua suolen epiteelikudokseen ja/tai Peyerin laikkuihin, levitä koko retikuloendoteelijärjestelmään ja päästä suolilieveimukudokseen, maksaan ja pernaan, jossa ne lisääntyvät tai ainakin säilyvät elossa jonkin aikaa ja aiheuttavat humoraalisen ja soluvälitteisen immuniteetin.
\ 25 Heikennettyjä tunkeutuvia bakteereja voidaan ai kaansaada monien menetelmien avulla mukaan lukien, mutta mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kemiallinen mutage-neesi, geneettinen lisäys, deleetio (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laborato-30 ry, Cold Spring Harbor, New York) tai rekombinantti-DNA-j·· metodologia (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A La boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), laboratoriossa suoritettu luonnollisten mutaatioiden valinta jne. Menetelmiä sellaisten 35 heikennettyjen Salmonella-kantojen aikaansaamiseksi, jotka ovat palautumattomia ei-virulentteja auksotrofisiä mutant- 111013 14 teja ja sopivat käytettäviksi elävinä rokotteina, on kuvattu US-patenteissa 4 550 081 (julkaistu 29. lokakuuta 1985), 4 735 801 (julkaistu 5. huhtikuuta 1988) ja 4 837 151 (julkaistu 6. kesäkuuta 1989), joiden opetukset 5 liitetään tähän viitteenä kokonaisuudessaan. Luotettava menetelmä Salmonellan heikentämisen suorittamiseksi on myös kuvattu (S.K. Hoiseth ja B.A.D. Stocker, Nature 291 (1981) 238; B.A.D. Stocker et ai., Develop. Biol. Standard 53 (1982) 47) ja sitä voidaan käyttää eräässä tämän kek- 10 sinnön erityisessä suoritusmuodossa.
Heikennettyjä Salmonella-lajeja, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisesti valmistetuissa elävä rokote -valmisteissa, ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, taulukossa 1 alla luetellut lajit.
15 Taulukko 1
Salmonella-lajeja, joita heikennetyissä muodoissa voidaan käyttää tässä kuvatuissa rokotevalmisteissa*
S. typhi S. typhimurium 20 S. paratyphi A
S. paratyphi B S. enteritidis (esim. serotyyppi dublin) 25 * Täydellinen kuvaus Salmonella-serotyypeistä löytyy teok- . sesta Edward ja Ewing, 1986, Classification of the Entero- bacteriaceae, 4. painos, Elsevier, N.Y.
Erityisissä suoritusmuodoissa voidaan käyttää Sal-30 monella-bakteereja, jotka on heikennetty aromaattisten yh-disteiden biosynteesin geeni(e)n (aro) kromosomaalisen de-leetion avulla tai qalE-qeeniin aiheutetun mutaation avulla tai jotka ovat Cya-, Crp- tai joilta puuttuu Vir-plasmidi, jne. Äro-mutantteja, joita voidaan käyttää, 35 ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, S. typhi -kannat 543Ty ja 541Ty, käytettäviksi ihmisten rokotteis- 111013 15 sa, ja S. typhimurium SL3261 ja SL1479 ja S. enteriditis serotyyppi dublin SL1438 (siitä käytetään myös nimeä S. dublin) käytettäviksi eläimillä. (Katso US-patentista 4 550 081 kuvaus S. typhimurium -kannoista kuten 543Ty ja 5 541Ty, jotka ovat avirulentteja ihmisissä, koska ne on heikennetty geeneihin aroA ja/tai purA vaikuttavan delee-tion avulla (M.M. Levine et ai., J. Clin. Invest. 79 (1987) 888). S. dublinin mutantteja kuten SL1438 ja S. typhimuriumin kuten SL3261 voidaan käyttää eläinmallisys-10 teemien kehittämisessä, sillä nämä lajit kykenevät aiheuttamaan lavantautia vastaavia eläinsairauksia. qalE-mutantteja, joita voidaan käyttää, ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Salmonella typhi -kannat Ty21a (Germanier, Bacteria Vaccines, Academic Press, NY, s. 15 137 - 165), Salmonella typhimurium G30D jne.
Geenintuotteiden ilmentäminen ja käyttö Tässä esitetään edelleen menetelmiä homologisten ja/tai vieraslajisten geenien yhden ainoan tai monen kopion viemiseksi sisään, valitsemiseksi ja ylläpitämiseksi 20 joko alhaisen kopioluvun omaavissa plasmideissa, suuren kopioluvun omaavissa plasmideissa tai integroituneena isäntäbakteerin kromosomiin yhtenä ainoana tai monena kopiona .
Ilmennettävät geenit voivat olla peräisin euka-25 ryoottilähteistä ja voivat koodata tautia aiheuttavista loisista peräisin olevia antigeenideterminantteja, ihmisen immunoaktiivisia peptidejä ja proteiineja, hormoneja, kasvutekijöitä, allergeenejä, kasvaimiin liittyviä antigeenejä ja muita proteiineja. Sellaiset geenit voivat olla pe-30 räisin viruslähteistä ja voivat koodata antigeenisiä proteiineja, rakennekomponentteja tai entsyymejä, jotka liittyvät viruksen replikaatioon tai kiinnittymiseen. Homologisia geenejä samoin kuin myös vieraalta lajilta peräisin olevia geenejä voidaan saada bakteeri-, virus-, lois-, 35 sieni- tai nisäkäslähteistä, ja ne voivat olla geenejä, jotka koodaavat tautia aiheuttavien organismien virulens- 111013 16 sitekijöitä mukaan lukien toksiineja, suojaavia immuno-geenisiä proteiineja, tai geenejä, jotka koodaavat antigeenisen polysakkaridiaineen säätelyyn tai synteesiin liittyviä proteiineja, ja lisäksi voivat olla isäntäbak-5 teerille vieraita entsyymejä.
Kiinnostavia bakteeriantigeenejä ovat sellaiset, jotka liittyvät ihmisen bakteeritaudinaiheuttajiin mukaan lukien Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meninqiditis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus py-10 oqenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Co-rynebacterium diphtheriae, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhea, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae ja Clostridium tetani. Esimerkkejä erityisistä kiinnostavista 15 bakteeriantigeeneistä ovat bakteeriproteiinit, joista erityisen hyödyllisiä esimerkkejä ovat ulkokalvoproteiinit (esim. lajeilta Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis tai Neisseria meninqiditis), bakteeritoksiinit (esim. pertussistoksiinit, difteriatoksiini, tetanustok-20 siini ja Pseudomonas- eksotoksiini A) ja bakteeripintapro-teiinit (esim. flagelliinit, hemagglutiniinit ja M-proteiini lajilta Streptococcus pyogenes) .
Tautia aiheuttavilta viruksilta peräisin olevia virusantigeeneja ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittu-, 25 matta, ihmisen immuunipuutosvirus (tyypit I ja II), ihmi sen T-soluleukemiavirus (tyypit I, II ja III), respiratory syncytial virus, hepatiitti A, hepatiitti B, hepatiitti C, ei-A- ja ei-B-hepatiittivirukset, herpes simplex-virus (tyypit I ja II), sytomegalovirus, influenssavirus, pa-30 rainfluenssavirus, poliovirus, rotavirus, koronavirus, vi-*«: hurirokkovirus, tuhkarokkovirus, vesirokkovirus, Epstein
Barrin virus, adenovirus, papilloomavirus ja keltakuumevirus .
Muutamia erityisiä näiden tautia aiheuttavien vi-35 rusten virusantigeenejä ovat respiratory syncytial viruksen (RSV) F-proteiini (erityisesti antigeenit, jotka si- 111013 17 sältavät F-peptidin 283 - 315, jonka ovat kuvanneet WO89/02935:ssä, joka on otsikoitu "Respiratory Syncytial Virus: Vaccines and Diagnostic Assays", Paradiso, P. et al.) ja N- ja G-proteiinit, rotaviruksen VP4 (aikaisemmin 5 tunnettu nimellä VP3), VP6 ja VP7-polypeptidit, ihmisen immuunipuutosviruksen kuoriglykoproteiinit ja hepatiitti B:n pinta- ja esipinta-antigeenit ja herpes-glykoprote-iinit B ja D.
Sieniantigeenejä, joita voidaan käyttää, ovat sel-10 laisilta sieniltä peräisin olevat, joihin kuuluu, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Candida-lajeja (erityisesti albicans), Cryptococcus-laieja (erityisesti neofor-mans), Blastomyces-lajeja (esim. dermatitidis), Histoplas-ma-lajeja (erityisesti capsulatum), Coccidioides-lajeja 15 (erityisesti immitis), Paracoccidioides-lajeja (erityisesti brasiliensis) ja Aspergillus-lajeja. Esimerkkejä lois-antigeeneistä ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Plasmodium-laj it, Eimeria-lajit, Schistosoma-lajit, Try-panosoma-laj it, Babesia-lajit, Leishmania-laj it, Crypto-20 sporidia-laiit, Toxoplasma-lajit ja Pneumocystis-lajit.
Kiinnostavia ovat myös erilaiset antigeenit, jotka liittyvät autoimmuunisairauksiin kuten nivelreumaan ja pu-nahukkaan, kasvainantigeenit, syöpäantigeenit ja sellaisten geenien ainoat ja useat kopiot, jotka koodaavat hor-*. 25 moneja, bioaktiivisia peptidejä, sytokiinejä, lymfokiinejä ja kasvutekijöitä, samoin kuin myös prokaryootti- tai eu-karyoottialkuperää olevia entsyymejä ja rakenneproteiine-ja, erityisesti käytettäväksi rokotteissa tai hoitoaineissa .
30 Uusien rokotevalmisteiden aikaansaamiseksi geene- :«* jä, jotka koodaavat suojaavia antigeenejä, voidaan viedä heikennettyihin bakteereihin, jotka toimivat toimitusväli-kappaleina immuunivasteiden stimuloimiseksi sitä taudinaiheuttajaa vastaan, josta ilmennetty geeni on peräisin. 35 Katso Dougan ja Tite, Seminars in Virology 1:29 (1990).
