ES3057791T3

ES3057791T3 - Methods for assessing risk of developing a viral disease using a genetic test

Info

Publication number: ES3057791T3
Application number: ES24173683T
Authority: ES
Inventors: Eli Hatchwell; Peggy S Eis; Edward B Smith; Yassine Taoufik
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris Saclay; PML Screening LLC
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris Saclay; PML Screening LLC
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2026-03-04
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: ES2935891T3; US11913074B2; EP4640714A2; EP4177356A8; HRP20251555T1; SI3625368T1; EP4417708B1; ZA202100925B; EP3625368B1; ES2989209T3; US12227807B2; US12241125B2; AU2019316556B9; DK3625368T3; AU2019316556B2; EP4640714A3; US20230265520A1; AU2019316556C1; SI4177356T1; US20260015665A1

Abstract

Este documento proporciona métodos y materiales relacionados con el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, proporciona métodos para tratar la enfermedad de un sujeto basándose en la identificación del riesgo de leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP) mediante una prueba genética. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Métodos para evaluar riesgo de desarrollar una enfermedad viral usando una prueba genética Antecedentes de la divulgación

[0003] La leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) es una infección oportunista rara y potencialmente mortal del sistema nervioso central causada por un poliomavirus ubicuo, el virus de JC (JCV). Si bien el JCV está presente en tasas muy altas en la población general, la PML sigue siendo un trastorno raro, aunque importante debido a la baja supervivencia y las graves secuelas neurológicas, y la asociación recientemente demostrada con una variedad de terapias útiles, por ejemplo, natalizumab en la esclerosis múltiple (MS). Se han descrito varios factores de riesgo para la PML, pero es mejor visualizarlos como necesarios, pero no suficientes. Si bien estos factores de riesgo son muy relevantes, por sí solos no predicen quién desarrollará PML, ya que la gran mayoría de las personas con estos factores de riesgo no desarrollarán el trastorno. Es necesario considerar otros factores y cada vez hay más pruebas del papel de los factores genéticos del huésped en la susceptibilidad a la PML. El documento US2017/016919 de Plavina et al., describe métodos para evaluar el riesgo de un paciente de desarrollar PML. Mills et al., en "Understanding Progressive Multifocal Leukoencephalopathy Risk in Multiple Sclerosis Patients Treated with immunomodulatory Therapies: A Bird’s eye view", A Bird’s eye view"; Front. Immunol.9:138 describe las métricas utilizadas para predecir el riesgo de PML.

[0004] La capacidad de predecir con mayor precisión quién está en riesgo de desarrollar PML será de gran beneficio en el contexto del tratamiento farmacológico con compuestos que son altamente efectivos en el contexto de su enfermedad (natalizumab en la MS, por ejemplo) pero conllevan el riesgo de un trastorno devastador. Existe la necesidad de desarrollar una prueba diagnóstica complementaria, para excluir efectivamente a aquellos que estaban en riesgo de PML, en el proceso tranquilizando a aquellos con pruebas negativas acerca de su riesgo drásticamente reducido de desarrollar PML.

[0005] Breve descripción de los dibujos

[0006] Las características novedosas de la divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación con referencia a la siguiente descripción detallada que establece realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la divulgación, y los dibujos adjuntos.

[0007] La Figura 1 representa un ejemplo de un gen (PRKCB) afectado por la línea germinal y las CNV adquiridos. La Figura 2 representa un ejemplo de genes (TNFRSF13C y CENPM) afectados por las CNV adquiridos. La Figura 3 representa un ejemplo de un gen (PKHD1) afectado por la línea germinal y las CNV adquiridos. La Figura 4 representa un ejemplo de un gen (BMPR2) afectado por una CNV (pérdidas homocigotas y heterocigotas).

[0008] La Figura 5 representa un ejemplo de un gen (COMMD6) afectado por una CNV (p. ej., duplicación homocigótica).

[0009] La Figura 6 representa un ejemplo de genes (KCTD7, RABGEF1) directa y potencialmente afectados por una CNV (p. ej., duplicación homocigótica).

[0010] La Figura 7 representa un ejemplo de un gen (FPR2) afectado por una CNV (p. ej., duplicación homocigótica). La Figura 8 representa un ejemplo de un gen (PIK3CD) afectado por una CNV (p. ej., pérdida homocigótica). La Figura 9 representa un ejemplo de un gen (CD180) potencialmente afectado por una ganancia de CNV intergénica (p. ej., duplicación homocigótica).

[0011] La Figura 10 representa un ejemplo de un gen (VDAC1) potencialmente afectado por una CNV intergénica (pérdida homocigótica).

[0012] La Figura 11 representa un ejemplo de genes (EGR1 y ETF1) potencialmente afectados por una CNV intergénica (pérdida homocigótica).

[0013] La Figura 12 representa un ejemplo de un gen (ITSN2) potencialmente afectado por una CNV intergénica (pérdida homocigótica).

[0014] La Figura 13 representa un ejemplo de interacciones proteicas conocidas y/o predichas utilizando la base de datos String para 21 de 43 genes (listado no redundante) informados en la Tabla 7. El número de casos de PML que albergan variantes que afectan a un gen determinado se indica junto a cada gen.

[0015] La Figura 14 representa un ejemplo de análisis de conjunto de genes de interacciones proteína-proteína utilizando la base de datos de String descrita en este documento. La lista de genes de entrada fue de 74 genes (véase la Tabla 42) y se representa la red más grande de la salida del análisis de la base de datos de String, una red de 24 genes. Los genes están codificados por colores en función de la identificación de la vía GO con la mayor cantidad de genes (26) que se encontraba entre los 5 mejores resultados de GO: GO:0006955, genes de color gris oscuro.

[0017] Sumario de la invención

[0019] En un primer aspecto, la presente invención proporciona natalizumab para usar como se define en la reivindicación 1. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método como se define en la reivindicación 13. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método como se define en la reivindicación 14. Otras características se definen en las reivindicaciones dependientes.

[0021] La afección puede ser un cáncer, un trasplante de órgano o una enfermedad autoinmune.

[0023] La afección puede ser una enfermedad autoinmune.

[0025] La enfermedad autoinmune puede seleccionarse del grupo que consiste en enfermedad de Addison, encefalitis anti-receptor de NMDA, síndrome de antisintetasa, anemia aplásica, anemias autoinmunes, anemia hemolítica autoinmune, pancreatitis autoinmune, enfermedad de Behcet, trastornos de la piel ampollosa, enfermedad celíaca - esprúe ( enteropatía sensible al gluten), síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, leucemia linfocítica crónica, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, enfermedad de Devic, eritroblastopenia, síndrome de Evans, glomeruloesclerosis segmentaria focal, granulomatosis con poliangitis, enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, enfermedades autoinmunes mediadas por IgA, enfermedad relacionada con IgG4, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis idiopática juvenil, esclerosis múltiple, miastenia grave, mieloma, linfoma no Hodgkin, síndrome de Opsoclonus myoclonus (OMS), penfigoide, pénfigo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, polimiositis, psoriasis, aplasia pura de glóbulos rojos, artritis reactiva, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjögren, lupus eritematoso sistémico, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, diabetes tipo I, colitis ulcerosa, vasculitis, vitíligo y combinaciones de las mismas;

[0027] La enfermedad autoinmune puede ser esclerosis múltiple o enfermedad de Crohn. La enfermedad autoinmune puede ser esclerosis múltiple. La esclerosis múltiple puede ser una forma recurrente de esclerosis múltiple. La esclerosis múltiple puede ser esclerosis múltiple recurrente-remitente (RRMS). La esclerosis múltiple puede ser esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS). La esclerosis múltiple puede ser esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS).

[0029] El sujeto puede no haber tomado uno o más medicamentos inmunosupresores. El sujeto puede haber tomado uno o más medicamentos inmunosupresores. El sujeto puede estar tomando uno o más medicamentos inmunosupresores.

[0031] Se pueden administrar al menos aproximadamente 10 mg de natalizumab, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 mg, al menos aproximadamente 15 mg, al menos aproximadamente 20 mg, al menos aproximadamente 30 mg, al menos aproximadamente 40 mg, al menos aproximadamente 50 mg, al menos aproximadamente 60 mg, al menos aproximadamente 70 mg, al menos aproximadamente 80 mg, al menos aproximadamente 90 mg, al menos aproximadamente 100 mg, al menos aproximadamente 150 mg, al menos aproximadamente 200 mg, al menos aproximadamente 250 mg, o al menos aproximadamente 300 mg de natalizumab. Se pueden administrar al menos aproximadamente 10 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa. Se pueden administrar al menos aproximadamente 10 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en cuatro semanas. Se pueden administrar aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab, por ejemplo, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 200 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 300 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 400 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg. mg, de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 300 mg, de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 400 mg, de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 300 mg a aproximadamente 400 mg, de aproximadamente 300 mg a aproximadamente 500 mg, o de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab. Se pueden administrar aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa. Se pueden administrar aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en cuatro semanas. Se pueden administrar aproximadamente 300 mg de natalizumab. Se pueden administrar aproximadamente 300 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa. Se pueden administrar aproximadamente 300 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en cuatro semanas. Se pueden administrar al menos aproximadamente 10 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en seis semanas. Se pueden administrar al menos aproximadamente 10 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en ocho semanas. Se pueden administrar aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en seis semanas. Se pueden administrar aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en ocho semanas. Se pueden administrar aproximadamente 300 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en seis semanas. Se pueden administrar aproximadamente 300 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa en ocho semanas.

[0032] El sujeto puede no tener una o más variaciones genéticas asociadas con el riesgo de desarrollar PML. El sujeto puede no tener una o más variaciones genéticas asociadas con un alto riesgo de desarrollar PML.

[0033] La prueba genética puede comprender detectar las variaciones genómicas de las reivindicaciones en una muestra de ácido polinucleico del sujeto. La prueba genética puede comprender detectar una o más variaciones genómicas de las reivindicaciones en una muestra de ácido polinucleico del sujeto.

[0034] En un aspecto, la invención proporciona natalizumab para uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple, en el que se identifica que el sujeto no tiene variación genómica de las reivindicaciones.

[0035] En un aspecto, la invención proporciona natalizumab para uso en el tratamiento de la enfermedad de Crohn, en el que se identifica que el sujeto no tiene variaciones genómicas de las reivindicaciones.

[0036] En este documento se proporciona un método para reducir el riesgo de que un sujeto desarrolle leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) que comprende evaluar a un sujeto para detectar la presencia de una variación genómica de las reivindicaciones, determinar que el sujeto tiene la variación genómica y desaconsejar la administración de natalizumab al sujeto que se determinó que tenía al menos una de las variaciones genómicas.

[0037] Se puede identificar que el sujeto no tiene riesgo de desarrollar leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) mediante una prueba genética. Se puede identificar que el sujeto no tiene un alto riesgo de desarrollar leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) mediante una prueba genética.

[0038] El natalizumab para uso o los métodos de la invención puede comprender además el análisis de la presencia de JCV en una muestra biológica del sujeto. El análisis puede comprender una prueba de anticuerpos contra JCV. La prueba de anticuerpos contra JCV puede tener un resultado negativo. La prueba de anticuerpos contra JCV puede no detectar la presencia de JCV en la muestra biológica del sujeto. La prueba de anticuerpos contra JCV puede detectar la presencia de JCV en la muestra biológica del sujeto.

[0039] El sujeto puerde estar en una terapia inmunosupresora.

[0040] El análisis de la presencia de JCV puede comprender una prueba de anticuerpos contra JCV, una prueba de CD62L o una prueba de bandas oligoclonales de IgM de CSF. El análisis de la presencia de JCV se puede realizar antes de la prueba genética. El análisis de la presencia de JCV se puede realizar después de la prueba genética. El análisis de la presencia de JCV se puede realizar realiza simultáneamente con la prueba genética. El análisis de la presencia de JCV puede identificar que el sujeto tiene JCV. El análisis de la presencia de JCV puede identificar que el sujeto no tiene JCV. El resultado de la prueba genética puede identificar que el sujeto tiene un riesgo o un mayor riesgo de desarrollar PML. El resultado de la prueba genética puede identificar que el sujeto no tiene riesgo o no tiene un mayor riesgo de desarrollar PML.

[0041] El sujeto puede estar inmunodeprimido. El sujeto puede tener HIV. El sujeto puede tener infección por HIV. El sujeto puede tener riesgo de infección por HIV.

[0042] La afección puede ser un cáncer, una neoplasia maligna hematológica, un trasplante de órganos o una enfermedad autoinmune. La afección puede ser linfocitopenia CD4+ idiopática (ICL).

[0043] La afección puede ser una enfermedad autoinmune.

[0044] La enfermedad autoinmune se puede seleccionar del grupo que consiste en enfermedad de Addison, enfermedad de Behcet, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad celíaca - esprúe (enteropatía sensible al gluten), enfermedad de Crohn, dermatomiositis, glomeruloesclerosis segmentaria focal, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo, penfigoide, anemia aplásica, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoinmune, eritroblastopenia, púrpura trombocitopénica, síndrome de Evans, vasculitis, granulomatosis con poliangitis, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Guillain-Barré, encefalitis anti-receptor de NMDA, enfermedad de Devic, pancreatitis autoinmune, síndrome de Opsoclonus myoclonus, enfermedad relacionada con IgG4, psoriasis, artritis reactiva, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, sarcoidosis, síndrome de Sjögren, lupus eritematoso sistémico, diabetes tipo I, vitíligo o colitis ulcerosa.

[0045] En un aspecto, la invención proporciona natalizumab, para uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesita, en el que el sujeto tiene un riesgo reducido de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) debido a una infección del cerebro por el virus John Cunningham (JCV), en el que el riesgo reducido del sujeto se debe a la ausencia de una variación genómica de las reivindicaciones.

[0046] En un aspecto, la invención proporciona natalizumab para su uso en el tratamiento de una afección en un sujeto que necesita una terapia con medicamentos inmunosupresores, en el que el sujeto tiene un riesgo reducido de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) debido a una infección del cerebro por el virus de John Cunningham (JCV), en el que la disminución del riesgo del sujeto se debe a la ausencia de una variación genómica de las reivindicaciones.

[0047] La presente invención se refiere al natalizumab para su uso en el tratamiento de una afección en un sujeto que requiere terapia inmunosupresora. No obstante, las siguientes enseñanzas sobre medicamentos inmunosupresores, que no se incluyen en el texto de las reivindicaciones, son útiles para comprender la invención. Tales medicamentos inmunosupresores pueden comprender una molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma. La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede ser una molécula de anticuerpo recombinante humanizado o fragmento de la misma. La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede ser una molécula de anticuerpo monoclonal IgG4κ recombinante humanizado o fragmento de la misma. La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender una secuencia en CAS registro número: 189261-10-7. La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender al menos una cadena pesada de anticuerpo. La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender dos cadenas pesadas de anticuerpo. La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender al menos una cadena ligera de anticuerpo. La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender dos cadenas ligeras de anticuerpo. La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender al menos una cadena pesada de anticuerpo y al menos una cadena ligera de anticuerpo.

[0048] La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma se puede producir en células de mieloma. La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma se puede producir en células de hibridoma de conejo.

[0049] La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma se puede unir a un receptor. La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma se puede unir a una integrina. La integrina se puede expresar en la superficie de un leucocito. El leucocito puede ser un neutrófilo. El leucocito puede no ser un neutrófilo. La molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma se puede unir a la integrina α4β1, a la integrina α4β7 o a ambas. La molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma se puede unir a la subunidad α4 de la integrina α4β1, la integrina α4β7 o ambas. La molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma puede inhibir la adhesión mediada por α4 de un leucocito a su receptor.

[0050] El medicamento inmunosupresor puede comprender un anticuerpo o un fragmento del mismo, que comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 3275 (QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNIK DTYIHWVRQA PGQRLEWMGR IDPANGYTKY DPKFQGRVTI TADTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAREG YYGNYGVYAM DYWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP SCPAPEFLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK). El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender una secuencia que tiene aproximadamente un 50 % - 100 % de identidad, por ejemplo, aproximadamente un 50 % - 60 %, aproximadamente un 50 % - 70 %, aproximadamente un 60 % - 70 %, aproximadamente un 60 % - 80 %, aproximadamente 70 % - 80 %, aproximadamente 70 % - 90 %, aproximadamente 80 % - 90 %, aproximadamente 80 % - 95 %, aproximadamente 90 % - 95 %, aproximadamente 90 % - 99 %, aproximadamente 90 % - 100 %, aproximadamente 95 % - 99 %, o aproximadamente 99 % - 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.3275.

[0051] El medicamento inmunosupresor puede comprender un anticuerpo o un fragmento del mismo, que comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.3528 (DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN KYMAWYQQTP GKAPRLLIHY TSALQPGIPS RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ YDNLWTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS DYSLEHQSTLVTL SKAVLEHQSTLVD SSPVTKSFNRGEC). El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender una secuencia que tiene aproximadamente un 50 % - 100 % de identidad, por ejemplo, aproximadamente un 50 % - 60 %, aproximadamente un 50 % - 70 %, aproximadamente un 60 % - 70 %, aproximadamente un 60 % - 80 %, aproximadamente 70 % - 80 %, aproximadamente 70 % - 90 %, aproximadamente 80 % - 90 %, aproximadamente 80 % - 95 %, aproximadamente 90 % - 95 %, aproximadamente 90 % - 99 %, aproximadamente 90 % - 100 %, aproximadamente 95 % - 99 %, o aproximadamente 99 % - 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.3276.

[0052] La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender al menos una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a α4 de la misma, que comprende CDR no humanas en las posiciones 3135 (CDR1), 50-65 (CDR2) y 95-102 (CDR3) (numeración de Kabat) de un anticuerpo anti-α4 de ratón y que tiene residuos no humanos en las posiciones del marco 27-30 (numeración de Kabat), en la que las posiciones 27-30 tienen la secuencia de aminoácidos Phe 27, Asn 28, Ile 29 y Lys 30.

[0053] La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender al menos una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a α4 de la misma, que comprende: una CDR1 de cadena ligera (LC) con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3529 (KTSQDINKYMA), una CDR2 de LC con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3530 (YTSALQP) y una CDR3 de LC con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 3531 (LQYDNLWT).

[0054] La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender al menos una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a α4 del mismo, que comprende: una CDR1 de cadena ligera (LC) con una secuencia de aminoácidos de la 3532 (QASQDIIKYLN), una CDR2 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3533 (EASNLQA), y una CDR3 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3534 (QQYQSLPYT).

[0055] La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender al menos una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a α4 del mismo, que comprende: una CDR1 de cadena ligera (LC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3535 (KASQSVTNDVA), una CDR2 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3536 (YASNRYT), y una CDR3 de LC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3537 (QQDYSSPYT).

[0056] La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender al menos una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a α4 del mismo, que comprende: una CDR1 de cadena pesada (HC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3538 (DTYIH), una CDR2 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3539 (RIDPANGYTKYDPKFQG), y una CDR3 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3540 (EGYYGNYGVYAMDY).

[0057] La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender al menos una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a α4 del mismo, que comprende: una CDR1 de cadena pesada (HC) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3541 (DTYMH), una CDR2 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3542 (RIDPASGDTKYDPKFQV), y una CDR3 de HC con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 3543 (DGMWVSTGYALDF).

[0058] La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender una cadena pesada humanizada, o un fragmento de la misma que se une a α4, que comprende: una región de cadena pesada variable seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO.: 3544 (MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFNIKDTYMHWVRQPPGR GLEWIGRIDPASGDTKYDPKFQVKATITADTSSNQFSLRLSSVTAADTAVYYCADGMWVSTGY ALDFWGQGTTVTVSSGES), SEQ ID NO.: 3545 (QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFNIKDTYMHWVRQPPGRGLEWIGRIDPASGDTKYDPKF QVRVTMLVDTSSNQFSLRLSSVTSEDTAVYYCADGMWVSTGYALDFWGQGTTVTVSSGES), SEQ ID NO.: 3546

[0059] (MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFNIKDTYMHWVKQRPGR GLEWIGRIDPASGDTKYDPKFQVRVTMLVDTSSNQFSLRLSSVTAADTAVYYCADGMWVSTGY ALDFWGQGTTVTVSSGES), SEQ ID NO.: 3547 (MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTASGFNIKDTYMHWVRQPPGR GLEWIGRIDPASGDTKYDPKFQVRVTMLVDTSSNQFSLRLSSVTAADTAVYYCADGMWVSTGY ALDFWGQGTTVTVSSGES), and SEQ ID NO.: 3548 (QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQRLEWMGRIDPANGYTKYDP KFQGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYYGNYGVYAMDYWGQGTLVTVSS).

[0060] La molécula de anticuerpo o fragmento de la misma puede comprender una cadena ligera humanizada, o un fragmento de la misma que se une a α4, que comprende una región de cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO.: 3549 (MGWSCIILFLVATATGVHSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVTNDVAWYQQKPGKAPK LLIYYASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSPYTFGQGTKVEIKRK), SEQ ID NO.: 3550

[0061] (MGWSCIILFLVATATGVHSSIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVTNDVAWYQQKPGKAPK LLIYYASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSPYTFGQGTKVEIKRK), SEQ ID NO.: 3551

[0063] (MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVTNDVAWYQQKPGKAP KLLIYYASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSPYTFGQGTKVEIKRK), and SEQ ID NO.: 3552

[0064] (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQDINKYMAWYQQTPGKAPRLLIHYTSALQPGIPSRFSGS GSGRDYTFTISSLQPEDIATYYCLQYDNLWTFGQGTKVEIKRTV).

[0066] Un producto biológico puede ser un producto biológico aprobado por una agencia reguladora. Por ejemplo, el producto biológico puede ser aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) y/o la Agencia Europea de Medicamentos (EMA). El producto biológico puede ser un producto de referencia. El producto biológico puede ser un producto biosimilar. El producto biológico puede ser un producto intercambiable.

[0068] Un producto biosimilar puede ser similar a un producto de referencia (véase, p. ej., la Tabla 67). Un producto biosimilar puede no tener diferencias clínicamente significativas en términos de seguridad y eficacia con respecto al producto de referencia. Un producto biosimilar puede tener los mismos componentes clínicamente inactivos. Un producto biosimilar puede tener diferentes componentes clínicamente inactivos. Un producto biosimilar puede interactuar específicamente con un sustrato y el producto de referencia puede interactuar específicamente con el mismo sustrato. Una tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se les administró el producto biosimilar puede ser del 50 % al 150 % de la tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se les administró el producto de referencia. Por ejemplo, la tasa de respuesta de sujetos humanos a los que se administró el producto biosimilar puede ser del 50 % - 100 %, del 50 % - 110 %, del 50 % - 120 %, del 50 % - 130 %, del 50 % - 140 %, del 50 % - 150 %, 60 % - 100 %, 60 % - 110 %, 60 % - 120 %, 60 % - 130 %, 60 % - 140 %, 60 % - 150 %, 70 % - 100 %, 70 % - 110 %, 70 % - 120 %, 70 % - 130 %, 70 % - 140 %, 70 % - 150 %, 80 % - 100 %, 80 % - 110 %, 80 % - 120 %, 80 % - 130 %, 80 % - 140 %, 80 % - 150 %, 90 % - 100 %, 90 % - 110 %, 90 % - 120 %, 90 % - 130 %, 90 % - 140 %, 90 % - 150 %, 100 % - 110 %, 100 % - 120 %, 100 % - 130 %, 100 % - 140 %, 100 % - 150 %, 110 % - 120 %, 110 % - 130 %, 110 % - 140 %, 110 % - 150 %, 120 % - 130 %, 120 % - 140 %, 120 % - 150 %, 130 % - 140 %, 130 % - 150 % o 140 % - 150 % de la tasa de respuesta de sujetos humanos a los que se administró el producto de referencia. Un producto biosimilar y un producto de referencia pueden utilizar el mismo mecanismo o mecanismos de acción para la afección o condiciones de uso prescritas, recomendadas o sugeridas en el etiquetado propuesto, pero solo en la medida en que el mecanismo o mecanismos sean conocidos para el producto de referencia.

[0070] Un producto intercambiable puede ser un producto biosimilar que cumple estándares adicionales de intercambiabilidad. Un producto intercambiable puede producir el mismo resultado clínico que un producto de referencia en todas las condiciones de uso licenciadas del producto de referencia. Un producto intercambiable puede ser sustituido por el producto de referencia por un farmacéutico sin la intervención del proveedor de atención médica que recetó el producto de referencia. Cuando se administra más de una vez a un individuo, el riesgo en términos de seguridad o disminución de la eficacia de alternar o cambiar entre el uso del producto biológico y el producto de referencia puede no ser mayor que el riesgo de usar el producto de referencia sin dicha alternancia o cambio. Un producto intercambiable puede ser un producto aprobado por una agencia reguladora. La tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se les administró el producto intercambiable puede ser del 80 % - 120 % de la tasa de respuesta de los sujetos humanos a los que se les administró el producto de referencia. Por ejemplo, la tasa de respuesta de sujetos humanos a los que se administró el producto intercambiable puede ser del 80 % - 100 %, del 80 % - 110 %, del 80 % - 120 %, del 90 % - 100 %, del 90 % - 110 %, del 90 % - 120 %, 100 % - 110 %, 100 % - 120 % o 110 % - 120 % de la tasa de respuesta de sujetos humanos a los que se administró el producto de referencia.

[0072] El natalizumab puede administrarse mediante infusión intravenosa. Aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg del natalizumab puede ser administrado. Aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg del natalizumab puede ser administrado, por ejemplo, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 200 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 400 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 200 mg a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 200 mg a aproximadamente 400 mg, aproximadamente 200 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 300 mg a aproximadamente 400 mg, aproximadamente 300 mg a aproximadamente 500 mg, o aproximadamente 400 mg a aproximadamente 500 mg del natalizumab puede ser administrado. Aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg del natalizumab puede ser administrado vía infusión intravenosa. Aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg del natalizumab puede ser administrado vía infusión intravenosa en cuatro semanas. Aproximadamente 300 mg del natalizumab puede ser administrado. Aproximadamente 300 mg del natalizumab puede ser administrado vía infusión intravenosa. Aproximadamente 300 mg del natalizumab puede ser administrado vía infusión intravenosa en cuatro semanas. Al menos aproximadamente 10 mg del natalizumab puede ser administrado vía infusión intravenosa en seis semanas. Al menos aproximadamente 10 mg del natalizumab puede ser administrado vía infusión intravenosa en ocho semanas. Aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg del natalizumab puede ser administrado vía infusión intravenosa en seis semanas. Aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg del natalizumab puede ser administrado vía infusión intravenosa en ocho semanas. Aproximadamente 300 mg del natalizumab puede ser administrado vía infusión intravenosa en seis semanas. Aproximadamente 300 mg del natalizumab puede ser administrado vía infusión intravenosa en ocho semanas. El método puede comprender la evaluación de la predisposición genética del sujeto a la LMP mediante un ensayo genético. El ensayo genético puede tener un rendimiento diagnóstico de al menos el 5 %. En algunos casos, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de al menos aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%. En algunos casos, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de aproximadamente 1%-5%, 1%-10%, 1%-20%, 5%-10%, 5%-20%, 10%-20%, 10%-30%, 20%-30%, 20%-40%, 30%-40%, 30%-50%, 40%-50%, 40%-60%, 50%-60%, 50%-70%, 60%-70%, 60%-80%, 70%-80%, 70%-90%, 80%-90%, 80%-95%, 90%-95%, 90%-99%, 90%-100%, 95%-99%, o 99%-100%. El ensayo genético puede tener un rendimiento diagnóstico de al menos 20%.

[0073] El método puede comprender probar la predisposición genética del sujeto a la PML con un ensayo genético. El ensayo genético puede tener un rendimiento diagnóstico de al menos el 5 %. En algunos casos, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de al menos un 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 %. En algunos casos, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de aproximadamente 1 % - 5 %, 1 % - 10 %, 1 % -20 %, 5 % - 10 %, 5 % - 20 %, 10 % - 20 %, 10 % - 30 %, 20 % - 30 %, 20 % - 40 %, 30 % - 40 %, 30 % - 50 %, 40 % - 50 %, 40 % - 60 %, 50 % - 60 %, 50 % - 70 %, 60 % - 70 %, 60 % - 80 %, 70 % - 80 %, 70 % - 90 %, 80 % - 90 %, 80 % - 95 %, 90 % - 95 %, 90 % - 99 %, 90 % - 100 %, 95 % - 99 % o 99 % - 100 %. El ensayo genético puede tener un rendimiento diagnóstico de al menos el 20 %.

[0074] En un aspecto, la invención proporciona un método para identificar a un sujeto que no tiene riesgo de desarrollar PML, que comprende: (a) analizar una muestra de ácido polinucleico del sujeto para una variación genómica de las reivindicaciones, en el que la variación genómica no está presente en la muestra de ácido polinucleico; y (b) identificar que el sujeto no tiene riesgo de desarrollar PML.

[0075] Descripción detallada de la divulgación

[0076] Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos, las reivindicaciones y en la presente descripción. Otras características, objetivos y ventajas de las realizaciones de la invención divulgadas y contempladas en este documento serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

[0077] Como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, el artículo "un, uno, una" significa uno o más, a menos que se disponga explícitamente lo contrario.

[0078] Como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, términos tales como "contiene", "que contiene", "incluye", "que incluye" y similares significan "que comprende".

[0079] Como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, el término "o" puede ser conjuntivo o disyuntivo. Como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, cualquier realización se puede combinar con cualquier otra realización.

[0080] Como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, algunas realizaciones de la invención en este documento contemplan intervalos numéricos. Cuando hay intervalos presentes, los intervalos incluyen los extremos del intervalo. Además, cada subintervalo y valor dentro del intervalo está presente como si estuviera escrito explícitamente.

[0081] Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "aproximadamente" en relación con un valor numérico de referencia y sus equivalentes gramaticales incluyen un intervalo de valores de más o menos el 10 % de ese valor, tal como un intervalo de valores de más o menos el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de ese valor. Por ejemplo, la cantidad "aproximadamente 10" incluye cantidades de 9 a 11.

[0082] Como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, el término "producto biológico" se refiere a un virus, suero terapéutico, toxina, antitoxina, vacuna, sangre, componente o derivado sanguíneo, producto alergénico, proteína (cualquier polímero de alfa aminoácido con una secuencia específica definida que tiene un tamaño mayor a 40 aminoácidos), o producto análogo, o arsfenamina o derivado de arsfenamina (o cualquier compuesto orgánico trivalente de arsénico), aplicable a la prevención, tratamiento o cura de una enfermedad o afección de los seres humanos.

[0083] Como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, el término "producto biosimilar" se refiere a 1) un producto biológico que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a un producto de referencia; 2) un producto biológico que tiene una secuencia de aminoácidos diferente (p. ej., truncamientos del extremo terminal N o C) de un producto de referencia; o 3) un producto biológico que tiene una modificación postraduccional diferente (p. ej., glicosilación o fosforilación) de un producto de referencia, en el que el producto biosimilar y el producto de referencia utilizan el mismo mecanismo o mecanismos de acción para la prevención, el tratamiento o la cura de una enfermedad o afección.

[0084] Como se usa en el presente documento, "mecanismo de acción" se refiere a una interacción o actividad a través de la cual un producto farmacéutico (p. ej., un producto biológico) produce un efecto farmacológico. Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "producto intercambiable" se refiere a un producto biosimilar, en el que la tasa de respuesta de un sujeto humano al que se le administró el producto intercambiable es del 80 % al 120 % de la tasa de respuesta del sujeto humano al que se le administró el producto de referencia.

[0085] Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, el término "producto de referencia" se refiere a 1) un producto biológico que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a un producto biosimilar; 2) un producto biológico que tiene una secuencia de aminoácidos diferente (p. ej., truncamientos del extremo terminal N o C) de un producto biosimilar; o 3) un producto biológico que tiene una modificación postraduccional diferente (p. ej., glicosilación o fosforilación) de un producto biosimilar, en el que el producto de referencia y el producto biosimilar utilizan el mismo mecanismo o mecanismos de acción para la prevención, el tratamiento o la cura de una enfermedad o afección.

[0086] Como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, cualquier nombre común o genérico de un producto biológico incluye el producto biológico y cualquier producto biosimilar del mismo. Por ejemplo, el nombre común, filgrastim, se refiere al producto biológico vendido bajo el nombre comercial NEUPOGEN; también incluye el producto biosimilar, filgrastim-sndz, vendido bajo el nombre comercial ZARXIO. En otro ejemplo, el nombre común, natalizumab, se refiere al producto biológico vendido bajo el nombre comercial TYSABRI; también incluye cualquier producto biosimilar del producto biológico.

[0087] Todas las moléculas y compuestos de fármacos proporcionados en el presente documento incluyen todas sus sales, polimorfos, profármacos, tautómeros, formas zwitteriónicas, etc., de los mismos.

[0088] Leucoencefalopatía Multifocal Progresiva (PML)

[0089] La leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) es una enfermedad viral rara y generalmente mortal que se caracteriza por daño progresivo o inflamación de la sustancia blanca del cerebro en múltiples ubicaciones. La causa de la PML puede ser un tipo de poliomavirus llamado virus de John Cunningham (JC) (o JCV), que puede ser inofensivo excepto en casos de sistemas inmunitarios debilitados. Si bien el JCV está presente en tasas muy altas en la población general, la PML sigue siendo un trastorno raro, aunque importante debido a las secuelas clínicas.

[0090] La PML puede ocurrir en pacientes con inmunodeficiencia severa, lo que permite la reactivación del virus de JC, tales como: 1) más comúnmente entre pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (AIDS) que resulta de la infección con el virus de inmunodeficiencia humana (HIV), 2) pacientes con medicamentos inmunosupresores tales como corticosteroides para trasplante de órganos (p. ej., riñón, hígado, pulmón y corazón) y en personas con cáncer (p. ej., enfermedad de Hodgkin, leucemia o linfoma y neoplasias mieloproliferativas tales como mielofibrosis), y 3) personas con enfermedades autoinmunes (p. ej., esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis y lupus eritematoso sistémico) con terapias que deprimen la respuesta inmunitaria. Se han informado varios fármacos inmunosupresores en el contexto de la PML inducida por fármacos o la PML asociada a fármacos. Por ejemplo, véase: Melis et al., CNS. Drugs 2015;29(10):879-91); Maas et al. J Neurol. 2016 octubre; 263 (10): 2004-21; Colin et al., Fundam Clin Pharmacol. octubre 13 de 2016. Los medicamentos inmunosupresores pueden incluir, pero no se limitan a, un glucocorticoide, citostático, anticuerpo, fármaco que actúa en la inmunofilinas, interferón, opioide, proteína de unión a TNF, micofenolato, agente biológico pequeño, molécula pequeña, compuesto orgánico, antagonista A2aR, inhibidor de Akt, anti CD20, agente anti-amiloidótico (AA), proteína terapéutica anti-CD37, mAb anti-CTLA4, Anti-CXCR4, mAb antihuCD40, mAb anti-LAG3, mAb anti-PD-1, agente anti-PD-L1, agente anti-PD-L1, mAb anti-PD-L1, mAb anti-TGFb, mAb anti-TIGIT, mAb anti-TIM-3, inhibidor de aurora quinasa, inhibidor de Bcl-2, proteína de fusión bifuncional dirigida a TGFb y PD-L1, mAb anti-PD-1 y anti-LAG3 biespecífico, ligando de CD1d, agonista de CD40, inhibidor C5a del complemento, inhibidor de CSF1R, inhibidor de EZH2, inhibidor de FGFR3, inhibidor de FGFR4, inhibidor de FGFrR3, agonista del gen relacionado con el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoide [GITR], inhibidor de glutaminasa, anticuerpo monoclonal humano contra IL-12, agonista de ICOS, inhibidor de IDO1,muteína de IL2, agonista del receptor de IL2, inhibidor MEK, inhibidor del receptor tirosina quinasa multidireccionado, inhibidor de la neutrófilo elastasa, inhibidor de Notch, inhibidor de MAPK p38, inhibidor de PD-1, Flt3L humano recombinante, inhibidor de ROCK, modulador selectivo del receptor de esfingosina-1-fosfato, inhibidor de Src, agonista de TLR4, agonista deTLR9, abatacept (p. ej., ORENCIA), abrilumab, acalabrutinib, adalimumab, hormona adrenocorticotrópica, agatolimod sódico, AJM300, aldesleucina, alefacept, alemtuzumab, alisertib, clorhidrato de alvespimicina, alvocidib, ambrisentán (p. ej., LETAIRIS), aminocamptotecina, amiselimod, anakinra, andecaliximab, andrografólidos (una hierba medicinal botánica también conocida como IB-MS), anifrolumab, Ig antitimocito, apatinib, apelisib, asparaginasa, atacicept, atezolizumab, avelumab, azacitidina, azatioprina, bafetinib, baminercept, baricitinib, basiliximab, becatecarina, begelomab, belatacept, belimumab, bemcentinib, bendamustina, bendamustina (p. ej., clorhidrato de bendamustina), betalutina con lilotomab, bevacizumab, BIIB033, BIIB059, BIIB061, bimekizumab, binimetinib, bleomicina, blinatumomab, BNZ-1, bortezomib (p. ej., VELCADE), brentuximab vedotina, briostatina 1, bucilamina, buparlisib, busulfano, canakinumab, capecitabina, carboplatino, carfilzomib, carmustina, maleato de cediranib, cemiplimab, ceralifimod, cerdulatinib, certolizumab (p. ej., certolizumab pegol), cetuximab, chidamida, clorambucilo, CHS-131, cilengitida, cirmtuzumab, cisplatino, cladribina, clazakizumab, clemastina, clioquinol, corticosteroides, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabina, quimioterapia citotóxica, daclizumab, dalfampridina (p. ej., AMPYRA), daprolizumab pegol, daratumumab, dasatinib, defactinib, defibrotida, denosumab, dexametasona, diacereina, fumarato de dimetilo, dinaciclib, fumarato de diroximel (p. ej., VUMERITY), doxorrubicina, doxorrubicina (p. ej., clorhidrato de doxorrubicina), durvalumab, duvelisib, duvortuxizumab, eculizumab (p. ej., SOLIRIS), efalizumab, eftilagimod alfa, EK-12 (una combinación de neuropéptidos de metencefalina y tridecactida), elezanumab, elotuzumab (p. ej., EMPLICITI), encorafenib, enfuvirtida (p. ej., FUZEON), entinostat, entospletinib, enzastaurina, epacadostat, epirrubicina, epratuzumab, eritoran tetrasódico, etanercept, etopósido, etrolizumab, everolimus, evobrutinib, filgotinib, fingolimod (p. ej., clorhidrato de fingolimod), firategrast, fludarabina, fluorouracilo, fontolizumab, clorhidrato de forodesina, fostamatinib, galunisertib, ganetespib, ganitumab, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina, gerilimzumab, glasdegib, glassia, acetato de glatirámero, glembatumumab vedotina, glesatinib, golimumab (p. ej., SIMPONI), guadecitabina, hidrocortisona, sulfato de hidroxiclorotina, hidroxiurea, ibritumomab tiuxetano, ibrutinib, ibudilast, idarrubicina, idebenona, idelalisib, ifosfamida, iguratimod, imatinib, imexona, IMU-838, infliximab, inotuzumab ozogamicina, interferón alfa-2, interferón beta-1a, interferón beta-1b, interferón gamma-1, ipilimumab, irofulveno, isatuximab, ispinesib, itacitinib, ixazomib, lapatinib, laquinimod, laromustina, 1d-aminopterina, leflunomida, lenalidomida, lenvatinib, letrozol (p. ej., FEMARA), levamisol, levocabastina, ácido lipoico, lirilumab, lonafarnib, lumiliximab, maraviroc (p. ej., SELZENTRY), masitinib, mavrilimumab, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, metoxsalen, metilprednisona, milatuzumab, mitoxantrona, mizoribina, mocetinostat, monalizumab, mosunetuzumab, difosfato de motesanib, moxetumomab pasudotox, muromonab-CD3, mofetil micofenolato (p. ej., clorhidrato de mofetil micofenolato), ácido micofenólico, namilumab, natalizumab, navitoclax, neihulizumab, nerispirdina, neurovax, niraparib, nivolumab, mesilato de obatoclax, obinutuzumab, oblimersen sódico, ocrelizumab, ofatumumab, olokizumab, opicinumab, oprelvekina, osimertinib, otelixizumab, oxaliplatino, oxcarbazepina, ozanimod, paclitaxel, pacritinib, palifermina, panobinostat, pazopanib, peficitinib, pegfilgrastim (p. ej., NEULASTA), peginterferón beta-1a, pegsunercept (peg stnf-ri), pembrolizumab, pemetrexed, penclomedina, pentostatina, perifosina, pevonedistat, pexidartinib, picoplatino, pidilizumab, pivanex, pixantrona, pleneva, acetato de plovamero, polatuzumab vedotina, pomalidomida, ponatinib, ponesimod, prednisona/prednisolona, piroxamida, R-411, ravulizimab-cwvz (p. ej., ULTOMIRIS), IL-12 recombinante, relatlimab, rhigf-1, rhigm22, rigosertib, rilonacept, ritonavir (p. ej., NORVIR), rituximab, ruxolitinib, SAR442168/PRN2246, sarilumab, secukinumab, selumetinib, simvastatina, sintilimab, siplizumab, siponimod (p. ej., MAYZENT), sirolimus (rapamicina), sirukumab, sitravatinib, sonidegib, sorafenib, acetato de sotrastaurina, sunitinib, galato de sunfenona epigalocatequina, tabalumab, tacrolimus (p. ej., tacrolimus anhidro), mesilato de talabostat, talacotuzumab, tanespimicina, tegafur/gimeracilo/oteracilo, temozolomida, temsirolimus, tenalisib, terameprocol, teriflunomida, talidomida, tiarabina, tiotepa, tipifarnib, tirabrutinib, tislelizumab, tivozanib, tocilizumab, tofacitinib, TR-14035, tregalizumab, tremelimumab, treosulfano, ublituximab, umbralisib, upadacitinib, urelumab, ustekinumab, varlilumab, vatelizumab, vedolizumab, veliparib, veltuzumab, venetoclax, vinblastina, vincristina, ditartrato de vinorelbina, visilizumab, vismodegib, vistusertib, voriconazol (p. ej., VFEND), vorinostat, vosaroxina, ziv-aflibercept, 2B3-201, 3PRGD2, 4SC-202, 506U78, ácido 6,8-bis(benciltio)octanoico, 68Ga-BNOTA-PRGD2, 852A, 89Zr-DFO-CZP, ABBV-257, ABL001, ABP 501, ABP 710, ABP 798, ABT-122, ABT-199, ABT-263, ABT-348, ABT-494, ABT-555, ABT-874, ABX-1431 HCl, ACP-196, ACP-319, ACT-128800, ACY-1215, AD 452, Ad-P53, ADCT-301, ADCT-402, ADL5859, ADS-5102, AFX-2, AGEN1884, AGEN2034, AGS67E, AIN457, AK106-001616, ALD518, ALKS 8700, ALT-803, ALT-803, ALX-0061, ALXN1007, ALXN6000, AMD3100, AMG 108, AMG 319, AMG 357, AMG 570, AMG 592, AMG 714, AMG 719, AMG 827, AMP-110, AP1903, APL A12, APO866, APX005M, AQ4N, AR-42, ARN-6039, ARQ 531, ARRY-371797, ARRY-382, ARRY-438162, ART-I02, ART621, ASK8007, ASN002, ASP015K, ASP1707, ASP2408, ASP2409, ASP5094, AT-101, AT7519M, AT9283, ATA188, ATN-103, ATX-MS-1467, AVL-292, AVP-923, AZD4573, AZD5672, AZD5991, AZD6244, AZD6738, AZD9056, AZD9150, AZD9567, AZD9668, B-701, BAF312, BAY1830839, BBI608, BCD-054, BCD-055, BCD-063, BCD-089, BCD-100, BCD-132, BCD-145, BEZ235, BG00012, BG9924, BGB-3111, BGB-A333, BGG492, BHT-3009, BI 655064, BI 695500, BI 695501, BI 836826, BI-1206, BIBR 796 BS, BIIB017, BIIB023, BIIB057, BIIB061, BIIL 284 BS, BLZ945, BMMNC, BMN 673, BMS-247550, BMS-582949, BMS-817399, BMS-936558, BMS-936564, BMS-945429, BMS-986104, BMS-986142, BMS-986156, BMS-986195, BMS-986205, BMS-986213, BMS-986226, BMS-986251, BNC105P, BOW015, BP1001, BT061, BTT-1023, C105, CAL-101, CAM-3001, CAT-8015, CB-839, CBL0137, CC-1088, CC-115, CC-122, CC-292, CC100, CCI-779, CCX 354-C, CDKI AT7519, CDP323, CDP6038, CDP870, CDX-1127, CDX-301, CE-224535, CF101, CFZ533, CGP 77116, CH-1504, CH-4051, CHR-5154, CHS-0214, CK-2017357, CLAG-M, CLR 131, CMAB008, CMP-001, CNF2024 (BIIB021), CNM-Au8, CNTO 1275, CNTO 136, CNTO 148, CNTO 6785, CP-195543, CP-461, CpG 7909, CPI-1205, CR6086, CRx-102, CS-0777, CS1002, CT-011, CT-1530, CT-P10, CV301, CX-3543, DAC-HYP, DCDT2980S, DI-B4, DPA-714 FDG, DS-3032b, DT2219ARL, DTRM-505, DTRM-555, DTRMWXHS-12, DWP422, E6011, E7449, EK-12, ELND002, ENIA11, EOC202, ETBX-011, F8IL10, FBTA05, FEDAA1106 (BAY85-8101), FGF401, FKB327, FPA008, FR104, FS118, FTY720, G100, GCS-100, GDC-0199, GDC-0853, GEH120714, GLPG0259, GLPG0634, GNbAC1, GNKG168, GP2013, GP2015, GRN163L, GS-1101, GS-5745, GS-9219, GS-9820, GS-9876, GS-9901, GSK1223249, GSK1827771, GSK2018682, GSK21110183, GSK239512, GSK2618960, GSK2831781, GSK2982772, GSK3117391, GSK3152314A, GSK3196165, GSK3358699, GSK706769, GW-1000-02, GW274150, GW406381, GW856553, GZ402668, HCD122, HE3286, HL2351, HL237, hLL1-DOX (IMMU-115), HLX01, HM71224, HMPL-523, HSC835, HZT-501, ICP-022, IDEC-C2B8, ILV-094, IMGN529, IMMU-114, IMO-2125, INCAGN02385, INCB018424, INCB028050, INCB039110, INCB047986, INCMGA00012, INNO-406, INT131, INT230-6, INVAC-1, IPI-145, IPX056, ISF35, ISIS 104838, ITF2357, JCARH125, JHL1101, JNJ 38518168, JNJ-39758979, JNJ-40346527, JNJ-63723283, JS001, JTE-051, JTX-2011, KB003, KD025, KPT-330, KW-2449, KW-2478, KX2-391, L-778123, LAG525, LAM-002A, LBEC0101, LBH589, LFB-R603, LMB-2, LX3305, LY2127399, LY2189102, LY2439821, LY3009104, LY3090106, LY3300054, LY3321367, LY3337641, M2951, M7824, M923, MBG453, MBP8298, MBS2320, MD1003, MDG013, MDV9300, MDX-1100, MDX-1342, MDX-1411, ME-401, MEDI-522, MEDI-538, MEDI-551, MEDI4920, MGA012, MGCD0103, MGD007, MIS416, MK-0873, MK-4280, MK-4827, MK-8457, MK-8808, MK0359, MK0457, MK0752, MK0782, MK0812, MK2206, MLN1202, MLTA3698A, MM-093, MN-122, MN-166, anticuerpo monoclonal M-T412, anticuerpo monoclonal mono-dgA-RFB4, MOR00208, MOR103, MORAb-022, MP-435, MP470, MRC375, MRG-106, MS-533, MSB11022, MSC2490484A, MT-1303, MT-3724, MTIG7192A, MTRX1011A, NBI-5788, NC-503, NI-0101, NI-071, NIS793, NKTR-214, NNC 0141-0000-0100, NNC 0151-0000-0000, NNC0109-0012, NNC0114-0000-0005, NNC0114-0006, NNC0142-0002, NNC0215-0384, NNC109-0012, NOX-A12, NT-KO-003, NU100, OMB157, OMP-313M32, ON01910 Na, ONO-2506PO, ONO-4641, ONTAK, OPB 31121, OSI-461, OTS167IV, P1446A-05, PBF-509, PBR06, PCI 32765, PCI-24781, PD 0360324, PDA001, PDR001, PF-04171327, PF-04236921, PF-04308515, PF-04629991, PF-05280586, PF-06342674, PF-06410293, PF-06438179, PF-06650833, PF-06651600, PF-06835375, PG-760564, PH-797804, PLA-695, PLX3397, PLX5622, POL6326, PROB 1921, PRO283698, PRTX-100, PS-341, PTL201, R(+)XK469, R788, RAD001, RC18, REGN1979, REGN3767, REGN2810, REGN4659, RFT5-SMPT-dgA, RG2077, RGB-03, RGI-2001, RHB-104, RNS60, RO5045337, RO7123520, Rob 803, RPC1063, RWJ-445380, S 55746, SAIT101, SAN-300, SAR245409, SB-681323, SB683699, SBI-087, SC12267 (4SC-101), SCH 727965, SCIO-469, SD-101, SG2000, SGN-40, SHC014748M, SHR-1210, SHR0302, SHR1020, SJG-136, SKI-O-703, SMP-114, SNS-032, SNS-062, SNX-5422, SPARC1103 I, SPC2996, SSR150106, mesilato de STA 5326, Sunpharma1505, SyB L-0501, Sym022, Sym023, SYN060, T-614, T0001, TA-650, TAB08, TAK-715, TAK-783, TAK-901, TGR-1202, TH-302, TL011, TMI-005, TMP001, TNFa Kinoid, TP-0903, TRU-015, TRU-016, TSR-022, TSR-033, TSR-042, TXA127, VAY736, VP-16, VSN16R, VX-509, VX-702, VX-745, VX15/2503, XCEL-MC-ALPHA, XL228, XL844, XmAb13676, XmAb5574, XOMA 052, YRA-1909, Z102, ZEN003365 o cualquier combinación de los mismos.

