NO314043B1 - Plasmid eller fagvektor som ikke inneholder en antibiotisk resistens determinant, Pur A-bakterievert som inneholder plasmidet eller vektoren,farmasöytiskpreparat som omfatter bakterien og fremgangsmåte for seleksjon ogopprettholdelse av bakte - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår plasmid eller fagvektor som ikke inneholder en antibiotisk resistens determinant, Pur A-bakterievert som inneholder plasmidet eller vektoren, farmasøytisk preparat som omfatter bakterien og fremgangsmåte for seleksjon og opprettholdelse av bakterielle transformanter.

Plasmider funnet i naturen blir fordelt blant delende celler, slik at dattercellene mottar minst én kopi. Bakterielle plasmidsystemer benytter forskjellige strategier for å sikre korrekt fordeling av plasmidene til etterkommerne. Å opprettholde plasmidene i høyt kopitall øker sannsynligheten for at dattercellene arver minst ett plasmid ut i fra vilkårlig fordeling, slik at sannsynligheten for at etterkommerne arver ikke noe plasmid er meget lav. Skjønt tilfeldige fordelingssystemer kan teoretisk funksjonere ved å fordele plasmidene blant delende celler, må plasmider som beholdes som én eller i et lavt kopitall pr. celle avhenge av aktiv fordelingsmekanisme. F.eks. må plasmider som blir opprettholdt i lavt kopitall eller en kopi pr. celle slik som F. cnli F-faktor (incFl), plasmid pro fag Pl (incY) og RI og NR1 (incF2), benytte aktive fordelingssystemer for å opprettholde plasmider i den celledelende populasjonen, siden vilkårlig fordeling av plasmider ville forutsette en tapsrate på 25% pr. generasjon. Videre, er noen høyere kopitallplasmider avhengig av setespesifikke rekombinasjoner for å løse opp multimer-dannelse, som funksjonelt reduserer kopitallet av plasmider i celler og deres evne til vilkårlig fordeling ved hjelp av fri diffusjon.

Flere aktive fordelingssystemer er blitt beskrevet for flere familier av bakterielle plasmider. Disse systemene har visse felles egenskaper. Plasmidreplikasjonsfunksjoner kan vanligvis tilskrives bestemte regioner av plasmider. Plasmid replikasjonsregioner (rep) for f.eks. Pl eller F, kan bli uavhengige beholdt i celler. Imidlertid, er miniF eller miniPl-plasmider som mangler fordelingsregionene ustabile og tapes fra populasjonen i frekvenser som kan forutsies ut i fra vilkårlig fordeling.

Utviklingen av plasmidvektorer for den bakterielle produksjon av heterologe gener for kommersielle formål er blitt i utstrakt grad dokumentert. En rekke kloningshjelpemidler basert på forskjellige plasmidreplikoner er blitt beskrevet og benyttet for produksjon av proteiner i F. coli og andre bakterier. I utviklingen av kloningshjelpemidler som er passende for produksjon av fremmede proteiner har den vanlige strategien vært å lage plasmider med lav molekylvekt med høyt eller regulert kopitall. Disse strategiene har noen ganger ledet til elimineringen av fordelingsfunksjonene som ville på annen måte lede til stabil plasmidarv. Høyt kopitall kloningsvektorer for konstruksjon av produksjonsorganismer viser ofte fordelingsustabilitet.

Den mest vanlige strategien for å oppnå stabil plasmidreplikasjon og arv i verts-cellepopulasjonen under fermentering har blitt å inkludere legemiddelresistens-deteiminanter på kloningshjelpemiddelet. Skjønt tilsetning av legemidler til vekst-medium tillater seleksjon med hensyn til celler som inneholder plasmid, blir tilsetning av antibiotika uakseptabelt i mange tilfeller på grunn av omkostninger og mulig forurensning av endeproduktet.

Flere alternative strategier er blitt utviklet for å oppnå stabil plasmidopprett-holdelse under fermentering. F.eks., parR locus i RI er blitt subklonet inn i en rekke plasmider som er vanlige kloningsvektorer. De resulterende plasmidene som inneholder RI paiB-regionen viste øket stabilitet når de ble dyrket i fravær av seleksjons-press. På samme måte kan sopp-regionen i F stabilisere ikke-stabile oriC-plasmider, og Pl par kan stabilisere en mini-F-plasmid som mangler sine egne fordelingsfunksjoner. Stabiliteten til kloningsvektorene som inneholder tryptofanoperongener ble øket ved tilsetning av nar-locus i pSClOl og den ikke-stabile multikopi vektor som stammer fra pl5a (pACYC184) ble stabilisert av pSClOl par-locus. Andre fordelingsregioner, slik som en fordelingsregion fra en Salmnnelle typhimurium virulensplasmid er også blitt benyttet med hell for å stabilisere kloningshjelpemidler.

Skjønt kloningshjelpemidler kan i det vesentlige bli stabilisert ved tilsetting av fordelingsregionene fra stabile plasmider, blir legemiddelresistensdeterminanter fremdeles vanlig brukt under fermentering. Legemiddel-resistensmarkører er passende for å innføre plasmider i bakterievertsceller. Alternativt kan plasmider bli innført i mottakende bakterieceller ved komplementering av vertskromosomale mutasjoner ved hjelp av plasmidbårede gener. Komplementeringssystemer avhenger av konstruksjonen av spesielle vertkromosomale mutasjoner, men kan bli benyttet på en pålitelig måte til å omgå bruken av antibiotika i kulturmedia. F.eks., komplementering av nærings-defekter kan lede til plasmidstabilisering. Komplementering av kromosomal mutasjon for aspartat semialdehyd dehydrogenase (aad) i Salmonella typhimnriiim eller D-alanin racemasemutasjon (dal) i Racillus suhtilis, som hver leder til feilaktig cellevegg biosyntese og cellelysis, gir stabil plasraidarv i fravær av seleksjon av alle levedyktige celler i kulturen. Både asd og dal-mutasjonene kan bli fenotypisk reparert ved supplering med næringstilsetninger. På den annen side, komplementering av et essensielt gen i verten, hvis defekt ikke kan bli overvunnet ved næringssupplering, kan også stabilisere plasmidene. F.eks., et F,, coli-gen, ssh, blir krevet for DNA-replikasjon og celleviabilitet og hindrer oppsamlingen av plasmid-løse celler under fermentering i en bioreaktor når det blir satt inn i et plasmid og kan bli benyttet for å komplettere en kromosomal ssh-defekt. På analog måte stabiliserer en plasmid-båren kopi av valyl tRNA syntetase plasmidene i F cnli som inneholder en kromosomal temperaturfølsom valyl tRNA syntetase. Plasmidene kan også bli stabilisert ved innbygging av et bakteriofag repressorgen, tapet av det leder til induksjon av vertsprofag og celledød.

Et stabilt plasmid eller bakteriofag vektorsystem for seleksjon og opprettholdelse har blitt utviklet for bakterier som kan produsere heterologe genprodukter under fermentering, eller for bruk i separat stabilisering av antigenproduksjon i levende svekkete bakterielle vaksiner. Dette system er basert på komplementering av en kromosomal mangelmutasjon ved å uttrykke et funksjonelt gen for adenylosuksinat-syntetase (purA genprodukt).

Tre fremgangsmåter kan bli benyttet for å gi funksjonell purA genprodukt (adenylsuksinatsyntetase) for seleksjon og opprettholdelse. Først, et lav kopitallplasmid kan bli benyttet som vektoren fra hvilken produksjon av puxA-genet er tilstrekkelig til å komplettere den kromosomale purA-defekten uten å overlesse cellen med en overproduksjon av purA proteinproduktet. En annen fremgangsmåte er å gi purA-genet på et høyt kopitall plasmid hvorfra det blir ineffektivt uttrykt. Dette kan bli oppnådd ved hjelp av en rekke fremgangsmåter vel kjent i feltet for nedstrømsregulering av genekspresjon, inklusive basespesifikk mutagenese av promotoren eller ribosom bindings-sekvensene for å redusere transkripsjonseffektiviteten og derfor ekspresjon av purA-genet. En tredje fremgangsmåte er å gi et funksjonelt purA-gen på en integrerings-vektor, slik som et plasmid eller bakteriofag, som ikke er i stand til å replikere i den motlagende piirA-vert, og således selektere for integrering av purA-vektoren.

Dette systemet forebygger behovet for å selektere bakterielle transformanter ved hjelp av antibiotikaresistens, og for bruk av levende bakterielle vaksinevektorer, forhindrer frigjøringen av legemiddel-resistensgener til omgivelsene og tilførsel til annen tarmflora ved hjelp av kjente genetiske mekanismer. Denne oppfinnelse er spesiell anvendbar i seleksjon og vedlikehold av plasmider, eller for integrering av vektorer i levende svekkede bakterielle vaksinestammer, begge for vekst og vaksineproduksjon og i antigene tilførselfaser i den vaksinerte verten.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 viser konstruksjonen av plasmid pPX3001, som inneholder K. coli purA-genet under kontrollen av lacZ-promotoren. Fig. 2 viser konstruksjonen av plasmid pPX3003 som inneholder F coli purA-genet og genet som koder for bindings subenheten til det varmelabile enterotoksin (LT-B) til F. cnli under kontrollen av lacZ-promotoren. Fig. 3 er en fremstilling av prosent av S- Aihlin SL5653-celler som bærer purA-plasmidene under selektiv (uten tilsatt adenin) og ikke-selektive betingelser (med adenin tilsatt). Fig. 4A viser en SDS polyakrylamidgel av total celleprotein fra kulturene til SL5653/pPX3003 dyrket i medium som inneholder adenin (+ad) eller uten adenin (-ad). Fig. 4B viser et western blot av total celleprotein i SL5653/pPX3003 undersøkt med geit anti-LT-B-antiserum og synliggjort med HRP-merket protein A. Fig. 5 viser konstruksjonen av to lavkopitall plasmidvektorer. Plasmid pPX3005 inneholder hele den LT-B-kodende sekvensen og en Kanamycin-resistens determinnt. Plasmid pPX3006 inneholder puxA-genet under kontrollen av lacZ-promotoren. Fig. 6 viser konstruksjonen av tre purA plasmidvektorer som inneholder den kodende sekvensen til LT-B (pPX3010), malariacirkumsporozoitt (CS) proteingen (pPX3009) og nukleotidsekvensen som koder for en LT-B/CS fusjonsprotein (pPX3007). Fig. 7 viser resultatene av in vivn stabiliseringsstudier av Salmnnelle t yphimuriiim-starmriene ved puxA-komplementering. £ typhimnrium gjenvunnet fra A: milt, B: lever og C: Payerske områder. Fig. 8 viser resultatene av in vivo stabiliseirngsstudier av S. typhi-stammene av purA-komplementering. S. typhi gjenvunnet fra A: lever og B: milt.

