FI107359B - Menetelmä anti-RNA-vasta-aineiden toteamiseksi - Google Patents

Description

107359

Menetelmä anti-RNA-vasta-aineiden toteamiseksi ' Keksintö koskee menetelmää autoimmuunisairauden aktiivisuuden tarkkailemiseksi osoittamalla ja määrittä-5 mällä kvantitatiivisesti anti-RNA-vasta-aineita autoimmuu nisairauden omaavien potilaiden koenesteestä ja koetarvik-keita menetelmän suorittamista varten.

Sen jälkeen kun on käynyt ilmi, että systeeminen lupus erythematosus (SLE) -sairauden omaavien potilaiden 10 seerumi sisältää tiiman komponenttien vastaisia vasta-aineita, on aikaansaatu pitemmälle kehitettyjä menetelmiä reaktioon osallistuvien antigeenien määrittämiseksi ja vasta-aineen pitoisuuden mittaamiseksi. Menetelmiä, joita on käytetty antigeenin laadun ja vasta-aineen määrittämi-15 seen, ovat olleet komplementinsitoutumiskoe, hemaggluti- naatio, liukoisten immuunikompleksien saostaminen ammoniumsulfaatilla, immunosaostus kaksoisdiffuusion avulla agarissa ja immunohistologia. Reaktio on määritetty kvantitatiivisesti laimentamalla seerumit immunohistologiaa 20 varten, seerumien aikaansaaman DNA:n sitomisen määrän avulla ja kiinteän faasin radioimmunoanalyysin avulla. Entsyymeihin kytkettyjen vasta-aineiden käyttö on tehnyt mahdolliseksi käyttää tällaisia konjugaatteja radioaktiivisen merkkiaineen syrjäyttämiseksi immunoanalyysijärjes-25 telmissä.

Pesee et ai. [Clinical Chem. 20/3 (1974) 353 - 359] ovat kuvanneet tekniikan, jossa valmistetaan antigeeni liukenemattoman kantajan pinnalle, muodostetaan kerros koeseerumista, jossa on anti-DNA, ja käytetään tätä seeru-30 mia antigeeninä reagoimaan sellaisen antihumaani-IgG:n kanssa, joka on merkitty peroksidaasientsyymillä. Periaatteessa liukenemattomaan kantajaan sitoutuneen lgG:n määrä on verrannollinen seerumin sisältämän vasta-aineen määrään. Pesee et ai. osoittivat, että kiinteän faasin kil-35 pailemattoman sitomisen analyysi, jossa käytetään entsyy- I ———-— i ! 107359 2 ! j min kanssa konjugoitua toista vasta-ainetta kvantitatiivi- | sena tai detektorijärjestelmänä, on tehokas tapa mitata j seerumissa oleva DNA:n vastainen vasta-aine.

Potilaat, joilla on systeemisiä autoimmuunisairauk- ; 5 siä, tuottavat monia erilaisia vasta-aineita, jotka on I suunnattu normaaleja solun komponentteja vastaan. Useat hyvin karakterisoidut autovasta-ainejärjestelmät on suun- ! nattu spesifisiä proteiineja tai nukleiinihappo-proteiini- j komplekseja vastaan [Tan, E. M., Adv. Immunol. 44 (1989) | * 10 93 - 151). Sidekudostauteja omaavilta potilailta peräisin j olevat seerumit sisältävät usein vasta-aineita sellaisia j solun komponentteja vastaan, jotka koostuvat pituudeltaan j 80 - 200 nukleotidia olevien pienten RNA-molekyylien kans- j sa yhdistyneistä proteiineista. Näiden pienten RNA-prd- j 15 teiinikompleksien tumatyypin (snRNP) vastaisia autovasta- | aineita löytyy useimmiten SLE:n tai SLE:n kanssa päällek- ; käin meneviä oireyhtymiä omaavilta potilailta peräisin j olevista seerumeista. Useita spesifisyyksiä on jo kuvat- j tu. On vasta-aineita, jotka seostavat pelkän (Ul)snRNP: ι i 20 sen johdosta, että ne tunnistavat yhden tai useampi* i (UI)snRNP-spesifisistä proteiineista, nimittäin proteii- I neista 70K, A ja C. Toinen spesifisyys, anti-Sm, saosta® kaikki tärkeimmät tumaliman snRNP:t sen johdosta, ett i j i nämä vasta-aineet tunnistavat proteiinit B’/B ja D, jotka j 25 ovat yhteisiä näille snRNP: eille (v. Venrooij ja

Sillekens, Clin. Exp. Rheum., 1989).