[0091] Los ejemplos de medicamentos inmunosupresores de molécula pequeña incluyen fumarato de dimetilo, fingolimod, fumarato de diroximel y ruxolitinib. Una terapia inmunosupresora se puede clasificar como un agente terapéutico de Clase 1 (alto riesgo), tal como efalizumab y natalizumab como se informa en Calabrese L.H. et al., Nat Rev Rheumatol. (2015).

[0093] En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser agentes de entrecruzamiento de ADN y/o ARN, incluidos agentes alquilantes, agentes alquilantes de mostaza nitrogenada, inhibidores de topoisomerasa, antraciclinas y fármacos anticancerosos basados en platino. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de quinasa, incluyendo fosfoinositido-3-quinasa, quinasa dependiente de ciclina (por ejemplo, CDK9), Aurora quinasa, ROCK, Akt o PKC. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de tirosina quinasa, incluidos los inhibidores del homólogo 1 del oncogén viral de la leucemia murina de Abelson de la región del grupo del punto de ruptura de la proteína de fusión (BCR-ABL), la tirosina quinasa de Bruton (BTK), el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), Janus quinasa (JAK), Syk, Lyn, MEK, FAK, BRAF, AXL o el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser anticuerpos monoclonales y/o conjugados de anticuerpo - fármaco dirigidos a proteínas, incluidas las proteínas del grupo de diferenciación (CD), tales como CD2, CD3, CD11a, CD20, CD30, CD52, CD-19, CD-38, CD-26, CD-37, CD-22, CD-33, CD-23, CD-74, CD-162, CD-79, CD-123, CD-4, CD-137, CD-27, CD-36, CD-39, CD-73, CD-226, CD-155, CD-40; interleuquinas (IL), tales como IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-23; proteínas de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), tales como TNFα; e integrinas, tales como la integrina α4, α<v>β<3>, a<v>β<5>, a<v>β<3>, o α<2>. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser anticuerpos monoclonales y/o conjugados de anticuerpo - fármaco dirigidos al receptor 1 de muerte celular programada (PD-1), ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), inmunoglobulina de células T y dominio de mucina que contiene 3 (TIM-3), inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT), también conocido como WUCAM o Vstm3, atenuador de linfocitos B y T (BTLA), gen relacionado con la familia TNFR inducido por glucocorticoides (GITR), OX40, HSP90, receptor tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR), receptor 9 tipo Toll (TLR9), receptor 4 tipo Toll (TLR4), metalopeptidasa 9 de matriz (MMP), receptor de interferón, interferón gamma, factor 1b de crecimiento transformante (TGF1β), receptor del factor 1 de crecimiento de insulina (IGF1 R), receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFrR3, FGFR4), neuromedina B, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF R), receptor de células asesinas naturales (NKG-2a), proteína 1 que contiene un dominio similar a la inmunoglobina y repeticiones ricas en leucina (LINGO 1), factor de activación de células B (BAFF), coestimulador de células T inducibles (ICOS). En algunos casos, el conjugado anticuerpo monoclonal/anticuerpo-fármaco puede activar el objetivo.

[0095] En algunos casos, el conjugado de anticuerpo monoclonal/anticuerpo-fármaco puede inhibir el objetivo. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de RANKL (activador del receptor del ligando del factor nuclear kappa-B). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la proteína 90 de choque térmico (HSP90). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la citidina desaminasa (CDA). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la vía de señalización Hedgehog (incluidos Sonic Hedgehog y Smoothened). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la alfa-1-proteinasa. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la ciclooxigenasa 2 (COX2). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores del complemento (C5a). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores del receptor del factor 1 estimulante de colonias (CSF1R). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de Notch. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de quinesina. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la farnesiltransferasa. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de células precursoras neurales expresadas, subreguladas desde el punto de vista del desarrollo (NEDD8). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la quinasa 2 de repeticiones ricas en leucina (LRRK2). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de las proteínas del punto de control inmunitario. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la indolamina 2,3-dioxigenasa-1 (IDO1). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de los receptores de quimiocinas (CCR4, CCR5, CCR7). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser terapias que inducen inmunosupresión tales como células T o células T reguladoras modificadas con un receptor de antígeno quimérico (CAR-T, CAR-Treg). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser lípidos estructurados. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser miméticos de Ras. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de la proteína 3 que contiene el dominio de purina del receptor de tipo NOD (NLRP3). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de mTOR y/o de calcineurina. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores del complemento. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser antimetabolitos inmunosupresores, inhibidores metabólicos de nucleósidos, nucleósidos de imidazol, análogos de nucleótidos, inhibidores de la síntesis de nucleósidos, inhibidores de la síntesis de purina, inhibidores de la síntesis de pirimidina o inhibidores de la pirimidina sintasa. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser proteínas recombinantes, tales como interferón beta recombinante, IL-2, IL-11, proteína de fusión de linfotoxina B, vacuna peptídica terapéutica receptora de células T, factor de crecimiento de queratinocitos o receptor del factor de necrosis tumoral (TNF).

[0097] En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser moduladores del receptor de esfingosina-1-fosfato y/o del receptor de acetilcolina nicotínico. Por ejemplo, se puede usar siponimod (BAF312) para el tratamiento de la MS progresiva secundaria (Kappos L et al., 2018, PMID 29576505). Otro medicamento, ibudilast (MN-122), se puede utilizar para el tratamiento de la MS progresiva (Fox R et al., 2016, PMID 27521810). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser anticuerpos terapéuticos, incluida la inmunoglobulina G. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de asparaginasa. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores específicos del estimulador de linfocitos B (BLyS). En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser moduladores de la coestimulación de células T. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inmunosupresores de polipéptidos cíclicos y/o polipéptidos sintéticos que modifican los procesos inmunitarios. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser corticosteroides. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser fármacos quimioterapéuticos citotóxicos. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser antibióticos glicopeptídicos citotóxicos y/o mezclas de los mismos. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser moléculas que inhiben la producción de citoquinas proinflamatorias. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser análogos de talidomida.

[0099] En algunos casos, el medicamento inmunosupresor puede ser un inhibidor del Complemento C5a. En algunos casos, el medicamento inmunosupresor puede ser un agonista de CD40. En algunos casos, el medicamento inmunosupresor puede ser un inhibidor de p38. En algunos casos, el medicamento inmunosupresor puede ser un inhibidor de CSF1R. En algunos casos, el medicamento inmunosupresor puede ser un inhibidor de MEK.

[0100] En algunos casos, el medicamento inmunosupresor puede ser un inhibidor de neutrófilo elastasa. En algunos casos, el medicamento inmunosupresor puede ser un inhibidor de FGFrR3. En algunos casos, el medicamento inmunosupresor puede ser mAb anti-LAG3, anti-CXCR, agonista del gen relacionado con el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides [GITR], inhibidor de IDO1, agonista de ICOS, inhibidor de glutaminasa, Flt3L humano recombinante, agonista de TLR9, inhibidor de EZH2, mAb anti-CTLA4, inhibidor de PD-1, inhibidor de PD-L1, mAb anti-PD-L1, inhibidor de FGFR4, mAb anti-PD-1 y anti-LAG3 biespecífico, agonista de TLR4, inhibidor de Bcl-2 o mAb anti-LAG3. En algunos casos, los medicamentos inmunosupresores pueden ser inhibidores de las vías de degradación celular, tales como los inhibidores del proteasoma. En algunos casos, el medicamento inmunosupresor puede seleccionarse entre antagonista de A2aR, inhibidor de Akt, anti CD20, agente antiamiloidótico (AA), proteína terapéutica anti-CD37, mAb anti-CTLA4, anti-CXCR4, mAb anti-huCD40, mAb anti-LAG3, mAb anti-PD-1, agente anti-PD-L1, agente anti-PD-L1, mAb anti-PD-L1, mAb anti-TGFb, mAb anti-TIGIT, mAb anti-TIM-3, inhibidor de Aurora quinasa, inhibidor de Bcl-2, proteína de fusión bifuncional dirigida a TGFb y PD-L1, mAb anti-PD-1 y anti-LAG3 biespecífico, ligando de CDld, agonista de CD40, inhibidor del complemento C5a, inhibidor de CSF1R, inhibidor de EZH2, inhibidor de FGFR3, inhibidor de FGFR4, inhibidor de FGFrR3, agonista del gen relacionado con el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides [GITR], inhibidor de glutaminasa, anticuerpo monoclonal humano contra IL-12, agonista de ICOS, inhibidor de IDO1, muteína de IL2, agonista del receptor de IL2, inhibidor de MEK, inhibidor del receptor tirosina quinasa multidireccionado, inhibidor de neutrófilo elastasa, inhibidor de Notch, inhibidor de MAPK p38, inhibidor de PD-1, Flt3L humano recombinante, inhibidor de ROCK, modulador selectivo del receptor de esfingosina-1-fosfato, inhibidor de Src quinasa, agonista de TLR4, agonista de TLR9.

[0102] En algunos casos, el medicamento inmunosupresor puede seleccionarse entre 2B3-201, 3PRGD2, 4SC-202, 506U78, ácido 6,8-bis(benciltio)octanoico, 68Ga-BNOTA-PRGD2, 852A, 89Zr-DFO-CZP, ABBV-257, ABL001, ABP 501, ABP 710, ABP 798, ABT-122, ABT-199, ABT-263, ABT-348, ABT-494, ABT-555, ABT-874, ABX-1431 HCl, ACP-196, ACP-319, ACT-128800, ACY-1215, AD 452, Ad-P53, ADCT-301, ADCT-402, ADL5859, ADS-5102, AFX-2, AGEN1884, AGEN2034, AGS67E, AIN457, AK106-001616, ALD518, ALKS 8700, ALT-803, ALT-803, ALX-0061, ALXN1007, ALXN6000, AMD3100, AMG 108, AMG 319, AMG 357, AMG 570, AMG 592, AMG 714, AMG 719, AMG 827, AMP-110, AP1903, APL A12, APO866, APX005M, AQ4N, AR-42, ARN-6039, ARQ 531, ARRY-371797, ARRY-382, ARRY-438162, ART-I02, ART621, ASK8007, ASN002, ASP015K, ASP1707, ASP2408, ASP2409, ASP5094, AT-101, AT7519M, AT9283, ATA188, ATN-103, ATX-MS-1467, AVL-292, AVP-923, AZD4573, AZD5672, AZD5991, AZD6244, AZD6738, AZD9056, AZD8156, AZD8150 B-701, BAF312, BAY1830839, BBI608, BCD-054, BCD-055, BCD-063, BCD-089, BCD-100, BCD-132, BCD-145, BEZ235, BG00012, BG9924, BGB-3111, BGB-A333, BGG492, BHT-3009, BI 655064, BI 695500, BI 695501, BI 836826, BI-1206, BIBR 796 BS, BIIB017, BIIB023, BIIB057, BIIB061, BIIL 284 BS, BLZ945, BMMNC, BMN 673, BMS-247550, BMS-582949, BMS-817399, BMS-936558, BMS-936564, B92MS, BMS-986104, BMS-986142, BMS-986156, BMS-986195, BMS-986205, BMS-986213, BMS-986226, BMS-986251, BNC105P, BOW015, BP1001, BT061, BTT-1023, C105, CAL-101, CAM-3001, CAT-8015, CB-839, CBL0137, CC-1088, CC-115, CC-122, CC-292, CC100, CCI-779, CCX 354-C, CDKI AT7519, CDP323, CDP6038, CDP870, CDX-1127, CDX-301, CE-224535, CF101, CFZ533, CGP 77116, CH-1504, CH-4051, CHR-5154, CHS-0214, CK-2017357, CLAG-M, CLR 131, CMAB008, CMP -001, CNF2024 (BIIB021), CNM-Au8, CNTO 1275, CNTO 136, CNTO 148, CNTO 6785, CP-195543, CP-461, CpG 7909, CPI-1205, CR6086, CRx-102, CS-0777, CS1002, CT-011, CT-1530, CT-P10, CV301, CX-3543, DAC-HYP, DCDT2980S, DI-B4, DPA-714 FDG, DS-3032b, DT2219ARL, DTRM-505, DTR M-555... DTRMWXHS-12... DWP422... E6011... E7449... EK-12... ELND002... ENIA11... EOC202... ETBX-011... F8IL10... FBTA05... FEDAA1106 (BAY85-8101) FGF401... FKB327... FPA008... FR104... FS1208... FTY7208, G100, GCS-100, GDC-0199, GDC-0853, GEH120714, GLPG0259, GLPG0634, GNbAC1, GNKG168, GP2013, GP2015, GRN163L, GS-1101, GS-5745, GS-9219, GS-9820, GS-9820, GS-9901, GSK1223249, GSK1827771, GSK2018682, GSK21110183, GSK239512, GSK2618960, GSK2831781, GSK2982772, GSK3117391, GSK3152314A, GSK3196165, GSK3358699, GSK706769, GW-1000-02, GW274150, GW406381, GW856553, GZ402668, HCD122, HE3286, HL2351, HL237, hLL1-DOX (IMMU-115), HLX01, HM71224, HMPL-523, HSC835, HZT-501, ICP-022, IDEC-C2B8, ILV-094, IMGN529, IMMU-114, IMO-2125, INCAGN02385, INCB018424, INCB028050, INCB039110, INCB047986, INCMGA00012, INNO-406, INT131, INT230-6, INVAC-1, IPI-45, IPX056, ISF35, ISIS 104838, ITF2357, JCARH12540346527, JNJ-63723283, JS001, JTE-051, JTX-2011, KB003, KD025, KPT-330, KW-2449, KW-2478, KX2-391, L-778123, LAG525, LAM-002A, LBEC0101, LBH589, LFB-R603, LMB-2, LX3305, LY2127399, LY2189102, LY2439821, LY3009104, LY3090106, LY3300054, LY3321367, LY3337641, M2951, M7824, M923, MBG453, MBP8298, MBS2320, MD1003, MDG013, MDV9300, MDX-1100, MDX-1342, MDX-1411, ME-401, MEDI-522, MEDI-538, MEDI-551, MEDI4920, MGA012, MGCD0103, MGD007, MIS416, MK-0873, MK-4280, MK-4827, MK-8457, MK-8808, MK0359, MK0457, MK0752, MK0782, MK0812, MK2206, MLN1202, MLTA3698A, MM-093, MN-122, MN-166, anticuerpo monoclonal M-T412, anticuerpo monoclonal mono-dgA-RFB4, MOR00208, MOR103, MORAb-022, MP-435, MP470, MRC375, MRG-106, MS-533, MSB11022, MSC2490484A, MT-1303, MT-3724, MTIG7192A, MTRX1011A, NBI- 5788, NC-503, NI-0101, NI-071, NIS793, NKTR-214, NNC 0141-0000-0100, NNC 0151-0000-0000, NNC0109-0012, NNC0114-0000-0005, NNC0114-0006, NNC0142- 0002, NNC0215-0384, NNC109-0012, NOX-A12, NT-KO-003, NU100, OMB157, OMP-313M32, ON01910 Na, ONO-2506PO, ONO-4641, ONTAK, OPB 31121, OSI-461, OTS167IV, P1446A-05, PBF-509, PBR06, PCI 32765, PCI-24781, PD 0360324, PDA001, PDR001, PF-04171327, PF-04236921, PF-04308515, PF-04629991, PF-05280586, PF-06342674, PF-06410293, 30.3 1 PF-0964, 30, 8PF-0964 PF06651600, PF-06835375, PG-760564, PH-797804, PLA-695, PLX3397, PLX5622, POL6326, PROB 1921, PRO283698, PRTX-100, PS-341, PTL201, R(+)XK469, R788, RC 18001, REGN1979, REGN3767, REGN2810, REGN4659, RFT5-SMPT-dgA, RG2077, RGB-03, RGI-2001, RHB-104, RNS60, RO5045337, RO7123520, Rob 803, RPC1063, RWJ-445380, S 55746, SAIT1-300, SAR245409, SB-681323, SB683699, SBI-087, SC12267 (4SC-101), SCH 727965, SCIO-469, SD-101, SG2000, SGN-40, SHC014748M, SHR-1210, SHR0302, SHR1020, SJG -136, SKI-O-703, SMP-114, SNS-032, SNS-062, SNX-5422, SPARC1103 I, SPC2996, SSR150106, mesilato de STA 5326, Sunpharma1505, SyB L-0501, Sym022, Sym023, SYN060, T-614, T0001, TA-650, TAB08, TAK-715, TAK-783, TAK-901, TGR-1202, TH-302, TL011, TMI-005, TMP001, TNFa Kinoid, TP-0903, TRU-015, TRU-016, TSR-022, TSR-033, TSR-042, TXA127, VAY736, VP-16, VSN16R, VX-509, VX-702, VX-745, VX15/2503, XCEL-MC-ALFA, XL228, XL844, XmAb13676, XmAb5574, XOMA 052, YRA-1909, Z102, ZEN003365.

[0104] La PML se puede diagnosticar en un paciente con un curso progresivo de la enfermedad, encontrando ADN del virus de JC en el líquido cefalorraquídeo junto con lesiones consistentes en la materia blanca en las imágenes de resonancia magnética (IRM) cerebral; como alternativa, una biopsia cerebral puede ser diagnóstica cuando están presentes la histopatología típica de desmielinización, astrocitos extraños y núcleos oligodendrogliales agrandados, junto con técnicas que muestran la presencia del virus de JC. La evidencia característica de la PML en las imágenes de CT del cerebro pueden ser lesiones hipodensas multifocales que no mejoran el contraste sin efecto de masa, pero las IRM pueden ser más sensible que la CT. El área más común de compromiso puede ser la sustancia blanca cortical de los lóbulos frontal y parietooccipital, pero las lesiones pueden ocurrir en cualquier parte del cerebro, como los ganglios basales, la cápsula externa y las estructuras de la fosa craneal posterior como el tronco encefálico y el cerebelo.

[0106] En general, el tratamiento de la PML tiene como objetivo revertir la inmunodeficiencia para retrasar o detener el progreso de la enfermedad. Los pacientes con un régimen de inmunosupresión pueden dejar de tomar el medicamento inmunosupresor o se puede usar el intercambio de plasma (PLEX) para acelerar la eliminación del medicamento inmunosupresor que pone a la persona en riesgo de PML. Los pacientes infectados por el HIV pueden iniciar la terapia antirretroviral de gran actividad (HAART). La aparición de PML también puede ocurrir en el contexto del síndrome inflamatorio de reconstitución inmunitaria (IRIS), en el que puede ocurrir la aparición de PML o los síntomas de PML pueden empeorar después del cese de la inmunosupresión (p. ej., de acuerdo con lo revisado por Pavlovic et al. Ther Adv Neurol Disord.2015 noviembre; 8(6): 255-73 y Bowen et al., Nat Rev Neurol. 27 de octubre de 2016; 12 (11): 662-674). Por ejemplo, en pacientes con MS que desarrollan PML durante el tratamiento con natalizumab, a menudo aparece el IRIS cuando se interrumpe el tratamiento y se utiliza PLEX para eliminar el natalizumab de la circulación del paciente. El tratamiento del IRIS en pacientes con PML puede incluir la administración de corticosteroides. Otros posibles tratamientos de la PML pueden incluir cidofovir, citarabina, el fármaco contra la malaria mefloquina, interleuquina-2 y 1-O-hexadeciloxipropil-cidofovir (CMX001, también conocido como brincidofovir). Como lo revisado por Pavlovic (Ther Adv Neurol Disord.2015 noviembre;8(6): 255-73), los posibles tratamientos para la PML incluyen agentes antivirales (p. ej., clorpromazina, citalopram, mirtazapina, risperidona, ziprasidona, retro-2cycl, brefeldina A, cidofovir, brincidofovir, citarabina, ganciclovir, leflunomida, topotecano, mefloquina, 3-aminobenzamida, imatinib y Ag122), moduladores de respuesta inmunitaria (p. ej., IFN-alfa, IL-2, IL-7, maraviroc y glucocorticoides) e inmunización (p. ej., anticuerpos monoclonales VP-1 anti-JCV humanos recombinantes, terapia con linfocitos T citotóxicos específicos para JCV, IL-7 más vacuna VP1 contra JCV y vacuna oral contra JCV).

[0108] El término "rendimiento de diagnóstico", como se usa en este documento, se refiere al porcentaje de casos que identificarían la presencia de una o más variaciones genéticas (p. ej., CNV, SNV) en una cohorte de PML utilizando un ensayo. Por ejemplo, si 40 casos identificaran la presencia de una o más variaciones genéticas (p. ej., CNV, SNV) en una cohorte de 100 pacientes con PML, el rendimiento diagnóstico del ensayo es del 40 %. En algunos casos, a los pacientes de la cohorte de PML se les diagnostica clínicamente PML. En algunos casos, a un paciente se le diagnostica clínicamente PML cuando el ADN del virus de JC está presente en el líquido cefalorraquídeo en el presente documento y hay lesiones consistentes en la sustancia blanca en imágenes de resonancia magnética (IRM) del cerebro. En algunos casos, a un paciente se le diagnostica clínicamente PML cuando la histopatología típica de desmielinización, astrocitos extraños y núcleos oligodendrogliales agrandados están presentes en una biopsia cerebral, junto con la presencia del virus de JC. En algunos casos, la cohorte de PML tiene al menos 5 casos de PML, por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 casos de PML. En algunos casos, la cohorte de PML es una cohorte enumerada en este documento. Por ejemplo, la cohorte de PML es la cohorte de pacientes con PML incluida en la Tabla 7. En algunos casos, el ensayo es un ensayo de anticuerpos contra JCV. En algunos casos, el ensayo no es un ensayo de anticuerpos contra JCV. En algunos casos, el ensayo es un ensayo genético. En algunos casos, el ensayo genético prueba la predisposición genética para la PML.

[0110] El ensayo genético puede comprender cualquier método divulgado en el presente documento. En algunos casos, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de al menos aproximadamente 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 %. En algunos casos, el ensayo genético tiene un rendimiento diagnóstico de aproximadamente 1 % - 5 %, 1 % - 10 %, 1 % - 20 %, 5 % - 10 %, 5 % - 20 %, 10 % - 20 %, 10 % - 30 %, 20 % - 30 %, 20 % - 40 %, 30 % - 40 %, 30 % - 50 %, 40 % - 50 %, 40 % - 60 %, 50 % - 60 %, 50 % - 70 %, 60 % - 70 %, 60 % - 80 %, 70 % - 80 %, 70 % - 90 %, 80 % - 90 %, 80 % - 95 %, 90 % - 95 %, 90 % - 99 %, 90 % - 100 %, 95 % - 99 % o 99 % - 100 %.

[0112] Variaciones genómicas asociadas con PML

[0114] La presente invención involucra una variación genómica seleccionada de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9: 137779251, G>A y chr1:160769595, G>A y crm21:45708278, G>A. A continuación, se proporciona una explicación general de las variaciones genéticas y se describen ejemplos de variaciones que no constituyen el objeto que se reivindica en el presente documento, en la medida en que se relacionen con variaciones distintas de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9:137779251, G>A y chr1:160769595, G>A. En el presente documento se describen métodos que pueden usarse para detectar variaciones genéticas. La detección de variaciones genéticas específicas, por ejemplo, etiquetadores polimórficos y/o haplotipos, número de copias, ausencia o presencia de un alelo o genotipo asociado con una afección (por ejemplo, enfermedad o trastorno) como se describe en este documento, puede lograrse mediante métodos conocidos en la técnica para analizar ácidos nucleicos y/o detectar secuencias en sitios polimórficos o genéticamente variables, por ejemplo, técnicas de amplificación, técnicas de hibridación, secuenciación, micromatrices/matrices, o cualquier combinación de los mismas. Por lo tanto, mediante el uso de estos métodos divulgados en este documento u otros métodos disponibles para el experto en la materia, uno o más alelos en etiquetadores polimórficos, incluidos microsatélites, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), variaciones de un solo nucleótido (SNV), inserciones/eliminaciones (indels), variaciones del número de copias (CNV), u otros tipos de variaciones genéticas, pueden identificarse en una muestra obtenida de un sujeto.

[0116] Las secuencias genómicas dentro de las poblaciones exhiben variabilidad entre individuos en muchos lugares del genoma. Por ejemplo, el genoma humano exhibe variaciones de secuencia que ocurren en promedio cada 500 pares de bases. Estas variaciones genéticas en las secuencias de ácidos polinucleicos se denominan comúnmente polimorfismos o sitios polimórficos. Como se usa en el presente documento, un polimorfismo, por ejemplo, una variación genética, incluye una variación en la secuencia del genoma entre una población, tal como variaciones alélicas y otras variaciones que surgen o se observan. Por lo tanto, un polimorfismo se refiere a la aparición de dos o más secuencias o alelos alternativos determinados genéticamente en una población. Estas diferencias pueden ocurrir en las partes codificantes (p. ej., exónicas) y no codificantes (p. ej., intrónicas o intergénicas) del genoma, y pueden manifestarse o detectarse como diferencias en las secuencias de ácidos polinucleicos, la expresión génica, incluidos, por ejemplo, la transcripción, el procesamiento, traducción, transporte, procesamiento de proteínas, tráfico, síntesis de ADN; proteínas expresadas, otros productos génicos o productos de vías bioquímicas o en modificaciones postraduccionales y cualquier otra diferencia que se manifieste entre los miembros de una población. Los polimorfismos que surgen como resultado de un solo cambio de base, tal como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o variaciones de un solo nucleótido (SNV), pueden incluir una inserción, eliminación o cambio en un nucleótido. Un marcador o sitio polimórfico es el lugar en el que se produce la divergencia. Dichos sitios pueden ser tan pequeños como un par de bases (un SNP o SNV). Los etiquetadores polimórficos incluyen, pero no se limitan a, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), número variable de repeticiones en tándem (VNTR), regiones hipervariables, minisatélites, repeticiones de dinucleótidos, repeticiones de trinucleótidos, repeticiones de tetranucleótidos y otros patrones repetitivos, repeticiones de secuencia simple y de elementos de inserción, tales como Alu. Las formas polimórficas también se manifiestan como diferentes alelos mendelianos para un gen. Los polimorfismos se pueden observar por diferencias en proteínas, modificaciones de proteínas, modificación de la expresión del ARN, metilación del ADN y del ARN, factores reguladores que alteran la expresión génica y la replicación del ADN, y cualquier otra manifestación de alteraciones en el ácido polinucleico genómico o en los ácidos polinucleicos de los orgánulos. Los expertos en la técnica pueden apreciar que los polimorfismos a veces se consideran una subclase de variaciones, definidas sobre la base de un corte de frecuencia particular en una población. Por ejemplo, los polimorfismos se pueden considerar variantes/variaciones que sean genéticas que ocurren con una frecuencia >1 % o >5 % en la población.

[0118] Se puede encontrar que estas variaciones genéticas están asociadas con uno o más trastornos y/o enfermedades usando los métodos divulgados en el presente documento. Se puede encontrar que estas variaciones genéticas están asociadas con la ausencia de uno o más trastornos y/o enfermedades (por ejemplo, una o más variantes protegen contra el desarrollo del trastorno y/o enfermedades) usando los métodos divulgados en el presente documento.

[0120] Estas variaciones genéticas pueden comprender mutaciones puntuales, polimorfismos, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), variaciones de un solo nucleótido (SNV), translocaciones, inserciones, eliminaciones, amplificaciones, inversiones, eliminaciones intersticiales, variaciones del número de copias (CNV), variación estructural (SV), pérdida de heterocigosidad, o cualquier combinación de los mismos. Dado que la variación genética incluye cualquier eliminación, inserción o sustitución de base del ADN genómico de uno o más individuos en una primera porción de una población total que, por lo tanto, da como resultado una diferencia en el sitio de la eliminación, inserción o sustitución de base en relación con uno o más individuos en una segunda porción de la población total. Por lo tanto, el término "variación genética" abarca "tipo silvestre" o la variación que ocurre con mayor frecuencia, y también incluye "mutante" o la variación que ocurre con menos frecuencia. Un alelo de tipo silvestre puede denominarse alelo ancestral.

[0122] Como se usa en el presente documento, una molécula objetivo que está "asociada con" o "se correlaciona con" una variación genética particular es una molécula que puede distinguirse funcionalmente en su estructura, actividad, concentración, compartimentación, degradación, secreción y similares, como resultado de tal variación genética. Los polimorfismos (p. ej., etiquetadores polimórficos, variaciones genéticas o variantes genéticas) pueden comprender cualquier posición de nucleótido en la que sean posibles dos o más secuencias en una población de sujetos. Cada versión de una secuencia de nucleótidos, con respecto al polimorfismo/variación, puede representar un alelo específico del polimorfismo/variación. El ADN genómico de un sujeto puede contener dos alelos para cualquier marcador polimórfico dado, representativo de cada copia de la etiqueta en cada cromosoma. Un alelo puede ser una secuencia de nucleótidos de una ubicación dada en un cromosoma. Los polimorfismos/variaciones pueden comprender cualquier número de alelos específicos. Un polimorfismo/variación puede caracterizarse por la presencia de dos o más alelos en una población. El polimorfismo/variación se puede caracterizar por la presencia de tres o más alelos. El polimorfismo/variación se puede caracterizar por cuatro o más alelos, cinco o más alelos, seis o más alelos, siete o más alelos, nueve o más alelos o diez o más alelos. Un alelo puede estar asociado con una o más enfermedades o trastornos, por ejemplo, un alelo de riesgo de PML puede ser un alelo que está asociado con un mayor o menor riesgo de desarrollar PML. Las variaciones genéticas y los alelos se pueden utilizar para asociar un fenotipo heredado con un genotipo responsable. Un alelo de riesgo de PML puede ser una variante del alelo que se asocia estadísticamente con una prueba de detección de PML. Las variaciones genéticas pueden tener cualquier frecuencia medible en la población, por ejemplo, una frecuencia superior al 10 %, una frecuencia del 5 al 10 %, una frecuencia del 1 al 5 %, una frecuencia del 0.1 al 1 % o una frecuencia inferior a 0.1 %. Como se usa en el presente documento, los alelos variantes pueden ser alelos que difieren de un alelo de referencia. Como se usa en el presente documento, una variante puede ser un segmento de ADN que difiere del ADN de referencia, tal como una variación genética. Las variaciones genéticas se pueden utilizar para rastrear la herencia de un gen que aún no se ha identificado, pero cuya ubicación aproximada se conoce.

[0124] Como se usa en el presente documento, un "haplotipo" puede ser información sobre la presencia o ausencia de uno o más etiquetadores genéticos en una región cromosómica dada en un sujeto. Un haplotipo puede ser un segmento de ADN caracterizado por uno o más alelos dispuestos a lo largo del segmento, por ejemplo, un haplotipo puede comprender un miembro del par de alelos para cada variación genética o locus. El haplotipo puede comprender dos o más alelos, tres o más alelos, cuatro o más alelos, cinco o más alelos, o cualquier combinación de los mismos, donde cada alelo puede comprender una o más variaciones genéticas a lo largo del segmento.

[0126] Una variación genética puede ser una aberración funcional que puede alterar la función génica, la expresión génica, la expresión polipeptídica, la función polipeptídica o cualquier combinación de las mismas. Una variación genética puede ser una mutación con pérdida de función, una mutación con ganancia de función, una mutación negativa dominante o una reversión. Una variación genética puede ser parte de la región codificante o de la región reguladora de un gen. Las regiones reguladoras pueden controlar la expresión génica y, por lo tanto, la expresión polipeptídica. Una región reguladora puede ser un segmento de ADN en el que pueden unirse polipéptidos reguladores, por ejemplo, factores de transcripción o empalme. Una región reguladora se puede colocar cerca del gen que se regula, por ejemplo, posiciones secuencia arriba o secuencia abajo del gen que se regula. Una región reguladora (p. ej., un elemento potenciador) puede tener varios miles de pares de bases secuencia arriba o secuencia abajo de un gen.

[0128] Las variantes pueden incluir cambios que afectan a un polipéptido, tal como un cambio en el nivel de expresión, secuencia, función, localización, compañeros de unión o cualquier combinación de los mismos. Una variación genética puede ser una mutación de cambio de marco, una mutación no sentido, una mutación sin sentido, una mutación neutra o una mutación silenciosa. Por ejemplo, las diferencias de secuencia, cuando se comparan con una secuencia de nucleótidos de referencia, pueden incluir la inserción o eliminación de un solo nucleótido, o de más de un nucleótido, lo que da como resultado un cambio de marco; el cambio de al menos un nucleótido, dando como resultado un cambio en el aminoácido codificado; el cambio de al menos un nucleótido, que da como resultado la generación de un codón de terminación prematuro; la eliminación de varios nucleótidos, que da como resultado la eliminación de uno o más aminoácidos codificados por los nucleótidos; la inserción de uno o varios nucleótidos, tal como por recombinación desigual o conversión génica, que da como resultado una interrupción de la secuencia codificante de un marco de lectura; duplicación total o parcial de una secuencia; transposición; o un reordenamiento de una secuencia de nucleótidos. Dichos cambios de secuencia pueden alterar el polipéptido codificado por el ácido nucleico, por ejemplo, si el cambio en la secuencia de ácido nucleico provoca un cambio de marco, el cambio de marco puede resultar en un cambio en los aminoácidos codificados y/o puede resultar en la generación de un codón de parada prematuro, que provoca la generación de un polipéptido truncado. Una variación genética asociada con la PML puede ser un cambio sinónimo en uno o más nucleótidos, por ejemplo, un cambio que no da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos. Dicho polimorfismo puede, por ejemplo, alterar los sitios de empalme, afectar la estabilidad o el transporte del ARNm o afectar de otro modo la transcripción o traducción de un polipéptido codificado. Una mutación sinónima puede dar como resultado que el producto polipeptídico tenga una estructura alterada debido al uso poco frecuente de codones que afecta el plegamiento del polipéptido durante la traducción, lo que en algunos casos puede alterar su función y/o propiedades de unión al fármaco si se trata de un objetivo farmacológico. Los cambios que pueden alterar el ADN aumentan la posibilidad de que se produzcan cambios estructurales, tales como amplificaciones o eliminaciones, a nivel somático. Un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia puede ser un polipéptido de referencia con una secuencia de aminoácidos de referencia particular, y los polipéptidos codificados por secuencias de nucleótidos variantes pueden ser polipéptidos variantes con secuencias de aminoácidos variantes.

[0130] Las variantes de secuencia más comunes comprenden variaciones de base en una sola posición de base en el genoma, y dichas variantes de secuencia, o polimorfismos, se denominan comúnmente polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o variantes de un solo nucleótido (SNV). Un SNP puede representar una variante genética presente en una ocurrencia superior o igual al 1 % en una población y un SNP o una SNV pueden representar una variante genética presente en cualquier nivel de frecuencia en una población. Un SNP puede ser una variación de la secuencia de nucleótidos que ocurre cuando un solo nucleótido en una ubicación del genoma difiere entre los miembros de una especie o entre los cromosomas emparejados en un sujeto. Los SNP pueden incluir variantes de un solo nucleótido, por ejemplo, en una posición de nucleótido dada, algunos sujetos pueden tener una 'G', mientras que otros pueden tener una 'C'. Los SNP pueden ocurrir en un solo evento mutacional y, por lo tanto, puede haber dos alelos posibles en cada sitio del SNP; el alelo original y el alelo mutado. Los SNP que tienen dos bases diferentes en una posición de un solo nucleótido se denominan SNP bialélicos, los que tienen tres se denominan trialélicos y los que tienen las cuatro bases representadas en la población son cuadralélicos. Los SNP pueden considerarse neutrales. Los SNP pueden afectar la susceptibilidad a una afección (p. ej., PML). Los polimorfismos de SNP pueden tener dos alelos, por ejemplo, un sujeto puede ser homocigoto para un alelo del polimorfismo en el que ambas copias cromosómicas del individuo tienen el mismo nucleótido en la ubicación del SNP, o un sujeto puede ser heterocigoto en el que los dos cromosomas hermanos del sujeto contienen diferentes nucleótidos. La nomenclatura de SNP que se informa en este documento es la etiqueta de identificación ID de referencia oficial del SNP (rs) asignada a cada SNP único por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).

[0132] Otra variación genética puede ser la variación del número de copias (CNV). Como se usa en el presente documento, las "CNV" incluyen alteraciones del ADN de un genoma que dan como resultado un número anormal de copias de una o más secciones de ADN. Una CNV puede comprender una subregión de CNV. Como se usa en el presente documento, una "subregión de CNV" incluye una secuencia de nucleótidos continua dentro de una CNV. La secuencia de nucleótidos de una subregión de CNV puede ser más corta que la secuencia de nucleótidos de la CNV, y la subregión de CNV puede ser equivalente a la CNV (por ejemplo, tal como para algunas CNV). Las CNV pueden ser heredadas o causadas por una mutación de novo y pueden ser responsables de una cantidad sustancial de variabilidad fenotípica humana, rasgos de comportamiento y susceptibilidad a enfermedades. Las CNV pueden estar asociadas con la susceptibilidad a una o más afecciones, por ejemplo, PML. Las CNV pueden incluir un solo gen o incluir un conjunto contiguo de genes. Las CNV pueden ser causadas por reordenamientos estructurales del genoma, por ejemplo, translocaciones o inversiones, inserciones, eliminaciones, amplificaciones y eliminaciones intersticiales desequilibradas. Estos reordenamientos estructurales ocurren en uno o más cromosomas. Las repeticiones de bajo número de copias (CSF), que son secuencias repetidas específicas de la región (también conocidas como duplicaciones segmentarias), pueden ser susceptibles a estos reordenamientos estructurales, lo que da como resultado CNV. Factores como el tamaño, la orientación, el porcentaje de similitud y la distancia entre las copias pueden influir en la susceptibilidad de las CSF al reordenamiento genómico. Además, los reordenamientos pueden estar mediados por la presencia de repeticiones de alto número de copias, tales como elementos intercalados largos (LINE) y elementos intercalados cortos (SINE), a menudo a través de una recombinación no homóloga. Por ejemplo, los reordenamientos cromosómicos pueden surgir de la recombinación homóloga no alélica durante la meiosis o a través de un mecanismo basado en la replicación, tal como el estancamiento de la horquilla y el cambio de molde (FoSTeS) (Zhang F. et al., Nat. Genet. (2009) o reparación inducida por rotura mediada por microhomología (MMBIR) (Hastings PJ et al., PLoS Genetics (2009). Las CNV se pueden denominar variantes estructurales, que son una clase más amplia de variantes que también incluyen alteraciones neutrales del número de copias, tales como inversiones equilibradas y translocaciones equilibradas.