I et første aspekt av oppfinnelsen omfarts et plasmid eller fagvektor som ikke inneholder en antibiotisk resistens determinant, kjennetegnet ved at den er blitt stabilisert ved innsetting av DNA som inneholder puiA-genet som koder for adenylosuksinatsyntetase, og at den er et lavkopitallplasmidvektor, eller et høykopitall-plasmid som inneholder et nedregulert purA-gen, eventuelt at det/den ytterligere omfatter minst en annen nukleotidsekvens som koder for et antigen eller fragment av dette.

Vektoren kan fortrinnsvis ytterligere omfatte minst en annen nukleotidsekvens som koder for et antigen eller fragment av dette.

Antigenet er foretrukket et viralt antigen valgt fra gruppen som består av human immunsviktvirus (typene I og II), human T lymfocyttvirus (typene I, II og III), respiratorisk syncytialt virus, hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C, non-A og non-B hepatittvirus, herpes simplex-virus (typene I og II), cytomegalovirus, influensavirus, parainfluensavirus, poliovirus, rotavirus, coronavirus, røde hunder-virus, meslingvirus, vannkoppe-virus, Epstein Barr-virus, adenovirus, papillomavirus og gulfebervirus, et bakterielt antigen valgt fra gruppen som består av Haemnphilns influenTae, Fscherichia coi \\} Neisseria meningiditiSj Streptncncciis pnenmoniae., Srreptocncciis pyngeneSj Rranhamella catarrhaliSj Vibrin chnlerae, Cnryne- hacterinm diphtheriae^ rhlatnydia trachnmaris, Neisseria gnnnrrhea, finrrietella pertnssis., Psendnmnnas aeruginnsa, Straphylnoonmis aurens, Klfthsiella pnftiimnniaa og nnstridiiim tetanij sopp eller parasittantigen eller et varmblodig dyr eller humanpatogen.

Spesielt foretrukne plasmidvektorer ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet at de er stabile lavkopitall plasmidvektorer valgt fra gruppen som består av pPX3005 (ATCC 68451), pPX3006 (ATCC 68452), pPX3009 (ATCC 68612), pPX3010 (ATCC 68453) og pPX3007.

I en annen foretrukken utførelsesform omfatter plasmidet ifølge oppfinnelsen et gen som koder for et antigen som er en epitop av et malaria cirkumsporozoittprotein, som uttrykkes som del av fusjonsproteinet, som omfatter cirkumsporozoittepitopen og B-under-enheten til det varmeustabile enterotoksin til F- floli eller en del av dette protein som kombinert med cirkumsporozoittepitopen lager et immunaktivt fusjonsprotein.

Fortrinnsvis kjennetegnes plasmidet ved at det ytterligere omfatter et gen som koder et funksjonelt delingslocus for eksempel par B.

I et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse omfatter et Eur A-bakterievert som er kjennetegnet ved at den inneholder plasmidet eller vektoren ifølge ethvert av kravene 1-7.

I et ytterligere aspekt omfattes en P_ur A-svekket bakterie kjennetegnet ved at den inneholder et stabilt plasmid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, som ikke inneholder et antibiotisk resistens locus, hvor plasmidet er en lavkopitallplasmidvektor eller et høykopitall-plasmid som inneholder et nedregulert purA-gen og hvor plasmidet inneholder et heterologt purA-gen som koder for adenylosuksinat-syntetase og minst ett annet gen som koder for et heterologt genprodukt.

Foretrukne bakterier ifølge foreliggende oppfinnelse har en pur A-kromsomal genmutasjon og eventuelt en kromosom mutasjon i ett eller flere gener som er funksjonelle med hensyn til biosyntese av aromatiske forbindelser, eller galaktosemetabolisme.

I en foretrukken utførelsesform er genproduktet fra virus-, bakteriell-, sopp-eller parasitt-opprinnelse av et varmblodig eller human patogen.

Andre aspekter ved foreliggende oppfinnelse vedrører farmasøytisk preparat som omfatter bakterier ifølge oppfinnelsen, og en fysiologisk akseptabel bærer og eventuelt adjuvans., og en fremgangsmåte for å selektere og beholde bakterielle transformanter av interesse ved bruk av ikke-antibiotiske seleksjons-fremgangsmåter, kjennetegnet ved at den omfatter innsetting av en stabil purA-vektor ifølge krav 1 inn i vertsbakterie som mangler purA-genet, og selektivt dyrke bakterien i adenin-manglende medium og selektere for purA plasmid-inneholdende bakteriekolonier som vokser på det.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også et plasmid eller fag som ikke inneholder en antibiotisk resistensdeterminant, kjennetegnet ved at plasmidet eller fagen bærer et purA-gen hvis innsetting i en vertscelle kan selekteres ved dyrking av vertscellen i et medium som ikke trenger purinsupplementering., og en fremgangsmåte for å selektere og opprettholde bakterielle transformanter av interesse for anvendelse i en vaksine ved bruk av ikke-antibiotiske fremgangsmåter, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter innsetting av en stabil purA-vektpr ifølge krav 1 inn i vertsbakterie som mangler purA-genet ifølge ethvert av kravene 8-15, og selektivt dyrke bakterien i adenin-manglende medium og selektere for purA-plasmid-inneholdende bakteriekolonier som vokser på det.

Stabile plasmidvektorer for komplementering av kromosomale delesjons-mutanter i purA-locus er beskrevet. Disse vektorene kan bli benyttet som et hjelpe-middel for å selektere kloner som bærer ikke-selekterbare markører eller andre passasjer-gener under kloningen. Vektorene i denne oppfinnelse kan også bli benyttet for å opprettholde disse klonene under vekst for dyrkningsmangfoldiggjøring, vaksinestammeproduksjon og genproduktisolering.

Stabile purA-vektorer i oppfinnelsen gir et funksjonelt purA-gen som er istand til å uttrykke adenylosuksinat-syntetase, og reparere enhver defekt i purinbiosyntese og tillate vekst. I kontrast, i stammene med et defekt purA-gen, kan purinbehovene bare bli tilfredsstilt ved næringssupplering med ekstracellulært adenin eller adenosin. Således sikrer vekst av celler som har puxA-vektoren, i adenin-manglende medium den fortsatte seleksjon og opprettholdelse av plasmidvektoren. Delesjoner av vert purA-genet blir foretrukket siden disse mutasjonene ikke går tilbake. Omfattende delesjoner er mer foretrukne fordi disse fjerner omfattende homologi mellom plasmid purA og kromosom, hvilket kunne føre til kromosomintegrering av plasmidet og til markør-gjenvinning av purA-genet i et dobbelt kryssoverhendelse med samtidig tap av det uttrykte passasjergenet. Bruk av komplementerende purA-gen fra en heterolog bakteriell kilde reduserer frekvensen av disse mulige uønskede homologe rekombina-sj onsbegi venhetene.

Dette systemet baserer seg på komplementeringen av en kromosomal mangelmutasjon ved å uttrykke et funksjonelt gen for adenylsuksinat-syntetase (purA genprodukt). purA-locus er spesielt viktig i tillagningen av levende svekkede Salmonella og relaterte tarmvaksinevektorer siden nærværet av purA-mutasjoner på kromosomet fører til svekkelse av virulensen. Tn vivo forhindrer nærværet av purA på et plasmid eller bakteriofag vektor, som også koder for produksjon av minst ett polypeptid-immunogen, tilsynekomsten av organismer som mangler immunogenproduksjon i den vaksinerte verten. Når det blir kombinert med andre svekkende loci, slik som dem som bestemmer auxotrofe behov for aromatiske forbindelser, fører purA til videre svekkelse av virulens. Kromosomal delesjon av disse genene fører til nedsatt evne til å replikere i verten, pga. mangel på tilgjengelighet av frie puriner, slik som adenin eller adenosin eller vitaminforstadier (slik som folsyre) som er avhengig av biosyntese av aromatisk forbindelse. Således er Salmonella typhimnriiim som har delesjonsmutasjoner i både aroA og i purA ineffektive i å gi et skikkelig immunsvar rettet mot bakterien, mens bakterien som har bare defekter i de aromatiske biosyntetiske genene (slik som aroA) er effektive i å gi immunsvar. Selv om Salmonella som har aroA-mutasjoner er istand til å replikere i et begrenset omfang intracellulært, er de som inneholder ytterligere purA-mutasjon ikke istand til å replikere i verten. Ved å gi purA-produktet til R coli lokalisert på et plasmid til en aro. purA-vertbakterie, har den komplementerte vaksine in vivn vekstegenskaper som er identiske til dem til Aiq-mutanten.

Flere generelle fremgangsmåter for valg og stabilisering av ekspresjon er beskrevet her ved bruk av lavkopi plasmidbærere, høykopiplasmidbærere og vektorer som tillater gjenvinning av enkel kopikromosomale integreringsbegivenheter. I tilfelle med lav kopitallvektorer, kan komplementering av purA kromosomale defekter gi ytterligere stabilitet til plasmider som også inneholder funksjonelle fordelingsloci.

I tilfelle med høykopi tallvektorer i denne oppfinnelse blir purA-genet fortrinnsvis mutert for å redusere ekspresjonseffektiviteten av genproduktet og derfor hindre veksthemming pga. skadelige effekter av en overproduksjon av adenylosuksinat-syntetase (purA) enzymet.

