ES3072340T3

ES3072340T3 - Microchip capillary electrophoresis assays and reagents

Info

Publication number: ES3072340T3
Application number: ES22743956T
Authority: ES
Inventors: Timothy Riehlman; Gabriel Carreau; Jeffrey Schneiderheinze; Nicole Nall
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2021-06-01
Filing date: 2022-06-01
Publication date: 2026-07-01
Anticipated expiration: 2042-06-01
Also published as: WO2022256383A1; BR112023024984A2; AU2022286340A1; IL308864A; DK4348234T3; EP4348234B1; TW202314240A; FI4348234T3; MX2023014246A; EP4348234A1; KR20240015646A; PL4348234T3; CA3220848A1; JP2024521871A; EP4756431A2

Abstract

Se proporcionan ensayos y reactivos de electroforesis capilar en microchip (MCE) para evaluar la pureza e identificar impurezas en muestras de fármacos proteicos. También se incluyen métodos para analizar los analitos presentes en dichas muestras. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Ensayos y reactivos de electroforesis capilar con microchip

[0003] Referencia cruzada a Solicitudes relacionadas

[0004] Con esta Solicitud se reivindica el beneficio y la prioridad de la Solicitud de Patente Estadounidense núm.17/335,756 presentada el 1 de junio de 2021 y la Solicitud de Patente Estadounidense núm.17/368,377 presentada el 6 de julio de 2021.

[0005] Campo técnico de la invención

[0006] Los aspectos de la invención se refieren generalmente al campo de la electroforesis capilar, en particular, a la electroforesis capilar en microchip.

[0007] Antecedentes de la invención

[0008] La implementación de una tecnología sólida, reproducible y fácil de usar es fundamental para cumplir con las demandas de prueba de los productos biológicos en los laboratorios de control de calidad (QC) actuales. Es necesario actualizar la tecnología para facilitar el aumento de la producción y, al mismo tiempo, seguir generando datos analíticos de calidad e intentando minimizar el número de resultados de pruebas inválidas e investigaciones relacionadas con los instrumentos. Si bien la electroforesis se ha usado históricamente en el control de calidad para el análisis de la pureza y la fragmentación del producto, la metodología ha pasado de ser basada en gel a basada en capilares y, más recientemente, al microchip. La electroforesis capilar con microchip (MCE, por sus siglas en inglés) permite reducir drásticamente los tiempos de análisis de las muestras, al tiempo que mantiene los estándares de rendimiento y reproducibilidad requeridos para el análisis de control de calidad (Ouimet, C., et al.,Expert Opin Drug Discov., 12 (2): 213-224 (2017)).

[0009] Si bien la MCE se ha convertido en una técnica prometedora con un uso creciente en la industria farmacéutica para la caracterización de productos biofarmacéuticos, el control de calidad y el descubrimiento de fármacos, puede ser propensa a interferencias en los ensayos.

[0010] Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar ensayos y composiciones de MCE mejorados que reduzcan las interferencias de los ensayos.

[0011] Otro objeto de la invención es proporcionar ensayos y composiciones de MCE para mejorar la detección de impurezas en un producto farmacológico proteico.

[0012] En el documento US 2019/285580 A1 se divulgan ensayos y reactivos de MCE para evaluar la pureza e identificar impurezas en muestras de productos farmacológicos proteicos, y métodos para analizar analitos en una muestra de fármaco proteico. El tampón de muestras de electroforesis acuosa usado para identificar agentes contaminantes en muestras de proteínas comprende 2-yodoacetamida, dodecilsulfato de litio y fosfato de sodio, y tiene un pH específico.

[0013] Compendio de la invención

[0014] Se proporcionan ensayos y reactivos de MCE para evaluar la pureza e identificar impurezas en muestras de productos farmacológicos proteicos. Se proporcionan métodos para analizar analitos en una muestra de fármaco proteico. Los fármacos proteicos preferidos incluyen, entre otros, proteínas recombinantes tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de estas, y proteínas de fusión. En los ensayos se emplean técnicas de MCE para separar, identificar y cuantificar el producto proteico y las impurezas en el producto proteico. Las impurezas incluyen, entre otros, agregados de proteínas, fragmentos de proteínas, multímeros de proteínas y agentes contaminantes de ensayo. También se proporcionan tampones reductores y no reductores. En algunas realizaciones, los ensayos y reactivos de MCE proporcionados en la presente memoria pueden usarse en el análisis y las pruebas de pureza de los productos contra el SARS-CoV-2, tales como los productos proteicos terapéuticos que incluyen REGEN-COV<™>(casirivimab e imdevimab).

[0015] Según la invención, el tampón de muestra de electroforesis acuosa no reductora contiene 2-yodoacetamida (IAM). En un ejemplo que se excluye del contenido reivindicado, el tampón de muestra de electroforesis acuosa no reductora contiene un agente alquilante, 2-yodoacetamida de 155 mM a 175 mM; dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 %; y fosfato de sodio de 65 mM a 95 mM, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH menor que 7. En una realización, el pH del tampón es 6. En otra realización, el tampón acuoso contiene 2-yodoacetamida 166 mM, dodecilsulfato de litio al 0,81 % y fosfato de sodio 81 mM.

[0016] En otra realización, el tampón de muestra de electroforesis acuosa no reductora contiene de 2-yodoacetamida de 155 mM a 200 mM; dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 %; y fosfato de sodio de 60 mM a 95 mM, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH menor o igual que 8. En una realización, el pH del tampón es 8. En otra realización más, el tampón acuoso contiene 2-yodoacetamida 200 mM, dodecilsulfato de litio al 1,2 % y fosfato de sodio 60 mM.

[0017] También se proporciona un tampón reductor. En una realización, el tampón reductor es un tampón de muestra de electroforesis acuosa que contiene dodecilsulfato de litio del 0,5 % al 1,5 %, fosfato de sodio de 55 mM a 75 mM y un agente reductor, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH mayor que 8. En una realización, el pH del tampón es 9. En un ejemplo que está excluido del contenido reivindicado, el tampón reductor contiene ditiotreitol de 135 mM a 155 mM.

[0018] En otra realización, el tampón reductor es un tampón de muestra de electroforesis acuosa que contiene dodecilsulfato de litio del 0,5 % al 1,5 %, fosfato de sodio de 45 mM a 75 mM y un agente reductor, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH de 8 o mayor. En una realización, el pH del tampón es 8. En una realización, el tampón reductor contiene ditiotreitol de 80 mM a 155 mM. En otra realización más se proporciona un tampón reductor que contiene dodecilsulfato de litio al 1,2 %, fosfato de sodio 60 mM y ditiotreitol 80 mM.

[0019] Los tampones a base de HEPES, aunque no forman parte del contenido reivindicado, también se pueden usar con los métodos divulgados. En una realización se proporciona un tampón de muestra de electroforesis acuosa a base de HEPES no reductor que contiene un agente alquilante, por ejemplo, 2-yodoacetamida de 55 mM a 75 mM; dodecilsulfato de litio del 0,1 % al 1,0 %; HEPES de 5 mM a 85 mM y cloruro de sodio de 5 mM a 115 mM, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH menor que 9. En otra realización, el pH del tampón es 8. En otra realización más, el tampón acuoso contiene 2-yodoacetamida 66,4 mM, dodecilsulfato de litio al 0,32 %, HEPES 16,2 mM y cloruro de sodio 48,6 mM.

[0020] En otra realización se proporciona un tampón de muestra de electroforesis acuosa a base de HEPES reductor que contiene dodecilsulfato de litio del 0,05 % al 0,75 %, cloruro de sodio de 5 mM a 115 mM, HEPES de 5 mM a 115 mM y un agente reductor, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH mayor que 7. En una realización, el pH del tampón es 8. En una realización, el tampón reductor contiene ditiotreitol de 35 mM a 50 mM. En otra realización más se proporciona un tampón reductor que contiene dodecilsulfato de litio al 0,28 %, cloruro de sodio 41,5 mM, HEPES 13,8 mM y ditiotreitol 42,5 mM.