Potilaiden seerumeissa olevat vasta-aineet ov.a: S

| kaikissa näissä tapauksissa suunnattuja snRNP-kompleksel · t hin sisältyviä proteiineja vastaan. Vaikka nukleiinihapot j 30 ovat yleensä heikkoja immunogeenejä, on tehty selostuksia j ··. nukleiinihappoja vastaan suunnatuista autovasta-aineista |

• · J

Suurin osa nukleiinihappojen vasta-aineisiin liittyvistä ; tutkimuksista on koskenut anti-DNA-aktiivisuuksia, vaikka j on kuvattu esimerkkejä antivirus-RNA-autovasta-aineista (. | 1 f : f ( j 107359 3 snRNPin (U)RNA-komponenttien vastaisten vasta-aineiden ajatellaan olevan harvinaisia (Tan, 1989). Wilusz ja Keene kuvasivat vuonna 1986 (J. Biol. Chem. 261, 5467 -5472) anti-(UI)RNA-autovasta-aineiden .läsnäolon kahdessa 5 anti-RNP-seerumissa. Tämän artikkelin perusteella ei voitu vetää yleisiä johtopäätöksiä yhteydestä anti-RNP- ja/tai Sm-aktiivisuuden ja anti-(UI)RNA-aktiivisuuden välillä. Deutscher ja Keene kuvasivat vuonna 1988 (P.N.A.S., 85, 3299 - 3303), että yhden mainituista seerumeista tunnista-10 ma (UI)RNA:n osa oli kartoitettu ja sen oli todettu käsittävän RNA:n toisen kanta-silmukan.

Aloitimme tutkimuksen, jossa suuri määrä anti-snRNP-seerumeita testattiin anti-(UI)RNA-vasta-aineiden läsnäolon suhteen. Seulomalla CIE:n (vastaimmunoelektrofo-15 reesi) ja IB:n (immunoblottaus) avulla identifioitiin 118 seerumia, jotka sisälsivät anti-snRNP-aktiivisuutta. RNP:n immunosaostuksen jälkeen kuusikymmentä seerumia luokiteltiin anti-(UI)RNP:ksi ja 18 seerumia anti-Sm:ksi. 25 seerumia sisälsi sekä anti-RNP- että anti-Sm-vasta-aineita, 20 kun taas 15 seerumia osoitti anti-(U1,U2)RNP-aktiivisuutta .

Testattiin näiden kaikkien 118 seerumin kyky saos-taa proteiinittomaksi tehtyjä (U)RNA:itä. Tätä tarkoitusta varten käytettiin 32P:lla merkittyä Hela-solujen kokonais-25 RNA:ta, joka oli puhdistettu laajan pronaasi- ja fenoli/ pesuainekäsittelyn avulla, mutta myös in vitro -syntetisoituja (U)RNA:itä antigeeninä presipitaatioanalyysissä. Immunosaostus suoritettiin liuoksessa, jossa oli IPP/500 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5 ja 0,05 % Nonidet P40(R) . Koko-30 naistulokset osoittavat, että 118:sta seerumista 45 (noin 40 %) sisälsi anti-(UI)snRNA-vasta-aineita. Näitä vasta-aineita ei ollut läsnä anti-Sm-seerumeissa. Autovasta-aineet oli aina suunnattu (Ul)snRNA:ta vastaan, ja niitä on useimmin läsnä potilailla, joilla on SLE:n kanssa päällek-35 käin meneviä oireyhtymiä. Käyttämällä immunosaostusta ra- 107359: 4 j ‘ j