Konstruksjon av pjirA plasmidvektorer

Rekombinant DNA-teknologi ble benyttet i konstruksjonen av purA-plasmidene Rekombinante teknikker omfatter innsetting av spesifikke DNA-sekvenser i en DNA-bærer (vektor) for å lage et rekombinant DNA-molekyl som er i stand til å replikere i en vertscelle. Den innsatte DNA-sekvensen kan være formet til den mottakende DNA-bærer, dvs. den innsatte DNA-sekvensen og DNA-vektoren stammer fra organismer som ikke utbytter genetisk informasjon i naturen, eller den innsatte DNA-sekvensen kan bli helt eller delvis laget syntetisk. Flere generelle fremgangsmåter har blitt utviklet som tillater konstruksjon av rekombinante DNA-molekyler.

Uavhengig av fremgangsmåtene som benyttes for konstruksjon, må det rekombinante DNA-molekylet være forenlig med vertscellen, dvs. istand til autonom replikasjon i vertscellen eller stabilt integrert inn i ett eller flere av vertscellens kromosomer eller plasmider. Det rekombinante DNA-molekylet skulle fortrinnsvis også ha en markørfunksjon som tillater seleksjonen av det ønskete rekombinante DNA-molekyl(ene). I tillegg, hvis alle de riktige replikasjons-, transkripsjons- og translasjonssignalene blir riktig arrangert på den rekombinante vektoren, vil det fremmede genet bli riktig uttrykt i, f.eks., de transformerte bakteriecellene, i tilfelle med bakterielle ekspresjonsplasmider, eller i permissive cellelinjer eller verter som er infisert med et rekombinant virus eller som bærer et rekombinant plasmid som har det passende startssted for replikasjon.

Forskjellige genetiske signaler og prosesseringshendelser kontrollerer nivået for genekspresjon slik som DNA-transkripsjon og budbringer-RNA (mRNA) translasjon. Transkripsjon av DNA er avhengig av nærværet av en promotor, som er en DNA-sekvens som dirigerer bindingen av RNA-polymerasen og derved fremmer mRNA-syntese. DNA-sekvensen i eukaryote promotorer avviker fra de i prokaryote promotorer. Videre kan eukaryote promotorer og etterfølgende genetiske signaler ikke bli gjenkjent i eller kan ikke fungere i et prokaryot system, og videre, prokaryote promotorer er ikke gjenkjent og fungerer ikke i eukaryote celler.

På samme måte, translasjon av mRNA i prokaryote avhenger av nærvær av de riktige prokaryote signalene, som varierer fra de i eukaryoter. Effektiv translasjon av mRNA i prokaryote krever et ribosomalt bindingssete kalt Shine-Dalgarno (S/D)-sekvensen (J. Shine og L. Dalgarno, Nature, 254:34-38 (1975)) på mRNA. Denne sekvens er en kort nukleotidsekvens i mRNA som er lokalisert foran startkodon, vanligvis AUG, som koder for den aminoterminale (formyl-) metionin i proteinet. S/D-sekvensene er komplementære til 3'-enden av 16S rRNA (ribosomalt RNA), og gir vanligvis binding av mRNA til ribosomer ved å dupleksbinde til rRNA for å tillate riktig posisjonering av ribosomet.

Vellykket ekspresjon av et klonet gen krever tilstrekkelig transkripsjon av DNA, translasjon av mRNA og i visse tilfeller posttranslasjonell modifikasjon av proteinet. Ekspresjonsvektorer har blitt benyttet for å uttrykke gener under kontroll av en aktiv

promotor i en passende vert, og for å øke proteinproduksjonen.

Forskjellige regulatoriske ekspresjonselementer kan bli benyttet, som er et av flere passende transkripsjons- og translasjonselementer som er aktive i bakterier. F.eks., promotorer som kan bli benyttet for å dirigere ekspresjonen av de rekombinante gensekvensene omfatter, men er ikke begrenset til, laktoseoperonpromotoren i R. coli, hybrid trp-lac UV-5 promotoren (tac) (H. DeBoer et al., In Promoter Structure and Function, (1982); R.L. Rodriguez og M.J. Champerlain, red., Praeger Publishing, New York), de venstrerettede (PL) og de høyrerettede (PR) promotorene i bakteriofag lambda, bakteriofag T7-promotorer, rrp operonpromotoren, lpp-promotoren ( R. coli lipoprotein genpromotor; K. Nakamura og I. Inouye, Cell, 18:1109-1117 (1979), etc. Andre promotorer laget ved hjelp av rekombinant DNA eller syntetiske fremgangsmåter kan også bli benyttet for å gi transkripsjon av de innsatte sekvensene.

Spesifikke startsignaler er også krevet for effektiv translasjon av innsatte proteinkodende sekvenser. Disse signalene omfatter ATG-startkodon og tilstøtende sekvenser. I tilfeller hvor de naturlige gensekvensene som koder for sitt eget startkodon og tilstøtende sekvenser er innsatt i de riktige ekspresjonsvektorene, er ingen ytterligere translasjons kontrollsignaler nødvendige. Imidlertid, i tilfeller hvor naturlige translasjonssignaler ikke er tilstede, må eksogene translasjons kontrollsignaler, inklusive ATG startkodon, bli gitt. Startkodonet må videre bli i fase med leserammen til de proteinkodende sekvensene for å sikre translasjon av hele innskuddet. Disse ytre tilførte translasjons kontrollsignaler og startkodoner kan være av en rekke typer, både naturlige og syntetiske.

Fremgangsmåte for å lage de passende ekspresjonsvektorene kan omfatte in vitrn rekombinant DNA og syntetiske fremgangsmåter og in vivn rekombinasjoner (genetisk rekombinasjon).

For oversikt med hensyn på maksimal genekspresjon, se Roberts og Lauer, Meth. Enzymol. 68:473 (1979); og W. Reznikoff og M. Gold, Maximizing Gene Expression, Plenum Press, New York (1986).

US-patent nr. 4 237 224 til Cohen og Boyer beskriver produksjon av rekombinante plasmider ved bruk av fremgangsmåter for spalting med restriksjonsenzymer og sammenbinding med DNA-ligase ved hjelp av kjente fremgangsmåter for ligering. Disse rekombinante plasmidene blir så innført ved hjelp av transformasjon og replikert i encellekulturer inklusive prokaryote organismer og eukaryote celler dyrket i vevs-kultur.

En annen fremgangsmåte for å innføre rekombinante DNA-molekyler i uni-cellulære organismer er beskrevet av Collins og Hohn i US-patent nr. 4 304 863. Denne fremgangsmåte benytter et pakke/transduksjonssystem med bakteriofage vektorer (kosmider).

Ekspresjonsvektoren som omfatter den rekombinante gensekvensen skulle så bli overført inn i en bakterie vertscelle hvor den kan replikere og bli uttrykt eller undergå betinget replikasjon. Dette kan bli utført ved hjelp av en rekke metoder kjent i feltet inklusive, men ikke begrenset til, transformasjon (f.eks. av isolert plasmid-DNA i den svekkede bakterielle vert), fagtransduksjon (Schmeiger, Mol. Gen. Genetics, 119:75

(1972)), konjugering mellom bakterievertsarter, elektroporering osv.

Produksjon i svekkede invasive bakterier

I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse blir ekspresjonsvektoren som består av purA-genet overført til en svekket invasiv bakterie, hvor den er uttrykt, og således fremkommer en bakteriestamme som er passende for bruk som levende vaksine.

En av en rekke svekkede invasive bakterier kan bli benyttet som bærer for å produsere det rekombinante gen(ene) slik at det heterogene antigen blir effektivt presentert for vertens immunsystem, i form av vaksineformuleringer fra den foreliggende oppfinnelsen. Bakterien beholder sine invasive egenskaper, men taper en stor del av sine virulente egenskaper, og gjør det mulig for dem å dele seg i verten i et begrenset omfang, men ikke så meget at det forårsaker nevneverdig sykdom eller ulempe. Eksempler på invasive bakterier som i svekket form kan bli benyttet i vaksineformuleringer i oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til, Salmonella spp., invasiv F cÆ (EIEC), og Shigella spp. I en foretrukket utførelsesform blir invasive bakterier som befinner seg i lymfoid vev slik som milten (f.eks. Salmonella spp) benyttet. Slike bakterier kan invadere tarmepitelvev og/eller Peyerske plakk og spre seg gjennom det retikuloendoteliale system, og få tilgang til mesenterialt lymfatisk vev, lever og milt, hvor de deler seg eller kan minst overleve for en tid, og sette igang humoral og celle-formidlet immunitet.

Svekkede invasive bakterier kan bli oppnådd via forskjellige fremgangsmåter inklusive, men ikke begrenset til, kjemisk mutagenese, genetisk innsetting, delesjon (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) eller rekombinant DNA-metodologi (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), laboratorieseleksjon blant naturlige mutasjoner etc. Fremgangsmåter for å oppnå svekkede Salmonella-stammer som er ikke-reverserende ikke-virulente auxotrofie mutanter som passer for bruk som levende vaksine blir beskrevet i US-patent nr. 4 550 081 (utstedt 29. oktober 1985), 4 735 801 (utstedt 5. april 1988) og 4 837 151 (utstedt 6. juni 1989), informasjonen fra disse er herved i sin helhet inntatt som referanse. En pålitelig fremgangsmåte for å oppnå svekkelse av Salmonella er blitt beskrevet (S.K. Hoiseth og B.A.D. Stocker, Nature, 291:238

(1981); B.A.D. Stocker et al., Develop. Biol. Standard, 53:47 (1982)) og kan bli benyttet som en spesiell utførelsesform innenfor oppfinnelsen.

Svekkede Salmonella som kan bli benyttet i levende vaksineformuleringer innenfor oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til de arter som er oppført i tabell 1 nedenfor.