[0134] Las CNV pueden explicar la variación genética que afecta a una proporción sustancial del genoma humano; por ejemplo, las CNV conocidas pueden cubrir más del 15 % de la secuencia del genoma humano (Estivill y Armengol, PLoS Genetics (2007)). Las CNV pueden afectar la expresión génica, la variación fenotípica y la adaptación al interrumpir o alterar la dosificación génica, y pueden causar enfermedades, por ejemplo, trastornos de microeliminación y microduplicación, y pueden conferir susceptibilidad a enfermedades y trastornos. La información actualizada sobre la ubicación, el tipo y el tamaño de las CNV conocidas se puede encontrar en una o más bases de datos, por ejemplo, la Base de Datos de Variantes Genómicas (Vease,MacDonald JR et al., Nucleic Acids Res., 42, D986-92 (2014), que actualmente contiene datos de más de 500,.000 CNV (a partir de mayo de 2016).

[0136] Se pueden encontrar otros tipos de variantes de secuencia en el genoma humano y se pueden asociar con una enfermedad o trastorno, incluyendo, pero sin limitarse a: los microsatélites. Los etiquetadores de microsatélites son estables, polimórficos, fáciles de analizar y pueden aparecer regularmente en todo el genoma, lo que los hace especialmente adecuados para el análisis genético. Un microsatélite polimórfico puede comprender múltiples repeticiones pequeñas de bases, por ejemplo, repeticiones CA, en un sitio particular en el que el número de longitudes de repetición varía en una población. Los microsatélites, por ejemplo, el número variable de repeticiones en tándem (VNTR), pueden ser segmentos cortos de ADN que tienen una o más secuencias repetidas, por ejemplo, de aproximadamente 2 a 5 nucleótidos de largo, que pueden ocurrir en el ADN no codificante. Los cambios en los microsatélites pueden ocurrir durante la recombinación genética de la reproducción sexual, aumentando o disminuyendo el número de repeticiones encontradas en un alelo o cambiando la longitud del alelo.

[0137] Las variaciones genéticas divulgadas en este documento pueden estar asociadas con un riesgo de desarrollar PML en un sujeto. En algunos casos, el sujeto puede tener un riesgo reducido debido a la ausencia de una o más variaciones genéticas que alteran o modulan un gen correspondiente de acuerdo con las Tablas 1 a 26. Por ejemplo, el sujeto puede tener un riesgo reducido debido a la ausencia de una o más variaciones genéticas que alteran o modulan un gen correspondiente de acuerdo con las Tablas 3 y 6. En algunos casos, el sujeto puede tener un mayor riesgo debido a la presencia de una o más variaciones genéticas que interrumpen o modulan un gen correspondiente de acuerdo con las tablas 1 a 26. Por ejemplo, el sujeto puede tener un mayor riesgo debido a la presencia de una o más variaciones genéticas que alteran o modulan un gen correspondiente de acuerdo con las Tablas 3 y 6. En algunos casos, uno o más genes enumerados en las Tablas 25A, 25B y 26 pueden eliminarse de cualquiera de las Tablas 1-24. En algunos casos, uno o más genes listados en las Tablas 25A, 25B y 26 pueden agregarse a cualquiera de las Tablas 1-24.

[0138] Tabla 25A: Eem lo del anel de 8 enes

[0140]

[0142] Tabla 25B: Eem lo del anel de 16 enes

[0144]

[0145]

[0147] Tabla 26: Eemlo del anel de 2 enes

[0148]

[0149]

[0151] Sujetos

[0152] Un "sujeto", tal como se usa en el presente documento, puede ser un individuo de cualquier edad o sexo del que se obtiene una muestra que contiene polinucleótidos para su análisis mediante uno o más métodos descritos en el presente documento para obtener información sobre el ácido polinucleico; por ejemplo, un adulto masculino o femenino, un niño, un recién nacido o un feto. Un sujeto puede ser cualquier objetivo de administración terapéutica. Un sujeto puede ser un sujeto de prueba o un sujeto de referencia.

[0153] Como se usa en el presente documento, una "cohorte" puede representar un grupo étnico, un grupo de pacientes, un grupo de edad particular, un grupo no asociado con una afección particular (p. ej., enfermedad o trastorno), un grupo asociado con una afección particular (p. ej., enfermedad o trastorno), un grupo de sujetos asintomáticos, un grupo de sujetos sintomáticos, o un grupo o subgrupo de sujetos asociados con una respuesta particular a un régimen de tratamiento o inscritos en un ensayo clínico. Un paciente puede ser un sujeto afectado por una afección (por ejemplo, una enfermedad o un trastorno). Un paciente puede ser un sujeto que no padece una afección (p. ej., una enfermedad o un trastorno) y se considera aparentemente sano, o un sujeto normal o de control. Un sujeto puede ser un sujeto de prueba, un paciente o un candidato para un producto terapéutico, en el que se obtiene ADN genómico del sujeto, paciente o candidato para su análisis mediante uno o más métodos de la presente divulgación en el presente documento, para obtener información de la variación genética del sujeto, paciente o candidato.

[0154] La muestra de ácido polinucleico se puede obtener prenatalmente de un feto o embrión o de la madre, por ejemplo, de células fetales o embrionarias en la circulación materna. La muestra de ácido polinucleico se puede obtener con la ayuda de un profesional de la salud, por ejemplo, para extraer sangre. La muestra de ácido polinucleico se puede obtener sin la ayuda de un proveedor de atención médica, por ejemplo, cuando la muestra de ácido polinucleico se obtiene de forma no invasiva, tal como una muestra de saliva, o una muestra que comprende células bucales que se obtiene utilizando un hisopo o cepillo bucal, o una muestra de enjuague bucal.

[0155] Las variaciones genéticas pueden evaluarse en sujetos que son miembros de una población objetivo. Dicha población objetivo puede ser una población o grupo de sujetos en riesgo de desarrollar la afección (p. ej., enfermedad o trastorno), de acuerdo con, por ejemplo, otros factores genéticos, biomarcadores, parámetros biofísicos, pruebas de diagnóstico tales como imágenes de resonancia magnética (IRM), antecedentes familiares de la afección, exámenes de detección previos o historial médico, o cualquier combinación de los mismos.

[0156] Las variaciones genéticas de la presente descripción que se encuentran asociadas con una afección (p. ej., una enfermedad o un trastorno) pueden mostrar una asociación similar en otras poblaciones humanas. Por lo tanto, también se contemplan realizaciones particulares que comprenden poblaciones humanas en cuestión y están dentro del alcance de la divulgación. Dichas realizaciones se relacionan con sujetos humanos que pertenecen a una o más poblaciones humanas, incluidas, pero no se limitan a, poblaciones caucásica, judía asquenazí, judía sefardita, europea, americana, euroasiática, asiática, asiática central/del sur, asiática del este, del Medio Oriente, africana, hispana, caribeña y oceánica. Las poblaciones europeas incluyen, pero no se limitan a, poblaciones sueca, noruega, finlandesa, rusa, danesa, islandesa, irlandesa, celta, inglesa, escocesa, holandesa, belga, francesa, alemana, española, portuguesa, italiana, polaca, búlgara, eslava, serbia, bosnia, checa, griega y turca. La contribución étnica en los sujetos también se puede determinar mediante análisis genético, por ejemplo, el análisis genético de la ascendencia se puede llevar a cabo utilizando etiquetadores de microsatélites no vinculados o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) tal como los establecidos en Smith. et al., (Smith MW et al., Am. J. Hum. Genet., 74: 1001 (2004)).

[0158] Ciertas variaciones genéticas pueden tener diferentes frecuencias de población en diferentes poblaciones, o son polimórficas en una población pero no en otra. Los métodos disponibles y como se cree en el presente documento pueden aplicarse para poner en práctica la presente divulgación en cualquier población humana dada. Esto puede incluir la evaluación de las variaciones genéticas de la presente divulgación, para identificar aquellos etiquetadores que producen una asociación más fuerte dentro de la población específica. Por lo tanto, las variantes de riesgo de la presente divulgación pueden residir en diferentes antecedentes de haplotipos y en diferentes frecuencias en diversas poblaciones humanas.

[0160] Condiciones y medicamentos inmunosupresores

[0162] Un sujeto puede ser diagnosticado o no diagnosticado con una afección (por ejemplo, una enfermedad o trastorno), puede ser asintomático o sintomático, puede tener una mayor o menor susceptibilidad a una afección (por ejemplo, una enfermedad o trastorno), puede estar actualmente bajo o previamente bajo o no bajo un tratamiento para una afección (por ejemplo, enfermedad o trastorno), o cualquier combinación de los mismos. La afección puede ser AIDS, cáncer, trasplante de órganos o una enfermedad autoinmune. La afección puede ser PML.

[0164] Un sujeto puede ser diagnosticado o no diagnosticado con PML, puede ser asintomático o sintomático, puede tener una mayor o menor susceptibilidad a la PML, puede estar actualmente o previamente bajo o no bajo un tratamiento para la PML, o cualquier combinación de los mismos. Un sujeto puede ser diagnosticado o no diagnosticado con AIDS (por ejemplo, individuos infectados con HIV), puede ser asintomático o sintomático, puede tener una mayor o menor susceptibilidad al AIDS, puede estar actualmente o previamente bajo o no bajo tratamiento para AIDS, o cualquier combinación de los mismos. Un sujeto puede ser diagnosticado o no diagnosticado con cáncer (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, leucemia, linfoma o mielofibrosis), puede ser asintomático o sintomático, puede tener una mayor o menor susceptibilidad al cáncer, puede estar actualmente bajo o anteriormente bajo o no bajo un tratamiento para el cáncer, o cualquier combinación de los mismos. Un sujeto puede ser diagnosticado actualmente o previamente diagnosticado o no diagnosticado con una enfermedad autoinmune (por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, lupus eritematoso sistémico), puede ser asintomático o sintomático, puede tener una mayor o menor susceptibilidad a una enfermedad autoinmune, puede estar actualmente bajo o anteriormente bajo o no bajo un tratamiento para una enfermedad autoinmune, o cualquier combinación de los mismos.

[0166] El término "cáncer" pretende incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados malignamente, independientemente del tipo histopatológico o etapa de invasividad. Un tumor metastásico puede surgir de una multitud de tipos de tumores primarios, incluyendo, pero sin limitarse a: a, los de origen mamario, pulmonar, hepático, de colon y de ovario. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, fibrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de recto, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer de cerebro, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mielofibrosis o sarcoma de Kaposi.

[0167] El término "enfermedad autoinmune" pretende incluir todos los tipos de estados patológicos que surgen de respuestas inmunes anormales del cuerpo a sustancias y tejidos que normalmente están presentes en el cuerpo. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Addison, encefalitis anti-receptor de NMDA, síndrome de antisintetasa, anemia aplásica, anemias autoinmunes, anemia hemolítica autoinmune, pancreatitis autoinmune, enfermedad de Behcet, trastornos de la piel ampollosa, enfermedad celíaca - esprúe (enteropatía sensible al gluten), síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, leucemia linfocítica crónica, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, enfermedad de Devic, eritroblastopenia, síndrome de Evans, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, granulomatosis con poliangitis, enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, enfermedades autoinmunes mediadas por IgA, enfermedad relacionada con IgG4, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis idiopática juvenil, esclerosis múltiple, miastenia grave, mieloma, linfoma no Hodgkin, síndrome de opsoclono mioclono (OMS), penfigoide, pénfigo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, polimiositis, psoriasis, aplasia pura de glóbulos rojos, artritis reactiva, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjögren, lupus eritematoso sistémico, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, diabetes tipo I, colitis ulcerosa, vasculitis (p. ej., vasculitis asociado con anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos) y vitíligo.

[0169] Un sujeto puede tratarse actualmente con un medicamento inmunosupresor. Un sujeto puede tratarse previamente con un medicamento inmunosupresor. Un sujeto aún no puede ser tratado con un medicamento inmunosupresor. El medicamento inmunosupresor puede incluir, pero no se limita a, glucocorticoides, citostáticos, anticuerpos, fármacos que actúan sobre inmunofilinas, interferones, opioides, proteínas de unión a TNF, micofenolato u otros agentes biológicos pequeños. Por ejemplo, los glucocorticoides pueden incluir, pero no se limitan a, cortisol (hidrocortisona), cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, triamcinolona, beclometasona, acetato de fludrocortisona, acetato de desoxicorticosterona (DOCA) o aldosterona. Los citostáticos pueden incluir, pero no se limitan a, mostazas nitrogenadas (por ejemplo, ciclofosfamida), nitrosoureas, compuestos de platino, análogos de ácido fólico tales como metotrexato, análogos de purina tales como azatioprina y mercaptopurina, análogos de pirimidina tales como fluorouracilo, inhibidores de la síntesis de proteínas, antibióticos citotóxicos tales como dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina o mitramicina. Los anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales tales como atgam y timoglobulina, anticuerpos monoclonales tales como anticuerpos dirigidos contra CD25 y CD3, muromonab-CD3, basiliximab (p. ej., SIMULECT) y daclizumab (p. ej., ZENAPAX). Los fármacos que actúan sobre las inmunofilinas pueden incluir, pero no se limitan a, ciclosporina, tacrolimus, sirolimus o everolimus. Las proteínas de unión a TNF pueden incluir, pero no se limitan a, infliximab (p. ej., REMICADE), etanercept (p. ej., ENBREL) o adalimumab (p. ej., HUMIRA). Otros agentes biológicos pequeños pueden incluir, pero no se limitan a, fingolimod, miriocina y rituximab (p. ej., RITUXAN).

[0171] El medicamento inmunosupresor pueden ser un fármacos para tratar la esclerosis múltiple que incluye, pero no se limitan a, interferón beta-1a (p. ej., AVONEX, REBIF), interferón beta-1b (p. ej., BETASERON, EXTAVIA), acetato de glatirámero (p. ej., COPAXONE, GLATOPA), peginterferón beta-1a (p. ej., PLEGRIDY), teriflunomida (p. ej., AUBAGIO), fingolimod (p. ej., GILENYA), fumarato de dimetilo (p. ej., TECFIDERA), alemtuzumab (p. ej., LEMTRADA), mitoxantrona (p. ej., NOVANTRONE), natalizumab (p. ej., TYSABRI), daclizumab (p. ej., ZINBRYTA) u ocrelizumab (p. ej., OCREVUS).

[0173] El medicamento inmunosupresor puede ser adalimumab (p. ej., HUMIRA), alemtuzumab (p. ej., LEMTRADA), alemtuzumab (p. ej., CAMPATH), azatioprina (p. ej., IMURAN), belimumab (p. ej., BENLYSTA), bevacizumab (p. ej., AVASTIN), bortezomib (p. ej., VELCADE), eculizumab (p. ej., SOLIRIS), leflunomida, brentuximab vedotina (p. ej., ADCETRIS), cetuximab (p. ej., ERBITUX), ciclofosfamida, fumarato de dimetilo (p. ej., TECFIDERA), efalizumab (p. ej., RAPTIVA), fingolimod (p. ej., GILENYA), fludarabina (p. ej., FLUDARA), ácido fumárico, imatinib (p. ej., GLEEVEC, GLIVEC), infliximab (p. ej., REMICADE), metotrexato (p. ej., TREXALL, RHEUMATREX), mofetil micofenolato (p. ej., CELLCEPT), natalizumab (p. ej., TYSABRI), daclizumab (p. ej., ZINBRYTA), rituximab (p. ej., RITUXAN), vedolizumab (p. ej., ENTYVIO), ruxolitinib (p. ej., JAKAFI, JAKAVI) u ocrelizumab (p. ej., Ocrevus). Por ejemplo, el rituximab se puede usar para tratar pacientes con MS (p. ej., sin marca), tanto en forma recurrente-remitente (RRMS) como progresiva (PMS); por ejemplo, de acuerdo con lo informado por Memon A et al., 2018 (PMID 29309416), Alcala C et al., 2018 (PMID 29785523), y Berntsson S et al., 2018 (PMID 29797711).

[0175] Muestras

[0177] Las muestras que son adecuadas para su uso en los métodos descritos en el presente documento pueden ser muestras de ácido polinucleico de un sujeto. Una "muestra de ácido polinucleico" como se usa en el presente documento puede incluir ARN o ADN, o una combinación de los mismos. Se puede usar una "muestra de polipéptido" (p. ej., péptidos o proteínas, o fragmentos de los mismos) para determinar la información de que se ha producido un cambio de aminoácido, que puede ser el resultado de una variante genética. Los ácidos polinucleicos y los polipéptidos se pueden extraer de una o más muestras que incluyen, pero no se limitan a, sangre, saliva, orina, raspados de la mucosa del revestimiento de la boca, expectorado, suero, lágrimas, piel, tejido o cabello. Se puede analizar una muestra de ácido polinucleico para obtener información sobre el ácido polinucleico. La "información de ácido polinucleico", como se usa en este documento, incluye una secuencia de ácido polinucleico en sí misma, la presencia/ausencia de variación genética en la secuencia de ácido polinucleico, una propiedad física que varía dependiendo de la secuencia de ácido polinucleico (p. ej., Tm) y la cantidad del ácido polinucleico (por ejemplo, número de copias de ARNm). Un "ácido polinucleico" significa cualquiera de ADN, ARN, ADN que incluye nucleótidos artificiales o ARN que incluye nucleótidos artificiales. Como se usa en el presente documento, un "ácido polinucleico purificado" incluye ADNc, fragmentos de ácidos polinucleicos genómicos, ácidos polinucleicos producidos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ácidos polinucleicos formados por tratamiento con enzimas de restricción de ácidos polinucleicos genómicos, ácidos polinucleicos recombinantes y moléculas de ácido polinucleico sintetizadas químicamente.

[0178] Una molécula de ácido polinucleico "recombinante" incluye una molécula de ácido polinucleico fabricada mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos polinucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. Como se usa en el presente documento, un "polipéptido" incluye proteínas, fragmentos de proteínas y péptidos, ya sean aislados de fuentes naturales, producidos mediante técnicas recombinantes o sintetizados químicamente. Un polipéptido puede tener una o más modificaciones, tales como una modificación postraduccional (p. ej., glicosilación, fosforilación, etc.) o cualquier otra modificación (p. ej., PEGilación, etc.). El polipéptido puede contener uno o más aminoácidos no naturales (p. ej., tales como un aminoácido con una modificación de la cadena lateral).

[0180] La muestra de ácido polinucleico puede comprender células o tejido, por ejemplo, líneas celulares. Los ejemplos de tipos de células a partir de los cuales se pueden obtener ácidos nucleicos utilizando los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: una célula sanguínea tal como un linfocito B, un linfocito T, un leucocito, un eritrocito, un macrófago o un neutrófilo; una célula muscular tal como una célula esquelética, una célula de músculo liso o una célula de músculo cardiaco; una célula germinal, tal como un espermatozoide o un óvulo; una célula epitelial; una célula de tejido conectivo, tal como un adipocito, condrocito; fibroblasto u osteoblasto; una neurona; un astrocito; una célula estromal; una célula específica de órgano, tal como una célula de riñón, una célula pancreática, una célula de hígado o un queratinocito; una célula madre; o cualquier célula que se desarrolle a partir del mismo. Una célula de la que se pueden obtener ácidos nucleicos puede ser una célula sanguínea o un tipo particular de célula sanguínea que incluye, por ejemplo, una célula madre hematopoyética o una célula que surge de una célula madre hematopoyética tal como un glóbulo rojo, un linfocito B, un linfocito T, una célula asesina natural, un neutrófilo, un basófilo, un eosinófilo, un monocito, un macrófago o una plaqueta. En general, puede usarse cualquier tipo de célula madre incluyendo, sin limitación, una célula madre embrionaria, una célula madre adulta o una célula madre pluripotente.

[0182] Una muestra de ácido polinucleico puede procesarse para el aislamiento de ARN o ADN, por ejemplo, el ARN o el ADN en una muestra de células o tejido puede separarse de otros componentes de la muestra de ácido polinucleico. Las células se pueden recolectar de una muestra de ácido polinucleico usando técnicas estándar, por ejemplo, centrifugando una muestra de células y resuspendiendo las células sedimentadas, por ejemplo, en una solución tamponada, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de centrifugar la suspensión celular para obtener un sedimento celular, las células pueden lisarse para extraer el ADN. La muestra de ácido nucleico se puede concentrar y/o purificar para aislar el ADN. Todas las muestras de ácido nucleico obtenidas de un sujeto, incluidas aquellas sujetas a cualquier tipo de procesamiento adicional, se consideran obtenidas del sujeto. Se pueden usar técnicas estándar y kits conocidos en la técnica para extraer ARN o ADN de una muestra de ácido nucleico, que incluye, por ejemplo, extracción con fenol, un Kit para tejido QIAAMP<®>(Qiagen, Chatsworth, California), un Kit de purificación de ADN genómico WIZARD<®>(Promega) o un método Qiagen Autopure que utiliza la química Puregene, que puede permitir la purificación de ADN altamente estable adecuado para archivar.

[0184] Determinar la identidad de un alelo o determinar el número de copias puede, pero no necesariamente, incluir la obtención de una muestra de ácido polinucleico que comprende ARN y/o ADN de un sujeto, y/o evaluar la identidad, número de copias, presencia o ausencia de una o más variaciones genéticas y sus ubicaciones cromosómicas dentro del ADN genómico (por ejemplo, el genoma del sujeto) derivadas de la muestra de ácido polinucleico.

[0186] No es necesario que el individuo u organización que realiza la determinación realice realmente el análisis físico de una muestra de ácido nucleico de un sujeto. Los métodos pueden incluir el uso de información obtenida mediante el análisis de la muestra de ácido polinucleico por un tercero. Los métodos pueden incluir etapas que ocurren en más de un sitio. Por ejemplo, se puede obtener una muestra de ácido polinucleico de un sujeto en un primer sitio, tal como en un proveedor de atención médica o en el hogar del sujeto en el caso de un kit de autodiagnóstico. La muestra de ácido polinucleico se puede analizar en el mismo lugar o en un segundo lugar, por ejemplo, en un laboratorio u otra instalación de prueba.

[0188] Ácidos nucleicos

[0190] Los ácidos nucleicos y los polipéptidos descritos en el presente documento se pueden usar en métodos y kits de la presente divulgación. Los aptámeros que se unen específicamente a los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en el presente documento se pueden usar en métodos y kits de la presente divulgación. Como se usa en el presente documento, un ácido nucleico puede comprender un desoxirribonucleótido (ADN) o un ribonucleótido (ARN), ya sea singular o en polímeros, de origen natural o no natural, de cadena doble o sencilla, que codifica, por ejemplo, un gen traducido, o no codificante, por ejemplo, una región reguladora, o cualquier fragmento, derivado, mimético o complemento de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden comprender oligonucleótidos, nucleótidos, polinucleótidos, secuencias de ácidos nucleicos, secuencias genómicas, ADN complementario (ADNc), ácidos nucleicos antisentido, regiones de ADN, sondas, cebadores, genes, regiones reguladoras, intrones, exones, marcos de lectura abierta, sitios de unión, ácidos nucleicos objetivo y ácidos nucleicos específicos de alelo.

[0191] Una "sonda", como se usa en el presente documento, incluye un fragmento de ácido nucleico para examinar un ácido nucleico en un espécimen usando la reacción de hibridación basada en la complementariedad del ácido nucleico.

[0193] Un "híbrido" como se usa en el presente documento, incluye una doble cadena formada entre cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados anteriormente, dentro del mismo tipo o entre diferentes tipos, incluidos ADN-ADN, ADN-ARN, ARN-ARN o similares.

[0195] Los ácidos nucleicos "aislados", como se usa en este documento, se separan de los ácidos nucleicos que normalmente flanquean la secuencia del gen o del nucleótido (como en las secuencias genómicas) y/o se han purificado total o parcialmente de otras secuencias transcritas (p. ej., como en una biblioteca de ARN). Por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados de la divulgación pueden aislarse sustancialmente con respecto al medio celular complejo en el que se produce de forma natural, o medio de cultivo cuando se producen mediante técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. En algunos casos, el material aislado puede formar parte de una composición, por ejemplo, un extracto crudo que contiene otras sustancias, un sistema tampón o una mezcla de reactivos. El material se puede purificar hasta una homogeneidad esencial utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) o cromatografía en columna (por ejemplo, HPLC). Con respecto al ADN genómico (ADNg), el término "aislado" también puede referirse a ácidos nucleicos que se separan del cromosoma con el que se asocia de forma natural el ADN genómico. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 250 kb, 200 kb, 150 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 25 kb, 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de los nucleótidos que flanquean la molécula de ácido nucleico en el ADNg de la célula de la que se deriva la molécula de ácido nucleico.

[0197] Los ácidos nucleicos pueden fusionarse con otras secuencias codificantes o reguladoras y pueden considerarse aisladas. Por ejemplo, el ADN recombinante contenido en un vector se incluye en la definición de "aislado" como se usa en este documento. Los ácidos nucleicos aislados pueden incluir moléculas de ADN recombinante en células huésped heterólogas u organismos heterólogos, así como moléculas de ADN parcial o sustancialmente purificadas en solución. Los ácidos nucleicos aislados también abarcan transcripciones de ARNin vivoein vitrode las moléculas de ADN de la presente divulgación. Una molécula aislada de ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos puede sintetizarse químicamente o por medios recombinantes. Tales secuencias aisladas de nucleótidos pueden ser útiles, por ejemplo, en la fabricación del polipéptido codificado, como sondas para aislar secuencias homólogas (p. ej., de otras especies de mamíferos), para el mapeo de genes (p. ej., mediante hibridaciónin situcon cromosomas), o para detectar la expresión del gen, en tejido (p. ej., tejido humano), tal como mediante análisis de transferencia Northern u otras técnicas de hibridación divulgadas en el presente documento. La divulgación también se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, tal como para la hibridación selectiva, con una secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento. Dichas secuencias de ácidos nucleicos se pueden detectar y/o aislar mediante hibridación específica de alelo o secuencia (p. ej., en condiciones de alta rigurosidad). Las condiciones de rigurosidad y los métodos para las hibridaciones de ácidos nucleicos son bien conocidos por los expertos (véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., John Wiley & Sons, (1998), y Kraus, M. y Aaronson, S., Methods Enzymol., 200: 546-556 (1991).

[0199] Los cálculos de "identidad" o "porcentaje de identidad" entre dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos se pueden determinar alineando las secuencias para fines de comparación óptimos (p. ej., se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera secuencia). Luego se comparan los nucleótidos en las posiciones correspondientes y el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (p. ej., % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100). Por ejemplo, una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias.

[0201] La longitud de una secuencia alineada con fines comparativos puede ser de al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 % de la longitud de la secuencia de referencia. La comparación real de las dos secuencias se puede lograr mediante métodos bien conocidos, por ejemplo, utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo de dicho algoritmo matemático se describe en Karlin, S. y Altschul, S., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90-5873-5877 (1993). Tal algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0), como se describe en Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997). Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, se puede utilizar cualquier parámetro relevante de los respectivos programas (p. ej., NBLAST). Por ejemplo, los parámetros para la comparación de secuencias se pueden establecer en puntuación = 100, longitud de palabra = 12, o se pueden variar (por ejemplo, W = 5 o W = 20). Otros ejemplos incluyen el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989)), ADVANCE, ADAM, BLAT y FASTA. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede lograr usando, por ejemplo, el programa GAP en el paquete de software GCG (Accelrys, Cambridge, RU).

[0202] Las "sondas" o "cebadores" pueden ser oligonucleótidos que se hibridan de una manera específica de la base con una cadena complementaria de una molécula de ácido nucleico. Las sondas pueden incluir cebadores, que pueden ser una sonda de oligonucleótido monocatenario que puede actuar como un punto de inicio de la síntesis de ADN dirigida por molde utilizando métodos que incluyen, pero no se limitan a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (CSF) para amplificación de una secuencia objetivo. Los oligonucleótidos, como se describe en el presente documento, pueden incluir segmentos o fragmentos de secuencias de ácidos nucleicos, o sus complementos. Los segmentos de ADN pueden tener entre 5 y 10,000 bases contiguas, y pueden variar de 5, 10, 12, 15, 20 o 25 nucleótidos a 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1,000 o 10,000 nucleótidos. Además de ADN y ARN, las sondas y los cebadores pueden incluir ácidos nucleicos polipeptídicos (PNA), como se describe en Nielsen, P. et al., Science 254: 1497-1500 (1991). Una sonda o cebador puede comprender una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida con al menos aproximadamente 15, típicamente aproximadamente 20-25, y en ciertos casos aproximadamente 40, 50, 60 o 75, nucleótidos consecutivos de una molécula de ácido nucleico.

[0203] La presente divulgación también proporciona ácidos nucleicos aislados, por ejemplo, sondas o cebadores, que contienen un fragmento o una porción que puede hibridarse selectivamente con un ácido nucleico que comprende, o consiste en, una secuencia de nucleótidos, donde la secuencia de nucleótidos puede comprender al menos un polimorfismo o alelo polimórfico contenido en las variaciones genéticas descritas en este documento o el nucleótido de tipo silvestre que se encuentra en la misma posición, o los complementos del mismo. La sonda o el cebador pueden ser al menos un 70 % idénticos, al menos un 80 % idénticos, al menos un 85 % idénticos, al menos un 90 % idénticos o al menos un 95 % idénticos a la secuencia de nucleótidos contigua o al complemento de la secuencia de nucleótidos contigua.

[0204] Una sonda de ácido nucleico puede ser un oligonucleótido capaz de hibridarse con una región complementaria de un gen asociado con una afección (p. ej., PML) que contiene una variación genética descrita en el presente documento. Los fragmentos de ácido nucleico de la divulgación se pueden usar como sondas o cebadores en ensayos tales como los descritos en el presente documento.

[0205] Los ácidos nucleicos de la divulgación, tal como los descritos anteriormente, pueden identificarse y aislarse utilizando técnicas estándar de biología molecular bien conocidas por los expertos. El ADN puede amplificarse y/o puede marcarse (p. ej., radiomarcarse, marcarse con fluorescencia) y usarse como sonda para la detección, por ejemplo, una biblioteca de ADNc derivada de un organismo. El ADNc se puede derivar del ARNm y puede estar contenido en un vector adecuado. Por ejemplo, se pueden aislar los clones correspondientes, se puede obtener el ADN después de la escisiónin vivoy se puede secuenciar el inserto clonado en una o ambas orientaciones mediante métodos reconocidos en la técnica para identificar el marco de lectura correcto que codifica un polipéptido del peso molecular apropiado. Usando estos o métodos similares, el polipéptido y el ADN que codifica el polipéptido pueden aislarse, secuenciarse y caracterizarse adicionalmente.

[0206] El ácido nucleico puede comprender uno o más polimorfismos, variaciones o mutaciones, por ejemplo, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), variaciones de un solo nucleótido (SNV), variaciones del número de copias (CNV), por ejemplo, inserciones, eliminaciones, inversiones y translocaciones. Los ácidos nucleicos pueden comprender análogos, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonato de metilo, fosfonatos de metilo quiral, ribonucleótidos de 2-0-metilo o ácidos nucleicos modificados, por ejemplo, enlaces o residuos de la columna principal modificada, o ácidos nucleicos combinados con carbohidratos, lípidos, polipéptidos u otros materiales, o ácidos nucleicos peptídicos (PNA), por ejemplo, cromatina, ribosomas y transcriptosomas. Los ácidos nucleicos pueden comprender ácidos nucleicos en diversas estructuras, por ejemplo, ADN A, ADN B, ADN en forma de Z, ARNpi, ARNt y ribozimas. El ácido nucleico puede ser polimórfico natural o no natural, por ejemplo, tener una o más diferencias de secuencia, por ejemplo, adiciones, eliminaciones y/o sustituciones, en comparación con una secuencia de referencia. Una secuencia de referencia puede basarse en información disponible públicamente, por ejemplo, la U.C. Santa Cruz Human Genome Browser Gateway (genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) o el sitio web de la NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Un practicante de la presente divulgación puede determinar una secuencia de referencia utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la secuenciación de un ácido nucleico de referencia.

[0207] Una sonda puede hibridar con un alelo, SNP, SNV o CNV como se describe en este documento. La sonda puede unirse a otra secuencia marcadora asociada con PML como se describe en este documento.

[0208] Un experto en la técnica sabría cómo diseñar una sonda para que la hibridación específica de secuencia pueda ocurrir solo si un alelo particular está presente en una secuencia genómica de una muestra de ácido nucleico de prueba. La divulgación también puede reducirse a la práctica usando cualquier método de genotipado conveniente, incluidas las tecnologías y métodos disponibles comercialmente para genotipificar variaciones genéticas particulares.

[0209] También se pueden usar sondas de control, por ejemplo, una sonda que se une a una secuencia menos variable, por ejemplo, un ADN repetitivo asociado con un centrómero de un cromosoma, se puede usar como control. Las sondas se pueden obtener de fuentes comerciales. Las sondas pueden sintetizarse, por ejemplo, químicamente oin vitro, o fabricarse a partir de ADN cromosómico o genómico a través de técnicas estándar.

[0210] Las fuentes de ADN que se pueden usar pueden incluir ADN genómico, secuencias de ADN clonadas, híbridos de células somáticas que contienen un cromosoma humano, o parte de uno, junto con el complemento cromosómico normal del huésped, y cromosomas purificados por citometría de flujo o microdisección. La región de interés se puede aislar mediante clonación o mediante amplificación específica del sitio usando PCR.

[0211] También se pueden marcar uno o más ácidos nucleicos, por ejemplo, una sonda o un cebador, por ejemplo, mediante marcaje directo, para comprender una etiqueta detectable. Una etiqueta detectable puede comprender cualquier etiqueta capaz de ser detectada por un proceso físico, químico o biológico, por ejemplo, una etiqueta radiactiva, tal como<32>P o<3>H, una etiqueta fluorescente, tal como FITC, una etiqueta de cromóforo, una etiqueta de ligando de afinidad, una etiqueta de enzima, tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante o I2-galactosidasa, una etiqueta de cofactor enzimático, una etiqueta conjugada con hapteno, tal como digoxigenina o dinitrofenilo, una etiqueta de generación de señales Raman, una etiqueta magnético, una etiqueta de espín, una etiqueta de giro, tal como el epítopo FLAG o HA, una etiqueta luminiscente, una etiqueta de átomo pesado, una etiqueta de nanopartículas, una etiqueta electroquímica, una etiqueta de dispersión de luz, una etiqueta de capa esférica, una etiqueta de nanocristal semiconductor, tal como puntos cuánticos (descritos en la patente de los Estados Unidos Nº 6,207,392), y sondas etiquetadas con cualquier otra etiqueta generadora de señal conocida por los expertos en la técnica, en la que una etiqueta puede permitir visualizar la sonda con o sin una molécula de detección secundaria. Un nucleótido se puede incorporar directamente en una sonda con técnicas estándar, por ejemplo, traducción de muescas, cebado aleatorio y etiquetado por PCR. Una "señal", como se usa en el presente documento, incluye una señal detectable y medible adecuadamente por medios apropiados, que incluyen fluorescencia, radiactividad, quimioluminiscencia y similares.

[0213] Los ejemplos no limitantes de fracciones de etiquetas útiles para la detección incluyen, sin limitación, enzimas adecuadas tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; miembros de un par de unión que son capaces de formar complejos tales como estreptavidina/biotina, avidina/biotina o un complejo antígeno/anticuerpo que incluye, por ejemplo, IgG de conejo e IgG anti-conejo; fluoróforos tales como umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, tetrametil rodamina, eosina, proteína fluorescente verde, eritrosina, cumarina, metil cumarina, pireno, verde malaquita, estilbeno, amarillo lucifer, azul cascada, rojo Texas, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo, ficoeritrina, complejos de lantánido fluorescentes tal como los que incluyen europio y terbio, miembros de la familia de colorantes de cianina, tales como Cy3 y Cy5, balizas moleculares y derivados fluorescentes de los mismos, así como otros conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz (Editor), Plenum Pub Corp, 2ª edición (julio de 1999) y la sexta edición del Molecular Probes Handbook de Richard P. Hoagland; un material luminiscente tal como luminol; materiales de dispersión de luz o de resonancia de plasmón tales como partículas de oro o plata o puntos cuánticos; o material radiactivo incluido<14>C,<123>I,<124>I,<125>I, tc99m,<32>P,<33>P,<35>S o<3>H

[0215] También se pueden usar otras etiquetas en los métodos de la presente descripción, por ejemplo, etiquetas en la cadena principal. Las etiquetas de la cadena principal comprenden tinciones de ácidos nucleicos que se unen a los ácidos nucleicos de una manera independiente de la secuencia. Los ejemplos no limitantes incluyen tintes de intercalamiento tales como fenantridinas y acridinas (por ejemplo, bromuro de etidio, yoduro de propidio, yoduro de hexidio, dihidroetidio, homodímero 1 y 2 de etidio, monoazida de etidio y ACMA); algunos aglutinantes del surco menor tales como indoles e imidazoles (p. ej., Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 y DAPI); y diversas tinciones de ácidos nucleicos tales como naranja de acridina (también capaz de intercalarse), 7-AAD, actinomicina D, LDS751 e hidroxiestilbamidina. Todas las tinciones de ácido nucleico mencionadas anteriormente están disponibles comercialmente de proveedores tal como Molecular Probes, Inc. Otros ejemplos más de tinciones de ácido nucleico incluyen los siguientes tintes de Molecular Probes: tintes de cianina tales como SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, POPO-1, POPO-3, YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, JOJO-1, LOLO-1, BOBO-1, BOBO-3, PO-PRO-1, PO-PRO-3, BO -PRO-1, BO-PRO-3, TO-PRO-1, TO-PRO-3, TO-PRO-5, JO-PRO-1, LO-PRO-1, YO-PRO-1, YO-PRO -3, PicoGreen, OliGreen, RiboGreen, SYBR Gold, SYBR Green I, SYBR Green II, SYBRDX, SYTO-40, -41, -42, -43, -44, -45 (azul), SYTO-13, -16, -24, -21, -23, -12, -11, -20, -22, -15, -14, -25 (verde), SYTO-81, -80, -82, -83, -84, -85 (naranja), SYTO-64, -17, -59, -61, -62, -60, -63 (rojo).

[0217] Se pueden elegir fluoróforos de diferentes colores, por ejemplo, ácido 7-amino-4-metilcumarin-3-acético (AMCA), 5-(y-6)-carboxi-X-rodamina, lisamina rodamina B, 5-(y-6)-carboxifluoresceína, fluoresceína-5-isotiocianato (FITC), ácido 7-dietilaminocumarin-3-carboxílico, tetrametilrodamina-5-(y-6)-isotio- cianato, 5-(y-6)-carboxitetrametilrodamina, ácido 7-hidroxicumarin-3-carboxílico, ácido 6-[fluoresceín-5-(y-6)-carboxamido]hexanoico, ácido N-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4ª-diaza-3 indacenopropiónico, eosin-5-isotiocianato, eritrosin-5-isotiocianato, TRITC, rodamina, tetrametilrodamina, R-ficoeritrina, Cy-3, Cy-5, Cy-7, Texas Red, Phar-Red, aloficocianina (APC), y acetilazida azul CASCADE<tm>, de modo que cada sonda dentro o fuera de un conjunto se pueda visualizar claramente. Las sondas etiquetadas con fluorescencia se pueden observar con un microscopio de fluorescencia y un filtro apropiado para cada fluoróforo, o usando conjuntos de filtros de paso de banda doble o triple para observar múltiples fluoróforos. Se pueden usar técnicas tales como citometría de flujo para examinar el patrón de hibridación de las sondas.

[0218] Las sondas pueden etiquetarse indirectamente, por ejemplo, con biotina o digoxigenina, o etiquetarse con isótopos radiactivos tales como<32>P y/o<3>H. Como ejemplo no limitante, una sonda etiquetada indirectamente con biotina puede detectarse mediante avidina conjugada con una etiqueta detectable. Por ejemplo, la avidina se puede conjugar con una etiqueta enzimático tal como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante. Los etiquetadores enzimáticos pueden detectarse usando reacciones colorimétricas usando un sustrato y/o un catalizador para la enzima. Se pueden usar catalizadores para la fosfatasa alcalina, por ejemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y nitro azul de tetrazolio. Se puede usar un catalizador para la peroxidasa de rábano picante, por ejemplo, diaminobenzoato.

[0220] Uno o más genes divulgados en el presente documento pueden estar en condiciones o vías moleculares relacionadas con diversos aspectos de la función inmunitaria, incluyendo, pero sin limitarse a: a, la respuesta al interferón de tipo I (por ej., PMID 26052098), la vía del receptor de células B (p. ej,Wikipathways WP23; PMID 22566564), vía de señalización RANKL/RANK (p. ej,Wikipathways WP2018), vía de señalización TCR (p. ej., Wikipathways WP69), señalización NF-kB (p. ej, PMID 28362430), vía JAK-STAT(p. ej, PMID 28255960), biología de modificación postraduccional tal como la ubiquitinación a través de LUBAC(p. ej, síndrome de Aicardi-Goutieres(p. ej., PMID 26052098), eosinofilia(p. ej.,PMID 27222657), neutropenia congénita(p. ej.,PMID 24753205), defectos del receptor de células T(p. ej.,PMID 25452106, 25636200, 26246585, 26379669, 26453379, 28400082) y defectos de autofagia (p. ej.,19229298, 22984599, 23222957, 26917586, 26953272, 27588602). Uno o más genes divulgados en el presente documento pueden estar relacionados con la biología del virus de JC (p. ej.,PMID 15327898, 19282432, 19903823, 22984599, 25910481). Uno o más genes divulgados en el presente documento pueden ser genes de respuesta inmunitaria antiviral.

[0222] Tabla 27. Ejemplos de vías y biología para genes de riesgo de PML (panel de 96 genes)

[0224]

[0225]

[0228] 

[0229]

[0231] La Tabla 27 contiene un conjunto de ejemplos de vías y biología para los genes de riesgo de PML basados en el panel de 96 genes que se enumeran en Tabla 19. Los genes divulgados en este documento, tales como los genes en el panel de 96 genes, se pueden agrupar en función de la vía o los procesos biológicos en los que están involucrados.

[0232] Métodos de detección

[0233] La presente invención implica determinar la ausencia o presencia de una variación genómica seleccionada de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9:137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A. A continuación, se proporciona una explicación general de los métodos de detección que se pueden utilizar para determinar la presencia o ausencia de variaciones genómicas, e incluye ejemplos que no forman parte de lo reivindicado en el presente documento, en la medida en que se relacionen con variaciones distintas de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9: 137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A. G>A. Como se usa en el presente documento, examinar a un sujeto comprende diagnosticar o determinar, hacer teragnosis o determinar la susceptibilidad a desarrollar (pronosticar) una afección, por ejemplo, PML. La presencia de, o una susceptibilidad a, PML, puede determinarse detectando al menos una variación genética en una muestra de un sujeto como se describe en este documento. La detección de alelos, etiquetadores, variaciones o haplotipos particulares puede ser indicativa de la presencia o susceptibilidad a una afección (p. ej., PML).

[0235] Si bien existen medios para detectar la PML mediante una prueba de anticuerpos contra JCV, el riesgo de PML no se evalúa de manera adecuada solo con la prueba de anticuerpos contra JCV. Por lo tanto, existe la necesidad de una prueba de detección mejorada para evaluar el riesgo de desarrollar PML. En el presente documento se describen métodos para evaluar a un individuo en busca de riesgo de desarrollar PML, incluyendo, pero sin limitarse a, determinar la identidad y la ubicación de las variaciones genéticas, tal como las variaciones en la secuencia de nucleótidos y el número de copias, y la presencia o ausencia de alelos o genotipos en una o más muestras de uno o más sujetos usando cualquiera de los métodos descritos en este documento. La determinación de una asociación para tener o desarrollar PML se puede realizar detectando variaciones particulares que aparecen con más frecuencia en los sujetos de prueba en comparación con los sujetos de referencia y analizando las vías moleculares y fisiológicas que estas variaciones pueden afectar.

