JP3320095B2 - 安定ｐｕｒＡベクターおよびそれらの使用 - Google Patents

安定ｐｕｒＡベクターおよびそれらの使用

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【政府の支持】ここに記述する研究は、部分的に、Nati
onal Institutes of Healthからの許可であるＲ４３ Ａ
Ｉ ２６９９５-０１によって支持された。政府はこの発
明に関して特定の権利を有する。
【０００２】
【発明の背景】天然に見いだされるプラスミドは分裂細
胞に分配され、その結果として、娘細胞は少なくとも１
個のコピーを受け取る。細菌のプラスミド系は、子孫細
胞にプラスミドを正確に分配することを保証するための
種々の方策を利用している。高コピー数でプラスミドを
維持すると、娘細胞が、少なくとも１個のプラスミドを
ランダムな分配で受け継ぐ可能性が増大し、その結果、
全くプラスミドを受け継いでいない子孫細胞の確立が極
めて低くなる。ランダム分配システムは、理論的には、
プラスミドを分裂細胞に分配する機能を果すことができ
るが、細胞当たり単位もしくは低コピー数で維持されて
いるプラスミドは、活性分配メカニズムに依存する必要
がある。例えば、低コピーか或は１細胞当たり１コピー
で維持されているプラスミド、例えば大腸菌のＦ因子
（incＦ１）、プラスミドのプロファージP1（incＹ）並
びにＲ１およびＮＲ１（incＦ２）は、分裂細胞集団の
中にプラスミドを維持するための活性分配システムを用
いる必要がある、と言うのは、プラスミドのランダム分
配は、１世代当たり２５％の損失率が予測されるからで
ある。更に、より高いコピー数のプラスミドのいくつか
は、多量体形成を決定させるための部位特異的レコンビ
ナーゼ（これらは、細胞中のプラスミドのコピー数を機
能的に減少させ、そして自由拡散によるランダム分配の
能力を低下させる）に依存している。
【０００３】活性を示すいくつかの分配システムが、い
くつかの科の細菌プラスミドに対して記述されてきた。
これらのシステムはいくつかの共通した特徴を有してい
る。プラスミド複製機能は、通常、プラスミドの個々の
領域に割り当てられ得る。例えばＰ１もしくはＦのプラ
スミド複製領域（rep）は独立して細胞中に維持され得
る。しかしながら、分配領域が欠失しているmini．Fも
しくはminiＰ１は不安であり、そしてランダム分配から
予測される頻度で、その集団から失われる。
【０００４】商業目的のための、異種遺伝子の細菌発現
用プラスミドベクターの開発は、広範囲に立証されてき
ている。種々のプラスミドレプリコンを基とする数多く
のクローニング用媒体が記述されており、そして大腸菌
および他の細菌中での蛋白質産生のために使用されてい
る。外来性蛋白質の発現に適切なクローニング用媒体の
開発における通常の方策は、高いか或は調節されたコピ
ー数を有する低分子量のプラスミドを設計することであ
った。このような方策は、時には、そうでない時には安
定なプラスミド遺伝をもたらす分配機能の損失を生じさ
せる。産生用有機体を構築するための、高コピー数クロ
ーニング用ベクターは、しばしば、分離不安定さを示
す。
【０００５】発酵において、宿主集団中で安定なプラス
ミド複製および遺伝を得るための、最も通常な方策は、
クローニング用媒体上に薬物耐性決定基を包含させるこ
とであった。増殖用培地に薬物を添加することで、プラ
スミドを有する細胞を選択することは可能であるが、多
くの場合、抗生物質の添加は許容されるものではない、
何故ならば、高価でありそして最終産生物中に不純物が
混入する可能性があるからである。
【０００６】発酵中に安定なプラスミド維持を達成する
ための代替方策がいくつか開発された。例えば、Ｒ１の
parＢ座位が、種々のプラスミド共通クローニング用ベ
クター中にサブクローン化された。このＲ１ parＢ領域
を含むところの、得られるプラスミドは、選択的圧力無
しで培養したとき増強された安定性を示した。同様に、
Ｆのsop領域は不安定なoriＣプラスミドを安定化させる
ことができ、そしてＰ１ parは、それ自身の分配機能が
不足しているmini-Ｆプラスミドを安定化することがで
きる。トリプトファンオペロン遺伝子を含んでいるクロ
ーニング用ベクターの安定性は、ｐＳＣ１０１のpar座
位を添加することによって増大し、そしてｐ１５ａから
誘導される不安定なマルチコピーベクター（ｐＡＣＹＣ
１８４）は、ｐＳＣ１０１のpar座位によって安定化さ
れた。他の分配領域、例えばネズミチフス菌（Salmonel
la typhimurium）の有毒プラスミドから得られる分配領
域がまた、成功裏に、クローニング用媒体を安定化する
ために使用された。
【０００７】安定なプラスミドから得られる分配領域を
添加することによって、クローニング用媒体は本質的に
安定化できるが、発酵に関しては、薬物耐性決定基がま
だ通常用いられている。薬物耐性マーカーは、プラスミ
ドを宿主細菌細胞に導入するとき便利である。二者択一
的に、プラスミドが産生する遺伝子を用いた宿主染色体
変異体の補足によって、受容体である細菌細胞にプラス
ミドを導入することもできる。補足システムは、特別な
宿主の染色体変異体の構築に依存しているが、それを用
いることで、確実に、培養培地に抗生物質を包含させる
ことができる。例えば、栄養的不足物を補足することに
よってプラスミドの安定化が得られる。ネズミチフス菌
におけるアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ（asd）のための染色体変異体の補足か、或は枯草菌
（Bacillus subtilis）におけるＤ−アラニンラセマー
ゼ変異体（dal）の補足（これらは各々、不完全な細胞
壁生合成および細胞溶解をもたらす）は、この培養物の
生細胞全てで、選択無しに安定なプラスミド遺伝をもた
らす。このasdおよびdal変異体の両方共、表現型的に、
栄養添加剤の補足によって修復できる。他方、栄養補足
によっては克服できない損失を有する宿主の必須遺伝子
に関する補足もまた、プラスミドを安定化させることが
できる。例えば、大腸菌の遺伝子ssbは、ＤＮＡ複製お
よび細胞生存力を必要としており、そしてこれは、プラ
スミド中に組み込まれたときのバイオリアクター中で発
酵を行っている間、プラスミドの無い細胞の蓄積を防止
し、そして染色体のssb欠失を補足するために使用でき
る。同様に、バリルｔＲＮＡシンセターゼのプラスミド
産生コピーは、染色体の温度敏感性バリルｔＲＮＡシン
セターゼ含有大腸菌中のプラスミドを安定化する。プラ
スミドはまた、バクテリオファージのレプレッサー遺伝
子（これが損失すると、宿主プロファージを誘発しそし
て細胞死滅をもたらす）を包含させることによって安定
化できる。
【０００８】
【発明の要約】発酵中、異種遺伝子生産物の製造で用い
られる細菌を選択および維持するためか、或は弱毒化し
た生細菌ワクチンにおける抗原産生の分離安定化で使用
するための、安定なプラスミドもしくはバクテリオファ
ージベクター系を開発した。この系は、アデニロスクシ
ネート（adenylosuccinate）シンセターゼ（purA遺伝子
生産物）のための機能的遺伝子の発現による、染色体の
欠失変異体の補足に依存している。
【０００９】選択および維持のための機能的purＡ遺伝
子生産物（アデニロスクシネートシンセターゼ）を得る
ため、３つの方法が使用できる。最初に、低コピー数の
プラスミドをベクター（これから得られる該purＡ遺伝
子の発現は、過剰のpurＡ蛋白質生産物と共にその細胞
に過度の負担を負わせることなく、染色体のpurＡ欠失
を補足するに充分である）として使用することである。
２番目の方法は、このpurＡ遺伝子を高コピー数のプラ
スミド（これからは、充分にはpurＡ遺伝子は発現され
ない）上に与えることである。これは、ダウンレギュレ
ーションする（downregulating）遺伝子発現に関して本
発明でよく知られた種々の方法のいくつかによって達成
でき、これには、転写の効率を低下させ、従ってpurＡ
の発現を低下させるプロモーターもしくはリボソーム結
合配列の部位特異的変異誘発が含まれる。３番目の方法
は、機能的purＡ遺伝子を、組み込み用ベクター、例え
ば受容体purＡ宿主内では複製することができないプラ
スミドもしくはバクテリオファージ上に与え、そしてこ
のように、該purＡベクターの組み込みを選択すること
である。
【００１０】このシステムでは、抗生物質耐性によって
細菌形質転換体を選択する必要性が回避され、そして細
菌の生ワクチン用ベクターに応用する場合、薬剤耐性遺
伝子を環境に放出することが防止され、そして公知の遺
伝メカニズムによる他の腸フローラの分配が防止され
る。本発明は、増殖およびワクチン生産、並びにワクチ
ン投与した宿主中の抗原配達段階の両方において、プラ
スミドの選択および維持か、或は弱毒化した生細菌ワク
チン用菌株へのベクター類の組み込みで有効である。
【００１１】
【発明の詳細な記述】purＡ座位における染色体欠失変
異の補足を行うための、安定なプラスミドベクターを記
述する。これらのベクターは、クローン構築中、非選択
性マーカーまたは他のパッセンジャー遺伝子を有するク
ローンを選択するための手段として使用できる。本発明
のベクターはまた、培養増幅、ワクチン用菌株製造、お
よび遺伝子生産物の単離、のための増殖中、上記クロー
ンを維持するために使用できる。
【００１２】本発明の安定なpurＡベクターは、アデニ
ロスクシネートシンセターゼを発現することができ、従
ってプリン生合成におけるいかなる欠失も修復しそして
増殖を可能にするところの、機能的purＡ遺伝子を与え
るものである。逆に、purＡ遺伝子が欠失した菌株にお
いては、細胞外アデニンもしくはアデノシンを用いた栄
養的補足によってのみプリン要求量が満足され得る。従
って、このpurＡベクターを有する細胞の増殖は、アデ
ニンが欠失した媒体中で、このプラスミドベクターの連
続した選択および維持を保証する。この宿主のpurＡ遺
伝子が欠失しているとき、これらの変異体は復帰しない
ため好適である。激しい欠失のときはより好適である、
と言うのは、これらはプラスミドpurＡと染色体との間
の広範な相同性（これは、プラスミドの染色体組み込み
をもたらし、そして発現したパッセンジャー遺伝子の損
失を伴う二重乗り換えが生じるとき、このpurＡ遺伝子
のマーカーＳＯＳを生じさせる）をなくさせるからであ
る。異種細菌源から得られる補足用purＡ遺伝子を使用
することで、このような望ましくない相同組換えが生じ
る可能頻度が低下する。
【００１３】この系はアデニロスクシネートシンセター
ゼ（purＡ遺伝子生産物）のための機能的遺伝子の発現
によって、染色体の欠失変異体を補うことに依存してい
る。このpurA座位は、弱毒化した生サルモネラおよび関
連腸管ワクチン用ベクターの設計において特に重要であ
る、と言うのは、染色体上にpurＡ変異が存在している
と弱毒化するからである。インビボで、少なくとも１個
のポリペプチド免疫原発現の遺伝情報も指定するプラス
ミドもしくはバクテリオファージベクター上にpurＡが
存在していると、ワクチン投与した宿主内で免疫原発現