I spesifikke utførelsesforrner har Salmanella-bakterier som er blitt svekket ved kromosomal delesjon av gen(er) for biosyntese av aromatiske forbindelser (arn), eller mutasjon i galE-genet, eller som er Cya-, Crp- eller mangler Yir-plasmidet, etc., kan bli benyttet. Am-mutanter som kan bli benyttet omfatter, men er ikke begrenset til, £L typhi-stammene 543Ty og 541 Ty, for bruk i vaksiner for humane, S typhimnriiim SL3261 og SL1479, og S enteriHitis serotype dublin SL1438 (også betegnet S HiiMin) for bruk i dyr (se US-patent nr. 4 550 081 for beskrivelse av £ typhimnriiim-stammer slik som 543Ty og 541 Ty som er avirulente i mennesker på grunn av svekkelse ved å fjerne affiserte gener am A og/eller purA (M.M. Levine et al., J. Clin. Invest. 79:888

(1987)). Mutanter av S. duhlin, slik som SL1438 og S. typhimnriiim slik som SL3261. Disse kan bli benyttet i utvikling av dyremodellsystemet, siden disse artene er i stand til å forårsake dyresykdommer som er ekvivalente til tyfoidfeber. galE-mutanter som kan benyttes omfatter, men er ikke begrenset til, Salmonella typhi-stammene Ty21a (Germanier, Bacteria Vaccines, Academic Press, NY, s. 137-165) Salmonella t yphimnriiim G30D, OSV.

Produksjon av genprodukter og anvendelser

Oppfinnelsen omhandler også fremgangsmåter for å innføre, selektere og vedlikeholde enkle eller multiple kopier for homologe og/eller heterogene gener, enten i lavkopi tallplasmider, høykopi tallplasmider eller integrert i vertens bakterielle kromosom som enkle eller multiple kopier.

Gener som kan uttrykkes kan bli oppnådd fra eukaryote kilder og kan kode for antigene determinanter fra patogene parasitter, humane immunoaktive peptider og proteiner, hormoner, vekstfaktorer, allergener, tumorforbundne antigener og andre proteiner. Slike gener kan stamme fra virale kilder og kan kode for antigene proteiner, strukturelle komponenter eller enzymer som er av betydning for viral replikasjon eller forankring. Homologe gener, såvel som hetero gener, kan stamme fra bakterielle, virale, parasitter, sopp eller pattedyrkilder og kan omfatte gener som koder for virulensfaktorer til patogene organismer, inklusive toksiner, beskyttende immunogene proteiner eller gener som koder for proteiner som har mer regulering eller syntese av antigene polysakkarider og, i tillegg, kan være enzymer som er fremmede for verts-bakterien.

Blant de bakterielle antigenene av interesse er de som er tilknyttet humane bakterielle patogener inklusive Haemnphihis influenTiaflj Fsnheridiia coli, Neisseria meningiHitiSj Streptnrn ccns pneiimoniaej £rreptom r:ciis pyogenes, Rranhamella ratarrhalis, Vihri<p> rhnlerae, CoTynehacteriiiTTi Hiphtheriap^ Chlamydia tranhnmatis, NTeisseria gonorrhf^ Rprdet<p>sHa perhissis, Pseurintrmna s aemginosa, Slraphylococcus aurens, FCIehsiella pn<p>iimnniae og C)" srridiiim tetanj Eksempler på spesifikke bakterielle antigener av interesse omfatter bakterielle proteiner der spesielt nyttige eksempler er yttermembranproteiner (f.eks. fra Haemnphilns infhiftnzafij Branhamella catarrhalis eller Neisseria meningidiris^ bakterielle toksiner (f.eks. pertussis-toksiner, difteritoksin, tetanustoksin og PsenHnmnnas exotoxin A) og bakterielle overflate-proteiner (f.eks. flagelliner, hemagluttininer og M-proteinet fra Srxeplococcus pyogenes).

Virale antigener fra patogene virus omfatter, men er ikke begrenset til human immunmangelvirus (typene I og II), human T-celle leukemivirus (typene I, II og III), respiratorisk syncytialt virus, hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C, non-A og non-B hepatittvirus, herpes simplex-virus (typene I og II), cytomegalovirus, influensavirus, parainfluensavirus, poliovirus, rotavirus, coronavirus, rubellavirus, meslingvirus, varicellavirus, Epstein Barr-virus, adenovirus, papillomavirus og gulfebervirus.

Flere spesifikke virale antigener fra disse patogene virus omfatter F-proteinet (spesielt antigener som inneholder F-peptidet 283-315, beskrevet i WO89/02935 med tittel "Respiratorisk syncytialt virus: Vaksiner og diagnostiske metoder" av Paradiso, P. et al.) og N- og G-proteiner fra respiratorisk syncytialt virus (RSV), VP4 (tidligere kjent som VP3), VP6 og VP7 polypeptider fra rotavirus, kapselglykoproteiner fra human immunmangelvirus og ytre og nær overflateantigener av hepatitt B og herpes glykoproteinene B og D.

Soppantigen som kan bli benyttet er de som stammer fra sopp inklusive, men ikke begrenset til, Candida spp. (spesielt albicans), Cryptncnccns spp. (Ctyptncoccus spp. (spesielt nenformans)., Rlastnmyces spp. (f.eks. Hermatitidis)J FTismplasma spp.

(spesielt capsnlatiim^ rnncidinides spp. (spesielt immitis), Paracnccidioides spp.

(spesielt hrasilknsis) og Aspergillns spp. Eksempler på parasittantigener omfatter, men er ikke begrenset til, Plasmndium spp., Fimeria spp., Schistosoma spp., Trypanosoma

Spp., Rahesia spp., T eishmania spp., Cr yptosporidia spp., T<py>oplasma spp. Og Pnenmocysrifi spp.

Også av interesse er forskjellige antigener forbundet med autoimmun-sykdommer, slik som reumatoid artritt og lupus erytnematosus, tumorantigener, cancer-ntigener og enkle eller multiple kopier av gener som koder for hormoner, bioaktive peptider, cytokiner, lymfokiner og vekstfaktorer, så vel som enzymer og strukturelle proteiner av prokaryot eller eukaryot opprinnelse, spesielt for bruk i vaksiner eller legemidler.

For å gi nye vaksineformuleringer, kan gener som koder for beskyttelses-ntigener bli innført i svekkede bakterier, som virker som avleveringsbærere for stimulering av immunsvar mot patogenet fra hvilke det uttrykte genet stammet. Se Dougan og Tite, Seminars in Virology 1:29 (1990). Gener som koder for antigener som stammer fra patogene bakterier, virus eller parasittkilder kan bli innført i svekkede Salmonella typni for bruk som levende vaksine i mennesker, for å beskytte mot f.eks. tyfoidfeber, diarésykdommer og seksuelt overførte sykdommer inklusive AIDS. Alternativt kan slike gener bli innført i andre Salmonella som er istand til å infisere dyrearter, f.eks. S_ dnhlin for bruk som levende svekkede kvegvaksiner (f.eks. mot shippingfeber eller storfe rotavirus), S enoleraesiiis for bruk som levende svekkede vaksiner for gris og S- gallinamm eller S pnllonim for bruk som levende svekkede vaksiner for hønseoppdrett. I en spesiell utførelsesform kan antigener som stammer fra Eimeria-parasitter bli innført i svekkede S gallinamm for å lage en oral vaksine for coccidal sykdom.

Alternativt kan gener som koder for antigener bli innført i andre bakterier for bruk som levende vaksineavleveringsbærere. Eksempler på slike kan omfatte enteroinvasive F.Kf.heri<p.>hia eoli, Yersinia e nterocolttica, Shj gejla flexneri, Shigella dysenteriae^ Campylohacøfrjejiini og Vihrio rholerae

I tillegg kan slike gener bli innført i bakterieverter for å gi effektiv produksjon av antigent materiale for vaksineproduksjon. Produksjon av naturlige eller muterte gener som stammer fra bakterielle patogener kan føre til øket og effektiv antigen-roduksjon. F.eks., genene som koder for muterte toksiner, gener som koder for virulensfaktorer eller andre naturlige proteiner eller muterte beskyttelsesimmunogener kan bli innført i homologe eller heterologe bakterielle stammer. I mange tilfeller kan virulensfaktorer eller beskyttelsesantigener bli laget effektivt bare i en spesiell vertsbakterie. I tillegg, gener som koder for produkter som har betydning i kompliserte biosyntetiske reaksjonsveier som fører til bakteriell overflatepolysakkarid eller kapselproduksjon kan ikke bli klonet på enkel måte og produsert i andre bakterier med formål å lage antigent materiale for vaksinebruk. Eksempler på slike anvendelser omfatter innføring av gener som koder for muterte kryssreagerende toksiner fra Rnrdetella perhissis i toksindefekte organismer for å produsere en kikhostevaksine.

Bakterier som har de stabile purA-plasmidene fra denne oppfinnelse kan bli benyttet som levende vaksine for å utløse et immunsvar overfor et immunogen i et varmblodig dyr. Denne fremgangsmåte omfatter tilførsel av levende vaksine til dyret, slik at bakterien som er i vaksinesammensetningen kan produsere immunogenet i en immunologisk effektiv mengde som er istand til å utløse et immunsvar. Vaksinene er anvendbare for å forhindre mikrobielle infeksjoner. Vaksinene kan bli tilført i en farmasøytisk aksepterbar bærer, slik som fysiologisk saltvann, eller etanolpolyoler (slik som glycerol eller propylenglycerol).

Vaksinene kan bli tilført til menneske eller dyr på en rekke måter. Disse omfatter intradermal, transdermal, intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs, sub-kutan, oral og intranasale veier for tilførsel. Mengden av levende svekkede bakterier som blir benyttet i en slik vaksine vil variere avhengig av naturen til antigenet som blir produsert. Justering og håndtering av etablerte doseområder er godt innenfor evnen til de som er erfarne i feltet. De levende vaksinene i den foreliggende oppfinnelse er ment for bruk i behandlingen av både unge og voksne varmblodige dyr, og spesielt i mennesker.

Det er typisk at vaksineopplegget krever tilførsel av antigen over en periode på uker eller måneder for å stimulere et "beskyttelse" immunsvar. Et beskyttende immunsvar er et immunsvar som er tilstrekkelig til å beskytte den immuniserte organisme fra produktiv infeksjon av en spesiell patogen eller patogener som vaksinen er rettet mot.

Oppfinnelsen vil bli videre illustrert ved hjelp av de følgende eksemplene:

EKSEMPLER

MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

Bakterielle stammer og plasmider

De bakterielle stammene og plasmider er beskrevet i tabell 2 nedenfor.