[0236] Dentro de cualquier población dada, puede haber una susceptibilidad absoluta de desarrollar una enfermedad o rasgo, definida como la posibilidad de que una persona desarrolle la enfermedad o rasgo específico durante un período de tiempo específico. La susceptibilidad (p. ej., estar en riesgo) generalmente se mide observando a un gran número de personas, en lugar de a un individuo en particular. Como se describe en el presente documento, ciertas variaciones del número de copias (variaciones genéticas) y/o variaciones de un solo nucleótido resultan útiles para la evaluación de la susceptibilidad de la PML. La evaluación de la susceptibilidad puede involucrar la detección de variaciones genéticas particulares en el genoma de los individuos sometidos a evaluación. Las variaciones genéticas particulares se encuentran con más frecuencia en individuos con PML que en individuos sin PML. Por lo tanto, estas variaciones genéticas tienen valor predictivo para detectar PML, o una susceptibilidad a PML, en un individuo. Sin pretender estar limitado por la teoría, se cree que las variaciones genéticas descritas en el presente documento que se asocian con la susceptibilidad a la PML representan variantes funcionales que predisponen a la enfermedad. Una variación genética puede conferir una susceptibilidad a la afección, por ejemplo, los portadores de la variación genética tienen un riesgo diferente de la afección que los no portadores. La presencia de tal variación genética puede ser indicativa de una mayor susceptibilidad a la PML.

[0238] La detección se puede realizar usando cualquiera de los métodos divulgados, solos o en combinación. La detección se puede realizar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La detección se puede realizar mediante hibridación genómica comparativa de matriz (aCGH) para detectar CNV. La detección se puede realizar utilizando la secuenciación del exoma para detectar SNV, indels y, en algunos casos, CNV utilizando algoritmos apropiados de análisis. La detección se puede realizar utilizando métodos de secuenciación del genoma completo de alto rendimiento (también conocidos como de próxima generación) y algoritmos apropiados para detectar todas o casi todas las variaciones genéticas presentes en una muestra de ADN genómico. La información sobre la variación genética en lo que se refiere a la divulgación actual se puede usar junto con cualquiera de las pruebas de detección sintomática mencionadas anteriormente para detectar la PML en un sujeto, por ejemplo, usando una combinación de aCGH y/o secuenciación con una prueba de detección de JCV, tal como la prueba de anticuerpos contra JCV, la prueba de CD62L o la prueba de banda oligoclonal de IgM de CSF. La selectina L (CD62L) expresada por células T CD3<+>CD4<+>, por ejemplo, en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) crioconservadas, pueden ser un biomarcador para la detección de JCV. Una expresión de CD62L se puede correlacionar con el riesgo de PML.

[0240] En el presente contexto, el término detección comprende diagnóstico, pronóstico y teragnosis. La detección puede referirse a cualquier método de detección disponible, incluidos los mencionados en este documento. Tal como se usa en el presente documento, la susceptibilidad puede ser la propensión de un sujeto a desarrollar PML, o a ser menos capaz de resistir la PML que uno o más sujetos de control. La susceptibilidad puede abarcar una mayor susceptibilidad. Por ejemplo, las variaciones particulares de ácido nucleico de la divulgación tal como se describe en el presente documento pueden ser características de una mayor susceptibilidad a la PML. Las variaciones particulares de ácidos nucleicos pueden conferir una menor susceptibilidad, por ejemplo, las variaciones particulares de ácidos nucleicos de la divulgación tal como se describe en el presente documento pueden ser características de una menor susceptibilidad al desarrollo de PML.

[0242] Una variante genética asociada con PML se puede utilizar para predecir la susceptibilidad de la enfermedad para un genotipo dado. Para cualquier variación genética, puede haber uno o más genotipos posibles, por ejemplo, homocigoto para la variante de riesgo (p. ej., en trastornos autosómicos recesivos), heterocigoto y no portador de la variante de riesgo. Los trastornos autosómicos recesivos también pueden resultar de dos variantes genéticas distintas que afectan el mismo gen, de modo que el individuo es un heterocigoto compuesto (p. ej., el alelo materno contiene una mutación diferente que el alelo paterno). La heterocigosidad compuesta puede resultar de dos SNV diferentes, dos CNV diferentes, una SNV y una CNV, o cualquier combinación de dos variantes genéticas diferentes pero cada una presente en un alelo diferente para el gen. Para los genes ligados al cromosoma X, los hombres que poseen una copia de un gen que contiene una variante pueden verse afectados, mientras que las mujeres portadoras, que también poseen un gen de tipo silvestre, pueden no verse afectadas. La susceptibilidad asociada con variantes en múltiples loci se puede utilizar para estimar la susceptibilidad general. Para variantes genéticas múltiples, puede haber k (k = 3^n<∗>2^P) genotipos posibles; donde n puede ser el número de loci autosómicos y p puede ser el número de loci gonosómicos (cromosómicos sexuales). Los cálculos de evaluación de susceptibilidad general pueden suponer que las susceptibilidades relativas de diferentes variantes genéticas se multiplican, por ejemplo, la susceptibilidad general asociada con una combinación de genotipo particular puede ser el producto de los valores de susceptibilidad para el genotipo en cada locus. Si la susceptibilidad presentada es la susceptibilidad relativa para una persona, o un genotipo específico para una persona, en comparación con una población de referencia, entonces la susceptibilidad combinada puede ser el producto de los valores de susceptibilidad específicos del locus y puede corresponder a una estimación de susceptibilidad general en comparación con una población. Si la susceptibilidad de una persona se basa en una comparación con los no portadores del alelo de riesgo, entonces la susceptibilidad combinada puede corresponder a una estimación que compara a la persona con una combinación determinada de genotipos en todos los loci con un grupo de individuos que no portan variantes de riesgo en ninguno de esos loci. El grupo de no portadores de cualquier variante de riesgo puede tener la susceptibilidad estimada más baja y puede tener una susceptibilidad combinada, en comparación consigo mismo, por ejemplo, los no portadores, de 1.0, pero puede tener una susceptibilidad general, en comparación con la población, de menos de 1.0.

[0244] El riesgo general para múltiples variantes de riesgo se puede realizar utilizando una metodología estándar. Las variaciones genéticas descritas en este documento pueden formar la base del análisis de riesgo que combina otras variaciones genéticas conocidas por aumentar el riesgo de PML u otras variantes genéticas de riesgo de PML. Se puede utilizar una pluralidad de variantes (variaciones genéticas, alelos variantes y/o haplotipos) para la evaluación general del riesgo. Estas variantes se pueden seleccionar de las variaciones genéticas que se divulgan en el presente documento. Las variantes de la presente divulgación pueden ser útiles en combinación con otras variantes que se sabe que son útiles para detectar la susceptibilidad a la PML. En este documento, el estado del genotipo de una pluralidad de variaciones genéticas, etiquetadores y/o haplotipos se determina en un individuo, y el estado del individuo se compara con la frecuencia poblacional de las variantes asociadas, o la frecuencia de las variantes en sujetos clínicamente sanos tales como sujetos emparejados por edad y sexo.

[0246] Los análisis multivariados o los análisis de riesgo conjunto, incluido el uso de un modelo multiplicativo para la evaluación del riesgo general, pueden utilizarse posteriormente para determinar el riesgo general conferido en función del estado del genotipo en los múltiples loci. El uso de un modelo multiplicativo, por ejemplo, suponiendo que el riesgo de las variantes de riesgo individuales se multiplica para establecer el efecto general, permite un cálculo directo del riesgo general para múltiples etiquetadores. El modelo multiplicativo es un modelo parsimonioso que generalmente se ajusta razonablemente bien a los datos de rasgos complejos. Las desviaciones de la multiplicidad rara vez se han descrito en el contexto de variantes comunes para enfermedades comunes y, si se informan, generalmente solo son sugerentes, ya que se pueden requerir tamaños de muestra muy grandes para poder demostrar interacciones estadísticas entre loci. La evaluación del riesgo basada en dicho análisis puede utilizarse posteriormente en los métodos, usos y kits de la divulgación, como se describe en el presente documento.

[0248] La importancia del aumento o disminución de la susceptibilidad puede medirse mediante un porcentaje. Un aumento significativo de la susceptibilidad se puede medir como una susceptibilidad relativa de al menos 1.2, incluyendo, pero sin limitarse a: al menos 1.3, al menos 1.4, al menos 1.5, al menos 1.6, al menos 1.7, al menos 1.8, al menos 1.9, al menos 2.0, al menos 2.5, al menos 3.0, al menos 4.0, al menos 5.0, al menos 6.0, al menos 7.0, al menos 8.0, al menos 9.0, al menos 10.0 y al menos 15.0. Una susceptibilidad relativa de al menos 2.0, al menos 3.0, al menos 4.0, al menos 5.0, al menos 6.0 o al menos 10.0 puede ser significativa. También se contemplan otros valores para una susceptibilidad significativa, por ejemplo, al menos 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, o cualquier otro valor numérico adecuado, en el que los valores también están dentro del alcance de la presente divulgación. Un aumento significativo en la susceptibilidad puede ser de al menos aproximadamente el 20 %, incluyendo, pero sin limitarse a: aproximadamente el 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 % y 1500 %. Un aumento significativo en la susceptibilidad puede ser de al menos 100 %. Un aumento significativo en la susceptibilidad puede ser de al menos 200 %, al menos 300 %, al menos 400 %, al menos 500 %, al menos 700 %, al menos 800 %, al menos 900 % y al menos 1000 %. También se contemplan otros cortes o intervalos que el experto en la materia considere adecuados para caracterizar la divulgación, y estos también están dentro del alcance de la presente divulgación. Un aumento significativo en la susceptibilidad se puede caracterizar por un valor p, tal como un valor p de menos de 0.5, menos de 0.4, menos de 0.3, menos de 0.2, menos de 0.1, menos de 0.05, menos de 0.01, menos de 0.001, menos de 0.0001, menos de 0.00001, menos de 0.000001, menos de 0.0000001, menos de 0.00000001 o menos de 0.000000001.

[0250] La importancia de la susceptibilidad aumentada o disminuida se puede determinar de acuerdo con la proporción de mediciones de un sujeto de prueba a un sujeto de referencia. Las pérdidas o ganancias de una o más CNV se pueden determinar de acuerdo con una de umbral determinada por estas medidas. Un valor de relación log2 superior a 0.35, o 0.5, puede ser indicativo de una ganancia de uno o más CNV. Un valor de relación log2 inferior a -0.35, o -0.5, es indicativo de una pérdida de uno o más CNV. La relación de mediciones de un sujeto de prueba a un sujeto de referencia puede invertirse de modo que las relaciones log2 de las ganancias del número de copias sean negativas y las relaciones log2 de las pérdidas del número de copias sean positivas.

[0251] También se puede evaluar la susceptibilidad combinada o global asociada con una pluralidad de variantes asociadas con PML; por ejemplo, las variaciones genéticas descritas en este documento que se asocian con la susceptibilidad a PML se pueden combinar con otros factores de riesgo genéticos comunes. El riesgo combinado de tales variantes genéticas se puede estimar de manera análoga a los métodos descritos en este documento.

[0253] El cálculo del riesgo conferido por un genotipo particular para el individuo puede basarse en la comparación del genotipo del individuo con el riesgo previamente determinado expresado, por ejemplo, como un riesgo relativo (RR) o una razón de posibilidades (OR), para el genotipo, por ejemplo, para un portador heterocigoto de una variante de riesgo de PML. Una razón de probabilidades puede ser una medida estadística utilizada como métrica de causalidad. Por ejemplo, en la investigación de enfermedades genéticas se puede utilizar para transmitir la importancia de una variante en una cohorte de enfermedades en relación con una cohorte no afectada/normal. El riesgo calculado para el individuo puede ser el riesgo relativo para un sujeto, o para un genotipo específico de un sujeto, en comparación con la población promedio. El riesgo promedio de la población se puede expresar como un promedio ponderado de los riesgos de diferentes genotipos, utilizando los resultados de una población de referencia, y luego se pueden realizar los cálculos apropiados para calcular el riesgo de un grupo de genotipos en relación con la población. Alternativamente, el riesgo para un individuo puede basarse en una comparación de genotipos particulares, por ejemplo, portadores heterocigotos y/u homocigotos de un alelo en riesgo de una etiqueta en comparación con no portadores del alelo en riesgo (o par de alelos en el caso de variantes heterocigotas compuestas, en las que una variante afecta al alelo heredado por vía materna y la otra afecta al alelo heredado por vía paterna). Usar el promedio de la población puede ser más conveniente, ya que proporciona una medida que puede ser fácil de interpretar para el usuario, por ejemplo, una medida que da el riesgo para el individuo, en función de su genotipo, en comparación con el promedio en la población.

[0255] El valor OR se puede calcular de la siguiente manera: OR = (A/(N1-A))/(U/(N2-U)), donde A = número de casos afectados con variante, N1 = número total de casos afectados, U = número de casos no afectados con variante y N2 = número total de casos no afectados. En circunstancias en las que U = 0, es convencional establecer U = 1, para evitar infinitos. El OR se puede calcular esencialmente como se indicó anteriormente, excepto que cuando U o A = 0, se suma 0.5 a todo A, N1, U, N2. La prueba exacta de Fisher (FET) se puede calcular utilizando métodos estándar. Los valores p se pueden corregir para la tasa de descubrimiento falso (FDR) utilizando el método de Benjamini-Hochberg (Benjamini Y. and Hochberg Y., J. Royal Statistical Society 57:289 (1995); Osborne JA and Barker CA (2007)).

[0257] Una variación genética se puede correlacionar con la PML haciendo referencia a los datos de variación genética en una tabla de búsqueda que comprende las correlaciones entre la variación genética y la PML. La variación genética puede comprender al menos una indicación de la variación genética. La tabla puede comprender una correlación para una variación genética. La tabla puede comprender una correlación para una pluralidad de variaciones genéticas en ambos escenarios, haciendo referencia a una tabla de búsqueda que da una indicación de una correlación entre una variación genética y PML, un riesgo de PML o una susceptibilidad a la PML, puede identificarse en el individuo del que se deriva la muestra de ácido nucleico.

[0259] La presente divulgación también se refiere a métodos de detección clínica, por ejemplo, diagnóstico, pronóstico o teragnosis de un sujeto realizado por un profesional médico utilizando los métodos divulgados en el presente documento. Los métodos de detección pueden ser realizados por un lego en la materia. El lego puede ser un cliente de un proveedor de servicios de genotipado, micromatrices, secuenciación del exoma o secuenciación del genoma completo. El lego también puede ser un proveedor de servicios de genotipo, micromatriz, secuenciación del exoma o secuenciación del genoma completo, que realiza un análisis genético en una muestra de ADN de un individuo, a fin de brindar un servicio relacionado con los factores de riesgo genéticos para rasgos o enfermedades particulares, con base en el estado del genotipo del sujeto obtenido a partir del uso de los métodos descritos en el presente documento. El genotipo o la información genética resultante se puede poner a disposición del individuo y se puede comparar con la información sobre la PML o el riesgo de desarrollar PML asociado con una o varias variaciones genéticas, incluyendo pero sin limitarse a, la información de bases de datos o literatura pública o privada sobre variaciones genéticas y publicaciones científicas. Las aplicaciones de detección de las variaciones genéticas asociadas a la PML, tal como se describen en el presente documento, pueden ser realizadas, por ejemplo, por una persona, un profesional sanitario o un tercero, por ejemplo, un proveedor de servicios que interprete la información del genotipo del sujeto. El análisis genético se puede realizar en un laboratorio certificado por CLIA (p. ej., los estándares regulatorios federales de EE. UU. que se especifican en las Enmiendas de mejora de laboratorios clínicos, administrados por los Centros de Servicios de Medicare y Medicaid) o laboratorios equivalentes en Europa y en otras partes del mundo.

[0261] La información derivada del análisis de los datos de la secuencia se puede comunicar a cualquier organismo en particular, incluido el individuo del que se deriva la muestra de ácido nucleico o los datos de la secuencia, un tutor o representante del individuo, un médico, un profesional de la investigación, un profesional médico, un proveedor de servicios y aseguradora médica o compañía de seguros. Los profesionales médicos pueden ser, por ejemplo, médicos, enfermeras, técnicos de laboratorio médico y farmacéuticos. Los profesionales de la investigación pueden ser, por ejemplo, investigadores principales, técnicos de investigación, becarios posdoctorales y estudiantes de posgrado.

[0263] Un profesional médico puede iniciar o modificar el tratamiento después de recibir información sobre la detección de PML de un sujeto, por ejemplo. Un profesional médico puede recomendar un cambio en la terapia o excluir una terapia. Un profesional médico puede inscribir a un sujeto en un ensayo clínico para, a modo de ejemplo, detectar correlaciones entre un haplotipo como se describe en este documento y cualquier parámetro medible o cuantificable relacionado con el resultado del tratamiento como se describió anteriormente.

[0265] Los resultados de estas pruebas y, opcionalmente, la información interpretativa, se pueden devolver al sujeto, al proveedor de atención médica o a un tercero. Los resultados se pueden comunicar al sujeto examinado, por ejemplo, con un pronóstico y, opcionalmente, materiales interpretativos que pueden ayudar al sujeto a comprender los resultados y el pronóstico de la prueba; utilizado por un proveedor de atención médica, por ejemplo, para determinar si administrar un fármaco específico, o si un sujeto debe ser asignado a una categoría específica, por ejemplo, una categoría asociada con un endofenotipo de enfermedad específico, o con respuesta o no respuesta al fármaco; utilizado por un tercero, como un pagador de atención médica, por ejemplo, una compañía de seguros o HMO, u otra agencia, para determinar si reembolsar o no a un proveedor de atención médica por los servicios prestados al sujeto, o si aprobar la prestación de servicios al sujeto. Por ejemplo, el pagador de atención médica puede decidir reembolsar a un proveedor de atención médica por tratamientos para PML si el sujeto tiene PML o tiene un mayor riesgo de desarrollar PML.

[0267] Métodos de detección utilizando variaciones en ARN y/o polipéptidos

[0269] La presente invención implica determinar la ausencia o presencia de una variación genómica seleccionada de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9:137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A. A continuación, se proporciona una explicación general de los métodos de detección que se pueden utilizar para determinar la presencia o ausencia de variaciones genómicas, e incluye ejemplos que no forman parte del objeto de la presente reivindicación, en la medida en que se relacionen con variaciones distintas de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9:137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A. La detección de la PML se puede realizar examinando o comparando los cambios en la expresión, la localización, las parejas de unión y la composición de un polipéptido codificado por una variante de ácido nucleico asociada con la PML, por ejemplo, en aquellos casos en los que las variaciones genéticas de la presente divulgación dan como resultado un cambio en la composición o expresión del polipéptido y/o ARN, por ejemplo, ARNm, microARN (miARN) y otros ARN no codificantes (ARNnc). Por lo tanto, la detección de PML se puede realizar examinando la expresión y/o composición de uno de estos polipéptidos y/o ARN, u otro polipéptido y/o ARN codificado por un ácido nucleico asociado con PML, en aquellos casos en los que la variación genética del la presente divulgación da como resultado un cambio en la expresión, localización, parejas de unión y/o composición del polipéptido y/o ARN. La detección puede comprender el diagnóstico de un sujeto. La detección puede comprender determinar un pronóstico de un sujeto, por ejemplo, determinar la susceptibilidad de desarrollar PML. La detección puede comprender hacer teragnosis a un sujeto.

[0271] Las variaciones genéticas descritas en este documento que muestran una asociación con la PML pueden desempeñar un papel a través de su efecto en uno o más de estos genes, ya sea impactando directamente en uno o más genes o influyendo en la expresión de uno o más genes cercanos. Por ejemplo, sin pretender limitarse a la teoría, por lo general se espera que una eliminación de un segmento cromosómico que comprende un gen en particular, o un fragmento de un gen, pueda dar como resultado una composición o expresión alterada, o ambas, del polipéptido codificado y/o ARNm. Del mismo modo, se espera que las duplicaciones, o las variaciones en el número de copias en un número alto, den como resultado una mayor expresión del polipéptido codificado y/o del ARN si el gen del que se expresan está completamente incluido dentro del segmento genómico duplicado (o triplicado, o incluso ganancias mayores del número de copias) o, por el contrario, puede dar como resultado una expresión disminuida o un ARN o polipéptido interrumpido si uno o ambos puntos de ruptura de la ganancia en el número de copias interrumpen un gen dado. Otros posibles mecanismos que afectan a los genes dentro de una región de variación genética incluyen, por ejemplo, efectos sobre la transcripción, efectos sobre el empalme del ARN, alteraciones en cantidades relativas de formas alternativas de empalme de ARNm, efectos sobre la estabilidad del ARN, efectos sobre el transporte del núcleo al citoplasma y efectos sobre la eficiencia y la precisión de la traducción. Por lo tanto, las variaciones de ADN pueden detectarse directamente, utilizando el ADN genómico amplificado o no amplificado del sujeto, o indirectamente, utilizando el ARN o el ADN obtenido del tejido o tejidos del sujeto que están presentes en una forma o nivel de expresión anómalos como resultado de las variaciones genéticas de la divulgación que muestra asociación con PML. Las variaciones de ADN pueden detectarse indirectamente usando un polipéptido o proteína obtenida del tejido o tejidos del sujeto que está presente en una forma o nivel de expresión anómala como resultado de variaciones genéticas de la divulgación que muestran asociación con la PML. Una forma o nivel de expresión anómala de un polipéptido o proteína que resulte de una o más variaciones genéticas de la divulgación que muestren asociación con PML puede detectarse indirectamente a través de otro polipéptido o proteína presente en la misma vía biológica/celular que se modula o interactúa con dicho polipéptido o proteína que resulta de una o más variaciones genéticas de la divulgación. Las variaciones genéticas de la divulgación que muestran asociación con la PML pueden afectar la expresión de un gen dentro de la región de variación genética. Una variación genética que afecta una región exónica de un gen puede afectar, interrumpir o modular la expresión del gen. Una variación genética que afecta una región intrónica o intergénica de un gen puede afectar, interrumpir o modular la expresión del gen.

[0273] Ciertas regiones de variación genética pueden tener segmentos duplicados flanqueantes, y los genes dentro de dichos segmentos pueden tener una expresión y/o composición alterada como resultado de dichas alteraciones genómicas. Los elementos reguladores que afectan a la expresión génica pueden estar situados lejos, incluso a decenas o cientos de kilobases, del gen que está regulado por dichos elementos reguladores. Por lo tanto, los elementos reguladores de los genes que están ubicados fuera del gen (por ejemplo, secuencia arriba o secuencia abajo del gen) pueden ubicarse dentro de la variación genética y, por lo tanto, verse afectados por la variación genética. Por lo tanto, se contempla que la detección de las variaciones genéticas descritas en el presente documento se puede usar para evaluar la expresión de uno o más genes asociados que no están directamente afectados por las variaciones genéticas. Una variación genética que afecta a una región intergénica de un gen puede afectar, interrumpir o modular la expresión de un gen ubicado en otra parte del genoma, tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, una variación genética que afecta una región intergénica de un gen puede afectar, interrumpir o modular la expresión de un factor de transcripción, ubicado en otra parte del genoma, que regula el gen. Los elementos reguladores también se pueden ubicar dentro de un gen, tal como dentro de las regiones intrónicas, e impactar de manera similar en el nivel de expresión del gen y, en última instancia, en el nivel de expresión de la proteína sin cambiar la estructura de la proteína. Los efectos de las variantes genéticas sobre los elementos reguladores pueden manifestarse de manera específica en el tejido; por ejemplo, uno o más factores de transcripción que se unen al elemento regulador que se ve afectado por una o más variaciones genéticas pueden expresarse en mayor concentración en las neuronas en comparación con las células de la piel (p. ej., el impacto de una o más variaciones genéticas puede ser principalmente evidente en las células neuronales).

[0275] Las variaciones genéticas de la divulgación que muestran asociación con PML pueden afectar la expresión de la proteína a nivel de traducción. Los expertos en la técnica pueden apreciar que esto puede ocurrir por el aumento o la disminución de la expresión de uno o más microARN (miARN) que regulan la expresión de una proteína que se sabe que es importante o está implicada en la causa, el inicio o la progresión de PML. El aumento o disminución de la expresión de uno o más miARN puede resultar de la ganancia o pérdida de todo el gen del miARN, la interrupción o el deterioro de una porción del gen (p. ej., por un indel o CNV), o incluso un cambio de una sola base (SNP o SNV) que produce una secuencia de miARN alterada, no funcional o de funcionamiento anómalo. Los expertos en la técnica también pueden apreciar que la expresión de una proteína, por ejemplo, una que se sabe que causa PML por aumento o disminución de la expresión, puede resultar debido a una variación genética que da como resultado la alteración de un sitio de unión de miARN existente dentro del transcrito de ARNm del polipéptido, o incluso crea un nuevo sitio de unión de miARN que conduce a una expresión anómala del polipéptido.

[0277] Se puede usar una variedad de métodos para detectar la composición polipeptídica y/o los niveles de expresión, incluyendo, pero sin limitarse a: ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, espectroscopia, espectrometría de masas, matrices de péptidos, colorimetría, electroforesis, enfoque isoeléctrico, inmunoprecipitaciones, inmunoensayos e inmunofluorescencia y otros métodos bien conocidos en la técnica. Se puede evaluar una muestra de ácido nucleico de prueba de un sujeto para determinar la presencia de una alteración en la expresión y/o una alteración en la composición del polipéptido codificado por un ácido nucleico asociado con PML. Una "alteración" en la expresión o composición del polipéptido, como se usa en el presente documento, se refiere a una alteración en la expresión o composición en una muestra de ácido nucleico de prueba, en comparación con la expresión o composición del polipéptido en una muestra de ácido nucleico de control. Dicha alteración puede ser, por ejemplo, una alteración en la expresión cuantitativa del polipéptido o puede ser una alteración en la expresión cualitativa del polipéptido, por ejemplo, la expresión de un polipéptido mutante o de una variante de empalme diferente, o una combinación de los mismos. La detección de PML se puede realizar detectando una variante de empalme particular codificada por un ácido nucleico asociado con PML, o un patrón particular de variantes de empalme.

[0279] Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden estar etiquetados o no etiquetados. Puede usarse un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo. El término "etiquetado", con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende abarcar el etiquetado directo de la sonda o el anticuerpo mediante el acoplamiento de una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, así como el etiquetado indirecto de la sonda o el anticuerpo mediante la reactividad con otro reactivo que está directamente etiquetado como se ha descrito anteriormente en este documento. Otros ejemplos no limitantes de etiquetado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario etiquetado, por ejemplo, un anticuerpo secundario etiquetado con fluorescencia y el etiquetado final de una sonda de ADN con biotina de modo que pueda detectarse con estreptavidina etiquetada con fluorescencia.

[0281] Métodos de detección de variaciones genéticas

[0282] La presente invención implica determinar la ausencia o presencia de una variación genómica seleccionada de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9:137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A. A continuación, se proporciona una explicación general de los métodos que se pueden usar para determinar la presencia o ausencia de variaciones genómicas, e incluye ejemplos que no forman parte del objeto que se reivindica en el presente documento, en la medida en que se relacionen con variaciones distintas de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9: 137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A. Pueden usarse técnicas estándar para el genotipado de la presencia de variaciones genéticas, por ejemplo, amplificación. La amplificación de ácidos nucleicos se puede lograr utilizando métodos conocidos en la técnica. En general, la información de la secuencia de la región de interés puede usarse para diseñar cebadores de oligonucleótidos que pueden ser idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas de un molde que se va a amplificar. Los métodos de amplificación pueden incluir, pero no se limitan a, técnicas basadas en fluorescencia que utilizan PCR, por ejemplo, reacción en cadena de ligasa (CSF), PCR anidada, amplificación de transcripción, replicación de secuencia autosostenida, amplificación de secuencia basada en ácido nucleico (NASBA) y amplificación de sonda dependiente de ligadura múltiplex (MLPA). Las pautas para seleccionar cebadores para la amplificación por PCR son bien conocidas en la técnica. Se puede utilizar un programa informático para diseñar cebadores, por ejemplo, Oligo (National Biosciences, Inc., Plymouth Minn.), MacVector (Kodak/IBI) y el conjunto de programas de análisis de secuencias GCG.

[0284] Las metodologías comerciales disponibles para el genotipado, por ejemplo, el genotipado SNP, se pueden usar, pero no se limitan a, ensayos de genotipado TaqMan (Applied Biosystems), plataformas SNPlex (Applied Biosystems), electroforesis en gel, electroforesis capilar, cromatografía de exclusión por tamaño, espectrometría de masas, por ejemplo, sistema MassARRAY (Sequenom), métodos de minisecuenciación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, sistema Bio-Plex (BioRad), sistemas CEQ y SNPstream (Beckman), tecnología de hibridación de matriz, por ejemplo, Affymetrix GeneChip (Perlegen), BeadArray Technologies, por ejemplo, los ensayos Illumina GoldenGate e Infinium, la tecnología de etiquetas de matriz, la amplificación de sonda dependiente de la ligadura múltiplex (MLPA) y la tecnología de hibridación de fluorescencia basada en endonucleasas (ensayo Invader, ya sea utilizando ADN genómico no amplificado o amplificado, o ARN total no amplificado, o ADNc no amplificado o amplificado; Third Wave/Hologic). La PCR puede ser un procedimiento en el que el ácido nucleico objetivo se amplifica de manera similar a la descrita en la patente de los Estados Unidos Nº 4,683,195 y posteriores modificaciones del procedimiento allí descrito. La PCR puede incluir un ciclo de temperatura de tres fases de desnaturalización del ADN en cadenas sencillas, hibridación de los cebadores con las cadenas desnaturalizadas y extensión de los cebadores mediante una enzima ADN polimerasa termoestable. Este ciclo se puede repetir para que haya suficientes copias para ser detectadas y analizadas. La PCR cuantitativa en tiempo real se puede usar para determinar variaciones genéticas, donde la PCR cuantitativa puede permitir tanto la detección como la cuantificación de una secuencia de ADN en una muestra de ácido nucleico, por ejemplo, como un número absoluto de copias o como una cantidad relativa cuando se normaliza a la entrada de ADN u otros genes normalizadores. Los métodos de cuantificación pueden incluir el uso de colorantes fluorescentes que pueden intercalarse con ADN de doble cadena y sondas de oligonucleótidos de ADN modificadas que pueden emitir fluorescencia cuando se hibridan con un ADN complementario.

[0286] Se puede recolectar una muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto y se puede usar la PCR para amplificar un fragmento de ácido nucleico que comprende una o más variaciones genéticas que pueden ser indicativas de una susceptibilidad a la PML. La detección de variaciones genéticas se puede lograr mediante análisis de expresión, por ejemplo, mediante el uso de PCR cuantitativa. Esta técnica puede evaluar la presencia o ausencia de una alteración genética en la expresión o composición de uno o más polipéptidos o variantes de empalme codificados por un ácido nucleico asociado a la PML.

[0288] La muestra de ácido nucleico de un sujeto que contiene un SNP se puede amplificar mediante PCR antes de la detección con una sonda. El ADN amplificado puede servir como molde para una sonda de detección y/o una sonda potenciadora. La sonda de detección, la sonda potenciadora y/o los cebadores usados para la amplificación del molde por PCR pueden comprender el uso de bases modificadas, por ejemplo, A, T, C, G y U modificadas, en el que el uso de bases modificadas puede ser útil para ajustar la temperatura de fusión de la sonda de nucleótidos y/o el cebador al ADN molde. Se pueden usar bases modificadas en el diseño de la sonda de nucleótidos de detección. Cualquier base modificada conocida por el experto puede seleccionarse en estos métodos, y la selección de bases adecuadas está también dentro del alcance del experto con base en las enseñanzas del presente documento y las bases conocidas disponibles de fuentes comerciales como sabe el experto.

[0290] La identificación de variaciones genéticas se puede lograr utilizando métodos de hibridación. La presencia de un alelo marcador específico o un segmento genómico particular que comprende una variación genética, o representativa de una variación genética, puede indicarse mediante hibridación específica de secuencia de una sonda de ácido nucleico específica para el alelo particular o la variación genética en una muestra de ácido nucleico que ha sido o no amplificada pero los métodos descritos en este documento. La presencia de más de un alelo marcador específico o varias variaciones genéticas puede indicarse usando dos o más sondas de ácido nucleico específicas de secuencia, en el que cada una es específica para un alelo y/o variación genética particular.

[0291] La hibridación se puede realizar mediante métodos bien conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, técnicas de hibridación tales como hibridación fluorescentein situ(FISH), análisis Southern, análisis Northern o hibridaciónin situ. La hibridación puede referirse a una hibridación específica, en la que la hibridación se puede realizar sin desajustes. La hibridación específica, si está presente, puede estar usando métodos estándar. Si se produce una hibridación específica entre una sonda de ácido nucleico y el ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, la muestra de ácido nucleico puede contener una secuencia que puede ser complementaria a un nucleótido presente en la sonda de ácido nucleico. Si una sonda de ácido nucleico puede contener un alelo particular de una etiqueta polimórfico, o alelos particulares para una pluralidad de etiquetadores, la hibridación específica es indicativa de que el ácido nucleico es completamente complementario a la sonda de ácido nucleico, incluidos los alelos particulares en los etiquetadores polimórficos dentro de la sonda. Una sonda puede contener más de un alelo marcador de un haplotipo particular, por ejemplo, una sonda puede contener alelos complementarios a 2, 3, 4, 5 o todos los etiquetadores que componen un haplotipo particular. La detección de uno o más etiquetadores particulares del haplotipo en la muestra de ácido nucleico es indicativa de que la fuente de la muestra de ácido nucleico tiene el haplotipo particular.

[0292] Se pueden desarrollar condiciones y cebadores de PCR que amplifiquen un producto solo cuando está presente el alelo variante o solo cuando está presente el alelo de tipo silvestre, por ejemplo, PCR específica de alelo. Cuando se lleva a cabo una PCR específica de alelo, se puede emplear un método que utiliza una sonda de oligonucleótidos de detección que comprende una fracción o grupo fluorescente en su extremo terminal 3' y un inactivador en su extremo terminal 5' y un oligonucleótido potenciador (véase, p. ej., Kutyavin et al., Nucleic Acid Res.34: e128 (2006)).

[0293] Un cebador/sonda específico de alelo puede ser un oligonucleótido que es específico para un polimorfismo particular que se puede preparar usando métodos estándar. Las sondas de oligonucleótidos específicas de alelo pueden hibridarse específicamente con una región de ácido nucleico que contiene una variación genética. Las condiciones de hibridación pueden seleccionarse de manera que una sonda de ácido nucleico pueda unirse específicamente a la secuencia de interés, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico variante.

[0294] El análisis de digestión de restricción específico de alelo se puede usar para detectar la existencia de una variante polimórfica de un polimorfismo, si las variantes polimórficas alternativas del polimorfismo pueden dar como resultado la creación o eliminación de un sitio de restricción. Se pueden realizar digestiones de restricción específicas de alelo, por ejemplo, con la enzima de restricción particular que puede diferenciar los alelos. La PCR se puede usar para amplificar una región que comprende el sitio polimórfico y se puede realizar un análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción. Para variantes de secuencia que no alteran un sitio de restricción común, se pueden diseñar cebadores mutagénicos que pueden introducir uno o más sitios de restricción cuando está presente el alelo variante o cuando está presente el alelo de tipo silvestre.

[0295] La incorporación del terminador de colorante dirigida a el molde de polarización de fluorescencia (FP-TDI) se puede utilizar para determinar cuál de las múltiples variantes polimórficas de un polimorfismo puede estar presente en un sujeto. A diferencia del uso de sondas o cebadores específicos de alelo, este método puede emplear cebadores que pueden terminar adyacentes a un sitio polimórfico, de modo que la extensión del cebador por un solo nucleótido puede resultar en la incorporación de un nucleótido complementario a la variante polimórfica en el sitio polimórfico.

[0296] El ADN que contiene una porción amplificada se puede transferir por puntos usando métodos estándar y la transferencia se puede poner en contacto con la sonda de oligonucleótidos. Entonces puede detectarse la presencia de hibridación específica de la sonda con el ADN. Los métodos pueden incluir determinar el genotipo de un sujeto con respecto a ambas copias del sitio polimórfico presente en el genoma, donde si existen múltiples variantes polimórficas en un sitio, esto puede indicarse apropiadamente especificando qué variantes están presentes en un sujeto. Cualquiera de los medios de detección divulgados en el presente documento puede usarse para determinar el genotipo de un sujeto con respecto a una o ambas copias del polimorfismo presente en el genoma del sujeto.

[0297] Puede usarse una sonda de ácido nucleico peptídico (PNA) además de, o en lugar de, una sonda de ácido nucleico en los métodos descritos en el presente documento. Un PNA puede ser un imitador de ADN que tiene un esqueleto inorgánico similar a un péptido, por ejemplo, unidades de N-(2-aminoetil) glicina con una base orgánica (A, G, C, T o U) unida al nitrógeno de glicina a través de un enlazador carbonilo de metileno.

[0298] El análisis de secuencias de ácidos nucleicos también puede usarse para detectar variaciones genéticas, por ejemplo, las variaciones genéticas pueden detectarse secuenciando exones, intrones, secuencias 5' no traducidas o secuencias 3' no traducidas. Se pueden usar uno o más métodos de análisis de ácidos nucleicos que están disponibles para los expertos en la técnica para detectar variaciones genéticas, que incluyen, pero no se limitan a, secuenciación manual directa, secuenciación fluorescente automatizada, ensayos de polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP); electroforesis en gel desnaturalizante fijado (CDGE); electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), electroforesis en gel bidimensional (2DGE o TDGE); electroforesis en gel sensible a la conformación (CSGE); cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante (DHPLC), espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz infrarroja (IR-MALDI), análisis de cambio de movilidad, PCR cuantitativa en tiempo real, análisis de enzimas de restricción, análisis de heterodúplex; escisión de desajuste químico (CMC), ensayos de protección de RNasa, uso de polipéptidos que reconocen desajustes de nucleótidos, PCR específica de alelo, secuenciación de ADN de pirofosfato en tiempo real, amplificación de PCR en combinación con cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante (dHPLC) y combinaciones de dichos métodos.

[0300] La secuenciación se puede lograr a través de métodos de secuenciación clásicos de Sanger, que son conocidos en la técnica. La secuenciación se puede realizar utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento, algunos de los cuales permiten la detección de un nucleótido secuenciado inmediatamente después o tras su incorporación a una cadena en crecimiento, por ejemplo, la detección de la secuencia en tiempo real o sustancialmente en tiempo real. En algunos casos, la secuenciación de alto rendimiento genera al menos 1,000, al menos 5,000, al menos 10,000, al menos 20,000, al menos 30,000, al menos 40,000, al menos 50,000, al menos 100,000 o al menos 500,000 lecturas de secuencia por hora; siendo cada lectura de al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 120 o al menos 150 bases por lectura (o 500 – 1,000 bases por lectura para 454).

[0302] Los métodos de secuenciación de alto rendimiento pueden incluir, pero no se limitan a, secuenciación de firma masivamente paralela (MPSS, Lynx Therapeutics), secuenciación de Polony, pirosecuenciación 454, secuenciación de Illumina (Solexa), secuenciación de Illumina (Solexa) utilizando la preparación de la biblioteca 10X Genomics, secuenciación SOLiD, sobre secuenciación de semiconductores, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación de moléculas individuales Helioscopio<MC>, SMRT<MC>de una sola molécula, secuenciación en tiempo real de una sola molécula (RNAP), secuenciación de ADN de nanoporos y/o secuenciación por hibridación, por ejemplo, un método no enzimático que utiliza una micromatriz de ADN o secuenciación de microfluidos de Sanger.

[0304] La secuenciación de alto rendimiento puede implicar el uso de tecnología disponible por Helicos BioSciences Corporation (Cambridge, MA), tal como el método de secuenciación de molécula única por síntesis (SMSS). SMSS es único porque permite secuenciar el genoma humano completo en hasta 24 horas. Este método de secuenciación rápida también permite la detección de un SNP/nucleótido en una secuencia en tiempo real o sustancialmente en tiempo real. Finalmente, SMSS es poderoso porque, al igual que la tecnología MIP, no utiliza una etapa de preamplificación previo a la hibridación. SMSS no utiliza ninguna amplificación. SMSS se describe en las solicitudes de publicación de patente de los Estados Unidos Nos.20060024711; 20060024678; 20060012793; 20060012784; y 20050100932. La secuenciación de alto rendimiento puede implicar el uso de tecnología disponible por 454 Life Sciences, Inc. (una empresa de Roche, Branford, Conn.), tal como el dispositivo PicoTiterPlate, que incluye una placa de fibra óptica que transmite la señal quimioluminiscente generada por la reacción de secuenciación que se va a registrar por una cámara CCD en el instrumento. Este uso de fibra óptica permite la detección de un mínimo de 20 millones de pares de bases en 4.5 horas.

[0306] El ácido nucleico monocatenario amplificado por PCR puede hibridarse con un cebador e incubarse con una polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa, apirasa y los sustratos luciferina y adenosina 5' fosfosulfato. A continuación, se pueden añadir secuencialmente trifosfatos de desoxinucleótidos correspondientes a las bases A, C, G y T (U). La incorporación de una base puede ir acompañada de la liberación de pirofosfato, que puede convertirse en ATP mediante sulfurilasa, que puede impulsar la síntesis de oxiluciferina y la liberación de luz visible. Dado que la liberación de pirofosfato puede ser equimolar con el número de bases incorporadas, la luz emitida puede ser proporcional al número de nucleótidos que se agregan en cualquier etapa. El proceso puede repetirse hasta que se pueda determinar la secuencia completa. La pirosecuenciación se puede utilizar para analizar amplicones para determinar si hay puntos de ruptura presentes. La pirosecuenciación puede mapear secuencias circundantes como un control de calidad interno.

[0308] Los métodos de análisis de pirosecuenciación son conocidos en la técnica. El análisis de secuencias puede incluir una secuenciación de cuatro colores mediante un esquema de ligadura (ligadura degenerada), que implica la hibridación de un cebador de anclaje en una de cuatro posiciones. Luego se puede realizar una reacción de ligadura enzimática del cebador de anclaje a una población de nonámeros degenerados que se etiquetan con tintes fluorescentes. En cualquier ciclo dado, la población de nonámeros que se utiliza se puede estructurar de modo que la identidad de una de sus posiciones se pueda correlacionar con la identidad del fluoróforo unido a ese nonámero. En la medida en que la ligasa discrimine complementariamente en esa posición consultada, la señal fluorescente puede permitir la inferencia de la identidad de la base. Después de realizar la ligadura y la formación de imágenes de cuatro colores, el cebador de anclaje: los complejos de nonámero se pueden eliminar y comienza un nuevo ciclo. Los métodos para obtener imágenes de la información de la secuencia después de realizar la ligadura son conocidos en la técnica.

[0310] El análisis por digestión con enzimas de restricción se puede usar para detectar una variación genética particular si la variación genética da como resultado la creación o eliminación de uno o más sitios de restricción con respecto a una secuencia de referencia. Se puede realizar un análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), en el que el patrón de digestión del fragmento de ADN relevante indica la presencia o ausencia de la variación genética particular en la muestra de ácido nucleico.

[0311] Las matrices de sondas de oligonucleótidos que pueden ser complementarias a los segmentos de secuencia de ácido nucleico objetivo de un sujeto pueden usarse para identificar variaciones genéticas. Una matriz de sondas de oligonucleótidos puede comprender una matriz de oligonucleótidos, por ejemplo, una micromatriz. Se pueden usar matrices que incluyen un sustrato que tiene una pluralidad de áreas direccionables. Al menos un área de la pluralidad incluye una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia que comprende una variación genética y puede usarse para detectar la ausencia o presencia de la variación genética, por ejemplo, uno o más SNP, microsatélites o CNV, como se describe en este documento, para determinar o identificar un alelo o genotipo. Por ejemplo, la matriz puede incluir una o más sondas de ácido nucleico que pueden usarse para detectar una variación genética asociada con un gen y/o un producto génico. La matriz puede comprender además al menos un área que incluye una sonda de ácido nucleico que se puede usar para detectar específicamente otro marcador asociado con la PML como se describe en el presente documento.

