FI102240B - Menetelmä hydrolysoitujen kasviproteiinien valmistamiseksi - Google Patents

Description

102240

Menetelmä hydrolysoitujen kasviproteiinien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää, jolla valmistetaan hydrolysoituja kasviproteiineja, jotka eivät sisällä ha-5 väittäviä määriä monoklooripropanolia. Tuloksena oleva hydrolysoitu kasviproteiini on puhdas ja maultaan mieto, ja sillä on huomattavia haju- ja makuominaisuuksia parantavia luonteenomaisia piirteitä.

Yleensä tavanomaisten hydrolysoitujen kasviproteii-10 nien (HVP:iden) valmistaminen suoritetaan happohydrolyy- sillä, jossa käytetään suolahappoa palautusjäähdytysolo-suhteissa, erityisesti käyttäen 6 M suolahappoa 109 °C:n lämpötilassa ja normaalissa ilmanpaineessa. On osoitettu, että kasviproteiinien hydrolysointi näissä olosuhteissa 15 saa aikaan raakaproteiinissa esiintyvistä rasva-aineiden jäännöksistä peräisin olevan glyserolin kloorautumisen, jonka tuloksena saadaan monoklooripropanoleja (MCP:itä) ja diklooripropanoleja (DCP:itä).

, Koska MCP:llä ja DCPrllä on kyseenalaisia ominai- ’ ’20 suuksia ja luonteenomaisia piirteitä, niiden esiintyminen • · · elintarvikkeissa ei ole suotavaa. DCP poistetaan helposti • · : tavallisissa menetelmissä käytettävien haihdutus- ja väke- • ,·' vöintivaiheiden aikana. Valitettavasti MCP ei poistu vaan ; väkevöityy lopputuotteeseen, ja siksi MCP:n poistamiseksi 25 lopputuotteesta täytyy suorittaa ylimääräisiä käsittely- vaiheita.

Tavallisissa HVPiiden valmistamiseksi käytetyissä • · · • · happohydrolyysimenetelmissä MCP:n ja DCP:n muodostuminen voidaan välttää käyttämällä suolahapon sijasta rikki- tai • · : *·· 30 fosforihappoa. Rikki- tai fosforihapolla hydrolysoidut • ·· ·,./· HVP:t ovat kuitenkin laadultaan huonompia, ja niissä on kitkerä maku.

• · ·

Erityinen ongelma on, että MCP saa alkunsa tavaili- * · sen happohydrolyysin aikana raakaproteiineissa esiintyvis-35 tä rasva-aineiden jäännöksistä peräisin olevien glysero- 102240 2 lien kloorautumisen tuloksena. Esimerkiksi vehnän ydinosan gluteeni, joka on noin 75-%:sesti proteiinia, sisältää myös 5,0 - 9,5 % rasvaa ja muita lipidimateriaaleja ja on runsas glyserolin lähde mono-, di- ja triglyseridien, fos-5 folipidien ja glykolipidien monimutkaisen seoksen muodos sa. Moniin tekijöihin, joiden uskotaan vaikuttavan MCP:n muodostumiseen, luetaan korkeiden kloridi-ionipitoisuuk-sien esiintyminen, suuret happoylimäärät, korkeat palautus jäähdytytyslämpötilat ja pitkät reaktioajat. Sitoutu-10 neen glyserolin uskotaan olevan aktiivisempi muodostamaan MCP:tä kuin sitoutumattoman.

Myös entsyymien käytöstä kasviproteiinien hydroly-soimiseksi elintarvikekäyttöä varten tiedetään paljon, mutta tämä ei koske maku- ja hajuominaisuuksien paranta-15 mistarkoituksia. Nykyisten oppien anti on yleensä suunnat tu toiminnallisesti parannettujen proteiinien valmistamiseen, kuten entsyymihydrolyysin aikana tapahtuvan kitkerien peptidien muodostumisen poistamiseen, kuten US-pa- . tentissä nro 4 636 388 on esitetty. Tarkemmin sanottuna • · .20 tässä patentissa kuvataan vähätuhkainen proteiinituote,

< | I

joka erityisesti soveltuu entsymaattiseen hydrolyysiin.

··.' : Proteiinista tehty dispersio hyytelöidään, ja sen jälkeen : sen partikkeleina olevaa muotoa pestään nesteessä, jotta muu kuin proteiinimateriaali diffusoituisi geelistä nes- :^::25 teeseen, minkä jälkeen neste erotetaan geelistä. Tämän jälkeen esikäsitelty tuote hydrolysoidaan entsymaattises-ti, edullisesti sienestä saadulla proteaasilla ja pan- • · kreatiinilla.

• · US-patentti nro 4 757 007 kuvaa ja esittää patent- • · J ** 30 tivaatimukset menetelmästä soijaproteiinin hydrolysoitujen • · · ·...* tuotteiden valmistamiseksi hydrolysoimalla soijaproteiini osittain proteaasilla ja sen jälkeen erottamalla tuloksena olleet hydrolysoidut tuotteet käyttäen trikloorietikka-hapon 5-%:ista vesipitoista liuosta. Heikkoliukoisella 35 hydrolysoidun proteiinin osalla on erinomaiset emulgointi- 3 102240 ominaisuudet, kun taas runsasliukoisella osalla on erinomaiset vaahdotusominaisuudet.