Medium og vekst av bakterier

Bakterier ble dyrket i M9-medium supplert med 0,5% kasaminosyrer, 0,2% glukose, 0,02% MgSO^^O, 5 /ig/ml tiamin, 1 mM natriumcitrat, 5 ug/ml nikotin-syre, 30 /ig/ml ver av fenylalanin, tyrosin og tryptofan, 10 /tg/ml 2,3-dihydroksybenzo-syre, 10 /ig/ml para-aminobenzosyre og 1 /ig/ml adenin. Skåler som inneholder 15 g agar pr. liter. Ampicillin ble tilsatt i 100 ng/ m\.

Genetisk transformasjon og transduksjon

Plasmider ble innført direkte i Salmonella ved hjelp av elektroporering med en BTX transfektor 100 med 0,5 mm elektrode og en feltstyrke på 15 kV/cm.

Plasmidkonstruksjoner som er et resultat av kobling av syntetiske oligonukleo-tider inn i plasmider ble transformert inn i vanlige laboratoriestammer av Fscherichia coli (for detaljer se Maniatis eLal, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)). Plasmidkonstruk-sjonene ble isolert og karakterisert ført i E-coJi, før de ble overført til Salmonella spp., på grunn av de høye transformasjonsfrekvensene til F coli K-12 i forhold til de i t yphimnriiim Plasmidene ble overført til S typhimnriiim LT-2 LB5010, en stamme som er restriksjons-negativ (men med modifikasjonsmuligheter) for tre restriksjons-systemer i Salmonella typhimiiriumj og også inneholder en mutasjon i galE, hvilket resulterer i høyere transformasjonsfrekvenser (for en beskrivelse av restriksjons-systemene til Salmonella typhimiirinm, se Bullas et al., J. Bacteriol. 141:275 (1980)).

Plasmider ble så satt inn i svekkede Salmonella ved hjelp av transformasjons-metoder. LB5010 som inneholdt det ønskede plasmidet ble dyrket i Luria-medium (LB) til en tetthet på 3 x 10° celler/ml, på det punktet ble D-galaktose (i endelig konsentrasjon på 1%) tilsatt vekstmediet for å stimulere syntese av "glatt" lipopoly-sakkarid (LPS). Etter 1,5 timer med vekst i nærvær av D-galaktose, ble bakteriofag P22 HT 105/1 int tilsatt kulturen i et infeksjonsforhold 1:1. Etter absorpsjon av fagen, ble cellene immobilisert i LB som inneholdt 0,7% agar. Fag ble høstet og benyttet for å overføre plasmider inn i svekkede P22-svekkede Salmonella.

Elektrooverføringsfremgangsmåte for antigenpåvisning

Heterolog rekombinant proteinsyntese ble påvist i K. coli og Salmonella vaksinestamme vertsceller ved blottingsoverføring av proteinprøver separert ved hjelp av polyakrylamid gelelektroforese til nitrocellulosemembraner, blokkering med 1,5% Tween-20 i PBS, etterfulgt av antistoffbinding i 0,1% Tween-20. Bundet antistoff ble påvist med pepperrot-peroksidase merket protein A (Kirgegaard og Perry, Gaithers-burg, MD). For påvisning av LT-B antigen, var det primære antistoffet geit a-LT-B polyklonal reagens, delvis renset ved å eluere bundet materiale fra en Sepharose 4B protein A affinitetskolonne.

Restriksjonsenzymanaryse

Horisontal gelelektroforese av DNA ble utført ved bruk av standard fremgangsmåter (Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, NY). Restriksjonsenzymene ble kjøpt fra Boehringer Manneheim (Indianapolis, IN) og New England Biolabs Inc. (Beverly, MA).

In vitro stabilitetstester

Stabilitetstester for plasmidinneholdende stammer ble utført ved bruk av fortynninger på 1:1000 fra over natts kulturer i M9-medium forsynt som beskrevet ovenfor. Fortynningene ble sådd ut i duplikater på selektive og ikke-selektive medium for å bestemme plasmidinnhold. I tillegg ble kolonier fra ikke-selektive skåler replikert ved bruk av FMC RepliPlate (Rockland, ME) på selektive skåler for å bekrefte plasmidretensj on.

Immunisering av mus

Inokulater ble dyrket i M9-medium supplert som beskrevet ovenfor til en tetthet på 3 x 10 organismer/ml som bestemt ved en Klett-Sommerson Colorimeter. Cellene ble bunnfelt ved 5000 rpm i 15 min. ved 4°C og resuspendert i 1,5% (vekt/volum) natriumbikarbonat til 2 x 10^ organismer/ml (Klett 100) for intragastrisk (mage-tilførsel) (i.g.) tilførsel og i fosfatbuffret saltvann pH 7,2 til 1 x 10 organismer/ml for intravenøs (i.v.) og intraperitoneal (i.p.) tilførsel. Seks uker gamle BALB/c hunnmus ble benyttet rutinemessig (Jackson Laboratories). Mat og vann ble tilbakeholdt i 4 timer før i.g.-inokulering og tilbakeført 30 minutter etter inokuleringen. 1x10^ organismer/ml (0,5 ml inokulum) ble tilført i.g. ved bruk av en Perfektum inkuberings-nål (10G x 2"). 1x10^ organismer/ml (0,1 ml) ble benyttet for i.v.- og i.p.-tilførsler.

Prøvesamling

Mus ble avlivet på forskjellige tidspunkter etter tilførsel. Lever, milt og 3 Peyerske plakkområder ble fjernet fra hvert dyr, plassert i individuelle sterile poser og homogenisert i 30 sekunder med en Stomacher modell 80 blander (A.J. Seward, London) ved bruk av 5 ml PBS (pH 7,2) for hver leverprøve og 2 ml for hver milt og Peyerske plakkområdeprøve.

Bakteriell kolonidannelse og plasmidstabilitet

Organhomogenatene ble sådd ut på selektive og ikke-selektive M9-medium supplert som beskrevet ovenfor for å bestemme plasmidinnehold. Kolonier dyrket på ikke-selektive skåler ble replikert på SS-agar (Difco, Detroit, Michigan) og på selektive skåler for å bekrefte prosent plasmid-inneholdende kolonier.

RESULTATER

Komplementering av purA auxotrofi i K. coli og Salmonella

Produktet av purA-genet, adenylosuksinatsyntetase (EC 6.3.4.4) katalyserer syntesen av adenylosuksinat fra inosinmonofosfat (IMP). Dette enzym katalyserer det første bestemmende trinn i syntesen av adeninmonofosfat (AMP) og er også innblandet i redningsreaksjonsveier og omdannelsen av nukleotider. Mutanter av R. colt og andre nær relaterte tarmbakterier som mangler det strukturelle genet for adenylosuksinat-syntetase (purA) avhenger av eksogent adenin eller adenosin, forsynt i næringen, for vekst.

Genet for R. coli purA blir inneholdt i 3,2 kilobasepar Kpnl restriksjons enzymfragment i plasmid pJS76 (SA. Wolfe og J.M. Smith, "Nucleotide sequence and analysis of the purA gene encoding adenylosiccinate synthetase of Rseherichia coli K12", J. Biol. Chem. 263:19147-19153 (1988)). For konstruksjon av plasmider som komplementerer enten R coli eller Salmonella purA auxotrofer, ble plasmid pJS76 (oppnådd fra John M. Smith, Seattle Biomedical Research Institute) benyttet som kilde for R coli purA genproduktet. Først ble purA-genet satt inn i pUC19 ved å ligere en butt ende 1,75 kilobasepar Accl-fragment med Dral-Smal-fragment av pUC19, som vist på diagram i fig. 1. Plasmid pPX3001 ble gjenvunnet i R. coli TX595 ved å selektere for adenin-uavhengige kolonier. Denne første konstruksjonen, pPX3001, beholdt hovedsakelig starten for replikasjon i start-pUC-vektoren og erstattet B-lakta-masegenet med purA, mens på den samme tid beholdt flere nyttige kloningsseter for videre modifikasjon av plasmidet. Dette plasmidet komplementerte effektivt purA gendefekter i R coli TX595 og resulterte i et høyt kopitall plasmid fenotype karakteristisk for pUC-plasmider.

Plasmid pPX3001 ble videre modifisert til å inneholde ytterligere uttrykt genprodukt. Genet for den atoksiske subenheten i enterotoksigenisk F- coli labil toksin (LT-B) på en 600 basepar like-endet EcoRI-Hindlll ble klonet inn i pPX3001 ved bruk av like-endet BamHI-sete, som vist i fig. 2. Denne plasmidkonstruksjon, pPX3003, ble gjenvunnet ved å transformere F cÆ TX595 og selektere adenin-uavhengige kloner som uttrykte protein gjenkjent på koloniblot ved polyklonal anti-LT-B antistoffer.

For å undersøke stabiliteten til purA-vektoren, ble plasmid pPX3001 og derivatet LT-B ekspresjonsplasmid pPX3001 transformert inn i S. dnhlin SL5653 eller inn i S typhirmirinm BB1231, derivater av Salmonella vaksinestammer som beholdt delesjonsmutasjoner i purA-genet. S^lmoneJJa-tarnsformantene ble undersøkt for nærvær av antatte plasmider ved DNA-analyse, og i tilfelle med pPX3003, for ekspresjon av LT-B. Passende isolater av hver stamme ble undersøkt for nærvær av plasmid etter passasje in vjtro under selektive og ikke-selektive betingelser. Som vist i fig. 3 ble plasmidinneholdende kolonier først dyrket under selektive betingelser, dvs. i definert medium som manglet adenin, i over-natt kulturer. Prøver fra over-natt kulturer ble vasket og fortynnet i friskt medium enten med, eller uten adeninsupplering. Etter 10 vekstgenerasjoner ble kulturene overført til samme friske medium. For hver 10. generasjons øking ble prøver tatt fra kulturene, fortynnet og sådd ut på enten selektiv eller ikke-selektiv agarmedium. Delene av kolonier som var istand til å gro på ikke-supplert medium representerer delen av kulturpopulasjonen som inneholdt en purA-komplementerende plasmid. I ikke-supplert medium inneholdt 100% av koloniene purA-komplementerende plasmider, mens bare en liten prosent av de resulterende koloniene fra passasje under adeninsupplering (ikke-selektive betingelser) inneholder plasmider etter 40 vekstgenerasjoner. Videre, i kulturer av SL5653 som inneholdt LT-B ekspresjonsplasmidet pPX3003, er LT-B produksjon og antigenisitet beholdt i kulturen som ble dyrket under selektive betingelser, men er tapt under ikke-selektive betingelser. Etter 40 generasjoner uttrykker hver av koloniene fra pPX3002/SL5653 dyrket under selektive betingelser på selektiv agar LT-B, hvilket antyder at segregering av purA og LT-B-ekspresjon ikke har funnet sted (se tabell 3 og fig. 4).