Geenejä, jotka koodaavat tautia aiheuttavista bakteeri-, 1Π013 18 virus- tai loislähteistä peräisin olevia antigeenejä, voidaan viedä heikennettyyn Salmonella typhiin ihmisillä elä- vinä rokotteina käyttöä varten, suojaamaan esimerkiksi lavantaudilta, ripulisairauksilta ja sukupuolitaudeilta mu-5 kaan lukien AIDS. Vaihtoehtoisesti tällaisia geenejä voidaan viedä muihin Salmonella-lajeihin, jotka kykenevät infektoimaan eläinlajeja, esim. lajiin S. dublin elävinä heikennettyinä karjan rokotteina käyttöä varten (esim. nautojen kuljetushalvausta tai naudan rotavirusta vas-10 taan), lajiin S. choleraesuis elävinä heikennettyinä rokotteina sioilla käyttöä varten ja lajiin S. gallinarum tai S. pullorum elävinä heikennettyinä rokotteina siipikarjalla käyttöä varten. Erityisessä suoritusmuodossa Ei-meria-loisilta peräisin olevia antigeenejä voidaan panna 15 heikennettyyn S. gallinarumiin oraalisen rokotteen aikaansaamiseksi itiöloissairautta varten.
Vaihtoehtoisesti antigeenejä koodaavia geenejä voidaan viedä muihin bakteereihin, joita käytetään elävinä rokotteentoimitusvälineinä. Esimerkkejä sellaisista voivat 20 olla suoleen tunkeutuvat Escherichia coli, Yersinia ente-rocolitica, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Campylobacter jejuni ja Vibrio cholerae.
Lisäksi tällaisia geenejä voidaan viedä bakteeri-isäntiin antigeenimateriaalin tehokkaan tuotannon aikaan-25 saamiseksi rokotteen tuottamista varten. Bakteeritaudinai-heuttajilta peräisin olevien alkuperäisten tai mutaation avulla muutettujen geenien ilmentäminen voi johtaa lisääntyneeseen ja tehokkaaseen antigeenin tuotantoon. Esimerkiksi geenejä, jotka koodaavat mutaation avulla muutettuja 30 toksiineja, geenejä, jotka koodaavat virulenssitekijöitä ·; tai muita alkuperäisiä proteiineja tai mutaation avulla muutettuja suojaavia immunogeenejä, voidaan viedä homologisiin tai vieraslajisiin bakteerikantoihin. Monissa tapauksissa virulenssitekijöitä tai suojaavia antigeenejä voi-35 daan tuottaa tehokkaasti ainoastaan määrätyssä isäntäbak-teerissa. Lisäksi monimutkaisiin biosynteesiteihin, jotka 111013 19 johtavat bakteerinpintapolysakkaridin tai kapselin tuotantoon, liittyviä tuotteita koodaavia geenejä ei voida helposti kloonata eikä ilmentää muissa bakteereissa anti-geenimateriaalin tuottamiseksi rokotteena käyttöä varten, 5 Esimerkki tällaisesta käytöstä on Bordetella pertussis -bakteerin mutaation avulla muutettuja ristireagoivia toksiineja koodaavien geenien vieminen organismeihin, joilta puuttuu toksiini, hinkuyskärokotteen tuottamiseksi.
Bakteereja, joissa on tämän keksinnön mukaisia 10 stabiileja purA-plasmideja, voidaan käyttää elävinä rokotteina immunogeenin vastaisen immuunivasteen synnyttämiseksi lämminverisessä eläimessä. Menetelmässä annetaan elävää rokotetta eläimelle, niin että rokotevalmisteen sisältämä bakteeri voi ilmentää immunogeeniä immunologisesti tehok-15 kaana annoksena, joka kykenee synnyttämään immuunivasteen. Rokotteet ovat hyödyllisiä mikrobi-infektioiden estämistä varten. Rokotteet voidaan antaa farmakologisesti hyväksyttävässä kantajassa kuten fysiologisessa suolaliuoksessa tai etanolipolyoleissa (kuten glyserolissa tai propeeni-20 glykolissa).
Rokotteita voidaan antaa ihmiselle tai eläimelle monilla eri tavoilla. Näitä ovat antaminen ihon sisään, ihon läpi, lihakseen, vatsaonteloon, laskimoon, ihon alle, suun kautta ja nenän sisään. Tällaisessa rokotteessa käy-\ 25 tettävä elävien heikennettyjen bakteerien määrä vaihtelee ilmennetyn antigeenin identiteetistä riippuen. Tunnettujen annostusalueiden tarkistus ja sovittaminen kuuluu alan ammattimiesten taitoihin. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat elävät rokotteet on tarkoitettu käytettäviksi se-30 kä epäkypsien että täysikasvuisten lämminveristen eläinten *«; ja erityisesti ihmisten hoidossa.
Rokotusmenetelmät vaativat tyypillisesti antigeenin antamisen viikkoja tai kuukausia kestävän ajan kuluessa "suojaavan" immuunivasteen stimuloimiseksi. Suojaava 35 immuunivaste on immuunivaste, joka riittää suojaamaan im-munoidun organismin määrätyn taudinaiheuttajan tai taudin- 111013 20 aiheuttajien, joita vastaan rokote on suunnattu, tuotteliaalta infektiolta.
Keksintöä valaistaan lisäksi seuraavien esimerkkien avulla, joita ei tulisi tulkita keksinnön piiriä ra-5 joittaviksi:
Esimerkkejä
Materiaalit ja menetelmät Bakteerikannat ja plasmidit
Bakteerikannat ja plasmidit on kuvattu alla taulu- 10 kossa 2.
Taulukko 2
Kannat, joita on käytetty stabiilien ilmentämis-plasmidien kehittämisessä Salmonella-rokotekantoi a varten 15 Lajin/kannan nimitys Genotyyppi
Escherichia coli
JM103 supE thi A(lac-proAB)hsdR4/F'ltraDproAB+Iadll IacZmIS
2 g TX595 purAr.mudlac T1, (ampr) TX595 . XPB100 pur A·. ;mudlac Ή- (ampr) XPB100 (cmr)
Salmonella “lajeja S. typhimurium
25 SL5495 zbj'908::Tnl0 purAtASB
SL3261 hisGAG aroAOEL407 SL3261 pur hisG46 aroAOEL407 CRR[zbj-908::Tn10]Tcs purAäl55 S. dublin 30 SL5653 $VA47aroM148 CRR(zbj-908::Tnl0]TcspurAA155 ♦ · S. typhi CDC10-80 villi tyyppi 679Ty eroADEL148
35 BB1333 aroAOELUS aroDAS
BB1354 aro/4DEL148 aroDA9 CRRlzbj^OSaTnlOlTc5 purAA155 111013 21
Elatusaineet ja bakteerien kasvatus
Bakteereja kasvatettiin M9-elatusaineessa, johon oli lisätty 0,5 % casaminohappoja, 0,2 % glukoosia, 0,02 % MgS04.7H20, 5 pg/ml tiamiinia, 1 mM natriumsitraattia, 5 5 pg/ml nikotiinihappoa, 30 pg/ml kutakin aminohapoista fenyylialaniini, tyrosiini ja tryptofaani, 10 pg/ml 2,3-dihydroksibentsoehappoa, 10 pg/ml para-aminobentsoe-happoa ja 1 pg/ml adeniinia. Maljat sisälsivät 15 g agaria litraa kohti. Ampisilliiniä lisättiin pitoisuudeksi 10 100 pg/ml.
Geneettinen transformaatio ja transduktio
Plasmideja vietiin suoraan Salmonellaan elektropo-raation avulla käyttäen BTX Transfector 100 -laitetta 0,5 mm:n elektrodin kanssa ja kentänvoimakkuutta 15 kV/cm. 15 Plasmidirakennelmia, jotka olivat tuloksena syn teettisten oligonukelotidien yhdistämisestä ligaation avulla plasmideihin, lisättiin Escherichia colin tavallisiin laboratoriokantoihin transformaation avulla (katso yksityiskohtia teoksesta Maniatis et ai., Molecular 20 Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)). Plasmidirakennelmia eristettiin ja karakterisoitiin ensin E. colissa ennen siirtämistä Salmonella-lajeihin, koska E. coli K-12:n transformaatiofrekvenssit ovat suuria verrattuna 25 S. typhimuriumilla esiintyviin. Plasmideja siirrettiin S. typhimurium LT-2 LB501Q -kantaan, joka on restriktiokiel-teinen (mutta modifiointipätevä) Salmonella typhimuriumin kolmen restriktiojärjestelmän suhteen ja sisältää myös mutaation galE:ssä, mikä johtaa suurempiin transformaa-30 tiofrekvensseihin (katso Salmonella typhimuriumin rest-riktiojärjestelmien kuvaus julkaisusta Bullas et ai., J. Bacteriol. 141 (1980) 275).
Plasmideja lisättiin sitten heikennettyyn Salmonellaan transduktiotekniikkojen avulla. LB5010, joka si-35 sälsi halutun plasmidin, kasvatettiin Luria-liemessä (LB) 111013 22 tiheyteen 3 x 108 solua/ml, jona ajankohtana D-galaktoosia (lopulliseksi pitoisuudeksi 1 %) lisättiin viljelyainee-seen "sileän" lipopolysakkaridin (LPS) synteesin indusoi-miseksi. Sen jälkeen kun oli kasvatettu 1,5 tuntia 5 D galaktoosin läsnä ollessa, bakteriofaagia P22 HT 105/1 int lisättiin viljelmään infektion kerrannaisuudeksi yksi. Faagin imeytymisen jälkeen solut immobilisoitiin LB elatusaineessa, joka sisälsi 0,7 % agaria. Faageja koottiin ja käytettiin plasmidien viemiseen transduktion 10 avulla sisälle heikennettyyn P22-herkkään Salmonellaan.
Sähkösiirtomenetelmiä antigeenin osoittamista varten
Vieraalta lajilta peräisin olevan rekombinantti-proteiinin synteesi osoitettiin E. coli ja Salmonella-ro-15 kotekantaisäntäsoluissa siirtämällä (transblotting) pro-teiininäytteitä, jotka oli eroteltu polyakryyliamidigee-lielektroforeesin avulla, nitroselluloosakalvoille, suojaamalla 1,5 % Tween-20:llä fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), mitä seurasi vasta-aineen sitoutu-20 minen 0,1 % Tween-20:ssä. Sitoutunut vasta-aine todettiin piparjuuriperoksidaasilla merkityn proteiini A:n avulla (Kirkegaard ja Perry, Gaithersburg, MD). LT-B-antigeenin osoittamista varten primaarinen vasta-aine oli vuohen α-LT-B- polyklonaalinen reagenssi, joka oli osittain puh-25 distettu eluoimalla sitoutunut aine Sepharose 4B proteiini c A -affiniteettipylväästä.
