FI104466B - Farmaseuttiset valmisteet - Google Patents

Description

, 104466

FARMASEUTTISET VALMISTEET

Tämä keksintö koskee transferriinin farmaseuttisia koostumuksia ja tällaisten lääkevalmisteiden tuottamista. Tämä keksintö koskee lisäksi farmaseuttisten koostumusten käyttöä 5 transferriiniin sitoumattoman raudan potilaille aiheuttamien haittavaikutusten estämiseksi.

Transferriini on proteiini, joka kuljettaa rautaa veriplasmassa ja kudosten solunulkoisessa nesteessä. Transferriini sitoo kaksi ferri (Fe3+) -ionia molekyyliä kohti korkealla affiniteetilla, ja normaalisti kaikki rauta plasmassa on sitoutuneena transferriiniin. Apotransferriini 10 on transferriinin raudaton muoto. Tässä yhteydessä käytettynä määritelmää "transferriini" käytetään tarkoittamaan kaikkia transferriinin muotoja, riippumatta niiden rautapitoisuudesta.

Tietyissä patologisissa tiloissa raudan konsentraatio ylittää transferriinin raudansitomiska-15 pasiteetin, ja transferriiniin sitoutumaton rauta (jota seuraavassa kutsutaan lyhenteellä "NTBI"), voidaan osoittaa potilaiden seeruminäytteistä. Tällaisiin patologisiin tiloihin kuuluvat pahanlaatuiset neoplastiset sairaudet, erityisesti leukemiat. NTBl:n esiintyminen on erityisen yleistä pahanlaatuisten sairauksien sytotoksisen kemoterapian aikana (tästä ovat esittäneet katsauksen Beare ja Steward, Lancet 347, 342-343,1996).

20 NTBI katalysoi erittäin reaktiivisten hydroksyyliradikaalien syntymistä, ja oletetaan, että NTBIillä on patogeneettinen rooli sytotoksisen terapian aiheuttamissa kudosvaurioissa. Sen • · · vuoksi alan tunnetussa tekniikassa on esitetty, että sytotoksista kemoterapiaa saaville potilaille tulisi antaa rautaa kelatoivia aineita, jotta estettäisiin NTBI:n haittavaikutukset (Beare 25 ja Steward, Lancet 347, 342-343, 1996). Deksratsonin (ICRF187, ADR-529), synteettisen raudan kelatoijan, on osoitettu vähentävän antrasykliinin indusoimaa kardiotoksisuutta eläinkokeissa, ja hoidettaessa musia, joilla on pitkälle edennyt rintasyöpä. Toinen raudan / kelatoija, desferrioksamiini, vähensi kokeellista bleomysiinin indusoimaa keuhkojen fib- roosia, ja sen esitettiin myös olevan hyödyllinen pitkälle kehittyneen neuroblastooman 30 kemoterapiassa (Beare ja Steward, Lancet 347, 342-343,1996).

Haittatekijä synteettisten kelatoivien aineiden antamisessa on se, että ne aiheuttavat vakavia sivuvaikutuksia, kuten myelosuppressiota (Beare ja Steward, Lancet 347, 342-343, 104466 2 1996). Toinen haittatekijä on se, että bakteerit voivat käyttää kelatoitua rautaa, ja kelatoin-tihoito saattaa altistaa potilaan infektioille (Robins-Browne ja Prpic, Infect Immun 47, 774-779,1985). Tämä on erityisen ei-toivottavaa potilaille, jotka ovat läpikäymässä suurian-noksista sytotoksista hoitoa pahanlaatuisten sairauksien vuoksi, koska nämä potilaat kärsi-5 vät tyypillisesti bakteerien ja sienten aiheuttamista septisistä infektioista. Multiresistenttien bakteerien aiheuttamat septiset infektiot ovat näiden potilaiden yleinen kuolinsyy. Koska vapaa rauta yleisesti edistää bakteerien ja sienten kasvua (katsauksen tästä ovat esittäneet (Ward et ai., J Trauma 41, 356-364,1996), NTBI:n sitoutuminen potilailla muotoon, jota bakteerit ja sienet eivät voisi käyttää hyödykseen, olisi arvokasta niiden potilaiden hoidos-10 sa, jotka saavat sytotoksista hoitoa pahanlaatuisten sairauksien vuoksi.

Teoreettisesti, puhdistetun transferriinin antamisella voisi olla edullisia vaikutuksia potilaille, koska se sitoo solunulkoisen NTBI:n haitattomaan muotoon. Transferriinin terapeuttista käyttöä on tutkittu aikaisemmin kolmella potilaalla, jotka saivat myeloablatiivista ke-15 moterapiaa, ja joille oli tehty luuydinsiirto (Rigal et ai., Biotechnology of plasma proteins,

Colleque INSERM 175, 107-114, 1989). Kahdelle näistä kolmesta potilaasta kehittyi akuutti munuaisvaurio, joka saattoi olla yhteydessä transferriinivalmisteen antoon. Tämä tutkimus ei osoittanut transferriinivalmisteen tehokkuutta potilaiden NTBI:n sitomisessa, tai mitään muutakaan etua, vaan ennemmin antaa olettaa, ettei transferriinin terapeuttinen 20 käyttö olisi turvallista.

Transferriinituotteen, jota voitaisiin antaa potilaille turvallisesti, tulisi ilmeisimmin olla puhdas viruksista ja muista infektoivista aineista ja mahdollisesti haitallisista epäpuhtauksista. Muutamia mahdollisuuksia virusturvallisten transferriinituotteiden valmistamiseksi 25 on esitetty. US-patentissa 5.252.715 kuvataan menetelmä ihmisen plasman pastöroidun transferriinin valmistamiseksi. Puhdistettu transferriiniliuos pastöroitiin kompleksoivan aineen läsnäollessa ja kompleksoiva aine poistettiin sitoutuneen raudan kanssa. Esitettiin, että transferriinia käytettäisiin terapeuttisesti harvinaisissa atransferriinianemiatapauksissa (synnynnäinen transferriinin puutos) tai kasvutekijänä.