Disse resultatene indikerer at det uttrykte purA-genet på høykopitall pUC-plasmidet fungerer til å stabilisere plasmider i fravær av utenfra tilført adenin. Skjønt purA-komplementering stabiliserer et LT-B ekspresjonsplasmid injdrxn, er de bestemte plasmidene, pPX3001 og pPX3003, sannsynligvis ikke optimale forbruk i en levende Salmanella-vaksine, siden en kombinasjon av purA og/eller LT-B produksjon per se i sammenhengen ovenfor hindrer veksthastigheten til verts- Salmonella I definert saltmedium (M9) som inneholder kasaminosyrer, har pPX3001/SL5653 og pPX3003/SL5653 en fordoblingstid på 1 time, mens SL5653 dyrket i det samme medium supplert med adenin har en doblingstid på omtrent 30 minutter. Skjønt vekst-indringen ville føre til en videre svekkelse av bakterien etter oral tilførsel, er det også sannsynlig at nedsatt evne til å etablere en forbigående infeksjon i dyreverten ville resultere i nedsatt immunogenitet. Således, skjønt plasmider blir stabilisert ved komplimentering av kromosomal purA-delesjon, vil overproduksjon av kandidat-antigenet øke svekkelsen av vaksinestammen.

Det er velkjent at høykopitall pUC vektorplasmider er stabile i K. pol i og Salmonell a-stammer. Den observerte ustabiliteten til purA-derivater av pUC-plasmidene er sannsynligvis på grunn av produksjon av høyt nivå av purA genproduktet (sett som et 40K dalton protein på SDS PAGE). Vektorene i den foreliggende oppfinnelse overvinner denne farlige overproduksjon av purA-genet ved en av to fremgangsmåter: Først ved bruk av lavkopitallplasmider for å redusere purA gen kopitallet og derfor dens ekspresjon; og for det andre ved bruk av høykopitallplasmider som bærer et pur A-gen som er lite effektivt uttrykt.

Lavkopitall ekspresjonsplasmider og integrerte uttrykte gener

Resultatene ovenfor antyder at genekspresjon som er laget for å være nøytral med hensyn til in vivo vekstegenskaper i en levende Salmonella vaksinestamme, kombinert med genetisk stabilitet, kunne gi en maksimal immunogen vaksine-konfigurasjon. Passende nivåer på genproduksjon kan stå i forhold til egenskapene til det uttrykte antigenet såvel som nivået som det blir uttrykt i, i Salmonella vaksinestammen. Flere faktorer som kan influere toleranse ovenfor den bakterielle verts-stammen til antigen ekspresjon omfatter intracellulær lokalisering av antigenet, nivået på produksjon og stabilitet av antigenet vis a vis proteolytisk prosessering. Noen av disse faktorene kan til gjengjeld bli influert av transkripsjoelle og translasjonelle signaler slik som promotorstyrke, ribosom rekrutteringseffektivitet og genkopitall.

For å lage en situasjon hvor LT-B produksjon ble stabilisert av purA-komplementering og laget for å være nøytral med hensyn til Salmonella vaksinestamme-veksten, ble effekten av genkopitallet på LT-B-ekspresjon og toleranse av Salmonella-verten undersøkt. Dette ble undersøkt under flere betingelser, én av disse omfattet en lac-promotor kontrollert LT-B som var uttrykt på en lavkopitall plasmidvektor og én hvor LT-B ble uttrykt som en enkel kromosomal kopi.

For å konstruere et lavkopitall LT-B ekspresjonsplasmid, ble plasmid pGD103 (R.A. Deich et al., (1988) J. Bacteriol. 170,489-498), spaltet med EcoRI og HincII og et EcoRI-Rsal DNA-fragment som inneholdt hele den LT-B-kodende sekvensen ble kodet inn i vektoren for å gi pPX3005, en LT-B-produserende plasmid som også inneholdt en kanamycin-resistent determinant (se fig. 5). Plasmid pPX3005 ble transformert ved elektroporering inn i S. typnimurinm SL3261. Veksten av SL3261 som inneholdt pPX3005 ble sammenliknet med SL3261 som inneholdt utgangs-plasmidet og med SL3261 selv. I M9-medium som inneholdt 0,5% kasaminosyre ble ingen forskjell i veksthastigheten observert mellom de tre stammene, hver hadde en doblingstid på omtrent 45 minutter. Dette resultatet antydet at produksjonsnivået til LT-B i denne konfigurasjonen var nøytral vis a vis vekstegenskapene til verten SL3261.

En kromosomal integrerende LT-B ble oppnådd på følgende måte: Et plasmid som inneholdt en 31 base invertert repetert sekvens som stammet fra de ytterste delene av TnlO og uttrykte transposongenet til TnlO under kontroll av tac-promotoren lokalisert på utsiden av de inverterte repeterte sekvensene ble benyttet for å lage en transposon som produserte LT-B. Et 800 basepar Haell-restriksjonsenzymfragment som hadde lac promotorregionen og det strukturelle genet for LT-B ble klonet inn i transposonvektoren, som også inneholdt en kanamycin-resistent determinant. I denne konfigurasjonen ble genet for LT-B og kanamycinresistens flankert av de inverterte repeterte sekvensene. For å lage en selvmordsvektor for bruk i Salmonella-stammer ble transposonet som bar LT-B og kanamycinet krysset inn i et derivat av Xgtl 1 slik at hybridfagpartikkelen som bar LT-B-transposonet og TnlO-transposase ble konstruert. En full forklaring for denne fremgangsmåten kan bli funnet i US-serie nr. 07/590 364, innlevert 28. september 1990, denne informasjonen er herved inntatt ved referanse, og er lik de modifiserte transposonene beskrevet av Herrero etal., J. Bacteriol. 172: 6537-67 (1990). Den modifiserte A,-fag som bærer LT-B-transposonet ble benyttet for å infisere Salmonella LB5010/F112, som bar en uttrykt Arfagreseptor. Siden DNA i fag X. ikke replikerer Salmonella, vil kloner som er valgt for kanamycinresistens resultere fra transposisjon av det modifiserte transposon over på kromosomet. Flere uavhengige isolater ble oppnådd; alle produserte LT-B-antigenet. Flere av S typhimnriiim LB5010-isolatene ble beholdt, og P22 faglysater ført videre på dem ble benyttet for å overføre den kromosomlokaliserte ekspresjonskassetten inn i Salmonella vaksinestammen SL3261 LT-B. To uavhengige SL3261 LT-B kromosomalt integrerte som resulterte fra transduksjon fra to separate alleler lokalisert i forskjellige loci i Salmnnella-kromosomet, ble funnet å være Stabile in vitrn og in vivo

Konstruksjon av en lavkopitall puxA-vektor

Plasmid pGD103 ble modifisert til å inneholde E. cpli purA-genet og flere enkeltstående kloningsseter. Det 1,7 kilobasepar Accl-fragmentet til pJS76 ble satt inn i XmnI Xhol-setene til pGD103 for å gi pPX3006 (se fig. 5). I dette plasmidet ble kanamycin-resistensdeterminanten erstattet helt med purA, hvilket ga en vektor med enkeltstående BamHI, Smal, Pstl og Sall-seter.

Lavkopitall pjirA-vektor som inneholder PL-promotor ekspresjonskassetter

Plasmid pPX3006 ble benyttet som vektor for å konstruere flere lavkopitallplasmider som uttrykte genprodukter under kontroll av den sterke A. PL-promotoren. Det er ventet at visse genprodukter hvis transkripsjon er regulert av Pl-promotoren vil bli laget i vertsbakteriecellen i høye nivåer sammenliknet med gener under kontroll av svakere promotorer slik som lac-promotoren. Videre, på grunn av at Salmonella-stammer er kjent for ikke å være lysogene for bakteriofag X, vil ekspresjon av plasmidbåret PL-produserte proteiner være konstitutive. Sammen med stabilisering ved hjelp av komplementering av purA, vil slike konfigurasjoner muligens overkomme lave nivåer av genekspresjon forbundet med lavt kopitall i vektorplasmidet, pPX3006 og vil øke immunogenisiteten av levende svekkede rekombinante <S>amiojidla-stammer.

Flere versjoner av Plasmodinm herghei cirkumsporosittprotein (CS) gen ble stabilisert i pPX3006. CS-genet er blitt nevnt som en av hovedimmunogenene av malariasporosittkapselen og, som sådan, er en kandidat for subenhetbruk med tanke på en malariavaksine. Strukturene til flere CS-gener er blitt undersøkt, hvilket har vist at alle har en liknende totalstruktur. Den enkelte fremhevende evnen for hver er at de inneholder et sentralt repeterende peptid, hvilket består av opptil en tredjedel av proteinet. De repeterte områdene er immundominerende, siden hoveddelen av anti-sporosoitt antistoffer er dirigert mot disse områdene. Skjønt antistoffene til de repeterte områdene er blitt nevnt å være innblandet i beskyttelse mot sporoazittstadiet av malaria er antistoffer alene ikke tilstrekkelig for å oppnå beskyttelse mot sporozoittinfeksjon. Det er sannsynlig at beskyttelse mot sporozoittstadiet av malariaparasittene omfatter ikke bare en humoral respons, men også en sterk T-cellerespons. Mest sannsynlig kreves aktivering av cytotoksiske T-lymfocytter som gjenkjenner deler av CS-proteinet og andre proteiner i den voksne sporozoitten på overflaten til sporozoitt-infiserte hepatocytter for beskyttelse. Således er vaksiner som er laget for å stimulere disse responsene spesifikt, og sammen med humorale responser, nødvendig for å oppnå effektive malariavaksiner. Stimulering av cellulær immunitet på nivå av cytotoksiske T-celler kan bli oppnådd ved å fremvise antigenet til antigenpresenterende celler på en måte slik at de sannsynligvis blir prosessert ved hjelp av en intern prosesseirngsvei. Presentering av antigener via interne reaksjonsveier kan resultere i en foretrukket overflateproduksjon av antigenet sammen med klasse-I-begrenset MHC, vanligvis forbundet med stimulering av CD8± cytotoksiske T-celler. Produksjon av CS-proteinet av P. berghei og P faldpamm i svekkede Salmonella og deretter oral immunisering har resultert i aktivering av spesifikke CD+ cytotoksiske T-celler som gjenkjenner peptider for disse CS-proteinene. Videre, oral immunisering av mus med P berghei CS-proteinkonstruksjoner resulterte i betydelig beskyttelse mot sporozoittutfordring, hvilket vanligvis bare blir oppnådd ved vaksinering av dyr med gammabestrålt inaktiverte sporozoitter.