Restriktioentsyymianalyysi DNA:n vaakasuora geelielektroforeesi suoritettiin käyttäen yleisiä menetelmiä (Maniatis et ai., "Molecular 30 Cloning", Cold Spring Harbor, NY). Restriktioentsyymejä hankittiin toiminimiltä Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) ja New England Biolabs Inc. (Beverly, MA).
In vitro -stabiiliustestejä
Plasmideja sisältävien kantojen stabiiliustestejä 35 suoritettiin käyttäen yli yön kasvatetuista viljelmistä 23 mo 13 tehtyjä 1:1 OOO-laimennoksia M9-elatusaineessa, johon oli tehty yllä kuvatun mukaiset lisäykset. Laimennoksista tehtiin kaksi rinnakkaista levyviljelmää selektiiviselle ja ei-selektiiviselle kasvualustalle plasmidin pysymisen mää-5 rittämiseksi. Lisäksi ei-selektiivisten maljojen kolonioista tehtiin jäljennöksiä käyttäen FMC RepliPlate -laitetta (Rockland, ME) selektiivisille maljoille plasmidin pysymisen varmistamiseksi.
Hiirten immunointi 10 Istutteita kasvatettiin M9-elatusaineessa, johon oli tehty yllä kuvatun mukaiset lisäykset, tiheydeksi 3 x 108 organismia/ml määritettynä Klett-Sommerson-kolorimet-rin avulla. Soluja pelletoitiin nopeudella 5 000 kierrosta minuutissa 15 minuutin ajan 4 °C:ssa ja ne uudelleensus-15 pendoitiin 1,5 % (paino/tilavuus) natriumbikarbonaattiin tiheydeksi 2 x 1010 organismia/ml (Klett 100) mahalaukun sisään (i.g.) istuttamista varten ja fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen, Ph 7,2, tiheydeksi 1 x 107 organismia/ml laskimoon (i.v.) ja vatsaontelon sisään (i.p.) is-20 tuttamista varten. Kuuden viikon ikäisiä naaraspuolisia BALB/c-hiiriä käytettiin rutiininomaisesti (Jackson Laboratories). Ravinto ja vesi pidettiin pois 4 tunnin ajan ennen mahalaukun sisään istuttamista ja palautettiin 30 minuuttia istuttamisen jälkeen. 1 x 1010 organismia/ml 25 (0,5 ml istutetta) annettiin mahalaukun sisään käyttäen
Perfektum-intubaationeulaa (18G x 2"). 1 x 106 organismia/ml (0,1 ml) käytettiin laskimoon ja vatsaontelon sisään istuttamiseen.
Näytteiden kokoaminen 30 Hiiriä tapettiin eri ajankohtina istuttamisen jäl- .. keen. Maksa, perna ja 3 Peyerin laikkua poistettiin kulta kin eläimeltä, pantiin yksittäisiin steriileihin pusseihin ja homogenoitiin 30 sekunnin ajan Stomacher malli 80 -se-koittimen avulla (A.J. Seward, Lontoo) käyttäen 5 ml PBS 35 (pH 7,2) kutakin maksanäytettä varten ja 2 ml kutakin perna- ja Peyerin laikku -näytettä varten.
111013 24
Bakteerikolonisaatio ja plasmidien stabiilius
Elinhomogenaateista tehtiin levyviljelmiä selektiiviselle ja ei-selektiiviselle M9-kasvualustalle, johon oli tehty yllä kuvatun mukaiset lisäykset, plasmidien pysymi-5 sen määrittämiseksi. Ei-selektiivisillä maljoilla kasvaneista kolonioista tehtiin jäljennöksiä SS-agarille (Dif-co, Detroit, Michigan) ja selektiivisille maljoille plas-midin sisältävien kolonioiden prosenttimäärän varmistamiseksi .
10 Tulokset purA-auksotrofian täydentäminen E. colissa ja Salmonellassa purA-geenin tuote adenylosukkinaattisyntetaasi (EC-6.3.4.4) katalysoi adenylosukkinaatin synteesiä ino-15 siinimonofosfaatista (IMP). Tämä entsyymi katalysoi ensimmäistä erityisvaihetta adeniinimonofosfaatin (AMP) synteesissä ja liittyy myös talteenotto ja hyväksikäyttö (salvage) -teihin ja nukleotidien välisiin muuntumisiin. E. colin ja muiden läheisesti samankaltaisten suolibakteerien 20 mutantit, joilta puuttuu adenylosukkinaattisyntetaasin rakennegeeni (purA), ovat kasvaakseen riippuvaisia ravintona tarjotusta eksogeenisestä adeniinista tai adenosii-nista.
E. coli purA -geeni sisältyy 3,2 kiloemäsparin . 25 Kpnl-restriktioentsyymifragmenttiin plasmidissa pJS76 (Wolfe, S.A. ja J.M. Smith, "Nucleotide sequence and analysis of the purA gene encoding adenylosuccinate synthetase of Escherichia coli K12”, J. Biol. Chem. 263 (1988) 19147 - 19153). Sellaisten plasmidien kokoonpane-30 miseksi, jotka täydentävät joko E. colin tai Salmonellan purA-auksotrofjoita, plasmidia pJS76 (saatu John M. Smithiltä, Seattle Biomedical Research Institute) käytettiin E. colin purA-geenin tuotteen lähteenä. Aluksi purA-geeni liitettiin pUC19:ään yhdistämällä ligaation 35 avulla tasapäinen 1,75 kiloemäsparin Accl-fragmentti 111013 25 pUC19:n Dral - Smal-fragmentin kanssa kuten on esitetty kaavamisesti kuviossa 1. Plasmidi pPX3001 saatiin talteen E. coli TX595:ssä valitsemalla adeniinista riippumattomia kolonioita. Tässä alkurakennelmassa pPX3001 oli oleelli-, 5 sesti jäljellä pUC-lähtövektorin replikaation aloituskoh ta, ja siinä oli β-laktamaasigeeni korvattu purA:lla säilyttäen samalla useita hyödyllisiä kloonauskohtia plas-midin lisämuuntamista varten. Tämä plasmidi täydensi tehokkaasti purA-geenipuutoksen E. coli TX595:ssä ja johti 10 pUC-plasmidien suuren kopioluvun omaavan plasmidin feno-tyyppiominaisuuteen.
Plasmidi pPX3001 modifioitiin lisäksi sisältämään lisänä oleva ilmennetty geenituote. Enterotoksiinia synnyttävän E. colin labiilin toksiinin (LT-B) myrkyttömän 15 alayksikön geeni, joka oli 600 emäsparin tasapäisessä EcoRI-HindIII:ssa, kloonattiin pPX3001:teen käyttäen tasapäistä BamHI-kohtaa, kuten on esitetty kuviossa 2. Tämä plasmidirakennelma pPX3003 saatiin talteen transformoimalla E. coli TX595 ja valitsemalla adeniinista riippumatto-20 mia klooneja, jotka ilmensivät proteiinia, jonka polyklo-naaliset anti-LT-B-vasta-aineet tunnistivat kolonioiden blot-analyysissä.
purA-vektorin stabiiliuden tutkimiseksi plasmidi pPX3001 ja johdannainen LT-B:n ilmentämisplasmidi pPX3003 . 25 transformoitiin S. dublin SL5653:een tai S. typhimurium BB1231:teen, jotka ovat purA-geenissä deleetiomutaatioita omaavia Salmonella-rokotekantojen johdannaisia. Salmonel-la-transformanttej a tutkittiin odotettujen plasmidien läsnäolon suhteen DNA-analyysin avulla ja pPX3003:n ta-30 pauksessa LT-B:n ilmentämisen suhteen. Kunkin kannan sopi-.. via isolaatteja tutkittiin plasmidin säilyttämisen suhteen sen jälken kun oli tehty alaviljelmiä in vitro selektiivisissä ja ei-selektiivisissä olosuhteissa. Kuten on osoitettu kuviossa 3, plasmideja sisältäviä kolonioita kasva-35 tettiin aluksi selektiivisissä olosuhteissa, esim. määri- 111013 26 tellyssä elatusaineessa, josta puuttui adeniini, yön yli kasvatettavissa viljelmissä. Yön yli kasvatettujen viljelmien näytteitä pestiin ja laimennettiin tuoreeseen elatus-aineeseen, johon joko oli tai ei ollut lisätty adeniinia.
5 Kun oli kasvatettu 10 sukupolven ajan, viljelmiä siirrettiin samanlaiseen tuoreeseen elatusaineeseen. Kunkin 10 sukupolven kasvun jälkeen viljelmistä otettiin näytteitä, laimennettiin ja tehtiin levyviljelmiä joko selektiiviselle tai ei-selektiiviselle agarkasvualustalle. Niiden kolo-10 nioiden osuus, jotka kykenivät kasvamaan lisäystä sisältämättömällä kasvualustalla, edustaa sitä viljelmäpopulaa-tion osaa, joka sisältää purA-täydennys- plasmidin. Ela-tusaineessa, johon lisäystä ei ole suoritettu, 100 % kolonioista sisältää purA-täydennysplasmideja, kun sen sijaan 15 ainoastaan pieni prosenttimäärä kolonioista, jotka ovat tuloksena alaviljelmien teosta käyttäen adeniinilisäystä (ei-selektiiviset olosuhteet), sisältää plasmideja 40 sukupolven pituisen kasvatuksen jälkeen. Lisäksi SL5653:n, joka sisältää LT-B-ilmentämisplasmidin pPX3003, viljel-20 missä LT-B:n ilmentäminen ja antigeenisyys säilyy viljelmässä, jota kasvatetaan selektiiviissä olosuhteissa, mutta katoaa ei-selektiivisissä olosuhteissa. 40 sukupolven jälkeen jokainen selektiivisissä olosuhteissa kasvatetusta pPX3003/SL5653:sta, saaduista kolonioista, joka nousee , 25 selektiiviselle agarille, ilmentää LT-B:tä, mikä osoittaa, ( ettei ole tapahtunut purA:n ja LT-B:n ilmentämisen segregaatiota. (Katso taulukko 3 ja kuvio 4).