30 US-patentin 5.252.715 erityinen ongelma on transferriiniaggregaattien muodostuminen virusten inakti vointi vaiheessa käytetyn lämpökäsittelyn tuloksena. Näitä ongelmia pohdi-• taan myös US-patentissa 5.041.537. Jopa suotuisissa olosuhteissa, joita on kuvattu US- 104466 3 patentissa 5.252.715, esitetään muodostuvan pieniä määriä transferriiniaggregaatteja, jotka keksijät suosittivat poistettavaksi adsorptiolla alumiinihydroksidiin. Alumiini-yhdisteiden käyttö ei ole toivottavaa, koska niiden vakavien sivuvaikutusten, jotka yhdistettiin transfer-riinivalmisteiden aikaisempaan antoon potilaille, esitettiin aiheutuneen tuotteen suuresta 5 alumiinipitoisuudesta (Rigal et ai., Biotechnology of plasma proteins, Colleque INSERM 175,107-114,1989). US-patentin 5.252.715 keksijät mainitsevat myös anioninvaihtokro-matografian keinona vähentää transferriiniaggregaattien määrää. Jopa edullisissa olosuhteissa, puhdistetun transferriinituotteen sanottiin kuitenkin sisältävän 2-5 % aggregaatteja, mikä ei ole toivottavaa, sillä aggregoitunut transferriini on denaturoitunut, biologisesti 10 inaktiivinen ja mahdollisesti haitallinen. Lisäksi lämpökäsittelyn käyttö ainoana virusten poisto vaiheena tuotantoprosessissa ei voi varmistaa turvallisuutta fysikaaliskemiallisesti resistenttien infektoivien aineiden suhteen, kuten parvovirusten ja aineiden, jotka aiheuttavat tarttuvia spongiformisia enkefalopatioita ("prionit").

15 US-patentissa 5.041.537 kuvataan toinen prosessi virusinaktivoidun transferriinin valmistamiseksi ihmisen plasmasta. Menetelmässä tehdään UV-käsittely β-propiolaktonin läsnäollessa tai käsittely tri-(n-butyyli)fosfaatilla ja detergentillä virusten inaktivointivaiheena. Se, että virustartuntoja on todettu sellaisten plasmasta peräisin olevien proteiinilääkkeiden välityksellä, joita on käsitelty yhdellä virusten eliminointivaiheella, on johtanut yksimieli-20 syyteen siitä, että plasmasta peräisin olevien proteiinien prosessointiin tulee sisällyttää monia virusten eliminointivaiheita, jotka kohdistuvat sekä vaipallisiin että vaipattomiin viruk-**; siin. Sen vuoksi US-patentissa 5.041.537 kuvattu menetelmä ei johda virusturvalliseen tuotteeseen alan nykyisen tunnetun tekniikan mukaan. Tuotteen raudansitomiskapasiteetin sanottiin olevan noin 80 %, mikä ei ole tyydyttävää transferriinin terapeuttisen käytön kan-25 naita, mitä kuvataan tässä keksinnössä.

. Jotta esitettäisiin kokonaiskatsaus alalla aikaisemmin tunnettuun tekniikkaan, tulisi mai nita kolmas menetelmä puhdistetun transferriinin valmistamiseksi ihmisen plasmasta; se on kuvattu patenttihakemuksessa PCT/US97/09808. Kuvattu prosessi alkaa osittain puhdiste-30 tusta Cohnin fraktion IV liuoksesta, joka saadaan käyttäen useita saostusvaiheita ja ionin-vaihtokromatografiaa. Transferriinin lisäpuhdistus käsittää konsentroinnin ja ultrasuoda-tuksen, liuotin-detergenttikäsittelyn, anioninvaihtokromatografian, konsentroinnin ja virus-suodatuksen. Vaikka tämä tunnettuun tekniikkaan kuuluva menetelmä saa aikaan virustur- 4 104466 vallisen transferriinikoostumuksen, julkaisussa ei lainkaan esitetä, että sitä voitaisiin käyttää terapeuttisesti käyttökelpoisten transferriinikoostumusten formuloinnissa, joilla olisi suuri kapasiteetti sitoa rautaa. Lisäksi tunnettu menetelmä on melko monimutkainen trans-ferriinin puhdistamiseksi Cohnin fraktiosta IV, joka on plasman fraktioinnista helposti 5 saatavilla oleva aloitusmateriaali.

Tästä voidaan päätellä, ettei tunnettu tekniikka tarjoa käyttöön transferriinin farmaseuttisia koostumuksia, joita voitaisiin käyttää turvallisesti ja tehokkaasti potilaiden solunulkoisen NTBI:n sitomiseksi haitattomaan muotoon. Alan tunnettu tekniikka ei liioin tarjoa käyt-10 töön mitään muita turvallisia ja tehokkaita menetelmiä NTBI:n potilaille haitallisten vaikutusten estämiseksi. Sen vuoksi tämä keksintö tähtää siihen, että se tarjoaa käyttöön terapeuttisesti hyödyllisen transferriinikoostumuksen, josta puuttuvat tunnettujen valmisteiden haittapuolet. Lisäksi tämä keksintö tarjoaa käyttöön tehokkaan menetelmän NTBI:n potilaille aiheuttamien haitallisten vaikutusten estämiseksi.

15

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan farmaseuttinen koostumus, joka sisältää virusturvallista apotransferriiniä, jolla on korkea raudansitomiskapasiteetti, ja josta aggregoituneet ja muuten denaturoituneet proteiinit ja muut mahdollisesti haitalliset epäpuhtaudet puuttuvat, ja jota voidaan antaa potilaille turvallisesti NTBI:n haittavaikutusten 20 estämiseksi.

Esillä olevan keksinnön toinen tarkoitus on saada aikaan uusi menetelmä apotransferriinin valmistamiseksi ja puhdistamiseksi, ja sen formuloimiseksi farmaseuttisesti hyödylliseksi valmisteeksi, joka soveltuu intravenaaliseen infuusioon.

25

Keksinnön kolmas tarkoitus on saada aikaan menetelmä turvallisten ja tehokkaiden farmaseuttisten apotransferriinikoostumusten tuottamiseksi, joita voidaan antaa sytotoksista hoitoa saaville potilaille estämään NTBI:n haitalliset vaikutukset.

30 Edellä esitetyt, ja muut keksinnön tarkoitukset, samoin kuin sen edut verrattuna tunnettui- s 104466 hin farmaseuttisiin koostumuksiin, valmistusmenetelmiin ja terapeuttisiin menetelmiin, tulevat esille seuraavasta keksinnön yksityiskohtaisesta selityksestä, ja kuuluvat keksintöön, kuten seuraavassa on kuvattuja kuten patenttivaatimuksissa esitetään.

5 Keksintö perustuu siihen havaintoon, että tehokkaan määrän puhdasta ja virusturvallista transferriinia sisältävää farmaseuttista koostumusta, jolla on suuri raudansitomiskapasi-teetti, voidaan antaa turvallisesti potilaille, jotka saavat sytotoksista hoitoa, ja sillä tavalla estää NTBI:n potilaille haitalliset vaikutukset. Lisäksi keksintö perustuu siihen havaintoon, että tällaiset transferriinin farmaseuttiset koostumukset voidaan tuottaa ihmisen plasmasta 10 liuottamalla transferrini Cohnin fraktiosta IV olosuhteissa, jotka säilyttävät transferriinin raudattomassa apotransferriinimuodossa vesiliuoksessa, puhdistamalla apotransferriini kationinvaihtokromatografian ja anioninvaihtokromatografian yhdistelmällä, ja eliminoimalla virukset ja muut fysikaaliskemiallisesti resistentit infektoivat aineet tekemällä apo-transferriinivalmisteelle vähintään kaksi virusten inaktivointi/poistovaihetta olosuhteissa, 15 jotka eivät aiheuta olennaisesti mitään proteiinien denaturoitumista.