が不足した有機体が現れるのを防止する。他の弱毒用座
位、例えば芳香族化合物の栄養要求性を決定する座位、
と組み合わせた時、purＡは更に弱毒化をもたらす。こ
れらの遺伝子に関する染色体欠失は、宿主内での複製能
力を弱める、何故ならば、芳香族化合物生合成に依存し
ている遊離プリン（例えばアデニンもしくはアデノシ
ン）またはビタミン前駆体（例えば葉酸）の利用度を低
くするからである。従って、aroＡおよびpurＡの両方に
欠失変異を有するネズミチフス菌は、この細菌に対して
特異的な有意の免疫応答を誘発させる点で有効でなく、
一方芳香族生合成遺伝子（例えばaroＡ）が単一欠失し
ている細菌は、免疫応答の誘発に有効である。aroＡ変
異を有するサルモネラ菌は、細胞内で、限定された度合
まで複製することができるが、追加的にpurA変異を有す
るものは、宿主内で複製することは全くできない。プラ
スミド上に存在している大腸菌のpurＡ生産物をaro pur
Ａ宿主細菌に与えることによって、この補足されたワク
チンは、Aro変異体のそれと同じインビボ増殖性を示
す。
【００１４】低コピー数プラスミド媒体、高コピー数プ
ラスミド媒体、および単一コピー染色体組み込み発生の
回復を可能にする媒体、を用いてここに、発現の選択お
よび安定化のためのいくつかの一般的方法を記述する。
低コピー数ベクターの場合、purＡ染色体欠失の補足
は、機能的分配座位も含んでいるプラスミドに追加的安
定性を与えることができる。
【００１５】本発明の高コピー数ベクターの場合、この
purＡ遺伝子を好適に変異させて、この遺伝子生産物の
発現効率を低下させ、それによって、過剰のアデニロス
クシネートシンセターゼ（purＡ）酵素が示す悪影響に
よる増殖抑制を防止する。
【００１６】purＡプラスミドベクターの構築 purＡプラスミドの構築において組換え型ＤＮＡ技術を
用いた。組換え型技術は、特定のＤＮＡ配列をＤＮＡ媒
体（ベクター）に挿入することで、宿主細胞中での複製
が可能な組換え型ＤＮＡ分子を生じさせることを伴うも
のである。この挿入されたＤＮＡ配列は、その受容体で
あるＤＮＡ媒体に対して外来性であってもよい、即ちこ
の挿入されたＤＮＡ配列およびＤＮＡベクターは、天然
では遺伝情報を交換しない有機体から誘導されるか、或
はこの挿入されたＤＮＡ配列は、全体もしくは部分的
に、合成されたものであってもよい。組換え型ＤＮＡ分
子を構築することができるいくつかの一般的方法が開発
されている。
【００１７】構築で用いる方法のいかんに拘らず、この
組換え型ＤＮＡ分子は宿主細胞に適合性を示す必要があ
る、即ちこの分子は、その宿主細胞中で自律複製可能で
あるか、或は宿主細胞の染色体もしくはプラスミドの１
つ以上に安定に組み込まれる必要がある。この組換え型
ＤＮＡ分子は、好適にはまた、所望の組換え型ＤＮＡ分
子（類）の選択を可能にするマーカー機能を有するべき
である。更に、もし適当な複製、転写、および翻訳シグ
ナルの全てがその組換え型ベクターの上に正確に配列さ
れているとしたならば、該外来性遺伝子は、例えば細胞
の発現プラスミドの場合、形質転換した細菌細胞中か、
或は組換え型ウイルスに感染したか、または適当な複製
起点を有する組換え型プラスミドを持っている許容細胞
系もしくは宿主中で、適当に発現する。
【００１８】異なる遺伝シグナルおよびプロセシングが
生じると、遺伝子発現、例えばＤＮＡ転写およびメッセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）翻訳のレベルが制御され
る。ＤＮＡの転写は、プロモーター（これは、ＲＮＡポ
リメラーゼの結合に特異的であり、それによってｍＲＮ
Ａ合成を促進するＤＮＡ配列である）の存在に依存して
いる。真核プロモーターのＤＮＡ配列は、原核プロモー
ターのものとは異なっている。更に、真核プロモーター
および付随する遺伝シグナルは、原核系では認識されな
いか、或は機能しない可能性があり、そして更に、原核
プロモーターは、真核細胞中では認識されずそして機能
しない。
【００１９】同様に、原核細胞中でのｍＲＮＡの翻訳
は、適当な原核シグナル（これは真核細胞のものとは異
なる）の存在に依存している。原核細胞中での有効なｍ
ＲＮＡ翻訳は、ｍＲＮＡ上の、Shine-Dalgarno（Ｓ／
Ｄ）配列（J. ShineおよびL. Dalgarno、 Nature、２５
４：３４-３８ （１９７５））と呼ばれるリボソーム結
合部位を必要としている。この配列は、開始コドン、即
ち通常この蛋白質のアミノ末端（ホルミル−）メチオニ
ンをコードするＡＵＧ、の前に位置しているｍＲＮＡの
短いヌクレオチド配列である。このＳ／Ｄ配列は、１６
Ｓの、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３′末端に相補
的であり、そして恐らくは、ｒＲＮＡと２倍体を形成す
ることで該リボソームの正確な位置付けを可能にするこ
とにより、リボソームへのｍＲＮＡの結合を促進してい
る。
【００２０】クローン化した遺伝子発現の成功には、充
分なＤＮＡ転写、該ｍＲＮＡの翻訳、そしてある場合に
は、この蛋白質の翻訳後修飾、を必要としている。適切
な宿主中の活性プロモーター制御下で遺伝子を発現さ
せ、そして蛋白質生産を増大させる目的で、発現ベクタ
ーが用いられてきた。
【００２１】種々の調節発現因子を用いることができ、
そしてこれらは、細菌中で活性を示す多数の適切な転写
および翻訳因子のいずれかである。例えば、組換え型遺
伝子配列の発現を意図して使用され得るプロモーターに
は、これに限定されるものではないが、大腸菌のラクト
ースオペロンプロモーター、ハイブリッドtrp-lac ＵＶ
-５プロモーター（tac）（H. DeBoer他著、 「プロモー
ターの構造および機能」（Promoter Structure and Fun
ction）、（１９８２）；R.L. RodriguezおよびM.J. Ch
amberlain編集、 Praeger Publishing, New York）、バ
クテリオファージラムダの左（ＰＬ）および右（ＰＲ）
に在るプロモーター、バクテリオファージＴ７プロモー
ター、trpオペロンプロモーター、lppプロモーター（大
腸菌のリポ蛋白質遺伝子プロモーター；K. Nakamuraお
よびI. Inouye、 Cell、１８：１１０９-１１１７ （１
９７９））などが含まれる。組換え型ＤＮＡもしくは合
成技術によって生産された他のプロモーターもまた、挿
入配列を転写するために使用されてもよい。
【００２２】特異的な開始シグナルもまた、挿入された
蛋白質コード配列の充分な翻訳を行うために必要であ
る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣
接する配列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣
接する配列をコードする未変性遺伝子配列が適当な発現
ベクター中に挿入されている場合、追加的翻訳制御シグ
ナルを全く必要としない可能性がある。しかしながら、
この未変性翻訳シグナルが存在していない場合、ＡＴＧ
開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを与える必要
がある。この開始コドンは更に、この挿入断片全体の翻
訳を保証するためには、蛋白質コード配列の読み枠を有
する相の中に在る必要がある。このような外因性翻訳制
御シグナルおよび開始コドンは、天然もしくは合成両方
の、種々の起源のものであり得る。
【００２３】適当な発現ベクターを構築するための方法
には、インビトロの組換え型ＤＮＡおよび合成技術、並
びにインビボの組換え（遺伝的組換え）が含まれる。
【００２４】遺伝子発現を最大限にするための考察に関
しては、RobertsおよびLauer、 Meth. Enzymol、６８：
４７３（１９７９）；およびW. ReznikoffおよびM. Gol
d、「遺伝子発現の最大化」（Maximizing Gene Expressi
on）、 Plenum Press、 New York（１９８６）参照。
【００２５】CohenおよびBoyerの米国特許番号４、２３
７、２２４には、制限酵素による開裂方法を用い、そし
て公知の連結反応方法によるＤＮＡリガーゼを用いた結
合によるところの、組換え型プラスミドの製造が記述さ
れている。その後、形質転換法により、これらの組換え
型プラスミドを、組織培養物中で増殖する原核有機体お
よび真核細胞を含む単細胞培養物中に導入した後、その
中で複製させた。
【００２６】組換え型ＤＮＡ分子を単細胞有機体に導入
するためのもう１つの方法が、米国特許番号４,３０４,
８６３中にCollinsおよびHohnによって記述されてい
る。この方法は、バクテリオファージベクター（コスミ
ド）を用いたパッケージング／形質導入システムを利用
している。
【００２７】組換え型遺伝子配列を含む発現ベクター
を、その後、細菌宿主細胞（ここでは、それが複製する
ことができ、そして発現するか、或は条件付きの複製を
行う）中に形質転換する必要がある。これは、本分野で
公知の多数の方法のいずれかで達成でき、これには、こ
れに限定されるものではないが、形質転換（例えば弱毒
化した細菌宿主中への単離プラスミドＤＮＡの形質転
換）、ファージ形質導入（Schmeiger、 Mol. Gen. Genet
ics、１１９：７５（１９７２））、細菌宿主種間の連
結、エレクトロポレーションなどが含まれる。
【００２８】弱毒化した侵入性細菌中での発現 本発明の好適な具体例において、purＡ遺伝子を含む発
現ベクターを、弱毒化した侵入性細菌中に転移させ、そ
こで発現させ、それにより、生ワクチンとしての使用に
適切な細菌株を生じさせる。
【００２９】種々の弱毒化した侵入性細菌のいずれかを
媒体として用いることで、組換え型遺伝子（類）を発現
させることが可能であり、その結果として、本発明のワ
クチン調剤において、有効に異種抗原を宿主免疫系に与
えることを可能にする。この細菌はそれらが有する侵入
性を維持しているが、それらが有する毒性は大部分損失
しており、従って、それらは限定された度合でのみその
宿主中で増殖することができるが、しかし有意な病気も
しくは損傷を生じさせるには不充分である。本発明のワ
クチン調剤中で使用できるところの、弱毒化された形態
の侵入性細菌の例は、これに限定されるものではない
が、サルモネラ菌種、侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ）、およ
び赤痢菌種が含まれる。好適な具体例において、脾臓の
如きリンパ組織中に存在している侵入性菌（例えばサル
モネラ菌種）が使用される。上記細菌は、腸上皮組織お
よび／またはパイエル板に侵入し、網内細胞系に渡って
広がり、そして腸管膜のリンパ組織、肝臓および脾臓に
近づくことができ、そこでそれらは一定期間繁殖もしく
は少なくとも生存し、そして体液性および細胞介在免疫
を誘発する。
【００３０】弱毒化した侵入性細菌は、種々の方法によ
って得ることができ、これらには、これに限定されるも
のではないが、化学的変異誘発、遺伝的挿入、欠失（J.