111013 27 O ö O B O O - O e „ _ o s o s o en o 0 o s S § *-· « *-· 0) ^ ^ 0) ^ 0) *3
•H
o
•H
S O Q o _ o o 3 o ort oh 0¾ o _ o
Q ° H Tf M't t-« to H H H
• Ai
OJ
CO f3 *—« M 0) rt
m > > O O O O O
*J -h HC OO OH O IQ Ot-" O « J-J- '+J o tn H IO H N H 00 H H H VO rt 0) 3 H O. “3 C » see 3 H o tn :rt Ai w ^ SH , r) ^ 3 H Sh :rt o co :rt co _ __ _ _ _ _ o -m
;crt (0 O O Ό O O O O Ci H
S H rt S 3 o on o ;} OO O vO OO Ö 0) >^α) Π'Η UN H \© H G H H H "*r r-< t-h 0) rt H ·!-) 0) rt rt S ·Η •H H ' Ό rt > ^ :rt ·Η H 3 co ^ :¾ cc > g a) rt ^ :rt co m Ai _ _ _ _ _ _ :rt@
Sm h 2 o O O O 00 Bo ON O 00 h-h •HC0 ι-t H m H lO H H H Q\ H 'n* (1)0) h Η *n 3 en h il
5 -h w -H B
co > 0) > 0 rt -H I <u · h-h rt -H _ rtrt 6 rt rt ,c Cl. Cl CX d· d rv „ ·η CO w cJ rt ' p» JT et t* ft r* 4) Φ 41 H ·» ns ss li li il ss 1¾ «s 2 » £2 +· +' + ' + ? + » a
Si Srt a o» ^ rt I « > •rt rt !rt o .
•i-i «rt - - ·(“) ;rt rt C rt H H H fO fO rt "" 2 s § s a s | s‘| S3 ^ 3 3 a a a S:§ rt co en tn tn tn to g rt 0 *H o ϋ
0 > -H H H
•H ö mk o :rt (rt Ή a) (0 2 V <U f* 5¾ 00 n S ä γη» 3 3 t? £ A b li 53 ^S' & ¥ ϊ ί ί 3» CH rtr?6 6 6 3 9 H rt • «οι 0 -h <| < < d, ex -° ^ ö 5 .m rt O *H :rt
g e -H CO
M H »
rt ^ .S
rt m rt o *rt •h V *h ti :rt co > w
irt co *h rt S
o) co t) (>J rt rt
rt o) Ή rJ
3 :rt 3 0 ,°9 h 00 “ |S
aw *iS UkUU 3^ W rM CÖ cd ö Hv Hv
•HO) rt h iJWJP
A! -ri “ft Pi,(XDuCl, ·£ 3 «3 .
w > 3 m . -h rt m 2 ^ •H rt s .s t > 1 O S S g 3%
H 0 rt 00 O VO Q Q to M
3 rt rt E e* /s 'Τ' JT> H H-h O (u P-t Ph · >rt rt o, ex, et, a, a - 111013 28 Nämä tulokset osoittavat, että ilmennetty purA-geeni, joka on suuren kopioluvun omaavassa pUC-plasmidis-sa, toimii plasmideja stabiloivana eksogeenisen adeniini-lisäyksen puuttuessa. Vaikka purA-täydennys stabiloi LT-B-5 ilmentämisplasmidin in vitro, nimenomaiset plasmidit pPX3001 ja pPX3003 eivät todennäköisesti ole optimaalisen hyödyllisiä elävässä Salmonella-rokotteessa, sillä purA:n ja/tai LT-B:n ilmennyksen yhdistelmä sinänsä yllä olevassa konfiguraatiossa jarruttaa isäntä-Salmonellan kasvunopeut-10 ta. Määritellyssä suolaelatusaineessa (M9), joka sisältää casaminohappoja, pPX3001/SL5653:n ja pPX3003/SL5653:n kah-dentumisaika oli 1 tunti, kun taas SL5653:n, jota kasvatettiin samassa elatusaineessa, johon oli lisätty adenii-nia, kahdentumisaika oli noin 30 minuuttia. Vaikka kasvu-15 nopeuden pienentyminen johtaisi bakteerien lisäheikentymi- seen suun kautta syöttämisen jälkeen, on myös todennäköistä, että vähentynyt kyky aikaansaada ohimenevä infektio isäntäeläimessä johtaisi vähentyneeseen immunogeenisyy-teen. Siten vaikka plasmidit stabiloidaan kromosomaalisen 20 purA-deleetion täydentämisen avulla, ehdokasantigeenin liiallinen ilmentyminen heikentää rokotekantaa liikaa.
On tunnettua, että suuren kopioluvun omaavat pUC-vektoriplasmidit ovat stabiileja E. coli ja Salmonella-kannoissa. pUC-plasmidien purA-johdannaisten havaittu 25 epästabiilius johtuu luultavasti suurten määrien purA-geenin tuotetta (joka näkyy 40 kilodaltonin proteiinina SDS-PAGE:ssa) ilmentymisestä. Tämän keksinnön mukaisilla vektoreilla vältetään tämä purA-geenin haitallinen yli-il-mentyminen yhdellä kahdesta menetelmästä: ensimmäiseksi 30 käyttämällä alhaisen kopioluvun omaavia plasmideja purA-geenin kopioluvun ja siten sen ilmentymisen vähentämisek-si; ja toiseksi käyttämällä suuren kopioluvun omaavia plasmideja, joissa on tehottomasti ilmentyvä purA-geeni.
111013 29
Alhaisen kopioluvun omaavia ilmentämisplasmideja ja integroituneita ilmennettyjä geenejä
Yllä olevat tulokset viittaavat siihen, että geenin ilmentämisen, joka on vartavasten suunniteltu olemaan vai-5 kuttamatta elävän Salmonella-rokotekannan in vivo kas- vuominaisuuksiin, yhdessä geneettisen stabiiliuden kanssa tulisi tuottaa maksimaalisen immunogeeninen rokotekokoon-pano. Geenin ilmentymisen sopivat tasot voivat luontaisesti liittyä ilmennetyn antigeenin ominaisuuksiin samoin 10 kuin myös taso, jolla se ilmentyy Salmonella-rokotekan-nassa. Muutamia tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa baktee-ri-isäntäkannan sietokykyyn antigeenin ilmentymistä kohtaan, ovat antigeenin solunsisäinen sijainti, ilmentymis-taso ja antigeenin stabiilius proteolyyttisen muokkauksen 15 suhteen. Joihinkin näistä tekijöistä voivat puolestaan vaikuttaa transkriptio- ja translaatiosignaalit kuten promoottorin voimakkuus, ribosomien hankinnan tehokkuus ja geenin kopioluku.
Sellaisen tilanteen aikaansaamiseksi, jossa LT-B:n 20 ilmentyminen oli stabiloitu purA-täydentämisen avulla ja vartavasten suunniteltu olemaan vaikuttamatta Salmonella-rokotekannan kasvuun, tutkittiin geenin kopioluvun vaikutusta Salmonella-isännän avulla tapahtuvaan LT-B:n ilmentämiseen ja sietokykyyn sitä kohtaan. Tätä tutkittiin muu-. 25 tamissa olosuhteissa, yksissä, joissa lac-promoottorin kontrolloima LT-B ilmentyi alhaisen kopioluvun omaavasta plasmidivektorista, ja toisissa, joissa LT-B ilmentyi yhtenä ainoana kromosomaalisena kopiona.
Alhaisen kopioluvun omaavan LT-B-ilmentämisplasmi-30 din rakentamiseksi plasmidia pGD103 (R.A. Deich et ai., J. Bacteriol. 170 (1988) 489 - 498) pilkottiin EcoRI:llä ja Hindi:11a ja EcoRI-RsaI-DNA-fragmentti, joka sisälsi koko LT-B:n koodaavan sekvenssin, kloonattiin vektoriin, jolloin saatiin pPX3005, LT-B:tä ilmentävä plasmidi, joka 35 myös sisältää kanamysiiniresistenssideterminantin (katso 111013 30 kuvio 5). Plasmidi pPX3005 transformoitiin elektroporaa-tion avulla S. typhimurium SL3261:teen. pPX3005:n omaavan SL3261:n kasvua verrattiin SL3261:teen, joka sisälsi läh-töplasmidin, ja varsinaiseen SL3261:teen. M9-elatusainees-5 sa, joka sisälsi 0,5 % casaminohappoja, ei huomattu eroa kasvunopeudessa kolmen kannan kesken, joiden jokaisen kah-dentumisaika oli suunnilleen 45 minuuttia. Tämä tulos viittaa siihen, että LT-B:n ilmentymistaso ei tässä kokoonpanossa vaikuta isäntä-SL3261:n kasvuominaisuuksiin. 10 Kromosomiin integroitunut LT-B saatiin seuraavalla tavalla: Plasmidia, joka sisälsi 31 emäksen käänteisen toiston, joka oli peräisin Tnl0:n ääripäistä, ja TnlO:n ilmennetyn transposonigeenin käänteistoistosekvenssien ulkopuolella sijaitsevan tac-promoottorin säätelyn alai-15 sena, käytettiin sellaisen transposonin aikaansaamiseen, joka ilmensi LT-B:tä. 800 emäsparin Haell-restriktioent-syymifragmentti, jossa oli lac-promoottorialue ja raken-negeeni LT-B:tä varten, kloonattiin transposonivektoriin, joka sisälsi myös kanamysiiniresistenssideterminantin. 20 Tässä kokoonpanossa LT-B:n ja kanamysiiniresistenssin geenejä reunustivat käänteiset toistosekvenssit. Itsemur-havektorin aikaansaamiseksi Salmonella-kannoissa käyttöä varten LT-B:n ja kanamysiinin omaava transposoni risteytettiin Λ gtll-johdannaiseen siten, että aikaansaatiin , 25 hybridifaagihiukkanen, joka omasi LT-B-transposonin ja
TnlO-transposaasin. Tämä tekniikka on selitetty yksityiskohtaisesti US-patenttihakemuksessa 07/590 364, joka on jätetty 28. syyskuuta 1990 ja jonka opetukset sisällytetään tähän viitteenä, ja se on samankaltainen kuin modi-30 fioidut transposonit, joita ovat kuvanneet Herrero et ai., J. Bacteriol. 172 (1990) 6537 - 6567. Modifioidulla LT-B-transposonin omaavalla Λ-faagilla infektoitiin Salmonella LB5010/F112, jolla on ilmennetty A-faagin reseptori. Koska A-faagin DNA ei replikoidu Salmonellassa, kanamysiinire-35 sistenssin perusteella valitut kloonit ovat tuloksena mo- 111013 31 difioidun transposonin siirtymisestä transpositiona kromosomiin. Saatiin useita itsenäisiä isolaatteja; kaikki il->. mensivät LT-B-antigeeniä. Useita S. typhimurium LB5010 - isolaatteja säilytettiin ja niillä lisättyjä P22-faagily-5 saatte ja käytettiin kromosomissa sijaitsevan ilmentämiska-setin siirtämiseen transduktion avulla SaLmonella-rokote-kantaan SL3261. Kahden itsenäisen kromosomiin integroituneen SL3261-LT-B:n, jotka olivat tuloksena transduktiosta kahdesta erillisestä alleelista ja sijaitsivat eri lokuk-10 sissa Salmonella-kromosomissa, havaittiin olevan stabiileja in vitro ja in vivo.