joittavissa olosuhteissa (500 mM NaCl) in vitro -synteti- I

soidun (Ul)RNA:n tai in vivo -merkityn Hela-solujen koko-nais-RNA:n kanssa on todettu, että noin 65 % SLE:n kanssa ; päällekkäisen oireyhtymän ja noin 30 % SLE-seerumeista, j 5 joissa oli anti-snRNP-aktiivisuutta, sisälsi (Ul)RNA:i j vastaista vasta-ainetta. Ei todettu muiden (U)RNA:ids i \ vastaisia autovasta-aineita. Käyttämällä in vitro -syntetisoituja (UI)RNA:n kanta-silmukoita on mahdollista osoit - ! taa (Ul)RNA:n kaikkien yksittäisten kanta-silmukkojen vais - j 10 täisiä vasta-aineita. Tärkeimmät antigeeniset alueet si - j jaitsevat kuitenkin (Ul)RNA:n niin kutsutuissa toisessa | (B) ja neljännessä (E) kanta-silmukkadomeenissa. Näyttää I siltä, että neljännessä E-kanta-silmukassa oleva nukleoti disekvenssi UUCG (numerot 150 - 154) on hyvin oleellinen 15 potilaan spesifisten vasta-aineiden tunnistuskohtana.

Anti-(UI) RNA-vasta-ainetason ja autoimmuunisairai|i- I den aktiivisuuden välinen korrelaatio oli erittäin hämmäsjr [ tyttävä. :

Keksinnön mukaiselle menetelmälle autoin- ; 20 muunisairauden aktiivisuuden tarkkailemiseksi on tuin i n nusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetääiji. i Keksinnön mukaisille koetarvikkeille keksinnön mukaisen ! menetelmän suorittamiseksi on tunnusomaista se, mitä pe- j tenttivaatimuksessa 11 esitetään.

. 25 Keksinnön mukaan voidaan anti-RNA-vasta-aineits ; i osoittaa koenesteestä saattamalla RNA kosketuksiin mainij- j tun koenesteen kanssa, jolloin tapahtuu reaktio RNA:n ja · koenesteessä läsnä olevien anti-RNA-vasta-aineiden kesken, | jonka jälkeen RNA:n kanssa reagoivien vasta-aineiden mää- j 30 rittäminen voi osoittaa ja ennustaa muutoksen sairauden * : ankaruudessa. i

Edullisesti yllä mainittu RNA:n kanssa reagoivien | vasta-aineiden määritys on UlRNA:n kanssa reagoivien vaa]- | ! ! i 107359 5 ta-aineiden määrän kvantitatiivinen määritys, joka osoittaa muutoksen sairauden ankaruudessa.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää autoimmuunisairauden SLE tai SLE:n kanssa päällekkäin menevän 5 oireyhtymän omaavilta potilailta peräisin olevassa seerumissa olevien anti-(UI)RNA-vasta-aineiden osoittamiseen.

Keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi käytetty RNA on edullisesti merkitty RNA, esimerkiksi radioaktiivisella isotoopilla tai biotiinilla merkitty. Kuiten-10 kin RNA, joka on kiinnitetty kiinteään faasiin kuten mik-rotiitterilevyn sisäseinämään, on myös vaihtoehto menetelmän suorittamiseksi.

Osa keksintöä ovat myös testitarvikkeet keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi.

15 Keksintöä selostetaan yksityiskohtaisemmin alla.

Käyttäen nopeaa ja kvantitatiivista dot-blot-sitomisana-lyysiä kuten on kuvattu alla osoitetaan sairauden aktiivisuuden ja anti-(UI)RNA-vasta-aineiden tason välinen korrelaatio ja se on esitetty kuviossa 1. Mainitussa kuviossa 1 20 on esitetty, että anti-(UI)RNA-aktiivisuutta löytyy pääasiallisesti potilailta, joilla on aktiivinen sairaus. Tyypillinen dot-blot-sitomisanalyysi voidaan suorittaa seuraavasti. Merkitty (UI)RNA-kopio valmistetaan in vitro käyttäen T7-polymeraasia ja (Ul)cDNA:ta. RNA voidaan mer-·. 25 kita monilla eri tavoilla (radioaktiivisuudella, biotii nilla jne.). Merkittyä RNA:ta inkuboidaan määrätyissä olosuhteissa ja puskuriliuoksessa potilailta peräisin olevan laimennetun koenesteen (seerumi, plasma jne.) kanssa. Potilaan vasta-aineet kykenevät sitomaan (Ul)RNA:n, ja sen 30 jälkeen kun tasapaino on saavutettu (1 tunti) seos imetään * ‘ pois nitroselluloosakalvon läpi dot-blot-laitteessa, käyt täen esimerkiksi Schleicherin ja Schullin sarjalaitetta, jossa on 96 kuoppaa. Koeolosuhteissa paljas RNA ei sitoudu nitroselluloosakalvoon ja RNA-vasta-ainekompleksi sitou-35 tuu. Nitroselluloosakalvo pestään, kuivataan ja vasta-ai- 6