Miller、「分子遺伝学における実験」（Experiments in
Molecular Genetics）、 Cold Spring Harbor Laborato
ry、 Cold Spring Harbor、 New York）または組換え型Ｄ
ＮＡ法（T. Maniatis他、「分子クローニング、実験室マ
ニュアル」（Molecular Cloning、 A Laboratory Manua
l）、 Cold Spring Harbor、 New York）、未変性変異体
の実験室選択などが含まれる。生ワクチンとしての使用
に適切な非復帰性無毒の栄養素要求性変異体である弱毒
化サルモネラ菌株を得るための方法は、米国特許番号
４,５５０,０８１（１９８５年１０月２９日発行）、
４,７３５,８０１（１９８８年４月５日発行）および
４,８３７,１５１（１９８９年６月６日発行）（これら
の教示はその全体がここでは参照に入れられる）中に記
述されている。サルモネラ菌の弱毒化を達成するための
信頼できる方法もまた記述されており（S.K. Hoisethお
よびB.A.D. Stocker、 Nature、２９１：２３８（１９８
１）； B.A.D. Stocker他、 Develop. Biol. Standard、
５３：４７（１９８２））、そしてこれらは本発明の特
別な具体例において使用できる。
【００３１】本発明の生ワクチン調剤中で使用できる弱
毒化サルモネラ菌には、これに限定されるものではない
が、以下の表１に挙げた種が挙げられる。
【００３２】
【表１】 表１ 本発明のワクチン調剤中で使用できる弱毒形態のサルモネラ菌種＊ チフス菌（S. typhi） ネズミチフス菌（S. typhimurium） パラチフス菌Ａ（S. paratyphi Ａ） パラチフス菌Ｂ（S. paratyphi Ｂ） 腸炎菌（S. enteritidis） （例えば血細型dublin） ＊サルモネラ菌の血細型の完全な記述に関しては、Edwa
rdおよびEwing著、１９８６「腸内細菌化の分類」（Cla
ssification of the Enterobacteriaceae）第４版、 Els
evier、N.Y.参照。
【００３３】特定の具体例において、芳香族化合物生合
成のための遺伝子（類）（aro）に関する染色体欠失、
或はgalE遺伝子中の変異によって弱毒化されたサルモネ
ラ菌か、或はCya-、 Crp-であるか、或はVirプラスミド
が欠失しているサルモネラ菌などが使用できる。使用で
きるaro変異体には、これに限定されるものではない
が、ヒト用ワクチンにおける使用のためのチフス菌株５
４３Ｔｙおよび５４１Ｔｙ、そして動物における使用の
ためのネズミチフス菌株ＳＬ３２６１およびＳＬ１４７
９、並びに腸炎菌血細型dublin ＳＬ１４３８（S. dubl
inとも呼ぶ）が含まれる。（ネズミチフス菌の記述に関
する米国特許番号４,５５０,０８１を参照にして、５４
３Ｔｙおよび５４１Ｔｙの如き菌株は、遺伝子aroＡお
よび／またはpurA（M.M. Levine他、 J. Clin. Inves
t.、７９：８８８（１９８７））に影響を与える欠失に
よる弱毒化によって、ヒトに対して無発病性を示す。）
S. dublin、例えばＳＬ１４３８、およびネズミチフス
菌、例えばＳＬ３２６１の変異体は、動物をモデルとす
るシステムの開発で使用できる、と言うのは、これらの
種は、腸チフスに類似した動物病を生じさせることがで
きるからである。使用できるgalE変異体には、これに限
定されるものではないが、チフス菌株Ｔｙ２１ａ（Germ
anier、 Bacteria Vaccines、 Academic Press、 NY、１３
７-１６５頁）、ネズミチフス菌G30Dなどが含まれる。
【００３４】遺伝子生産物の発現および使用 本発明はまた、低コピー数プラスミドもしくは高コピー
数プラスミド中に在るか、或は単一もしくは多数コピー
として宿主細菌の染色体に組み込まれいるところの、同
種および／または異種遺伝子の単一もしくは複数コピー
を、導入、選択および維持するための方法にも関する。
【００３５】発現可能な遺伝子は、真核源から誘導で
き、そして病原性寄生虫、ヒト免疫活性ペプチドおよび
蛋白質、ホルモン類、成長因子、アレルゲン、腫瘍関連
抗原および他の蛋白質から得られる抗原決定基をコード
することができる。上記遺伝子は、ウイルス源から誘導
でき、そして抗原性蛋白質、構造構成要素、或はウイル
ス複製もしくは付着に伴う酵素、をコードすることがで
きる。同種遺伝子並びに異種遺伝子が、細菌、ウイル
ス、寄生虫、菌・カビまたは哺乳動物源から誘導でき、
そしてこれらには、毒素、保護免疫原生蛋白質、或は抗
原性多糖類材料の調節もしくは合成に伴う蛋白質をコー
ドする遺伝子、を含む病原性有機体の毒性因子をコード
する遺伝子が含まれ、そしてこれらは更に、この宿主細
菌に対して外来性の酵素であってもよい。
【００３６】興味の持たれている細菌抗原の中には、イ
ンフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、大腸菌
（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningit
idis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、
化膿連鎖球菌（Streptococcuspyogenes）、カタル球菌
（Branhamella catarrhalis）、コレラ菌（Vibrio chol
erae）、ジフテリア菌（Corynebacteria diphtheria
e）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomati
s）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、百日咳菌（Bord
etella pertussis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginos
a）、黄色ぶどう球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎
かん菌（Klebsiella pneumoniae）および破傷風菌（Clo
stridium tetani）を含むヒト細菌病原体に関連した抗
原がある。興味の持たれている特定の細菌抗原の例には
細菌の蛋白質が含まれ、その特に有益な例は、膜外蛋白
質（例えばインフルエンザ菌、カタル球菌または髄膜炎
菌から得られる）、細菌毒素（例えば百日咳毒素、ジフ
テリア毒素、破傷風毒素およびプソイドモナス外毒素
Ａ）および細菌表面蛋白質（例えばフラゲリン類、血球
凝集素類および化膿連鎖球菌からのＭ蛋白質）である。
【００３７】病原性ウイルスからのウイルス抗原には、
これに限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイル
ス（Ｉ型およびＩＩ型）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス
（Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）、呼吸シンシチウムウ
イルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａ型および
非Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（Ｉ型およ
びＩＩ型）、シトメガロウイルス、インフルエンザウイ
ルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、
ロタウイルス、コロナウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウ
イルス、水痘ウイルス、エプスタイン・バール（Epstei
n Barr）ウイルス、アデノウイルス、乳頭腫ウイルスお
よび黄熱病ウイルスが含まれる。
【００３８】これらの病原性ウイルスのいくつかの特異
的ウイルス抗原には、呼吸シンシチウムウイルス（ＲＳ
Ｖ）のＦ蛋白質［特に、Paradiso, P.他の、表題が「呼
吸シンシチウムウイルス：ワクチンおよび診断方法」
（Respiratory Syncytial Virus: Vaccines and Diagno
stic Assays)のＷＯ８９／０２９３５内に記述されてい
るＦペプチド２８３−３１５を含有している抗原］、Ｎ
およびＧ蛋白質、ロタウイルスのＶＰ４（従来ＶＰ３と
して知られている）、ＶＰ６およびＶＰ７ポリペプチ
ド、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖蛋白質、Ｂ
型肝炎の表面およびプレ表面抗原、そしてヘルペス糖蛋
白質ＢおよびＤが含まれる。
【００３９】使用できる菌・カビ抗原は、これに限定さ
れるものではないが、カンジダ種（特にアルビカン
ス）、クリプトコックス種（特にネオフォルマンス）、
ブラストミヤス種（例えばデルマティティス）、ヒスト
ルプズマ種（特にカプスラーツム）、コクシジオイデス
種（特にイミティス（immitis））、パラコクシジオイ
デス種（特にブラジル）およびアスペルギスル種を含む
菌・カビから誘導される抗原である。寄生虫抗原の例に
は、これに限定されるものではないが、プラスモディウ
ム種、アイメリア種、住血吸虫種、トリパノソーマ種、
バベシア種、リーシュマニア種、クリプトスポリジア種
（Cryptosporidia spp.）、トキソプラスマ種およびニ
ューモシスティス種が含まれる。
【００４０】また興味の持たれているものは、自己免疫
疾患、例えば慢性関節リウマチおよびエリテマトーデス
に関連した種々の抗原、腫瘍抗原、癌抗原、そしてホル
モン、生活性ペプチド、シトキン、リンホカインおよび
成長因子をコードする遺伝子の単一もしくは複数コピ
ー、並びに特にワクチンもしくは治療薬における使用の
ための、原核もしくは真核源の酵素および構造蛋白質で
ある。
【００４１】新規なワクチン調剤を得る目的で、保護用
抗原をコードする遺伝子が、弱毒化した細菌の中に導入
でき、これらは、発現遺伝子を誘導させる病原体に対す
る免疫応答を刺激するための配達媒体として働く。Doug
anおよびTite、 Seminars inVirology １：２９（１９９
０）参照。病原性細菌、ウイルスもしくは寄生虫源から
誘導される抗原をコードする遺伝子を、ヒトに関する生
ワクチンとして使用するための弱毒化したチフス菌中に
導入することで、例えば腸チフス、下痢およびエイズを