[0021] La divulgación proporciona un método de MCE no reductor para identificar agentes contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico que incluye las etapas de añadir la muestra de proteína a un tampón no reductor mencionado anteriormente para formar una muestra de fármaco proteico tamponado. En un ejemplo que se excluye del contenido reivindicado, la muestra de fármaco proteico tamponado se calienta a una temperatura entre 65 °C y 85 °C durante 5 a 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico tamponado y desnaturalizado. Por ejemplo, la muestra de fármaco proteico tamponado se calienta a 70 °C durante 10 min.

[0022] En una realización, la muestra de fármaco proteico tamponado se calienta a 63 °C durante 10 min. En otra realización, la muestra de fármaco proteico tamponado se calienta a 60 °C durante 10 min.

[0023] En algunas realizaciones, la muestra de fármaco proteico se mezcla con un marcador detectable y se calienta a una temperatra de 30 °C a 40 °C durante 20 a 40 minutos o durante 10 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada y desnaturalizada. En otras realizaciones, la muestra de fármaco proteico se mezcla con un marcador detectable y se calienta a una temperatura de 30 °C a 40 °C durante 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada y desnaturalizada. Un marcador detectable incluye, entre otros, Dyomics DY-631 NHS Ester. En algunas realizaciones, el marcador se diluye con agua purificada MilliQ y, en otras realizaciones, la marca se diluye en un tampón de fosfato de sodio. En algunos ejemplos, el marcador detectable se reconstituye con sulfóxido de dimetilo (DMSO) seguido de una dilución con tampón de fosfato de sodio 200 mM de pH 7,2. Se pueden usar otros marcadores detectables, incluidos otros colorantes, fluoróforos, cromóforos, etiquetas de masa, puntos cuánticos y similares y los divulgados en la Patente Estadounidense número 6,924,372. En una realización, la muestra de fármaco proteico con marcador añadido se calienta a 35 °C durante 30 minutos. En otra realización, la muestra de fármaco proteico con marcador añadido se calienta a 35 °C durante 15 minutos. El exceso de marcador se retira opcionalmente de la muestra, por ejemplo, mediante el uso de un filtro de centrifugación. En otra realización más, el exceso de marcador no se extingue. En otra realización más, el exceso de marcador no se retira.

[0024] El producto farmacológico proteico marcado y desnaturalizado se diluye y se somete a MCE para separar la muestra de fármaco proteico diluido en un sistema de electroforesis capilar con microchip para producir un electroferograma. En una realización, la concentración final de una muestra que comienza con 0,5 mg/ml y que luego se inyecta sobre el microchip es de 9 µg/ml en MCE. En otra realización, la concentración final de una muestra que comienza con 0,2 mg/ml y que luego se inyecta sobre el microchip es de 3,6 µg/ml en MCE. El electroferograma contiene picos correspondientes al producto farmacológico proteico y a las impurezas. El método concluye identificando los picos en el electroferograma correspondientes al producto farmacológico proteico, los agentes contaminantes y/o las impurezas.

[0025] En otra realización se proporciona un método de reducción de MCE para identificar agentes contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico. El método comienza añadiendo la muestra de proteína a cualquiera de los tampones reductores descritos anteriormente para formar una muestra de fármaco proteico tamponada. La muestra de fármaco proteico se mezcla con un marcador detectable y se calienta a una temperatura de 30 °C a 40 °C durante 20 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada y desnaturalizada. En una realización, la muestra de fármaco proteico con marcador añadido se calienta a 35 °C durante 30 minutos.

[0026] En otras realizaciones, la muestra de fármaco proteico tamponado se desnaturaliza calentando la muestra de fármaco proteico tamponado a 60 °C durante 10 minutos para formar una muestra de fármaco proteico desnaturalizado. Por ejemplo, la muestra de fármaco proteico se mezcla con un marcador detectable y se calienta a una temperatura de 30 °C a 40 °C durante 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada y desnaturalizada. En otra realización, la muestra de fármaco proteico con marcador añadida se calienta a 35 °C durante 15 minutos.

[0027] El exceso de marcador se retira opcionalmente de la muestra, por ejemplo, mediante el uso de un filtro de centrifugación. En otra realización más, el exceso de marcador no se extingue. En otra realización más, el exceso de marcador no se retira. Un marcador detectable ejemplar incluye, entre otros, Dyomics DY-631 NHS Ester. Otros marcadores detectables que pueden usarse incluyen otros colorantes, fluoróforos, cromóforos, etiquetas de masa, puntos cuánticos y similares y los divulgados en la Patente Estadounidense número 6,924,372.

[0028] En una realización, el intervalo de ensayo establecido para la concentración de la muestra es de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml, lo que corresponde a una concentración final que se analiza de aproximadamente 7 µg/ml a 11 µg/ml que se somete a un análisis de MCE en un sistema de electroforesis capilar con microchip para producir un electroferograma. En otra realización, el intervalo de ensayo establecido para la concentración de la muestra es de 0,2 mg/ml a 0,6 mg/ml, lo que corresponde a una concentración final que se analiza de aproximadamente 3,6 µg/ml a 11 µg/ml. El método concluye identificando los picos en el electroferograma correspondientes al producto farmacológico proteico, los agentes contaminantes y/o las impurezas.

[0029] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0030] Breve descripción de los dibujos

[0031] La figura 1A muestra un electroferograma de un análisis de muestra no reducido típico.

[0032] La figura 1B muestra un electroferograma de un análisis típico de muestras reducidas. En el eje X se representa el tiempo en minutos y en el eje Y se representan las unidades de fluorescencia relativa (UFR). El aumento del tiempo de migración corresponde al aumento del tamaño de la proteína.

[0033] Descripción detallada de la invención

[0034] I. Definiciones

[0035] El uso de los términos “un”, “una”, “el/la” y referencias similares en el contexto de la descripción de la presente invención reivindicada (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) debe interpretarse en el sentido de que abarca tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o que el contexto lo contradiga claramente.

[0036] La enumeración de los intervalos de valores en la presente memoria solo sirve como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en la presente memoria.

[0037] El uso del término “aproximadamente” describe valores por encima o por debajo del valor establecido en un intervalo de alrededor de /-10 %; en otras realizaciones, los valores pueden estar por encima o por debajo del valor establecido en un intervalo de alrededor de /-5 %; en otras realizaciones, los valores pueden estar por encima o por debajo del valor establecido en un intervalo de alrededor de /-2 %; en otras realizaciones, los valores pueden estar por encima o por debajo del valor establecido en un intervalo de alrededor de /-1 %. Los intervalos precedentes quedan claros por el contexto, y no se implica ninguna otra limitación. Todos los métodos descritos en la presente memoria pueden realizarse en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del lenguaje de ejemplo (p. ej., “tal como”) proporcionados en la presente memoria, simplemente ilustra mejor la invención y no supone ninguna limitación al alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse en el sentido de que indica que ningún elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la invención.

[0039] “Proteína” se refiere a una molécula que comprende dos o más residuos aminoácido unidos entre sí por una unión peptídica. La proteína incluye polipéptidos y péptidos y también puede incluir modificaciones tales como glucosilación, unión a lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos ácido glutámico, alquilación, hidroxilación y ADP-ribosilación. Las proteínas pueden ser de interés científico o comercial, incluidos los fármacos a base de proteínas, y las proteínas incluyen, entre otras cosas, enzimas, ligandos, receptores, anticuerpos y proteínas quiméricas o de fusión. Las proteínas son producidas por diversos tipos de células recombinantes usando métodos de cultivo celular bien conocidos, y generalmente se introducen en la célula mediante técnicas de ingeniería genética (por ejemplo, tales como una secuencia que codifica una proteína quimérica, o una secuencia optimizada para codones, una secuencia sin intrones, etc.) donde pueden residir como un episoma o integrarse en el genoma de la célula.