Alhaisen kopioluvun omaavan purA-vektorin kokoon-paneminen
Plasmidi pGD103 modifioitiin sisältämään E. coli 15 -purA-geenin ja useita ainoina esiintyviä kloonauskohtia. pJS76:n 1,7 kiloemäsparin Accl-fragmentti liitettiin in-sertiksi pGD103:n XmnI-, Xhol-kohtiin, jolloin saatiin pPX3006. (Katso kuvio 5). Tässä plasmidissa kanamysiini-resistenssideterminantti oli kokonaan korvattu purArlla 20 aikaansaaden vektori, jossa oli ainoina esiintyvät kohdat BamHI, Smal, PstI ja Sali.
PL-promoottori-ilmentämiskasetteja sisältävä alhaisen kopioluvun omaava purA-vektori
Plasmidia pPX3006 käytettiin vektorina useiden , 25 sellaisten alhaisen kopioluvun omaavien plasmidien ra kentamiseen, jotka ilmensivät geenintuotteita vahvan A-PL-promoottorin säätelyn alaisena. Otaksutaan, että eräitä geenintuotteita, joiden transkriptiota säätelee Pl-promoottori, tuotetaan isäntäbakteerisolussa suurina mää-30 rinä verrattuna geeneihin, jotka ovat heikompien promoottorien kuten lac-promoottorin säätelyn alaisina. Lisäksi koska tiedetään, että Salmonella-kannat eivät ole lyso-geenisiä bakteriofaagille A, plasmidiin sisältyvien PL:n edistämien proteiinien ilmentäminen on konstitutiivista. 35 Yhdessä purA:n täydentämisen aikaansaaman stabiloinnin 111013 32 kanssa tällaiset kokoonpanot voittavat mahdollisesti geenin ilmentymisen alhaiset tasot, jotka liittyvät vektori-plasmidin pPX3006 alhaiseen kopiolukuun, ja lisäävät elävien heikennettyjen rekombinantti-Salmonella-kantojen im-5 munogeenisyyttä.
Plasmodium berghei -eläinitiötä ympäröivän proteiinin (CS) geenin useita versioita stabiloitiin pPX3006:ssa. CS-geenin on osoitettu olevan yksi malariaan liittyvän eläinitiön kalvon tärkeimmistä immunogeeneistä, 10 ja sellaisena se on ehdokas suunniteltaessa alayksikön käyttöä malariarokotteessa. Useiden CS-geenien rakenne on selvitetty paljastaen, että kaikilla on samankaltainen yleisrakenne. Kunkin ainoa silmiinpistävä piirre on, että ne sisältävät keskeisen toistuvan peptidin, joka käsittää 15 kolmasosaan saakka proteiinista. Toistoalueet ovat immu- nodominantteja, sillä pääosa eläinitiön vastaisista vasta-aineista on suunnattu näitä alueita vastaan. Vaikka toistoalueiden vastaisten vasta-aineiden on osoitettu osallistuvan suojaukseen malarian eläinitiövaihetta vastaan, vas-20 ta-aineet yksin eivät riitä aikaansaamaan suojausta eläin-itiöinfektiota vastaan. On todennäköistä, että suojaus malarialoisten eläinitiövaihetta vastaan ei käsitä ainoastaan humoraalista immuunivastetta, vaan myös vahvan T-so-luvasteen. Todennäköisimmin vaaditaan suojausta varten , 25 sellaisten sytotoksisten T-imusolujen aktivointi, jotka tunnistavat CS-proteiinin osia ja muita kehittyvän eläin-itiön proteiineja eläinitiön infektoimien maksasolujen pinnalla. Siten rokotteiden suunnittelu stimuloimaan noita vasteita spesifisesti tai yhdessä humoraalisten vasteiden 30 kanssa on välttämätöntä tehokkaissa malariarokotteissa. o, Soluvälitteisen immuniteetin stimulointi sytotoksisten T-solujen tasolla voidaan aikaansaada toimittamalla antigeenit antigeenin esittäville soluille sellaisella tavalla, että ne todennäköisesti käsitellään sisäisen käsitte-35 lytien avulla. Antigeenien esittäminen sisäisten teiden 111013 33 kautta voi edullisesti johtaa antigeenin ilmentymiseen pinnassa luokan I rajoitetun MHC:n yhteydessä, joka taval-► lisesti liittyy CD8± sytotoksisten T-solujen stimuloin tiin. P. berghein ja P. falciparumin CS-proteiinin ilmen-5 täminen heikennetyssä Salmonellassa ja sen jälkeen oraalinen immunointi on johtanut sellaisten spesifisten CD+ sytotoksisten T-solujen induktioon, jotka tunnistavat näiden CS-proteiinien peptidejä. Lisäksi hiirten oraalinen immunointi P. berghei -CS-proteiinirakennelmilla johti merkitit) tävään suojaukseen eläinitiöärsykettä vastaan, jollainen tavallisesti aikaansaadaan vain rokottamalla eläimiä gam-masäteillä inaktivoiduilla eläinitiöillä.
Vaikka suojaus eläinitiöhaastetta vastaan on dokumentoitu käytettäessä rokottamista CS-proteiinia ilmentä-15 väliä Salmonellalla, oli suojaus epätäydellinen, mikä viittaa siihen, että immuniteetin riittävää induktiota ei ollut tapahtunut. Lisäksi tämä viitta siihen, että tekijöitä, jotka liittyvät CS-proteiinin ilmentämiseen heikennetyssä Salmonella-rokotekannassa, voitaisiin manipuloida 20 immunogeenisyyden suurentamiseksi. Tällaisia tekijöitä ovat, kuten yllä on mainittu, geeninsäätelysignaalit, jotka ilmeisesti vaikuttavat proteiinin ilmentymistasoon, ilmennetyn proteiinin stabiilius ja ilmennetyn proteiinin geneettinen stabiilius. Jos heikennetyn Salmonellan ai- , 25 heuttaman ohimenevän infektion aikana merkittävä osa immu- * noivista bakteereista kadottaa plasmidin segregaation johdosta, tehokasta immunointia ei tapahdu.
CS-proteiinirakennelmien stabiloinnin purA:n täydentämisen avulla arvioimiseksi täysipitkä CS-proteiinira-30 kennelma liitettiin pPX3006:n BamHI-kohtaan. Tämä raken-^ nelma sisältää PL-promoottorin avulla ilmentyvän P. berg- , hei (ANKA) -CS-proteiinigeenin koko koodavan sekvenssin ja sille annettiin nimitys pPX3009 (kuvio 6). Toinen rakennelma, joka sisälsi typistetyn CS-proteiinin (pPX1601), 35 joka ilmentyi P1-promoottorin avulla fuusioproteiinina 111013 34 LT-B:n ensimmäisen 30 aminohapon kanssa, liitettiin pPX3006:n BamHI-kohtaan. Tämä rakennelma sisältää LT-B-fuusioproteiinin CS-proteiinin sellaisen ilmennetyn osan kanssa, josta puuttuu 60 aminopäätteen aminohappoa ja 30 5 karboksipäätteen. aminohappoa. Tälle rakennelmalle annettiin nimitys pPX3007 (kuvio 6). Kummatkin raknnelmat transformoitiin S. typhimurium BB1231:teen (ΔpurA) valitsemalla puriinista riippumattomuuden perusteella. Kun ilmentämistä verrattiin niiden samankaltaisiin suuremman 10 kopioluvun omaaviin lähtöplasmideihin (saatu pBR322:sta), ei havaittu eroa ilmentymistasoissa SL3261:ssä, mikä viittaa siihen, että geenin ilmentyminen ei ollut kytkeytynyt geenin kopiolukuun.
Kolmas promoottorin kontrolloima ilmentämiskasetti 15 tutkittiin purA-täydentämisen avulla stabiloinnin suhteen.
LT-B:n koodaava sekvenssi (590 emäsparin EcoRI - Hindlll-fragmentissa, joka oli tehty tasapäiseksi Klenow-entsyymin toiminnan avulla) liitettiin pPL/\:n (Pharmacia Molecular Biologicals, Piscataway, NJ) Hpal-kohtaan, jolloin saatiin 20 pPX1602. LT-B:n koodaava sekvenssi, joka sijaitsi nyt 1,7 kiloemäsparin BamHI-fragmentissa, liitettiin pPX3006:n BamHI-kohtaan, jolloin saatiin pPX3010 (kuvio 6). Tämä plasmidi transformoitiin BB1231:teen. LT-B-antigeenin ilmentymistä verrattiin Salmonellan kasvukierroksen eri koh-, 25 dissa ja verrattiin geenin intergoituneiden muotojen, suu ren kopioluvun omaavien plasmidimuotojen ja alhaisen kopioluvun omaavien plasmidimuotojen kesken. Maksimaalinen geenin ilmentyminen havaittiin bakteerien yli yön kasvatetuissa viljelmissä. Ilmentyrnistaso liittyi geenin kopiolu-30 kuun, kun LT-B:n ilmentymistä kontrolloi lac-promoottori. Ilmentyminen oli runsainta viljelmissä, jotka sisälsivät pPX100:n, ja seuraavalla sijalla oli pPX3005; vähiten ilmentymistä havaittiin SL3261/\3:n viljelmissä. Kuitenkin LT-B:n ilmentyminen pPX3010:stä ylitti sen, joka havait-35 tiin pPX100:n viljelmissä, mikä osoittaa, että vahva 111013 35 PL-promoottori oli voittanut geenin kopioluvun vaikutukset LT-B-antigeenin ilmentymiseen.