含む性伝達病に対する保護を与えることができる。二者
択一的に、上記遺伝子を、動物種に感染し得る他のサル
モネラ菌、例えばウシ用の弱毒化生ワクチン（例えば船
積熱またはウシロタウイルスに対する）として使用する
ためのS. dublin、ブタ用の弱毒化生ワクチンとして使
用するためのブタコレラ菌、そして家禽用の弱毒化生ワ
クチンとして使用するためのトリチフス菌もしくはS. p
ullorum、中に導入できる。特別な具体例において、ア
イメリア寄生虫から誘導される抗原を弱毒化トリチフス
菌に導入することで、コクシジア病用経口ワクチンを製
造することができる。
【００４２】二者択一的に、抗原をコードする遺伝子を
他の細菌に導入することで、生ワクチン配達用媒体とし
て使用することもできる。上記の例には、腸侵入性大腸
菌、エルジニア・エンテロコリチカ（Yersinia enteroc
olitica）、フレクスナー赤痢菌、志賀赤痢菌、カンピ
ロバクテル・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）およ
びコレラ菌が含まれる。
【００４３】更に、上記遺伝子を細菌宿主中に導入する
ことで、ワクチン製造のための抗原性材料を有効に産生
させることができる。細菌病原体から誘導される天然も
しくは変異遺伝子の発現は、増強されたか効率良い抗原
産生をもたらすことができる。例えば、変異毒素をコー
ドする遺伝子、毒性因子もしくは他の天然蛋白質もしく
は変異保護用免疫原をコードする遺伝子を、同種もしく
は異種細菌株中に導入することができる。多くの場合、
毒性因子もしくは保護用抗原は、特別な宿主細菌中での
み有効に産生され得る。更に、細菌の表面多糖類もしく
はきょう膜生産をもたらす複雑な生合成過程に必要な生
産物をコードする遺伝子は、ワクチン用途のための抗原
材料を製造するための他の細菌中では、容易にクローン
化することはできない。上記用途の例には、百日咳ワク
チン製造のため、百日咳菌毒素を交差反応させる変異体
をコードする遺伝子を、毒素欠失有機体中に導入するこ
とが含まれる。
【００４４】本発明の安定なpurＡプラスミドを有する
細菌は、温血動物中の免疫原に対する免疫応答を引き出
すための生ワクチンとして使用することができる。この
方法は、免疫応答を引き出すことができる免疫学的有効
量で、このワクチン組成物中に含まれている細菌が免疫
原を発現できるような動物に生ワクチンを投与すること
から成る。このワクチンは微生物感染の予防に対して有
益である。これらのワクチンは、薬学的に許容される媒
体、例えば生理食塩水、或はエタノールポリオール類
（例えばグリセロールまたはプロピレングリコール）中
に入れて投与され得る。
【００４５】これらのワクチン類は、種々の方法でヒト
もしくは動物に投与され得る。これらには、皮内、経
皮、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、経口および鼻孔内
投与ルートが含まれる。上記ワクチンで用いられる弱毒
化生細菌の量は、発現された抗原の識別に応じて変化さ
せ得る。確立された服用範囲を調節および操作すること
は、本分野の技術者の能力の範囲内である。本発明の生
ワクチン類は、未成熟および成熟両方の温血動物、特に
ヒトの治療における使用を意図したものである。典型的
に、予防接種食餌法は、「保護」免疫応答を刺激するた
めに数週間から数カ月の期間に渡る抗原投与を必要とし
ている。保護免疫応答は、ワクチンに対して特異性を示
す特別な病原体もしくは病原体類による生産力のある感
染から、免疫化した有機体を保護するに充分な免疫応答
である。
【００４６】本発明の範囲を制限することを意図したも
のではない以下に示す実施例により
【００４７】本発明を更に説明する。
【実施例】材料および方法 細菌株およびプラスミド 細菌株およびプラスミドを以下の表２に記述する。
【００４８】
【表２】 培地および細菌の増殖 ０．５％のカザミノ酸、０．２％のグルコース、０．０
２％のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５μｇ／ｍＬのチアミン、
１ｍＭのクエン酸ナトリウム、５μｇ／ｍＬのニコチン
酸、各々３０μｇ／ｍＬのフェニルアラニン、チロシン
およびトリプトファン、１０μｇ／ｍＬの２，３−ジヒ
ドロキシ安息香酸、１０μｇ／ｍＬのパラ−アミノ安息
香酸および１μｇ／ｍＬのアデニンを補充したＭ９培地
中で細菌を増殖させた。プレートに１リットル当たり１
５ｇの寒天を含有させた。１００μｇ／ｍＬでアンピシ
リンを添加した。
【００４９】遺伝的形質転換および形質導入 ０．５ｍｍの電極および１５ｋＶ／ｃｍの電界強度のBT
X Transfector 100を用いたエレクトロポレーションに
より、直接プラスミドをサルモネラ菌に導入した。
【００５０】プラスミドと合成オリゴヌクレオチドとの
結合によって得られるプラスミド構築物を、形質転換
（詳細には、Maniatis他、「分子クローニング、実験室
マニュアル」（Molecular Cloning、 A Laboratory Manu
al）、 Cold Spring Harbor Laboratory、 Cold Spring H
arbor、 New York（１９８２）を参照）により、大腸菌
の通常実験室菌株中に挿入した。プラスミド構築物を単
離した後、サルモネラ菌種に転移させるに先立って、最
初に大腸菌中で特徴づけした、と言うのは、ネズミチフ
ス菌に対して大腸菌Ｋ-１２は高い形質転換頻度を有し
ているからであった。プラスミドを、ネズミチフス菌Ｌ
Ｔ-２ ＬＢ５０１０に転移させたが、この菌株は、ネズ
ミチフス菌が有する３つの制限システムのため、制限陰
性を示し（しかし修飾を受け易い）、そしてまたgalＥ
に変異を有しており、その結果高度の形質転換頻度生じ
させる（ネズミチフス菌の制限システムに関する記述に
関しては、Bullas他、 J. Bacteriol.、１４１：２７５
（１９８０）を参照）。
【００５１】次に、形質導入技術により、プラスミドを
弱毒化サルモネラ菌に挿入した。所望プラスミドを有し
ているＬＢ５０１０を、ルリアブロス（ＬＢ）中で、３
×１０8個細胞／ｍＬの密度になるまで増殖させ、この
時点で、この増殖用培地にＤ−ガラクトース（最終濃度
１％）を添加することで、「スムースな」リポ多糖（Ｌ
ＰＳ）の合成を誘発させた。Ｄ−ガラクトース存在下で
の増殖を１．５時間行った後、この培養物にバクテリオ
ファージＰ２２ ＨＴ １０５／１ intを添加して、これ
の多数感染を生じさせた。このファージの吸収に続い
て、０．７％の寒天が入っているＬＢ中に細胞を固定化
した。ファージを収穫した後、弱毒化Ｐ２２敏感性サル
モネラ菌中にプラスミドを形質導入するために用いた。
【００５２】抗原検出のための電気転移法 ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した蛋白
質サンプルをニトロセルロース膜上にトランスブロッテ
ィングし、ＰＢＳ中１．５％のTween-２０を用いたブロ
ック化に続く、０．１％のTween-２０中での抗体結合に
よって、異種組換え型蛋白質の合成を大腸菌およびサル
モネラ菌ワクチン用菌株宿主細胞中で検出した。結合し
た抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼ標識した蛋白質
Ａ（KirkegaardおよびPerry、 Gaithersburg、 MD）を用
いて検出した。ＬＴ-Ｂ抗原を検出するための主要抗原
は、ヤギα-ＬＴ-Ｂ多クローン試薬（Sepharose ４Ｂ蛋
白質Ａアフィニティーカラムから結合材料を溶離させる
ことによって部分精製した）であった。
【００５３】制限酵素分析 標準方法（Maniatis他、「分子クローニング」、Cold Sp
ring Harbor、ＮＹ）を用いて、ＤＮＡの水平ゲル電気
泳動を行った。制限酵素は、Boehringer Mannhiem (Ind
ianapolis、 ＩＮ）およびNew England Biolabs Inc. (B
everly、ＭＡ）から購入した。
【００５４】インビトロ安定性試験 プラスミド含有菌株に関する安定性試験を、上述したよ
うに補充したＭ９培地中で一晩培養したものから得られ
るものを１：１，０００に希釈して用いることで行っ
た。希釈物を、重複して、選択的および非選択的培地上
に置き、プラスミド保持率を測定した。更に、非選択的
プレートから得られるコロニーを、FMC RepliPlate（Ro
ckland、 ＭＥ）で選択的プレート上に複製させて、プラ
スミド保持率を確認した。
【００５５】マウスの免疫化 上述したように補充したＭ９培地中で接種物を増殖さ
せ、Klett-Sommerson比色計で測定して３×１０8個有機
体／ｍＬの密度にした。細胞を、４℃で１５分間、５０
００ｒｐｍでペレット化した後、腸内（i.g.）接種用と
して２×１０10個有機体／ｍＬ（Klett １００）になる
ように１．５％（ｗ／ｖ）重炭酸ナトリウム中に懸濁さ
せ、そして静脈内（i.v.）および腹こう内（i.p.）接種
用として１×１０7個有機体／ｍＬになるように燐酸塩
緩衝食塩水ｐＨ７．２中に懸濁させた。常法に従い６週
目のBALB/cメスマウスを用いた（Jackson Laboratorie
s）。i.g.接種に先立って４時間、食餌および水を控
え、そして接種後３０分で元に戻した。Perfektum挿管
針（１８Ｇ×２″）を用い、i.g.で、１×１０10個有機
体／ｍＬ（０．５ｍＬの接種物）を投与した。１×１０
6個有機体／ｍＬ（０．１ｍＬ）を、i.v.およびi.p.接
種で用いた。
【００５６】標本採取 接種後種々の時点でマウスをと殺した。各々の動物から
肝臓、脾臓および３枚のパイエル板を取り出し、個々の
無菌バッグ中に入れ、肝臓サンプル各々に対しては５ｍ
ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いそして脾臓およびパイ
エル板サンプル各々に対しては２ｍＬを用いて、Stomac
herモデル８０ブレンダー（A.J. Seward、 London）で３
０秒間均一化した。
【００５７】細菌のクローン化およびプラスミド安定性 上述したように補充した選択的および非選択的Ｍ９培地
上に器官均一物を置くことで、プラスミド保持率を測定
した。非選択的プレート上で増殖するコロニーを、ＳＳ
寒天（Difco、 Detroit、 Michigan）および選択的プレー
ト上に複製させることで、プラスミド含有コロニーのパ
ーセントを確認した。
【００５８】結果 大腸菌およびサルモネラ菌中におけるpurA栄養素要求性