[0041] “Anticuerpo” se refiere a una molécula de inmunoglobulina que consiste en cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por uniones disulfuro. Cada cadena pesada tiene una región variable de cadena pesada (HCVR o VH, por sus siglas en inglés) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada contiene tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera tiene una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera consiste en un dominio (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, por sus siglas en inglés). Cada VH y VL está compuesto por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. El término “anticuerpo” incluye la referencia a inmunoglobulinas tanto glucosiladas como no glucosiladas de cualquier isotipo o subclase. El término “anticuerpo” incluye moléculas de anticuerpos preparadas, expresadas, creadas o aisladas por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula hospedadora transinfectada para expresar el anticuerpo. El término anticuerpo también incluye un anticuerpo biespecífico, que incluye una inmunoglobulina heterotetramérica que puede unirse a más de un epítopo diferente. Los anticuerpos biespecíficos se describen generalmente en la Patente Estadounidense número 8,586,713.

[0042] Las “proteínas de fusión Fc” comprenden parte o la totalidad de dos o más proteínas, una de las cuales es una porción Fc de una molécula de inmunoglobulina, que, de otro modo, no se encuentran juntas en la naturaleza. La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados con diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluido el dominio Fc) ha sido descrita, por ejemplo, por Ashkenazi et al.,Proc. Natl. Acad. SciUSA, 88: 10535 (1991); Byrn et al.,Nature344:677 (1990); y Hollenbaugh et al., “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, enCurrent Protocols in Immunology, supl. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11 (1992). Las “proteínas de fusión del receptor Fc” comprenden uno o más dominios extracelulares de un receptor acoplado a un resto Fc, que en algunas realizaciones comprende una región bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la proteína de fusión Fc comprende dos o más cadenas receptoras distintas que se unen a uno o más ligandos. Por ejemplo, una proteína de fusión Fc es una trampa, tal como, por ejemplo, una trampa de IL-1 o una trampa de VEGF.

[0044] El término “MCE” o “electroforesis capilar en microchip” se refiere a la separación de analitos por electroforesis capilar (CE) basada en microchips.

[0046] II. Ensayos y tampones de MCE

[0048] Se proporcionan métodos para analizar analitos en una muestra de fármaco proteico. Los fármacos proteicos incluyen, entre otros, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de estos, proteínas de fusión y proteínas recombinantes. En los ensayos se emplean técnicas de MCE para separar, identificar y cuantificar el producto proteico y las impurezas en el producto proteico. Las impurezas incluyen, entre otros, agregados de proteínas, fragmentos de proteínas, multímeros de proteínas y agentes contaminantes de ensayo. También se proporcionan tampones reductores y no reductores.

[0050] La electroforesis capilar con microchip (MCE) proporciona un análisis de la pureza de las proteínas y las impurezas adecuado para las pruebas durante el proceso, la liberación de lotes y la indicación de estabilidad. Las muestras de proteínas, como casirivimab e imdevimab, se prepararon desnaturalizando la muestra mediante calentamiento y adición de dodecilsulfato de litio (LDS, por sus siglas en inglés) con un agente alquilante (no reducido) o un agente reductor (reducido). Sin pretender imponer ninguna teoría, esto produce cadenas polipeptídicas proteína-LDS lineales cargadas negativamente, que luego se incuban con un colorante de éster amínico para marcar covalentemente cualquier grupo amino libre. Las muestras marcadas pueden inyectarse en un microchip donde la aplicación de una corriente separa los componentes de la muestra según la relación masa/carga. La detección se puede realizar mediante fluorescencia inducida por láser, produciendo un electroferograma. El análisis del electroferograma proporciona la pureza relativa de la muestra en comparación con las impurezas presentes.

[0051] A. Tampones

[0052] 1. Tampones no reductores

[0053] En una realización se proporciona un tampón de muestra de electroforesis acuosa no reductor que contiene 2-yodoacetamida de 155 mM a 200 mM; dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 %; y fosfato de sodio de 60 mM a 95 mM, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH menor que 7. En una realización, el pH del tampón es 6.

[0054] En otra realización se proporciona un tampón de muestra de electroforesis acuosa no reductor que contiene 2-yodoacetamida de 155 mM a 200 mM; dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 %; y fosfato de sodio de 60 mM a 95 mM, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH menor que 8. En otra realización, el pH del tampón es 8. En otra realización, el tampón acuoso contiene 2-yodoacetamida 200 mM, dodecilsulfato de litio al 1,2 % y fosfato de sodio 60 mM.

[0055] Todas las realizaciones tienen la condición de que el tampón no sea un tampón de muestra de electroforesis acuosa que contenga 2-yodoacetamida de 155 mM a 175 mM, dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 % y fosfato de sodio de 60 mM a 95 mM, y que tenga un pH menor que 7.

[0056] 2. Reducción de los tampones

[0057] También se proporciona un tampón reductor. En una realización, el tampón reductor es un tampón de muestra de electroforesis acuosa que contiene dodecilsulfato de litio del 0,5 % al 1,5 %, fosfato de sodio de 65 mM a 75 mM y un agente reductor, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH mayor que 8. En otra realización, el tampón reductor contiene dodecilsulfato de litio del 0,5 % al 1,5 %, fosfato de sodio de 45 mM a 75 mM y un agente reductor, y el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH de 8 o mayor. En una realización, el pH del tampón es 9. En otra realización, el pH del tampón es 8.

[0058] Los agentes reductores son conocidos en la técnica. Los ejemplos de agentes reductores incluyen, entre otros, ditiotreitol (DTT, CAS 3483-12-3), beta-mercaptoetanol (BME, 2BME, 2-ME, b-mer, CAS 60-24-2), 2-aminoetanotiol (2-MeA-HCl, también llamado cisteamina-HCl, CAS 156-57-0), clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, (TCEP, CAS 5961-85-3), clorhidrato de cisteína (Cys-HCl, CAS 52-89-1) o sal sódica del ácido 2-mercaptoetanosulfónico (MESNA). En la técnica se conocen otros métodos para reducir los enlaces proteicos, tales como una columna reductora inmovilizada que contiene resina en la que se ha inmovilizado un agente reductor a base de tiol para permitir la reducción en fase sólida de los enlaces disulfuro peptídicos y proteicos. También se contemplan agentes reductores adicionales adecuados para escindir enlaces disulfuro. Según la invención, el tampón reductor contiene ditiotreitol. En una realización, el tampón reductor contiene ditiotreitol de 80 mM a 155 mM, con la condición de que el tampón no contenga ditiotreitol de 135 mM a 155 mM. En otra realización más se proporciona un tampón reductor que contiene dodecilsulfato de litio al 1,2 %, fosfato de sodio 60 mM y ditiotreitol 80 mM.

[0059] 3. Tampones no reductores a base de HEPES

[0060] Los tampones a base de HEPES no forman parte del contenido reivindicado, pero también se pueden usar con los métodos divulgados. Una realización proporciona un tampón de muestra de electroforesis acuosa a base de HEPES no reductor que contiene un agente alquilante, por ejemplo, 2-yodoacetamida de 55 mM a 75 mM; dodecilsulfato de litio del 0,1 % al 1,0 %; HEPES de 5 mM a 85 mM y cloruro de sodio de 5 mM a 115 mM, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH menor que 9. En una realización, el pH del tampón es 8. En otra realización, el tampón acuoso contiene 2-yodoacetamida 66,4 mM, dodecilsulfato de litio al 0,32 %, HEPES 16,2 mM y cloruro de sodio 48,6 mM.