Alhaisen kopioluvun omaavien ja kromosomiin integroituneiden ilmentämiskasettien stabiilius in vitro 5 S. typhimurium SL3261 -kantoja, jotka sisälsivät ilmentämiskasetteja pBR322-, pUC- tai pSCIOI-johdannaisissa, verrattiin stabiiliuden suhteen kasvatettaessa ilman valintaa. Kuten taulukosta 3 nähdään, pUC-vektoriplasmidit tai pUC-plasmideihin perustuvat ilmentämisplasmidit olivat 10 huomattavan epästabiileja viljeltäessä in vitro ilman am-pisilliinivalintaa. Lisäksi pBR322:sta, joka ilmensi typistettyä P. berghei -CS/LT-B-fuusioproteiinia (kuvattu yllä), saatu plasmidi (pPXlöOl) osoitti merkittävää häviämistä alaviljelmistä ampisilliinin puuttuessa.
15 Kun mikä tahansa näistä ilmentämiskaseteista kloo nattiin joko pGD103:een tai sen purA-johdannaiseen (pPX3006), havaittiin ilmentämisplasmidien 100 % pysyminen 80 sukupolven verran. Tämä tulos osoittaa, että pSCIOI:teen perustuvat plasmidit ovat luonnostaan stabii-20 leja S. typhimurjumissa. Lisäksi että E. colin purA-geeni korvaa tehokkaasti lääkeresistenssideterminantit, jotka tavallisesti liittyvät kloonausplasmideihin. (Katso taulukko 4). 1 9 β » 111013 36 oo oo oo oo oo oo ~ oo oo oo oo oo oo d 00 f1 1-« r-< r-< t-< t—< rH r-< t—< 0)
TJ
Ή o d oo oo oo oo oo oo o oo oo oo oo oo oo H O t—< I—1 f—< H i—< r-1 I—I r-ι r-< r-t r-« r-f p O <f e rt
•H P P W
g 0) H CO
:S H > OOOOOOOOOOOO H
p > H OOOOOOOOOOOO “3 p :aj :cd OO r-< r-< r—it—< t—· r—· Η-< ri t—i t—« rH r-· >i CO +-1 a n 2^ H CO H rt £ ^
•Η Ή '.rt ,5 3 -O
;cd CO ' Μ !!β 3 2 1-1 (Λ ·Η Η Ρ CG _ _ Βω > ' en :rt en ΟΟ ΟΟ ΟΟ ΟΟ ΟΟ ΟΟ Ή « c ·Η !Κ 3 Ο ΟΟ ΟΟ ΟΟ ΟΟ ΟΟ ΟΟ rt Η
0)·Η aJp-UCM Ht—« Η t—ι t—« rH H H H t-< r- f1 HP
•H P -r-j H rt M ‘3 T3 ,ώ 1 a) -M > E crt ho u μ b ή g g rH h ö ti ω mu ’>7h cd co coco OO OO OO OO OO OO H <u
H I edo O OO OO OO OO OO OO H
r—IM t—1 r-« r-< r-1 r-H i—« r-1f—· H 1"« r-< >H
W <L> Pn Cl _ ,
•H 3 E
g rt p p ’ :cd o ω cd ω +j i <υ .cd pj :cd cd p co ·« 0) co p ,C _ _ . "i sm e 3 e e g e a> οι οι v a> «j
H ·Η Ή !0 ÖJ (rt Ό ^ <rl Ό Ύί Tl TJ TJ
3 f> >θ+1 + 1 ' + ·+ '+ 1+ J h oj 1h rM co ♦H -H 4J > :cd ^ i 5 3 3 3 ^ :2
p CU :cd 2 2 2 3 P
p—( iH -P cd M·· Ot M« ’ 1 P
:cd ai pj p h r-ι h r-1 h H P :rt co co :rt Ρ Ό Ό Ό 'Q 'O Ό 30 •H co rt IM (M (M (M (M (M H :rt cort h λ; en en en ro ro en cp es (Λ en en to tn to ^ £
CO -H C MM
Μ M ω , _ _ _ rt 3 ω v) cd rt ex g ω f) i-π en rt H tö Cä CQ(Q PQrtrt rt £ P ? H rt <Λ H S3
> u PC H tJ M U »J
g ή ^Sd'e'^ H
OH P E « P H P p P -h . rt1 «J 3 3 3 3 3 3 C rt S ·Η « ^ ex CU a tx , M 5 -S3 h cd a) o :rt o en p -r1 ^ •rt m > u O, :rt e rt rt ω
O co co p 3 P
M II) O CO _ _ , _ Prt ωΗ h mtni5i5i5 « ^
3 :rt o rt Ji O O S S 2 3>S
aipirt h o o O O C
co h h es p4 n n 0 0 0 “3 ϋ h oja) pcoU ts ri λ es eS 'HrH, rt ·“)-n rt rt {/) Π Π Cu, fU (Vc oh id h h rt h λ jv ft, Cu CU CU j
h -rt H C/Oft1"14 ^4 ^4 ^ ^4 ^4 HP
<; s > a en ^ ^ ^ h ρ)
. Ό H
a 5 O 2 > p rt co \j rt i—I cd e h Λ »n jo φ g ΡΜΛί
H SbuSSSSS
^ 1d CU CU CU Cu CU CU
Pm P
111013 37
Plasmidivektorit, jotka sisältävät pSC101:een liittyvät jakamisalueet ja -funktiot, ovat stabiileja - E. colissa ja Salmonellassa panosviljelyolosuhteissa.
Vaikka pSCIOIrn par-alue on säilytetty pGD103:ssa ja tässä 5 kuvatuissa purA-johdannaisissa, eivät jakamisfunktiot yksin ehkä riitä aikaansaamaan tehokasta plasmidin stabilointia rekombinanttirokotekantojen fermentaatiokasvatuk-sessa tuottamisen aikana (Nilsson ja Skogman, Biotechnology 4 (1986) 901 - 903). Kromosomissa olevan purA-deleetio-10 mutaation täydentäminen plasmidin avulla yhdistettynä ja-kamisfunktioiden säilyttämiseen antaa tehokkaan stabiiliuden panoskavatuksen, ravinnon avulla rajoitetuissa olosuhteissa kasvatuksen ja fermentaation aikana.
Salmonella typhimurium -rokotekantojen in vivo 15 -stabilointi purA-täydentämisen avulla
Tarkoituksena tutkia pSCIOl-plasmidien stabilointia purA-täydentämisen avulla rokotusolosuhteissa, hiiriä im-munoitiin oraalisesti SL3261:llä, BB1231:llä (SL326lApurA) ja pPX3006/BB1231:llä. Hankittiin elinnäytteitä ja ne tut-20 kittiin immunoivien organismien läsnäolon suhteen korkeintaan 30 päivää bakteerien suun kautta nauttimisen jälkeen. Kuten voidaan nähdä kuviosta 7, BB1231:tä voitiin viljellä pernan, maksan ja Peyerin laikkujen näytteistä hyvin alhaisilla tasoilla ainoastaan 2 päivää rokottamisen jäl-25 keen, kun taas SL3261 ja täydennetty BB1231 voitiin saada * talteen kudosnäytteissä useiden viikkojen ajan. Täydennetyn rokotekannan jji vivo -kasvuominaisuudet olivat samankaltaiset elleivät tilastollisen vaihtelun rajoissa identtiset kuin SL3261:llä. Tämä osoittaa, että purA-täydentä-30 mien palauttaa tehokkaasti kromosomin purA-deleetion tyyp-... piä pur+ olevaksi käyttäytymiseksi ja on tehokkaasti vai kuttamatta rokotekannan tunkeutumis- ja bakteeri-replikaa-tio-ominaisuuksiin.
pSC101:teen perustuvat plasmidit ovat myös stabi-35 loituja in vivo. Kuten taulukossa 5 on esitetty, in vitro 111013 38 -stabiiliustietoja tukien pSCIOIeteen perustuvat plasmi-dit, jotka joko on tai ei ole lisäksi stabiloitu purA-täydennyksen avulla, ovat täysin stabiileja elinnäytteissä, jotka on saatu korkeintaan 29 päivää rokottamisen jälkeen.
5 LT-B-ilmentämisplasmideilla immunoitujen eläinten tapauksessa kaikki isolaatit, jotka karakterisoitiin plasmideja sisältäviksi, ilmensivät myös antigeeniä. Sitä vastoin vähemmistö organismeista, jotka oli saatu talteen joko pUC-vektorilla tai pPX100:lla immunoiduista eläimistä, 10 sisälsi plasmidin, niin ettei plasmideja sisältäviä orga nismeja voitu viljellä elinnäytteistä 15 päivää rokottamisen jälkeen. Lisäksi sellaiset eläimet, jotka saivat geeneihin integroituneen LT-B-muodon, osoittivat myös ilmentymisen 100 % pysymistä (kanamysiiniresistenssin ja LT-15 B;n).