の補足 このpurA遺伝子の生産物、即ちアデニロスクシネートシ
ンセターゼ（EC ６.３.４.４）は、一燐酸イノシン（Ｉ
ＭＰ）からのアデニロスクシネートの合成を触媒する。
この酵素は、一燐酸アデニン（ＡＭＰ）の合成における
第一段階を触媒し、そしてまたサルベージ経路およびヌ
クレオチドの相互変換も伴う。大腸菌の変異体、そして
アデニロスクシネートシンセターゼのための構造遺伝子
（purＡ）が欠失しているところの、他の密接に関連し
た腸管細菌は、増殖のために栄養学的に供給された外因
性アデニンもしくはアデノシンに依存している。
【００５９】大腸菌purＡのための遺伝子は、プラスミ
ドｐＪＳ７６中の３．２キロベースペアから成るKpnI制
限酵素フラグメント内に含まれている（Wolfe, S.A.お
よびJ.M. Smith著、「大腸菌Ｋ１２のアデニロスクシネ
ートシンセターゼをコードするpurＡ遺伝子のヌクレオ
チド配列および分析」（Nucleotide sequence and anal
ysis of the purA gene encoding adenylosuccinate sy
nthetase of Escherichiacoli Ｋ１２）、J. Biol. Che
m. ２６３：１９１４７-１９１５３（１９８８））。大
腸菌もしくはサルモネラ菌のpurＡ栄養素要求性を補足
するプラスミドを構築する目的で、大腸菌purA遺伝子生
産物の給源としてプラスミドｐＪＳ７６（John M. Smit
h、 Seattle Biomedical Research Instituteから入手）
を用いた。最初に、図１に図式するように、平滑断端を
有する１．７５キロベースペアのAccIフラグメントにｐ
ＵＣ１９のDraI-SmaIフラグメントを結合させることに
よって、purＡ遺伝子をｐＵＣ１９中に挿入した。アデ
ニン独立コロニーを選択することによって、大腸菌ＴＸ
５９５中でプラスミドｐＰＸ３００１を回収した。この
最初の構築物ｐＰＸ３００１は、本質的に、出発ｐＵＣ
ベクターの複製起点を保持しており、そしてβ−ラクタ
マーゼ遺伝子がpurＡで置換されている一方、同時に、
このプラスミドを更に修飾するに有益なクローニング部
位をいくつか維持していた。このプラスミドは、大腸菌
ＴＸ５９５中のpurＡ遺伝子欠失を有効に補足し、そし
てｐＵＣプラスミドの高コピー数プラスミド表現型特性
を生じさせた。
【００６０】プラスミドｐＰＸ３００１を更に修飾し
て、追加的に発現する遺伝子生産物を含有させた。６０
０個の塩基対から成る平滑断端EcoRI-HindIII上の、腸
中毒原性（enterotoxigenic）大腸菌の不安定毒素の無
毒サブユニットのための遺伝子（ＬＴ-Ｂ）を、図２に
示すように、平滑断端BamHI部位を用いてｐＰＸ３００1
中にクローン化した。大腸菌ＴＸ５９５を形質転換した
後、コロニーブロット上の、多クローン型抗ＬＴ-Ｂ抗
体が認識する蛋白質を発現したアデニン独立クローンを
選択することによって、このプラスミド構築物ｐＰＸ３
００３を回収した。
【００６１】purＡベクターの安定性を試験する目的
で、プラスミドｐＰＸ３００１、および誘導ＬＴ-Ｂ発
現プラスミドｐＰＸ３００３を、S. dublin ＳＬ５６５
３またはネズミチフス菌ＢＢ１２３１、即ちpurA遺伝子
中に欠失変異を有するサルモネラ菌ワクチン用菌株の誘
導体、中に形質転換した。サルモネラ菌形質転換体を、
ＤＮＡ分析により、予測されるプラスミドの存在に関し
て試験し、そしてｐＰＸ３００３の場合、ＬＴ-Ｂの発
現に関して試験した。菌株各々の適切な単離物を、選択
的および非選択的条件下インビトロで、継代後のプラス
ミドの保持率に関して試験した。図３中に示すように、
プラスミド含有コロニーは、最初、選択的条件下、例え
ばアデニンが欠失している限定培地中で、一晩培養物中
に増殖させた。一晩培養物中のサンプルを洗浄した後、
アデニンの補充有り無しで、新鮮な培地中に希釈した。
１０世代から成る増殖後、培養物を同様な新鮮培地に移
した。１０世代増分各々で、これらの培養物からサンプ
ルを取り出し、希釈した後、選択的もしくは非選択的寒
天培地どちらかの上に置いた。補充しなかった培地上で
増殖し得るコロニーの集団は、purA補足用プラスミドを
含む培養集団の一部を表している。補足しなかった培地
中、コロニーの１００％がpurＡ補足用プラスミドを含
んでおり、一方アデニン補充下（非選択的条件下）の継
代から得られるコロニーに関しては、４０世代から成る
増殖後でも、プラスミドを含有しているものは低パーセ
ントのみであった。更に、ＬＴ-Ｂ発現プラスミドｐＰ
Ｘ３００３を含んでいるＳＬ５６５３の培養物におい
て、ＬＴ-Ｂ発現および抗原性は、選択的条件下で増殖
させた培養物中では保持されているが、非選択的条件下
では損失した。４０世代後、選択的寒天上で現れるとこ
ろの、選択的条件下で増殖させたｐＰＸ３００３／ＳＬ
５６５３から得られるコロニーの各々は、ＬＴ-Ｂを発
現し、このことは、purＡとＬＴ-Ｂ発現の分離がないこ
とを示している。（表３および図４参照。）
【００６２】
【表３】 これらの結果は、高コピー数ｐＵＣプラスミド上に存在
している発現purＡ遺伝子は、外因性アデニン補充無し
でプラスミドを安定化させる機能を有することを示して
いる。purＡ補足は、インビトロでＬＴ-Ｂ発現プラスミ
ドを安定化したが、特別なプラスミドｐＰＸ３００１お
よびｐＰＸ３００３は、サルモネラ菌生ワクチンでは、
同様に最適には有効でない、と言うのは、本質的に上記
配置でのpurＡおよび／またはＬＴ-Ｂ発現組み合わせは
宿主サルモネラ菌の増殖速度を妨げるからである。カザ
ミノ酸が入っている限定塩培地（Ｍ９）中、ｐＰＸ３０
０１／ＳＬ５６５３およびｐＰＸ３００３／ＳＬ５６５
３は１時間から成る倍化時間を有しており、一方アデニ
ンを補充した同じ培地中で増殖させたＳＬ５６５３は、
約３０分の倍化時間を有していた。増殖速度の低下は、
経口食餌後、この細菌の更に一層の弱毒化を生じさせる
が、宿主動物中の一過性感染を確立する能力を減少させ
ると免疫原性の低下をもたらすことも有り得る。従っ
て、染色体のpurA欠失の補足によってプラスミドを安定
化することはできるが、候補となる抗原を過剰に発現さ
せると、ワクチン用菌株を過剰に弱毒化することにな
る。
【００６３】高コピー数ｐＵＣベクタープラスミドは大
腸菌およびサルモネラ菌株中で安定であることはよく知
られている。このｐＵＣプラスミドのpurＡ誘導体に関
する観察された不安定さは、恐らくは、高レベルのpur
Ａ遺伝子生産物の発現によるものであろう（ＳＤＳ Ｐ
ＡＧＥ上、４０Ｋダルトンから成る蛋白質として現れて
いる）。本発明のベクター類は、次の如き２つの方法の
１つによって、悪影響を与えるこのpurＡ遺伝子過剰発
現に打ち勝つことができる。最初に、低コピー数のプラ
スミドを用いることで、purＡ遺伝子のコピー数を減少
させ、それによってその発現を低下させること、そして
２番目として、充分には発現しないpurＡ遺伝子を有す
る高コピー数プラスミドを使用することによる。
【００６４】低コピー数の発現プラスミドおよび組み込
まれた発現遺伝子 上の結果は、遺伝的安定性と共に、サルモネラ菌の生ワ
クチン用菌株のインビボ増殖性に対して中性を示すよう
にした遺伝子発現は最大限の免疫原性を示すワクチン配
置をもたらすことを示唆している。遺伝子発現の適当な
レベルは、本来、発現した抗原の特性、並びにサルモネ
ラ菌ワクチン用菌株でそれが発現するレベルに関係して
いる可能性がある。抗原発現に対する細菌宿主菌株の寛
容性に影響を与え得るいくつかの因子には、この抗原の
細胞内位置、蛋白質分解プロセシングに対するこの抗原
の発現および安定性レベルが含まれる。これらの因子の
いくつかは、逆に、転写および翻訳シグナル、例えばプ
ロモーター強度、リボソーム補充効率および遺伝子コピ
ー数、の影響を受ける可能性がある。
【００６５】ＬＴ-Ｂ発現がpurＡ補足によって安定化さ
れそしてサルモネラ菌ワクチン用菌株の増殖に対して中
性を示すようにした状態を作り出す目的で、サルモネラ
菌宿主によるLT-B発現および寛容性に対する遺伝子コピ
ー数の効果を試験した。これは、いくつかの条件下で試
験し、その１つでは、lacプロモーターで制御したＬＴ-
Ｂを低コピー数プラスミドベクター上で発現させ、その
１つでは、ＬＴ-Ｂを単一染色体コピーとして発現させ
た。
【００６６】低コピー数のＬＴ-Ｂ発現プラスミドを構
築するため、プラスミドｐＧＤ１０３（R.A. Deich他、
（１９８８） J. Bacteriol. １７０：４８９-４９８）
をEcoRIおよびHincIIで消化させた後、ＬＴ-Ｂコード配
列全体を含んでいるEcoRI RsaI ＤＮＡフラグメントを
該ベクター中にクローン化して、ｐＰＸ３００５、即ち
カナマイシン耐性決定基も含んでいるＬＴ-Ｂ発現プラ
スミドを得た（図５参照）。エレクトロポレーション
で、プラスミドｐＰＸ３００５をネズミチフス菌ＳＬ３
２６１中に形質転換した。ｐＰＸ３００５を有するＳＬ
３２６１の増殖を、親プラスミドを有するＳＬ３２６１
および正規ＳＬ３２６１と比較した。０．５％のカザミ
ノ酸が入っているＭ９培地中、これらの３種の菌株の間
でいかなる増殖速度の差も見られず、各々は約４５分の
倍化時間を有していた。この結果は、この配置でのＬＴ
-Ｂ発現レベルは、宿主ＳＬ３２６１の増殖特性に対し
て中性を示すことを示唆していた。
【００６７】次のようにしてＬＴ-Ｂの染色体インテグ
ラント（integrant）が得られた。Tn１０の最先端から
誘導された３１個の塩基から成る逆方向反復と、この逆
方向反復配列の外側に在るtacプロモーター制御下のTn
１０の発現トランスポゾン遺伝子と、を含んでいるプラ
スミドを用いて、ＬＴ-Ｂを発現するトランスポゾンを
作り出した。lacプロモーター領域と、ＬＴ-Ｂのための
構造遺伝子と、を有しているところの、８００個の塩基
対から成るHaeII制限酵素フラグメントを、カナマイシ
ン耐性決定基も有している該トランスポゾンベクター中
にクローン化した。この配置において、ＬＴ-Ｂおよび
カナマイシン耐性のための遺伝子を逆方向反復配列に隣
接させた。サルモネラ菌株で使用するための自己不活化
ベクターを作り出す目的で、ＬＴ-Ｂおよびカナマイシ
ンを有する該トランスポゾンを、λgt11の誘導体中に交
雑させ、その結果として、該ＬＴ-ＢトランスポゾンとT
n１０トランスポザーゼとを有するハイブリッドファー
ジ粒子を構築した。この技術に関する充分な説明は、１
９９０年９月２８日出願した米国連続番号０７／５９
０，３６４（この教示はここでは参照にいれられる）中
に見い出すことができ、そしてこれは、Herrero他、J.