Edellä kuvattujen menetelmävaiheiden tuloksena on mahdollista saada apotransferriinin farmaseuttinen koostumus, jossa apotransferriinin puhtaus on enemmän kuin 98 % ja jossa koostumus sisältää vähemmän kuin 3 % transferriinidimeerejä, eikä lainkaan osoitettavissa 20 olevia transferriinipolymeerejä tai aggregaatteja. "Ei osoitettavissa oleva" määrä transfer-riinipolymeerejä ja aggregaatteja tarkoittaa, ettei kokoekskluusionestekromatografiassa ·· havaita huippuja, menetelmän alemman detektiorajan ollessa noin 1 %, edullisesti vähem män kuin 0,5 %. Apotransferriinikoostumuksen rautasaturaatio on vähemmän kuin 2 %, ja sillä on enemmän kuin 90 % raudattoman transferriinin teoreettisesta raudansitomiskapa-25 siteetista tutkittuna rautatitraatiolla. Apotransferriinikoostumus soveltuu laskimonsisäiseen infuusioon.

* Kuten alan ammattilaiselle on ilmeistä, tämän keksinnön mukaiset apotransferriinikoostu- mukset voivat sisältää erilaisia tunnettuja apuaineita ja stabilointiaineita, kuten albumiinia, 30 sokereita ja polyoleja. Edellä mainitut rajat puhtaudelle, rautasaturaatiolle ja raudansitomi- skapasiteetille on laskettu koostumuksen apotransferriiniosuudesta.

Kuten jäljempänä esitetyt koetulokset osoittavat, uusi apotransferriinikoostumus saa aikaan 104466 6 erinomaiset tulokset, kun sitä annetaan potilaille, jotka saavat sytotoksista hoitoa.

Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaisille koostumuksille on pääasiassa tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

5

Keksinnön mukaiselle uudelle menetelmälle apotransferriinikoostumusten tuottamiseksi on puolestaan tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 5 tunnusmerkkiosassa.

Apotransferriinivalmisteen käytölle farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi NTBI.n 10 haittavaikutusten estämiseksi potilailla on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 11 tunnusmerkkiosassa.

Esillä olevalla keksinnöllä saavutetaan merkittäviä etuja. Niinpä keksinnön mukainen tuotantoprosessi saa aikaan hyvin puhdistetun ja virusturvallisen apotransferriinin, joka säi-15 lyttää täyden raudansitomiskapasiteettinsa. Menetelmällä on kapasiteetti eliminoida viruksia ja muita infektoivia aineita, joiden fysikaaliskemialliset ominaisuudet ovat erilaisia. Apotransferriinia tuotetaan mahdollisimman pienellä määrällä menetelmävaiheita, mikä tekee mahdolliseksi käyttää keksintöä tuotteen suuren mittakaavan taloudellisessa tuotannossa.

20

On tärkeää, että tämän keksinnön mukainen apotransferriinikoostumus sitoo tehokkaasti NTBI:tä haitattomaan muotoon, kun sitä annetaan intravenaalisena injektiona tai infuusio-na potilaille. Keksinnön mukaisesti potilaiden veriplasman kyky vastustaa multiresistentti-en bakteereiden kasvua voidaan palauttaa antamalla heille tehokas määrä farmaseuttista 25 koostumusta. Esillä olevan keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus ei sisällä viruksia, denaturoituja muotoja transferriinista tai muita haitallisia komponentteja, ja sitä voi-: daan antaa turvallisesti intravenaalisena injektiona tai infuusiona jopa kriittisessä tilassa oleville potilaille. Antamalla tämän keksinnön mukaista farmaseuttista apotransfer-riinivalmistetta potilaille, jotka saavat suuriannoksista sytotoksista hoitoa, NTBI voidaan 30 sitoa muotoon, jota palautuva luuydin voi myöhemmin käyttää hyväksi verisolujen muodostamiseen. Näin ollen keksintö kohdistuu apotransferriinin terapeuttiseen käyttöön poti- 104466 7 laille, jotka saavat sytotoksista hoitoa, ja muihin kliinisiin tiloihin, joissa seerumin transfer-riini on saturoitunut raudan suhteen ja seerumissa on NTBI:tä. Tällaisiin kliinisiin tiloihin kuuluvat hemodialyysipotilaiden ja vaikeata maksan vajaatoimintaa sairastavien potilaiden parenteraalinen raudan korvaaminen.

5

Seuraavassa keksintöä tarkastellaan lähemmin yksityiskohtaisen kuvauksen ja muutamien sovellutusesimerkkien avulla.

Kuviossa 1 on esitetty kokoekskluusionestekromatogrammi tämän keksinnön mukaiselle 10 koostumukselle; nuolet osoittavat eri molekyylilajien retentioaikoja,

Kuviossa 2 on esitetty urea-polyakryyliamidigeelielektroforeesi, joka on suoritettu suuren raudansitomiskapasiteetin omaavalle apotransferriinivalmisteelle ennen (kaista 1) rau-tasaturointia ja vastaavasti tämän jälkeen (kaista 2). Standardi, joka sisältää kaikki transfer-riinin raudan muodot, on ajettu kaistalla 3.

15 Kuviossa 3 on esitetty eri transferriinivalmisteiden raudansitomiskapasiteetti määritettynä lisäämällä suurenevat määrät ferrirautaa transferriinivalmisteisiin ja seuraamalla raudan sitoutumista absorbanssilla 450 nm.

Kuviossa 4 on esitetty esillä olevan keksinnön mukaisen farmaseuttista apotransferriini-koostumuksen yhden injektion (100 mg/kg) vaikutukset seerumin NTBI.hin ja bakteerien 20 kasvuun suuriannoksista sytotoksista terapiaa saavan leukemiapotilaan seerumissa. Seerumin NTBI määritettiin bleomysiinillä osoitettavalla raudanmääritysmenetelmällä (bleomycin detectable iron, BDI) ja bakteerien kasvu multiresistentillä Staphylococcus epidermidis -kannalla.

Kuviossa 5 on esitetty Staphylococcus epidermidiksen kasvu seeruminäytteissä ennen 25 tämän keksinnön mukaisen farmaseuttisen apotransferriinikoostumuksen yhden injektion (100 mg/kg) antamista suuriannoksista sytotoksista terapiaa saavalle leukemiapotilaalle sekä sen jälkeen. Vertailun vuoksi on esitetty kasvu normaalissa seerumissa ja rikkaalla ravintoalustalla.