Skjønt beskyttelse mot sporozoittinfeksjon er blitt vist ved vaksinering med CS protein-produserende Salmonella, var beskyttelsen ufullstendig, hvilket antydet at adekvat induksjon av immunitet hadde ikke oppstått. Videre, dette antyder at faktorer som har med CS proteinproduksjon i den svekkede Salmonella vaksinestammen kan bli manipulert for øket immunogenisitet. Slike faktorer omfatter, som nevnt ovenfor, genregulerende signaler, antakelig påvirker dette nivået av proteinproduksjon, stabilitet av det uttrykte proteinet og genetisk stabilitet til det uttrykte proteinet. Hvis under for-øpet av den forbigående infeksjon på grunn av den svekkede Salmonella, en betydelig del av de immuniserende bakteriene mister plasmidet på grunn av segregering, vil effektiv immunisering ikke opptre.

For å evaluere stabiliteten til CS proteinkonstruksjonene ved komplementering av pur A, ble en full-lengde CS proteinkonstruksjon satt inn i BamHI-setet til pPX3006. Denne konstruksjon inneholder den hele kodende sekvensen til P herghei (ANKA) CS proteingenet uttrykt fra PL-promotoren og ble betegnet pPX3009 (fig. 6). En annen konstruksjon som inneholdt en trunkert CS-protein (pPX1601) uttrykt fra Pl-promotoren som et fusjonsprotein med de første 30 aminosyrene til LT-B ble satt inn i BamHI-setet til pPX3006. Denne konstruksjon inneholder en LT-B fusjonsprotein med en uttrykt del av CS-proteinet som mangler 60 aminosyrer av den N-terminale delen og 30 aminosyrer av den karboksylterminale delen. Denne konstruksjonen ble betegnet pPX3007 (fig. 6). Begge konstruksjonene ble transformert inn i S_ typhimnriiim BB1231 (ApurA), for seleksjon for purinuavhengighet. Når ekspresjon ble sammenliknet med deres tilsvarende høyere kopitall utgangsplasmider (avledet fra pBR322), ble ingen forskjell i ekspresjonsnivåer i SL3261 observert, hvilket antydet at genekspresjon ikke var koplet til genkopitall.

En tredje promotorkontrollert ekspresjonskassett ble undersøkt for stabilisering av purA-komplementering. Den kodende sekvensen for LT-B (på en 590 basepar EcoRI-Hindlll-fragment, gjort like-endet ved bruk av Klenow-enzym) ble satt inn i Hpal-setet til pPLn (Pharmacia Molecular Biologicals, Piscataway, NJ) for å gi pPX1602. Den kodende sekvensen til LT-B, nå lokalisert på et 1,7 kilobasepar BamHI-fragment ble satt inn i BamHI-setet til pPX3006<N>for å gi pPX3010 (fig. 6). Dette plasmidet ble transformert i BB1231. Ekspresjons av LT-B-antigenet ble sammenliknet på forskjellige punkter i vekstcyklus til Salmonella og ble sammenliknet med gen-integrerte former, høykopitall plasmidformer og lavkopitall plasmidformer. Maksimal genekspresjon ble sett i over natts kulturer av bakterien. Ekspresjonsnivået ble relatert til genkopitallet når ekspresjon av LT-B ble kontrollert av lac-promotoren. Produk-sjonen var størst i kulturer som inneholder pPXIOO, etterfulgt av pPX3005; med minst produksjon i kulturer av SL3261n3. Imidlertid, produksjon av LT-B fra pPX3010 gikk ut over de som ble observert i kulturer av pPXIOO, hvilket viste at sterk PL-promotor hadde overkommet genkopitall-effektene for produksjon av LT-B-antigen.

In vitrn-stahiliret av lavkopitall og kromosomal integrerende ekspresjonskassetter

S, typhimnriiim SL3261-stammer med ekspresjonskassetter på pPB322, pUC eller pSClOl-derivater ble sammenliknet for stabilitet ved dyrkning i fravær av seleksjon. Som vist i tabell 3 ble pUC vektorplasmidene eller ekspresjonsplasmidene basert på pUC-plasmider dramatisk ustabile når de ble dyrket in vitro uten ampicillin-seleksjon. Videre, et plasmid (pPX1601) som stammer fra pBR322 som uttrykte en forkortet P. berghei CS/LT-B-fusjonsprotein (beskrevet ovenfor) viste betydelig tap ved passasje av kulturene i fravær av ampicillin.

Når én av disse ekspresjonskassettene ble klonet inn i enten pGD103 eller dets purA-derivat (pPX3006) ble 100% tilbakeholdelse av ekspresjonsplasmidene observert for opptil 80 generasjoner. Dette resultatet indikerer at plasmidene basert på pSClOl-replikon er iboende stabile i S typhimnriiim Videre, at purA-genet til E_ coli er effektiv i å erstatte antibiotika-resistensdeterminanter som vanligvis er forbundet med kloningsplasmider (se tabell 4).

Plasmidvektorer som inneholder de deltakende områdene og funksjonene forbundet med pSClOl er stabile i F. coli og Salmonella under "sats-<M>kulturbetingelser. Skjønt par-regionen til pSClOl blir beholdt i pGD103 og purA-derivatene som er beskrevet her, kan fordelingsfunksjoner alene ikke være tilstrekkelig til å tillate effektiv plasmidstabilisering under fermentering av de rekombinante vaksinestammer under produksjon (Nilsson og Skogman 1986, Biotechnology 4:901-903). Plasmid-komplementering av en purA delesjonsmutasjon på kromosomet kombinert med retensjon av fordelingsfunksjonene tillater effektiv stabilisering under cellevekst, vekst under næringsbegrensende betingelser og under fermentering.

In_ma-stabilisering av Salmonella typhimurium vaksinestammer ved purA-komplementering

For å undersøke stabilisering av pSClOl-plasmider ved purA-komplementering under vaksineringsbetingelser, ble mus immunisert oralt med SL3261, BB1231 (SL3261+purA) og pPX3006/BB1231. Organprøver ble tatt og undersøkt for nærvær av de immuniserende organismene opptil 30 dager etter oralt inntak av bakterien. Som det kan sees i fig. 7, kunne BB1231 bli dyrket fra prøvene i milt, lever og peyerske områder i meget lave nivåer bare to dager etter inokulering, mens SL3261 og komple-mentert BB1231 kunne bli gjenvunnet i vevsprøver i flere uker. Den komplementene vaksinestammen ga in vivo-vekst som hadde karakteristika som var like, hvis ikke identiske, innenfor statistisk variasjon, med SL3261. Dette viser at purA-komplementering fører effektivt tilbake den kromosomale purA-delesjon til pur+-oppførsel og er effektivt nøytral overfor invasjon og bakterielle replikasjonsegenskaper i vaksinestammen.

Plasmidene basert på pSClOl blir også stabilisert in vivn. Som vist i tabell 5, til støtte for in vi tro stabiliseringsresultatene, blir plasmidene basert på pSClOl, hvorvidt de er ytterligere stabilisert ved purA-komplementering eller ikke, fullstendig stabile i organprøver som ble oppnådd opp til 29 dager etter inokulering. For disse dyrene som ble immunisert med LT-B ekspresjonsplasmidet, uttrykte alle isolatene som ble karakterisert til å inneholde plasmider, antigenet. En minoritet av organismene som ble gjenvunnet fra dyr immunisert med enten pUC-vektor eller pPXIOO inneholdt plasmid, slik at ikke noe plasmidinneholdende organismer kunne bli dyrket fra organprøven 15 dager etter inokulering. I tillegg, de dyrene som mottok en genintegrert form av LT-B viste også 100% retensjon av produksjonen (av kanamycin-resistens og LT-B).

Stabilisering av genekspresjon i S. typhi vaksinestammer

Skjønt S typhimnriiim og S. duhlin-svekkesde stammer kan bli benyttet for å bedømme immunogenisiteten i dyremodeller eller kunne bli utviklet til rekombinante vaksiner for veterinærbruk, er de ikke ideelle for bruk i mennesker som enten tyfoid-febervaksineirngsprogram eller som vektorer for å gi heterologe antigener til det humane immunsystemet. For å demonstrere nytten av purA-komplementering ble svekkede S typhi, pPX3006 og pPX3001 transformert ved elektroporering inn i aroA S^iphi-kandidat BB1354 (679 Ty +purA). Nærvær av plasmid ble bekreftet og produksjon av LT-B i pPX3010-transformanter ble bekreftet ved western blot-analyse. De to stammene ble undersøkt for vekstegenskaper: fordoblingstider for plasmid som inneholdt transformanter var lik de ikke-transformerte foreldre. De to plasmid-inneholdende stammene ble undersøkt for plasmidstabilitet in vitrn ved passasje i fravær og nærvær av adenin. Begge plasmider var 100% stabile opptil 80 generasjoner med og uten seleksjon.

S ryphi-stammer 679Ty, BB1354 og pPX3006/BB1354 ble sammenliknet for evnen til å bestå i dype vev etter parenteral inokulering. S. typhi i sin naturlige tilstand er ikke patogen for mus og infiserer ikke mus oralt. Når pPX3006/BB 1354 eller 679Ty (10 7 bakterier pr. dyr) ble benyttet for å inokulere mus, organismer gjenvunnet fra levere og milt for opptil 10 dager etter inokulering. På den annen side, BB1354 (10<7 >organismer pr. dyr) ble gjenvunnet bare i meget lave nivåer etter flere dager, hvilket viste begrenset evne for disse stammene å vokse i dyrevev. Videre, komplementering av den kromosomale purA-mangel med purA-genet på plasmid pPX3006 også komplementerer evnen av delesjonen til å vedvare i vev (se fig. 8).