Bacteriol. １７２：６５３７-６７ （１９９０）が記
述している修飾トランスポゾンと同様である。発現した
λファージレセプタを有するサルモネラ菌ＬＢ５０１０
／Ｆ１１２を感染させるため、該ＬＴ-Ｂトランスポゾ
ンを有する修飾λファージを用いた。ファージλのＤＮ
Ａはサルモネラ菌中では複製しないため、該修飾トラン
スポゾンを該染色体上に転位させることで、カナマイシ
ン耐性に対して選択したクローンが得られる。いくつか
の独立単離体が得られ、そして全てがＬＴ-Ｂ抗原を発
現した。ネズミチフス菌ＬＢ５０１０単離体のいくつか
が保持され、そしてそれらの上に繁殖させたＰ２２ファ
ージ溶解物を用いて、染色体に位置している発現カセッ
トをサルモネラ菌ワクチン菌株ＳＬ３２６１中に形質導
入した。サルモネラ菌の染色体中の異なる座位に位置し
ている２つの分離した対立遺伝子からの形質導入で得ら
れるところの、２つの独立したＳＬ３２６１ ＬＴ-Ｂ
染色体インテグラントは、インビトロおよびインビボで
安定性を示すことが見いだされた。
【００６８】低コピー数のpurＡベクターの構築 プラスミドｐＧＤ１０３を修飾して、大腸菌のpurＡ遺
伝子およびいくつかのユニークなクローニング部位を含
有させた。ｐＪＳ７６の、１．７キロベースペアから成
るAccIフラグメントを、ｐＧＤ１０３のXmnI XhoI部位
中に挿入して、ｐＰＸ３００６を得た（図５参照）。こ
のプラスミド中、該カナマイシン耐性決定基を全体的に
purＡで置換することで、ユニークなBamHI、 SmaI、 PstI
およびSalI部位を有するベクターを作り出した。
【００６９】ＰＬプロモーター発現カセットを有する低
コピー数のpurＡベクター 強λＰＬプロモーター制御下で遺伝子生産物を発現する
いくつかの低コピー数プラスミドを構築するためのベク
ターとして、プラスミドｐＰＸ３００６を用いた。宿主
細菌細胞中、このＰ１プロモーターによって調節される
転写を示す特定の遺伝子生産物は、弱いプロモーター、
例えばlacプロモーター、の制御下に在る遺伝子に比較
して、高いレベルで生産されると予想される。更に、サ
ルモネラ菌株はバクテリオファージλに対して溶原性を
示さないことが知られているため、プラスミド産生ＰＬ
が促進する蛋白質の発現は本質的である。purＡの補足
による安定化と共に、上記配置は、低コピー数のベクタ
ープラスミドｐＰＸ３００６に関連した遺伝子発現の低
レベルに打ち勝つ可能性があり、そしてこれらは、弱毒
化した生組換え型サルモネラ菌株の免疫原性を増強す
る。
【００７０】プラスモディウム・ベルグハイ（Plasmodi
um berghei）サーカムスポロゾイト蛋白質（ＣＳ）遺伝
子変形のいくつかは、ｐＰＸ３００６中で安定化され
た。このＣＳ遺伝子は、マラリアスポロゾイトコートの
主要免疫原の１つとして関係しており、そしてこれはそ
のまま、マラリアワクチンのためのサブユニット方法の
ための候補である。いくつかのＣＳ遺伝子の構造が明ら
かになり、その結果、全てが同様な全体的構造を有する
ことが分かった。各々の際だった特徴の１つは、中心と
なる繰り返しペプチド（この蛋白質の１／３に及ぶ）を
それらが含んでいることである。この繰り返し領域は免
疫優性を示す、と言うのは、抗スポロゾイト抗体の大半
がこれらの領域に対して特異的であるからである。この
繰り返し領域に対する抗体はマラリアのスポロゾイト段
階に対する保護に関連しているが、スポロゾイト感染に
対する保護を達成するためには、抗体単独では不充分で
ある。マラリア寄生虫のスポロゾイト段階に対する保護
は、体液性応答のみでなく強力なＴ細胞応答も伴う可能
性がある。保護には、ＣＳ蛋白質の部分、およびスポロ
ゾイトに感染した肝細胞表面上で発育するスポロゾイト
が有する他の蛋白質、を認識する細胞障害Ｔリンパ球の
活性化が必要である可能性が高い。従って、有効なマラ
リアワクチンには、これらの応答を特異的に刺激させる
ように設計したワクチンか、或は体液性応答に関連した
ワクチンが必要である。細胞障害Ｔ細胞のレベルでの細
胞免疫の刺激は、プロセシングの内部経路によって細胞
がプロセシングされ易いように、これらの細胞を提示す
る抗原に抗原を配達することによって達成できる。内部
経路による抗原の提示は、優先的に、ＣＤ８±細胞障害
Ｔ細胞の刺激に通常関連しているクラスＩの制限された
ＭＨＣに関連して、抗原の表面発現を生じさせる可能性
がある。弱毒化したサルモネラ菌中のプラスモディウム
・ベルグハイおよびプラスモディウム・ファルシパルム
（P. falciparum）のＣＳ蛋白質発現に続く経口免疫化
によって、これらのＣＳ蛋白質のペプチドを認識する特
異的ＣＤ＋細胞障害Ｔ細胞の誘発がもたらされた。更
に、プラスモディウム・ベルグハイのＣＳ蛋白質構築物
を用いたマウスの経口免疫化は、ガンマー線で不活性化
したスポロゾイトを用いて動物にワクチン接種すること
によってのみ通常達成されるところの、スポロゾイトの
攻撃に対する有意な保護を生じさせた。
【００７１】スポロゾイト攻撃に対する保護が、ＣＳ蛋
白質発現サルモネラ菌を用いたワクチン接種によって確
認されたが、保護は不完全であり、このことは、適当な
免疫誘発が生じなかったことを示唆している。更にこの
ことは、この弱毒化したサルモネラ菌ワクチン用菌株に
おけるＣＳ蛋白質発現に関連している因子を操作するこ
とで免疫原性を増強することができることを示唆してい
る。上記因子には、上述したように、遺伝子調節シグナ
ル（恐らくは蛋白質発現のレベルに影響を与える）、発
現した蛋白質の安定性、およびこの発現蛋白質の遺伝的
安定性が含まれる。もし、弱毒化したサルモネラ菌によ
る一過性感染を受ける過程中、免疫化用細菌の有意な集
団が分離によってプラスミドを損失した場合、有効な免
疫化は生じないであろう。
【００７２】purＡの補足によるＣＳ蛋白質構築物の安
定化を評価する目的で、全長のＣＳ蛋白質構築物を、ｐ
ＰＸ３００６のBamHI部位に挿入した。この構築物は、
ＰＬプロモーターから発現したプラスモディウム・ベル
グハイＣＳ蛋白質遺伝子（ＡＮＫＡ）の全体コード配列
を含んでおり、そしてこれをｐＰＸ３００９と表示した
（図６および７）。ＬＴ-Ｂの、最初の３０個のアミノ
酸を有する融合蛋白質として、Ｐ１プロモーターから発
現した端の切り取られたＣＳ蛋白質を含んでいる第二構
築物（ｐＰＸ１６０１）を、ｐＰＸ３００６のBamHI部
位中に挿入した。この構築物は、アミノ末端の６０個か
ら成るアミノ酸とカルボキシル末端の３０個から成るア
ミノ酸が不足している、ＣＳ蛋白質の発現部分と共に、
ＬＴ-Ｂ融合蛋白質を含んでいる。この構築物をｐＰＸ
３００７と表示した（図６および７）。プリン独立性に
対して選択することによって、両方の構築物をネズミチ
フス菌ＢＢ１２３１（△purＡ）中に形質転換した。発
現をそれらの同種高コピー数親プラスミド（ｐＢＲ３２
２から誘導された）と比較したとき、ＳＬ３２６１の発
現レベルにはいかなる差異も見られず、このことは、遺
伝子発現が遺伝子コピー数とは対になっていないことを
示唆している。
【００７３】３番目の、プロモーター制御発現カセット
を、purＡ補足による安定化に関して試験した。ＬＴ-Ｂ
のためのコード配列（クレノー酵素の作用によって平滑
断端された、５９０個の塩基対から成るＥcoRI-HindIII
フラグメント上）を、ｐＰＬλ（Pharmacia Molecular
Biologicals、 Piscataway、ＮＪ）のHpaI部位中に挿入
することで、ｐＰＸ１６０２を得た。１．７キロベース
ペアのBamHIフラグメント上に今位置しているＬＴ-Ｂの
コード配列を、ｐＰＸ３００６のBamHＩ部位中に挿入す
ることで、ｐＰＸ３０１０を得た（図６および７）。こ
のプラスミドをＢＢ１２３１中に形質転換した。サルモ
ネラ菌の増殖サイクルにおける異なる地点で、ＬＴ-Ｂ
抗原の発現を比較し、そして遺伝子の組み込まれた形
態、即ち高コピー数プラスミド形態と低コピー数プラス
ミド形態、の間の比較を行った。この細菌の一晩培養物
中に最大遺伝子発現が見られた。発現レベルを、lacプ
ロモーターによってＬＴ-Ｂ発現を制御したときの遺伝
子コピー数に関連させた。発現は、ｐＰＸ１００を含ん
でいる培養物中で最大であり、続いてｐＰＸ３００５で
あり、そして最小の発現がＳＬ３２６１λ３の培養物中
に見られた。しかしながら、ｐＰＸ３０１０からのＬＴ
-Ｂ発現は、ｐＰＸ１００の培養物中で観察されたもの
を越えており、このことは、ＬＴ-Ｂ抗原の発現に関し
て、強力なＰＬプロモーターが遺伝子コピー数効果に打
ち勝ったことを明らかに示している。
【００７４】低コピー数および染色体インテグラント発
現カセットのインビトロ安定性 ｐＢＲ３２２、ｐＵＣまたはｐＳＣ１０１上に発現カセ
ットを有するネズミチフス菌ＳＬ３２６１菌株を、選択
無しで培養したときの安定性に関して比較した。表３で
見られるように、ｐＵＣベクタープラスミド、或はｐＵ
Ｃプラスミドを基とする発現プラスミドは、アンピシリ
ン選択無しにインビトロで培養したとき、顕著に不安定
であった。更に、端が切り取られたプラスモディウム・
ベルグハイＣＳ／ＬＴ−Ｂ融合蛋白質（上述）を発現す
るｐＢＲ３２２から誘導されるプラスミド（ｐＰＸ１６
０１）は、アンピシリン無しのとき、継代させた培養物
からの有意な損失を示していた。
【００７５】これらの発現カセットのいずれかをｐＧＤ
１０３またはそのpurＡ誘導体（ｐＰＸ３００６）中に
クローン化したとき、発現プラスミドの１００％保持率
が８０世代に及んで観察された。この結果は、ｐＳＣ１
０１レプリコンを基とするプラスミドは、本来、ネズミ
チフス菌中で安定であることを示している。更に、大腸
菌のそのpurＡ遺伝子は、クローニング用プラスミドに
通常関連している薬剤耐性決定基の置き換えに有効であ
る。（表４参照。）
【００７６】
【表４】 ｐＳＣ１０１に関連した分配領域および機能を含んでい
るプラスミドベクターは、バッチ培養条件下の大腸菌お
よびサルモネラ菌中で安定性を示す。ｐＳＣ１０１のpa
r領域は、ｐＧＤ１０３およびここに記述したpurＡ誘導
体中に保持されているが、分配機能単独では、製造中の
組換え型ワクチン用菌株の発酵を通して有効なプラスミ
ド安定性を可能にするには不充分であり得る（Nilsson
およびSkogman １９８６、 Biotechnology ４：９０１
−９０３）。分配機能の保持と共に、染色体上のpurＡ
欠失変異のプラスミド補足によって、バッチ増殖、栄養
素限定条件下の増殖、および発酵中の、有効な安定性が
可能になる。
【００７７】purＡ補足によるネズミチフス菌ワクチン
用菌株のインビボ安定性 ワクチン接種条件下での、purＡ補足によるｐＳＣ１０
１プラスミドの安定化を検査する目的で、ＳＬ３２６
１、ＢＢ１２３１（ＳＬ３２６１△purＡ）およびｐＰ
Ｘ３００６／ＢＢ１２３１を用いてマウスを経口免疫化
した。器官サンプルを得た後、この細菌の経口接種に続
いて３０日まで、この免疫化用有機体の存在に関して試
験した。図８で見られるように、接種後２日のみ非常に
低レベルであるが、脾臓、肝臓およびパイエル板のサン
プルからＢＢ１２３１が培養でき、一方、ＳＬ３２６１
および補足ＢＢ１２３１は、数週間に渡って組織サンプ
ル中で回収できた。この補足したワクチン株はインビボ
で、統計的偏差の範囲内ではＳＬ３２６１と同じでない
が、ＳＬ３２６１と同様な増殖特性を与えた。このこと
は、purＡ補足は、pur＋挙動に対して、この染色体pur
Ａ欠失を有効に回復し、そしてこのワクチン用菌株の侵
入性および細菌複製特性に対して有効に中性であること
を示している。
【００７８】ｐＳＣ１０１を基とするプラスミドもまた
インビボで安定化される。インビトロ安定性データを支
持している表５に示されように、ｐＳＣ１０１を基とす
るプラスミドは、purＡ補足によって追加的に安定化さ
れているかいないかに拘らず、接種後２９日間に及ん
で、得られる器官サンプル中で完全に安定である。ＬＴ
−Ｂ発現プラスミドで免疫化された動物に関しては、プ
ラスミドを含んでいるものとして特徴づけられた単離物
の全てがまた、この抗原を発現した。逆に、ｐＵＣベク
ターか、或はｐＰＸ１００含有プラスミドのどちらかで
免疫化した動物からは、僅かの有機体が回収され、その
結果、接種１５日後の器官サンプルからは、いかなるプ
ラスミド含有有機体も培養できなかった。更に、ＬＴ-
Ｂの遺伝子組み込み形態を接種した動物もまた、発現
（カナマイシン耐性およびＬＴ-Ｂの）の１００％保持
率を示していた。
【００７９】
【表５】 チフス菌ワクチン用菌株における遺伝子発現の安定化 ネズミチフス菌およびS. dublinの弱毒化した菌株は、
動物モデル中の免疫原性を評価するために使用できる
か、或は獣医学的用途のための組換え型ワクチン中に展
開できるが、腸チフス用ワクチン接種プログラムに対し
てか、或はヒト免疫系へ異種抗原を配達するためのベク
ターとしての、ヒト用途においては、それらは理想的に
は有効であるとは言えない。弱毒化したチフス菌中での
ｐｕｒＡ補足の利用性を示す目的で、ｐＰＸ３００６お
よびｐＰＸ３０１０を、エレクトロポレーションによ
り、aroＡチフス菌候補体ＢＢ１３５４中に形質転換し
た（６７９Ｔｙ △purＡ）。プラスミドの存在を確認
した後、ｐＰＸ３０１０形質転換体中でのＬＴ-Ｂ発現
をウエスタンブロット分析によって確認した。この２つ
の菌株の増殖特性に関して試験し、その結果、形質転換
体を含んでいるプラスミドの倍化時間は、形質転換して
いない親と同様であった。この２つのプラスミド含有菌
株を、アデニンの存在有り無しで継代させることによっ
て、インビトロのプラスミド安定性に関して試験した。
両方のプラスミド共、選択有り無しで、８０世代に及ん
で１００％の安定性を示した。
【００８０】チフス菌株６７９Ｔｙ、ＢＢ１３５４およ
びｐＰＸ３００６／ＢＢ１３５４を、非経口接種後の、
深い組織内に維持される能力に関して試験した。未変性
状態のチフス菌は、マウスに対しては病原性を示さず、
そして経口ではマウスを感染しない。ｐＰＸ３００６／
ＢＢ１３５４または６７９Ｔｙ（動物１匹当たり１０７
個の細菌）を用いてマウスに接種したとき、接種後１０
日間に渡って肝臓および脾臓から有機体が回収された。
他方、ＢＢ１３５４（動物１匹当たり１０７個の有機
体）は、数日間非常に低レベルでのみ回収可能であり、
このことは、これらの菌株が動物組織中で増殖する能力
は限定されていることを示している。更に、染色体のpu
rＡ欠失を、プラスミドｐＰＸ３００６上のpurＡ遺伝子
で補ったとき、この欠失が組織中で維持される能力も補
う。（図９参照。）ネズミチフス菌およびチフス菌のar
oＡ purＡ菌株におけるインビボおよびインビトロ結果
は、明らかに、これらの菌株中で、大腸菌のプラスミド
産生ｐｕｒＡ遺伝子は染色体欠失を補うことができるこ
とを示している。更に有意に、低コピー安定性を示すプ
ラスミドベクターに対するこのpurＡ欠失補足は、この
ワクチン用細菌のインビボ増殖挙動に対して中性であ
る。このことは、purＡ補足を用いた組換え型細菌は、
経口接種で有効な異種抗原の安定な発現を可能にする、
ことを強く示している。
【００８１】染色体組み込みのためのマーカーとしての
purＡ遺伝子 大腸菌のpurＡ遺伝子を操作するための更に多様な手段
を作り出す目的で、１．７４キロベースペアから成るAc
cＩ purＡ含有フラグメントを種々のリンカーで適合さ
せて、対称性を示すユニークな制限部位を含有させた。
１つのリンカーは、SalIのための単一制限部位を有して
おり、そしてSalIで連結したpurＡ遺伝子を、ｐＵＣ１
８のＳａｌＩ部位中にクローン化させた。このプラスミ
ドを、次に、ユニークなSalI部位に隣接するpurＡ遺伝
子のための源として使用した。
【００８２】この修飾したトランスポゾンを構築して、
次のようにしてpurＡ遺伝子およびＬＴ-Ｂ（ＰＬ制御さ
れた）の両方を含有させた。最初に、ｐＰＸ１６０２か
ら得られるＰＬプロモーターとＬＴ-Ｂ構造遺伝子とを
含んでいるBamHIフラグメントを、転位プラスミド（こ
こでは、Ｔｎ１０の、逆方向の３１個反復体が、カナマ
イシン耐性決定基に隣接している）中にサブクローニン
グすることによって、ファージλ１１２を構築した。こ
の得られるプラスミド（ｐＰＸ１５８４と表示する）
は、逆方向反復体に隣接するＬＴ-Ｂおよびカナマイシ
ン耐性を含んでいた。Ｔｎ１０末端の間で同種組換えを
行うことによって、λgt11の誘導体中に転位カセットを
交雑させた。ＬＢ５０１０／Ｆ１１２を形質導入するこ
とによって、該トランスポゾンが転位を生じる能力を評
価した。ＬＴ-Ｂの発現を個々の単離体中で確認した。
このSalIで連結した大腸菌purＡ遺伝子を用い、この片
を直接λ１１２のXhoI部位中にサブクローニングした
後、大腸菌ＴＸ５９５中でpurＡ＋溶原を選択すること
によって、λ１１２のカナマイシン耐性決定基を置き換
えた。この修飾したファージは、purＡ遺伝子とＬＴ-Ｂ
を含んでおり、そしてネズミチフス菌ＬＢ５０１０ △
purＡ／Ｆ１１２もしくはチフス菌aroＡ △purＡ／Ｆ
１１２を形質導入してプリン独立性にする目的で、これ
を用いた。上記形質導入完了体は、一定して、サルモネ
ラ菌染色体上のランダムな位置にpurＡおよびＬＴ-Ｂで
転位することから生じる。
【００８３】菌株の寄託 以下に示す菌株を、下記の如く、ブタペスト条約規約下
の（ＡＴＣＣ）、Rockville、Marylandに寄託した。
【００８４】
【表６】 ＡＴＣＣ 菌 株 取得番号 寄託日付 ネズミチフス菌 ：BB1231(aroApurA) 55107 1990年10月29日ネズミチフス菌 ：pPX3005／BB1231 68451 1990年10月29日ネズミチフス菌 ：pPX3006／BB1231 68452 1990年10月29日ネズミチフス菌 ：pPX3010／BB1231 68453 1990年10月29日ネズミチフス菌 ：pPX3009／BB1231 68612 1991年 5月 3日チフス菌 ： BB1354 55179 1991年 5月 3日
【００８５】１． アデニロスクシネートシンセターゼ
をコードするpurＡ遺伝子を含んでいるＤＮＡ挿入断片
によって安定化されたファージベクターのプラスミド。
【００８６】２． 低コピー数のプラスミドベクター
か、或はダウンレギュレーションしたpurＡ遺伝子を含
んでいる高コピー数のプラスミドである第１項のベクタ
ー。
【００８７】３． 少なくとも１種の他の抗原もしくは
それらのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を
更に含んでいる第１または２項のベクター。
【００８８】４． 該抗原が、ヒト免疫不全ウイルス
（Ｉ型およびＩＩ型）、ヒトＴリンパ球ウイルス（Ｉ
型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）、呼吸性シンシチウムウイ
ルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａおよび非Ｂ
型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（Ｉ型およびＩ
Ｉ型）、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイル
ス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ロ
タウイルス、コロナウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイ
ルス、水痘ウイルス、エプスタイン・バール（Epstein
Barr）ウイルス、アデノウイルス、乳頭腫ウイルスおよ
び黄熱病ウイルスから成る群から選択されるウイルス抗
原、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、大
腸菌（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meni
ngitidis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia
e）、カタル球菌（Branhamella catarrhalis）、コレラ
菌（Vibrio cholerae）、ジフテリア菌（Corynebacteri
a diphtheriae）、トラコーマクラミジア（Chlamydia t
rachomatis）、淋菌（Neisseriagonorrhoeae）、百日咳
菌（Bordetella pertussis）、緑膿菌（Pseudomonas ae
ruginosa）、黄色ぶどう球菌（Staphylococcus aureu
s）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎
かん菌（Klebsiella pneumoniae）および破傷風菌（Clo
stridium tetani）から成る群から選択される細菌抗
原、菌・カビまたは寄生虫の抗原、或は温血動物または
ヒト病原体である第１〜３項いずれかのベクター。
【００８９】５． ｐＰＸ３００５（ＡＴＣＣ ６８４
５１）、ｐＰＸ３００６（ＡＴＣＣ６８４５２）、ｐＰ
Ｘ３００９（ＡＴＣC ６８６１２）、ｐＰＸ３０１０
（ＡＴＣＣ ６８４５３）およびｐＰＸ３００７から成
る群から選択される安定な低コピー数プラスミドベクタ
ー。
【００９０】６． 第１〜５項いずれか１項のプラスミ
ドを有する宿主。
【００９１】７． アデニロスクシネートシンセターゼ
をコードする異種purＡ遺伝子と、異種遺伝子生産物を
コードする少なくとも１種の他の遺伝子とを含む安定な
プラスミドを有する弱毒化した細菌。
【００９２】８． 該プラスミドが、低コピー数のプラ
スミドか、或はダウンレギュレーションしたpurＡ遺伝
子を含んでいる高コピー数のプラスミドである第７項の
細菌。
【００９３】９． 芳香族化合物生合成で機能する１種
以上の遺伝子中にpurＡ染色体の遺伝子変異体および任
意の染色体変異体を有する第７項の細菌。
【００９４】１０． 該遺伝子生産物が、ウイルス、細
菌、菌・カビ、または温血動物の寄生虫源、或はヒト病
原体のものである第７項の細菌。
【００９５】１１． サルモネラ属、赤痢菌属、エルジ
ニア属、エシェリキア属、ビブリオ属、グラム陰性属の
腸侵入性細菌である第７項の細菌。
【００９６】１２． 第７〜１１項いずれかの細菌を含
む組成物。
【００９７】１３． サーカムスポロゾイトエピトープ
と、大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンのＢサブユニ
ットか、或は該サーカムスポロゾイトエピトープに結合
したそれらの部分蛋白質と、から成る融合蛋白質の一部
として発現するマラリア性サーカムスポロゾイトエピト
ープである抗原をコードする遺伝子を含む該プラスミド
が、免疫活性を示す融合蛋白質を産生する第１２項の組
成物。
【００９８】１４． 薬学的に許容される賦形剤および
任意のアジュバント中の、免疫学的有効量の第１または
１３項の組成物を温血動物宿主に投与することから成