8 104466

Virusturvallisen. puhtaan, suuren raudansitomiskapasiteetin omaavan apotransferriinin tuottaminen

Esillä olevaan keksintöön kuuluvan menetelmän mukaisesti ihmisplasman virusturvallisen 5 transferriinin valmistus aloitetaan Cohnin fraktion IV tahnasta, joka liuotetaan veteen. Jotta estettäisiin raudan sitoutuminen transferriiniin, pH pidetään alle 6,0:ssa ja rautaa sitomaan lisätään kelatoivaa ainetta. Apotransferriini esipuhdistetaan ja konsentroidaan sitomalla se kationinvaihtokromatografiahartsiin ja eluoimalla se nostamalla pH:ta. Esipuhdistetusta apotransferriinista inaktivoidaan virukset käyttämällä orgaanista liuotinta ja detergenttiä.

10 Apotransferriini sidotaan anioninvaihtokromatografiahartsiin ja eluoidaan nostamalla suo-lakonsentraatiota. Tuotteen proteiinikonsentraatio ja koostumus säädetään ultrasuodatta-malla. Tuote suodatetaan käyttäen virustenpoistosuodatinta. Valmiste steriloidaan suodattamalla ja täytetään aseptisesti säiliöihin. Tuotetta voidaan säilyttää joko nestemäisenä tai se voidaan kylmäkuivata.

15 Tämän keksinnön edullisessa sovellutusmuodossa Cohnin fraktion IV tahna liuotetaan veteen tai puskuriliuokseen, jonka ionivahvuus on pieni (< 5 mS/cm). Kun käytetään tyypillistä Cohnin fraktiota IV, liuoksen pH pidetään alle 6,0:ssa, mikä ei vaadi pH:n säätämistä. Edullinen pH-alue on 5,4-5,9. Liuokseen lisätään kelatoivaa ainetta, esim. etyleenidiamii-20 nitetraetikkahappoa (EDTA) tai sen suoloja konsentraatioon 1-10 mmol/1. Liuos kirkastetaan suodattamalla käyttämällä syväsuodatinta ja saatu kirkas liuos kerätään talteen. Apo-.· transferriinin osittainen puhdistaminen ja konsentraatio tehdään adsorboimalla se kationin- vaihtohartsiin, joka on tasapainotettu pH 5,5-6,0:aan puskurilla, jonka ionivahvuus on alle 5 mS/cm. Kationinvaihtohartsin funktionaalinen ryhmä on joko karboksimetyyli (CM) tai 25 sulfonyyli, edullisimmin sulfopropyyli (SP), kuten SP Sepharosessa (Amersham Pharmacia Bioiech). Apotransferriini eluoidaan pylväästä käyttäen puskuria, jonka pH on 7,0-7,5. Eluaatti kerätään talteen ja eluaatin pH säädetään 7,0-7,5 :teen. pH:sta riippuvaisen eluoin-nin käyttö tekee mahdolliseksi saada liuos, jonka ionivahvuus on matala (<5 mS/cm), mikä sopii seuraavaan anioninvaihtokromatografiaan ilman puskurinvaihtoa. Edullinen eluointi-30 puskuri sisältää 40 mmol/1 Tris-HCl:oa, pH 7.5.

Osittain puhdistettu apotransferriinivalmiste käsitellään orgaanisella liuottimella, kuten tri- «< (n-butyyli)fosfaatilla joko yhdessä detergentin kanssa tai ilman sitä, jotta inaktivoidaan 104466 9 vaipalliset virukset. Edullisissa olosuhteissa orgaaninen liuotin on 0,3-prosenttista tri-(n-butyyli)fosfaattia, detergentti on 1-prosenttista polysorbaatti 80:aa tai 1-prosenttista Triton X-100:aa, ja inkubaatiota jatketaan 6-10126-30 °C:ssa. Anioninvaihtohartsin funktionaalinen ryhmä on joko dietyyliaminoetyyli (DEAE) tai kvatemäärinen ammonium (Q), edulli-5 simmin kvatemäärinen ammonium, kuten Q Sepharosessa (Amersham Phamiacia Biotech). Apotransferriini eluoidaan puskurilla, joka sisältää 60-100 mmol/1 NaCliia, edullisimmin puskurilla, joka sisältää 40 mmol/1 Tris-HCl:oa, 85 mmol/1 NaCkia, pH 7.5.

Tämän keksinnön mukaisessa edullisessa koostumuksessa puhtaan apotransferriinin pH 10 säädetään 5,8-7,2:teen. Eluointipuskuri vaihdetaan koostumuksen puskuriin, joka soveltuu intravenaaliseen infuusioon, kuten 130-150 mmol/1 NaCkiin, ja tuote konsentroidaan pro-teiinikonsentraatioon 20-100 g/1 ultrasuodattamalla. Haluttaessa, jotta varmistetaan trans-ferriinivalmisteen hyvin matala raudan saturaatio (vähemmän kuin 1 %), eluaatin pH voidaan laskea alle 5,0:n ja ennen ultrasuodatusta voidaan lisätä kelatoivaa ainetta, kuten 15 EDTA.ta.

Puhtaalle apotransferriiniliuokselle tehdään virussuodatus ennen ultrasuodatusta tai sen jälkeen, käyttämällä spesifistä virustenpoistosuodatinta, jonka huokoskoko on edullisesti 10-40, erityisesti 10-20 nm. Apotransferriiniliuos steriloidaan suodattamalla ja täytetään 20 aseptisesti steriileihin säiliöihin. Haluttaessa voidaan tehdä lyofilisointi, mutta sitä ei vaadita, koska nestemäinen koostumus on stabiili jääkaapin lämpötilassa, ja valmis infuusiota . varten ilman nesteen lisäystä.

Kuten edellä esitetystä kuvauksesta käy ilmi, tämä keksintö eroaa olennaisesti tunnetusta 25 tekniikasta, erityisesti menetelmästä, joka kuvataan patenttihakemuksessa

PCT/US97/09808 transferriinia sisältävien nestemäisten valmisteiden puhdistamiseksi. Tässä keksinnössä Cohnin fraktio IV liuotetaan happamalla alueella olevassa pH:ssa, jotta .. pidetään transferriini raudattomassa muodossa, jossa se pääasiassa on Cohnin fraktion IV

tahnassa. Tunnetussa tekniikassa käytettiin korkeampaa pH:ta, ja tuotteelle tehtiin sitten 30 saostuksia, mitä tällä keksinnöllä vältetään. Kationinvaihtokromatografiaa ja pH-eluointia ei ole käytetty tunnetussa tekniikassa. pH:sta riippuvainen eluointi tekee tunnetussa tekniikassa tyypillisesti käytetyn, ultrasuodatuksella tehdyn puskurinvaihtovaiheen tarpeetto-maksi.

104466 10

Transferriinin farmaseuttiset koostumukset, joilla on suuri raudansitomiskapasiteetti Tämän keksinnön mukaisessa farmaseuttisessa koostumuksessa olevan apotransferriinin puhtaus on enemmän kuin 98 %, ja se sisältää vähemmän kuin 3 %, edullisesti vähemmän 5 kuin 2 % dimeerejä, eikä lainkaan osoitettavissa olevia polymeerejä tai aggregaatteja (katso kuvasta 1).

Puhtautta voidaan tutkia selluloosa-asetaatilla ja natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliami-digeelielektroforeesilla ja molekyylikokojakaumaa kokoekskluusionestekromatografialla.

10 Denaturoituneiden proteiinimuotojen puuttuminen voidaan osoittaa urea-polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla ennen ja jälkeen valmisteen rautasaturaation, kuten kuviossa 2 ja esimerkissä 2 on esitetty. Transferriinin rautasaturaatio on vähemmän kuin 2 %, ja sillä on enemmän kuin 90 % (edullisesti enemmän kuin 95 %) raudattoman transferriinin teoreettisesta raudansitomiskapasiteetista. Raudansitomiskapasiteetti määritetään titraamalla rau-15 tanitrilotrietikkahapolla, kuten kuviossa 3 ja esimerkissä 2 on esitetty.

Tämän keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus soveltuu intravenaaliseen infuusi-oon tai injektioon. Apotransferriinin konsentraatio liuoksessa on 20-100 g/1, jotta tehdään mahdolliseksi antaa apotransferriinia tehokkaina määrinä aiheuttamatta ylimääräistä tila-20 vuuslisäystä potilaille. Valmiste voidaan lyofilisoida ja palauttaa ennalleen ennen antamista, tai se voidaan säilyttää liuoksena, joka on valmiina antamista varten. Liuoksen pH on 5,8-7,2, mikä on edullisinta nestemäisen tuotteen stabiliteetille. Liuoksen osmolaalisuus on edullisesti vähintään 240 mosmol/1, mikä voidaan saavuttaa lisäämällä natriumkloridia ja/tai orgaanisia molekyylejä, kuten sokereita, polyoleja tai aminohappoja. Koostumuksiin 25 voidaan lisätä farmaseuttisesti hyväksyttäviä täyteaineita ja stabilointiaineita, kuten albumiinia, sokereita ja erilaisia polyoleja, tyypillisesti määrinä alueella 0-50 painoprosenttia aktiivisen proteiinin määrästä. Nestemäinen koostumus on edullinen, koska sitä on taloudellista tuottaa, ja se on valmista annettavaksi ilman nesteen palauttamista.

Π 104466

Hoitomenetelmät Tämän keksinnön mukainen transferriinikoostumus on terapeuttisesti käyttökelpoinen patologisissa tiloissa, joita luonnehtii NTBI:n läsnäolo potilaan seerumissa. Farmaseuttisen 5 koostumuksen anto on erityisen hyödyllistä pahanlaatuisten sairauksien sytotoksisen terapian aikana, kuten sytotoksisen kemoterapian ja/tai sytotoksisen sädehoidon aikana, sekä myeloablatiivisen hoidon aikana, joka liittyy luuytimen kantasolujen siirtoihin. Koostumuksen anto on hyödyllistä myös uremiaan liittyvän anemian parenteraalisesti annettavalla raudalla tehdyn hoidon yhteydessä ja vakavan maksan vajaatoiminnan aikana.

10

Farmaseuttinen koostumus annetaan potilaille intravenaalisena injektiona tai infuusiona. Apotransferriinin tehokkaat annokset vaihtelevat 50-250 mg/kg kliinisen tilan mukaan. Useimmat potilaat, jotka saavat sytotoksista terapiaa, vaativat toistuvia annoksia apotrans-ferriinia 1-3 päivän välein. Annosta voidaan pienentää antokertojen toistuessa.

15

Farmaseuttisen koostumuksen mukainen apotransferriini sitoo solunulkoista NTBI:tä haitattomaan muotoon, ja estää NTBI:n haittavaikutuksia potilaille. Näihin haittavaikutuksiin kuuluvat toksiset vaikutukset, joita NTBI:n aikaansaamat vapaat radikaalit aiheuttavat; näihin kuuluvat mukosiitti ja maksan ja sydämen vauriot, ja NTBI:n aikaansaamat mikro-20 bikasvua edistävät vaikutukset potilaiden plasmassa ja solunulkoisissa nesteissä. Lisäksi apotransferriini sitoo NTBI:tä muotoon, jota palautuva luuydin voi käyttää. Näin ollen farmaseuttinen koostumus vähentää kemoterapiaan ja sädehoitoon liittyvää toksisuutta elimille ja lisää potilaiden vastustuskykyä bakteeri-ja sieni-infektioita vastaan. Lisäksi se edistää luuytimen palautumista luuytimen kantasolujen siirron jälkeen.

25

On merkillepantavaa, että apotransferriinikoostumuksen anto lisää seerumin rautakonsent-raatiota, mikä on päinvastaista kuin aikaisemmin on esitetty. Ward et ai. (J Trauma 41, * 356-364,1996) esittivät, että jos puhdistetun apotransferriinin anto voisi pienentää korkeaa seerumin rautamäärää normaaleihin tasoihin, leukemiapotilaiden resistenssi infektioita 30 vastaan saattaisi lisääntyä. Tämä keksintö osoittaa, että transferriinikoostumuksen aikaansaaman bakteerien kasvun inhibitiomekanismin takana on NTBI:n sitominen haitattomaan muotoon, eikä seerumin korkean rautatason alentaminen.

• · 104466 12

Kuvatun farmaseuttisen koostumuksen turvallisuus ja tehokkuus NTBI:n sitomisessa haitattomaan muotoon, kun sitä annetaan potilaille, on osoitettu esimerkissä 3.

Yhdistelmä-DNA-teknoloeialla tuotettu transferriini 5 Tämän keksinnön mukaisesti farmaseuttinen apotransferriinikoostumus voidaan valmistaa ihmisen plasman transferriinista tai ihmisen transferriinista, jota tuotetaan yhdistelmä-DNA-teknologian avulla. Ihmisen transferriiniproteiinia koodittavan cDNA:n kloonaus ja sekvensointi on kuvattu US-patentissa 5.026.651. Tämä cDNA-sekvenssi voidaan trans-10 fektoida sopivaan isäntään, jotta tuotettaisiin yhdistelmäproteiinia massatuotannossa, esimerkiksi eläin- tai hiivasoluviljelmiin tai transgeenisiin eläimiin. Yhdistelmäproteiini voidaan puhdistaa käyttäen sopivaa yhdistelmää tekniikoista, mukaanluettuna tässä keksinnössä kuvatut, jotta saadaan puhdas apotransferriinivalmiste, ja tämän keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus voidaan tuottaa puhdistetusta yhdistelmäproteiinista. Tämän 15 keksinnön selityksen mukaista yhdistelmätransferriinikoostumusta voidaan antaa potilaille NTBI:n haittavaikutusten estämiseksi samalla tavalla kuin plasmasta peräisin olevaa apo-transferriinikoostumusta.

Seuraavat esimerkit selventävät keksintöä rajoittamatta sitä: 20

Esimerkeissä käytetyt analyyttiset menetelmät •

SDS-PAGE

Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) toteutettiin 25 käyttäen 10-prosenttisia geelejä ei-pelkistävissä olosuhteissa. Geelit värjättiin käyttämällä hopeavärjäystä.

Selluloosa-asetaattielektroforeesi Määritys toteutettiin sen menetelmän mukaisesti, joka on kuvattu julkaisussa Ph. Eur. 3.

30 painos 2.2.31 (1997).

• I

13 104466

Molekyylikokoerottelu Määritys toteutettiin kokoekskluusionestekromatografialla menetelmän mukaisesti, joka on kuvattu julkaisussa Ph. Eur. 3. painos 2.2.29 (1997) ja 2.2.30 (1997) ihmisen albumiinille. Esimerkki kromatogrammista on esitetty kuviossa 1.

5

Urea-PAGE

Urea-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (urea-PAGE) toteutettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu (Williams et ai., Biochem J 173, 535-542), käyttämällä 6-prosenttisia geelejä, joissa oli 6 M ureaa. Geelit värjättiin Coomassie-sinisellä. Esimerkki urea-PAGE:sta on 10 esitetty kuviossa 2.

Raudansitomiskapasiteetti

Transferriinin raudansitomiskapasiteetti määritettiin ferrinitrilotrietikkahapolla, kuten aikaisemmin on kuvattu (Welch ja Skinner, Comp Biochem Physiol 93B, 417-424, 1989).

15 Raudan sitoutumista transferriiniin mitattiin seuraamalla absorbanssin lisääntymistä 450 nm:ssa. Raudansitomiskapasiteetti laskettiin käyttämällä yhtälöä (1):

Raudansitomiskapasiteetti (%) = [Fe-titrattu] (1) _x 100% 20 [Fe-teoreettinen] jossa [Fe-titrattu] = Lisätyn raudan määrä transferriinin saturoimiseksi titraatiossa (mol/1) .· [Fe-teoreettinen] = Raudan määrä, joka tarvitaan teo- 25 reettisesti saturoimaan transferriini (mol/1) [Fe-teoreettinen] laskettiin yhtälön (2) mukaisesti: 30 [Fe-teoreettinen] = Proteiinipitoisuus (g/1) x 2 (2) jossa 35 Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä biuret-menetelmää

Mjransfemini= transferriinin molekyylipaino, 79570 (g/mol)

Tulokset eri transferriini valmisteiden raudansitomiskapasiteetin määrityksestä on esitetty • · 14 104466 kuviossa 3.

Kokonaisproteiini

Kokonaisproteiini määritettiin biuret-menetelmällä käyttäen standardina ihmisen seerumin 5 albumiinia (Kokonaisproteiinistandardi, Suomen Punainen Risti, Veripalvelu, Helsinki, Suomi).

Prekallikreiiniaktivaattori

Prekallikreiiniaktivaattoriaktiivisuus määritettiin julkaisun Ph. Eur. 3. painos 2.6.15 (1997) 10 mukaisesti.

Rautasaturaatio

Transferriinin rautasaaturaatio määritettiin mittaamalla transferriinin rautapitoisuus käyttäen ferrotsiini-menetelmää ("Iron without deproteinization"-pakkaus, Boehringer Mannheim 15 Diagnostics GmbH) ja laskemalla transferriinin rautasaturaatio yhtälön (3) mukaisesti:

Rautasaturaatio % = [Fe-transferriini] _x 100 % (3) [Fe-teoreettinen] 20 jossa [Fe-transferriini] = Määritetty transferriinin rautakon- sentraatio (mol/1) . [Fe-teoreettinen] = Raudan määrä, joka tarvitaan teo- 25 reettisesti saturoimaan transferriini (mol/1), katso yhtälö (2) BDI-määritvs

Transferriiniin sitoutumaton rauta määritettiin seeruminäytteistä käyttäen bleomysiinillä 30 osoitettavaa rautamääritystä (BDI), kuten aikaisemmin on kuvattu (Evans ja Halliwell, Meth Enzymol 233, 82-92,1994).

Bakteerien kasvuindeksi

Kasvuindeksi laskettiin kasvukäyristä seeruminäytteillä, joihin oli siirrostettu bakteereita. 35 Seeruminäytteet laimennettiin 1/5 puskuroituun ravintoalustaan, jossa raudan konsentraatio oli erittäin matala (Reeves et ai. J Bacteriol 154, 324-329, 1983), jotta vältettäisiin pH:n 104466 15 muutokset kasvun aikana. Näytteisiin lisättiin ymppi multiresistenttiä kantaa Staphylococcus epidermidtksestä, joka oli eristetty leukemiapotilaalta, jolla oli septinen infektio, ja näytteitä inkuboitiin 37 °C:ssa ravistelussa. Kasvua mitattiin optisen tiheyden (absorbanssi) yksikköinä. Kontrolleina käytettiin normaalia ihmisen seerumia ja rikasta ravintolientä 5 (Trypticase-soijaliemi, bioMerieux). Tyypilliset kasvukäyrät on esitetty kuviossa 5.

Kasvuindeksi laskettiin yhtälön 4 mukaan:

Kasvuindeksi = Potilaan seerumin μ/lag 10 _ (4)

Rikkaan ravintoliemen μ/lag jossa μ= spesifinen kasvunopeus eksponentiaalisen kasvu- 15 vaiheen aikana (h1) lag= kasvun lag-vaihe (t)

Jos kasvua ei osoitettu, kasvuindeksi oli 0.

20 Esimerkki 1 Tässä esimerkissä kuvataan, miten raudan suhteen tyhjennetty, virusturvallinen transfer-riinivalmiste voidaan tuottaa ihmisen plasmasta.

25 Aloitusmateriaali oli noin 20 kg Cohnin fraktion IV tahnaa, joka liuotettiin 250 litraan pyrogeenitonta vettä. Proteiiniliuos otettiin talteen levysuodatuksella käyttämällä suoda-tusapuaineita. Suodatuksen jälkeen saatiin noin 300 kg liuosta. Liuokseen lisättiin EDTA:aa konsentraatioon 5 mmol/1. Liuos syötettiin kromatografiapylvääseen, joka oli pakattu SP Sepharose-geelillä (Amersham Pharmacia, Ruotsi) ja tasapainotettu 40 mmol/1 30 natriumasetaattipuskurilla, pH 5,9. Ei-toivottu proteiini ja muut epäpuhtaudet huuhdeltiin pois tasapainotuspuskurilla. Transferriini eluoitiin 40 mmol/1 Tris-HCl-puskurilla, pH 7,5. Eluoidun, osittain puhdistetun apotransferriinin pH säädettiin arvoon 7,3 eluointipuskurilla. Lisättiin 1 % (w/w) Tween 80:aa ja 0,3 % (w/w) tri-(n-butyyli)fosfaattia ja liuosta käsiteltiin 26°C:ssa 10 tuntia. Osittain puhdistettu transferriiniliuos syötettiin kromatografia-• 35 pylvääseen, joka oli pakattu Q Sepharose-geelillä (Amersham Pharmacia, Ruotsi) ja esi- 104466 16 tasapainotettu 40 mmol/1 Tris-HCl-puskurilla, pH 7.5. Liuotin-ja detergenttikemikaalit ja proteiiniepäpuhtaudet huuhdeltiin pois tasapainotuspuskurilla. Apotransferriini eluoitiin käyttämällä 40 mmol/1 Tris-HCl-puskuria, pH 7,5 jossa oli 85 mmol/1 natriumkloridia.

5 Puhtaan apotransferriiniliuoksen pH säädettiin arvoon 6,0 käyttämällä natriumasetaattipus-kuria, pH 4. Puskuri vaihdettiin 150 mmol/1 natriumkloridiin käyttämällä diasuodatusta ultrasuodatusyksikössä. Liuos konsentroitiin lopuksi käyttämällä samaa välineistöä prote-iinikonsentraatioon 55 g/1. Liuos esisuodatettiin käyttämällä 0,1 pm suodatinta (Gelman, Supor, USA) ja virussuodatettiin tangentiaalivirtausmoodissa käyttämällä 15 nm virus-10 suodatinta (Asahi Industries, Japan) ja transferriini otettiin talteen. Puhdas ja virusturvalli-nen tuote steriilisuodatettiin ja täytettiin aseptisesti infuusiopulloihin.

Esimerkki 2 15 Tässä esimerkissä kuvataan esimerkin 1 mukaisesti tuotetun apotransferriinin kemialliset ja biokemialliset ominaisuudet. Tyypillisen tuote-erän tulokset on esitetty taulukossa 1.

„ 104466

Taulukko 1 Tulokset transferriinierästä, joka on tuotettu esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti

Ominaisuus Määrittely Tulos

Puhtaus SDS- Vaintransferriinijuovatnä- Vain transferriinijuovat nä- PAGE:lla (ei-pelkist.) kyvissä kyvissä

Puhtaus selluloosa- >98 % β-globuliinia >99,7 % β-globuliinia asetaattielektro- foreesilla

Molekyylikoko- >97 % monomeeriä 99 % monomeeriä erottelu HPLCrllä <3 % dimeeriä (mukaan- 1 % dimeeriä (mukaanluet- luettuna IgG) tuna IgG) 0 % polymeerejä tai aggre- 0 % polymeerejä tai aggregaatteja gaatteja (Kuva 1)

Puhtaus urea- Vain apotransferriinijuova Vain apotransferriinijuova PAGE :11a näkyvissä. Rautasaturaation näkyvissä. Rautasaturaation jälkeen täydellinen muutos jälkeen täydellinen muutos diferritransferriiniksi. diferritransferriiniksi (Kuva 2).

• — “ — 1 '· 11 1 “

Raudansitomis- >90 % 96 % kapasiteetti

Rautasaturaatio <2 % 0,8 %

Prekallikreiini- < 1 IU/ml < 1 IU/ml aktivaattori • · 18 104466

Esimerkki 3 Tämä esimerkki osoittaa, kuinka farmaseuttista apotransferriinikoostumusta voidaan antaa turvallisesti potilaille, sitomaan transferriiniin sitoutumatonta rautaa (NTBI) haitattomaan 5 muotoon, ja estää NTBI :n potilaille aiheuttamat haitalliset vaikutukset.

Esimerkin 2 mukaista apotransferriinikoostumusta annettiin 6 leukemiapotilaalle, jotka olivat saaneet allogeenisen luuydinsiirron 3 päivää aikaisemmin ja sitä edeltävän myeloa-blatiivisen hoidon, joka käsitti kehon kokonaissäteilytyksen 12 Gy:llä ja syklofosfamidia 10 120 mg/kg. Kaikki seeruminäytteet olivat positiivisia NTBI:n suhteen kolme päivää suuri- annoksisen sytotoksisen terapian aloittamisen jälkeen, ja näillä potilailla NTBI tyypillisesti pysyy positiivisena jopa 3 viikkoa. Yksi annos apotransferriinia (100 mg/kg) annettiin in-travenaalisena injektiona, mikä johti NTBI:n nopeaan häviämiseen kaikkien potilaiden seeruminäytteistä. NTBI määritettiin bleomysiinillä osoitettavalla raudanmäärityksellä 15 (BDI), joka perustuu NTBI:n indusoimaan DNA:n hajoamiseen, ja joka mittaa NTBI:n vapaita radikaaleja synnyttävää aktiivisuutta. Yhden injektion terapeuttisen vaikutuksen kesto vaihteli 12 tunnista enemmän kuin 12 päivään eri potilailla.

Bakteerien kasvu estyi potilaiden seeruminäytteissä samanaikaisesti NTBI:n radikaaleja 20 synnyttävän aktiivisuuden häviämisen kanssa transferriinikoostumuksen antamisen jälkeen. Multiresistentti Staphylococcus epidermidis -kanta, joka oli eristetty leukemiapotilailta, ja . joka ei kasvanut normaalilla seerumilla, kasvoi kaikkien potilaiden seeruminäytteissä en- nen apotransferriinin antamista. Bakteerit eivät kasvaneet millään seeruminäytteellä, joka oli otettu transferriinin antamisen jälkeen, ja niiden kasvu uudelleen alkoi hitaasti useim-25 missä seeruminäytteissä, jotka oli otettu 12 tunnista 2 päivään transferriin antamisen jälkeen. Yhdellä potilaalla kasvun inhibitio säilyi enemmän kuin 12 päivää. Koska S. epider-.. midis -kanta oli resistentti muille antibiooteille kuin vankomysiinille, potilaiden saama kemoterapia ei vaikuttanut sen kasvuun seeruminäytteissä, kun vankomysiinihoidon aikana otetut näytteet karsittiin pois.

30

Kuvio 4 esittää NTBI:n häviämisen (BDI-määritys) ja bakteerien kasvun inhibition transferriinin annon tuloksena yhdelle tyypilliselle leukemiapotilaalle, joka sai myeloablatiivista • hoitoa. Kuviossa 5 esitetään multiresistentin S. epidermidiksen kasvukäyrät leukemiapoti- 19 104466 laan seeruminäytteissä ennen ja jälkeen transferriinin antamisen. Potilailla havaittujen vaikutusten riippuminen apotransferriinikoostumuksen antamisesta osoitettiin myös lisäämällä transferriinivalmistetta in vitro seeruminäytteisiin, jotka sisälsivät NTBIrtä. BDI-analyy-sillä määritetty radikaaleja synnyttävä aktiivisuus inhiboitui annoksesta riippuvaisella ta-5 valla kun seeeruminäytteisiin lisättiin apotransferriinivalmistetta. Samalla tavalla, apotrans-ferriinivalmisteen anto inhiboi tehokkaasti S. epidermidis ja Escherichia coli -kantojen kasvua seeruminäytteissä.

Transferriinikoostumuksen antaminen lisäsi sekä seerumin transferriinia että seerumin ko-10 konaisrautakonsentraatiota kaikilla potilailla. Keskimääräinen seerumin transferriini lisääntyi l,5:stä 3,5:teen g/1 ja seerumin rauta 34:stä 53:een pmol/l. Transferriini-rautamuotojen määrittäminen potilaiden seeruminäytteistä urea-PAGE:lla osoitti, että annetta apotransferriini muunnettiin mono-ja diferritransferriineiksi. Tämä osoittaa, että mekanismi bakteerien kasvun inhibition ja NTBI:n häviämisen takana transferriinikoostumuk-15 sen annon seurauksena, oli NTBI:n sitominen haitattomaan muotoon, eikä seerumin korkean rautatason pieneneminen.

Farmaseuttista valmistetta annettiin toiseen kliiniseen tilaan vastasyntyneelle vauvalle, joka kärsi synnynnäisestä letaalista metaboliahäiriöstä, jota luonnehti vaikea maksan vajaatoi-20 minta, matala seerumin transferriini ja erittäin korkea NTBI-konsentraatio seerumissa (Fellman et ai., Lancet 351,490-493, 1998). Toistuvat apotransferriinin antokerrat, keskimäärin 200 mg/kg, poistivat NTBI:n seerumista väliaikaisesti. Samalla potilaalla veren vaihto ei merkitsevästi vähentänyt NTBI:n määrää seerumissa, mikä korosti farmaseuttisen koostumuksen tehokkuutta NTBI:n sitomisessa.

25

Vakavia haittavaikutuksia, jotka olisivat liittyneet farmaseuttisen apotransferriinikoostumuksen antamiseen, ei havaittu seurattaessa tarkasti potilaita, jotka saivat koostumusta annoksina 100-250 mg/kg. Tämä osoitti, että tämän keksinnön mukainen farmaseuttinen apotransferriinikoostumus on hyvin siedetty, ja että sitä voidaan antaa turvallisesti jopa 30 kriittisessä tilassa oleville potilaille.

Claims (14)

20 104466

1. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää ihmisen virusturvallisen apotransferriinin, tunnettu siitä, että 5. sillä on vähintään 90 % raudattoman transferriinin teoreettisesta raudansitomiskapasi- teetista. - se sisältää vähemmän kuin 3 % transferriinidimeerejä, eikä se sisällä osoitettavissa olevia transferriinipolymeerejä tai -aggregaatteja ja - sen rautasaturaatio on pienempi kuin 2 %. 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää 20-100 g/1 apotransferriinia vesiliuoksessa, jonka pH on 5,8-7,2, ja että se soveltuu intravenaaliseen infuusioon tai injektioon.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää kylmäkuivatun apotransferriinivalmisteen, joka on palautettu liuottimella prote-iinikonsentraatioon 20-100 g/1 ennen antamista potilaille intravenaalisesti.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu sii-20 tä, että se käsittää ihmisen apotransferriinin, joka on peräisin ihmisen plasmasta tai tuotettu yhdistelmä-DNA-teknologialla. •

5. Menetelmä ihmisen virusturvallisen apotransferriiniliuoksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 25. käytetään Cohnin fraktiota IV ja liuotetaan apotransferriini Cohnin fraktiosta IV vesi- liuokseen pHtssa, joka on alle 6,0, . - puhdistetaan ja konsentroidaan apotransferriini sitomalla se kationinvaihtohartsiin ja eluoimalla se nostamalla pH:ta, - inaktivoidaan transferriinivalmisteesta virukset olosuhteissa, jotka eivät aiheuta olen-30 naisesti lainkaan proteiinien denaturaatiota, - puhdistetaan apotransferriini anioninvaihtokromatografialla, - konsentroidaan eluaatti proteiinikonsentraatioon 20-100 g/1, - tehdään puhtaalle apotransferriinille virustenpoistosuodatus joko ennen tai jälkeen kon- 21 104466 sentroinnin ja - otetaan talteen virusturvallinen apotransferriiniliuos, jonka raudansitomiskapasiteetti on enemmän kuin 90 %.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liukoisessa muo dossa olevaan fraktioon IV lisätään raudan sitomiseksi rautaa kelatoiva aine, kuten etylee-nidiamiinitetraetikkahappo.

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virusten inak-10 ti vointi toteutetaan inkuboimalla orgaanisen liuottimen kanssa joko detergentin läsnäollessa tai ilman sitä.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 5-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kationin-vaihtohartsin funktionaalinen ryhmä on karboksimetyyli tai sulfopropyyli. 15

9. Jonkin patenttivaatimuksen 5-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anionin-vaihtohartsin funktionaalinen ryhmä on joko dietyyliaminoetyyli tai kvatemäärinen ammonium.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 5-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puh taalle apotransferriiniliuokselle asetetaan pH alle 5,0 ja lisätään rautaa kelatoivaa ainetta, kuten etyleenidiamiinitetraetikkahappoa, sitomaan jäljellä olevat raskasmetalli-ionit ennen ultrasuodatusta.

11. Sellaisen virusturvallisen apotransferriinivalmisteen käyttö farmaseuttisen koostumuk sen valmistamiseksi transferriiniin sitoutumattoman raudan sitomiseksi solunulkoiseen tilaan potilaassa patologisissa tiloissa, joissa endogeeninen transferriini on saturoitunut j a ]. joissa potilaan veriplasmassa on transferriiniin sitoutumatonta rautaa, jolla valmisteella on vähintään 90 % raudattoman transferriinin teoreettisesta raudansitomiskapasiteetista, joka 30 valmiste sisältää vähemmän kuin 3 % transferriinidimeerejä eikä sisällä osoitettavissa olevia transferriinipolymeerejä tai -aggregaatteja ja jonka valmisteen rautasaturaatio on pienempi kuin 2 %. 104466

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että potilas saa sytotok-sista kemoterapiaa ja/tai sytotoksista sädehoitoa.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että potilas saa myeloa- 5 blatiivista terapiaa ja luuytimen kantasolujen siirron.

14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, tunnettu siitä että potilas kärsii maksan vajaatoiminnasta tai häntä hoidetaan parenteraalisella raudalla munuaisvikaan liittyvän anemian vuoksi. 23 104466