[0061] 4. Tampones reductores a base de HEPES

[0062] En otra realización se proporciona un tampón de muestra de electroforesis acuosa a base de HEPES reductor que contiene dodecilsulfato de litio del 0,05 % al 0,75 %, cloruro de sodio de 5 mM a 115 mM, HEPES de 5 mM a 115 mM y un agente reductor, en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH mayor que 7. En una realización, el pH del tampón es 8. En una realización, el tampón reductor contiene ditiotreitol de 35 mM a 50 mM. En otra realización más se proporciona un tampón reductor que contiene dodecilsulfato de litio al 0,28 %, cloruro de sodio 41,5 mM, HEPES 13,8 mM y ditiotreitol 42,5 mM.

[0063] B. Ensayos

[0064] 1. Ensayos no reductores

[0065] En una realización se proporciona un método de MCE no reductor para identificar agentes contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico, incluyendo el método las etapas de añadir la muestra de proteína a un tampón no reductor mencionado anteriormente para formar una muestra de fármaco proteico tamponado. La muestra de fármaco proteico tamponado se calienta a una temperatura entre 50 °C y 85 °C durante 5 a 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico tamponado desnaturalizado, con la condición de que la muestra de fármaco proteico tamponado no se caliente a una temperatura entre 65 °C y 85 °C durante 5 a 15 minutos para formar la muestra de fármaco proteico tamponado desnaturalizado. En otra realización, la muestra de fármaco proteico tamponado se calienta a una temperatura entre 45 °C y 75 °C durante 5 a 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico tamponado y desnaturalizado, con la condición de que la muestra de fármaco proteico tamponado no se caliente a una temperatura entre 65 °C y 85 °C durante 5 a 15 minutos para formar la muestra de fármaco proteico tamponado y desnaturalizado. En otra realización preferida, la muestra de fármaco proteico tamponado se calienta a 60 °C durante 10 min. En otra realización preferida más, la muestra de fármaco proteico tamponado se calienta a 63 °C durante 10 min. Se prepara un marcador detectable según las recomendaciones del proveedor en sulfóxido de dimetilo (DMSO). Las diluciones posteriores se preparan según las recomendaciones del proveedor en MilliQ. En otras realizaciones, el marcador se prepara mediante dilución en fosfato de sodio 200 mM a pH 7,2. En algunas realizaciones, el marcador se diluye hasta una solución 5 µM. En otras realizaciones, el marcador se diluye hasta una solución 16 µM. El marcador diluido se añade luego a la muestra de fármaco proteico tamponado y desnaturalizado y se calienta a una temperatura de 30 °C a 40 °C durante 10 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcado y desnaturalizado. En otra realización, se añade luego un marcador detectable a la muestra de fármaco proteico tamponado y desnaturalizado y se calienta a una temperatura de 30 °C a 40 °C durante 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcado y desnaturalizado. En una realización, la muestra de fármaco proteico desnaturalizado con marcador añadido se calienta a 35 °C durante 30 minutos. En otra realización preferida, la muestra de fármaco proteico desnaturalizado con marcador añadido se calienta a 35 °C durante 15 minutos. El exceso de marcador se retira opcionalmente de la muestra, por ejemplo, mediante el uso de un filtro de centrifugación. En otra realización más, el exceso de marcador no se extingue. En otra realización más, el exceso de marcador no se retira. Un marcador detectable preferido incluye, entre otros, Dyomics DY-631 NHS Ester. Se pueden usar otros marcadores detectables que incluyan otros colorantes, fluoróforos, cromóforos, etiquetas de masa, puntos cuánticos y similares y los divulgados en la Patente Estadounidense número 6,924,372.

[0066] El producto farmacológico proteico marcado y desnaturalizado se diluye y se somete a MCE para separar la muestra de fármaco proteico diluido en un sistema de electroforesis capilar con microchip para producir un electroferograma. En una realización, la concentración final de una muestra que comienza con 0,5 mg/ml y que luego se inyecta sobre el microchip es de 9 µg/ml en MCE. En otra realización, la concentración de comienzo de la muestra es de 0,2 mg/ml. El electroferograma contiene picos correspondientes al producto farmacológico proteico y a las impurezas. El método concluye identificando los picos en el electroferograma correspondientes a agentes contaminantes o impurezas.

[0067] 2. Ensayos reductores

[0068] En otra realización se proporciona un método de reducción de MCE para identificar agentes contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico. El método empieza añadiendo la muestra de fármaco proteico a cualquiera de los tampones reductores descritos anteriormente para formar una muestra de fármaco proteico tamponada. En una realización, la muestra de fármaco proteico tamponado se desnaturaliza calentando la muestra de fármaco proteico tamponado a una temperatura de 50 °C a 72 °C, o de 45 °C a 75 °C, o preferiblemente a 60 °C durante 10 minutos para formar una muestra de fármaco proteico desnaturalizado, con la condición de que la muestra de fármaco proteico tamponado no se caliente a una temperatura de entre 65 °C y 85 °C durante 5 a 15 minutos para formar la muestra de fármaco proteico tamponado y desnaturalizado. En otra realización preferida más, la muestra de fármaco proteico tamponado se calienta a 63 °C durante 10 min. La temperatura necesaria para desnaturalizar la muestra de fármaco de proteína diana puede cambiarse según la estructura de la muestra de fármaco de proteína diana.

[0069] La muestra de fármaco proteico con marcador añadido se calienta luego a una temperatura de 30 °C a 40 °C durante 20 a 40 minutos o durante 10 a 20 o durante 10 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada y desnaturalizada. En una realización, la muestra del producto farmacológico proteico con marcador añadido se calienta a 35 °C durante 30 minutos. En otra realización preferida, la muestra del producto farmacológico proteico con marcador añadido se calienta a 35 °C durante 15 minutos. El exceso de marcador se retira opcionalmente de la muestra, por ejemplo, mediante el uso de un filtro de centrifugación. En otra realización más, el exceso de marcador no se extingue. En otra realización más, el exceso de marcador no se retira. Un marcador detectable preferido incluye, entre otros, Dyomics DY-631 NHS Ester. Otros marcadores detectables que pueden usarse incluyen otros colorantes, fluoróforos, cromóforos, etiquetas de masa, puntos cuánticos y similares y los divulgados en la Patente Estadounidense número 6,924,372.

[0071] En una realización, el intervalo de ensayo establecido para la concentración de la muestra es de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml, lo que corresponde a una concentración final que se analiza de aproximadamente 7 µg/ml a 11 µg/ml que se somete a un análisis de MCE en un sistema de electroforesis capilar con microchip para producir un electroferograma. En otra realización, el intervalo de ensayo establecido para la concentración de la muestra es de 0,2 mg/ml a 0,6 mg/ml, lo que corresponde a una concentración final que se analiza de aproximadamente 3,6 µg/ml a 11 µg/ml que se somete a un análisis de MCE en un sistema de electroforesis capilar con microchip para producir un electroferograma. El método concluye identificando los picos en el electroferograma correspondientes al producto farmacológico proteico, los agentes contaminantes y/o las impurezas.

[0073] C. Instrumentación

[0075] La instrumentación para llevar a cabo los ensayos de MCE divulgados está disponible comercialmente. En una realización, los ensayos de MCE divulgados se realizan usando LabChip GXII o LabChip GXII Touch HT y el chip LabChip<®>HT Protein Express.