• «
Taulukko 5 111013 39
Plasmidin sisältävän S. typhimurium aroArn pysyvyys Peyerin laikuissa 5 ----r-,-_____ Päivä 10 Päivä 15 Päivä 29 i i t .... I C-H I β·Η I C-r) immunointi- .« i-tcu m -h e m m -h £ m . -rl Prf T3 at M ·Η 0ίΌ«)« ·Η Qi n <a v bakteerit, Eläin λ i-h-hc cd ι ή ή e rt i -h-hc . _9 P «o o 0 > a) :rt c w at β > a> :rt c :rt ai a > a» :rt
10 p.O. „ OM .iiWrtWM OM .14 tt rt <0 M OM M 10 rt » M
1 9 A! :rt :rt rt rt o :rt H irt :rt rt rt O :rt :rt :rt rt rt O :rt O trt :rt t-i β m :rt o :rt :rt <-i β M :rt o :rt :rt >π β M :rt 6 iJ P( O P.0 « β hJ CM O Cu S Ui 0 iJ pn o α β 10 ' pUC8/SL3261 (vektori- #1 2 2 KW 1 1 100 0 0 ne kontrolli) »2 0 0 n. 0 0 ne 6 0 0 «3 1 1 100 158 3 2 0 0 ne pPX100/SL3261 (pUC LT-B) 15 #1 3 3 100 59 0 0 1 0 0 #2 38 0 0 4400 100 *3 36000 00 ne I 0 0 pGD103/SL3261 (pSCIOI:stä saatu vek- 6J2 6J2 m o 0 ne 8 8 100 tori) 91 370 370 100 103 103 100 0 0 K» 20 #3 456 456 100 102 102 100 8 8 100 pPX3005/SL3261 (pGD103LT-B) »1 600 600 100 40 40 100 1 1 100 *2 218 218 100 31 31 100 0 0 ne «3 436 436 100 30 30 100 0 0 ne 25 3261X3
(LT-B
integroi- #1 28 28 100 18 18 100 1 1 100 tunut) #2 300 300 100 43 43 100 1 1 100 •3 480 480 100 29 29 100 1 1 100 30
Geenin ilmentämisen stabilointi S. typhi -rokote-kannoissa
Vaikka S. typhimuriumin ja S. dublinin heikennettyjä kantoja voidaan käyttää immunogenisyyden arvioimiseen 35 eläinmalleissa tai voitaisiin kehittää rekombinanttirokot- 111013 40 teiksi eläinlääkintäkäyttöä varten, ne eivät ole ihanteellisen käyttökelpoisia ihmiskäytössä joko lavantautiroko-tusohjelmia varten tai vektoreina vieraalta lajilta peräisin olevien antigeenien toimittamiseksi ihmisen immuuni-5 järjestelmälle, purA-täydennyksen hyödyllisyyden osoittamiseksi heikennetyssä S. typhissä, pPX3006 ja pPX3010 transformoitiin elektroporaation avulla aroA S. typhi -ehdokkaaseen BB1354 ( 679TyΔ purA). Plasmidin läsnäolo varmistettiin ja LT-B:n ilmentyminen pPX30l0-transformanteis-10 sa vahvistettiin western blot -analyysin avulla. Kyseisten kahden kannan kasvuominaisuuksia tutkittiin: plasmidin sisältävien transformanttien kahdentumisajat olivat samankaltaiset kuin transformoimattomalla alkuperäiskannalla. Kaksi plasmidin sisältävää kantaa tutkittiin plasmidin 15 stabiiliuden suhteen in vitro tekemällä alaviljelmiä ade-niinin puuttuessa ja ollessa läsnä. Kummatkin plasmidit olivat 100 % stabiileja 80 sukupolven verran käytettäessä tai oltaessa käyttämättä valintaa.
Verrattiin S. typhi -kantojen 679Ty, BB1354 ja 20 pPX3006/BB1354 kykyä pysyä syvällä olevissa kudoksissa ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta rokottamisen jälkeen. S. typhi ei luonnollisessa tilassaan ole taudinaiheuttaja hiirille eikä infektoi hiiriä suun kautta. Kun pPX3006/-BB1354 tai 679Ty (107 bakteeria eläintä kohti) käytettiin . 25 hiirten rokottamiseen, organismeja saatiin talteen mak soista ja pernoista 10 päivään saakka rokottamisen jälkeen. Toisaalta BB1354 (107 organismia eläintä kohti) voitiin saada talteen ainoastaan hyvin pieninä määrinä muutamien päivien ajan, mikä osoittaa näiden kantojen rajoitet-30 tua kykyä kasvaa eläinkudoksissa. Lisäksi kromosomin purA-deleetion täydentäminen plasmidissa pPX3006 olevan purA-geenin avulla täydentää myös deleetion kyvyn pysyä kudoksissa. (Katso kuvio 8).
In vivo ja in vitro -tulokset S. typhimurium ja 35 S. typhi aroA purA-kannoilla osoittavat selvästi plasmi- 111013 41 dissa olevan E. colin purA-geenin kyvyn täydentää kromo-somaalisia puutoksia näissä kannoissa. Merkittävämpää on, että purA-puutoksen täydentäminen alhaisen kopioluvun omaavan stabiilin plasmidin avulla ei vaikuta rokotebak-5 teerien in vivo -kasvukäyttäytymiseen. Tämä viittaa vahvasti siihen, että purA-täydentämistä hyväksikäyttävien rekombinanttibakteerien pitäisi sallia sellaisten vierailta lajeilta peräisin olevien antigeenien stabiili ilmentyminen, jotka ovat hyödyllisiä suun kautta rokottamisessa. 10 PurA-geeni kromosomiin integroitumisen merkkigee- ninä
Jotta aikaansaataisiin käyttökelpoisempi keino E. coli purA-geenin käsittelemistä varten, purA;n sisältävä 1,74 kiloemäsparin Accl-fragmentti varustettiin eri-15 laisilla liittäjillä (linker) sisältämään symmetrisiä ainoina esiintyviä restriktiokohtia. Yksi liittäjä sisälsi yhden ainoan restriktiokohdan Säliltä varten; Sall-liittä-jillä varustettu purA-geeni kloonattiin pUC18:n Sali-kohtaan. Tätä plasmidia käytettiin myöhemmin ainoina esiinty-20 vien Sali-kohtien reunustaman purA-geenin lähteenä.
Modifioitu transposoni rakennettiin sisältämään sekä purA-geenin että LT-B:n (PL:n kontrolloima) seuraavalla tavalla. Ensin kokoonpantiin faagi^H2 subkloonaamalla BamHI-fragmentti, joka sisälsi PL-promoottorin ja LT-B-rakenne- , 25 geenin pPX1602:sta, transpositioplasmidiin, jossa TnlO;n « käänteiset 31-toistot reunustivat kanamysiiniresistenssi-determinanttia. Tulokseksi saatu plasmidi, jolle on annettu nimitys pPX1584, sisälsi LT-B:n ja kanamysiiniresis-tenssin käänteisten toistojen reunustamana. Transponoituva 30 kasetti risteytettiin Agtllrn johdannaiseen Tnl0:n päät-teiden välisen homologisen rekombinaation avulla. Trans-posonin kyky tuottaa transpositiotapahtumia arvioitiin suorittamalla transduktio LB5010/F112:teen. LT-B;n ilmentyminen varmistettiin itsenäisessä isolaatissa. Sall-liit-35 täjillä varustetulla E. colin purA-geeni1lä korvattiin 111013 42 Λ112: n kanamysiiniresistenssideterminantti subkloonaamalla suoraan palanen λ112:n Xhol-kohtaan ja valitsemalla purA+ lysogeenejä E. coli TX595:ssä. Modifioitu faagi sisältää purA-geenin ja LT-B:n ja sitä käytetään S. typhimurium 5 LB501021 purA/F112:n tai S. typhi aroA4purA/F112:n muutta miseen transduktion avulla puriinin suhteen riippumattomaksi. Tällaiset transduktantit syntyvät poikkeuksetta purA:n ja LT-B:n siirrosta transposition avulla sattumanvaraisiin paikkoihin Salmonella-kromosomiin.
10 Kantatalletuksia
Seuraavat kannat talletettiin kokoelmaan (ATCC), Rockville, Maryland, Budapestin sopimuksen ehdoilla: ATCC- talle- Talletue- 15 Kanta tusnro päivä S. typhimurium: BB1231 (aroApurA) 55107 29. lokakuuta 1990 S. typhimurium: pPX3005/BBl231 68451 29. lokakuuta 1990 S. typhimurium: pPX3006/BBl231 68452 29. lokakuuta 1990 20 S. typhimurium: pPX3010/BB1231 68453 29. lokakuuta 1990 S. typhimurium: pPX3009/BB1231 68612 3. toukokuuta 1991 S. typhi: BB1354 55179 3. toukokuuta 1991
Vastikkeita 25 Alan ammattimiehet tuntevat tai kykenevät saamaan selville vain tavanomaista kokeilua käyttäen monia vastikkeita tässä kuvatuille keksinnön erityisille suoritusmuo-doille. Sellaisten vastikkeiden tarkoitetaan sisältyvän seuraaviin patenttivaatimuksiin:

Claims (11)

111013
1. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää adenylosukkinaattisyntetaasin koodaavan purA-qeenin, 5 mutta ei sisällä antibioottiresistenssideterminanttia, jolloin vektori on esimerkiksi alhaisen kopioluvun omaava plasmidi tai suuren kopioluvun omaava plasmidi, joka sisältää vähentyneesti ilmentymään säädetyn purA-qeenin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen vektori, 10 tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää nukleoti- disekvenssin, joka koodaa vähintään yhden muun antigeenin tai sen fragmentin.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen vektori, tunnettu siitä, että antigeeni on virusantigeeni, 15 joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat ihmisen im-muunipuutosvirus (tyypit I ja II), ihmisen T-lymfosyyt-tivirus (tyypit I, II ja III), respiratory syncytial (RS) virus, hepatiitti A, hepatiitti B, hepatiitti C, ei-A- ja ei-B-hepatiittivirukset, herpes simplex-virus (tyypit I ja 20 II), sytomegalovirus, influenssavirus, parainfluenssavirus, poliovirus, rotavirus, koronavirus, vihurirokkovirus, tuhkarokkovirus, vesirokkovirus, Epstein Barrin virus, adenovirus, papilloomavirus ja keltakuumevirus, bakteerian-tigeeni, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat Hae-25 mophilus influenzae, Escherichia cpli, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhea, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococ-30 cus aureus, Klebsiella pneumoniae ja Clostridium tetani, ··' sieni- tai loisantigeeni, joka on peräisin lämminverisen eläimen tai ihmisen taudinaiheuttajasta. 111013
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on pPX3005 (ATCC 68451), pPX3006 (ATCC 68452), pPX3009 (ATCC 68612), pPX3010 (ATCC 68453) tai kuviossa 6B esitetty pPX3007.
5. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mu kaisen vektorin sisältävän isäntäsolun valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu vektori viedään mainittuun isäntäsoluun.
6. Menetelmä rokotekoostumuksen valmistamiseksi, 10 joka käsittää heikennetyn bakteerin joka sisältää stabiilin vektorin, joka sisältää adenylosukkinaattisyntetaasin koo-daavan heterologisen purA-qeenin ja vähintään yhden muun geenin, joka koodaa heterologisen geenin tuotteen, mutta ei sisällä antibioottiresistenssideterminanttia, t u n 15 net t u siitä, että mainittu vektori viedään heikennettyyn bakteeriin, joka sitten sekoitetaan fysiologisesti hyväksyttävän kantaja-aineen ja valinnaisesti adjuvantin kanssa, jolloin vektori on esimerkiksi pienen kopioluvun omaava plasmidi tai suuren kopioluvun omaava plasmidi, joka 20 sisältää vähentyneesti ilmentymään säädetyn purA-geenin.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että bakteerilla on purA- kro-mosomaalisen geenin mutaatio ja valinnaisesti kromosomaali-nen mutaatio yhdessä tai useammassa geenissä, joka on funk- 25 tionaalinen aromaattisten yhdisteiden biosynteesissä.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geenin tuote on viruksen, bakteerin, sienen tai loisen, joka on lämminverisen eläimen tai ihmisen taudinaiheuttaja, antigeeni.