[0313] La hibridación de micromatriz se puede realizar hibridando un ácido nucleico de interés, por ejemplo, un ácido nucleico que abarca una variación genética, con la matriz y detectando la hibridación usando sondas de ácido nucleico. El ácido nucleico de interés puede amplificarse antes de la hibridación. La hibridación y la detección se pueden llevar a cabo de acuerdo con los métodos estándar descritos en las solicitudes PCT publicadas: WO 92/10092 y WO 95/11995, y la patente de los Estados Unidos Nº 5,424,186. Por ejemplo, se puede escanear una matriz para determinar la posición en la matriz con la que se hibrida el ácido nucleico. Los datos de hibridación obtenidos del escaneo pueden ser, por ejemplo, en forma de intensidades de fluorescencia en función de la ubicación en la matriz.

[0315] Las matrices pueden formarse sobre sustratos fabricados con materiales tales como papel; vidrio; plástico, por ejemplo, polipropileno, nailon o poliestireno; poliacrilamida; nitrocelulosa; silicio; fibra óptica; o cualquier otro soporte sólido o semisólido adecuado; y puede configurarse en forma plana, por ejemplo, placas de vidrio o chips de silicio); o configuración tridimensional, por ejemplo, pines, fibras, perlas, partículas, pocillos de microtitulación y capilares.

[0317] Los métodos para generar matrices son conocidos en la técnica y pueden incluir, por ejemplo; métodos fotolitográficos (patentes de los Estados Unidos Nos.5,143,854, 5,510,270 y 5,527,681); métodos mecánicos, por ejemplo, métodos de flujo dirigido (patente de los Estados Unidos No. 5,384,261); métodos basados en pines (patente de los Estados Unidos No.5,288,514); técnicas basadas en perlas (PCT US/93/04145); métodos de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida; o por otros métodos conocidos por un experto en la materia (véase, p. ej., Bier, FF, et al., Adv Biochem Eng Biotechnol 109: 433-53 (2008); Hoheisel, JD, Nat Rev. Genet 7: 200-10 (2006); Fan, JB, et al., Methods Enzymol 410: 57-73 (2006); Raqoussis, J. & Elvidge, G., Expert Rev Mol Design 6: 145-52 (2006); Mockler, TC, et al., Genomics 85: 1-15 (2005), y las referencias citadas allí). Se pueden encontrar muchas descripciones adicionales de la preparación y el uso de matrices de oligonucleótidos para la detección de polimorfismos, por ejemplo, en los documentos US 6,858,394, US 6,429,027, US 5,445,934, US 5,700,637, US 5,744,305, US 5,945,334, US 6,054,270, US 6,300,063, US 6,733,977, US 7,364,858, EP 619,321, y EP 373,203. Los métodos para la producción, hibridación y análisis de matrices también se describen en Snijders et al., Nat. Genetics 29: 263-264 (2001); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4494-4499 (1999); Albertson et al., Breast Cancer Research and Treatment 78: 289-298 (2003); y Snijders et al., "BAC microarray based comparative genomic hybridization," en: Zhao et al., (eds), Bacterial Artificial Chromosomes: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press (2002).

[0319] Las sondas de oligonucleótidos que forman una matriz se pueden unir a un sustrato mediante varias técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, la síntesisin situ, por ejemplo, matrices de oligonucleótidos de alta densidad, usando técnicas fotolitográficas; manchado/impresión de densidad media a baja sobre vidrio, nailon o nitrocelulosa; por enmascaramiento; y por transferencia de puntos en una membrana de hibridación de nailon o nitrocelulosa. Los oligonucleótidos se pueden inmovilizar a través de un enlazador, incluyendo, pero sin limitarse a: enlace covalente, iónico o físico. Los enlazadores para inmovilizar ácidos nucleicos y polipéptidos, incluidos los enlazadores reversibles o escindibles, son conocidos en la técnica (patente de los Estados Unidos No.5,451,683 y el documento WO98/20019). Los oligonucleótidos se pueden inmovilizar de forma no covalente sobre un sustrato mediante hibridación con anclajes, por medio de perlas magnéticas, o en una fase fluida, por ejemplo, en pocillos o capilares.

[0321] Una matriz puede comprender sondas de hibridación de oligonucleótidos capaces de hibridarse específicamente con diferentes variaciones genéticas. Las matrices de oligonucleótidos pueden comprender una pluralidad de diferentes sondas de oligonucleótidos acopladas a una superficie de un sustrato en diferentes ubicaciones conocidas. Las sondas de oligonucleótidos pueden exhibir una unión diferencial o selectiva a sitios polimórficos, y un experto en la materia puede diseñarlas fácilmente, por ejemplo, un oligonucleótido que es perfectamente complementario a una secuencia que abarca un sitio polimórfico, por ejemplo, una secuencia que incluye el sitio polimórfico, dentro de él, o en un extremo, puede hibridar preferentemente con un ácido nucleico que comprende esa secuencia, a diferencia de un ácido nucleico que comprende una variante polimórfica alternativa.

[0322] Las matrices pueden incluir múltiples bloques de detección, por ejemplo, múltiples grupos de sondas diseñadas para la detección de polimorfismos particulares. Estas matrices se pueden utilizar para analizar múltiples polimorfismos diferentes. Los bloques de detección se pueden agrupar dentro de una sola matriz o en múltiples matrices separadas, en las que se pueden usar condiciones variables, por ejemplo, condiciones optimizadas para polimorfismos particulares, durante la hibridación. Las descripciones generales del uso de matrices de oligonucleótidos para la detección de polimorfismos se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,858,659 y 5,837,832. Además de las matrices de oligonucleótidos, se pueden utilizar matrices de ADNc.

[0324] Los ejemplos de métodos pueden incluir, pero no se limitan a, proporcionar una matriz como se describe en este documento; poner en contacto la matriz con una muestra de ácido nucleico y detectar la unión de un ácido nucleico de la muestra de ácido nucleico a la matriz. Tal método puede comprender la amplificación de ácido nucleico de la muestra de ácido nucleico, por ejemplo, una región asociada con PML o una región que incluye otra región asociada con PML. Los métodos descritos en este documento pueden incluir el uso de una matriz que puede identificar patrones de expresión diferenciales o números de copias de uno o más genes en muestras de ácido nucleico de individuos afectados y de control. Por ejemplo, se pueden usar matrices de sondas para una etiqueta descrito en el presente documento para identificar variaciones genéticas entre el ADN de un sujeto afectado y el ADN de control obtenido de un individuo que no tiene PML. Dado que los nucleótidos de la matriz pueden contener etiquetas de secuencia, sus posiciones en la matriz pueden conocerse con precisión en relación con la secuencia genómica.

[0326] Puede ser deseable emplear métodos que puedan detectar la presencia de múltiples variaciones genéticas, por ejemplo, variantes polimórficas en una pluralidad de sitios polimórficos, en paralelo o sustancialmente simultáneamente. Estos métodos pueden comprender matrices de oligonucleótidos y otros métodos, incluidos métodos en los que las reacciones, por ejemplo, amplificación e hibridación, se pueden realizar en recipientes individuales, por ejemplo, dentro de pocillos individuales de una placa de pocillos múltiples u otro recipiente.

[0327] La determinación de la identidad de una variación genética también puede incluir o consistir en revisar el historial médico de un sujeto, donde el historial médico incluye información sobre la identidad, el número de copias, la presencia o ausencia de uno o más alelos o SNP en el sujeto, por ejemplo, resultados de una prueba genética.

[0329] Los procesos extendidos de homocigosidad (ROH) pueden ser útiles para mapear genes de enfermedades recesivas en poblaciones exogámicas. Además, incluso en trastornos complejos, un gran número de individuos afectados pueden tener el mismo haplotipo en la región que rodea la mutación de la enfermedad. Por lo tanto, una variante patogénica rara y un haplotipo circundante pueden enriquecerse en frecuencia en un grupo de individuos afectados en comparación con la frecuencia de haplotipos en una cohorte de controles no afectados. Los haplotipos homocigotos (HH) que comparten varios individuos afectados pueden ser importantes para el descubrimiento de genes de enfermedades recesivas en una afección tal como la PML. El método tradicional de mapeo de homocigosidad se puede ampliar mediante el análisis del haplotipo dentro de las regiones ROH compartidas para identificar segmentos homocigotos de haplotipo idéntico que están presentes de forma única o con mayor frecuencia en los probandos de PML en comparación con los controles parentales. Estas regiones se denominan haplotipos homocigóticos de riesgo (rHH), que pueden contener variantes recesivas de baja frecuencia que contribuyen al riesgo de PML en un subconjunto de pacientes con PML.

[0331] Las variaciones genéticas también pueden identificarse utilizando cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse variaciones genéticas disponibles en bases de datos públicas, que pueden buscarse usando métodos y algoritmos personalizados o algoritmos conocidos en la técnica. Una secuencia de referencia puede ser, por ejemplo, la secuencia preliminar del genoma humano, disponible públicamente en varias bases de datos, o una secuencia depositada en una base de datos tal como el GenBank.

[0333] Una comparación de uno o más genomas en relación con uno o más genomas con CGH de matriz, o una variedad de otros métodos de detección de variaciones genéticas, puede revelar el conjunto de variaciones genéticas entre dos genomas, entre un genoma en comparación con múltiples genomas, o entre un conjunto de genomas en comparación con otro conjunto de genomas. Se puede realizar un experimento de CGH de matriz mediante la hibridación de un solo genoma de prueba contra una muestra de ácido nucleico agrupada de dos o más genomas, lo que puede resultar en la minimización de la detección de variantes de mayor frecuencia en el experimento. Un genoma de prueba se puede hibridar solo (p. ej., detección de un color) con una micromatriz, por ejemplo, utilizando métodos de genotipado de CGH de matriz o SNP, y se puede realizar la etapa de comparación con uno o más genomas de referenciain silicopara revelar el conjunto de variaciones genéticas en el genoma de prueba en relación con uno o más genomas de referencia. Un solo genoma de prueba se puede comparar con un solo genoma de referencia en un experimento de 2 colores en el que ambos genomas se hibridan conjuntamente con la micromatriz. Se puede analizar el genoma completo o el exoma completo de uno o más sujetos. La información de ácido nucleico puede haberse obtenido ya para el genoma completo o el exoma completo de uno o más individuos y la información de ácido nucleico se obtiene del análisisin silico.

[0334] Cualquiera de los polinucleótidos descritos, incluidos los polinucleótidos que comprenden una variación genética, puede fabricarse sintéticamente utilizando métodos conocidos en la técnica.

[0336] Natalizumab para uso en terapia

[0338] En un aspecto, la invención proporciona natalizumab para su uso en el tratamiento de una afección en un sujeto que necesita una terapia con medicamentos inmunosupresores. El natalizumab para uso de la presente invención implica determinar la ausencia de una variación genómica seleccionada de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9:137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A. La afección puede ser HIV/AIDS, cáncer o una enfermedad autoinmune. La afección puede ser PML. Por ejemplo, la afección puede ser esclerosis múltiple. El término "sujeto animal", como se usa en el presente documento, incluye humanos así como otros mamíferos. El término "tratar", como se usa en el presente documento, incluye lograr un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se entiende la erradicación o mejora de la infección viral subyacente (por ejemplo, HIV), cáncer o enfermedad autoinmune.

[0340] El natalizumab para uso puede ser para administración a un sujeto que actualmente está siendo tratado con un medicamento antirretroviral. El natalizumab para uso puede ser para administración a un sujeto que ha sido tratado previamente con un medicamento antirretroviral. El natalizumab para uso puede ser para administración a un sujeto que aún no ha sido tratado con un medicamento antirretroviral. El medicamento antirretroviral puede incluir, pero no se limita a, inhibidores de transcriptasa inversa nucleosídicos (NRTI), inhibidores de transcriptasa inversa no nucleosídicos (NNRTI), inhibidores de proteasa (PI), inhibidores de fusión, inhibidores de entrada, inhibidores de integrasa, potenciadores farmacocinéticos y medicamentos combinados contra el HIV. En algunos casos, los inhibidores de transcriptasa inversa nucleosídicos pueden incluir, pero no se limitan a, abacavir, didanosina, emtricitabina, lamivudina, estavudina, tenofovir disoproxil fumarato y zidovudina. En algunos casos, los inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosídicos pueden incluir, pero no se limitan a, efavirenz, etravirina, nevirapina y rilpivirina. En algunos casos, los inhibidores de la proteasa pueden incluir, pero no se limitan a, atazanavir, darunavir, fosamprenavir, indinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir y tipranavir. En algunos casos, los inhibidores de fusión pueden incluir, pero no se limitan a, enfuvirtida. En algunos casos, los inhibidores de entrada pueden incluir, pero no se limitan a, maraviroc. En algunos casos, los inhibidores de la integrasa pueden incluir, pero no se limitan a, dolutegravir, elvitegravir y raltegravir. En algunos casos, los potenciadores farmacocinéticos pueden incluir, pero no se limitan a, cobicistat. En algunos casos, los medicamentos combinados contra el HIV pueden incluir, pero no se limitan a, abacavir y lamivudina, abacavir, dolutegravir y lamivudina, abacavir, lamivudina y zidovudina, atazanavir y cobicistat, darunavir y cobicistat, efavirenz, emtricitabina y tenofovir disoproxil fumarato, elvitegravir, cobicistat, emtricitabina y tenofovir alafenamida fumarato, elvitegravir, cobicistat, emtricitabina, y tenofovir disoproxil fumarato, emtricitabina, rilpivirina, y tenofovir alafenamida, emtricitabina, rilpivirina, y tenofovir disoproxil fumarato, emtricitabina y tenofovir, alafenamida, emtricitabina, y tenofovir disoproxil fumarato, lamivudina y zidovudina, lopinavir y ritonavir, y cualquier combinación de medicamentos antirretrovirales mencionados anteriormente.

[0342] Cuando se identifica que un sujeto tiene al menos una de las variantes genéticas descritas en el presente documento, el natalizumab a utilizar puede ser para administrarlo al sujeto con un agente que se dirige al virus de JC. El natalizumab para usar puede ser para administrar a un sujeto con un medicamento que previene el desarrollo de PML, o puede reducir, disminuir, acortar y/o mejorar de otro modo la progresión de la PML, o los síntomas que se desarrollan. Dicho medicamento puede modular o dirigirse al virus de JC. El natalizumab para uso puede ser para administración a un sujeto identificado con PML con un agente que reduce la carga viral en el sujeto. El natalizumab para uso puede ser para administración antes de, o junto con, un agente que reduce la carga viral en el sujeto. El natalizumab para uso puede ser para administración a un sujeto identificado con riesgo de desarrollar PML con un agente que evita un aumento en la carga viral en el sujeto. El natalizumab para uso puede ser para administración a un sujeto identificado por tener un alto riesgo de desarrollar PML con un agente que evita un aumento en la carga viral en el sujeto. El natalizumab para uso puede ser para administración antes de, o junto con, un agente que previene un aumento en la carga viral en el sujeto. El agente que reduce la carga viral en el sujeto o que evita un aumento de la carga viral en el sujeto puede ser, por ejemplo, un agente que se dirige al virus de JC. Los ejemplos de agentes incluyen anticuerpos, tales como anticuerpos de JCV ampliamente neutralizantes. Por ejemplo, un agente puede ser un anticuerpo específico de VP-1 del poliomavirus de JC monoclonal humano ampliamente neutralizante (véase, p. ej., Jelcic et al., Science Translational Medicine, vol.7, Número 306, págs.306ra150 (2015) y Ray et al., Science Translational Medicine, vol. 7, número 306, págs. 306ra151 (2015)). Ejemplos de agentes adicionales incluyen agentes antirretrovirales, cidofovir, hexadeciloxipropil-cidofovir (un derivado de éster de lípido), citarabina (p. ej., arabinósido de citosina), agentes que bloquean el receptor 5HT2a (p. ej., olanzapina, zisprasidona, mirtazapina, ciproheptadina y risperidona), inhibidores de topoisomerasa (p. ej., topotecano) y mefloquina.

[0344] El natalizumab para uso puede ser para administración a un sujeto en riesgo de desarrollar PML, o a un sujeto que informa uno o más de los síntomas fisiológicos de PML, aunque no se haya realizado una detección de la afección.

[0346] La presente divulgación también incluye kits que se pueden usar para tratar una afección en sujetos animales. Estos kits pueden comprender natalizumab y, opcionalmente, instrucciones que enseñan el uso del kit de acuerdo con los diversos métodos y enfoques descritos en este documento. Dichos kits también pueden incluir información, tal como referencias de literatura científica, materiales de prospecto, resultados de ensayos clínicos y/o resúmenes de estos y similares, que indican o establecen las actividades y/o ventajas (o riesgos y/o desventajas) del agente. Dicha información puede basarse en los resultados de varios estudios, por ejemplo, estudios que utilizan animales de experimentación que involucran modelosin vivoy estudios basados en ensayos clínicos en humanos. Los kits descritos en este documento se pueden proporcionar, comercializar y/o promocionar a proveedores de atención médica, incluidos médicos, enfermeras, farmacéuticos, funcionarios del formulario y similares.

[0347] Formulaciones, vías de administración y dosis eficaces

[0348] En un aspecto, la invención proporciona natalizumab para su uso en el tratamiento de una afección en un sujeto que necesita una terapia con medicamentos inmunosupresores. A continuación se proporciona una explicación general de las composiciones, formulaciones, vías de administración y dosis efectivas útiles para tal natalizumab para su uso, pero que no forman el objeto que se reivindica en el presente documento. Además, el natalizumab para uso de la presente invención implica determinar la ausencia de una variación genómica seleccionada de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9: 137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A. A continuación, se proporciona una explicación general de las variaciones y, por lo tanto, se incluyen ejemplos que no constituyen el objeto que se reivindica en este documento, en la medida en que se relacionen con variaciones distintas de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9: 137779251, G>A y chr1:160769595, AG >A. Otro aspecto más de la presente divulgación se refiere a formulaciones, vías de administración y dosis efectivas para composiciones farmacéuticas que comprenden un agente o una combinación de agentes de la presente divulgación. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden usar para tratar una afección (p. ej., esclerosis múltiple) como se describió anteriormente.

[0349] Los compuestos de la divulgación se pueden administrar como formulaciones farmacéuticas que incluyen aquellas adecuadas para administración oral (incluyendo bucal y sublingual), rectal, nasal, tópica, parche transdérmico, pulmonar, vaginal, supositorio o parenteral (incluyendo intramuscular, intraarterial, intratecal, intradérmica), intraperitoneal, subcutánea e intravenosa) o en una forma adecuada para la administración por aerosolización, inhalación o insuflación. Puede encontrarse información general sobre los sistemas de administración de medicamentos en Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999)).

[0350] La composición farmacéutica puede incluir vehículos y excipientes (incluyendo, pero sin limitarse a: a, tampones, carbohidratos, manitol, polipéptidos, aminoácidos, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes), agua, aceites, incluidos los del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, soluciones salinas, soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, agentes saborizantes, agentes colorantes, eliminadores de adhesión y otros aditivos, adyuvantes o aglutinantes aceptables, otras sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes reguladores del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes emulsionantes, agentes humectantes y similares. Los ejemplos de excipientes incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La preparación farmacéutica puede estar sustancialmente libre de conservantes. La preparación farmacéutica puede contener al menos un conservante. La metodología general sobre formas farmacéuticas se encuentra en Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott, Williams, & Wilkins, Baltimore Md. (1999)). Puede reconocerse que, aunque se puede emplear cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos en la técnica para administrar las composiciones de esta divulgación, el tipo de vehículo puede variar de acuerdo con el modo de administración.

[0351] Los compuestos también se pueden encapsular dentro de liposomas usando tecnología bien conocida. Las microesferas biodegradables también se pueden emplear como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta divulgación. Las microesferas biodegradables adecuadas se divulgan, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,897,268, 5,075,109, 5,928,647, 5,811,128, 5,820,883, 5,853,763, 5,814,344 y 5,942,252.

[0352] El compuesto se puede administrar en liposomas o microesferas (o micropartículas). Los métodos para preparar liposomas y microesferas para la administración a un sujeto son bien conocidos por los expertos en la técnica. La patente de los Estados Unidos No. 4,789,734 describe métodos para encapsular materiales biológicos en liposomas. Esencialmente, el material se disuelve en una solución acuosa, se añaden los fosfolípidos y lípidos apropiados, y junto con los tensioactivos si se requiere, y el material se dializa o somete a ultrasonido, según sea necesario. Se proporciona una revisión de los métodos conocidos por G. Gregoriadis, Capítulo 14, "Liposomes", Drug Carriers in Biology and Medicine, pp.2. sup.87-341 (Academic Press, 1979). Las microesferas formadas por polímeros o polipéptidos son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden adaptarse para pasar a través del tracto gastrointestinal directamente al torrente sanguíneo.

[0353] Alternativamente, el compuesto puede incorporarse y las microesferas, o el compuesto de microesferas, implantarse para una liberación lenta durante un período de tiempo que oscila entre días y meses. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos.4,906,474, 4,925,673 y 3,625,214, y Jein, TIPS 19:155-157 (1998).

[0354] La concentración de fármaco se puede ajustar, el pH de la solución tamponada y la isotonicidad ajustada para que sea compatible con la inyección intravenosa, como es bien conocido en la técnica.

[0355] Los compuestos de la divulgación pueden formularse como una solución o suspensión estéril, en vehículos adecuados, bien conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas, o se pueden esterilizar por filtración. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración. Las formulaciones adecuadas y los vehículos adicionales se describen en Remington "The Science and Practice of Pharmacy" (vigésima edición, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MD).

[0356] Los agentes o sus sales farmacéuticamente aceptables se pueden proporcionar solos o en combinación con uno o más agentes o con una o más formas. Por ejemplo, una formulación puede comprender uno o más agentes en proporciones particulares, de acuerdo con las potencias relativas de cada agente y la indicación prevista. Por ejemplo, en composiciones para dirigirse a dos objetivos huésped diferentes, y donde las potencias son similares, se puede usar una proporción de agentes de aproximadamente 1:1. Las dos formas se pueden formular juntas, en la misma unidad de dosificación, por ejemplo, en una crema, supositorio, tableta, cápsula, aerosol o paquete de polvo para disolver en una bebida; o cada forma se puede formular en una unidad separada, por ejemplo, dos cremas, dos supositorios, dos tabletas, dos cápsulas, una tableta y un líquido para disolver la tableta, dos aerosoles o un paquete de polvo y un líquido para disolver el polvo, etc. El término "sal farmacéuticamente aceptable" significa aquellas sales que retienen la eficacia biológica y las propiedades de los agentes usados en la presente divulgación, y que no son indeseables desde el punto de vista biológico o de otro tipo.

[0357] Las sales típicas son aquellas de los iones inorgánicos, tales como, por ejemplo, iones de sodio, potasio, calcio, magnesio y similares. Tales sales incluyen sales con ácidos inorgánicos u orgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido ptoluenosulfónico, ácido acético, ácido fumárico, ácido succínico, ácido láctico, ácido mandélico, ácido málico, ácido cítrico, ácido tartárico o ácido maleico. Además, si el agente o agentes contienen un grupo carboxilo u otro grupo ácido, se puede convertir en una sal de adición farmacéuticamente aceptable con bases inorgánicas u orgánicas. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco, ciclohexilamina, diciclohexilamina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina y similares.

[0358] Un éster o amida farmacéuticamente aceptable se refiere a aquellos que retienen la eficacia biológica y las propiedades de los agentes usados en la presente divulgación, y que no son indeseables biológicamente o de otro modo. Los ésteres típicos incluyen etilo, metilo, isobutilo, etilenglicol y similares. Las amidas típicas incluyen amidas no sustituidas, alquilamidas, dialquilamidas y similares.

[0359] Un agente se puede administrar en combinación con uno o más compuestos, formas y/o agentes, por ejemplo, como se describió anteriormente. Las composiciones farmacéuticas con uno o más de otros agentes activos pueden formularse para comprender ciertas relaciones molares. Por ejemplo, pueden usarse relaciones molares de aproximadamente 99:1 a aproximadamente 1:99 de un primer agente activo al otro agente activo. El intervalo de relaciones molares de un primer agente activo: otros agentes activos pueden seleccionarse de aproximadamente 80:20 a aproximadamente 20:80; aproximadamente 75:25 a aproximadamente 25:75, aproximadamente 70:30 a aproximadamente 30:70, aproximadamente 66:33 a aproximadamente 33:66, aproximadamente 60:40 a aproximadamente 40:60; aproximadamente 50:50; y aproximadamente 90:10 a aproximadamente 10:90. La relación molar de un primer agente activo: otros agentes activos puede ser de aproximadamente 1:9 o puede ser de aproximadamente 1:1. Los dos agentes, formas y/o compuestos se pueden formular juntos, en la misma unidad de dosificación, por ejemplo, en una crema, supositorio, tableta, cápsula o paquete de polvo para disolver en una bebida; o cada agente, forma y/o compuesto se puede formular en unidades separadas, por ejemplo, dos cremas, supositorios, tabletas, dos cápsulas, una tableta y un líquido para disolver la tableta, aerosol, un paquete de polvo y un líquido para disolución del polvo, etc.

[0360] Si es necesario o deseable, los agentes y/o combinaciones de agentes pueden administrarse con otros agentes más. La elección de los agentes que se pueden coadministrar con los agentes y/o combinaciones de agentes de la presente divulgación puede depender, al menos en parte, de la afección que se esté tratando. Los agentes de uso particular en las formulaciones de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, cualquier agente que tenga un efecto terapéutico para una infección viral, incluidos, por ejemplo, fármacos utilizados para tratar afecciones inflamatorias. Por ejemplo, en los tratamientos para la gripe, las formulaciones de la presente divulgación pueden contener además uno o más fármacos antiinflamatorios convencionales, tales como un NSAID, por ejemplo, ibuprofeno, naproxeno, acetaminofén, cetoprofeno o aspirina. O bien, para el tratamiento de la gripe, las formulaciones de la presente divulgación pueden contener adicionalmente uno o más agentes antivirales contra la gripe convencionales, tales como amantadina, rimantadina, zanamivir y oseltamivir. En tratamientos para infecciones retrovirales, tales como el HIV, las formulaciones de la presente divulgación pueden contener adicionalmente uno o más fármacos antivirales convencionales, tales como inhibidores de la proteasa (lopinavir/ritonavir {p. ej., KALETRA}, indinavir {p. ej., CRIXIVAN}, ritonavir {p. ej., NORVIR}, nelfinavir {p. ej., VIRACEPT}, cápsulas de gelatina dura de saquinavir {p. ej., INVIRASE}, atazanavir {p. ej., REYATAZ}, amprenavir {p. ej., AGENERASE}, fosamprenavir {p. ej., TELZIR}, tipranavir {p. ej., APTIVUS}), inhibidores de transcriptasa inversa, incluidos los inhibidores no nucleósidos y nucleósidos/nucleótidos (AZT {zidovudina, por ejemplo, Retrovir}, ddI {didanosina, por ejemplo, VIDEX}, 3TC {lamivudina, por ejemplo, EPIVIR}, d4T {estavudina, por ejemplo, ZERIT}, abacavir {p. ej., ZIAGEN}, FTC {emtricitabina, p. ej., EMTRIVA}, tenofovir {p. ej., VIREAD}, efavirenz {p. ej., SUSTIVA} y nevirapina {p. ej., VIRAMUNE}), inhibidores de fusión T20 {enfuvirtida, p. ej., FUZEON}, inhibidores de integrasa (Raltegravir, por ejemplo, ISENTRESS, MK-0518; y elvitegravir, por ejemplo, VITEKTA, GS-9137), e inhibidores de la maduración (bevirimat {PA-457}). Como otro ejemplo, las formulaciones pueden contener adicionalmente uno o más suplementos, tales como vitamina C, E u otros antioxidantes.

[0362] El agente o agentes (o sus sales, ésteres o amidas farmacéuticamente aceptables) pueden administrarse per se o en forma de una composición farmacéutica en la que el agente o agentes activos están mezclados con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Una composición farmacéutica, como se usa en el presente documento, puede ser cualquier composición preparada para la administración a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas para usar de acuerdo con la presente descripción se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables, que comprenden excipientes, diluyentes y/o auxiliares, por ejemplo, que facilitan el procesamiento de los agentes activos en preparaciones que se pueden administrar. La formulación adecuada puede depender al menos en parte de la vía de administración elegida. El agente o agentes útiles en la presente divulgación, o sus sales, ésteres o amidas farmacéuticamente aceptables, pueden administrarse a un sujeto mediante varias vías o modos de administración, que incluyen oral, bucal, tópica, rectal, transdérmica, transmucosa, aplicaciones subcutáneas, intravenosas e intramusculares, así como por inhalación.

[0364] Para la administración oral, los agentes pueden formularse fácilmente combinando el agente o agentes activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten que los agentes de la divulgación se formulen como tabletas, incluidas tabletas masticables, píldoras, grageas, cápsulas, pastillas, caramelos duros, líquidos, geles, jarabes, mezclas semilíquidas, polvos, suspensiones, elixires, obleas y similares, para ingestión oral por un sujeto a tratar. Dichas formulaciones pueden comprender vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyen diluyentes o rellenos sólidos, medios acuosos estériles y diversos disolventes orgánicos no tóxicos. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como diluyentes, agentes saborizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes de desintegración de tabletas o material de encapsulación. En polvos, el vehículo generalmente es un sólido finamente dividido que es una mezcla con el componente activo finamente dividido. En las tabletas, el componente activo generalmente se mezcla con el vehículo que tiene la capacidad de unión necesaria en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados. Los polvos y tabletas contienen preferiblemente de aproximadamente uno (1) a aproximadamente setenta (70) por ciento del compuesto activo. Los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. En general, los agentes de la divulgación pueden incluirse en niveles de concentración que oscilan entre aproximadamente 0.5 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 % o aproximadamente 30 % hasta aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 % o aproximadamente 90 % en peso de la composición total de formas de dosificación orales, en una cantidad suficiente para proporcionar una unidad de dosificación deseada.

[0366] Las suspensiones acuosas para uso oral pueden contener un agente o agentes de esta divulgación con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como un agente de suspensión (p. ej., metilcelulosa), un agente humectante (p. ej., lecitina, lisolecitina y/o un alcohol graso de cadena larga), así como agentes colorantes, conservantes, aromatizantes y similares.

[0368] Se pueden utilizar aceites o disolventes no acuosos para disolver los agentes debido, por ejemplo, a la presencia de grandes fracciones lipofílicas. Alternativamente, pueden usarse emulsiones, suspensiones u otras preparaciones, por ejemplo, preparaciones liposomales. Con respecto a las preparaciones liposomales, puede usarse cualquier método conocido para preparar liposomas para el tratamiento de una afección. Véase, por ejemplo, Bangham et al., J. Mol. Biol.23: 238-252 (1965) y Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194-4198 (1978). Los ligandos también se pueden unir a los liposomas para dirigir estas composiciones a sitios de acción particulares. Los agentes de esta divulgación también se pueden integrar en productos alimenticios, por ejemplo, queso crema, mantequilla, aderezos para ensaladas o helados para facilitar la solubilización, administración y/o cumplimiento en ciertas poblaciones de sujetos.

[0369] Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener como un excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; elementos saborizantes, preparados de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar o ácido algínico o una de sus sales, tal como alginato de sodio. Los agentes también se pueden formular como una preparación de liberación sostenida.

[0370] Los núcleos de grageas se pueden proporcionar con recubrimientos adecuados. Para ello se pueden utilizar soluciones concentradas de azúcar, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Se pueden agregar colorantes o pigmentos a las tabletas o recubrimientos de grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de agentes activos. Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los ingredientes activos mezclados con relleno tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los agentes activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden agregar estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para la administración.

[0371] Otras formas adecuadas para la administración oral incluyen preparaciones en forma líquida que incluyen emulsiones, jarabes, elixires, soluciones acuosas, suspensiones acuosas o preparaciones en forma sólida que están destinadas a convertirse poco antes de su uso en preparaciones en forma líquida. Las emulsiones se pueden preparar en soluciones, por ejemplo, en soluciones acuosas de propilenglicol o pueden contener agentes emulsionantes, por ejemplo, tales como lecitina, monooleato de sorbitán o goma arábiga. Las soluciones acuosas se pueden preparar disolviendo el componente activo en agua y agregando colorantes, sabores, estabilizadores y agentes espesantes adecuados. Las suspensiones acuosas se pueden preparar dispersando el componente activo finamente dividido en agua con material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y otros agentes de suspensión bien conocidos. Los rellenos o vehículos adecuados con los que se pueden administrar las composiciones incluyen agar, alcohol, grasas, lactosa, almidón, derivados de celulosa, polisacáridos, polivinilpirrolidona, sílice, solución salina estéril y similares, o mezclas de los mismos usados en cantidades adecuadas. Las preparaciones en forma sólida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones y pueden contener, además del componente activo, colorantes, sabores, estabilizantes, tampones, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares.

[0372] Se puede hacer un jarabe o suspensión añadiendo el compuesto activo a una solución acuosa concentrada de un azúcar, por ejemplo, sacarosa, a la que también se le puede añadir cualquier ingrediente accesorio. Dichos ingredientes accesorios pueden incluir saborizantes, un agente para retardar la cristalización del azúcar o un agente para aumentar la solubilidad de cualquier otro ingrediente, por ejemplo, como un alcohol polihídrico, por ejemplo, glicerol o sorbitol.

[0373] Cuando se formulan compuestos de la divulgación para administración oral, puede ser deseable utilizar formulaciones para mejorar la absorción desde el tracto gastrointestinal (GI). Una formulación que se retiene en el estómago durante varias horas puede liberar lentamente los compuestos de la divulgación y proporcionar una liberación sostenida que puede preferirse. La divulgación de dichas formulaciones que se retienen en el tracto gastrointestinal se encuentra en Klausner EA et al., Pharm. Res.20, 1466-73 (2003); Hoffman, A. et al., Int. J. Pharm.11, 141-53 (2004), Streubel, A., et al., Expert Opin. Drug Deliver 3, 217-3, y Chavanpatil, MD et al., Int. J. Pharm. (2006). Pueden utilizarse técnicas expandibles, flotantes y bioadhesivas para maximizar la absorción de los compuestos de la divulgación.

[0374] Los compuestos de la divulgación pueden formularse para administración parenteral (p. ej., mediante inyección, por ejemplo, inyección en bolo o infusión continua) y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en recipientes para múltiples dosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, por ejemplo, soluciones en polietilenglicol acuoso.

[0375] Para las formulaciones inyectables, el vehículo se puede elegir entre los conocidos en la técnica como adecuados, incluidas las soluciones acuosas o suspensiones oleosas, o emulsiones, con aceite de sésamo, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón o aceite de cacahuete, así como elixires, manitol, dextrosa, o una solución acuosa estéril, y vehículos farmacéuticos similares. La formulación también puede comprender composiciones poliméricas que sean biocompatibles, biodegradables, tales como ácido poli(láctico-co glicólico). Estos materiales pueden transformarse en micro o nanoesferas, cargarse con fármaco y recubrirse o derivatizarse para proporcionar un rendimiento superior de liberación sostenida. Los vehículos adecuados para inyección periocular o intraocular incluyen, por ejemplo, suspensiones de agente terapéutico en agua de calidad para inyección, liposomas y vehículos adecuados para sustancias lipófilas. Otros vehículos para inyección periocular o intraocular son bien conocidos en la técnica.

[0377] La composición se puede formular de acuerdo con los procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. En general, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, como una ampolla o un sobre, que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene solución salina o agua estéril de grado farmacéutico. Cuando la composición se administre por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se mezclen antes de la administración.

[0379] Cuando la administración es por inyección, el compuesto activo puede formularse en soluciones acuosas, concretamente en tampones fisiológicamente compatibles como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el compuesto activo puede estar en forma de polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. La composición farmacéutica puede no comprender un adyuvante o cualquier otra sustancia añadida para potenciar la respuesta inmunitaria estimulada por el péptido. La composición farmacéutica puede comprender una sustancia que inhibe una respuesta inmune al péptido. Los métodos de formulación son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se divulga en Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack Publishing Co., Easton P.

[0381] Además de las formulaciones descritas anteriormente, los agentes también se pueden formular como una preparación de depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación o administración transcutánea (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular), inyección intramuscular o uso de un parche transdérmico. Así, por ejemplo, los agentes pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

[0382] Las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más agentes de la presente divulgación pueden ejercer efectos locales y regionales cuando se administran tópicamente o se inyectan en o cerca de sitios particulares de infección. La aplicación tópica directa, por ejemplo, de un líquido viscoso, solución, suspensión, soluciones a base de dimetilsulfóxido (DMSO), formulaciones liposomales, gel, jalea, crema, loción, ungüento, supositorio, espuma o aerosol, puede usarse para la administración local, para producir, por ejemplo, efectos locales y/o regionales. Los vehículos farmacéuticamente apropiados para dicha formulación incluyen, por ejemplo, alcoholes alifáticos inferiores, poliglicoles (p. ej., glicerol o polietilenglicol), ésteres de ácidos grasos, aceites, grasas, siliconas y similares. Dichas preparaciones también pueden incluir conservantes (p. ej., ésteres de ácido p-hidroxibenzoico) y/o antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico y tocoferol). Véase también Dermatological Formulations: Percutaneous absorption, Barry (Ed.), Marcel Dekker Inc., 1983.

[0384] Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden contener un vehículo cosmético o dermatológicamente aceptable. Dichos vehículos son compatibles con la piel, las uñas, las membranas mucosas, los tejidos y/o el cabello, y pueden incluir cualquier vehículo cosmético o dermatológico utilizado convencionalmente que cumpla estos requisitos. Dichos vehículos pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la materia. Al formular ungüentos para la piel, un agente o una combinación de agentes de la presente divulgación se puede formular en una base de hidrocarburo oleaginoso, una base de absorción anhidra, una base de absorción de agua en aceite, una base de aceite en agua eliminable con agua y/o una base soluble en agua. Los ejemplos de dichos vehículos y excipientes incluyen, pero no se limitan a, humectantes (p. ej., urea), glicoles (p. ej., propilenglicol), alcoholes (p. ej., etanol), ácidos grasos (p. ej., ácido oleico), tensioactivos (p. ej., miristato de isopropilo y laurilsulfato de sodio), pirrolidonas, monolaurato de glicerol, sulfóxidos, terpenos (p. ej., mentol), aminas, amidas, alcanos, alcanoles, agua, carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.

[0386] Los ungüentos y las cremas se pueden formular, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones se pueden formular con una base acuosa u oleosa y, en general, también pueden contener uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes o agentes colorantes. La construcción y el uso de parches transdérmicos para la administración de agentes farmacéuticos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos.5,023,252, 4,992,445 y 5,001,139. Dichos parches se pueden construir para la administración continua, pulsátil o bajo demanda de agentes farmacéuticos.

[0388] Los lubricantes que se pueden usar para formar composiciones farmacéuticas y formas de dosificación de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, estearato de calcio, estearato de magnesio, aceite mineral, aceite mineral ligero, glicerina, sorbitol, manitol, polietilenglicol, otros glicoles, ácido esteárico, laurilsulfato de sodio, talco, aceite vegetal hidrogenado (p. ej., aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja), estearato de zinc, oleato de etilo, laureato de etilo, agar o mezclas de los mismos. Los lubricantes adicionales incluyen, por ejemplo, un gel de sílice siloide, un aerosol coagulado de sílice sintética o mezclas de los mismos. Se puede añadir opcionalmente un lubricante, en una cantidad inferior a aproximadamente el 1 por ciento en peso de la composición farmacéutica.

[0389] Las composiciones de acuerdo con la presente divulgación pueden estar en cualquier forma adecuada para aplicación tópica, incluyendo soluciones acuosas, hidroalcohólicas u oleosas, dispersiones de lociones o sueros, geles acuosos, anhidros u oleosos, emulsiones obtenidas por dispersión de una fase grasa en una fase acuosa (O/W o aceite en agua) o, por el contrario, (W/O o agua en aceite), microemulsiones o alternativamente microcápsulas, micropartículas o dispersiones de vesículas lipídicas de tipo iónico y/o no iónico. Estas composiciones se pueden preparar de acuerdo con métodos convencionales. Aparte de los agentes de la divulgación, las cantidades de los diversos constituyentes de las composiciones de acuerdo con la divulgación son las que se usan convencionalmente en la técnica. Estas composiciones constituyen en particular cremas, leches, lociones, geles o espumas protectoras, de tratamiento o de cuidado para el rostro, para las manos, para el cuerpo y/o para las mucosas, o para la limpieza de la piel. Las composiciones también pueden consistir en preparaciones sólidas que constituyen jabones o barras limpiadoras.

[0391] Las composiciones de la presente divulgación también pueden contener adyuvantes comunes a los campos cosmético y dermatológico, tales como agentes gelificantes hidrofílicos o lipofílicos, agentes activos hidrofílicos o lipofílicos, agentes conservantes, agentes antioxidantes, disolventes, fragancias, rellenos, filtros solares, absorbentes de olores y colorantes. Las cantidades de estos diversos adyuvantes son las clásicamente utilizadas en los campos considerados y, por ejemplo, son del orden de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 20 % del peso total de la composición. Según su naturaleza, estos adyuvantes pueden introducirse en la fase grasa, en la fase acuosa y/o en las vesículas lipídicas.

[0393] Las infecciones virales oculares se pueden tratar eficazmente con soluciones, suspensiones, ungüentos o insertos oftálmicos que comprenden un agente o una combinación de agentes de la presente divulgación. Las gotas para los ojos se pueden preparar disolviendo el ingrediente activo en una solución acuosa estéril, tal como solución salina fisiológica, solución tampón, etc., o combinando composiciones en polvo para disolverlas antes de su uso. Se pueden elegir otros vehículos, como se sabe en la técnica, que incluyen pero no se limitan a: solución salina de equilibrio, solución salina, poliéteres solubles en agua tales como polietilenglicol, polivinilos, tales como alcohol polivinílico y povidona, derivados de celulosa tales como metilcelulosa e hidroxipropil metilcelulosa, derivados del petróleo tales como aceite mineral y vaselina blanca, grasas animales tales como lanolina, polímeros de ácido acrílico tales como gel de carboxipolimetileno, grasas vegetales tales como aceite de cacahuete y polisacáridos tales como dextranos y glicosaminoglicanos tales como hialuronato de sodio. Si se desea, se pueden agregar aditivos que se usan normalmente en las gotas para los ojos. Dichos aditivos incluyen agentes isotonizantes (p. ej., cloruro de sodio, etc.), agente tampón (p. ej., ácido bórico, fosfato monohidrógeno de sodio, fosfato dihidrógeno de sodio, etc.), conservantes (p. ej., cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorobutanol, etc.), espesantes (por ejemplo, sacárido tal como lactosa, manitol, maltosa, etc.; por ejemplo, ácido hialurónico o su sal como hialuronato de sodio, hialuronato de potasio, etc.; por ejemplo, mucopolisacárido tal como sulfato de condroitina, etc.; por ejemplo, poliacrilato de sodio, polímero de carboxivinilo, poliacrilato entrecruzado, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa u otros agentes conocidos por el experto en la materia).

[0395] La solubilidad de los componentes de las presentes composiciones se puede mejorar mediante un tensioactivo u otro codisolvente apropiado en la composición. Dichos codisolventes incluyen polisorbato 20, 60 y 80, Pluronic F68, F-84 y P-103, ciclodextrina u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica. Dichos codisolventes pueden emplearse a un nivel de aproximadamente 0.01 % a 2 % en peso.

[0397] Las composiciones de la divulgación se pueden envasar en forma de multidosis. Se pueden preferir los conservantes para evitar la contaminación microbiana durante el uso. Los conservantes adecuados incluyen: cloruro de benzalconio, timerosal, clorobutanol, metilparabeno, propilparabeno, alcohol feniletílico, edetato disódico, ácido sórbico, Onamer M u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica. En los productos oftálmicos de la técnica anterior, tales conservantes pueden emplearse a un nivel de 0.004 % a 0.02 %. En las composiciones de la presente solicitud, el conservante, preferiblemente cloruro de benzalconio, se puede emplear a un nivel de 0.001 % a menos de 0.01 %, por ejemplo, de 0.001 % a 0.008 %, preferiblemente aproximadamente 0.005 % en peso. Se ha encontrado que una concentración de cloruro de benzalconio de 0.005 % puede ser suficiente para preservar las composiciones de la presente divulgación del ataque microbiano.