US-patentissa nro 3 830 942 tuotetaan liukoinen proteiinituote, joka on erityisen käyttökelpoinen hyvin 5 happamissa elintarvikkeissa, ja liukenematon proteiinituo te, jota käytetään proteiinipitoisten leipomotuotteiden valmistuksessa. Tässä patentissa kuvataan näiden kahden tuotteen valmistusmenetelmä, jossa öljypitoisista siemen-materiaaleista, joista rasva on poistettu, tehdään vesi-10 pitoinen liuos, säädetään lietteen pH siemenmateriaalien isoelektriseen pisteeseen, kuumennetaan liete korkeisiin lämpötiloihin, lisätään lietteeseen entsyymiä, sekoitetaan seosta hydrolyysin aikana ja sen jälkeen erotetaan hydrolysoituneet ja hydrolysoitumattomat proteiinituotteen 15 osat.

Vaikka entsyymihydrolyysi ja happohydrolyysi ovat yleensä erillisiä menetelmiä, löytyy patentteja, joissa kuvataan happo- ja entsyymihydrolyysin yhdistelmä proteii-nihydrolysaatin aikaansaamiseksi. SU-patenttihakemuksessa .20 442 800 on esitetty menetelmä ruuansulatuskanavan ulkopuo- "j* liseen ravitsemiseen tarkoitetun valmisteen aikaansaami- ‘ · seksi. Siinä on kuvattu menetelmä, jossa raakaproteiini- : ’.· materiaalille suoritetaan entsymaattinen pilkkominen, jota • * # seuraa happohydrolysointi 5,0-%:isella rikkihapolla :J*:25 (4,0 N) hiilidioksidi-ilmakehässä. Tämän jälkeen hydro- lysaatti viedään anioninvaihtopylvään läpi, käsitellään aluminiumhydroksidilla ja viedään kationinvaihtohartsia • · sisältävän pylvään läpi. Tämä happohydrolyysi tapahtuu noin 100 °C:n lämpötilassa noin seitsemän (7) tunnin ajan.

• · • ** 30 Japanilaisessa patenttijulkaisussa A 63-74 465 • · · ·...· (1988) kuvataan valmistusmenetelmä, jossa gluteiini jauhoa käsitellään entsyymillä, ja siitä saatua vesiliukoista uutetta hydrolysoidaan hapolla noin 24 tuntia.

Vuosien varrella on tehty useita yrityksiä sellais-35 ten hydrolysoitujen kasviproteiinituotteiden valmistami- 4 102240 seksi, joita voidaan käyttää useisiin erilaisiin tarkoituksiin, mutta kuitenkaan tähän mennessä ei ole esitetty yhtään sellaista menetelmää, jossa tuotetaan hydrolysoitua kasviproteiinia, jossa MCP:n tai DCP:n määrä on pienenty-5 nyt tai sitä ei esiinny lainkaan seurauksena siitä, että MCP:n ja DCP:n muodostuminen olisi estetty happohydrolyy-sin muuttujia säätelemällä, ja jolle on ominaista huomattava maku- ja hajuominaisuuksien parantuminen.

Tämä keksintö koskee menetelmää, jossa tuotetaan 10 hydrolysoituja kasviproteiineja, jotka eivät sisällä ha vaittavia määriä MCP:tä. Tämä saadaan aikaan ainutlaatuisella menetelmällä, jossa yhdistetään kaksi kasviproteii-nien hydrolysointimenetelmää, entsymaattinen hydrolyysi ja lievä happohydrolyysi. Tästä menetelmästä tuloksena saata-15 vat hydrolysaatit ovat puhtaita ja maultaan mietoja, niil lä on merkittäviä makua ja hajua parantavia ominaisuuksia, ja ne sisältävät merkittäviä määriä mononatriumglutamaat-tia, jota on kuivapainosta jopa 25 paino-%.

Menetelmä, jossa tuotetaan hydrolysoituja kasvipro-‘ 20 teiineja, jotka eivät sisällä havaittavia määriä MCP:tä, :..v alkaa proteiinin hydrolysoinnilla lisäämällä sitä ainakin yhtä proteaasia sisältävään vesipitoiseen liuokseen, jolloin ainakin yksi proteaasi on endoproteaasi. Tämän jälkeen tuloksena oleva hydrolysoitu liukoinen proteiini ero-25 tetaan liukenemattomasta massasta. Tämän jälkeen lisätään happoa ja seosta kuumennetaan, hydrolysaatin merkittävän deaminoitumisen aikaansaamiseksi, jolloin happohydrolyysi • · · suoritetaan niin lyhyen aikaa, ettei synny havaittavia • · · *** määriä monoklooripropanolia mitattuna kaasukromatografil- • 30 la, joka on herkkä kahden miljoonasosan pitoisuuksille.

Tuloksena saadaan happameksi tehty, deaminoitu hydro- • · · lysaatti, joka sen jälkeen neutraloidaan.

Entsyymihydrolyysivaiheen uskotaan vaikuttavan MCP:n ja DCP:n muodostumisen vähentymiseen liuottamalla 35 proteiinin pois suurimmasta osasta raakaproteiinin pro- 5 102240 teiinia sisältämättömistä komponenteista. Tästä uskotaan olevan tuloksena saatavilla olevien, glyserolia sisältävien rasva-aineiden määrän merkittävä vähentyminen, mikä siten vähentää sitä seuraavan happohydrolyysivaiheen aika-5 na tapahtuvassa MCP:n muodostumisessa tarvittavien avain- substraattien määrää. Toinen entsyymihydrolyysin tehtävä on vaikuttaa proteiiniin pienikokoisten peptidien ja aminohappojen vapauttamiseksi.

Happohydrolyysivaihe vaikuttaa myös MCP:n määrän 10 vähenemiseen, koska käytetty menetelmä on lievä happohyd- rolyysi. Olosuhteet, joissa happohydrolyysi tai deamidoin-ti tapahtuvat, ovat merkittävästi lievemmät kuin tavanomaisissa menetelmissä käytetyt. Tarkemmin sanottuna lievä happohydrolyysi suoritetaan merkittävästi pienemmissä hap-15 popitoisuuksissa, alemmissa lämpötiloissa ja lyhyempien aikamäärien kuluessa kuin tavanomaisissa hydrolysointi-menetelmissä. Näitä olosuhteita säätelemällä saadaan dea-midoituminen, tarkemmin sanottuna amidisidosten hydrolysoituminen, tapahtumaan ensisijaisesti, kun taas pepti- • · .20 disidosten hydrolyysi tapahtuu säädellyllä tai minimoidul- la tavalla. Uskotaan, että yhdessä entsyymihydrolyysistä '· * johtuvien vähentyneiden rasvamäärien kanssa näiden olosuh- • » · teiden ansiota on se, että MCP:t jäävät muodostumatta lop-·,,,·' putuotteeseen.

•‘J :25 Tämä menetelmä käsittää lukuisia vaiheita kasvipro- teiinin hydrolysoimiseksi, jotta saataisiin tuote, joka ei ·*.*. sisällä havaittavia määriä MCP:tä. Käsitteellä "ei sisäl- < « t · lä havaittavia määriä" tarkoitetaan tässä yhteydessä käy-tettynä sitä, ettei esiinny havaittavia määriä, jotka • « • ” 30 olisivat havaittavissa kaasukromatografialla mitattuna ♦ · » *...· niinkin alhaisella herkkyystasolla kuin kaksi miljöö- nasosaa.

Tarkemmin sanottuna kasviproteiini hydrolysoidaan lisäämällä se ainakin yhtä proteaasia sisältävään vesi-35 pitoiseen liuokseen. Kasviproteiini voi olla mikä tahansa 6 102240 saatavissa olevista kasviproteiineista, kuten öljysiemen-proteiinit (soija, maapähkinä, auringonkukka, pellavansiemen), plasmaproteiinit tai lehtiproteiinit. Edullinen proteiini miellyttävien maku- ja hajuaineiden valmistami-5 seksi, joilla on merkittäviä makua ja hajua parantavia ominaisuuksia, on vehnän gluteeni, ja tämä on seurausta sen suuresta glutamiinihapposisällöstä, joka esiintyy pääasiassa glutamiinina.

Proteiini lisätään vesipitoiseen liuokseen, joka 10 sisältää ainakin yhtä endoproteaasia, joka voi muodoltaan olla hapan, neutraali tai alkalinen. Proteaasi valitaan riippuen tietyn entsyymi/substraatti -yhdistelmän vaatimasta muuttujien määrästä, kuten a) mikä olisi sopiva pH parhaan mahdollisen proteolyyttisen vaikutuksen aikaansaa-15 miseksi, b) parhaiten lopputuotteen vaatimukset täyttävä peptidisidosspesifisyys, ja c) tarvitseeko substraatti kitkeryyttä aiheuttavien aineiden poistamista vai ei. Edullinen entsyymi vehnän gluteenia varten on neutraali endoproteaasi, tarkemmin sanottuna Prozyme 6 (Amano Inter- i 20 national Enzyme, Troy, Virginia).

« ,

Proteiinin entsyymihydrolyysi tapahtuu noin 25 -·'· 75 °C:n lämpötilassa ja pH:ssa, joka on noin 5,5 - 8,5, 1 r i neutraalin entsyymin kanssa, jota on noin 0,1 - 2,0 pai-no-% substraatin painosta. Jälleen nämä olosuhteet vaih-.25 televat riippuen proteiini-proteaasi -yhdistelmästä. Esi merkiksi pH riippuu käytetyn entsyymin tyypistä. Jos käy-tetään hapanta entsyymiä, pH tulee olemaan välillä 1,5 - • · 4,0 ja jos käytetään alkalista entsyymiä, pH tulee olemaan välillä 7,0 - 12,0. Tässä käytetty pH-alue perustuu neut- • · ; ' 30 raalin proteaasin käyttöön.

·· · *...· Edullisessa tapauksessa, jossa käytetään vehnän f*«<# gluteenia ja Prozyme 6:tta, neutraalia proteaasia, entsyy- i mihydrolyysi suoritetaan noin 40 - 50 °C:n lämpötilassa, « « edullisesti 45 °C:n lämpötilassa ja pH:n ollessa välillä 35 noin 6,5 - 7,0 ja Prozyme 6:n määrän ollessa edullisesti 0,5 - 1,0 paino-%. Entsyymihydrolyysiin kuluva aika riip- 102240 7 puu melkoisesta määrästä tekijöitä, tarkemmin sanottuna käytetystä entsyymipitoisuudesta, pH:sta, reaktiolämpöti-lasta, substraatin määrästä ja halutusta hydrolyysin asteesta. Edullista sovellutusmuotoa varten ehdotetaan noin 5 neljän (4) tunnin mittaista aikaa.

Myös substraatin määrällä on tärkeä osuus tässä 7 keksinnössä. Haluttu määrä on noin 1,0 - 30 paino-% koko erästä, edullisen määrän ollessa noin 22 - 26 paino-%. Nämä määrät ovat poikkeuksellisen suuria, eikä niitä voida 10 yleensä saada aikaan tavanomaisilla menetelmillä. Jotta päästäisiin haluttuihin määriin, entsyymiin lisätään substraattia tavanomaisen menetelmän sijasta, jossa entsyymiä lisättäisiin substraattiin.

Entsyymihydrolyysi on suunniteltu suorittamaan suu-15 rimman osan peptidisidoshydrolyysistä, joka on tarpeelli nen makuun ja hajuun vaikuttavien peptidien ja aminohappo-. jen vapauttamiseksi. Se ei vapauta glutamiinihappoa eikä , mononatriumglutamaattia glutamiinista, eikä se vaikuta • I « [ peptideihin sitoutuneen glutamiinin amidisidoksiin. Kuten • · · ·' · ’ 20 yllä on esitetty, halutun tuotteen aikaansaamiseksi voi- • « · : .: daan käyttää melkoista valikoimaa kaupallisesti saatavilla olevia endo- ja eksoproteaaseja. Spesifisiä eksoproteaa-.' seja, kuten leusiiniamidopeptidaasia sisältävää

Debitrasea (Imperial Biotechnology Inc., Rosemont, 25 Illinois), voidaan käyttää, jos halutaan vähentää hydro- m · lysoidussa kasviproteiinissa esiintyvien hydrofobisten • · · peptidien kitkeryyttä.

0 0 i M On syytä kiinnittää huomiota siihen, että endopro- 0 00 *...· teaasi on ehdottoman välttämätön ensimmäisen entsyymihyd- # 30 rolyysin suorittamiseksi. Tästä johtuen käytettäessä ai- noastaan yhtä proteaasia, sen täytyy olla endoproteaasi.

0 0

Jos kasviproteiinin hydrolysoinnissa käytetään useampaa kuin yhtä entsyymiä, niin entsyymit voivat olla millainen tahansa yhdistelmä endoproteaaseja ja eksoproteaaseja ja 35 niitä voidaan käyttää joko samanaikaisesti tai peräkkäin.

102240 8 Tässä vaiheessa entsymaattinen menetelmä voidaan pysäyttää halutulle tasolle lisäämällä happoa vesipitoiseen liuokseen. Tämä vaihe ei ole välttämätön, vaikka se onkin osa edullista menetelmää, ja hydrolysoitu liukoinen 5 proteiini voidaan erottaa liukenemattomasta massasta ilman sitä. Elintarvikelaatuisen orgaanisen tai epäorgaanisen hapon lisäys, joka muuttaa vesipitoisen liuoksen pH:n noin 2,0 - 4,0:ksi, pysäyttää kuitenkin entsymaattisen reaktion muodostaen siten keinon valvoa tarkasti päätepistettä ja 10 antaen hydrolysaatille mikrobiologisen stabiilisuuden.

Elintarvikelaatuisen hapon lisäyksellä haluttuna ajankohtana saadaan aikaan myös hydrolysoidun liukoisen proteiinin parempi erottuminen liukenemattomasta massasta. Happoa voidaan lisätä, kun hydrolysaatti on saavuttanut halutun 15 liukoisuuden ja hydrolyysin asteen. Tarkemmin sanottuna liukoisuusasteen tulisi taloudellisista syistä olla ainakin 60 %, edullisen asteen ollessa ainakin 90 %. Hydrolyysin asteen tulisi olla välillä noin 10 - 70 %, edullisesti | · ’ noin 20 - 50 %.

« « « • ' : 20 Tämän jälkeen hydrolysoitu kasviproteiini erotetaan i ’.· liukenemattomasta massasta millä tahansa sopivalla, tavan- omaisella menetelmällä, kuten suodatuksella tai sentrifu-: : goinnilla tai niiden yhdistelmällä.

Tämän jälkeen hydrolysoidulle liukoiselle proteii-25 nille suoritetaan lievä happohydrolyysi lisäämällä elin- • · tarvikelaatuista happoa ja se kuumennetaan. Happo voi olla • · · yksin mineraalihappo tai sen kanssa voidaan käyttää or- • · : *' gaanista happoa. Tämä lievä happohydrolyysi on suunniteltu • «t :...· maksimoimaan vapaiden aminohappojen ja peptidien deami- 30 dointi ja minimoimaan pyroglutamiinihapon muodostuminen ♦ optimoimalla vetyionipitoisuuden ylimäärä. Tarkemmin sa- • · nottuna hydrolysoidun proteiinin titrauksen jälkeen vetyionipitoisuuden ylimäärä on noin 0,5 - 2,0-molaarinen, edullisesti 1,0-molaarinen. Esimerkkeihin tässä vaiheessa 35 käytettävistä elintarvikelaatuisista hapoista luetaan suo- 102240 9 lahappo, fosforihappo, rikkihappo ja mikä tahansa niiden yhdistelmä. Lisäksi nämä mineraalihapot voidaan osittain korvata monilla erilaisilla orgaanisilla hapoilla, kuten omenahapolla. Edullinen happo käytettäväksi tässä keksin-5 nössä on suolahappo. Tämä deamidointivaihe suoritetaan noin 75 - 100 °C:een lämpötilassa, edullisesti noin 95 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen deamidoinnilla aikaansaatu, happameksi tehty hydrolysaatti neutraloidaan pH:hon, joka on noin 5,0 - 7,0. Mitä tahansa tunnettuja 10 aineita voidaan käyttää, mutta edullinen aine on elintar- vikelaatuinen 50-%:inen natriumhydroksidi.

Tämän jälkeen tuloksena olevaa neutraloitua hydro-lysaattia voidaan haluttaessa prosessoida edelleen, jotta se saataisiin käyttökelpoisempaan muotoon. Hydrolysaatti 15 voidaan käsitellä värin- ja hajunpoistomenetelmillä. Tämän jälkeen värin- ja hajunpoistolle altistettu hydrolysaatti . voidaan väkevöidä. Tämä voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä, kuten suihkekuivauksella, tyh-jiöhyllykuivauksella tai haihdutuksella, esimerkiksi ohut-' t : 20 kalvohaihduttimella.

: ’.· Lievän happodeamidoinnin aikana kaikki alkuvaiheen entsymaattisen prosessin aikana muodostunut glutamiini muuttuu mononatriumglutamaatiksi (MSG) . Siksi lopputuotteessa esiintyvän MSG:n määrä määräytyy käytetyn entsy-25 maattisen menetelmän ja käytetyn substraatin perusteella.

• ·

Esimerkiksi jos kasviproteiinina käytetään vehnän glutee- • i · nia ja entsymaattisessa prosessissa tapahtuu täydellinen • · : ** muuntuminen, MSG:n määrä lopputuotteessa saattaa olla • t a niinkin korkea kuin 20 - 25 paino-% kuivapainosta.

30 Seuraavat esimerkit ovat esimerkkejä tästä keksin- i *· nöstä, eikä niitä ole tarkoitettu millään tavalla rajoit- • · taviksi.

Esimerkki I Entsyymihydrolyysi 35 Kullekin näytteelle suoritettiin entsyymihydrolyysi

New Brunswick -yhtiön tieteelliseen käyttöön tarkoitetulla 10 102240 14 litran astialla varustetulla ja normaalin kokoonpanon mukaisella MICROFERM -fermenttorilla. Vehnän gluteenin entsyymihydrolyysin suorittamiseksi yleisen menetelmän ensimmäinen vaihe oli reaktioastian täyttäminen 65 -5 90 %:lla kokonaisvesimäärästä. Samalla kun astiaa lämmi tettiin, pH-elektrodi standardoitiin ja automaattinen tit-rauslaite täytettiin 4,O-molaarisella natriumhydroksidil-la. Titrauslaite asetettiin kohde-pH-arvoon, ja valmistettiin entsyymiliuos (10 paino-% entsyymiä deionisoidussa 10 vedessä).

Lisättiin 2 400 grammaa vehnän gluteenia (Manildra Milling Corp., Shawnee Mission, Kansas 66205) 24 grammaan Prozyme 6:tta (Amano Enzymes, edustaja Yhdysvalloissa Mitsubishi International Corp., New York, New York 10022), 15 joka oli 7 500 grammassa vettä, 15 - 20 minuutin aikana koko ajan sekoittaen. Entsyymihydrolyysin annettiin jat-. kua neljän tunnin ajan, jona aikana sen pH pidettiin 7:ssä ja lämpötila 45 °C:ssa.

Neljän tunnin kuluttua hydrolysaatti titrattiin no-: 20 peasti pH-arvoon 2 20 Baumella (10,0 N) elintarvikelaa- : tuista suolahappoa (HC1) . Tämän jälkeen tämä happameksi tehty hydrolysaatti pumpattiin jääveteen upotetun putken läpi keräysastioihin ja jäähdytettiin välittömästi. Liukoinen faasi otettiin talteen sentrifugoimalla koko hydro-25 lysaatti 15 minuutin ajan sentrifugissa, 16 000 x G, minkä • · jälkeen talteenotettu supernatantti väkevöitiin pakas- • · · tekuivaamalla sen valmistamiseksi deamidointia varten.

• · : ** Lievä happodeamidointi • · «

Mitattiin 9,63 grammaa pakastekuivattua superna-30 tanttia (kosteutta 0,1 %) 50 ml:n mittapulloon. 10-molaa- • «« ....j rista HCl:a lisättiin 50 ml:n merkkiin saakka (1,0-molaa- « · rista HCl-ylimäärää varten käytettiin 9,04 g 10-molaarista HCl:a, 1,5-molaarista HCl-ylimäärää varten käytettiin 11,94 g, ja 2, 0-molaarista HCl-ylimäärää varten käytettiin 35 14,84 g). Näyte siirrettiin Wheatonin 125 ml:n seerumipul- loon (numero 223 748 Wheatonin luettelossa) ja inkuboitiin n 102240 ravistelevalla vesihauteella yhden tunnin ajan. Tämän jälkeen näyte neutraloitiin 50-%:isella elintarvikelaatuisel-la natriumhydroksidilla (NaOH, J. F. Henry Chemical Co., Inc., Union, New Jersey 07083). Tulokset on esitetty alla 5 olevassa taulukossa.

Taulukko I

Vesihauteen

lämpötila HA Deamid. GLU PG

10 Näyte HC1 (°C) (!) (%) (q/1) (q/1) 1 1,0 95 44,8 67,7 11,5 2,5 2 2,0 95 48,3 106,0 12,6 1,75 3 1,5 85 ei ei 10,1 3,1 4 1,0 75 34,6 54,9 6,0 5,3 15 5 2,0 75 39, 4 65, 6 8,1 3,6 . HA = hydrolyysiaste; prosenttia hydrolysoituneiden pep- tidisidosten kokonaismäärästä.

Deamid. = deamidaatioprosentti vapautuneen ammoniakin kohl :20 konaismäärän perusteella.

• '.· GLU = vapaata glutamiinihappoa (MSG) .

PG = vapaata pyroglutamiinihappoa. ei = ei saatavilla.

.25 Esimerkki II

• · · ' -• ·

Entsyymihydrolyysi

Entsyymihydrolyysi suoritettiin esimerkissä I esi- • < ί " tetyn menetelmän mukaisesti.

•u · Lievä happodeamidointi

Γ. 30 Tämän esimerkin pohjana oli suurentaa esimerkin I

• ·· mukaista deamidointimenetelmää yhden litran mittakaava!- • · seksi reaktioksi. Reaktoriin lisättiin 686,7 grammaa vettä ja 183,3 grammaa 10-molaarista HC1:a (1,0-molaarinen ylimäärä) ja lämmitettiin 95 °C:n lämpötilaan. Tämän jälkeen 35 reaktoriin lisättiin 200 g hydrolysaattia (20 paino-%) kuivana jauheena sivukaulan kautta noin viiden minuutin 102240 12 jakson aikana. Kaulaan asetettiin lauhdutin ja reaktion annettiin jatkua yhden tunnin jakson ajan lämpötilan pysyessä 95 °C:ssa. Tämän jälkeen lämmitin poistettiin reak-tioastiasta, ja astia jäähdytettiin nopeasti jäähauteessa 5 alle 50 °C:n lämpötilaan reaktion pysäyttämiseksi. 160 grammaa 50-%:ista NaOH:a lisättiin astiaan näytteen pH:n saamiseksi 7:ään. Tämä neutralointi suoritettiin jäähauteessa alle 25 °C:n lämpötilassa MSG-tason säilyttämiseksi. Tämän jälkeen 1 100 grammaa neutraloitua deamidoin-10 tituotetta käsiteltiin 11 grammalla Darco KB -aktiivihiil tä (American Norit Company, Inc., Jacksonville, Florida) kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen deamidointituote suodatettiin Buchner-suppilossa tuhkat-toman Whatman 42 -paperin läpi. Suodos väkevöitiin tyh-15 jiöhyllykuivaajassa 50 °C:n lämpötilassa ja 3 333 Pa:n paineessa kahden tunnin ajan. Tuloksena ollut tuote, jonka pitoisuus oli noin 70 % kiinteää ainetta, laimennettiin vedellä, jotta analyysiä varten saataisiin noin 40 % kiin- '···' teää ainetta sisältävä homogeeninen liuos. Tämän jälkeen : 20 MCP-taso mitattiin standardilla GC-menetelmällä, jonka herkkyys oli kaksi miljoonasosaa ja jonka tulokset eivät osoittaneet havaittavia määriä MCP:tä. MSG:n määrä lopputuotteessa oli 5 % kuivapainosta.

Esimerkki III

25 Entsyymihydrolyysi • ·

Entsyymihydrolyysi suoritettiin esimerkissä I esi- ♦ · · tetyn menetelmän mukaisesti.

«· i ** Lievä happodeamidointi • « i

Seurattiin esimerkin II mukaista menetelmää, jotta 30 nähtäisiin 2,0-molaarisen HCl-ylimäärän vaikutus deami- • r · daatioon ja MCP:n muodostumiseen. Reaktoriin, joka sisäl-si 570 grammaa vettä ja 300 grammaa 10-molaarista HCl:a (2,0-molaarinen ylimäärä), lisättiin 200 grammaa (kuiva-paino) hydrolysaattia. Kun tätä oli pidetty yhden tunnin 35 ajan 95 °C:n lämpötilassa, deamidaatiotuote jäähdytettiin ja neutraloitiin 232 grammalla 50-%:ista NaOH:a. 608 gram- 13 102240 maa neutraloitua deamidaatiotuotetta käsiteltiin 6,1 grammalla Darco S-51 -aktiivihiiltä kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen deamidaatiotuote suodatettiin ja väkevöitiin. Noin 45 % kiinteää ainetta sisältävää ho-5 mogeenista liuosta käytettiin GC:llä suoritettuun analyy siin, jonka tuloksena ei löydetty havaittavia määriä MCP:tä.

Esimerkki IV Entsyymihydrolyysi 10 Näytteen entsyymihydrolyysi suoritettiin esimerkis sä I esitetyn menetelmän mukaisesti.

Lievä happodeamidointi

Seurattiin samaa deamidointimenetelmää, mutta ent-syymihydrolysaatin pitoisuutta lisättiin, jotta nähtäisiin 15 sen vaikutus deamidaatioon ja MCP:n muodostumiseen.

Liuokseen, joka sisälsi 250,6 grammaa 10-molaarista HCl:a . (1,O-molaarinen ylimäärä) 490,0 grammassa vettä (substraa tin tiheys 1,14), lisättiin 400 grammaa hydrolysaattia (40 % paino-%) . Kun tätä oli pidetty yhden tunnin ajan :20 95 °C:n lämpötilassa, deamidaatiotuote jäähdytettiin ja neutraloitiin 220 grammalla 50-%:ista NaOH:a. Deamidaa-tiotuotteen 647 gramman suuruinen neutraloitu erä käsiteltiin 6,5 grammalla Darco S-51 -aktiivihiiltä kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Suodatuksen ja väkevöin-25 nin jälkeen noin 45 % kiinteää ainetta sisältävää liuosta • · · • · ,···, analysoitiin GC:llä, jonka tuloksena ei löydetty havaitta- » i · via määriä MCP:tä.

• ·

: Esimerkki V

I > \ · Entsyymihydrolyysi 30 Seurattiin samaa esimerkissä I esitettyä menetel- • ·· mää, paitsi että käytettiin neutraalien proteaasien yhdis- • · telmää. Reaktioastiaan lisättiin alkuvaihetta varten veden kanssa 24 grammaa Prozyme 6:tta ja 33,7 grammaa (0,5 % entsyymiä substraattia kohti kuivamateriaalimäärien perus-35 teella) nestemäistä Neutrasea (vastaanotetussa muodossa) (NOVO Industries, Danbury, Connecticut).

„ 102240 14

Lievä happodeamidointi

Seuraten esimerkin II mukaista menetelmää 200 grammaa hydrolysaattia lisättiin liuokseen, joka sisälsi 183.3 grammaa 10-molaarista HCl:ää (1,0-molaarinen ylimää- 5 rä) ja 686,7 grammaa vettä. Kun tätä oli pidetty yhden tunnin mittaisen ajan 95 °C:n lämpötilassa, jäähdytetty deamidaatiotuote neutraloitiin 156 grammalla 50-%:ista NaOHrta. Deamidaatiotuotteen 400 gramman suuruinen erä käsiteltiin neljällä grammalla Darco KB-aktiivihiiltä kahden 10 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Suodatuksen ja konden- soinnin jälkeen noin 40 % kiinteää ainetta sisältävälle liuokselle suoritettiin analyysi GC:llä, jonka tuloksena ei löydetty havaittavia määriä MCP:tä.

Esimerkki VI

15 Entsyymihydrolyysi

Seurattiin esimerkissä I esitettyä entsyymihydro-. lyysimenetelmää, paitsi että käytettiin entsyymien yhdis telmää ja entsyymit lisättiin peräkkäin. Tämä menetelmä suoritettiin, jotta nähtäisiin eksopeptidaasin vaikutus : 20 MSG:n vapautumiseen. Ensimmäiseksi reaktoriin lisättiin ; veden kanssa 24 grammaa Prozyme 6:tta, minkä jälkeen yllä- : kuvatun menetelmän mukaisesti astiaan lisättiin myöhemmin ; 2 400 grammaa vehnän gluteenia. 30 minuutin kuluttua reak toriin lisättiin 13,0 grammaa Debitrase 4500.10:tä 25 (Imperial Biotechnology Inc., Rosemont, Illinois), ja • · » • · reaktion annettiin jatkua neljä tuntia Debitrasen lisäämi- • · · sen jälkeen tai yhteensä 4,5 tunnin ajan.

• « i * * Lievä happodeamidointi \ ' Seuraten esimerkin II mukaista menetelmää 200 :·. 30 grammaa hydrolysaattia lisättiin liuokseen, joka sisälsi • · < 183.3 grammaa 10-molaarista HCl:a (1,0-molaarinen ylimää- • * rä) ja 686,7 grammaa vettä (substraatin tiheys 1,07). Kun tätä oli pidetty yhden tunnin ajan 95 °C:n lämpötilassa, jäähdytetty deamidaatiotuote neutraloitiin 159 gram-35 maila 50-%:ista NaOH:a. Deamidaatiotuotteen 618 gramman suuruinen neutraaloitu erä käsiteltiin 6,2 grammalla Darco 102240 15 S-51 -hiiltä kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Noin 45 % kiinteää ainetta sisältävää liuosta analysoitiin GC:llä, jonka tuloksena ei löydetty havaittavia määriä MCP:tä. Lopputuotteessa esiintyvän MSG:n määrä oli 10 pai-5 no-% kuivapainosta.

Esimerkki VII Entsyymihydrolyysi

Seurattiin esimerkissä I esitettyä entsyymihydro-lyysimenetelmää, paitsi että käytettiin eri entsyymiä, 10 minkä seurauksena oli, että entsyymihydrolyysin tapahtuma- aikaa ja -lämpötilaa täytyi muuttaa. Prozyme 6:n sijasta entsyyminä käytettiin 36 grammaa Debitrase 4060.50:aa (1,5 % entsyymiä substraattia kohti kuivapainojen perusteella) ja hydrolyysi suoritettiin 38 °C:n lämpötilassa 15 kuuden tunnin mittaisena aikana.

Lievä happodeamidointi . Liuokseen, joka sisälsi 183,3 grammaa 10-molaarista HCl:ää (1,0-molaarinen ylimäärä) ja 686,7 grammaa vettä, « « lisättiin 200 grammaa hydrolysaattia. Kun tätä oli pidetty : :20 yhden tunnin ajan 95 °C:n lämpötilassa, jäähdytetyn deami- • · · • V daatiotuotteen neutraloimiseksi lisättiin 153 grammaa • I · : 50-%:ista NaOH:a. 600 grammaa neutraloitua deamidaatio- tuotetta käsiteltiin 6,0 grammalla Darco S-51 -aktiivi-hiiltä kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Noin 45 % ,V,25 kiinteää ainetta sisältävää liuosta analysoitiin, eikä havaittavia määriä MCP:tä löydetty.

• · · • · • ·

• M

• t 11 • o • < 1 < <-« « « « · • ·« ·

Claims (23)

1. Menetelmä hydrolysoitujen kasviproteiinien valmistamiseksi, jotka eivät sisällä havaittavia määriä mono- 5 klooripropanolia mitattuna kaasukromatografilla, joka on herkkä jopa kahden miljoonasosan pitoisuuksille, tunnettu siitä, että (a) hydrolysoidaan kasviproteiini lisäämällä se ainakin yhtä proteaasia sisältävään vesipitoiseen liuok- 10 seen, jolloin mainittu ainakin yksi proteaasi on endopro- teaasi, (b) erotetaan hydrolysoitu liukoinen proteiini liukenemattomasta massasta, (c) lisätään happoa hydrolysoituun, liukoiseen pro- 15 teiiniin ja kuumennetaan seosta hydrolysaatin merkittävän deamidoitumisen aikaansaamiseksi, jolloin happohydrolyysi suoritetaan niin lyhyen aikaa, ettei synny havaittavia määriä monoklooripropanolia mitattuna kaasukromatografilla, joka on herkkä jopa kahden miljoonasosan pitoisuuksil-20 le, (d) neutraloidaan deamidoitu hydrolysaatti.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-n e t t u siitä, että siinä lisäksi lisätään happoa vesi- . .·. pitoiseen liuokseen vaiheessa (a) entsyymireaktion pysäyt- < · 25 tämiseksi. « 4 * • · · “V

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- • · t • · n e t t u siitä, että siinä lisäksi poistetaan vaiheessa • « (d) saadusta hydrolysaatista haju ja väri. • i

· *·' * 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, t u n- 30. e t t u siitä, että siinä lisäksi väkevöidään hydro- • · :.V lysaatti, josta on poistettu haju ja väri. : Γ:

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- I<' n e t t u siitä, että endoproteaasi on hapan, neutraali t · · tai alkalinen. '1* 35

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- • *·· n e t t u siitä, että vaiheen (a) kasviproteiini on öl- · 102240 π jysiemenproteiini, plasmaproteiini, lehtiproteiini tai niiden yhdistelmä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasviproteiini on vehnän gluteeni. 5

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että hydrolyysi vaiheessa (a) tapahtuu noin 25 - 75 °C:n lämpötilassa ja pH:ssa, joka on noin 5.5 - 8,5.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, t u n- 10. e t t u siitä, että hydrolyysi vaiheessa (a) tapahtuu noin 40 - 50 °C:n lämpötilassa ja pH:ssa, joka on noin 6.5 - 7,0.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erotus vaiheessa (b) suorite- 15 taan suodattamalla, sentrifugoimalla tai niiden yhdistel mällä .

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (c) hydrolysoidun proteiinin titrauksen jälkeen lisätty happo tuottaa vety- 20 ioniväkevyyden ylimäärän, joka on noin 0,5 - 2,0-molaari- nen.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (c) lisätty happo , ,·, tuottaa vetyioniväkevyyden ylimäärän, joka on noin 1,0-mo- 25 laarinen. t t t • · · “V

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • · · tunnettu siitä, että reaktio vaiheessa (c) tapah- • · '···' tuu noin 75 - 100 °C:n lämpötilassa. *.· 1

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että reaktio vaiheessa (c) tapah- • · ί,ί.ί tuu noin 95 °C:n lämpötilassa.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen (d) neutralointi ta- '... pahtuu pH:ssa, joka on noin 5,0 - 7,0. < · « « • • 1 102240

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrolyysi vaiheessa (a) suoritetaan lisäämällä peräkkäin ainakin kahta proteaasia.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että hydrolyysi vaiheessa (a) suo ritetaan lisäämällä ainakin kahta proteaasia samanaikaisesti .

18. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hajunpoisto ja värinpoisto 10 suoritetaan käyttämällä aktiivihiiltä.

19. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happo on elintarvikelaatuinen mineraalihappo.

20. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että happo vaiheessa (b) on elin tarvikelaatuinen mineraalihappojen ja orgaanisten happojen yhdistelmä.

21. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happo vaiheessa (c) on elin- 20 tarvikelaatuinen mineraalihappo.

22. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happo vaiheessa (c) on elin- . tarvikelaatuinen mineraalihappojen ja orgaanisten happojen yhdistelmä. '25

23. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, i.i: tunnettu siitä, että elintarvikelaatuinen mineraa- • · · • lihappo tai orgaaninen happo on suolahappo, fosforihappo, :]**: rikkihappo, sitruunahappo, omenahappo tai niiden yhdistel- mä. 30 • · • · · • · · • · • · · • · · r t t t * I I I « < · 4 « « « • · • · · 1 # 19 102240