る、抗原に対する免疫応答を引き出す方法。
【００９９】１５． purＡ遺伝子が欠失している宿主
細菌に安定なpurＡベクターを挿入し、アデニン欠失培
地中で該細菌を選択的に増殖させた後、そこに増殖する
pｕrＡプラスミド含有細菌コロニーを選択する、ことか
ら成る、非抗生物質選択手段を用いた、興味の持たれて
いる細菌形質転換体の選択および維持方法。
【０１００】１６． 生理学的に許容される賦形剤およ
び任意のアジュバント中の、第７〜１１項いずれか１項
の細菌を含むワクチン組成物。
【０１０１】１７． プリン独立増殖によって選択でき
る挿入断片を有するpurＡ遺伝子を含んでいるプラスミ
ドもしくはファージ。
【図面の簡単な説明】
【図１】lacＺプロモーター制御下の大腸菌purＡ遺伝子
を含んでいるプラスミドpPX３００１の構築を示すもの
である。
【図２】lacＺプロモーター制御下の、大腸菌purＡ遺伝
子と、大腸菌の熱不安定エンテロトキシンの結合サブユ
ニット（ＬＴ-Ｂ）をコードする遺伝子と、を含んでい
るプラスミドpPX３００３の構築を示すものである。
【図３】選択的（アデニン添加無し）および非選択的
（アデニン添加）条件下の、purＡプラスミドを有する
S.dublin ＳＬ５６５３細胞のパーセントを示すグラフ
である。
【図４】図４Ａは、アデニン有り（＋ａｄ）またはアデ
ニン無し（−ａｄ）培地中で増殖させたＳＬ５６５３／
pPX３００３培養物からの全細胞蛋白質に関するＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲルを示すものである。図４Ｂは、
ヤギ抗LT-B抗血清を用いて試験しそしてＨＲＰ標識蛋白
質Ａで可視化したＳＬ５６５３／pPX３００３の全細胞
蛋白質に関するウエスタンブロットを示すものである。
【図５】２つの低コピー数プラスミドベクターの構築を
示すものである。プラスミドpPX３００５は、LT-Bコー
ド配列全体とカナマイシン耐性決定基を含んでいる。プ
ラスミドpPX３００６は、lacＺプロモーター制御下のpu
rA遺伝子を含んでいる。
【図６】ＬＴ-Ｂのコード配列（pPX３０１０）、マラリ
アのサーカムスポロゾイト（circumsporozoite）（Ｃ
Ｓ）蛋白質遺伝子（pPX３００９）、およびＬＴ-Ｂ／Ｃ
Ｓ融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列（pPX３０
０７）を含んでいる、３種のpurＡプラスミドベクター
の構築を示すものである。
【図７】ＬＴ-Ｂのコード配列（pPX３０１０）、マラリ
アのサーカムスポロゾイト（circumsporozoite）（Ｃ
Ｓ）蛋白質遺伝子（pPX３００９）、およびＬＴ-Ｂ／Ｃ
Ｓ融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列（pPX３０
０７）を含んでいる、３種のpurＡプラスミドベクター
の構築を示すものである。
【図８】purＡ補足によるネズミチフス菌株に関するイ
ンビボ安定化試験の結果を示すものである。Ａ：脾臓、
Ｂ：肝臓、およびＣ：パイエル板、から回収されたネズ
ミチフス菌。
【図９】purＡ補足によるチフス菌株に関するインビボ
安定化試験の結果を示すものである。Ａ：肝臓、および
Ｂ：脾臓、から回収されたチフス菌。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジエイムズ・ピーター・フルジニテイ アメリカ合衆国ニユーヨーク州14424カ ナンダイガ・フオスターロード5180 (72)発明者 アルジス・アニリオニス アメリカ合衆国ニユーヨーク州11743ハ ンテイントン・ウイストラーヒルレイン 25 (56)参考文献 Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅ ｃｈ．，1987年，Ｖｏｌ．256，Ｎｏ. １，ｐ．335−342 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/52 - 15/90 A61K 39/00 - 39/116 C12N 1/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アデニロスクシネートシンセターゼをコ
    ードする発現可能なｐｕｒＡ遺伝子を含むＤＮＡの挿入
    によって安定化された、抗生物質耐性決定基を含まない
    プラスミドまたはファージベクター。
  2. 【請求項２】 低コピー数のプラスミドベクター、また
    はダウンレギュレーションしたpurＡ遺伝子を含む高コ
    ピー数のプラスミドである請求項１に記載のベクター。
  3. 【請求項３】 少なくとも１種の他の抗原またはそのフ
    ラグメントをコードするヌクレオチド配列を更に含んで
    なる請求項１または２に記載のベクター。
  4. 【請求項４】 該抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（Ｉ型
    およびＩＩ型）、ヒトＴリンパ球ウイルス（Ｉ型、ＩＩ
    型およびＩＩＩ型）、呼吸性シンシチウムウイルス、Ａ
    型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａおよび非Ｂ型肝炎ウ
    イルス、単純ヘルペスウイルス（Ｉ型およびＩＩ型）、
    サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、パラ
    インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ロタウイル
    ス、コロナウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、水
    痘ウイルス、エプスタイン・バール（Epstein Barr）ウ
    イルス、アデノウイルス、乳頭腫ウイルスおよび黄熱病
    ウイルスから成る群より選択されるウイルス抗原、イン
    フルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、大腸菌（Es
    cherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidi
    s）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化
    膿連鎖球菌（Ｓtreptococcus pyogenes）、カタル球菌
    （Branhamella catarrhalis）、コレラ菌（Vibrio chol
    erae）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria
    e）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomati
    s）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、百日咳菌（Bord
    etella pertussis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginos
    a）、黄色ぶどう球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎
    かん菌（Klebsiella pneumoniae）および破傷風菌（Clo
    stridium tetani）から成る群より選択されるバクテリ
    ア抗原、菌・カビまたは寄生虫抗原、或いは温血動物ま
    たはヒト病原体である請求項１〜３のいずれか１項に記
    載のベクター。
  5. 【請求項５】 ｐＰＸ３００５（ＡＴＣＣ ６８４５
    １）、ｐＰＸ３００６（ＡＴＣＣ ６８４５２）、ｐＰ
    Ｘ３００９（ＡＴＣＣ ６８６１２）およびｐＰＸ３０
    １０（ＡＴＣＣ ６８４５３）から成る群より選択され
    る安定な低コピー数プラスミドベクター。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のベ
    クターを含有するpurＡ染色体突然変異をもつ宿主バク
    テリア。
  7. 【請求項７】 抗生物質耐性遺伝子座を含まないプラス
    ミドであって、アデニロスクシネートシンセターゼをコ
    ードする発現可能な異種purＡ遺伝子と、異種遺伝子生
    産物をコードする少なくとも１種の他の遺伝子とを含む
    安定なプラスミドを含有するpurＡ染色体突然変異をも
    つ弱毒化バクテリア。
  8. 【請求項８】 該プラスミドが、低コピー数のプラスミ
    ドであるか、或いはダウンレギュレーションしたpurＡ
    遺伝子を含む高コピー数のプラスミドである請求項７に
    記載のバクテリア。
  9. 【請求項９】 芳香族化合物生合成またはガラクトース
    代謝において機能する１種もしくはそれ以上の遺伝子中
    に染色体突然変異を有する請求項７に記載のバクテリ
    ア。
  10. 【請求項１０】 該遺伝子生産物が、ウイルス、バクテ
    リア、菌・カビ、または温血動物もしくはヒト病原体の
    寄生虫由来のものである請求項７に記載のバクテリア。
  11. 【請求項１１】 サルモネラ属、赤痢菌属、エルジニア
    属、エシェリキア属、ビブリオ属およびキヤンピロバク
    ター属の腸侵襲性バクテリアである請求項７に記載のバ
    クテリア。
  12. 【請求項１２】 生理学的に許容されうる賦形剤および
    任意のアジュバント中の請求項７〜１１のいずれか１項
    に記載のバクテリアを含んでなるワクチン組成物。
  13. 【請求項１３】 サーカムスポロゾイトエピトープと、
    大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンのβ−サブユニッ
    トまたは該サーカムスポロゾイトエピトープに結合した
    それらの蛋白質の一部を含んでなる融合蛋白質の一部と
    して発現されるマラリア性サーカムスポロゾイト蛋白質
    のエピトープである抗原をコードする遺伝子を含んでな
    るプラスミドが、免疫活性融合蛋白質を産生する請求項
    １２に記載のワクチン組成物。
  14. 【請求項１４】 薬学的に許容されうる賦形剤および任
    意のアジュバント中の免疫学的に有効な投与量の請求項
    １２または１３に記載のワクチン組成物をヒト以外の温
    血動物宿主に投与することを特徴とする抗原に対する免
    疫応答を誘発する方法。
  15. 【請求項１５】 purＡ遺伝子が欠失している宿主バク
    テリアに、抗生物質耐性決定基を含まない安定なpurＡ
    ベクターを挿入し、アデニン欠失培地中で該バクテリア
    を選択的に増殖させ、そこに増殖するpｕrＡプラスミド
    含有バクテリアコロニーを選択することを特徴とする非
    抗生物質選択手段を用いる問題のバクテリア形質転換体
    の選択および維持方法。
  16. 【請求項１６】 薬学的に許容されうる賦形剤および任
    意のアジュバントをさらに含んでなる免疫応答を誘発す
    るための組成物を製造するための請求項１２または１３
    に記載のワクチン組成物。
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