[0077] III. Proteínas de interés

[0079] La proteína de interés, por ejemplo, un producto farmacológico proteico, ensayada con los ensayos y reactivos de MCE divulgados puede ser cualquier proteína de interés adecuada para la expresión en células procariotas o eucariotas y puede usarse en los sistemas de células hospedadoras modificados genéticamente proporcionados. Por ejemplo, la proteína de interés incluye, entre otros, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión al antígeno de este, un ScFv o fragmento de este, una proteína de fusión Fc o un fragmento de esta, un factor de crecimiento o un fragmento de este, una citocina o un fragmento de esta, o un dominio extracelular de un receptor de la superficie celular o un fragmento de este. Las proteínas de interés pueden ser polipéptidos simples que consisten en una única subunidad, o proteínas multisubunidades complejas que comprenden dos o más subunidades. La proteína de interés puede ser un producto biofarmacéutico, un aditivo alimentario o un conservante, o cualquier producto proteico sujeto a estándares de purificación y calidad.

[0081] En algunas realizaciones, el fármaco proteico (proteína de interés) es un anticuerpo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un fragmento de anticuerpo de unión a antígenos, un anticuerpo monocatenario, un diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2, un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgE, un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgG, un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3 o un anticuerpo IgG4. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2/IgG4 quimérico. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2/IgG1 quimérico. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2/IgG1/IgG4 quimérico.

[0083] Las realizaciones se pueden usar con cualquier anticuerpo terapéutico conocido. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo contra la muerte celular 1 programada (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD1 como se describe en la Patente de EE. UU. Appln. Pub. núm., US2015/0203579A1), un antiligando-1 de muerte celular programada (p. ej., un anticuerpo anti-PD-L1 como se describe en la Patente de EE. UU. Appln. Pub. núm., US2015/0203580A1), un anticuerpo anti-DII4, un anticuerpo antiangiopoyetina-2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-ANG2 como se describe en la Patente de EE. UU. núm., 9,402,898), un anticuerpo antiangiopoyético tipo 3 (p. ej., un anticuerpo anti-AngPtl3 tal como se describe en la Patente Estadounidense núm., 9,018,356), un anticuerpo antirreceptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (p. ej., un anticuerpo anti-PDGFR, tal como se describe en la Patente de EE. UU. núm., 9,265,827), un anticuerpo anti-Erb3, un anticuerpo antirreceptor de la prolactina (p. ej., un anticuerpo anti-PRLR, tal como se describe en la Patente Estadounidense núm., 9,302,015), un anticuerpo anticomplemento 5 (p. ej., un anticuerpo anti-C5, tal como se describe en la Patente de EE. UU. Appln. Pub. núm., US2015/0313194A1), un anticuerpo anti-TNF, un anticuerpo antirreceptor del factor de crecimiento epidérmico (p. ej., un anticuerpo anti-EGFR, tal como se describe en la Patente de EE. UU. núm., 9,132,192 o un anticuerpo anti-EGFR-vIII, tal como se describe en la Patente de EE. UU. Appln. Pub. núm., US2015/0259423A1), un anticuerpo antiproproteína convertasa subtilisina kexina-9 (p. ej., un anticuerpo anti-PCSK9 como se describe en la Patente de EE. UU. núm., 8,062,640 o la Patente de EE. UU. núm., 9,540,449), un anticuerpo antifactor 8 de crecimiento y diferenciación (por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF8, también conocido como anticuerpo antimiostatina), tal como se describe en las Patentes Estadounidenses núms. 8,871,209 o 9,260,515), un anticuerpo antirreceptor de glucagón (por ejemplo, un anticuerpo anti-GCGR como se describe en la Patente de EE. UU. Appln. Pub. núm., US2015/0337045A1 o US2016/0075778A1), un anticuerpo anti-VEGF, un anticuerpo anti-IL1R, un anticuerpo antirreceptor de la interleucina 4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL4R como se describe en la Patente de EE. UU. Appln. Pub.

[0084] núm., US2014/0271681A1 o las Patentes Estadounidenses núms. 8,735,095 o 8,945,559), un anticuerpo antirreceptor de la interleucina 6 (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL6R como se describe en las Patentes de EE. UU. números 7,582,298, 8,043,617 o 9,173,880), un anticuerpo anti-IL1, un anticuerpo anti-IL2, un anticuerpo anti-IL3, un anticuerpo anti-IL4, un anticuerpo anti-IL5, un anticuerpo anti-IL6, un anticuerpo anti-IL7, un anticuerpo antiinterleucina 33 (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL33 como se describe en las Patentes de EE. UU. números 9,453,072 o 9,637,535), un anticuerpo antivirus sincitial respiratorio (por ejemplo, un anticuerpo anti-RSV como se describe en la Patente de EE. UU. Appln. Pub. núm., 9,447,173), un antiagrupamiento de diferenciación 3 (p. ej., un anticuerpo anti-CD3, tal como se describe en las Patentes de EE. UU. números 9,447,173 y 9,447,173, y en la Solicitud Estadounidense núm. 62/222,605), un antiagrupamiento de diferenciación 20 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 como se describe en las Patentes Estadounidenses números 9,657,102 y US20150266966A1, y en la Patente Estadounidense núm., 7,879,984), un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD28, un anticuerpo antiagrupamiento de diferenciación-48 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD48, tal como se describe en la Patente Estadounidense núm., 9,228,014), un anticuerpo anti-Fel d1 (por ejemplo, tal como se describe en la Patente Estadounidense núm., 9,079,948), un virus antisíndrome respiratorio de Oriente Medio (p. ej., un anticuerpo anti-MERS, tal como se describe en la Patente Estadounidense Appln. Pub. núm., US2015/0337029A1), un anticuerpo antivirus del Ébola (por ejemplo, como se describe en la Patente de EE. UU. Appln. Pub. núm., US2016/0215040), un anticuerpo antivirus del Zika, un anticuerpo contra el gen 3 de activación de los linfocitos (por ejemplo, un anticuerpo anti-LAG3 o un anticuerpo anti-CD223), un anticuerpo contra el factor de crecimiento nervioso (por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF como se describe en la Patente de EE. UU. Appln. Pub. núm., US2016/0017029 y las Patentes de EE. UU. números.8,309,088 y 9,353,176) y un anticuerpo antiproteína Y. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD20 (como se describe en la Patente de EE. UU. Appln. Pub. núm., US2014/0088295A1 y US20150266966A1), un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x antimucina 16 (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-Muc16) y un anticuerpo biespecífico de antígeno de membrana anti-CD3 x antiprostático (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-PSMA). En algunas realizaciones, la proteína de interés puede seleccionarse del grupo que consiste en casirivimab, imdevimab, ravulizumab-cwvz, abciximab, adalimumab, adalimumab-atto, ado-trastuzumab, alemtuzumab, alirocumab, atezolizumab, avelumab, basiliximab, belimumab, benralizumab, bevacizumab, bezlotoxumab, blinatumomab, brentuximab vedotina, brodalumab, canakinumab, capromab pendetide, certolizumab pegol, cemiplimab, cetuximab, denosumab, dinutuximab, dupilumab, durvalumab, eculizumab, elotuzumab, emicizumab-kxwh, emtansinealirocumab, evinacumab, evolocumab, fasinumab, golimumab, guselkumab, ibritumomab tiuxetan, idarucizumab, infliximab, infliximab-abda, infliximab-dyyb, ipilimumab, ixekizumab, mepolizumab, necitumumab, nesvacumab, nivolumab, obiltoxaximab, obinutuzumab, ocrelizumab, ofatuzumab, olaratumab, omalizumab, panitumumab, pembrolizumab, pertuzumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, reslizumab, rinucumab, rituximab, sarilumab, secukinumab, siltuximab, tocilizumab, trastuzumab, trevogrumab, ustekinumab y vedolizumab.