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, ;> tunnettu siitä, että bakteeri on suoleen tunkeutuva bakteeri, joka on sukua Salmonella, Shigella, Yersinia, Escherichia, Vibrio tai Campylobacter. 111013
10. Jonkin patenttivaatimuksen 6-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori sisältää geenin, joka koodaa antigeenin, joka on malarian eläinitiötä ympäröivän proteiinin epitooppi ja joka ilmentyy osana fuu-5 sioproteiinia, joka käsittää eläinitiötä ympäröivän proteiinin epitoopin ja E. colin lämpöä kestämättömän enterotok-siinin B-alayksikön tai sen osaproteiinin, joka yhdistettynä eläinitiötä ympäröivän proteiinin epitoopin kanssa tuottaa immunoaktiivisen fuusioproteiinin.
11. Menetelmä kiinnostuksen kohteena olevien bak- teeritransformanttien valitsemiseksi ja ylläpitämiseksi käyttäen ei-antibioottivalintakeinoa, tunnettu siitä, että lisätään jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen vektori isäntäbakteereihin, joilta puuttuu purA-15 geeni, kasvatetaan selektiivisesti bakteerit kasvualustassa, josta puuttuu adeniini, ja valitaan siinä kasvaneita purA-plasmidin sisältäviä bakteeripesäkkeitä. e t < ( 111013
FI921940A 1991-05-03 1992-04-30 Stabiileja purA-vektoreita ja niiden käyttö FI111013B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69570691A 1991-05-03 1991-05-03
US69570691 1991-05-03

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI921940A0 FI921940A0 (fi) 1992-04-30
FI921940A FI921940A (fi) 1992-11-04
FI111013B true FI111013B (fi) 2003-05-15

Family

ID=24794162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI921940A FI111013B (fi) 1991-05-03 1992-04-30 Stabiileja purA-vektoreita ja niiden käyttö

Country Status (16)

Country Link
US (2) US5919663A (fi)
EP (1) EP0512260B1 (fi)
JP (1) JP3320095B2 (fi)
KR (1) KR100242798B1 (fi)
AT (1) ATE202800T1 (fi)
AU (1) AU654347B2 (fi)
CA (1) CA2067862C (fi)
DE (1) DE69231907T2 (fi)
DK (1) DK0512260T3 (fi)
ES (1) ES2160573T3 (fi)
FI (1) FI111013B (fi)
GR (1) GR3036487T3 (fi)
IL (1) IL101751A0 (fi)
NO (1) NO314043B1 (fi)
PT (1) PT512260E (fi)
TW (1) TW201794B (fi)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
US7279313B2 (en) * 1995-09-15 2007-10-09 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
EP0927246A2 (de) * 1996-09-04 1999-07-07 Basf Aktiengesellschaft Adenylosuccinat synthetase
US6010705A (en) * 1997-04-11 2000-01-04 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Attenuated, invasive vaccines against fish pathogens
WO1998046725A2 (en) * 1997-04-11 1998-10-22 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Attenuated, invasive vaccines against fish pathogens
DE69930147T2 (de) * 1998-12-04 2007-01-11 University Of Manitoba, Winnipeg Zwei-schritte-verfahren zur impfung gegen chlamydia
KR100427587B1 (ko) * 2001-01-12 2004-04-27 주식회사 바이오리더스 신규 ｄ-글루탐산 합성효소 유전자 ｄｎａ 및 이를 이용한 항생제 비의존성 벡터
FI116851B (fi) * 2001-05-03 2006-03-15 Fit Biotech Oyj Plc Ilmentämisvektori, sen käyttöjä ja menetelmä sen valmistamiseksi sekä sitä sisältäviä tuotteita
US20040009937A1 (en) * 2002-01-31 2004-01-15 Wei Chen Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system
AU2003210688A1 (en) * 2002-01-31 2003-09-02 Symbigene, Inc. Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system
CN1276076C (zh) * 2004-12-14 2006-09-20 华东理工大学 一种鳗弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株及其应用
EP2150616A4 (en) 2007-05-10 2011-07-27 Univ Arizona REGULATED ANTIGEN SYNTHESIS AND / OR REGULATED ATTENUATION FOR IMPROVING VACCINATE IMMUNOGENICITY AND / OR SAFETY
US20100317084A1 (en) * 2007-05-10 2010-12-16 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacteria comprising vectors for expression of nucleic acid sequences encoding antigens
WO2009046449A1 (en) 2007-10-05 2009-04-09 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against enteric pathogens
WO2010045620A1 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae
US9163219B2 (en) * 2009-04-14 2015-10-20 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Single expression vector for generation of a virus with a segmented genome
GB2483595B (en) 2009-05-22 2017-03-29 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State Univ Recombinant bacterium and methods of antigen and nucleic acid delivery
US9045742B2 (en) * 2009-05-29 2015-06-02 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant Edwardsiella bacterium
US9062297B2 (en) 2010-01-13 2015-06-23 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Yersinia pestis vaccine
EP2526185A4 (en) 2010-01-22 2013-07-24 Univ Arizona BACTERIUM WITH REGULATED RFAH NUCLEIC ACID
WO2011150421A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium to decrease tumor growth
WO2012082946A2 (en) * 2010-12-14 2012-06-21 The Regents Of The University Of California Creation of super-stable coie1 plasmids by duplication of sl 1-4 sequence and point mutations.
US9303264B2 (en) 2012-05-18 2016-04-05 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Photosynthetic microorganisms expressing thermostable lipase
US9580718B2 (en) 2013-06-17 2017-02-28 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Attenuated live bacteria with increased acid resistance and methods of use thereof
KR102006976B1 (ko) * 2019-02-26 2019-08-06 씨제이제일제당 주식회사 신규 프로모터 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0025118A1 (de) * 1979-08-18 1981-03-18 Riedlinger, Rainer, Dr.-Ing. Anordnung zur akustischen Wiedergabe von Signalen, die mittels eines rechten und eines linken Stereo-Kanals darstellbar sind
US4550081A (en) * 1980-05-19 1985-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Non-reverting salmonella
US4735801A (en) * 1982-09-07 1988-04-05 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting salmonella live vaccines
US4837151A (en) * 1980-05-19 1989-06-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Stanford University Live vaccines comprising two mutations and foreign antigen
DK410783D0 (da) * 1982-09-16 1983-09-09 Benzon A Salfred Fremgangsmade til stabilisering af plasmider
EP0251579A3 (en) * 1986-06-24 1989-03-22 Enterovax Research Pty. Ltd. Non-antibiotic marker system
DE3751564T2 (de) * 1986-08-05 1996-03-28 Transgene Sa Verfahren zur Stabilisierung eines Plasmids, das in einem Bakterienstamm enthalten ist und der erhaltene Stamm.
JPS6427477A (en) * 1987-04-01 1989-01-30 Takeda Chemical Industries Ltd Dna and use thereof
US5112749A (en) * 1987-10-02 1992-05-12 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for the malaria circumsporozoite protein
GB8730037D0 (en) * 1987-12-23 1988-02-03 Wellcome Found Vaccines
WO1990012086A1 (en) * 1989-03-31 1990-10-18 Washington University Bordetella vaccines
ATE190660T1 (de) * 1990-12-18 2000-04-15 Gen Hospital Corp Verbesserte impfstoffe

Also Published As

Publication number Publication date
AU1595992A (en) 1992-11-05
FI921940A (fi) 1992-11-04
EP0512260A2 (en) 1992-11-11
US5961983A (en) 1999-10-05
NO921729D0 (no) 1992-04-30
NO921729L (no) 1992-11-04
TW201794B (fi) 1993-03-11
DE69231907D1 (de) 2001-08-09
FI921940A0 (fi) 1992-04-30
ATE202800T1 (de) 2001-07-15
DK0512260T3 (da) 2001-09-17
IL101751A0 (en) 1992-12-30
EP0512260B1 (en) 2001-07-04
CA2067862C (en) 2003-12-30
JPH05192161A (ja) 1993-08-03
JP3320095B2 (ja) 2002-09-03
ES2160573T3 (es) 2001-11-16
GR3036487T3 (en) 2001-11-30
EP0512260A3 (en) 1993-07-28
US5919663A (en) 1999-07-06
KR100242798B1 (ko) 2000-02-01
KR920021701A (ko) 1992-12-18
AU654347B2 (en) 1994-11-03
PT512260E (pt) 2001-12-28
CA2067862A1 (en) 1992-11-04
DE69231907T2 (de) 2001-10-18
NO314043B1 (no) 2003-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI111013B (fi) Stabiileja purA-vektoreita ja niiden käyttö
FI110008B (fi) Menetelmä heikennetyn bakteerin ja sitä sisältävän rokotteen valmistamiseksi
Garmory et al. Salmonella vaccines for use in humans: present and future perspectives
US5424065A (en) Vaccines containing avirulent phop-type microorganisms
AU754795B2 (en) Attenuated mutants of salmonella which constitutively express the Vi antigen
EP0563311B1 (en) Improved vaccines
JP4583607B2 (ja) 感染症の治療のための弱毒化微生物
JPH04502402A (ja) 組み換えフラジエリンのワクチン
US8475810B2 (en) Attenuated Salmonella enterica serovar paratyphi a and uses thereof
US8137930B2 (en) Attenuated Salmonella enterica serovar paratyphi A and uses thereof
EP0465561A1 (en) Avirulent microbes and uses therefor
IL100010A (en) ALLENOMLAS non-violent strains that include a mutation in the TDC gene and immunogenic preparations that contain the above-mentioned non-violent strains of ALLENOMLAS
WO1991018092A1 (en) Acid-tolerant salmonella typhi, double aro mutants thereof and use as an oral vaccine for typhoid fever
AU653362B2 (en) Insertion of DNA by modified transposons
Nagata et al. 15 Anti-Infective Vaccine Strategies
PL171476B1 (en) Method of obtaining attenuated salmonella bacterium

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired