FI104218B - Diagnostinen menetelmä - Google Patents

Description

104218

Diagnostinen menetelmä

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää, jolla Chlamydia trachomatis -bakteerin läsnäolo voidaan osoittaa Papanicolaou-värjätyistä sytologi-5 sista sivelynäytteistä, sekä menetelmässä käyttökelpoista reagenssia.

Chlamydia trachomatis on kohdun ja sivuelinten tulehduksen eli PID.n (pelvic inflammatory disease) tärkein etiologinen tekijä. PID aiheuttaa synnytysikäisillä naisilla usein hedelmättömyyttä ja kohdunulkoisia raskauksia: yhden ainoan klamydian aiheuttaman PID:n jälkeen hedelmättömyyttä esiintyy 10 20 - 25 %:lla potilaista [Schachter, J., New England Journal of Medicine 298 (428 - 435) 1978; Svensson, L. O. et ai. Acta Obstetrica et Gynecologica Scandinavia 70 (587 - 590) 1991].

Kliinisiä näytteitä otetaan tavallisesti potilailta, joilla on taudin oireita. Oireettomia taudinkantajia kuitenkin esiintyy yleisesti varsinkin nuorissa ikä-15 luokissa (20 - 25-vuotiaat), ja näille saattaa syntyä pitkäaikaisia komplikaatiota, joiden hoito on kallista. Genitaalisten klamydiainfektioiden esiintymistiheys oireettomissa naisissa saattaa olla jopa 5,4-15 %, ja klamydiavasta-aineita on raportoitu 19,3 %:lla hedelmättömyysklinikoilla hoidettavista naisista [Edet, E. E., British Journal of Clinical Practice 47 (1993) 21 - 22; Driscoll, G. E. et ai., 20 Medical Journal of Australia 160 (1994) 46]. Chlamydia trachomatis -infektion sairastaneet tai sairastavat potilaat tulisikin löytää ja hoitaa mahdollisesta oireettomuudesta huolimatta, jotta vältyttäisiin hankalilta, henkilökohtaisia ongelmia aiheuttavilta ja yhteiskunnallekin kalliilta jälkiseurauksilta, jotka liittyvät klamydian aiheuttamiin tulehduksiin ja erityisesti niistä aiheutuvaan lapsetto-' 25 muuteen.

Chlamydia trachomatis on pienikokoinen solunsisäinen bakteeri, jonka tarttumismuoto on vain noin 0,3 mikrometrin läpimittainen nk. elemen-taarikappale. Tämä infektoiva elementaarikappale tarttuu herkästi solun pintaan, josta se fagosytoidaan solun sisään. Isäntäsolun sisässä olevissa in-30 kluusioissa klamydia monistuu lisääntymismuodokseen. Tällaisissa klamy- r l diainkluusiossa saatetaan tuottaa tuhansia uusia infektoivia elementaarikap-paleita, jotka vapautuvat soluista. Klamydiainfektiota voidaan hoitaa esimer- f kiksi tetrasykliiniä, erytromysiinillä tai klindamysiinillä, mutta hoidon epäonnistumisia on kuvattu [Jones, R. B., J. Infect. Dis. 162 (1990) 1309 - 1315; 35 Munday, P. E. et ai., Genitour. Med. 71 (1995) 24 - 26]. Tällöin seurauksena saattaa olla latentti oireeton infektio.

• 2 104218

Nykyisin on käytettävissä useita menetelmiä Chlamydia trachomatis -bakteerin toteamiseksi, esimerkiksi viljely, ELISA, immunofluoresenssi ja DNA-tekniikat. Viime vuosina rutiinimenetelmäksi klamydiainfektion toteamiseksi on yleistynyt RNA-DNA-hybridisaatio, joka tehdään lähes poikkeuksetta 5 oirehtivan potilaan virtsanäytteestä, joskus myös emättimen tai kohdunkaulan limakalvonäytteestä. Laajoja seulontaohjelmia ei ole toteutettu, vaikka tällaisen seulonnan tarve olisi ilmeinen. Laajamittaisia massaseulontaohjelmia irtosolunäytteen Papanicolaou-värjäystä käyttäen suoritetaan kuitenkin kohdunkaulan syöpien toteamiseksi monissa maissa ympäri maailmaa. Sytologisella värjäyk-10 sellä ei kuitenkaan tähän asti ole pystytty luotettavasti diagnosoimaan Chlamydia trachomatis -bakteeri-infektiota, vaikka soluvärjäys usein viittaakin infektioon. Papanicolaou-värjäyksessä käytetyt reagenssit ja olosuhteet muuttavat näytteessä mahdollisesti olevan klamydiabakteerin antigeenisyyttä, eikä bakteeria näin ollen ole aikaisemmin voitu todeta esimerkiksi vasta-15 ainereagensseilla. Klamydian toteamiseksi on aina ollut otettava oma näyt-teensä.

On ilmeistä, että oireettoman klamydiainfektion havaitseminen olisi yhteiskunnallisesti edullista ja toivottavaa. Lisäksi olisi erittäin edullista, että tämä voitaisiin yhdistää jo käytössä olevaan seulontamenetelmään, kuten 20 esimerkiksi kohdunkaulan syövän seulontaan käytettyyn irtosolututkimukseen.

Nyt on kehitetty menetelmä, jonka avulla Chlamydia trachomatis -bakteerin antigeeniset ominaisuudet yllättäen voidaan palauttaa ja bakteeri voidaan osoittaa samasta Papanicolaou-värjätystä irtosolunäytteestä, jota käytetään laajalti esimerkiksi kohdunkaulan syöpien seulonnassa, vieläpä si-25 ten, että näyte voidaan värjätä uudelleen Papanicolaou-värjäyksellä ja arkistoida tarpeen mukaan. Antigeenisten ominaisuuksien palauttaminen on mahdollista jopa kuukausien kuluttua Papanicolaou-värjätyksen suorittamisesta, jolloin on mahdollista takautuvasti todeta mahdollinen klamydiainfektio.

Tällä menetelmällä voidaan oleellisesti helpottaa klamydiainfektioi-30 den toteamista väestössä, jolle suoritetaan sytologinen irtosolututkimus. Keksintö antaa käyttöön menetelmän, jolla Chlamydia trachomatis -bakteerin läsnäolo voidaan osoittaa Papanicolaou-värjätyistä sytologisista sivelynäytteistä muuttamatta alkuperäisen näytteen solumorfologiaa.

Keksintö koskee menetelmää Chlamydia trachomatis -bakteerin 35 toteamiseksi Papanicolaou-värjätyistä sytologisista näytteistä. Menetelmä käsittää vaiheet, joissa 3 104218 a) Papanicolaou-värjätystä, objektilasilla olevasta näytteestä, josta peitinlasi on poistettu, poistetaan väri inkuboimalla värinpoistoliuoksessa, joka * on hapetinta sisältävä puskuriliuos, jonka pH on happamalla alueella, 5-30 minuuttia, ja värinpoistoliuos pestään pois näytteestä esimerkiksi hapetinta 5 sisältämättömällä puskuriliuoksella; b) näytettä inkuboidaan palautusreagenssiliuoksessa, joka sisältää maa-alkalimetallisuolakomponentin (-komponentteja), sokerikomponentin ja aminohappokomponentin puskuriliuoksessa, jonka pH on happamalla alueella, 30 min - 12 tuntia, ja palautusreagenssi pestään pois näytteestä esimerkiksi- 10 puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella; c) näytettä käsitellään liuoksella, joka sisältää leimattua tunnista-misreagenssia, joka on spesifinen Chlamydia trachomatis -bakteerille, 20 min -12 tuntia; ja d) todetaan mahdollisen Chlamydia trachomatis -bakteerin läsnä-15 olo sopivalla tavalla.

Keksinnön kohteena on myös palautusreagenssi, joka sisältää maa-alkalimetallisuolakomponentin (-komponentteja), sokerikomponentin ja aminohappokomponentin puskuriliuoksessa, jonka pH on happamalla alueella.

Keksinnön kohteena on vielä menetelmä Chlamydia trachomatis -20 bakteerin antigeenisyyden palauttamiseksi Papanicolaou-värjätyssä sytologisessa näytteessä käsittelemällä näytettä keksinnön mukaisella palautusrea-genssilla.

Kuvio 1 on fluoresenssimikroskooppikuva, jossa näkyy Chlamydia trachomatis -bakteerin elementaarikappaleita kirkkaina pisteinä Buffalo Green 25 Monkey -soluviljelmässä.

Kuvio 2 on fluoresenssimikroskooppikuva, jossa näkyy Chlamydia trachomatis -bakteerin elementaarikappaleita kirkkaina pisteinä viljelypositiivi-sen potilaan sivelynäytteessä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä värinpoistoliuoksena käytetty 30 hapetinta sisältävä puskuriliuos voi olla esimerkiksi 0,3 - 1,8-%:inen perhalo-geenihappoliuos sopivassa puskurissa, jonka pH on selvästi happamalla alueella (pH on alle 6,0, esimerkiksi 3,5 - 5,5), kuten 0,01 - 0,2 mol/l fosfaattipuskurissa, sitraattipuskurissa tai Tris-HCI-puskurissa. Edullisesti käytetään perjo-dihappoa ja sen suoloja 0,5 - 1-%:isena liuoksena 0,05 - 0,1 mol/l fosfaattipus-35 kurissa, jonka pH on 4,0 - 5,5. Erityisen edullinen värinpoistoreagenssi on 1-%:inen perjodihappo 0,1 mol/l fosfaattipuskurissa, jonka pH on 5,0.

• * 4 104218

Palautusreagenssiliuos sisältää maa-alkalimetallisuoloina kalsiumia magnesiumkloridia ja/tai mahdollisesti muita divalentteja ioneja pitoisuutena 10-40 mmol/l. Edullinen palautusreagenssiliuos sisältää 20 mmol/l kal-siumkloridia ja 20 mmol/l magnesiumkloridia. Sokerikomponentti on glukoosi 5 tai sakkaroosi pitoisuutena 5-40 mmol/l. Edullinen palautusreagenssiliuos sisältää 10-20 mmol/l, edullisimmin 15 mmol/l glukoosia. Palautusreagenssin aminohappokomponentti on jokin emäksinen tai hydrofiilinen aminohappo, esimerkiksi lysiini, määränä 10-40 mg/ml. Edullinen palautusreagenssiliuos sisältää 25 - 35 mg/ml, edullisimmin 30 mg/ml lysiiniä.

10 Palautusreagenssin pH on happamalla alueella, esimerkiksi 3,5 - 5,5. Reagenssin pohjana käytettävä puskuri voi olla mikä tahansa sopiva puskuri, kuten 0,01 - 0,2 mol/l fosfaatti-, sitraatti- tai Tris-HCI-puskuri. Edullisesti käytetään 0,1 mol/l fosfaattipuskuria, jonka pH on 3,5 - 5,5, edullisimmin 5,0.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty tunnistamisrea-15 genssi voi olla mikä tahansa leimattu poly- tai monoklonaalinen vasta-aine tai geenitekninen koetin, kunhan se on spesifinen Chlamydia trachomatis -bakteerille ja tunnistaa sen kaikki tunnetut serovaarit, eikä ristireagoi Chlamydia psittaci -bakteerin, Chlamydia pneumoniae -bakteerin tai muiden organismien kanssa, joiden tiedetään helposti ristireagoivan ainakin antiklamydia-20 vasta-aineiden kanssa. Tunnistamisreagenssi voi olla leimattu millä tahansa osoitettavissa olevalla leimalla, kuten fluoresoivalla, fosforoivalla, kemilumine-soivalla tai värileimalla, tai muulla todettavissa olevalla leimausmenetelmällä, kuten biotiini-avidiinimenetelmällä, radioaktiivisella tai entsymaattisella leimalla, kuten anaalisella fosfataasilla tai peroksidaasilla. Edullisia tunnistamisrea-25 gensseja ovat fluoresoivalla aineella, kuten fluoreskeiinilla, leimatut vasta-aineet.

Chlamydia trachomatis -bakteerin läsnäolo todetaan sisänsä tunnetulia tavalla käytetystä leimatusta tunnistamisreagenssista riippuen. Tällaiset menetelmät ovat alan ammattimiesten yleisesti tuntemia. Jos esimerkiksi käy-30 tetään fluoresoivalla leimalla varustettua vasta-ainetta, toteaminen voidaan ; tehdä fluoresenssimikroskooppisesti. Radioaktiivista leimaa käytettäessä to teaminen voidaan suorittaa autoradiografisesti. Entsyymileimaus todetaan yleensä värireaktion perusteella.

Käytön yksinkertaisuuden ja herkkyyden vuoksi edullinen leimattu 35 tunnistamisreagenssi on fluoresoivalla merkkiaineella leimattu vasta-aine, joka 104218 * 5 voidaan todeta fluoresenssimikroskooppisesti. Fluoresenssimikroskoopissa merkkiaineet saadaan näkyviin valottamalla niitä UV-valolla, joka on suoda- tettu merkkiaineelle sopivalla herätesuodattimella. Merkkiaineen lähettämä valo suodatetaan niille ominaisella emissiosuodattimella, jolloin niiden ominai-5 nen väri voidaan havaita mikroskoopissa. Vastavärit, joilla pyritään parantamaan solumorfologian erottumista (mm. Evans Blue), eivät saa heikentää merkkiaineen fluoresenssia.

Menetelmässä käytetyt inkubointiajat voivat vaihdella 5 minuutista yön yli inkubointiin. Edullisesti valitaan inkubointiajat, jotka ovat menetelmän 10 käytännön toteuttamisen kannalta sopivia esimerkiksi siten, että menetelmä voidaan kätevästi toteuttaa yhden tai työpäivän aikana. Inkubointiaika palautus- ja tunnistamisreagenssissa voi siten olla esimerkiksi 30 minuutista 2-4 tuntiin tai yli yön.

Sytologinen näyte voi olla mikä tahansa Papanicolaou-värjätty irto-15 solunäyte, josta mahdollinen Chlamydia trachomatis -bakteerin läsnäolo halutaan todeta, esimerkiksi kohdunkaulan limakalvolta, emättimen limakalvolta, silmästä tai virtsaputkesta otettu sivelynäyte. Näyte voi olla tuore Papanicolaou-värjätty sivelynäyte tai esimerkiksi arkistoitu näyte, josta myöhemmin halutaan tutkia mahdollinen Chlamydia trachomatis -bakteerin läsnäolo. Vastaa-20 vasti, sivelynäytteet voidaan värjätä uudelleen Papanicolaou-värjäyksellä arkistointia tai muita tarkoituksia varten, sillä keksinnön mukainen menetelmä ei aiheuta minkäänlaisia muutoksia solumorfologiaan.

Papanicolaou-värjätyiltä objektilaseilta poistetaan peitinlasit sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi inkuboimalla ksyleenissä, jos peitinlasit on kiin-*: 25 nitetty ksyleenipohjaisella kiinnitysreagenssilla.

Esillä oleva keksinnön mukainen menetelmä Chlamydia trachomatis -bakteerin läsnäolon toteamiseksi soveltuu erityisesti yhdistettäväksi seulontatutkimuksiin, joissa on mahdollista, että klamydiainfektiota sairastavia henkilöitä voi tulla esiin. Esimerkiksi keksinnön mukaista menetelmää käyttäen on 30 mahdollista tutkia klamydiainfektio kohdunkaulan syövän seulontatutkimuksis-sa otetuista Papanicolaou-värjätyistä sivelynäytteistä ja palauttaa sivelynäytteet alkuperäiseen muotoonsa.

Esillä olevaa keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti seuraavien esimerkkien avulla. Nämä esimerkit annetaan vain keksinnön valaisemiseksi 35 edelleen, eikä niitä tule pitää mitenkään keksintöä rajoittavina.

• · 6 104218

Esimerkki 1

Kaupallisesti saatavia Papanicolaou-värjättyjä objektilaseja (15 kpl), jotka sisälsivät Chlamydia trachomatis -elementaarikappaleita Buffalo Green Monkey -soluviljelmässä, (Cellabs Pty Ltd., Brookvale, Australia), inkuboitiin 5 ensin ksyleenissä, kunnes peitinlasi irtosi, minkä jälkeen objektilaseja pestiin puhtaalla ksyleenillä viiden minuutin ajan. Sitten objektilaseja pestiin kahdesti viiden minuutin ajan absoluuttisella etanolilla, ja tämän jälkeen väri poistettiin inkuboimalla objektilaseja liuoksessa, joka sisälsi 1-%:ista perjodihappoa 0,1 mol/l fosfaattipuskurissa (pH 5,0), 15 minuutin ajan. Värin poiston jälkeen ob-10 jektilasit pestiin 0,1 mol/l fosfaattipuskurilla (pH 5,0) vähintään kahdesti kahden minuutin ajan. Tämän jälkeen objektilaseja inkuboitiin 30 minuuttia palau-tusliuoksessa, joka sisälsi 20 mmol/l kalsiumkloridia, 20 mmol/l magnesiumklo-ridia, 15 mmol/l glukoosia, 30 mg/ml lysiiniä, 10 % normaalia hiiren seerumia ja 0,05 % natriumatsidia, kosteassa kammiossa huoneen lämpötilassa. Sitten 15 objektilasit pestiin 0,1 mol/l fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS) kahdesti kahden minuutin ajan. Objektilaseja kuivattiin viiden minuutin ajan siten, että seuraavaksi lisättävä fluoreskeiinillä leimattu vasta-aine jäi pisarana valitulle alueelle ja muu osa objektilasista sai kuivua täydellisesti. Seuraavaksi objektilasille lisättiin pisara (25 - 30 mikrolitraa) liuosta (Cellabs Pty 20 Ltd., Brookvale, Australia), joka sisälsi fluoreskeiinikonjugoitua monoklonaa-lista vasta-ainetta (Cellabs klooni 512F), joka on spesifinen Chlamydia trachomatis -bakteerin tärkeimmille ulkomembraaniproteiineille, ja Evans Blue -väriainetta, ja objektilasia inkuboitiin 60 minuuttia kosteassa kammiossa 37 °C:ssa. Lopuksi objektilasi huuhdeltiin PBS:llä, ja peitinlasi kiinnitettiin immu-25 nofluoresenssimikroskooppista tarkastelua varten.

Kontrolleina käytettiin vastaavia Papanicolaou-värjäämättömiä kont-rolliobjektilaseja (15 kpl) (Cellabs Pty Ltd., Brookvale, Australia), jotka värjättiin suoraan fluoreskeiinikonjugoidulla monoklonaalisella vasta-aineella, johon oli yhdistetty Evans Blue -väri.

30 Mikroskooppisessa tarkastelussa sytologisen tutkimuksen perus- teella valitut tutkittavat alueet objektilaseilla merkittiin timanttikynällä objektila-sin takapuolelle. Alueet, joiden halkaisija oli 8 - 10 mm, vastasivat normaalin m fluoresenssivasta-ainevärjäyksen alueita. Fluoresenssimikroskopiassa käytettiin epifluoresenssia, fluoreskeiininauhasuodatinta ja 40-, 60- tai 100-kertaisia 35 öljyimersio-objektiiveja.

• « 7 104218

Kun näytteitä tarkasteltiin fluoresenssimikroskooppisesti, kaikissa Papanicoiaou-värjätyissä objekti laseissa, jotka sisälsivät klamydian elemen-taarikappaleita, näkyi kirkkaasti fluoresoivia eiementaarikappaleita (kuvio 1). Elementaarikappaleet eivät poikenneet elementaarikappaleista, joita esiintyi 5 vastaavilla Papanicolaou-värjäämättömillä objekti laseilla.

Esimerkki 2

Chlamydia trachomatis -bakteerin kohdunkaulan irtosolusivelynäyt-teet (12 kpl), joista seitsemän näytettä oli otettu potilailta, joiden Chlamydia trachomatis -bakteeriviljely oli positiivinen, ja viisi näytettä oli potilailta, joiden 10 Chlamydia trachomatis -bakteeriviljely oli negatiivinen, kiinnitettiin suihkefiksa-tiivilla, joka sisälsi metanolia, etanolia ja Carbowaxia (Mekalasi Co, Helsinki) tai 90-%:isella etanolilla. Fluoresenssivasta-ainevärjäyksen kontrolliobjektilasit (Cellabs), jotka oli alunperin kiinnitetty absoluuttisella metanolilla, kiinnitettiin uudelleen samalla tavalla kuin potilasnäytteet. Kiinnityksen jälkeen objektilasit 15 värjättiin tavanomaisella Papanicolaou-värjäyksellä ja peitettiin peitinlasilla käyttäen ksyleenipohjaista liuosta. Sitten näytteet käsiteltiin ja värjättiin esimerkissä 1 Papanicolaou-värjätyille objektilaseille kuvatulla tavalla. Tutkittaessa keksinnön mukaisesti käsiteltyjä näytteitä fluoresenssimikroskooppisesti, kaikissa viljelypositiivissa näytteissä havaittiin eri määriä Chlamydia trachoma-20 tis -bakteerin eiementaarikappaleita (kuvio 2).

Esimerkki 3

Kymmenen nuoren aborttipotilaan virtsanäytteet tutkittiin Chlamydia trachomatis -bakteerin suhteen Base 2 RNA-DNA-hybridisaatiokitillä (Gen-Probe Inc., San Diego, Kalifornia, USA). Kolme näytteistä oli klamydiapositiivi-25 siä. Samoilta potilailta otetut kohdunkaulan Papanicolaou-värjätyt sivelynäyt-teet käsiteltiin ja värjättiin esimerkissä 1 Papanicolaou-värjätyille objektilaseille kuvatulla tavalla, ja tulokset tulkittiin sokkona tietämättä hybridisaatiomenetel-män tuloksista. Keksinnön mukainen menetelmä tunnisti samat kolme klamy-diapositiivista näytettä kuin hybridisaatiomenetelmä.

30 Esimerkki 4 -: 64 rutiiniseulontanäytteestä valittiin solumuutoksiltaan klamydia-infektioon viittaavat alueet, jotka merkittiin lasien takapuolelle timanttikynällä. Näin oli mahdollista pienentää tunnistusreagenssin määrää ja siitä aiheutuvia kuluja. Tämän jälkeen näytteet käsiteltiin ja värjättiin esimerkissä 1 Papanico-35 laou-värjätyille objektilaseille kuvatulla tavalla. Tutkituista näytteistä 39 oli sy- • < < 8 104218 tologialtaan normaaleja ja 25 näytteessä oli todettu kohdunkaulan tulehdukseen viittaavia muutoksia. Tulokset on esitetty taulukossa 1.

Kuusi (27 %) näytettä 22 näytteestä, joissa oli todettu kohdunkaulan tulehdukseen viittaavia muutoksia, oli positiivisia fluoresenssivärjäyksessä.

5 Yhdessä (2,4 %) näytteessä 42 näytteestä, jotka olivat sytologialtaan normaaleja, havaittiin fluoresenssivärjäyksessä 12 elementaarikappaletta, mikä tulkittiin positiiviseksi (taulukko 1).

Taulukko 1

Suoran fluoresenssivasta-ainevärjäyksen vertailu sytologiseen tut-10 kimukseen 64 kohdunkaulan seulonnan sivelynäytteissä

Sytologia Fluoresenssimikroskopia __(tapausten lukumäärä)_

Tulehdus_ Atypia_Positiivinen_Negatiivinen_

Lievä_jts__8_

Kohtalainen ns_2_3_

Vaikea_jts_3__

Lievä ASCUS__2_

Kohtalainen_ASCUS__1__

Vaikea_ ASCUS__J_

Lievä_ LSIL__1_

Kohtalainen_LSIL__J_ ns_ASCUS__1_ . ns LSIL 2 ns_[ns_[1_38_ ASCUS = atyyppisiä suomumaisia soluja, joiden merkitystä ei määritetty 15 LSIL = matala-asteinen epiteelinsisäinen vaurio ns = normaali sytologia

Claims (13)

1. Menetelmä Chlamydia trachomatis -bakteerin läsnäolon toteamiseksi Papanicolaou-värjätyistä sytologisista irtosolunäytteistä, tunnettu i 5 siitä, että se käsittää vaiheet, joissa a) Papanicolaou-värjätystä, objektilasilla olevasta näytteestä, josta peitinlasi on poistettu, poistetaan väri inkuboimalla värinpoistoliuoksessa, joka on hapetinta sisältävä puskuriliuos, jonka pH on happamalla alueella, 5 - 30 minuuttia, ja värinpoistoliuos pestään pois näytteestä; 10 b) näytettä inkuboidaan palautusreagenssiliuoksessa, joka sisältää maa-alkalimetallisuolakomponentin (-komponentteja), sokerikomponentin ja aminohappokomponentin puskuriliuoksessa, jonka pH on happamalla alueella, 30 min -12 tuntia, ja palautusreagenssi pestään pois näytteestä; c) näytettä käsitellään liuoksella, joka sisältää tunnistamisreagens- 15 siä, joka on spesifinen Chlamydia trachomatis -bakteerille, 20 min - 12 tuntia; ja d) todetaan mahdollisen Chlamydia trachomatis -bakteerin läsnäolo sopivalla tavalla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- 20 tä, että palautusreagenssi sisältää maa-alkalimetallisuolakomponenttina kalsium- ja magnesiumkloridia ja/tai mahdollisesti muita divalentteja ioneja pitoisuutena 10-40 mmol/l , edullisesti kalsium- ja magnesiumkloridia 20 mmol/l, sokerikomponenttina glukoosia tai sakkaroosia pitoisuutena 5-40 mmol/l, edullisesti pitoisuutena 10-20 mmol/l, ja aminohappokomponenttina lysiiniä 25 pitoisuutena 10-40 mg/ml, edullisesti 25 - 35 mg/ml, 0, 01 - 0,1 mol/l fosfaatti-, sitraatti- tai Tris-HCI-puskurissa, jonka pH on 3,5 - 5,5.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että palautusreagenssi sisältää maa-alkalimetallisuolakomponenttina 20 moml/l kalsiumkloridia ja 20 mmol/l magnesiumkloridia, sokerikomponenttina 30 15 mmol/l glukoosia ja aminohappokomponenttina 30 mg/ml lysiiniä 0,1 mol/l fosfaattipuskurissa, jonka pH on 5,0.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että värinpoistoreagenssi on 0,3 - 1,8-%:inen perhalogeenihappoliuos sopivassa puskurissa, jonka pH on alle 6,0, edullisesti 0,01 - 0,1 mol/l fosfaatti- 35 puskurissa, sitraattipuskurissa tai Tris-HCI-puskurissa, jonka pH on 3,5 - 5,5. 10 104218

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että värinpoistoreagenssi on perjodihappo tai sen suola 0,5 - 1-%:isena liuoksena 0,05 - 0,1 mol/l fosfaattipuskurissa, jonka pH on 4,0 - 5,5.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- * t 5 tä, että värinpoistoreagenssi on 1-%:inen perjodihappo 0,1 mol/l fosfaattipuskurissa, jonka pH on 5,0.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tunnistamisreagenssi on leimattu poly- tai monoklonaalinen vasta-aine tai geenitekninen koetin, joka on spesifinen Chlamydia trachomatis - 10 bakteerille ja tunnistaa sen kaikki tunnetut serovaarit, eikä ristireagoi Chlamydia psittaci -bakteerin, Chlamydia pneumoniae -bakteerin tai muiden organismien kanssa, joiden tiedetään helposti ristireagoivan ainakin antiklamydia-vasta-aineiden kanssa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu sii- 15 tä, että tunnistamisreagenssi on leimattu millä tahansa osoitettavissa olevalla leimalla, kuten fluoresoivalla, fosforoivalla, kemiluminesoivalla tai värileimalla, tai muulla todettavissa olevalla leimausmenetelmällä, kuten biotiiniavidiinime-ne-telmällä, radioaktiivisella tai entsymaattisella leimalla, kuten alkalisella fosfataasilla tai peroksidaasilla.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että tunnistamisreagenssi on fluoresoivalla aineella, kuten fluoreskeiinilla, leimattu vasta-aine.

9 104218 Patentti vaati m u kset ψ

10. Palautusreagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää maa-alkalimetallisuolakomponentin (-komponentteja), sokerikomponentin ja amino- 25 happokomponentin puskuriliuoksessa, jonka pH on happamalla alueella, jolloin maa-alkalimetallisuolakomponentti on kalsium- ja magnesiumkloridi ja/tai muu divalentti ioni pitoisuutena 10-40 mmol/l, sokerikomponentti on glukoosi tai sakkaroosi pitoisuutena 5 - 40 mmol/l, edullisesti glukoosi pitoisuutena 10 -20 mmol/l, ja aminohappokomponentti on emäksinen tai hydrofiilinen amino- 30 happo, edullisesti lysiini, pitoisuutena 10-40 mg/ml, edullisesti 25 - 35 mg/ml, * » ja puskuri on 0, 01 - 0,2 mol/l fosfaatti-, sitraatti- tai Tris-HCI-puskuri tai vastaava puskuri, jonka pH on 3,5 - 5,5.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen palautusreagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää 20 mmol/l kalsiumkloridia, 20 mmol/l magne- 35 siumkloridia, 15 mmol/l glukoosia ja 30 mg/ml lysiiniä 0,1 mol/l fosfaattipuskurissa, jonka pH on 5,0. 11 104218

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen palautusreagenssi, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää reagenssin stabilointia ja säilyvyyttä edistävää ainetta tai edistäviä aineita.

13. Menetelmä Chlamydia trachomatis -bakteerin antigeenisyyden 5 palauttamiseksi Papanicolaou-värjätyssä sytologisessa näytteessä, tunnettu siitä, että näytettä käsitellään jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukaisella palautusreagenssilla. * · \ 12 104218