[0086] En algunas realizaciones, la proteína de interés es una proteína recombinante que contiene un resto Fc y otro dominio (por ejemplo, una proteína de fusión Fc). En algunas realizaciones, una proteína de fusión Fc es una proteína de fusión Fc del receptor, que contiene uno o más dominios extracelulares de un receptor acoplado a un resto Fc. En algunas realizaciones, el resto Fc comprende una región bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una IgG. En algunas realizaciones, la proteína de fusión del receptor Fc contiene dos o más cadenas receptoras distintas que se unen a un único ligando o a múltiples ligandos. Por ejemplo, una proteína de fusión Fc es una proteína TRAP, tal como una trampa para IL-1 (p. ej., rilonacept), que contiene la región de unión al ligando IL-1RAcP fusionada con la región extracelular de IL-1R1 fusionada con la Fc del hIgG1; véase la patente de EE. UU. núm., 6,927,044, o una trampa de VEGF (p. ej., aflibercept o ziv-aflibercept), que comprende el dominio 2 de Ig del receptor Flt1 de VEGF fusionado con el dominio 3 de Ig del receptor Flk1 de VEGF fusionado con el Fc de hIgG1; véanse las Patentes de EE. UU. números 7,087,411 y 7,279,159). En otras realizaciones, una proteína de fusión Fc es una proteína de fusión ScFv-Fc, que contiene uno o más de uno o más dominios de unión al antígeno, tales como un fragmento de cadena pesada variable y un fragmento de cadena ligera variable, de un anticuerpo acoplado a un resto Fc.

[0088] IV. Cultivo celular

[0090] El producto farmacológico proteico ensayado con los ensayos y reactivos de MCE divulgados son cultivos celulares producidos. Los cultivos celulares pueden ser un “cultivo celular alimentado por lotes” o un “cultivo alimentado por lotes”, que se refiere a un cultivo por lotes en donde las células y el medio de cultivo se suministran inicialmente al recipiente de cultivo y se suministran lentamente nutrientes de cultivo adicionales, en incrementos discretos, al cultivo durante el cultivo, con o sin recolección periódica de células y/o productos antes de la finalización del cultivo. El cultivo alimentado por lotes incluye el “cultivo alimentado por lotes semicontinuo” en donde periódicamente el cultivo completo (que puede incluir células y medio) se retira y se reemplaza por medio fresco. El cultivo alimentado por lotes se distingue del simple “cultivo por lotes”, mientras que todos los componentes para el cultivo celular (incluidas las células animales y todos los nutrientes del cultivo) se suministran al recipiente de cultivo al comienzo del proceso de cultivo en el cultivo por lotes. El cultivo alimentado por lotes puede ser diferente del “cultivo por perfusión” en la medida en que el sobrenadante no se retira del recipiente de cultivo durante un proceso estándar de alimentación por lotes, mientras que en el cultivo por perfusión, las células se retienen en el cultivo, por ejemplo, mediante filtración, y el medio de cultivo se introduce y se retira del recipiente de cultivo de forma continua o intermitente. Sin embargo, se contempla la retirada de muestras con fines de prueba durante el cultivo celular alimentado por lotes. El proceso de alimentación por lotes continúa hasta que se determina que se alcanza el volumen de trabajo máximo y/o la producción de proteínas, y la proteína se recolecta posteriormente.

[0091] El cultivo celular puede ser un “cultivo celular continuo”, que es una técnica usada para hacer crecer células de forma continua, normalmente en una fase de crecimiento particular. Por ejemplo, si se requiere un suministro constante de células, o se requiere la producción de una proteína de interés particular, el cultivo celular puede requerir mantenimiento en una fase particular de crecimiento. Por lo tanto, las condiciones deben monitorizarse continuamente y ajustarse en consecuencia para mantener las células en esa fase particular.

[0092] Las células se cultivan en medio de cultivo celular. Los términos “medio de cultivo celular” y “medio de cultivo” se refieren a una solución nutritiva usada para el crecimiento de células de mamíferos que normalmente proporciona los nutrientes necesarios para mejorar el crecimiento de las células, como una fuente de energía de carbohidratos, esencial (por ejemplo, fenilalanina, valina, treonina, triptófano, metionina, leucina, isoleucina, lisina e histidina) y no esencial (por ejemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, prolina, serina y tirosina) aminoácidos, oligoelementos, fuentes de energía, lípidos, vitaminas, etc. El medio de cultivo celular puede contener extractos, por ejemplo, suero o peptonas (hidrolizados), que suministran materias primas que favorecen el crecimiento celular. Los medios pueden contener extractos derivados de levadura o soja, en lugar de extractos de origen animal. El medio químicamente definido se refiere a un medio de cultivo celular en el que todos los componentes químicos son conocidos (es decir, tienen una estructura química conocida). El medio químicamente definido está completamente exento de componentes de origen animal, tales como peptonas de origen animal o sérico. En una realización, el medio es un medio químicamente definido.

[0093] La solución también puede contener componentes que mejoren el crecimiento y/o la supervivencia por encima de la tasa mínima, incluidas las hormonas y los factores de crecimiento. La solución puede formularse a un pH y una concentración de sal óptimos para la supervivencia y la proliferación de la célula particular que se está cultivando.

[0094] Una “estirpe celular” se refiere a una célula o células que se derivan de un linaje particular mediante pases en serie o subcultivo de células. El término “células” se usa indistintamente con “población celular”.

[0095] El término “célula” incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las procariotas y eucariotas, tales como células bacterianas, células de mamíferos, células humanas, células de animales no humanos, células de aves, células de insectos, células de levadura o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En ciertas realizaciones, la célula es una célula humana, de mono, simio, hámster, rata o ratón. En otras realizaciones, la célula se puede seleccionar entre las siguientes células: Ovario de hámster chino (CHO) (p. ej., CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (p. ej., COS-7), célula retiniana, Vero, CV1, riñón (p. ej., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, linfocito, p. ej., Jurkat (linfocito T) o Daudi (linfocito B), A431 (epidérmico), U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, célula MMT, célula madre, célula tumoral y una estirpe celular derivada de una célula anteriormente mencionada. En algunas realizaciones, la célula comprende uno o más genes víricos, p. ej., una célula retiniana que expresa un gen vírico (p. ej., una célula PER.C6<®>). En algunas realizaciones, la célula es una célula CHO. En otras realizaciones, la célula es una célula CHO K1.

[0096] V.Kits

[0097] En una realización se proporciona unkitque incluye uno o más de los tampones o ingredientes divulgados para preparar los tampones divulgados. Elkitpuede incluir un contenedor para los tampones o los ingredientes. Los tampones pueden estar en solución o en forma liofilizada. Elkittambién incluye opcionalmente un segundo contenedor que contiene un diluyente o una solución reconstituyente para la formulación liofilizada; y opcionalmente, instrucciones para el uso de la solución o la reconstitución y/o el uso de los tampones liofilizados o ingredientes en polvo.

[0098] Elkitpuede incluir además los reactivos adicionales necesarios para realizar los ensayos de MCE divulgados, incluidos uno o más de un tampón, un diluyente y un filtro. El tampón y los reactivos pueden estar en una botella, un vial o un tubo de pruebas.

[0099] Los siguientes ejemplos no limitan el alcance de lo que los autores consideran sus invenciones.

[0100] Ejemplos

[0101] Ejemplo 1: Ensayo MCE para el análisis de pureza e impurezas de proteínas terapéuticas.

[0102] Métodos y materiales

[0103] Materiales

[0104] Se usaron LabChip GXII o LabChip GXII Touch HT y LabChip<®>HT Protein Express Chip para la separación electroforética capilar y la recopilación de datos (Perkin Elmer). Los tampones desnaturalizantes reductores y no reductores divulgados anteriormente se usaron para el ensayo MCE.

[0105] Métodos

[0106] La electroforesis capilar con microchip (MCE) proporciona un análisis de la pureza de las proteínas y las impurezas adecuado para las pruebas durante el proceso, la liberación de lotes y la indicación de estabilidad. Las muestras de proteína de casirivimab e imdevimab se prepararon desnaturalizando la muestra mediante calentamiento y adición de dodecilsulfato de litio (LDS) con un agente alquilante (no reducido) o reductor (reducido). Las muestras resultantes se incubaron luego con un colorante de éster amínico para marcar covalentemente cualquier grupo amino libre. Las muestras marcadas se inyectaron en un microchip donde la aplicación de una corriente separó los componentes de la muestra según el tamaño (de bajo a alto peso molecular). La detección se realizó mediante fluorescencia inducida por láser, produciendo un electroferograma. El análisis del electroferograma proporcionó la pureza relativa de la muestra en comparación con las impurezas presentes.

[0107] La tabla 1 muestra el procedimiento de flujo de trabajo para preparar una muestra para un primer ensayo de MCE. En resumen, las muestras de proteína se diluyeron a 0,5 mg/ml. Se añadieron 1 µl de tampón desnaturalizante no reductor (NR) o reductor (R) y 4 µl de la muestra diluida a una placa de 96 pocillos. La muestra se mezcló, se centrifugó y se calentó durante 10 minutos a la temperatura especificada para el producto, normalmente 75 °C. Luego, las muestras se marcaron con 5 µM de colorante disponible en el mercado (por ejemplo, Dyomics DY-631 NHS Ester, también denominado colorante PICO). Las muestras se mezclaron, se centrifugaron y después se calentaron a 35 °C durante 30 minutos. La muestra marcada se diluyó luego con 105 µl de solución de parada diluida. Las muestras se separaron usando LabChip GXII o LabChip GXII Touch HT.

[0108] Tabla 1. Método de preparación de muestras para un primer ensayo de MCE

[0111]

[0113] La tabla 2 muestra el procedimiento de flujo de trabajo para preparar una muestra para un segundo ensayo de MCE. En resumen, las muestras de proteína se diluyeron a 0,5 mg/ml o 2 mg/ml. Se añadieron 10 µl de tampón desnaturalizante no reductor (NR) o reductor (R) y 40 µl de la muestra diluida a una placa de 96 pocillos. La muestra se mezcló, se centrifugó y se calentó durante 10 minutos a la temperatura especificada para el producto, normalmente 60 °C. Luego, las muestras se marcaron con 16 µM de colorante disponible en el mercado (por ejemplo, Dyomics DY-631 NHS Ester). Las muestras se mezclaron, se centrifugaron y luego se calentaron a 35 °C durante 15 minutos. La muestra marcada se diluyó luego con 105 µl de solución de parada diluida o solución diluida. Las muestras se separaron usando LabChip GXII o LabChip GXII Touch HT.

[0114] Ejemplo 1A: Tampón no reductor

[0115] Se siguió la preparación general presentada en la Tabla 1, usando en la etapa de preparación de la muestra un tampón de muestra de electroforesis acuosa no reductora que contenía 2-yodoacetamida 166 mM, dodecilsulfato de litio al 0,81 % y fosfato de sodio 81 mM y tenía un pH de 6. La muestra se calentó a 75 °C durante 10 minutos. En la etapa de marcado de la muestra se usó una solución de colorante 5 µM. En la etapa de dilución final se usaron 105 μl de solución de parada diluida.

[0116] Ejemplo 1B: Reducción del tampón

[0117] Se siguió la preparación general presentada en la Tabla 1, usando en la etapa de preparación de la muestra un tampón de muestra para electroforesis acuosa reductora que contenía un 0,69 % de dodecilsulfato de litio, 69 mM de fosfato de sodio y 142 mM de ditiotreitol, y tenía un pH de 9. La muestra se calentó a 75 °C durante 10 minutos. En la etapa de marcado de la muestra se usó una solución de colorante 5 µM. En la etapa de dilución final se usaron 105 μl de solución de parada diluida.

[0118] Tabla 2. Método general de preparación de muestras para un segundo ensayo de MCE

[0121]

[0123] Tampones

[0124] Se prepararon soluciones madre de monohidrato de fosfato de sodio 200 mM, hepathidrato dibásico de fosfato de sodio 200 mM y dodecilsulfato de litio (LDS) al 10 %. Alternativamente, se usó un tampón de fosfato de sodio preparado comercialmente con un pH de 8.

[0125] Usando las soluciones madre y agua Milli-Q<®>, se prepararon soluciones de fosfato sódico 100 mM, LDS al 1 %, pH 6, y fosfato sódico 100 mM, LDS al 1 %, pH 9.

[0126] Se prepararon tampones alternativos usando soluciones madre y el agua Milli-Q incluía soluciones de fosfato de sodio 100 mM, LDS al 2 %, pH 6, y fosfato de sodio 100 mM, LDS al 2 %, pH 8.

[0127] Se preparó un tampón no reductor añadiendo 34 µl de yodoacetamida (IAM) 1 M (preparada fresca en agua Milli-Q<®>) 166 µl de fosfato de sodio 100 mM, LDS al 1 %, pH 6 5 µl de agua Milli-Q<®>. Las concentraciones finales fueron de 2-yodoacetamida 166 mM, dodecilsulfato de litio al 0,81 % y fosfato de sodio 81 mM.

[0128] Se preparó un tampón no reductor alternativo añadiendo 800 µl de yodoacetamida (IAM) 1 M (preparada fresca en agua Milli-Q<®>) 1200 µl de fosfato de sodio 100 mM con LDS al 2 %, pH 8. Las concentraciones finales fueron de 2-yodoacetamida 200 mM, dodecilsulfato de litio al 1,2 % y fosfato de sodio 60 mM.

[0129] Se preparó otro tampón no reductor añadiendo 800 µl de yodoacetamida (IAM) 1 M (preparada fresca en agua Milli-Q<®>) 1200 µl de fosfato de sodio 100 mM con LDS al 2 %, pH 6. Las concentraciones finales fueron de 2-yodoacetamida 200 mM, dodecilsulfato de litio al 1,2 % y fosfato de sodio 60 mM.

[0130] Se preparó un tampón reductor añadiendo 68 µl de agente reductor 10x (500 mM de ditiotreitol (DTT) 166 µl de fosfato de sodio 100 mM al 1 % de LDS, pH 9 6 µl de agua Milli-Q<®>. Las concentraciones finales fueron dodecilsulfato de litio al 0,69 %; fosfato de sodio 69 mM y ditiotreitol 142 mM.

[0131] Se preparó un tampón reductor alternativo añadiendo 320 µl de agente reductor 10x (500 mM de ditiotreitol (DTT) 1200 µl de fosfato de sodio 100 mM de LDS al 2 %, pH 8 480 µl de agua MilliQ<®>. Las concentraciones finales fueron de dodecilsulfato de litio al 1,2 %; fosfato de sodio 60 mM y ditiotreitol 80 mM.

[0132] Ejemplo 2A: Tampón no reductor

[0133] Se siguió la preparación general presentada en la Tabla 2, usando en la etapa de preparación de la muestra un tampón de muestra de electroforesis acuosa no reductora que contenía 2-yodoacetamida 200 mM, dodecilsulfato de litio al 1,2 % y fosfato de sodio 60 mM y tenía un pH de 8. La muestra se calentó a 60 °C durante 10 minutos. En la etapa de marcado de la muestra se usó una solución de colorante 16 µM. En la etapa de dilución final se usaron 105 μl de solución de parada diluida.

[0134] Ejemplo 2B: Reducción del tampón

[0135] Se siguió la preparación general presentada en la Tabla 2, usando en la etapa de preparación de la muestra un tampón de muestra para electroforesis acuosa reductora que contenía dodecilsulfato de litio al 1,2 %, fosfato de sodio 60 mM y ditiotreitol 80 mM, y tenía un pH de 8. La muestra se calentó a 60 °C durante 10 minutos. En la etapa de marcado de la muestra se usó una solución de colorante 16 µM. En la etapa de dilución final se usaron 105 μl de solución de parada diluida.