[0398] Los agentes de la presente divulgación pueden administrarse en forma soluble en lugar de suspensión, lo que permite una absorción más rápida y cuantitativa en los sitios de acción. En general, las formulaciones tales como jaleas, cremas, lociones, supositorios y ungüentos pueden proporcionar un área con una exposición más prolongada a los agentes de la presente divulgación, mientras que las formulaciones en solución, por ejemplo, aerosoles, proporcionan una exposición más inmediata a corto plazo.

[0399] Las composiciones farmacéuticas que se relacionan con la aplicación tópica/local pueden incluir uno o más potenciadores de la penetración. Por ejemplo, las formulaciones pueden comprender vehículos o excipientes adecuados en fase sólida o gel que aumentan la penetración o ayudan a la administración de agentes o combinaciones de agentes de la divulgación a través de una barrera de permeabilidad, por ejemplo, la piel. Muchos de estos compuestos que mejoran la penetración se conocen en la técnica de la formulación tópica e incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes (por ejemplo, terpenos como metanol, etanol, 2-propanol), sulfóxidos (por ejemplo, dimetilsulfóxido, decilmetilsulfóxido, tetradecilmetilsulfóxido), pirrolidonas (p. ej., 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona, N-(2-hidroxietil)pirrolidona), laurocapram, acetona, dimetilacetamida, dimetilformamida, alcohol tetrahidrofurfurílico, L-α-aminoácidos, tensioactivos aniónicos, catiónicos, anfóteros o no iónicos (p. ej., miristato de isopropilo y laurilsulfato de sodio), ácidos grasos, alcoholes grasos (p. ej., ácido oleico), aminas, amidas, amidas de ácido clofíbrico, hexametilen lauramida, enzimas proteolíticas, α-bisabolol, d-limoneno, urea y N,N-dietil-m-toluamida, y similares. Los ejemplos adicionales incluyen humectantes (p. ej., urea), glicoles (p. ej., propilenglicol y polietilenglicol), monolaurato de glicerol, alcanos, alcanoles, ORGELASE, carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y/u otros polímeros. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir uno o más de tales potenciadores de la penetración.

[0400] Las composiciones farmacéuticas para aplicación local/tópica pueden incluir uno o más conservantes antimicrobianos tales como compuestos de amonio cuaternario, mercuriales orgánicos, p-hidroxibenzoatos, alcoholes aromáticos, clorobutanol y similares.

[0401] Las composiciones farmacéuticas pueden ser soluciones, suspensiones, ungüentos, enemas y/o supositorios administrados por vía oral o rectal que comprenden un agente o una combinación de agentes de la presente divulgación.

[0402] Las composiciones farmacéuticas pueden ser soluciones en aerosol, suspensiones o polvos secos que comprenden un agente o una combinación de agentes de la presente divulgación. El aerosol se puede administrar a través del sistema respiratorio o de las fosas nasales. Por ejemplo, un experto en la técnica puede reconocer que una composición de la presente divulgación puede suspenderse o disolverse en un vehículo apropiado, p. ej., un propulsor farmacéuticamente aceptable, y administrarse directamente en los pulmones usando un aerosol nasal o un inhalador. Por ejemplo, una formulación en aerosol que comprende un agente puede disolverse, suspenderse o emulsionarse en un propelente o una mezcla de disolvente y propulsor, por ejemplo, para administración como aerosol nasal o inhalante. Las formulaciones de aerosol pueden contener cualquier propulsor aceptable bajo presión, tal como un propulsor aceptable desde el punto de vista cosmético, dermatológico o farmacéutico, como se usa convencionalmente en la técnica.

[0403] Una formulación en aerosol para administración nasal es generalmente una solución acuosa diseñada para administrarse en las fosas nasales en forma de gotas o aerosoles. Las soluciones nasales pueden ser similares a las secreciones nasales en que generalmente son isotónicas y ligeramente tamponadas para mantener un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, aunque también se pueden usar valores de pH fuera de este intervalo. También se pueden incluir agentes antimicrobianos o conservantes en la formulación.

[0404] Se puede diseñar una formulación en aerosol para inhalaciones e inhalantes de modo que el agente o la combinación de agentes de la presente divulgación se transporte al sistema respiratorio del sujeto cuando se administra por vía respiratoria nasal u oral. Las soluciones para inhalación se pueden administrar, por ejemplo, mediante un nebulizador. Las inhalaciones o insuflaciones, que comprenden fármacos líquidos o en polvo fino, pueden administrarse al sistema respiratorio como un aerosol farmacéutico de una solución o suspensión del agente o combinación de agentes en un propulsor, por ejemplo, para ayudar a la propagación. Los propulsores pueden ser gases licuados, incluidos halocarburos, por ejemplo, fluorocarburos tales como hidrocarburos clorados fluorados, hidroclorofluorocarburos e hidroclorocarburos, así como hidrocarburos y éteres de hidrocarburos.

[0405] Los propulsores de halocarbono útiles en la presente divulgación incluyen propulsores de fluorocarbono en los que todos los hidrógenos se reemplazan con flúor, propulsores de clorofluorocarbono en los que todos los hidrógenos se reemplazan con cloro y al menos un flúor, propulsores de fluorocarbono que contienen hidrógeno y propulsores de clorofluorocarbono que contienen hidrógeno. Los propulsores halocarbonados se describen en Johnson, patente de los Estados Unidos No. 5,376,359; Byron et al., patente de los Estados Unidos No.

[0406] 5,190,029; y Purewal et al., patente de los Estados Unidos Nº 5,776,434. Los propelentes de hidrocarburos útiles en divulgación incluyen, por ejemplo, propano, isobutano, n-butano, pentano, isopentano y neopentano. También se puede utilizar una mezcla de hidrocarburos como propulsor. Los propulsores de éter incluyen, por ejemplo, dimetil éter así como los éteres. Una formulación en aerosol de la divulgación también puede comprender más de un propulsor. Por ejemplo, la formulación en aerosol puede comprender más de un propulsor de la misma clase, tal como dos o más fluorocarbonos; o más de uno, más de dos, más de tres propulsores de diferentes clases, tal como un fluorohidrocarburo y un hidrocarburo. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también se pueden dispensar con un gas comprimido, por ejemplo, un gas inerte tal como dióxido de carbono, óxido nitroso o nitrógeno.

[0407] Las formulaciones de aerosol también pueden incluir otros componentes, por ejemplo, etanol, isopropanol, propilenglicol, así como tensioactivos u otros componentes, tales como aceites y detergentes. Estos componentes pueden servir para estabilizar la formulación y/o lubricar los componentes de la válvula.

[0408] La formulación en aerosol se puede envasar a presión y se puede formular como un aerosol usando soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos y preparaciones semisólidas. Por ejemplo, una formulación en aerosol en solución puede comprender una solución de un agente de la divulgación en un propulsor (sustancialmente) puro o como una mezcla de propulsor y disolvente. El disolvente se puede usar para disolver el agente y/o retardar la evaporación del propulsor. Los disolventes útiles en la divulgación incluyen, por ejemplo, agua, etanol y glicoles. Se puede utilizar cualquier combinación de disolventes adecuados, opcionalmente combinados con conservantes, antioxidantes y/u otros componentes del aerosol.

[0409] Una formulación en aerosol también puede ser una dispersión o suspensión. Una formulación de suspensión en aerosol puede comprender una suspensión de un agente o una combinación de agentes de la presente divulgación. Los agentes dispersantes útiles en la divulgación incluyen, por ejemplo, trioleato de sorbitán, alcohol oleílico, ácido oleico, lecitina y aceite de maíz. Una formulación en aerosol en suspensión también puede incluir lubricantes, conservantes, antioxidantes y/u otros componentes del aerosol.

[0410] Una formulación en aerosol puede formularse de manera similar como una emulsión. Una formulación de aerosol en emulsión puede incluir, por ejemplo, un alcohol tal como etanol, un tensioactivo, agua y un propulsor, así como un agente o combinación de agentes de la divulgación. El tensioactivo utilizado puede ser no iónico, aniónico o catiónico. Un ejemplo de una formulación de aerosol en emulsión comprende, por ejemplo, etanol, tensioactivo, agua y propulsor. Otro ejemplo de una formulación de aerosol en emulsión comprende, por ejemplo, aceite vegetal, monoestearato de glicerilo y propano.

[0411] Los compuestos de la divulgación se pueden formular para su administración como supositorios. Primero se funde una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de triglicéridos, glicéridos de ácidos grasos, Witepsol S55 (marca registrada de Dynamite Nobel Chemical, Alemania) o manteca de cacao y el componente activo se dispersa homogéneamente, por ejemplo, mediante agitación. La mezcla homogénea fundida se vierte luego en moldes de tamaño conveniente, se deja enfriar y solidificar.

[0412] Los compuestos de la divulgación se pueden formular para administración vaginal. Pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o aerosoles que contienen, además del ingrediente activo, los vehículos que se sabe que son apropiados en la técnica.

[0413] Se contempla además, que los compuestos de la divulgación puedan unirse de forma liberable a polímeros biocompatibles para su uso en formulaciones de liberación sostenida sobre, en o unidos a insertos para administración tópica, intraocular, periocular o sistémica. La liberación controlada de un polímero biocompatible también se puede utilizar con un polímero soluble en agua para formar una formulación instilable. La liberación controlada de un polímero biocompatible, como por ejemplo, microesferas o nanoesferas de PLGA, se puede utilizar en una formulación adecuada para la implantación o inyección intraocular para la administración de liberación sostenida, así como se puede utilizar cualquier polímero biodegradable y biocompatible adecuado. En un aspecto de la divulgación, se puede usar el estado de portador del sujeto de cualquiera de las variantes de riesgo de variación genética descritas en el presente documento, o variantes genéticas identificadas a través de otros métodos de análisis dentro de los genes o loci reguladores identificados por las CNV o SNV descritas en el presente documento, para ayudar a determinar si se debe administrar una modalidad de tratamiento en particular, tal como uno cualquiera de los anteriores, o una combinación de los mismos. La administración de una opción de tratamiento como cualquiera de las opciones de tratamiento mencionadas anteriormente se puede determinar en función de la presencia o ausencia de una variante de riesgo de variación genética particular en el individuo, o mediante el control de la expresión de genes que están asociados con las variantes de la presente divulgación. Los niveles de expresión y/o los niveles de ARNm pueden así determinarse antes y durante el tratamiento para controlar su eficacia. Alternativamente, o concomitantemente, el estado con respecto a una variación genética y/o el estado de genotipo y/o haplotipo de al menos una variante de riesgo para PML presentada en este documento puede determinarse antes y durante el tratamiento para controlar su eficacia. Los expertos en la técnica también pueden apreciar que los niveles de expresión anómalos de un gen afectado por una CNV u otras mutaciones encontradas como consecuencia de la secuenciación dirigida del gen identificado por las CNV pueden analizarse o someterse a pruebas diagnósticas midiendo el nivel de expresión del polipéptido de dicho gen expresado de forma anómala. Los niveles de expresión anómalos de un gen pueden deberse a que una CNV impacta en una secuencia de ADN (p. ej., el sitio de unión del factor de transcripción) que regula un gen cuyo nivel de expresión anómalo está implicado o causa PML, u otras mutaciones encontradas como consecuencia de la secuenciación dirigida de la secuencia reguladora del gen identificado con CNV puede analizarse o someterse a pruebas diagnósticas midiendo el nivel de expresión del polipéptido del gen implicado o causante de PML. Una mutación específica de CNV dentro de un gen, u otras mutaciones específicas que se encuentran en la secuenciación dirigida de un gen identificado en CNV que se encuentra implicado o causante de PML, puede causar un cambio estructural anómalo en el polipéptido expresado que resulta de dichas mutaciones genéticas y la estructura o estructuras polipeptídicas alteradas pueden ensayarse mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la materia.

[0415] Alternativamente, las redes biológicas o vías metabólicas relacionadas con los genes dentro de, o asociadas con, las variaciones genéticas descritas en el presente documento pueden monitorearse determinando los niveles de ARNm y/o polipéptido. Esto se puede hacer, por ejemplo, monitoreando los niveles de expresión de polipéptidos para varios genes que pertenecen a la red y/o vía en muestras de ácido nucleico tomadas antes y durante el tratamiento. Alternativamente, los metabolitos que pertenecen a la red biológica o vía metabólica pueden determinarse antes y durante el tratamiento. La eficacia del tratamiento se determina comparando los cambios observados en los niveles de expresión/niveles de metabolitos durante el tratamiento con los datos correspondientes de sujetos sanos.

[0417] Las variaciones genéticas descritas en este documento y/o las encontradas posteriormente (p. ej., a través de otros métodos de análisis genético, tales como la secuenciación) a través del análisis dirigido de aquellos genes identificados inicialmente por las variaciones genéticas descritas en este documento, se pueden usar para prevenir los efectos adversos asociados con un agente terapéutico, tal como durante los ensayos clínicos. Por ejemplo, las personas que son portadoras de al menos una variación genética de riesgo pueden tener más probabilidades de responder negativamente a un agente terapéutico, tal como un agente inmunosupresor. Por ejemplo, es más probable que los portadores de ciertas variantes genéticas muestren una respuesta adversa al agente terapéutico. Una o más de las variaciones genéticas empleadas durante los ensayos clínicos para un agente terapéutico dado se pueden usar en una prueba de diagnóstico complementaria que se administra al paciente antes de la administración del agente terapéutico para determinar si es probable que el paciente tenga una respuesta favorable o adversa al agente terapéutico.

[0419] Las variaciones genéticas descritas en el presente documento pueden usarse para determinar si a un sujeto se le administra un agente farmacéutico, tal como un fármaco inmunosupresor. Ciertas combinaciones de variantes, incluidas las descritas en este documento, pero también combinaciones con otras variantes de riesgo de PML, pueden ser adecuadas para una selección de opciones de tratamiento, mientras que otras combinaciones de variantes pueden ser adecuadas para la selección de otras opciones de tratamiento. Dichas combinaciones de variantes pueden incluir una variante, dos variantes, tres variantes o cuatro o más variantes, según sea necesario para determinar con precisión clínicamente fiable la selección del módulo de tratamiento. La información de las pruebas de las variaciones genéticas descritas en este documento, u otras variaciones genéticas raras en o cerca de los genes descritos en este documento, puede combinarse con información de otros tipos de pruebas (por ejemplo, una prueba de anticuerpos contra JCV, prueba de CD62L o prueba de bandas oligoclonales de IgM en CSF para la selección de opciones de tratamiento.

[0421] Kits

[0423] La presente invención se relaciona con natalizumab para uso o métodos como se define en las reivindicaciones, para los cuales lo siguiente proporciona una descripción útil relacionada con kits (en los que, por ejemplo, el natalizumab puede estar incluido en un kit, o los reactivos para transportar el método reivindicado puede proporcionarse en un kit), pero dichos kits no forman el objeto que se reivindica en este documento. Los kits útiles en los métodos de la divulgación comprenden componentes útiles en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, incluidos, por ejemplo, cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos, sondas de hibridación para detectar variaciones genéticas u otra detección de etiquetadores, enzimas de restricción, sondas de ácidos nucleicos, opcionalmente etiquetadas con etiquetas adecuadas, oligonucleótidos específicos de alelo, anticuerpos que se unen a un polipéptido alterado codificado por un ácido nucleico de la divulgación como se describe en este documento o a un polipéptido de tipo silvestre codificado por un ácido nucleico de la divulgación como se describe en este documento, medios para la amplificación de variaciones genéticas o fragmentos de los mismos, medios para analizar la secuencia de ácidos nucleicos de ácidos nucleicos que comprenden variaciones genéticas como se describe en el presente documento, medios para analizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por una variación genética, o un ácido nucleico asociado con una variación genética, etc. Los kits pueden, por ejemplo, incluir tampones necesarios, cebadores de ácidos nucleicos para amplificar ácidos nucleicos y reactivos para la detección específica de alelos de los fragmentos amplificados utilizando dichos cebadores y las enzimas necesarias (p. ej., ADN polimerasa). Además, los kits pueden proporcionar reactivos para ensayos que se usarán en combinación con los métodos de la presente divulgación, por ejemplo, reactivos para usar con otros ensayos de detección de PML.

[0425] La divulgación se refiere a un kit para analizar una muestra de ácido nucleico de un sujeto para detectar la presencia de una variación genética, en el que el kit comprende los reactivos necesarios para detectar selectivamente al menos una variación genética particular en el genoma del individuo. La divulgación se refiere a un kit para analizar una muestra de ácido nucleico de un sujeto para detectar la presencia de al menos un alelo particular de al menos un polimorfismo asociado con una variación genética en el genoma del sujeto. Los reactivos pueden comprender al menos un oligonucleótido contiguo que hibrida con un fragmento del genoma del individuo que comprende al menos variación genética. Los reactivos pueden comprender al menos un par de oligonucleótidos que hibridan con cadenas opuestas de un segmento genómico obtenido de un sujeto, donde cada par de cebadores de oligonucleótidos está diseñado para amplificar selectivamente un fragmento del genoma del individuo que incluye al menos una variación genética, o un fragmento de una variación genética. Dichos oligonucleótidos o ácidos nucleicos pueden diseñarse usando los métodos descritos en este documento. El kit puede comprender uno o más ácidos nucleicos etiquetados capaces de detección específica de alelos de uno o más etiquetadores polimórficos o haplotipos específicos con una variación genética, y reactivos para la detección de la etiqueta. Un kit para detectar etiquetadores SNP puede comprender una sonda oligonucleotídica de detección, que se hibrida con un segmento de ADN molde que contiene un polimorfismo SNP a detectar, una sonda oligonucleotídica potenciadora, una sonda de detección, un cebador y/o una endonucleasa, por ejemplo, como lo describen Kutyavin et al., (Nucleic Acid Res.34:el28 (2006)). El kit puede contener reactivos para detectar SNV y/o CNV.

[0427] El molde de ADN puede amplificarse por cualquier medio de la presente divulgación, antes de la evaluación de la presencia de variaciones genéticas específicas como se describe en el presente documento. Se pueden utilizar métodos estándar bien conocidos por los expertos para realizar estos métodos, y están dentro del alcance de la divulgación. Los reactivos para realizar estos métodos se pueden incluir en el kit de reactivos.

[0428] En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un empaque (kit) farmacéutico, el empaque comprende un agente terapéutico y un conjunto de instrucciones para la administración del agente terapéutico a seres humanos examinados para una o más variantes de la presente divulgación, como se divulga en el presente documento. El agente terapéutico puede ser un fármaco de molécula pequeña, un anticuerpo, un péptido, una molécula antisentido o de ARNi, u otras moléculas terapéuticas como se describe en el presente documento. A un individuo identificado como no portador de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que tome el agente terapéutico. A un individuo identificado como no portador de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que tome una dosis prescrita del agente terapéutico. A un individuo identificado como portador de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que no tome el agente terapéutico. A un individuo identificado como portador de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que no tome una dosis prescrita del agente terapéutico. Una persona identificada como portadora de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que tome un agente que se dirija al virus de JC. Por ejemplo, a un individuo identificado como portador de al menos una variante de la presente divulgación se le puede indicar que tome un agente que se dirija al virus de JC antes o junto con natalizumab.

[0430] También se proporcionan en este documento artículos de fabricación, que comprenden una sonda que se hibrida con una región del cromosoma humano como se describe en este documento y puede usarse para detectar un polimorfismo descrito en este documento. Por ejemplo, cualquiera de las sondas para detectar polimorfismos o variaciones genéticas descritas en el presente documento se puede combinar con material de envasado para generar artículos de fabricación o kits. El kit puede incluir uno o más elementos que incluyen: instrucciones de uso; y otros reactivos tales como una etiqueta o un agente útil para unir una etiqueta a la sonda. Las instrucciones de uso pueden incluir instrucciones para aplicaciones de exploración de la sonda para realizar un diagnóstico, pronóstico o teragnosis de PML en un método descrito en el presente documento. Otras instrucciones pueden incluir instrucciones para unir una etiqueta a la sonda, instrucciones para realizar análisisin situcon la sonda y/o instrucciones para obtener una muestra de ácido nucleico que se va a analizar de un sujeto. En algunos casos, el kit puede incluir una sonda etiquetada que se hibrida con una región del cromosoma humano como se describe en este documento.

[0432] El kit también puede incluir una o más sondas de control o de referencia adicionales que hibridan con el mismo cromosoma u otro cromosoma o parte del mismo que puede tener una anomalía asociada con un endofenotipo particular. Un kit que incluye sondas adicionales puede incluir además etiquetas, por ejemplo, una o más etiquetas iguales o diferentes para las sondas. La sonda o sondas adicionales proporcionadas con el kit pueden ser una sonda o sondas etiquetadas. Cuando el kit incluye además una o más sondas o sondas adicionales, el kit puede proporcionar además instrucciones para el uso de la sonda o sondas adicionales. También se pueden proporcionar kits para uso en autodiagnóstico. Dichos kits de prueba pueden incluir dispositivos e instrucciones que un sujeto puede usar para obtener una muestra de ácido nucleico (p. ej., células bucales, sangre) sin la ayuda de un proveedor de atención médica. Por ejemplo, las células bucales se pueden obtener usando un hisopo o cepillo bucal, o usando un enjuague bucal.

[0434] Los kits que se proporcionan en este documento también pueden incluir un remitente (por ejemplo, un sobre con franqueo pagado o un paquete de correo) que se puede usar para devolver la muestra de ácido nucleico para su análisis, por ejemplo, a un laboratorio. El kit puede incluir uno o más recipientes para la muestra de ácido nucleico, o la muestra de ácido nucleico puede estar en un vial de extracción de sangre estándar. El kit también puede incluir uno o más de un formulario de consentimiento informado, un formulario de solicitud de prueba e instrucciones sobre cómo usar el kit en un método descrito en este documento. Los métodos para usar dichos kits también se incluyen en el presente documento. Uno o más de los formularios (p. ej., el formulario de solicitud de prueba) y el recipiente que contiene la muestra de ácido nucleico se pueden codificar, por ejemplo, con un código de barras para identificar al sujeto que proporcionó la muestra de ácido nucleico. Una prueba de detecciónin vitropuede comprender uno o más dispositivos, herramientas y equipos configurados para recolectar una muestra de ácido nucleico de un individuo. Una prueba de detecciónin vitro, las herramientas para recolectar una muestra de ácido nucleico pueden incluir uno o más de un hisopo, un bisturí, una jeringa, un raspador, un recipiente y otros dispositivos y reactivos diseñados para facilitar la recolección, almacenamiento y transporte de una muestra de ácido nucleico. Una prueba de detecciónin vitropuede incluir reactivos o soluciones para recolectar, estabilizar, almacenar y procesar una muestra de ácido nucleico.

[0435] Dichos reactivos y soluciones para recolectar, estabilizar, almacenar y procesar nucleótidos son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden indicarse mediante métodos específicos utilizados por una prueba de detecciónin vitrocomo se describe en este documento. Una prueba de detecciónin vitro, como se divulga en el presente documento, puede comprender un aparato de micromatriz y reactivos, un aparato de celda de flujo y reactivos, un secuenciador de nucleótidos multiplex y reactivos, y hardware y software adicionales necesarios para analizar una muestra de ácido nucleico para ciertos etiquetadores genéticos y para detectar y visualizar ciertos etiquetadores genéticos.

[0436] La presente divulgación se refiere además a kits para usar anticuerpos en los métodos descritos en el presente documento. Esto incluye, pero no se limita a, kits para detectar la presencia de un polipéptido variante en una muestra de ácido nucleico de prueba. Un kit preferido comprende anticuerpos tales como un anticuerpo etiquetado o etiquetable y un compuesto o agente para detectar polipéptidos variantes en una muestra de ácido nucleico, medios para determinar la cantidad o la presencia y/o ausencia de polipéptido variante en la muestra de ácido nucleico, y medios para comparar la cantidad de polipéptido variante en la muestra de ácido nucleico con un estándar, así como instrucciones para el uso del kit. El kit puede comprender además un conjunto de instrucciones para usar los reactivos que componen el kit.

[0437] Aspectos implementados por ordenador

[0438] La presente invención se refiere a natalizumab para uso o métodos como se define en las reivindicaciones, para los cuales lo siguiente proporciona una divulgación útil relacionada con aspectos implementados por ordenador (que pueden, por ejemplo, usarse para determinar el riesgo de PML), pero tales aspectos implementados por ordenador no forman el objeto que se reivindica en este documento. Como entienden los expertos en la materia, los métodos y la información descritos en este documento (asociación de variación genética con PML) pueden implementarse, en su totalidad o en parte, como instrucciones ejecutables por ordenador en medios conocidos legibles por ordenador. Por ejemplo, los métodos descritos en este documento se pueden implementar en hardware. Alternativamente, el método puede implementarse en software almacenado, por ejemplo, en una o más memorias u otro medio legible por ordenador u ordenador en uno o más procesadores. Como es sabido, los procesadores pueden asociarse con uno o más controladores, unidades de cálculo y/u otras unidades de un sistema informático, o implantarse en firmware según se desee. Si se implementan en software, las rutinas se pueden almacenar en cualquier memoria legible por tal como en memoria RAM, ROM, flash, un disco magnético, un disco láser u otro medio de almacenamiento, como también se conoce. Asimismo, este software se puede suministrar a un dispositivo informático a través de cualquier método de suministro conocido, incluidos, por ejemplo, a través de un canal de comunicación tal como una línea telefónica, Internet, una conexión inalámbrica, etc., o a través de un medio transportable, tal como un disco legible por ordenador, unidad flash, etc.

[0439] De manera más general, y tal como lo entienden los expertos en la materia, las diversas etapas descritas anteriormente se pueden implementar como varios bloques, operaciones, herramientas, módulos y técnicas que, a su vez, se pueden implementar en hardware, firmware, software o cualquier combinación de hardware, firmware y/o software. Cuando se implementan en hardware, algunos o todos los bloques, operaciones, técnicas, etc. se pueden implementar, por ejemplo, en un circuito integrado personalizado (IC), un circuito integrado de aplicación específica (ASIC), una matriz lógica programable de campo (FPGA ), una matriz lógica programable (PLA), etc.

[0440] Los resultados de dicho genotipado pueden almacenarse en una unidad de almacenamiento de datos, tal como un soporte de datos, que incluye bases de datos informáticas, discos de almacenamiento de datos u otros medios convenientes de almacenamiento de datos. La base de datos informática puede ser una base de datos de objetos, una base de datos relacional o una base de datos posrelacional. Los datos se pueden recuperar de la unidad de almacenamiento de datos usando cualquier método conveniente de consulta de datos.

[0441] Cuando se implementa en software, el software se puede almacenar en cualquier medio legible por ordenador tal como un disco magnético, un disco óptico u otro medio de almacenamiento, en una memoria RAM o ROM o flash de un ordenador, procesador, unidad de disco duro, unidad de disco óptico, unidad de cinta, etc. Asimismo, el software puede suministrarse a un usuario o a un sistema informático a través de cualquier método de suministro conocido incluyendo, por ejemplo, un disco legible por ordenador u otro mecanismo de almacenamiento informático transportable.

[0442] Las etapas de los métodos reivindicados pueden ser operativas con muchos otros entornos o configuraciones de sistemas informáticos de propósito general o de propósito especial. Los ejemplos de sistemas informáticos, entornos y/o configuraciones bien conocidos que pueden ser adecuados para su uso con los métodos o el sistema de las reivindicaciones incluyen, pero no se limitan a, ordenadores personales, servidores, dispositivos portátiles o de mano, sistemas multiprocesador, sistemas basados en microprocesadores, decodificadores, electrónica de consumo programable, PC de red, miniordenadores, ordenadores centrales, entornos informáticos distribuidos que incluyen cualquiera de los sistemas o dispositivos anteriores, y similares.

[0443] Las etapas del método y sistema reivindicados pueden describirse en el contexto general de instrucciones ejecutables por ordenador, tales como módulos de programa, que son ejecutados por un ordenador. Generalmente, los módulos de programa incluyen rutinas, programas, objetos, componentes y/o estructuras de datos que realizan tareas particulares o implementan tipos de datos abstractos particulares. Los métodos y aparatos también se pueden practicar en entornos informáticos distribuidos donde las tareas se realizan mediante dispositivos de procesamiento remoto que están vinculados a través de una red de comunicaciones. Tanto en entornos informáticos integrados como distribuidos, los módulos de programa se pueden ubicar en medios de almacenamiento informáticos tanto locales como remotos, incluidos los dispositivos de almacenamiento de memoria.

[0444] Si bien se ha descrito que el sistema y el método de evaluación de riesgos y otros elementos se implementan preferiblemente en software, se pueden implementar en hardware, firmware, etc., y se pueden implementar mediante cualquier otro procesador. Por lo tanto, los elementos descritos en este documento se pueden implementar en una CPU multipropósito estándar o en hardware o firmware específicamente diseñado, tal como un circuito integrado de aplicación específica (ASIC) u otro dispositivo cableado, según se desee. Cuando se implementa en software, la rutina de software se puede almacenar en cualquier memoria legible por ordenador, tal como en un disco magnético, un disco láser u otro medio de almacenamiento, en una memoria RAM o ROM de una ordenador o procesador, en cualquier base de datos, etc. Igualmente este software se puede suministrar a un usuario o a un sistema de detección a través de cualquier método de suministro conocido o deseado que incluya, por ejemplo, un disco legible por ordenador u otro mecanismo de almacenamiento de ordenador portátil o por un canal de comunicación, por ejemplo, una línea telefónica, el Internet o comunicación inalámbrica. Se pueden realizar modificaciones y variaciones en las técnicas y estructuras aquí descritas e ilustradas sin apartarse del espíritu y alcance de la presente divulgación.

[0445] A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Las siguientes referencias contienen enseñanzas de los métodos y composiciones que pueden usarse en el presente documento: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18.ª Edición, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Benjamin Lewin, Genes IX, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[0446] Los procedimientos estándar de la presente divulgación se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.ª ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); o Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl (eds.), Academic Press Inc., San Diego, USA (1987)). Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5.ª edición (2005), y Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol.57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1.ª edición, 1998).

[0447] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los significados que entendería comúnmente un experto en la técnica en el contexto de la presente memoria descriptiva.

[0448] Cabe señalar que tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referencia al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un nucleótido" incluye una pluralidad de dichos nucleótidos; la referencia a "el nucleótido" es una referencia a uno o más nucleótidos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

[0449] En el presente contexto, se entenderá que el término "y/o" indica que están involucrados uno o ambos elementos conectados por él.

[0450] Ejemplos

[0451] La presente invención involucra una variación genómica seleccionada de chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9: 137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A. Los siguientes ejemplos, en la medida en que no se relacionan con las variaciones genómicas chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A, chr9:137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A, se incluyen como referencia.

[0452] Ejemplo 1 - Enfoque experimental

[0453] En el presente estudio se identificaron un conjunto de genes, variantes deletéreas dentro de las cuales aumentan la susceptibilidad a PML. Los genes relevantes se descubrieron sobre la base de un enfoque combinado de CNV más análisis de secuencia. Se compilaron dos conjuntos de genes (véase la Tabla 6 y la descripción correspondiente):

[0454] A. Un conjunto basado en una revisión bibliográfica detallada de genes implicados en el sistema inmunitario y la biología del virus de JC, junto con genes descritos en el contexto de PML a través de informes de casos. B. Un conjunto basado en la observación de CNV raras dentro de la cohorte de PML.

[0455] Se generó una lista no redundante de 419 genes (véase la Tabla 6), que contiene 245 reseñas seleccionadas de inmuno deficiencia (inmunodeficiencia) (Tabla 6, 'Publica db'), 169 identificados a través de CNV raras utilizando los métodos descritos en este documento (Tabla 6, 'PBio'), y 6 genes que se encontraron utilizando ambos métodos (Tabla 6, 'Both'). Véase la Tabla 6 y la descripción a continuación para obtener más información).

[0456] Utilizando este conjunto de 419 genes, se determinó si:

[0457] ● Hubo CNV raras que podrían explicar la susceptibilidad a la PML;

[0458] ● Se encontraron variantes de secuencia raras (determinadas a través del análisis de secuenciación del exoma completo - WES) que pueden explicar la susceptibilidad a la PML;

[0459] ● Las combinaciones de CNV, SNV y/o CNV y SNV podrían explicar la susceptibilidad;

[0460] ● Las variantes individuales pueden estar presentes con mayor frecuencia en la cohorte de PML (análisis de carga de variantes - Tablas 14, 15);

[0461] ● El número total de variantes heterocigotas dañinas fue alto para cualquier gen específico (análisis de carga génica - Tabla 13).

[0462] En todos los casos, se tuvo debidamente en cuenta:

[0463] ● La naturaleza patógena/perjudicial de las variantes observadas (p. ej., si era muy probable que la función del gen se viera afectada);

[0464] ● La rareza de las variantes o combinaciones de variantes (p. ej., se consideraron aquellas que se esperaría que estuvieran presentes en el 1 % o menos de la población normal);

[0465] ● El origen étnico de los casos de PML para tener en cuenta las posibles diferencias de frecuencia en un subgrupo de población frente a otro. Las etnias (p. ej., ascendencia) de los pacientes con PML se informan en la Tabla 7. Para los identificadores ID de la muestra que comienzan con 'MVGS', no se informaron las etnias, pero todos los pacientes eran de los EE. UU. y se asumió que sus etnias eran de ascendencia europea (EUR). Sin embargo, el caso de PML MVGS811-13a es potencialmente de ascendencia africana (AFR) sobre la base de SNV comunes que también se encuentran en casos de PML que se sabe que tienen ascendencia AFR. En un caso, se usaron datos de frecuencias étnicas específicas de la base de datos ExAC para evaluar las frecuencias relativas de las variantes encontradas en pacientes con PML frente a una población no seleccionada (sujetos de ExAC). Las etnias de ExAC se designaron de la siguiente manera: africana/afroamericana (AFR), latina (LAT, también conocida como AMR), asiática oriental (EAS), finlandesa (FIN), europea no finlandesa (EUR, también conocida como NFE), asiática del sur (SAS) y otras (OTH). Para algunos casos de PML informados en la Tabla 7, los grupos étnicos se informaron alternativamente como subsahariana, norafricana (MGB), caribeña (CAR) o hispana (HISP). Para la interpretación de las variantes encontradas en estos pacientes, las asignaciones de ascendencia utilizando las designaciones de la base de datos de ExAC fueron las siguientes: AFR = MGB o Subsahariana; LAT = CAR o HISP. Se desconocía la ascendencia de dos casos de PML (PML02 y PML28) y, para fines de interpretación de frecuencia (usando la base de datos de ExAC), se supuso que tenían ascendencia europea (EUR).

[0466] Si bien el mecanismo genético principal que se consideró fue la herencia autosómica recesiva (AR), varias soluciones se basaron en la herencia autosómica dominante (AD), pero solo en los casos en los que se encontró evidencia previa de que las variantes heterocigotas en el gen relevante se habían asociado previamente con un síndrome de inmunodeficiencia. Los expertos en la técnica pueden apreciar que algunos genes pueden contener variantes patogénicas del modelo AR y AD (p. ej., véanse las entradas de la Tabla 6 marcadas como 'AR AD' en la columna 'Modelo de enfermedad').

[0467] Para la herencia AR (-40 % de los genes en la Tabla 6 caen en esta categoría, AR o AR AD), se consideraron los siguientes:

[0468] ● CNV disruptivas de genes homocigotos o heterocigotos compuestos;

[0469] ● variantes de secuencia homocigota o heterocigota compuesta; p.ej. variantes de un solo nucleótido (SNV). La heterocigosidad compuesta solo se infirió cuando estaba disponible el ajuste de fase o uno de los pares de SNV era homocigoto;

[0470] ● Heterocigosidad compuesta para una CNV y una SNV. Dichas llamadas solo eran posibles en casos en los que la SNV estaba en trans a una eliminación (por ejemplo, SNV DUSP16 en la Tabla 10 y la CNV en Tabla 1).

[0471] Ejemplo 2 - Análisis de variante de número de copia (CNV)

[0472] Los datos presentados en este documento se generaron sobre la base de una comparación de las variantes del número de copias (CNV) identificadas en 2 cohortes:

[0473] 1) 1,005 individuos normales (motor de variación normal - NVE);

[0474] 2) 71 casos de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) junto con 6 casos de virus de inmunodeficiencia humana (HIV) sin diagnóstico de PML (para ayudar a distinguir las variantes de la línea germinal frente a las variantes adquiridas que resultan de la infección por el HIV). Tamaño total de la cohorte = 77.

[0475] Hibridación de muestras de ADN genómico - cohortes de NVE y PML, HIV

[0476] Muestras de ADN genómico de individuos dentro de la cohorte normal (sujetos de 'prueba' de NVE, también denominados 'casos de NVE' en algunas tablas del presente documento) y de la cohorte de PML, HIV (sujetos de 'prueba' de PML, HIV) se hibridaron contra un solo individuo de referencia emparejado por sexo. Las muestras de ADN de referencia se etiquetaron con Cy5 y las muestras de ADN del sujeto de prueba se etiquetaron con Cy3. Después del etiquetado, las muestras se combinaron y cohibridaron con micromatrices de oligonucleótidos de características 1M de Agilent, diseño ID 021529 (número de producto de Agilent G4447A) usando condiciones estándar (hibridación genómica comparativa de matriz - aCGH). Después de la hibridación, las matrices se escanearon a una resolución de 2 µm, utilizando el escáner de micromatrices de ADN de Agilent, generando imágenes tiff para su posterior análisis.

[0477] Todas las imágenes tiff se analizaron con el software Agilent Feature Extraction (FE), con la siguiente configuración:

[0478] • Congelación del genoma humano: Hg18:NCBI36:Mar2006

[0479] • Versión de FE: 10.7.3.1

[0480] • Archivo de cuadrícula/diseño: 021529 D F 20091001

[0481] • Protocolo: CGH 107 Sep09

[0482] Este procedimiento genera una variedad de archivos de salida, uno de los cuales es un archivo delimitado por tabulaciones de texto que contiene aproximadamente 1,000,000 de filas de datos, cada una de las cuales corresponde a una característica específica de la matriz. Este archivo *.txt se usó para realizar llamadas de CNV usando DNAcopy, un paquete de software de código abierto implementado en R a través de BioConductor (http://www.bioconductor.org/ packages/release/bioc/html/DNAcopy.html). Las pérdidas heterocigotas (het loss), las pérdidas homocigotas (hom loss) o las ganancias se determinaron de acuerdo con una relación de umbral log2, que se estableció como:;[0483] ● hom loss mín. = -1,000;;[0484] ● hom loss máx. = -2;;[0485] ● het loss mín. = -2;;[0486] ● het loss máx. = -0.5;;[0487] ● ganancia mín. = 0.5;;[0488] ● ganancia máx. = 1,000;;[0489] Con muy pocas excepciones, no se consideraron todas las CNV con un valor de relación log2 entre -0.5 y 0.5. Todos los valores de relación log2 se determinaron de acuerdo con Cy3/Cy5 (Prueba/Referencia). Se estableció un umbral de sondeo mínimo para la llamada de CNV en 2 (2 sondeos consecutivos fueron suficientes para llamar una CNV). Se generó una lista de CNV para cada individuo en las 3 cohortes (NVE, PML y HIV).;[0490] Usando guiones personalizados, las CNV identificadas en las cohortes de NVE y PML (muchas de las cuales aparecieron en varios individuos) se 'fusionaron' (por separado) en listas maestras de subregiones de CNV no redundantes, de acuerdo con la presencia o ausencia de la subregión de CNV en individuos dentro de la cohorte. Usando este enfoque, las listas maestras de NVE tienen:;[0492] 7778 het loss;[0493] 653 hom loss;[0494] 4862 ganancia;[0496] distintas subregiones de CNV, respectivamente. La cohorte de PML HIV de 77 listas maestras de individuos contenía:;[0498] 2523 het loss;[0499] 314 hom loss;[0500] 1639 ganancia;[0502] distintas subregiones de CNV, respectivamente.;[0504] Los expertos en la materia pueden apreciar que las CNV pueden adquirirse en el genoma de un individuo que no se heredan. Tales 'CNV adquiridas' a menudo ocurren de una manera específica del tejido, tal como en tumores sólidos en comparación con el tejido normal del paciente. En las muestras de ADN genómico derivadas de sangre, que son las que se usaron tanto para los sujetos con NVE como con PML en los estudios descritos en este documento, las CNV adquiridas pueden ser el resultado de cánceres de la sangre como la leucemia y el linfoma, pero también debido a la infección por HIV. Muchos de los casos de PML en este estudio tenían el HIV como su enfermedad principal (véase la Tabla 7). Para ayudar en la interpretación de las CNV adquiridas frente a las de línea germinal, se incluyó una subcohorte de HIV de 6 casos en la comparación primaria de CNV de todo el genoma, pero las CNV raras en los 6 casos de HIV (sin PML) no se consideraron como relevantes para la susceptibilidad a la PML. El propósito de generar datos sobre los 6 casos de HIV fue determinar si algunos cambios observados en pacientes con PML que desarrollaron el trastorno con antecedentes de HIV (PML/HIV) probablemente estaban relacionados con el HIV subyacente y no con la susceptibilidad de la PML en sí. En otras palabras, los casos de HIV sirvieron como control general para la gran cantidad de casos de PML/HIV.;[0506] Por ejemplo, considérense 3 personas dentro de la cohorte de NVE con las siguientes CNV hipotéticas:;[0507] crml: 1-100,000; crml: 10,001-100,000; y crml: 1-89,999. En la lista maestra, estos se fusionarían en 3 subregiones de CNV distintas, de la siguiente manera:;[0509] • Subregión 1 de CNV Chr1:1-10,000 Sujetos A, C;[0510] • Subregión 2 de CNV Chr1:10,001-89,999 Sujetos A, B, C;[0511] • Subregión 3 de CNV Chr90,000: 1-100,000 Sujetos A, B;[0513] Se realizó una comparación de las listas maestras correspondientes de NVE y PML de las subregiones de CNV (het loss frente a het loss, home loss, frente a home loss y ganancia frente ganancia), lo que dio como resultado un archivo combinado con los totales de NVE y PML para cada subregión de CNV distinta en el estudio.;[0514] Posteriormente, los datos se seleccionan de la siguiente manera (el ejemplo de cálculo a continuación se basó en una cohorte original de PML de 80 casos, de los cuales 6 son controles de HIV sin PML y 3 casos de PML que eran muestras duplicadas. En algunos casos, los valores de OR y FET informados en la Tabla 2 se utilizaron como directrices 'relativas' al considerar la relevancia de una CNV. En casi todos los casos, una CNV se consideró como una causa potencial o un factor contribuyente a la PML si no estaba en la base de datos de CNV de NVE).;[0515] ● Anotación mediante guiones diseñados a medida para adjuntar información relevante a cada región de la CNV con respecto a la superposición con genes y exones conocidos, superposición con genes implicados en el sistema inmunitario y superposición con regiones reguladoras, incluidos los sitios de unión de factores de transcripción.;[0516] ● Un cálculo de la razón de probabilidades (OR) y la prueba exacta de Fisher (FET) para cada subregión de la CNV, de acuerdo con la siguiente fórmula:;[0518] o;[0521] OR = (PML/(77-PML))/(NVE/(1005-NVE));[0522] o en la que:;[0523] o PML = número de individuos con PML con la subregión de CNV de interés;[0524] o NVE = número de individuos con NVE con la subregión de CNV de interés;[0525] Como ejemplo ilustrativo, considérese la ganancia de la subregión de CNV que involucra crm2: 55764753-55771586, que se encuentra en 3 individuos en la cohorte de PML y 1 individuo en la cohorte de NVE (véase la Tabla 2). La OR es: (3/74)/(1/1004) = 40.7;[0526] Téngase en cuenta que, por una convención, si NVE o PML = 0, se agrega un valor de 0.5 a las 4 entradas en la fórmula principal anterior, para evitar tener que lidiar con infinitos (véase Deeks y Higgins, Statistical algorithms in Review Manager 5, Statistical Methods Group of The Cocrmane Collaboration, (2010)). Esto tiene el efecto de reducir artificialmente los valores de OR en los casos en que ningún individuo dentro del NVE tiene la CNV. Este método es aplicable a todos los cálculos en la Tabla 2. Este método también se utiliza cuando se calcula la prueba exacta de 2 colas de Fisher (FET) en el caso de que alguna de las variables sea cero. Por conveniencia en el análisis, la subcohorte de 6 casos de HIV (sin PML) se retuvo en la Tabla 2. Por lo tanto, los valores de OR informados en la Tabla 2 son ligeramente diferentes de los cálculos de OR para el número real de casos de PML (n = 71). Usando el ejemplo anterior para una ganancia de la subregión de CNV que implica el crm2:55764753-55771586, el OR real usando 71 casos de PML frente a 1005 sujetos de NVE fue: (3/68)/(1/(1004) = 44.29. En algunos casos, un control del HIV sin PML (véase la Tabla 11, identificado como 3280, 3281, 3283, 3284, 3285 y 3286) se encontró que tiene una CNV de relevancia potencial en sujetos con PML. Esto también puede afectar el cálculo de OR. Por ejemplo, para la pérdida de la subregión de CNV crm19:55247874-55250186, la OR en la Tabla 2 aparece como 17.38 pero un caso es un control de HIV sin PML (Tabla 11, control de PML70 = 3280). Para este ejemplo, la OR real usando 71 casos de PML frente a 1005 sujetos de NVE, y excluyendo el caso de HIV sin PML, fue: (4/67)/(4/(1001) = 14.94.;[0527] Las subregiones/genes de CNV que se enumeran en el presente documento (por ejemplo, en una o más de las Tablas 1-4), cumplen uno de los siguientes criterios:;[0528] ● Fuerte biología que vincula el gen que una subregión de CNV impacta o está cerca, con vías/mecanismos de inmunodeficiencia conocidos o biología en PML (p. ej., biología relacionada con el virus de JC). Es decir, en algunos casos falta evidencia estadística pero no excluye a la subregión CNV como candidata;;[0529] ● Análisis estadístico combinado con medio para biología fuerte (p. ej., enlaces en la literatura revisada por pares con PML, virus de JC, defensa del huésped, inmunodeficiencia o neuropatología) sin conexión biológica obvia (la mejor FET en esta categoría fue 3.25E-10);;[0530] Los expertos en la materia pueden apreciar que el número de subregiones de CNV candidatas a PML, independientemente de la categoría, puede aumentar o disminuir a medida que se analizan cohortes de PML adicionales.;[0531] Ejemplo 3 - Secuenciación de exoma completo (WES) y análisis de nivel de caso.;[0532] Los datos de WES se obtuvieron en un total de 70 casos de PML (los casos de HIV sin PML no se secuenciaron; se usaron simplemente para ayudar en la interpretación de las CNV complejas observadas en pacientes con PML que también tenían el HIV).;[0533] Los informes de anotación de variantes se interrogaron adicionalmente contra el conjunto completo de genes detallados anteriormente. No se consideraron las variantes sinónimas y las variantes previstas como modificadoras (fuera de las regiones de codificación). Para todas las demás variantes, se realizó un filtrado adicional para que solo aquellas predichas por al menos un algoritmo de predicciónin silico(p. ej., Polyphen2, SIFT, MutationTaster) para ser patógeno se consideraron para una evaluación adicional. Finalmente, solo se evaluaron las variantes o combinaciones de variantes que se esperaría que estuvieran presentes en el 1 % o menos de la población normal para el análisis a nivel de casos (Tablas 7-10). Se utilizaron datos del Exome Aggregation Consortium (ExAC) para obtener datos de frecuencia específicos de la etnia para las variantes en consideración (véase,Lek et al., Nature, 17;536(7616): 285-91) (2016)).;[0534] Ejemplo 4 - Descripción de datos de secuencia;[0535] El archivo de secuencia 56969-701.601 ST25.txt contiene información de secuencia genómica para (en el siguiente orden):;[0536] A. Todas las distintas CNV enumeradas en la Tabla 1;;[0537] B. La extensión genómica completa de las transcripciones enumerados en la Tabla 4;;[0538] C. Variantes de secuencia detalladas en la Tabla 5.;[0539] D. La extensión genómica completa de las transcripciones enumerados en la Tabla 12;[0540] Téngase en cuenta que:;[0541] 1. Las SEQ ID 1-172 son las secuencias de CNV en la Tabla 1;;[0542] 2. Las SEQ ID 173-455 son las secuencias de las transcripciones en la Tabla 4;;[0543] 3. Las SEQ ID 1000-1329 son las variantes de secuencia en la Tabla 5;;[0544] 4. Las SEQ ID 1500-2177 son las secuencias de las transcripciones en la Tabla 12.;[0546] Ejemplos de secuencias presentadas:;[0548] La entrada de la secuencia comienza:;[0550] Tabla 1: SEQ ID 1 = CNV de 49,653 pb (het loss) en crm1: 1086119-1135772 que involucra los genes;[0551] MIR200A, MIR200B, MIR429, TNFRSF18, TTLL10:;[0552] <210> 1;[0553] <211> 49654;[0554] <212> ADN;[0555] <213> Homo sapiens;[0557] ;[0558] Finaliza la entrada de secuencia.;[0560] Comienza la entrada de secuencia:;[0562] Tabla 4: SEQ ID 173 = MIR200B, transcripción NR 029639, que tiene una longitud de 95 pb: <210> 173;[0563] <211> 95;[0564] <212> ADN;[0565] <213> Homo sapiens;[0566] <400> 173;[0569] ;[0572] Finaliza la entrada de secuencia.;[0574] Comienza la entrada de secuencia:;[0576] Tabla 5: SEQ ID 1148 = crm9:304628 alelo de referencia = G; alelo alternativo = A <210> 1148;[0577] <211> 40;[0578] <212> ADN;[0579] <213> Homo sapiens;[0580] <220>;[0581] <221> variante;[0582] <222> (20)..(20);[0583] <223> G->A;[0584] <400> 1148;[0585] tttaaaaaga ctggatctcg aaaagatttt cacaagacgc 40;[0587] Finaliza la entrada de secuencia.;[0588] Comienza la entrada de secuencia;[0590] Tabla 12: SEQ ID 1500 = ACADM, transcrito NM 000016, que tiene una longitud de 39,313 pb <210> 1500;[0591] <211> 39313;[0592] <212> ADN;[0593] <213> Homo sapiens;[0594] <400> 1500;[0597] ;[0600] Finaliza la entrada de secuencia.;[0602] Ejemplo 5;[0604] Los expertos en la técnica pueden apreciar que los genes pueden verse afectados por variantes genéticas adquiridas o de línea germinal (p. ej., CNV), donde cada gen tiene el potencial de contener variantes genéticas que se adquieren (p. ej., a través de un proceso de enfermedad como la infección por HIV o cánceres como la leucemia y el linfoma) o presentes en la línea germinal (p. ej., heredados de un padre o nuevamente, p. ej., no heredados de un padre). En la Figura 1, el gen PRKCB se vio afectado por variantes de la línea germinal en 2 casos de PML y variantes adquiridas en 6 casos de PML. La invención descrita en este documento se centra en la detección de variantes de la línea germinal que están presentes en los genomas de pacientes con PML. Por lo tanto, ninguna solución/explicación para una PML de un paciente determinado se basó en una CNV adquirida, aunque otro paciente con PML podría ser potencialmente "resuelto" por una o dos variantes raras de la línea germinal que afectan al gen.;[0606] Para este ejemplo de PRKCB, no se encontraron soluciones basadas en CNV (se asumió un modelo AR), pero se informa 1 solución SNV en la Tabla 8 (SNV het, se asume un modelo AD para este caso de PML). Se evaluó más evidencia de apoyo para el gen PRKCB mediante la realización de un análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores; string-db.org; véase Szklarczyk et al., (2015), y las referencias citadas allí). El análisis de String mostró que PRKCB interactúa con los genes CARD11, IKBKB y RBCK1 de PML-419 (véase la Tabla 6).;[0608] En la Figura 2, tanto TNFRSF13C como CENPM se ven interrumpidos y/o ganados por un conjunto de ganancias CNV adquiridas. Las CNV adquiridas pueden ser muy complejas, tal como las altas ganancias en el número de copias que a menudo se identifican en muestras de ADN derivadas de tumores (en comparación con el genoma normal del paciente). En el descubrimiento del gen de PML descrito en este documento, el ADN genómico derivado de la sangre obtenido de varios pacientes con HIV diagnósticos con PML o casos de PML con una enfermedad primaria de leucemia y linfoma (informados como 'Otros' en la Tabla 7), mostró cambios genómicos complejos (p. ej., ganancias que muestran un patrón dup-trip-dup). En algunos casos de PML, las ganancias adquiridas pasaron el corte de relación log2 (>0.5) que se seleccionó para este estudio, pero en otros casos de PML, las relaciones log2 para las ganancias fueron <0.5 y estos datos se filtraron de los análisis principales que se realizaron para determinar las CNV raras de la línea germinal.;[0610] En un caso, se utilizó un conjunto de 6 casos de HIV sin PML (3 de ascendencia africana, 3 de ascendencia europea) para ayudar en la interpretación de si una CNV era un evento adquirido o de línea germinal. Los 'casos de PML' que no son PML están etiquetados con 'control' en la Tabla 11 y corresponden a los números de ‘ID de caso de PML' 3280, 3281, 3283, 3284, 3285 y 3286. Si bien se informan algunas CNV en las Tablas 1 y 2 para este grupo de sujetos con HIV de control sin PML, ninguno de estos hallazgos genéticos se usó para nominar un gen descubierto sobre la base de CNV raras (en comparación con la base de datos NVE) como un gen potencial de PML (genes PBio informados en la Tabla 6). En otras palabras, estas CNV raras solo se usaron para ayudar a determinar si una región genómica particular que contenía múltiples CNV superpuestas se debía potencialmente a un evento genético adquirido. Los expertos en la materia pueden apreciar que el conjunto de experimentos descritos en este documento no necesariamente descarta o acepta por completo que una región genómica determinada contenga solo CNV adquiridas frente a solo CNV de línea germinal (por ejemplo, es posible que la misma región pueda contener una CNV adquirida en un individuo y una CNV de línea germinal en otro).;[0611] Para los datos de CNV que se muestran en la Figura 2, los genes TNFRSF13C y CENPM se incluyeron en la lista de genes PML-419 (Tabla 6) sobre la base de su biología inmunológica o neurológica relacionada reportada en la literatura. No se encontraron soluciones de PML para CNV o SNV para estos dos genes, pero el análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) muestra que TNFRSF13C interactúa con los genes TRAF3 de PML-419 (solución de la Tabla 7) y TNFRSF13B (solución de la Tabla 8), así como BTK (un gen de PML conocido, véase la Tabla 6).;[0612] La Figura 3 muestra otro ejemplo de un gen que se ve afectado tanto por las CNV de la línea germinal como por las adquiridas. Si bien no se resolvió ningún caso de PML sobre la base de las CNV adquiridas o de la línea germinal que se demostró que afectan al gen PKHD1, la nominación de este gen en la Tabla 6 sobre la base de su biología resultó en la búsqueda de 3 posibles soluciones alternativas (modelo AR) para otros 3 casos de PML (vease la Tabla 8). Sin embargo, el análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen PML-419 con PKHD1.;[0613] Ejemplo 6;[0614] Los expertos en la técnica pueden apreciar que un modelo de enfermedad AR implicaría determinar si ambos alelos (para un gen o un locus genético) se ven afectados por una variante genética en individuos afectados por el trastorno. Los tipos de variantes genéticas pueden ser las SNV, CNV, indels, etc. En el estudio descrito en este documento, si se invocó un modelo de enfermedad AR para un gen (vease la Tabla 6), se evaluaron los datos de CGH del paciente con PML para CNV (heterocigotos u homocigotos) y sus datos de exoma para SNV (heterocigotos u homocigotos). Por lo tanto, cada paciente puede resolverse para uno de los genes PML-419 (Tabla 6) con uno de los siguientes escenarios: eliminación homocigota, duplicación homocigota (la relación log2 parecerá comparable a la que normalmente se encuentra para las triplicaciones), SNV homocigota, SNV heterocigotas compuestas, CNV heterocigotas compuestas o SNV y CNV heterocigotas compuestas. Los expertos en la técnica saben que, para un mecanismo de enfermedad AR, una SNV o CNV patógena puede tener una frecuencia apreciable en la población general (por ejemplo, hasta un 1 % de frecuencia) con poco o ningún impacto en la salud del individuo, pero cuando se presenta con una segunda variante patogénica sobre el otro alelo, puede causar enfermedad.;[0615] La Figura 4 muestra un ejemplo de una pérdida intrónica que afecta al gen BMPR2. Se encontró que el paciente PML29 tenía una eliminación homocigota, mientras que los pacientes PML58 y MVGS811-13a tenían una eliminación heterocigota. Suponiendo un modelo de enfermedad AR, no se encontraron soluciones de SNV para este gen; sin embargo, PML29 se resuelve potencialmente debido a la eliminación homocigótica que se detectó. Si bien la biología relacionada con el sistema inmunitario se informa para los estudios sobre BMPR2 (vease la Tabla 6), el análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen PML-419 con BMPR2.;[0616] La Figura 5 muestra un ejemplo de una ganancia exónica que interrumpe el gen COMMD6. Se encontró que dos pacientes con PML tenían duplicaciones homocigotas de esta CNV. Curiosamente, aunque el análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen PML-419 con COMMD6, estudios recientes (véase la Tabla 6, PMID 25355947 y 27441653) muestran un vínculo potencial entre el gen COMMD6 y el gen WAS de PML conocido a través del gen WASH.;[0617] La Figura 6 muestra un ejemplo de una ganancia exónica que interrumpe el gen KCTD7 y su punto de ruptura derecho está secuencia arriba de RABGEF1 (p. ej., uno o ambos genes pueden estar causando/contribuyendo a la PML). Un ARN no codificante anotado recientemente (véase el ensamblaje hg19, LOC100996437) también puede verse afectado por esta CNV. Ambos genes tienen vínculos inmunológicos y neurológicos (véase la Tabla 6) y dado que el paciente PML29 tiene una duplicación homocigota, se agregó como una solución de PML en la Tabla 7. El análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen PML-419 para ninguno de los genes, pero están vinculados entre sí en un análisis de String conjunto.;[0618] La Figura 7 muestra un ejemplo de una ganancia que interrumpe FPR2 (punto de ruptura izquierdo) y ZNF616 (punto de ruptura derecho, gen no etiquetado), y otros genes están completamente abarcados por esta CNV. Hay una fuerte biología de apoyo para FPR2 (véase la Tabla 6) y aparece como una solución de PML en la Tabla 7. El análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen PML-419 para FPR2, pero un análisis conjunto de los genes de la Tabla 7 sí reveló una interacción (véase la Figura 13).;[0619] La Figura 8 muestra un ejemplo de una pérdida exónica que afecta a los genes PIK3CD y PIK3CD-AS1. El paciente MVGS811-13a tiene una eliminación homocigota y se informa como una solución en la Tabla 7 basado en la fuerte biología relacionada con el sistema inmunitario para PIK3CD (véase la Tabla 6). El análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) revela interacciones del gen PML-419 para PTEN y PIK3R1.;[0620] Ejemplo 7;[0621] Un subconjunto de las CNV raras encontradas en nuestro estudio de PML se ubicaron en regiones intergénicas. Si bien los expertos en la técnica pueden apreciar que las variantes intergénicas (CNV, SNV, etc.) pueden tener efectos de largo alcance en la expresión de genes (por ejemplo, los elementos reguladores de genes pueden ubicarse a varias kilobases de distancia de los genes bajo su influencia), en nuestro estudio asumimos que las CNV intergénicas estaban afectando potencialmente a uno o ambos genes adyacentes si estaban ubicados a <~100 Kb de distancia, ya sea secuencia arriba o secuencia abajo. El proyecto ENCODE ha revelado una gran cantidad de información, tal como los sitios de unión del factor de transcripción, y las CNV raras que se identificaron en el presente estudio se verificaron por su impacto potencial en estos sitios (se verificó la anotación ENCODE del ensamblaje hg19) y se encontró que a menudo impactan los sitios de unión del factor de transcripción y/o estaban ubicados en regiones de ADN conservadas.;[0622] La Figura 9 muestra una ganancia intergénica que está secuencia arriba de CD 180. El paciente MVGS995-4a tiene una duplicación homocigótica y, aunque no se considera una solución de PML en la Tabla 7, es potencialmente una solución alternativa que puede estar causando o contribuyendo a la PML del paciente en función de la expresión alterada de CD180. El gen tiene una biología relacionada con el sistema inmunitario (véase la Tabla 6) y el análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) revela una interacción del gen PML-419 con PLCG2 (véase la Tabla 7, 2 casos de PML tienen solución para este gen).;[0623] La Figura 10 muestra una pérdida intergénica que está secuencia arriba de VDAC1. El paciente PML30 tiene una eliminación homocigótica y, aunque no se considera una solución de PML en la Tabla 7, es potencialmente una solución alternativa que puede estar causando o contribuyendo a la PML del paciente en función de la expresión alterada de VDAC1. El análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen PML-419 para VDAC1.;[0624] La Figura 11 muestra una pérdida intergénica que está secuencia abajo de EGR1 y ETF1. El paciente PML69 tiene una eliminación homocigota y, de acuerdo con los enlaces de EGR1 a los genes PML-419 (Tabla 6) y su proximidad a EGR1 (~4 Kb de distancia), se agregó como una posible solución de PML en la Tabla 7. El análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) revela interacciones del gen PML-419 con JUN, PTEN y TP53), pero no se encontró nada importante para el análisis de String de ETF1.;[0625] La Figura 12 muestra una pérdida intergénica que está secuencia arriba de ITSN2. El paciente PML65 tiene una eliminación homocigota y, de acuerdo con los enlaces de ITSN2 a un gen conocido de PML (WAS) en la lista de genes PML-419 (Tabla 6), se agregó como una solución potencial de PML en la Tabla 7. Curiosamente, se encontró que otro caso de PML tenía una SNV homocigoto raro en ITSN2, por lo que este gen tiene 2 soluciones de PML informadas en la Tabla 7. El análisis de String (confianza alta = 0.7, primera capa = hasta 10 interactuadores) no reveló ninguna interacción del gen PML-419.;[0626] Ejemplo 8;[0627] Los análisis de vías, tales como las interacciones proteína-proteína, están proporcionando información valiosa sobre la biología subyacente de enfermedades complejas. Si bien la PML es una enfermedad muy rara que requiere varios factores concurrentes (p. ej., infección por el virus de JC), varios genes pueden estar causando de forma independiente o aumentando el riesgo de desarrollar este trastorno neurodegenerativo en función de la presencia de una variante genética en un gen determinado (por ejemplo, una variante heterocigota en la que una variante perjudicial está presente en el alelo heredado por vía materna o paterna, una variante homocigota en la que la misma variante perjudicial está presente en ambos alelos, o variantes heterocigotas compuestas en las que un par de variantes perjudiciales están presentes pero una se encuentra en el alelo de herencia materna y el otro se encuentra en el alelo de herencia paterna). Como se planteó como hipótesis, la presencia de un trastorno genético de inmunodeficiencia era otro requisito previo. De hecho, en el estudio de PML descrito en el presente documento, se propusieron 43 genes como soluciones para 61 de los 71 casos de PML (véase la Tabla 7) que se evaluaron mediante CGH de matriz y secuenciación del exoma completo. Se han desarrollado numerosos algoritmos y bases de datos asociadas para investigar vías moleculares, tales como String (vease, Szklarczyket al.,(2015), y las referencias citadas allí).;[0628] La Figura 13 muestra un ejemplo de análisis de String realizado en los 43 genes considerados como soluciones de PML sobre la base de un modelo de enfermedad de AD o AR. Se encontró una serie de interacciones para 21 de 43 genes, y en varios casos esto incluyó interacciones para genes implicados en 2 o más casos de PML que se informan en la Tabla 7 (9 casos para TNFRSF11A, 4 casos para PLCG2, 3 casos para ZAP70 y NOD2, y 2 casos de PML para TICAM1).;[0629] Ejemplo 9;[0630] Para determinar la probabilidad de que un individuo seleccionado al azar albergara una de las variantes descritas en este documento, se realizó el siguiente análisis: Para cada variante o combinación de variantes, la frecuencia específica de la etnia citada en la Tabla 7 se utilizó para determinar la probabilidad de que se esperaría que un individuo seleccionado al azar de la misma etnia no albergara la variante o combinación de variantes. Se calculó el producto de todas esas probabilidades (p. ej., la probabilidad de que un individuo seleccionado al azar no albergue ninguna de las variantes) y se restó de 1, dando como resultado la probabilidad de que un individuo seleccionado al azar albergue al menos una de las variantes. Se encontró que, para los casos de HIV, la probabilidad de que un individuo al azar albergara al menos una de las variantes era ~5 %, lo cual es consistente con el riesgo de PML anterior a la HAART en el contexto del HIV. Para los casos sin HIV (principalmente MS/NTZ), el riesgo fue de ~ 1 %, lo que, nuevamente, es consistente con el riesgo de PML en MS/NTZ, especialmente después de una terapia a largo plazo.;[0631] Estos análisis respaldan la noción de que las frecuencias de las variantes identificadas como relevantes para el riesgo de PML son consistentes con los riesgos reales observados para individuos no seleccionados. Los análisis se basan en la suposición razonable de que no existe una conexión relevante de PML con el riesgo de desarrollar HIV (una infección adquirida) y/o MS (por ejemplo, esto implica que el tratamiento de personas sanas con Natalizumab, por ejemplo, daría como resultado riesgos similares de PML). Cualquier desviación (p. ej., variantes encontradas en un número ligeramente mayor de individuos normales de lo esperado de acuerdo con los números realmente observados afectados por PML) puede deberse a: penetrancia (p. ej., no todas las personas con las variantes tendrán un riesgo máximo de PML); la suposición de que las personas con MS, HIV y otras afecciones subyacentes representaban una sección transversal normal (p. ej., con respecto al riesgo de PML) de la población general, antes de desarrollar los trastornos subyacentes HIV, MS, etc.; y bajo comprobación de PML, incluso en pacientes con HIV, MS/NTZ.;[0632] Ejemplo 10 - Tablas a las que se hace referencia en este estudio;[0633] Tabla 1: CNV de interés en este estudio;[0635] ;[0636] ;[0637] ;[0638] ;[0639] ;[0640] ;[0641] ;[0642] ;[0643] ;[0644] ;[0645] ;[0648] La Tabla 1 enumera todas las CNV de interés, obtenidas como se describe en el texto, con la excepción de que, para cada entrada, se anotan las posiciones de inicio y parada de la CNV original, junto con el tamaño original de la CNV, el tipo (pérdida heterocigótica, pérdida o ganancia homocigótica), ID del Caso y anotación del gen (para la subregión de CNV NO CNV original). La última columna contiene números de SEQ ID. La numeración cromosómica estándar utilizada por los expertos en la materia se utiliza en la Tabla 1 para los cromosomas autosómicos (1-22) pero, por conveniencia con los métodos de análisis, el cromosoma X se designa en el presente documento como cromosoma conveniencia con los métodos de análisis, el cromosoma X se denomina como crm23 en el presente documento. Todas las coordenadas se basan en hg18.;[0650] Tabla 2: Subregiones de CNV de interés en este estudio;[0651] ;[0652] ;[0653] ;[0654] ;[0655] ;[0656] ;[0657] ;[0660] La Tabla 2 es idéntica a la Tabla 1, con una serie de excepciones. En primer lugar, las coordenadas de CNV enumeradas se refieren a las subregiones de CNV reales que se encontraron únicas o significativamente diferentes entre la cohortes de enfermedad y normales, a diferencia de la Tabla 1, que enumera las CNV originales. En segundo lugar, una columna adicional detalla si las subregiones de interés de la CNV génica se superponen a un exón o no. Tercera y cuarta, 2 columnas adicionales detallan el número de casos normales y el número de casos de enfermedades que albergan la subregión de CNV relevante. Finalmente, 2 columnas informan la prueba exacta de 2 colas de Fisher (FET) y la razón de probabilidades (OR). La numeración cromosómica estándar utilizada por los expertos en la materia se utiliza en la Tabla 2 para los cromosomas autosómicos (1-22) pero, por conveniencia con los métodos de análisis, el cromosoma X se designa en el presente documento como crm23. Todas las coordenadas están en hg18.;[0662] Tabla 3: Una lista no redundante de genes enumerados en la Tabla 2;[0663] ;[0664] ;[0665] ;[0666] ;[0667] ;[0668] ;[0669] ;[0670] ;[0671] ;[0672] ;[0673] ;[0674] ;[0675] ;[0676] ;[0677] ;[0678] ;[0679] ;[0680] ;[0681] ;[0682] ;[0683] ;[0684] ;[0685] ;[0686] ;[0687] ;[0688] ;[0689] ;[0690] ;[0691] ;[0692] ;[0693] ;[0694] ;[0695] ;[0696] ;[0697] ;[0698] ;[0699] ;[0700] ;[0701] ;[0702] ;[0703] ;[0704] ;[0705] ;[0706] ;[0707] ;[0708] ;[0709] ;[0710] ;[0711] ;[0712] ;[0713] ;[0714] ;[0715] ;[0716] ;[0717] ;[0718] ;[0719] ;[0720] ;[0721] ;[0722] ;[0723] ;[0724] ;[0725] ;[0726] ;[0727] ;[0728] ;[0729] ;[0730] ;[0732] Para todos los genes enumerados en la Tabla 2 (es decir, aquellos relevantes para las subregiones de interés de la CNV), la Tabla 3 representa una lista no redundante.;[0733] Tabla 4: Una lista no redundante de variantes de transcripción que corresponden a los genes en la Tabla 3; ;[0734] ;[0735] ;[0736] ;[0737] ;[0738] ;[0739] ;[0740] ;[0741] ;[0742] ;[0743] ;[0744] ;[0745] ;[0748] Para todos los genes enumerados en la Tabla 2 (a saber, aquellos relevantes para las subregiones de interés de la CNV), la Tabla 4 representa una lista no redundante.;[0750] Tabla 5: El conjunto de SNV reportados en las Tablas 7-10, 14 o 15 que se encontraron en los 70 casos de PML en este estudio ara los cuales se eneraron datos de WES.;[0753] ;[0754] ;[0755] ;[0756] ;[0757] ;[0758] ;[0759] ;[0760] ;[0761] ;[0762] ;[0764] La Tabla 5 enumera, en orden de coordenadas genómicas, todas las variantes de un solo nucleótido (SNV) que son relevantes para el presente estudio, ya sea como soluciones a nivel de caso (Tablas 7, 8) o soluciones posibles (Tablas 9, 10), o al nivel de análisis de carga variante (Tablas 14, 15). Todas las coordenadas del genoma se basan en hg19;[0765] ;[0768] ; ;[0769] ;[0770] ;[0773] ı72; ;[0776] ı73; ;[0778] ı74; ;[0780] ı75; ;[0782] ı76; ;[0784] ı77; ;[0786] ; ;[0789] ; ;[0790] ;[0791] ;[0793] ı82; ;[0796] ı83; ;[0799] ı84; ;[0802] ı85; ;[0804] ı86 La Tabla 6 es una lista completa de 419 ejemplos de genes (referidos en el presente documento como 'genes PML-419' o 'lista de genes PML-419') interrogados en el presente estudio, junto con información relacionada con el patrón de herencia asumido para el análisis y la razón para la inclusión del gen. Fuentes de genes para la Tabla 6 (encabezado de columna 'Fuente de genes'): 1) nominados sobre la base de estar vinculados a la inmunodeficiencia, seleccionados de bases de datos públicas (indicadas por 'Public db') como PubMed y ClinVar, 2) genes identificados por PBio CNV ('PBio', véase el encabezado de columna de la Tabla 6 'Fuente de genes') de un estudio de descubrimiento de genes CGH de matriz amplia del genoma de 71 casos de PML, o 3) seleccionados de bases de datos públicas e identificados en el estudio de descubrimiento de genes de PML de PBio (indicado por 'Ambos'). Se propuso una predisposición genética a la PML con base en el genoma del huésped; es decir, lao las variantes genéticas de línea germinal en el genoma del paciente con PML, en lugar de las variantes genéticas que están presentes en el virus de JC, son la causa de la PML del paciente (Hatchwell, Front Immunol., 6: 216 (2015)). Los detalles sobre la fuente de los genes en la lista de genes PML-419 se pueden encontrar en las siguientes fuentes de genes relacionados con la inmunodeficiencia y la inmunidad: Durandy et al., Nat Rev Immunol., 13(7):519-33 (2013); Milner et al., Nat Rev Immunol., 13(9):635-48 (2013); Paciolla et al., Genes Immun., 16(4): 239-46 (2015); Hatchwell, Front Immunol., 6: 216 (2015); Thijssen et al., Nat Commun., 6: 7870 (2015); Chinn et al., Immunol Allergy Clin North Am., 35(4):671-94 (2015); Zhou et al., Nat Genet., 48(1):67-73 (2015); Navabi et al., Allergy Asthma Clin Immunol., 12:27 (2016); y Tsujita et al., J Allergy Clin Immunol. (2016). Los genes de MySql se derivan de la base de datos ClinVar. Se buscó en ClinVar usando los términos "deficiencia inmune" e "inmunodeficiencia". Se excluyeron las entradas que describían grandes reordenamientos genómicos, que contenían múltiples genes. Se compiló una lista no redundante de 125 genes combinando el resultado de las dos búsquedas y se depositó en una base de datos MySQL. NOTA: Un subconjunto de estos genes no está etiquetado como 'MySql' si apareció en uno o más de los artículos de revisión de genes inmunitarios mencionados anteriormente. van der Kolk et al., Ann Clin Transl Neurol.; 3(3): 226-32 (2016) fue la fuente del gen BAG3 de PML conocido (véase más abajo) y 28 genes candidatos de PML con base en la conexión con JCV. van der Kolket al.,cita un método de la siguiente manera: "este último se realizó buscando JCV en NCBI y seleccionando genes en humanos". Esto arrojó 30 genes humanos, 5 de los cuales se superpusieron con la lista de genes de PML y 2 genes (HLA-DQB1, HLA-DRB1) fueron excluidos porque los loci de HLA son difíciles de interpretar. Los genes ADA, BAG3, BTK, CD40LG, DOCK8, STAT1, WAS y WIPF1 se derivaron de Hatchwell, Front Immunol., 6: 216 (2015) (véase la Tabla 1 para referencias primarias); van der Kolk et al., Ann Clin Transl Neurol., 3(3): 226-32 (2016); y Zerbe et al., Clin Infect Dis., 62(8): 986-94 (2016). Los genes PBio se basan en estudios de CNV y un subconjunto se superpone a las listas de genes de revisión inmunitaria (anotados como 'Ambos' en el encabezado de la columna 'Fuentes del gen'). Los genes de nivel 1 se utilizaron como posibles soluciones para los casos de PML. La determinación del modelo de enfermedad autosómica dominante (AD), autosómica recesiva (AR), dominante ligado a X (XLD) o ligado a X (XLR) para cada gen se derivó de los artículos de revisión de inmunodeficiencia y/o anotaciones OMIM. Las entradas marcadas como 'asociación' indican que se encontró que las variantes estaban asociadas con una afección relacionada con el sistema inmunitario; 'desconocido' indica que no hay evidencia reportada en la literatura para un modelo AD o AR.;[0805] ;[0808] ı88; ;[0810] ;[0811] ;[0813] La Tabla 7 contiene una solución/explicación genética única que es la causa potencial de PML en cada paciente del estudio (71 casos se evaluaron con CGH de matriz amplia del genoma y 71 también se evaluaron mediante secuenciación del exoma completo), con la excepción de 19 casos "sin resolver". Las soluciones se basan en una combinación de variantes CNV y SNV, conectadas por las SEQ ID con las tablas 1, 4 y 5. Para soluciones de variantes homocigotas o heterocigotas compuestas, las frecuencias de población esperadas se calcularon de la siguiente manera:;[0814] Frecuencia de población esperada para la variante a (frec. p) y variante b (frec. q) = pq/4.;[0815] Por ejemplo, PML09 tiene 2 variantes, SEQ ID 1221 y 1222, con frecuencias individuales en la población normal de 0.00399, 0.287. La frecuencia esperada en una población normal emparejada étnicamente para esta combinación es (0.00399<∗>0.287)<*>0.25 = 0.000286283 = 1/3,497.

[0816] Los identificadores de enfermedades primarias en la Tabla 7 son: HIV, infección por el virus de la inmunodeficiencia humana; MS (NZ Rx), esclerosis múltiple tratada con natalizumab; otro, que incluye una variedad de trastornos/afecciones (MVGS694-6a tenía anemia aplásica, PML02 y PML52 tenían linfoma, PML45 y PML 57 tenían leucemia linfocítica crónica, PML53 tenía sarcoidosis y PML69 es un paciente de trasplante de riñón que estaba con belatacept).

[0817] Las soluciones se consideraron sobre la base de la presencia de variantes raras (CNV y/o SNV) en o cerca de los genes que se enumeran en Tabla 6. Los modelos de enfermedad autosómica recesiva (AR) y autosómica dominante (AD) comprenden este conjunto de soluciones, basadas en la búsqueda de SNV homocigotos, CNV homocigotos, SNV heterocigotos compuestos o SNV heterocigotos. Nueve casos de PML en la Tabla 7 se consideraron 'no resueltos' sobre la base del análisis de los datos de CNV y SNV, y un caso (PML67) se evaluó para CNV solo porque los datos de WES no estaban disponibles. En algunos casos, un caso se consideró sin resolver para una mejor solución (Tabla 7) pero se informaron soluciones alternativas en la Tabla 8 (véase más abajo).

[0818] Para casos de PML que tenían más de una posible solución. En estos casos, la 'mejor' solución (Tabla 7) se determinó sobre la base de la rareza de la o las variantes genéticas y la fuerza relativa de la biología para los genes PML-419 (Tabla 6). Las soluciones alternativas se informan en la Tabla 8. Por ejemplo, para el caso de PML MVGS1116-8a, se encontraron tres soluciones que afectaron a los genes DOCK8, HIVEP2 y RNF168. En este ejemplo, las SNV heterocigotas compuestas DOCK8 (Tabla 7, SNV hom y SNV het) fueron seleccionados como la mejor solución porque DOCK8 es un gen PML conocido. En otro ejemplo, el caso de PML MVGS1359 tiene IL17F (het SNV) como la mejor solución en la Tabla 7 porque es más raro que las soluciones alternativas para los genes ATR y STXBP2.

[0819] Mientras que algunos pacientes con PML pueden tener múltiples genes/variantes que causan y/o contribuyen a su PML, en muchos pacientes con PML solo un único gen será la causa principal análoga a los pacientes diagnosticados con trastornos de inmunodeficiencia primaria. Además de las soluciones alternativas informadas en la Tabla 8, que se basan únicamente en hallazgos genéticos de SNV, se informan soluciones alternativas adicionales basadas en hallazgos genéticos de CNV en la Tabla 1.

[0820] Tabla 8: Soluciones/ex licaciones enéticas alternativas como osible causa de PML en el estudio

[0822]

[0823]

[0824]

[0825]

[0828] La Tabla 8 contiene información análoga a la Tabla 7, con la excepción de que Etnicidad, Género y Enfermedad primaria no se repiten. La Tabla 8 contiene soluciones/explicaciones genéticas alternativas como la posible causa de PML para los pacientes en el estudio (71 casos se evaluaron con CGH de matriz amplia del genoma y 70 también se evaluaron mediante secuenciación del exoma completo). Las soluciones en Tabla 8 también son a nivel de caso y representan soluciones alternativas secundarias para los casos enumerados (utilizando los mismos criterios utilizados para identificar soluciones posibles informadas en Tabla 7). En otras palabras, para algunos individuos, se identificó más de una solución razonable y, mientras que aquellos en Tabla 7 se consideran los más probables, aquellos en la Tabla 8 también son posibles soluciones. Los expertos en la técnica pueden apreciar que más datos sobre nuevos casos de PML, pacientes con trastornos de inmunodeficiencia de origen genético o estudios funcionales sobre un gen determinado pueden respaldar la selección de una solución de la Tabla 8 como la 'mejor' solución única (por ejemplo, una solución actual de la Tabla 7 podría considerarse en cambio como una solución de la Tabla 8 y viceversa).

[0830] Tabla 9: Pares de SNV que afectan al mismo gen

[0831]

[0834] ı95

[0836] ı96

[0838] ı97

[0840] ı98

[0842] ı99

[0843] La Tabla 9 enumera, para cada caso (en varias filas), variantes para las que no fue posible, utilizando los datos disponibles de secuenciación del exoma completo (WES), determinar la fase (p. ej., si dos variantes están en cis, en el mismo cromosoma, o trans en cromosomas opuestos). La determinación de la fase es una consideración importante cuando se trata de trastornos que se evalúan de forma autosómica recesiva (AR). Si se sabe que están presentes dos variantes pero es imposible determinar si están en cis o trans, entonces es imposible concluir que ambas copias del gen están afectadas, a diferencia de solo una (aunque con 2 variantes). Este problema no surge en el caso de variantes homocigotas, para las cuales es obvio que las variantes deben estar en trans (por ejemplo, solo es un problema para variantes no idénticas). Todas las coordenadas del genoma se basan en la construcción hg19.

[0844] En resumen, la Tabla 9 enumera todas las soluciones de SNV heterocigotas compuestas a nivel de caso desfasadas, que podrían representar más soluciones a nivel de caso, donde el ajuste de fase hubiera sido posible. Además, los expertos en la materia pueden apreciar que las soluciones desfasadas informadas en la Tabla 9 (2 SNV het por gen) o la Tabla 10 (véase a continuación, que informa SNV het en pacientes que también tienen un CNV informado en Tabla 1) potencialmente puede causar o contribuir a la PML del paciente si el análisis genético de seguimiento revela que el par de variantes se encuentran en alelos diferentes (p. ej., cada copia del gen se ve afectada por una variante). Las variantes reportadas en las Tablas 1, 9, o 10 también pueden resultar significativamente perjudiciales por sí mismas (p. ej., en estudios funcionales en células derivadas de pacientes, modelos animales, etc.) y, por lo tanto, constituyen una solución de modelo de AD (p. ej., genes que actualmente figuran como modelo 'AR' en la Tabla 6) puede ser causal o contribuir a la enfermedad a través de un modelo AD o AR, como varios genes que ya se sabe que son AD o AR (Tabla 6, modelo de enfermedad 'AD AR').

[0845] Tabla 10: SNV encontradas en genes que se sospecha que son afectadas por las CNV adquiridas

[0847]

[0850] <1>El SNV DUSP16 (crm12: 12673965) estaba en trans con una eliminación del crm12 de DUSP16 en este paciente (PML02), cuyo diagnóstico primario fue linfoma.

[0851] La Tabla 10 es una lista de todos las SNV heterocigotas que son heterocigotas potencialmente compuestas con una CNV en el alelo. Véase el texto para una explicación más completa. Todas las coordenadas del genoma se basan en la construcción hg19.

[0852] Tabla 11: Clave ue asi na la ID de la muestra ara los casos de PML a los números de ID de casos de PML

[0855]

[0856]

[0857]

[0860] La Tabla 11 proporciona la ID de la muestra y la ID de caso de PML (ID experimental para datos de CGH) para 77 'casos de PML' (incluye 6 casos de HIV sin PML enumerados como controles).

[0862] Tabla 12: Listado no redundante de variantes de transcripción que corresponden al conjunto de genes de los ue no se han informado "soluciones" de CNV en los 71 casos de PML

[0864]

[0865]

[0866]

[0867]

[0868]

[0869]

[0870]

[0871]

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[0887]

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[0889]

[0890]

[0891]

[0892]

[0893]

[0896] La Tabla 12 enumera todas las variantes de transcripción para los genes en la Tabla 6 que no fueron 'descubiertos' por PBio sobre la base de aCGH (genes identificados con CNV). Las SEQ ID NO corresponden a variantes de transcripción (a menudo más de una por gen).

[0898] Tabla 13: Genes para los que se encontró que la carga total de variantes heterocigotas dañinas era estadísticamente ma or en los casos de PML ue en los controles de ExAC

[0900]

[0901]

[0904] La Tabla 13 enumera los genes para los que se encontró que la carga total de variantes heterocigotas dañinas era estadísticamente mayor en los casos de PML que en los controles de ExAC. El análisis de la carga génica se realizó como se describe a continuación con puntos de corte de frecuencia de alelos menores (MAF) de 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 y 0.05. No todos los genes sobrevivieron al análisis estadístico en todos los puntos de corte de MAF. Para cada gen que sobrevivió a múltiples cortes de MAF, se calcularon los promedios de la prueba exacta de Fisher (FET), nominal y corregido, al igual que las otras métricas relevantes. Dos genes se superpusieron entre los análisis AFR y EUR. Las FET se corrigieron para múltiples pruebas con la cantidad de genes utilizados en este estudio (419). Solo se consideraron para la inclusión los genes para los que la FET corregida era < 0.05 y en los que las variantes afectaban a > 10 % de los casos dentro de la etnia dada (> 2 para AFR, > 4 para EUR).

[0905]

[0908]  La Tabla 14 enumera el nivel superior de variantes que se encontraron significativas sobre la base del análisis de carga de variantes, como se describe a continuación. Para cada variante (las coordenadas del genoma se basan en UCSC hg19), se presenta información detallada del número de casos de EUR y AFR que presentan la variante, junto con las métricas estadísticas agregadas y específicas de la etnia.

[0909]

[0912] 

[0915] 

[0917]  La Tabla 15 enumera el segundo nivel de variantes que se encontraron sobre la base del análisis de carga de variantes, como se describe a continuación. Para cada variante (las coordenadas del genoma son UCSC hg19), se presenta información detallada del número de casos de EUR y AFR que portan la variante, junto con las métricas estadísticas agregadas y específicas de la etnia.

[0918] Tabla 16: Escenario de rueba otencial, basado en aciertos de car a de variante rinci al

[0920]

[0922] La Tabla 16 enumera un escenario de prueba potencial, basado en los principales aciertos de carga de variantes (informados en la Tabla 14). El análisis es solo para fines ilustrativos, y se reconoce que se pueden obtener mayores rendimientos diagnósticos analizando un mayor número de variantes, incluidas las enumeradas en la Tabla 15. Se dan ejemplos del rendimiento del diagnóstico utilizando variantes de un solo componente, así como una variedad de combinaciones, incluido el uso de las 4 variantes principales. Para este conjunto de variantes, el método de prueba se describe como genotipado, en oposición a la secuenciación de genes completos (p. ej., determinación del estado en cada una de las bases, lo que produce un resultado binario, en oposición a la identificación de variantes en otras partes de los genes relevantes).

[0923] Tabla 17: Posible escenario de prueba utilizando genes identificados que tienen una mayor carga de variantes heteroci otas dañinas en la cohorte de PML

[0926]

[0928] La Tabla 17 enumera un posible escenario de prueba utilizando genes identificados por tener una mayor carga de variantes heterocigotas dañinas en la cohorte de PML (véase la Tabla 13). La naturaleza del método de prueba es la 'secuenciación de genes' ya que las variantes no se conocen de antemano - todas y cada una de las variantes potencialmente dañinas deben considerarse en dicho ensayo.

[0929] Tabla 18: Resumen de los genes que sobreviven a los análisis a nivel de casos, carga de genes y/o carga de variantes

[0930]

[0932] La Tabla 18 representa un resumen de los genes que sobreviven a nivel de caso (2 o más ejemplos en las Tablas 7, 8), carga de genes y/o análisis de carga de variantes (con base en las Tablas 13 y 14). Cabe destacar que PLCG2 satisface los 3 criterios (2 o más ejemplos, en la Tabla 8, presencia en las Tablas 13, 14). Este resumen demuestra que muchos genes han sido identificados como significativos sobre la base de métodos de análisis independientes.