107359 I

I j t

neen avulla nitroselluloosaan sitoutuneen merkityn RNA:i j osoittaminen voidaan suorittaa kvalitatiivisesti ja kvajn- ! titatiivisesti. On erittäin tärkeää, että koenesteell3 I

i tarjottua (UI)RNA:ta on läsnä ylimäärin, jotta saavutet- j 5 täisiin lineaarinen korrelaatio vasta-aineen pitoisuudsi j ja sitoutuneen (UI)RNA:n määrän välille. Menetelmä voida ai : myös suorittaa käyttäen (Ul)RNA:n yksittäisiä domeenej i tai epitooppialueita. Tämä on tärkeää, koska erinäisissä j seerumeissa sairauden ankaruus voisi korreloida ainoasta ai 10 yhden vasta-aineluokan kanssa, joka on suunnattu ainoastaan yhtä epitooppialuetta vastaan. Kolmen vuoden pitujl -sessa tulevaisuuteen liittyvässä tutkimuksessa mitattiin j sairauden aktiivisuuden indeksejä ja (UI)RNA:n vastaisen vasta-aineaktiivisuuden tasoja. Yllättäen todettiin, etpä 15 merkittäviin taudin vaikeutumisiin liittyy anti-(UI)RNA· I tiitterin suureneminen. Tämä on nyt todettu yli 10 pot i · j laalla, joita seurattiin 3 vuoden ajan tai kauemmin. Hu<|>· ; miota herättävää oli, että samoilla potilailla ei voitu ! todeta korrelaatiota sairauden aktiivisuuden ja RNP-pr<p j 20 teiinien (70K ja A) vastaisten vasta-ainetasojen välillä ! Mittaamalla anti-(UI)RNA-aktiivisuuden taso keksinnön miji | kaan on nyt ensimmäistä kertaa mahdollista tarkkailla sa;.· j rauden aktiivisuutta ja ennustaa sairauden vaikeutumisia. j t mikä on erittäin tärkeää sairauden arviointia varten j . 25 Käyttämällä keksinnön mukaista menetelmää lääkäri kykenee * ' 1 tietyssä määrin ennustamaan, että potilaan tila kehitti" j pahemmaksi. Tämän tiedon omatessaan lääkäri voi määrätä ! oikealla hetkellä määrättyjä lääkkeitä, jotka saavat pot:.- j laan tilan paremmaksi tai estävät taudin vaikeutumisen j 30 (kiihtymisen).

·· Keksinnön mukaan menetelmä voidaan myös suorittiin i käyttäen kiinteään faasiin kiinnitettyä RNA:ta. Tällaisin j tarkoitusta varten on usein käytetty mikrotiitterilevysijsi. j • [ • ·

• I

7 107359 olevan pienen kuopan seinämää, johon mainittu RNA on sidottu. Tutkittava koeneste lisätään mikrotiitterilevyn pieniin kuoppiin. Sidottu RNA kykenee reagoimaan SLE- tai MCTD-oireyhtymän omaavilta potilailta, peräisin olevassa 5 seerumissa läsnä olevien vasta-aineiden, erityisesti anti-(Ul)RNA-vasta-aineiden kanssa, minkä seurauksena mainitut anti-(UI)RNA-vasta-aineet tulevat sidotuksi. Jotta kyettäisiin osoittamaan, onko immunokemiallinen reaktio tapahtunut, voidaan sen jälkeen käyttää esimerkiksi merkittyjä 10 vasta-aineita, jotka on suunnattu määritettäviä autovasta-aineita vastaan. Mainitut merkityt vasta-aineet reagoivat RNA-autovasta-ainekompleksin kanssa, joka on jo muodostunut kiinteän faasin pinnalle. Merkityt vasta-aineet koostuvat vasta-aineista, joihin on sidottu entsyymi, edulli-15 sesti peroksidaasientsyymi. Seuraavassa vaiheessa lisätään väritön liuos (substraatti + kromogeeni). Entsyymi kykenee muuttamaan tämän liuoksen värilliseksi seokseksi.