[0136] Ejemplo 2C: Tampón no reductor, sin extinción

[0137] Se siguió la preparación general presentada en la Tabla 2, usando en la etapa de preparación de la muestra un tampón de muestra de electroforesis acuosa no reductora que contenía 2-yodoacetamida 200 mM, dodecilsulfato de litio al 1,2 % y fosfato de sodio 60 mM y tenía un pH de 6. La muestra se calentó a 63 °C durante 10 minutos. En la etapa de marcado de la muestra se usó una solución de colorante 16 µM. En la etapa de dilución final se usaron 105 μl de solución diluida.

[0138] Ejemplo 2D: Tampón reductor, sin extinción

[0139] Se siguió la preparación general presentada en la Tabla 2, usando en la etapa de preparación de la muestra un tampón de muestra para electroforesis acuosa reductora que contenía dodecilsulfato de litio al 1,2 %, fosfato de sodio 60 mM y ditiotreitol 80 mM, y tenía un pH de 8. La muestra se calentó a 63 °C durante 10 minutos. En la etapa de marcado de la muestra se usó una solución de colorante 16 µM. En la etapa de dilución final se usaron 105 μl de solución diluida.

[0140] Resultados

[0141] La electroforesis capilar (MCE) con microchip permite reducir drásticamente los tiempos de análisis de las muestras, al tiempo que mantiene los estándares de rendimiento y reproducibilidad necesarios para el análisis de control de calidad. Se desarrolló un ensayo de MCE usando los tampones desnaturalizantes reducidos y no reducidos divulgados en la presente memoria. Las figuras 1A-1B muestran electroferogramas representativos de proteína en muestras no reducidas y muestras reducidas del primer ensayo de MCE. La figura 1A muestra un electroferograma de análisis no reducido. El pico principal (PP) a 0,426 corresponde al anticuerpo principal, y los picos marcados de bajo peso molecular (PMB) corresponden a fragmentos de anticuerpos. Aunque no está presente en este ejemplo, en algunos casos está presente un pico que corresponde a uno o más fragmentos de alto peso molecular. La figura IB muestra un electroferograma de análisis reducido. Los picos correspondientes a fragmentos de anticuerpos de cadena ligera (CL), cadena pesada y cadena pesada no glucosilada (CPNG), de bajo peso molecular (PMB) y de alto peso molecular (PMA) se marcan en consecuencia. Cabe señalar que los diferentes productos pueden tener variaciones en los electroferogramas producidos y, por tanto, diferentes convenciones de marcado.

[0142] La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un tampón de muestra de electroforesis acuosa, que comprende:

2-yodoacetamida de 155 mM a 200 mM;

dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 %; y

fosfato de sodio de 60 mM a 95 mM,

en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH menor o igual que 8, con la condición de que no sea un tampón de muestra de electroforesis acuosa con un pH menor que 7, y que comprende: 2-yodoacetamida de 155 mM a 175 mM;

dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 %; y

y fosfato de sodio de 65 mM a 95 mM.

2. El tampón acuoso de la reivindicación 1, en donde el pH es 6.

3. El tampón acuoso de la reivindicación 1, que comprende 2-yodoacetamida 200 mM, dodecilsulfato de litio al 1,2 % y fosfato de sodio 60 mM.

4. El tampón de muestra de electroforesis acuosa de la reivindicación 1, que comprende:

2-yodoacetamida 200 mM,

dodecilsulfato de litio al 1,2 %, y

fosfato de sodio 60 mM,

en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH de 6,0; o comprende:

2-yodoacetamida 200 mM,

dodecilsulfato de litio al 1,2 %, y

fosfato de sodio 60 mM,

en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH de 8,0.

5. Un tampón de muestra de electroforesis acuosa, que comprende:

dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 %;

fosfato de sodio de 45 mM a 75 mM,

ditiotreitol de 80 mM a 155 mM,

en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH de 8 o mayor, por ejemplo, en donde el pH es 8 o 9, y con la condición de que el tampón de muestra de electroforesis acuosa no comprenda ditiotreitol de 135 mM a 155 mM.

6. El tampón acuoso de la reivindicación 5, que comprende ditiotreitol 80 mM.

7. El tampón acuoso de la reivindicación 5, que comprende además dodecilsulfato de litio al 1,2 % y fosfato de sodio 60 mM.

8. El tampón acuoso de la reivindicación 5, que consiste en

dodecilsulfato de litio al 0,69 %;

fosfato de sodio 69 mM, y

ditiotreitol de 80 mM a 155 mM,

REIVINDICACIONES

1. Un tampón de muestra de electroforesis acuosa, que comprende:

2-yodoacetamida de 155 mM a 200 mM;

dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 %; y

fosfato de sodio de 60 mM a 95 mM,

dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 %; y

y fosfato de sodio de 65 mM a 95 mM.

2. El tampón acuoso de la reivindicación 1, en donde el pH es 6.

2-yodoacetamida 200 mM,

dodecilsulfato de litio al 1,2 %, y

fosfato de sodio 60 mM,

2-yodoacetamida 200 mM,

dodecilsulfato de litio al 1,2 %, y

fosfato de sodio 60 mM,

en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH de 8,0.

5. Un tampón de muestra de electroforesis acuosa, que comprende:

dodecilsulfato de litio del 0,50 % al 1,5 %;

fosfato de sodio de 45 mM a 75 mM,

ditiotreitol de 80 mM a 155 mM,

6. El tampón acuoso de la reivindicación 5, que comprende ditiotreitol 80 mM.

8. El tampón acuoso de la reivindicación 5, que consiste en

dodecilsulfato de litio al 0,69 %;

fosfato de sodio 69 mM, y

ditiotreitol de 80 mM a 155 mM,

en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH de 9,0; o consiste en dodecilsulfato de litio al 1,2 %;

fosfato de sodio 60 mM, y

ditiotreitol 80 mM,

en donde el tampón de muestra de electroforesis acuosa tiene un pH de 8,0.

9. Un método para identificar agentes contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico, comprendiendo el método las etapas siguientes:

añadir la muestra de fármaco proteico al tampón de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para formar una muestra de fármaco proteico tamponada;

calentar la muestra de fármaco proteico tamponado a una temperatura de 45 °C a 75 °C durante 5 a 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico tamponado y desnaturalizado;

añadir un marcador detectable a la muestra de fármaco proteico tamponado y desnaturalizado y calentarla a una temperatura de 30 °C a 40 °C durante 10 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcado y desnaturalizado;

diluir la muestra de fármaco proteico marcada y desnaturalizada y someterla a (a) electroforesis capilar con microchip (MCE) para separar la muestra de fármaco proteico diluida en un sistema de electroforesis capilar con microchip para producir un electroferograma o (b) análisis de MCE en un sistema de electroforesis capilar con microchip para producir un electroferograma; e

identificar los picos en el electroferograma correspondientes al fármaco proteico, a los agentes contaminantes y/o a las impurezas,

con la condición de que la muestra de fármaco proteico tamponado no se caliente a una temperatura entre 65 °C y 85 °C durante 5 a 15 minutos para formar la muestra de fármaco proteico tamponado y desnaturalizado.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la muestra de fármaco proteico tamponado se calienta a 60 °C durante 10 minutos y/o en donde la muestra de fármaco proteico marcada se calienta a 35 °C durante 15 minutos.

11. El método de la reivindicación 9, en donde la muestra de fármaco proteico diluido tiene una concentración de 3,6 µg/ml.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el marcador detectable es el éster N-hidroxisuccinimidílico DY-631.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el marcador detectable se reconstituye con sulfóxido de dimetilo (DMSO) seguido de una dilución con tampón de fosfato de sodio 200 mM de pH 7,2.

14. Unkitque comprende el tampón según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, e instrucciones escritas para preparar una muestra para la electroforesis en el tampón.