Tn vivo- og rnjuJiQ-resultatene i S_ typhimurium og S. typhi aroA purA-stammer viser klart evnen til plasmid-båret purA-gen i F- coli å komplementere kromosomale mangler i disse stammene. Mer betydningsfull er komplementering av purA-defekten på en lavkopistabil plasmidvektor nøytral til in_sri<y>j>vekstoppførsel av vaksinebakte-rien. Dette peker sterkt på at rekombinante bakterier som benytter purA-komplementering skulle tillate stabil produksjon av heterologe antigener som er verdifulle for oral inokulering.

purA-gen som en markør for kromosomal integrering

For å lage flere fleksible måter å manipulere F. coli purA-genet, ble det 1,74 kilobasepar Accl-inneholdende fragmentet tilpasset forskjellige linkere for å inneholde symmetriske og enkeltstående restriksjonsseter. En linker inneholdt et enkelt restrik-sjonssete Sali; Sall-bundet purA-genet ble klonet inn i Sall-setet til pUC18. Dette plasmidet ble deretter benyttet som en kilde for purA-genet flankert av de enkeltstående Sall-setene.

En modifisert transposon ble konstruert for å inneholde både pur A-genet og LT-B

(PL-kontrollert) på den følgende måten. Fag XI12 ble først konstruert ved subkloning av BamHI-fragmentet som inneholdt PL-promotoren og det LT-B strukturelle gen fra pPX1602 inn i et transposisjonsplasmid hvor de inverterte 31 repeterte sekvensene av TnlO flankerte en kanamycin-resistens determinant. Det resulterende plasmid, betegnet pPX1584, inneholdt LT-B og kanamycin-resistens flankert av inverterte repeterte sekvenser. Den transposerbare kassetten ble krysset inn i et derivat av Xgtl 1 ved homolog rekombinasjon mellom endene til TnlO. Evnen av transposonet til å gi transposisjonshendelser ble bedømt ved transformasjon av LB5010/F112. Ekspresjon av LT-B ble bedømt i uavhengig isolat. Sali linkerbundet E. P" li purA-genet ble benyttet for å erstatte kanamycin-resistensdeterminanten til XI12 ved direkte å sub-klone biten inn i Xhol-setet til XI12 og selektert purA+-lysogener i E. cnli TX595. Det modifiserte faget inneholder purA-gen og LT-B og blir benyttet for å transformere S-t yphimnriiim LB5010 ApurA/Fl 12 eller S typhi aroA ApurA/Fl 12 til purinuavhengighet. Slike transduktanter opptrår alltid fra transposisjonen av purA og LT-B til vilkårlige steder på Salinoiieila-kromosomet.

Stammedeponering

De følgende stammene ble deponert ved (ATCC) Rockwille, Maryland, under reglene til Budapest Treaty:

De som er erfarne i feltet vil forstå, eller være istand til å forsikre seg om at ved å ikke bruke annet enn rutineekspeirmentering, kan mange tilsvarende deler i forhold til de spesifikke utførelsesformene av oppfinnelsen beskrevet her bli foretatt. Slike ekvivalenter er omfattet av de følgende krav:

Claims (22)

1. Plasmid eller fagvektor som ikke inneholder en antibiotisk resistens determinant, karakterisert ved at den er blitt stabilisert ved innsetting av DNA som inneholder purA-genet som koder for adenylosuksinatsyntetase, og at den er et lavkopitallplasmidvektor, eller et høykopitallplasmid som inneholder et nedregulert purA-gen, eventuelt at det/den ytterligere omfatter minst en annen nukleotidsekvens som koder for et antigen eller fragment av dette.

2. Vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den ytterligere omfatter minst en annen nukleotidsekvens som koder for et antigen eller fragment av dette.

3. Vektor ifølge krav 2, karakterisert ved at antigenet er et viralt antigen valgt fra gruppen som består av human immunsviktvirus (typene I og II), human T lymfocyttvirus (typene I, II og III), respiratorisk syncytialt virus, hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C, non-A og non-B hepatittvirus, herpes simplex-virus (typene I og II), cytomegalovirus, influensavirus, parainfluensavirus, poliovirus, rotavirus, coronavirus, røde hunder-virus, meslingvirus, vannkoppe-virus, Epstein Barr-virus, adenovirus, papillomavirus og gulfebervirus, et bakterielt antigen valgt fra gruppen som består av Haemnphilns inflnenyae, Escherichia coli3 Neisseria meningiditis, Sh- eptococcus pneumoniae, Streptr>nn r. cns pyogenes, Rranhamella ratarrhalis, Vihrio cholerae, Cnrynehacteriiim Hi phtheriae, Chlamydia trachnmaris, Neisseria gnnorrhea3 Bnrdetella perhissig PsenHnmnnas aeniginnsa, Straphylncnccus aureus, Klebsiella pneumoniae og Clostridium tetani, sopp eller parasittantigen eller et varmblodig dyr eller humanpatogen.

4. Plasmidvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den er en stabil lavkopitall plasmidvektor valgt fra gruppen som består av pPX3005 (ATCC 68451), pPX3006 (ATCC 68452), pPX3009 (ATCC 68612), pPX3010 (ATCC 68453) og pPX3007.

5. Plasmid ifølge kravene 1-4, karakterisert ved at det omfatter et gen som koder for et antigen som er en epitop av et malaria cirkumsporozoittprotein, som uttrykkes som del av fusjonsproteinet, som omfatter cirkumsporozoittepitopen og B-underenheten til det varmeustabile enterotoksin til F_ coli eller en del av dette protein som kombinert med cirkumsporozoittepitopen lager et immunaktivt fusjonsprotein.

6. Plasmid eller vektor ifølge kravene 1-5, karakterisert ved at det/den ytterligere omfatter et gen som koder et funksjonelt delingslocus for eksempel par B.

7.. Vektor ifølge krav 1-6, karakterisert ved at den ytterligere omfatter i det minste ett annet gen som koder for et antigen eller fragment derav.

8. PurA-bakterievert, karakterisert ved at den inneholder plasmidet eller vektoren ifølge ethvert av kravene 1-7.

9. PurA-svekket bakterie, karakterisert ved at den inneholder et stabilt plasmid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, som ikke inneholder et antibiotisk resistens locus, hvor plasmidet er en lavkopitallplasmidvektor eller et høykopitall-plasmid som inneholder et nedregulert purA-gen og hvor plasmidet inneholder et heterologt purA-gen som koder for adenylosuksinat-syntetase og minst ett annet gen som koder for et heterologt genprodukt.

10. Bakterie ifølge krav 9, karakterisert ved at den har en purA-kromosomal genmutasjon og eventuelt en kromosom mutasjon i ett eller flere gener som er funksjonelle med hensyn til biosyntese av aromatiske forbindelser, eller galaktosemetabolisme.

11. Bakterie ifølge krav 9-10, karakterisert ved at genproduktet er fra virus-, bakteriell-, sopp- eller parasitt-opprinnelse av et varmblodig eller human patogen.

12. Bakterie ifølge krav 8-11, karakterisert ved at den er en enteroinvasiv (tarminvaderende) bakterie av slekten Salmonella, Shigella, Yersinia, Rseherichia, Vibrio og Campylohacter.

13. Bakterie ifølge krav 8-12, karakterisert ved at den omfatter et gen som koder for et antigen som er en epitop av et malaria cirkumsporozoittprotein, som uttrykkes som del av fusjonsproteinet, som omfatter cirkumsporozoittepitopen og B-underenheten til det varmeustabile enterotoksin til Kr coli eller en del av dette protein som kombinert med cirkumsporozoittepitopen lager et immunaktivt fusjonsprotein.

14. Bakterie ifølge krav 9-12, karakterisert ved at den ytterligere omfatter et funksjonelt delingslocus par B.

15. Bakterie ifølge krav 9-12, karakterisert ved at den ytterligere omfatter i det minste ett annet gen som koder for et antigen eller fragment derav.

16. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at den omfatter bakterien i ett av kravene 9-12, og en fysiologisk akseptabel bærer og eventuelt adjuvans.

17. Farmasøytisk preparat ifølge krav 16, karakterisert ved at det omfatter et gen som koder for et antigen som er en epitop av et malariacirkum-sporozoittprotein, som uttrykkes som del av fusjonsproteinet, som omfatter cirkumsporozoittepitopen og B-underenheten til det varmeustabile enterotoksin til R. coli eller en del av dette protein som kombinert med cirkumsporozoittepitopen lager et immunaktivt fusjonsprotein.

18. Fremgangsmåte for å selektere og beholde bakterielle transformanter av interesse ved bruk av ikke-antibiotiske seleksjons-fremgangsmåter, karakterisert ved at den omfatter innsetting av en stabil purA-vektor ifølge krav 1 inn i vertsbakterie som mangler purA-genet, og selektivt dyrke bakterien i adenin-manglende medium og selektere for purA plasmid-inneholdende bakteriekolonier som vokser på det.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at den ytterligere omfatter et funksjonelt delingslocus for eksempel par B.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at den ytterligere omfatter i det minste ett annet gen som koder for et antigen eller et fragment derav.

21. Plasmid eller fag som ikke inneholder en antibiotisk resistensdeterminant, karakterisert ved at plasmidet eller fagen bærer et purA-gen hvis innsetting i en vertscelle kan selekteres ved dyrking av vertscellen i et medium som ikke trenger purinsupplementering.

22. Fremgangsmåte for å selektere og opprettholde bakterielle transformanter av interesse for anvendelse i en vaksine ved bruk av ikke-antibiotiske fremgangsmåter, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter innsetting av en stabil purA-vektor ifølge krav 1 inn i vertsbakterie som mangler purA-genet ifølge ethvert av kravene 8-15, og selektivt dyrke bakterien i adenin-manglende medium og selektere for purA-plasmid-inneholdende bakteriekolonier som vokser på det.