Värin voimakkuus riippuu entsyymin määrästä, joka on verrannollinen sitoutuneen autovasta-aineen määrään. 20 Mainittu väri voidaan muuttaa lisäämällä pysäytysreagens-siä.

Täten kuvattu menetelmä autovasta-aineen määrittämiseksi koenesteestä on voileipätyyppiä oleva menetelmä. Muita immunokemial lisiä menetelmiä, kuten agglutinaatiota, . 25 inhibitiota tai kilpailureaktiota, voidaan myös käyttää.

Sopivina entsyymeinä voidaan käyttää muun muassa alkalista fosfataasia, ureaasia ja aikaisemmin mainittua peroksidaa-sia, edullisesti piparjuuriperoksidaasia (HRP).

Yllä mainitun mikrotiitterilevyssä olevan pienen 30 kuopan seinämän asemesta voidaan kiinteänä faasina käyttää ' ·· putkea tai kapillaaria, kalvoa, suodatinta, koeliuskaa tai hiukkasen, kuten esimerkiksi lateksihiukkasen, pintaa, punasolua, värisoolia, metallisoolia tai metalliyhdistettä soolihiukkaseha.

• · - ---------- ----------------- -- '1 I---

107359 I

8

Sen sijaan että käytetään merkkiaineena yllä maji- j nittuja entsyymejä, voidaan käyttää merkitsevinä aineina j muun muassa radioaktiivista isotooppia, fluoresoivaa yh - i distettä, värisoolia, metallisoolia tai metalliyhdistetti j 5 soolihiukkasena.

* l • | i j

Claims (11)

107359 \

1. Menetelmä autoimmuunisairauden aktiivisuuden 5 tarkkailemiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan Ul-RNA kosketuksiin autoimmuunisairauden omaavan potilaan koenesteen kanssa, ja havaitaan Ul-RNA:n ja koenesteessä olevien vasta-aineiden välille muodostuneet immuunikom-pleksit.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Ul-RNA:n kanssa reagoivien vasta-aineiden määritys on Ul-RNA:n kanssa reagoivien vasta-aineiden määrän kvantitatiivinen määritys, joka osoittaa muutoksen sairauden ankaruudessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anti-(UI)RNA-vasta-aineet ovat reaktiokykyisiä anti-(UI)-RNA-vasta-aineita.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että UI RNA sisältää UI RNA:n B- 20 kanta-silmukkadomeenin.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (UI)-RNA sisältää Ul-RNA:n E-kanta-silmukkadomeenin.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, . 25 tunnettu siitä, että Ul-RNA sisältää nukleotidis- ekvenssin UUCG.

7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Ul-RNA on modifioitu tai merkitty RNA.

8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai- * ·· nen menetelmä, tunnettu siitä, että Ul-RNA on kiinnitetty kiinteään faasiin.

9. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koeneste on 35 seerumi, plasma tai veri. • · --- -------------------------- I I --------- t 107359

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, j tunnettu siitä, että koeneste on potilailta, joifl - j la on sidekudostauti kuten SLE tai SLE:n kanssa päällek - j käin menevä oireyhtymä, peräisin oleva seerumi, plasma t.£.. 5 veri. ; ;

11. Koetarvikkeet patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseksi, tunnetut siitä, ett#. ! koetarvikkeet sisältävät kiinteän faasin, johon Ul-RNA ώη I kiinnitetty ja välineet minkä tahansa Ul-RNA:n ja koene$- j 10 teessä olevien vasta-aineiden välille muodostuneen immui,i- j nikompleksin havaitsemiseksi. • f • * « ! — > · · ! j