[0933] Ejemplo 11 - Figuras a las que se hace referencia en este estudio

[0934] Las Figuras 1-12 representan ejemplos de datos de CNV del estudio de descubrimiento del gen de PML (71 casos de PML, véase la Tabla 7 para información del paciente) utilizando una matriz CGH (métodos descritos en este documento). En cada figura/dibujo: 1) las coordenadas del genoma se enumeran en la parte superior (ensamblaje hg18, número de cromosoma y posición representada); 2) la pista de datos 1 (etiquetada como 'Genes') representa la ubicación de los genes de RefSeq (los exones son porciones de color gris oscuro de las barras, los intrones son porciones de color gris claro de las barras); 3) la pista de datos 2 (etiquetada como 'cohorte normal') muestra el tamaño y la ubicación de las CNV encontradas en la cohorte de NVE (base de datos de control patentada de PBio que consiste en hallazgos de CNV en sujetos aparentemente sanos, por ejemplo, normales, véase los métodos en el presente documento) con el eje y correspondiente al número de sujetos de NVE que tienen la CNV; y 4) las pistas de datos restantes son datos de CNV que se encuentran en pacientes con PML individuales en los que el eje y corresponde a la relación log2 (véase los métodos en el presente documento), los puntos representan sondas individuales en la micromatriz y los segmentos de línea se desplazan a positivo (ganancia del número de copias) o negativo (pérdida de número de copias) basado en la salida de DNAcopy, el algoritmo de llamadas de CNV. Las proporciones típicas de log2 para ganancias y pérdidas en el micromatriz 1M de Agilent (véase los métodos en el presente documento) y nuestros protocolos experimentales son: 0.6 para duplicaciones, 1.0 para triplicaciones (o duplicaciones homocigotas), -1.0 para eliminaciones heterocigotas y <-2 (a menudo -4.0 a -6.0) para eliminaciones homocigotas. Los genes relevantes están etiquetados en la pista de datos de 'Genes'.

[0935] La Figura 1 representa un ejemplo de un gen afectado por la línea germinal y las CNV adquiridas. Las CNV de la línea germinal que afectan al gen PRKCB incluyen al paciente PML50 con una pérdida heterocigota intrónica de 4.8 Kb (también encontrada en 7 sujetos normales) y al paciente PML11 con una ganancia intrónica de 7.3 Kb (también encontrada en 1 sujeto normal). Se encontraron CNV adquiridos en 6 pacientes con PML, una serie de aumentos de ~23.9 Mb con proporciones log2 variables, lo que sugiere una población de células mixtas (se realizaron experimentos de matriz CGH en ADN genómico derivado de sangre).

[0936] La Figura 2 representa un ejemplo de genes potencialmente relevantes para la PML (TNFRSF13C y CENPM) afectados por las CNV adquiridas. Se encontraron CNV adquiridas en 9 pacientes con PML, una serie de ganancias de ~40.6 Mb con proporciones log2 variables, lo que sugiere una población de células mixtas (se realizaron experimentos de matriz CGH en ADN genómico derivado de sangre). Los 9 pacientes con PML (véase la Tabla 7 para información del paciente) tenían un diagnóstico primario de HIV y eran de género mixto (3 mujeres y 6 hombres) y etnia (4 de ascendencia africana y 5 de ascendencia europea).

[0937] La Figura 3 representa un ejemplo de un gen afectado por las CNV. En el paciente PML26 se detectó una pérdida heterocigota intrónica de 7.2 Kb (que no se encuentra en sujetos normales, pero se encuentra una pérdida adyacente en 8 sujetos normales) que afecta al gen PKHD1. Se encontraron CNV en 3 pacientes con PML, una serie de ganancias de ~51.9 Mb con proporciones log2 variables, lo que sugiere una población de células mixtas (se realizaron experimentos de matriz CGH en ADN genómico derivado de sangre).

[0938] La Figura 4 representa un ejemplo de un gen afectado por una pérdida de CNV. La eliminación intrónica de 14.7 Kb afecta al gen BMPR2. Se detectaron eliminaciones heterocigotas en los pacientes PML58 y MVGS811-13a (también encontradas en 2 sujetos normales), y se detectó una eliminación homocigótica en el paciente PML29 (ninguna encontrada en sujetos normales). Los tres pacientes con PML son hombres y su enfermedad primaria es el HIV (véase la Tabla 7).

[0939] La Figura 5 representa un ejemplo de un gen afectado por una ganancia de CNV. La ganancia exónica de 10.2 Kb interrumpe el gen COMMD6. Dos pacientes con PML, PML29 y MVGS811-13a, tienen una duplicación homocigótica (proporción log2 comparable a las triplicaciones) basada en la observación de que se informa que 1000 genomas de sujetos tienen esta ganancia (véase la variante esv3632749 de DGV del ensamblaje hg19, que informa que 148 de 2504 sujetos tienen esta ganancia; no se encontraron sujetos normales en la base de datos de NVE de PBio). Ambos pacientes con PML son hombres y su enfermedad primaria es el HIV (véase la Tabla 7).

[0941] La Figura 6 representa un ejemplo de un gen afectado por una ganancia de CNV. La ganancia exónica de 27.4 Kb interrumpe el gen KCTD7 y el punto de interrupción correcto es 16-90 Kb secuencia arriba de las variantes de transcripción RABGEF1 (RefSeq: NM 001287060, NR 104676, NM 014504, NM 001287062, NM 001287061). El paciente PML29 tiene una duplicación homocigótica (proporción log2 comparable a las triplicaciones) basada en la observación de que se informa que 1000 genomas de sujetos tienen esta ganancia (véase la variante esv3613515 de DGV del ensamblaje hg19, que informa que 28 de 2504 sujetos tienen esta ganancia; no se encontraron valores normales en db de NVE de PBio). El paciente PML63 tiene una duplicación. Ambos pacientes con PML son hombres de ascendencia africana y su principal enfermedad es el HIV (véase la Tabla 7).

[0943] La Figura 7 representa un ejemplo de un gen afectado por una ganancia de CNV. La ganancia exónica de 344 Kb interrumpe los genes FPR2 y ZNF616 (a través de los puntos de corte izquierdo y derecho) y los genes adicionales incluidos completamente en esta CNV son: FPR3, ZNF350, ZNF350-AS1, ZNF432, ZNF577, ZNF613, ZNF614, ZNF615, ZNF649, ZNF649-AS1, ZNF841. El paciente PML03 tiene una duplicación homocigótica (proporción log2 comparable a las triplicaciones) de acuerdo con la observación de que 3 sujetos normales (db DE NVE de PBio) tienen una duplicación de esta región, junto con el paciente PML 10. Ambos pacientes con PML son mujeres de ascendencia europea y sus principales enfermedades son el HIV y MS (véase la Tabla 7).

[0945] La Figura 8 representa un ejemplo de un gen afectado por una pérdida de CNV. La eliminación exónica de 1.1 Kb afecta a los genes PIK3CD y PIK3CD-AS1 (el símbolo del gen anterior era Clorf200). Se detectó una eliminación homocigota en el paciente MVGS811-13a y esta pérdida (heterocigota u homocigota) no se encontró en sujetos normales ni en la base de datos pública del CNV de la DGV. El paciente con PML es un hombre y su enfermedad primaria es el HIV (véase la Tabla 7). Se presume que tiene ascendencia EUR (las etnias no estaban disponibles para las muestras de MVGS).

[0947] La Figura 9 representa un ejemplo de un gen afectado por una ganancia de CNV intergénica. La ganancia intergénica de 16.7 Kb tiene un punto de corte izquierdo que está 105 Kb secuencia arriba del gen CD 180 (variante de transcripción de RefSeq NM 005582). El paciente MVGS995-4a tiene una duplicación homocigótica (proporción log2 comparable a las triplicaciones) basada en la observación de que se informa que los 1000 genomas de sujetos tienen esta ganancia (véase la variante esv3605336 de DGV de ensamblaje hg19, que informa que 2 de 2504 sujetos tienen esta ganancia; no se encontraron sujetos normales en la base de datos de NVE de PBio). El paciente con PML es un varón de ascendencia europea y su enfermedad primaria es la MS (véase la Tabla 7).

[0949] La Figura 10 representa un ejemplo de un gen afectado por una pérdida de CNV intergénica. La eliminación homocigótica intergénica de 7.7 Kb tiene un punto de corte izquierdo que está 3-4 Kb secuencia arriba de las variantes de transcripción de VDAC1 (RefSeq: NM 003374, NR 036625, NR 036624). Esta pérdida (heterocigota u homocigota) no se encontró en sujetos normales ni en la base de datos pública de CNV de la DGV. El paciente PML30 es un varón de ascendencia europea y su principal enfermedad es el HIV (véase la Tabla 7).

[0951] La Figura 11 representa un ejemplo de un gen afectado por una pérdida intergénica de CNV. La eliminación homocigota intergénica de 6.8 Kb tiene un punto de corte izquierdo que está 4 Kb secuencia abajo de la variante de transcripción EGR1 (RefSeq: NM 001964) y 26 Kb secuencia abajo de las variantes de transcripción de ETF1 (RefSeq: NM 001256302, NM 004730, NM 001282185, NM 001291975, NM 001291974). Se encontró que esta pérdida era homocigota en 1 sujeto normal y la pérdida también se informó en la base de datos pública de CNV de la DGV (véase la variante esv3606925 de DGV del ensamblaje hg19, que informa que 33 de 2504 sujetos tienen esta pérdida, se desconocen los sujetos homocigotos frente a los heterocigotos). El paciente PML69 es un varón de ascendencia europea y su principal enfermedad (afección) es un trasplante de riñón (véase la Tabla 7, reportado como 'Otro'). El paciente PML69 fue tratado con CTLA4-Ig (belatacept, un bloqueador de la coestimulación de CD28-B7 e inductor de la anergia de las células T). La vía de CD28 incluye vínculos con el hallazgo genético del paciente (p. ej., eliminación homocigótica adyacente al gen EGR1) y varios otros genes que pueden estar relacionados con la inmunodeficiencia (p. ej., CD40LG, ITK, LCK, LRBA, PIK3CD, PIK3R1, PLCG2, WAS, y ZAP70) (Dekeyser M et al., Open Forum Infect Diseases, 2016, Refractory T-Cell Anergy and Rapidly Fatal Progressive Multifocal Leukoencephalopathy following Prolonged CTLA4 Therapy).

[0952] La Figura 12 representa un ejemplo de un gen afectado por una pérdida de CNV intergénica. La eliminación homocigótica intergénica de 5.6 Kb tiene un punto de corte izquierdo que está 20 Kb secuencia arriba de las variantes de transcripción de ITSN2 (RefSeq: NM 019595, NM 006277, NM 147152). Se encontraron pérdidas heterocigotas en 50 sujetos normales y la pérdida también se informó en la base de datos pública de CNV de la DGV (véase la variante esv3590068 de la DGV del ensamblaje hg19, que informa que 222 de 2504 sujetos presentan esta pérdida; se desconocen los sujetos homocigóticos frente a los heterocigóticos). El paciente PML65 es un varón de ascendencia africana y su principal enfermedad es el HIV (véase la Tabla 7).

[0953] La Figura 13 representa un ejemplo de interacciones de proteínas conocidas y/o previstas utilizando la base de datos String (string-db.org; véase Szklarczyk et al., (2015) y referencias citadas allí). Una lista no redundante de todos los genes informados en la Tabla 7 (43 genes, que incluían aquellos cuya expresión se infirió que estaba afectada por una CNV intergénica cercana) como mejores soluciones/explicaciones para 61 de 71 casos de PML (11 casos de PML se notifican como 'sin resolver', incluido 1 caso para el que solo se obtuvieron datos de CGH) se evaluó mediante el uso de la base de datos de String. La "puntuación de interacción mínima requerida" se fijó en "confianza alta (0.7)" y no se agregaron "interactuadores" adicionales. De los 43 genes de entrada, se encontró que 21 tenían interacciones de alta confianza, como se muestra en la figura, junto con la anotación del número de casos de PML que tenían cada uno de estos genes como solución/explicación (p. ej., 3 casos de PML en la Tabla 7 se encontró que tenían una solución PLCG2).

[0954] Ejemplo 12 - Análisis de carga génica

[0955] El análisis de la carga génica se realizó de la siguiente manera. Usando una variedad de guiones internos y datos descargados de ExAC (exac.broadinstitute.org), se realizó un conteo de todas las variantes que ocurren en cada uno de los 419 genes enumerados en la Tabla 6. Cada variante se clasificó de acuerdo con si se consideraba dañina (sobre la base de al menos uno de los algoritmos de predicción SIFT, PolyPhen2 o MutationTaster) o no dañina, heterocigota u homocigota. Esto se realizó en paralelo para las variantes de PML y las encontradas en ExAC. Los datos de ExAC para los que la calidad/cobertura era < 80 % de lo esperado no se utilizaron y, por lo tanto, no se pudo realizar el análisis de la carga génica.

[0956] Luego se realizó una comparación específica de la etnia (solo EUR o AFR, hubo muy pocos casos de LAT para este tipo de análisis) para cada una de las 4 categorías:

[0957] ● Daño homocigoto

[0958] ● Sin daño homocigoto

[0959] ● Daño heterocigoto

[0960] ● Sin daño heterocigoto

[0961] Se consideraron para las 4 categorías, variantes con cortes de frecuencia de alelos menores (MAF) de 0.01, 0.02.0.03.0.04, 0.05 y 0.1.

[0962] Para cada comparación, se calcularon las relaciones de probabilidades (OR) y la prueba exacta de Fisher (FET) para la comparación del número de casos de PML con al menos una variante del tipo en consideración y aquellos en ExAC. La corrección para pruebas múltiples se realizó multiplicando la FET por el número de genes considerados (419). Solo los genes para los que la FET corregida fue < 0.05 se incluyeron en la Tabla 13, que contiene datos sobre los valores promedio para un gen dado en todos los MAF que pasaron la corrección de la FET. En la práctica, solo la categoría de daño heterocigoto produjo genes significativos.

[0963] Ejemplo 13 - Análisis de carga variante

[0964] Para cada variante identificada en al menos un caso de PML, se realizó un recuento para obtener la frecuencia de la misma variante en el conjunto de la cohorte. Estos datos agregados se compararon con los recuentos de la misma variante informados en ExAC. Los datos de ExAC se filtraron por calidad/cobertura y no se realizó un análisis de carga de variantes si la cobertura esperada de ExAC era < 80 %.

[0965] El análisis de carga variante se realizó por separado para las cohortes EUR (n = 44 casos) y AFR (n = 21 casos) (la cohorte LAT era demasiado pequeña) y se calcularon los valores de OR y FET. A partir de este análisis, solo se consideraron las variantes con OR >1 (p. ej., potencialmente indicativas de un mayor riesgo de PML) para ambas etnias (AFR y EUR) y para las cuales la frecuencia de ExAC de la variante fue <5 %. Además, solo aquellas variantes para las que la frecuencia en la cohorte específica de la etnia fue >10 % (5 o más casos de EUR, 3 o más casos de AFR) se consideraron de primer nivel (Tabla 14), aunque se han tabulado otras variantes en la Tabla 15.

[0966] Ejemplo 14 – Ejemplos de pruebas de predicción del riesgo de PML

[0967] La Tabla 16 proporciona ejemplos de marcadores para crear una prueba de predicción de riesgo de PML simple y de bajo costo (SNV específicas del genotipo). Otros marcadores podrían diseñarse de manera similar a partir de otras SNV informadas en las Tablas 14 y 15. Se podrían utilizar diferentes combinaciones de SNV de las Tablas 14, 15 en pruebas de complejidad variable, para desarrollar una prueba que produzca rendimientos de diagnóstico más altos que el ejemplo principal enumerado en la Tabla 16 (por ejemplo, 40 %).

[0968] La Tabla 17 proporciona ejemplos de genes que podrían incluirse en una prueba de secuenciación de panel de genes para la predicción del riesgo de PML. Otros paneles de genes podrían diseñarse de manera similar a partir de los genes informados en la Tabla 13, o de otras tablas divulgadas en este documento.

[0969] La Tabla 9 contiene variantes de 'ejemplo' que pueden considerarse como causas de inmunodeficiencia de 'AD' (p. ej., la presencia de solo 1 de las 2 SNV het notificadas en un paciente determinado puede estar causando inmunodeficiencia), lo que puede aumentar el riesgo de PML. Por ejemplo, este puede ser un escenario más probable para SNV het que son "nuevas" en la base de datos de ExAC (p. ej., que no se encuentran en la población general), e incluso más probable si tales SNV nuevas se encuentran en > =2 casos de PML (independientemente del modelo de enfermedad invocado). Ejemplos de esto incluyen los siguientes 3 genes:  AK2, 2 casos (Tabla 9), crm1:33476435, C>A, nuevos en ExAC PML20 y PML33, AFR y EUR, ambos HIV  EPG5, 2 casos (Tabla 9), crm18: 43445601, T>G, nuevos en ExAC PML25 y PML27, ambos EUR, ambos HIV

[0970]  TNFRSF11A, 9 casos (Tabla 7), crm18: 60052034, A>C, nuevos en ExAC, véase la Tabla 7 para las ID de casos, 2 AFR y 7 EUR, todos HIV

[0971] Los expertos en la técnica pueden apreciar que los genes de inmunodeficiencia que actualmente se sabe que causan la enfermedad de AR pueden causar potencialmente la enfermedad de AD. Se han informado numerosos ejemplos en la literatura, incluidos varios de los genes enumerados en la Tabla 6 (p. ej., el modelo de enfermedad se indica como AR AD para 32 genes, tal como ADAR y TICAM1).

[0972] Ejemplo 15 - Ejemplos de pruebas de predicción del riesgo de PML con un panel de 96 genes

[0973] La Tabla 19 contiene un ejemplo de panel de 96 genes basado en genes que se encontró que tenían al menos un recuento de casos de PML de las Tablas 7 y 8. Las columnas "Genes" y "Soluciones a nivel de caso" mostraban los genes y el número total de casos de PML (con al menos una solución a nivel de caso) informados en las Tablas 7 y 8. Además, los 7 genes principales (CHD7, IFIH1, IGLL1, MAVS, PLCG2, SHARPIN, TCIRG1) de la Tabla 14 con SNV basadas en valores de ‘FET TODOS DE PML’ < 0.05 (columna O) también se incluyeron en la Tabla 19. Entre estos 7 genes, 3 genes (IGLL1, MAVS, SHARPIN) con SNV se basaron en valores de ‘FET TODOS DE PML’ <0.05 (columna O) de la Tabla 15.

[0974] Tabla 19: anel de eem los de 96 enes

[0977]

[0978]

[0979]

[0980]

[0982] El número no redundante de casos de PML y el rendimiento del diagnóstico se enumeran en las últimas 2 filas de LA Tabla 19. Específicamente, una prueba que incluía los 96 genes tuvo un rendimiento diagnóstico del 95.7 % de acuerdo con los hallazgos genéticos de los 70 casos de PML utilizados en el presente estudio.Ejemplo 16 - Ejemplos de pruebas de predicción del riesgo de PML con panel de 39 genes

[0983] La Tabla 20 contiene un ejemplo de panel de 39 genes basado en genes que se encontró que tenían múltiples recuentos de casos de PML en las Tablas 7 y 8. Las columnas "Genes" y "Soluciones a nivel de caso" mostraban los genes y el número total de casos de PML (con al menos dos soluciones a ‘nivel de caso’) informados en las Tablas 7 y 8. Además, los 7 genes principales (CHD7, IFIH1, IGLL1, MAVS, PLCG2, SHARPIN, TCIRG1) de la Tabla 14 con SNV basados en valores de ‘FET TODOS DE PML’ <0.05 (columna O) también se incluyeron en la Tabla 20. Entre estos 7 genes, 3 genes (IGLL1, MAVS, SHARPIN) con SNV se basaron en valores de ‘FET TODOS DE PML’ <0.05 (columna O) de la Tabla 15.

[0984] Tabla 20: Eem lo de anel de 39 enes

[0987]

[0988]

[0990] El número no redundante de casos de PML y el rendimiento del diagnóstico se enumeran en las últimas 2 filas de la Tabla 20. Específicamente, una prueba que incluía los 39 genes tuvo un rendimiento diagnóstico del 81.4 % de acuerdo con los hallazgos genéticos de los 70 casos de PML utilizados en el presente estudio.

[0991] Ejemplo 17 - Ejemplos de pruebas de predicción del riesgo de PML con panel de 23 genes

[0992] La Tabla 21 contiene un ejemplo de panel de 23 genes basado en genes que se encontró que tenían múltiples recuentos de casos de PML en las Tablas 7 y 8. Las columnas "Genes" y "Soluciones a nivel de caso" mostraban los genes y el número total de casos de PML (con al menos tres soluciones a ‘nivel de caso’) informados en las Tablas 7 y 8. Además, los 7 genes principales (CHD7, IFIH1, IGLL1, MAVS, PLCG2, SHARPIN, TCIRG1) de la Tabla 14 con SNV basados en valores de 'FET TODOS DE PML' <0.05 (columna O) también se incluyeron en la Tabla 21. Entre estos 7 genes, 3 genes (IGLL1, MAVS, SHARPIN) con SNV se basaron en valores de 'FET TODOS DE PML' <0.05 (columna O) de la Tabla 15.

[0993] Tabla 21: Eem lo de anel de 23 enes

[0996]

[0997]

[0999] El número no redundante de casos de PML y el rendimiento del diagnóstico se enumeran en las últimas 2 filas de la Tabla 21. Específicamente, una prueba que incluía los 23 genes tuvo un rendimiento diagnóstico del 71,4 % de acuerdo con los hallazgos genéticos de los 70 casos de PML utilizados en el presente estudio.

[1000] Ejemplo 18 - Ejemplos de pruebas de predicción del riesgo de PML con panel de 15 genes

[1001] La Tabla 22 contiene un ejemplo de panel de 15 genes basado en genes que se encontró que tenían múltiples casos de PML en las Tablas 7 y 8. Las columnas "Genes" y "Soluciones a nivel de caso" mostraban los genes y el número total de casos de PML (con al menos cuatro soluciones a nivel de caso) informados en las Tablas 7 y 8. Además, los 7 genes principales (CHD7, IFIH1, IGLL1, MAVS, PLCG2, SHARPIN, TCIRG1) de la Tabla 14 con SNV basados en valores de 'FET TODOS DE PML' <0.05 (columna O) también se incluyeron en la Tabla 22. Entre estos 7 genes, 3 genes (IGLL1, MAVS, SHARPIN) con SNV se basaron en valores de 'FET TODOS DE PML' <0.05 (columna O) de la Tabla 15.

[1002] Tabla 22: Eem lo del anel de 15 enes

[1005]

[1007] El número no redundante de casos de PML y el rendimiento del diagnóstico se enumeran en las últimas 2 filas de la Tabla 22. Específicamente, una prueba que incluía los 15 genes tuvo un rendimiento diagnóstico del 55.7 % de acuerdo con los hallazgos genéticos de los 70 casos de PML utilizados en el presente estudio.

[1008] Ejemplo 19 - Ejemplos de pruebas de predicción del riesgo de PML con panel de 11 genes

[1009] La Tabla 23 contiene un ejemplo de panel de 11 genes basado en genes que se encontró que tenían múltiples casos de PML en las Tablas 7 y 8. Las columnas "Genes" y "Soluciones a nivel de caso" mostraban los genes y el número total de casos de PML (con al menos cinco soluciones a 'nivel de caso') informados en las Tablas 7 y 8. Además, los 7 genes principales (CHD7, IFIH1, IGLL1, MAVS, PLCG2, SHARPIN, TCIRG1) de Tabla 14 con SNV basados en valores de 'FET TODOS DE PML' <0.05 (columna O) también se incluyeron en la Tabla 23. Entre estos 7 genes, 3 genes (IGLL1, MAVS, SHARPIN) con SNV se basaron en valores de 'FET TODOS DE PML' <0.05 (columna O) de Tabla 15.

[1010] Tabla 23: Eem lo de anel de 11 enes

[1013]

[1015] El número no redundante de casos de PML y el rendimiento del diagnóstico se enumeran en las últimas 2 filas de la Tabla 23. Específicamente, una prueba que incluía los 11 genes tuvo un rendimiento diagnóstico del 47.1 % de acuerdo con los hallazgos genéticos de los 70 casos de PML utilizados en el presente estudio.

[1016] Ejemplo 20 - Ejemplos de pruebas de predicción del riesgo de PML con panel de 10 genes

[1017] La Tabla 24 contiene un ejemplo de panel de 10 SNV basado en los 7 SNV principales en la Tabla 14 y 3 SNV de la Tabla 15 (basado en genes superpuestos entre 14 y 15: IGLL1, MAVS, SHARPIN). Específicamente, usando los 10 SNV principales (7 de la Tabla 14, junto con 3 de la Tabla 15, que residen en genes ya seleccionados de la Tabla 14), se realizó un recuento aditivo (columna "Caso total aditivo (no redundante)") para determinar cuántos casos de PML tenían al menos una de las variantes cuando se consideraban en orden (p. ej., columna "Orden (FET)": '1', primero, seguido de '1' '2', seguido de '1' '2' '3' etc.). Dado que algunas personas albergan más de una variante, el recuento aditivo no es igual a la simple suma de los números de casos de PML para cada variante (columna "Total de casos por SNV"). Todas las coordenadas del genoma se basan en la construcción hg19.

[1018] Se realizó un recuento aditivo para sujetos de ExAC (columna "total aditivo de sujetos de ExAC (redundante)"), como sigue: i) se calculó el tamaño de cohorte promedio para ExAC para todas las variantes; ii) Cada recuento total de sujetos (todas las etnias) se normalizó a este tamaño de cohorte promedio. El recuento aditivo de ExAC representa una adición simple: etiquetada como "redundante" en la columna "total aditivo de sujetos de ExAC (redundante)", porque no se dispone de información sobre la posible presencia de múltiples variantes en el mismo individuo; iii) Se calcularon los valores de las relaciones de probabilidades (OR) y la prueba exacta de Fisher (FET) (columnas de "OR TODO DE PML aditivo" y "FET TODO DE PML aditivo").

[1019] Tabla 24: Ejemplo de panel de 10 genes

[1020]

[1022] <1>Orden de SNV basado en el valor de FET más bajo informado en las Tablas 14 y 15 para etnias combinadas<2>Total de casos de PML = 70

[1023] <3>Total de sujetos de ExAC = 43,419 (promedio para las 10 SNV)

[1025] Los expertos en la materia pueden apreciar que los paneles de genes anteriores se seleccionaron con base en los hallazgos genéticos presentes en 70 casos de PML. Además, puede añadirse al panel de genes un gen no seleccionado actualmente para ninguno de estos ejemplos de paneles de genes. Por ejemplo, los genes en los que solo se encontró que 1 caso de PML tenía variantes que cumplían con los criterios pueden agregarse al panel de genes si la validación genética en casos adicionales de PML muestra que un gen 'n=1 caso' se ve afectado por más de 1 caso de PML cuando los datos se examinan para un nuevo conjunto de casos de PML. En algunos casos, se pueden agregar genes adicionales (p. ej., genes vinculados a PML como DOCK8, BAG3, STAT1) al panel de genes.

[1027] Ejemplo 21 - Identificar variaciones genéticas adicionales

[1029] Los métodos y protocolos descritos en los ejemplos anteriores pueden usarse para identificar cualquier posible variación genética. Los datos se pueden generar comparando las variaciones genéticas identificadas en 2 cohortes: 1) cohorte sin enfermedad que incluye 1000 individuos sin enfermedad (p. ej., individuos sin PML); y 2) cohorte enferma que incluye 100 individuos enfermos (p. ej., individuos con PML). Los individuos en las cohortes pueden ser de género y/o étnicamente coincidentes. Las variaciones genéticas presentes en la cohorte no enferma y la cohorte enferma pueden identificarse mediante análisis de CNV (p. ej., descrito en el Ejemplo 2) o secuenciación del exoma completo (p. ej., descrito en el Ejemplo 3). Se identifican dos nuevas variaciones genéticas, CNV 1 (ubicada en el gen # 1) y CNV 2 (ubicada en el gen # 2), por ejemplo, comparando los datos de la secuencia con una secuencia de referencia (p. ej., UCSC hg19). Los datos de una base de datos de CNV creada utilizando datos de CNV de todo el genoma en sujetos sanos (o individuos sin PML) como el motor de variación normal (NVE) descrito en este documento se pueden usar para determinar si una CNV encontrada en una cohorte de PML ocurre con mayor frecuencia o no comparado con el NVE. De manera similar, las SNV identificadas en una cohorte de PML se pueden interpretar por su relevancia potencial para la PML utilizando los recursos disponibles públicamente del Exome Aggregation Consortium (ExAC) o Genome Aggregation Database (gnomAD) [Lek M et al. Nature 2016 Au 18; 536 (7616): 285-91]; es decir, para obtener datos de frecuencia (p. ej., frecuencia específica de la etnia) para las variantes bajo consideración. Las bases de datos de NVE para la evaluación de CNV se pueden crear para una variedad de etnias (p. ej., sujetos de ascendencia africana y latina) para determinar la relevancia de una CNV en una cohorte de PML en comparación con una base de datos de CNV étnicamente coincidente en individuos sin PML y/o usando datos étnicos específico de bases de datos de CNV disponibles públicamente, como la base de datos de variantes genómicas [Macdonald et al. Nucleic Acid Res.2014 Jan; 42 (Database Issue): D986-92]. En un ejemplo, 20 de los 100 individuos enfermos tienen CNV 1, y solo 10 de los 1000 individuos no enfermos tienen CNV 1. En otro ejemplo, 10 de los 100 individuos enfermos tienen CNV 2, y solo 5 de los 1000 individuos no enfermos tienen CNV 2. El valor p se puede calcular usando pruebas estándar, como la prueba exacta de Fisher (FET) y los datos se pueden seleccionar usando cierto valor significativo. Por ejemplo, se incluyen variaciones genéticas con un valor p inferior a 0.05. Además, la frecuencia y la razón de probabilidades de las dos variaciones genéticas se pueden calcular y resumir en una tabla de ejemplo:

[1031]

[1034] Un sujeto sin CNV 1, CNV 2, o ambos, puede tener un menor riesgo de PML debido a una infección del cerebro por el virus de John Cunningham (JCV) y, por lo tanto, se le puede administrar natalizumab, como natalizumab.

[1035] Otras variaciones genéticas como SNV se pueden identificar utilizando el mismo método descrito anteriormente.

[1037] Ejemplo 22 - Análisis de los datos de CGH de matriz de cohortes de PML para CNV adicionales

[1038] Se evaluaron los datos de matriz CGH en los 71 casos de PML (70 de 71 casos tienen datos de matriz CGH y WES, pero PML67 solo tiene datos de matriz CGH) para identificar las CNV recurrentes que cumplen los criterios de un OR > = 3 y una FET < = 0.05. El beneficio de observar las CNV recurrentes y de mayor frecuencia es que el riesgo de PML se puede evaluar fácilmente con métodos de detección de alto rendimiento basados en PCR que también son rentables. Las CNV más frecuentes también tienen el potencial de identificar un mayor riesgo de PML en una mayor proporción de pacientes, similar a las SNV de carga variante informadas en múltiples casos de PML (p. ej., Tablas 14, 15, 38 y 39). Por ejemplo, una prueba de panel de variantes genéticas para identificar el riesgo de un paciente de desarrollar PML podría contener una o más CNV de las Tablas 1 o 28A y/o una o más SNV de las Tablas 14, 15, 34 o 35.

[1040] Se encontraron cuatro pérdidas recurrentes de relevancia potencial en la evaluación del riesgo de PML y se informan en la Tabla 28A (coordenadas del genoma GRCh36/hg18), tres de los cuales también se informan en la Tabla 28B. Una pérdida afecta las regiones exónicas de CFHR1 y CFHR3 (SEQ ID 2200) y otras dos pérdidas ocurren en las regiones intrónicas de los genes FUT8 (SEQ ID 2203) y ZBTB20 (SEQ ID 2202). La cuarta pérdida es intergénica (SEQ ID 2201) y está ubicada entre dos genes Ensembl (ensamblaje del genoma GRCh37/hg19): ENSG00000229703 (variante de transcripción Ensembl ENST00000437830, que se superpone al gen de RefSeq LOC101928226 y su correspondiente transcripción RefSeq NR 125950.1) y ENSG00000232694 (variante de transcripción Ensembl ENST00000436484). Si bien la eliminación intergénica puede afectar la expresión de uno o ambos genes adyacentes (p. ej., a través de la pérdida de un sitio de unión del factor de transcripción), los expertos en la técnica también considerarán si están involucradas interacciones de largo alcance, de modo que los niveles de expresión de genes ubicados más lejos se modulan hacia arriba o hacia abajo (por ejemplo, véase Mifsud B et al. 2015, PMID 25938943). De manera similar, las variantes intrónicas pueden tener un impacto similar y también existe la posibilidad de que las variantes genéticas (SNP/SNV, CNV, etc.) no participen directamente en la modulación de la expresión génica sino que estén en desequilibrio de ligamiento (LD) con otras variantes genéticas que sí lo son causando directamente un efecto (por ejemplo, tales variantes sirven como etiquetas de variantes causales o protectoras).

[1042] Los expertos en la materia pueden apreciar que las variantes genéticas (CNV, SNV, etc.) se pueden encontrar en múltiples estudios independientes y muchas se informan en bases de datos públicas, tales como la Base de Datos de Variantes Genómicas (MacDonald J et al., 2014, PMID 24174537), el Exome Aggregation Consortium (ExAC), véase Lek M. et al., 2016, PMID 27535533) y ClinVar (Landrum M et al.2018, PMID 29165669). Las CNV recurrentes (ganancias o pérdidas), como las reportadas en la Tabla 28A (y un subconjunto que se informa en Tabla 1), a menudo coinciden aproximadamente con los puntos de corte cromosómicos para las CNV informadas en el estudio de fase 3 del 1000 Genomes Consortium (Mills R. et al.2011, PMID 21293372; 1000 Genomes Project Consortium 2015, PMID 26432245). Dado que la matriz CGH (Agilent, Santa Clara, CA; ID de diseño de matriz AMADID 021529) utilizada para la detección de CNV en todo el genoma en los casos de PML contiene ~ 1 millón de sondas, cada una con una separación de ~ 3 Kb, los puntos de interrupción pueden mapearse en cualquier lugar entre las ubicaciones de sondas informadas (Tablas 1 y 28A) y la siguiente sonda más cercana. El uso de datos de CNV disponibles públicamente a veces es útil para mapear puntos de corte a través de la secuenciación y el diseño de ensayos cuando son similares en tamaño y ubicación a las CNV detectadas en un estudio independiente. Por ejemplo, las tres CNV recurrentes reportadas en la Tabla 28A son aproximadamente iguales y tienen la misma ubicación que la eliminación informada en la Fase 3 de 1000 Genomes Consortium: SEQ ID 2200 es similar a esv3588469, SEQ ID 2201 es similar a esv3589567, SEQ ID 2202 es similar a esv3597466 y SEQ ID 2203 es similar a esv3634776.

[1044] La Tabla 28B enumera los números de subregión de CNV (SRN, números 364-366) para las tres variantes que están presentes como pérdidas heterocigotas y/u homocigotas y pasan los filtros estadísticos, como se describe a continuación. Para las CNV que no son idénticas, la subregión de CNV corresponde a las partes superpuestas con otras CNV. En el caso de las CNV recurrentes, la subregión de la CNV puede ser idéntica a la CNV original (por ejemplo, como en las Tablas 28A y 28B). La Tabla 28B también contiene los valores de OR y FET en la comparación de la frecuencia de la CNV en casos de NVE (p. ej., sujetos de control que no tienen PML) frente a casos de PML. El tamaño de la cohorte de NVE es de 1,000 sujetos (no afectados) y el tamaño de la cohorte de PML es de 71 pacientes (afectados). Todas las CNV/subregiones de CNV reportadas en la Tabla 28B tenían una FET < 0.004, que está muy por debajo del filtro de corte de 0.05 que se aplicó para este análisis. Los valores de OR correspondientes para las pérdidas heterocigotas (het loss) fueron de 3.61 a 32.62 y para las pérdidas homocigotas (hom loss) fueron de 42.57 a 71.98, que son todos mayores que el corte de OR de 3. Las Tablas 29 y 30 contienen el gen y la información de la variante de transcripción para los genes de la Tabla 28A que están directamente afectados por una CNV (FUT8 y ZBTB20), excepto los genes CFHR1 y CFHR3, que se informan en las Tablas 31 y 32.

[1046] Genes de desregulación inmunitaria

[1048] Los trastornos de desregulación inmunitaria, que son uno de los factores subyacentes de la PML (Hatchwell E 2015, PMID 26029204), son causados por mutaciones en uno o más genes. Ya se han informado numerosos genes en la literatura (p. ej., NCBI PubMed) u otras bases de datos públicas (p. ej., OMIM) y se siguen descubriendo nuevos. En consecuencia, una prueba de predicción del riesgo genético integral de última generación para la PML incluirá periódicamente la evaluación de la información en el campo para los genes de desregulación inmunitaria recientemente reportados, así como la realización de nuevos estudios de descubrimiento (p. ejemplo, usando un enfoque de descubrimiento de genes basado en CNV, como se describe en este documento, en una nueva cohorte de casos de PML). Además, los genes recién descubiertos vinculados a una enfermedad o afección a menudo son validados de forma independiente por otros estudios. Por ejemplo, en nuestro primer estudio de PML, nuestro descubrimiento de una eliminación homocigota (SEQ ID 1028) secuencia arriba de ITSN2 (GN 309) como una causa potencial de la afección de inmunodeficiencia subyacente de un paciente con PML fue respaldado posteriormente por evidencia en un modelo de ratón de que este gen está involucrado en la desregulación inmunitaria (Burbage M et al.2018, PMID 29337666).

[1049] Nuestro estudio original de descubrimiento de variantes/genes de riesgo de PML implicó la evaluación de un total de 435 genes (véase las Tablas 3, 6, 25A, 25B y 26). Se reevaluó la literatura publicada en busca de nuevos genes que causan o contribuyen a los trastornos de desregulación inmunitaria y se reunió una lista seleccionada de 270 genes (véase Tabla 31). Por ejemplo, una fuente de nuevos genes a considerar en nuestra cohorte de PML se derivó de una actualización de diciembre de 2017 de la Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas (IUIS) sobre inmunodeficiencias primarias (Bousfiha A et al., 2017, PMID 29226301; Picard C et al.2017, PMID 29226302), que describió 334 genes relacionados con errores innatos de la inmunidad y 137 de estos no se incluyeron en nuestras listas de genes originales (Tablas 3, 6, 25A, 25B y 26). Otra fuente fue un estudio de genes de inmunodeficiencia variables comunes (CVID) y una revisión de la literatura (de Valles-Ibanez G., et al., 2017, PMID 29867916), que describieron 92 genes y 40 no estaban incluidos en nuestra lista original de 435 genes. Curiosamente, 37 de estos 92 genes no se incluyeron en la lista actualizada de IUIS (PMID 29226301 y 29226302), lo que subraya la importancia de consultar múltiples fuentes independientes al seleccionar una lista actualizada de nuevos genes de desregulación inmunitaria a considerar. Otra fuente importante de nuevos genes que componen nuestro conjunto de 270 genes fue un estudio de secuenciación del exoma en pacientes con deficiencia primaria de anticuerpos (PAD), una forma frecuente de inmunodeficiencia primaria (PID). Este estudio (Abolhassani H et al.2018, PMID 29921932) evaluó 202 genes, de los cuales 76 genes no se incluyeron en nuestro conjunto original de 435 genes y 45 de los 202 genes no se incluyeron en la lista actualizada de IUIS (PMID 29226301 y 29226302). Se ha discutido el papel de la genética del complemento en los trastornos de desregulación inmunitaria (Mayilyan K 2012, PMID 22773339). Algunos genes del sistema del complemento ya se evaluaron en nuestro conjunto original de genes de PML (p. ej., C1QA, C1QB, C1QC, C5AR1, CD55, CD59, CR2 y FCN3 enumerados en Tabla 6) y se incluyeron 30 nuevos en el nuevo conjunto de genes de desregulación inmunitaria (Tabla 31, véanse lo genes anotados con PMID 22773339).

[1051] Dado que otro factor subyacente clave de PML es la infección por el virus de JC (Hatchwell E 2015, PMID 26029204), también reevaluamos la literatura y otras fuentes (p. ej., interacciones a través de la base de datos de String, Szklarczyk D et al. 2017, PMID 27924014) para biología relacionada con JCV y genes correspondientes. Por ejemplo, esto se hizo previamente para identificar genes de riesgo de PML candidatos (p. ej., como se describe por van der Kolk N et al., 2016, PMID 27042682) en el que posteriormente se encontró que un subconjunto albergaba variantes raras en uno o más casos de PML en nuestro estudio (véase la Tabla 27, columna de biología del virus de JC). Esta nueva evaluación resultó en la inclusión de 18 nuevos genes que están vinculados a la biología de JCV: B2M, BRD4, CXCR3, CXCL10, HERC5, IFI35, IFIT2, IFIT3, IGHMBP2, MX1, MX2, OAS1, OAS2, OAS3, OASL, RELA, RSAD2, XAF1. La anotación de fuente publicada para este conjunto de genes se informa en Tabla 31. Por ejemplo, la vía de interferón tipo I, que estuvo implicada como un factor en la PML sobre la base de las variantes genéticas encontradas en los genes implicados en la vía (p. ej., IFIH1 y MAVS) en nuestro estudio previo de los 70 casos de PML (p. ej., véase la Tabla 27), se relacionó con la biología de JCV a través del análisis de la base de datos de String de otros genes en la vía (Assetta B et al., 2016, PMID 27381292). En otro ejemplo, se encontró biología de apoyo para la familia de genes OAS en un estudio de pacientes con trastorno neurocognitivo asociado al HIV (HAND) (Puccini J et al., 2015, PMID 25834052; Sanfilippo C., et al. 2018, PMID 28236279), que es otro tipo de trastorno neurológico que puede manifestarse en pacientes con HIV (Kolson D 2018, PMID 28820724).

[1053] Los vínculos posibles entre los genes de la enfermedad de Parkinson (PD) y PML se exploraron más a fondo, ya que SNCA estaba en nuestra primera lista de genes (véase la Tabla 6) y nuestra investigación separada de los puntos de corte de triplicación de SNCA identificó los genes HERC5 y HERC6 como potencialmente relevantes para la PD (véase Zafar F. et al., 2018, PMID 29928688; Im E et al., 2016, PMID 27534820). La superposición potencial en los mecanismos patológicos entre la PML y la PD se destaca aún más por el vínculo de HERC5 con JCV (Assetta B et al.2016, PMID 27381292) y neuroinflamación en general (Gelders G et al., 2018, PMID 29850629). Nuestra selección de estudios independientes sobre PD (incluidos los nuestros) o artículos de revisión ahora han vinculado un total de 37 genes relacionados con PD con nuestros genes candidatos para la PML: 16 genes (CXCL12, CXCR4, DDX58, IFIH1, IL1B, MAVS, MYD88, RAB7A, RABGEF1, RAG1, SNCA, SQSTM1, TBK1, TLR3, TLR4, TMEM173) en nuestra lista original de 435 genes (Tabla 6) y 21 genes (ATG9A, CCZ1, FIS1, HERC5, HERC6, IFIT1, IFIT2, IFIT3, LRRK2, MFN1, MFN2, MON1A, MON1B, PINK1, PARK2/PRKN, RAB5A, RAB5B, RAB5C RSAD2, TBC1D15, TBC1D17) en nuestro nueva lista de 270 genes (Tabla 31). Además de las citas de PD mencionadas anteriormente (PMID 29850629 y 29928688), la literatura de apoyo para vincular genes de PD conocidos y candidatos a genes de PML candidatos incluye: Torres-Odio S et al.2017, PMID 28768533; Yamano K et al.2018, PMID 29360040; Paparisto E et al.2018, PMID 29669830. En Tabla 31, el modelo de enfermedad para LRRK2 aparece como desconocido ya que actualmente no se sabe que las mutaciones en este gen causen un trastorno de inmunodeficiencia (p. ej., no aparece en las listas actualizadas de genes de la IUIS, véase los PMID 29226301 y 29226302). Se sabe que causa PD a través de un modelo de AD pero, sin más estudios, esto no se puede suponer con respecto a la desregulación inmunitaria en el contexto de otros trastornos. Curiosamente, estudios recientes (p. ej., véase Yan R y Liu Z 2017, PMID 27830463; Lee H et al. 2017, PMID 28202666; Witoelar A et al. 2017, PMID 28586827; Hui K et al.2018, PMID 29321258; Sheng D et al.2018, PMID 29499195; Toledo Pinto T et al.2018, PMID 29755459; Kim K et al.2018, PMID 29760073) respaldan cada vez más el papel de LRRK2 en la función inmunitaria (p. ej., la vía de interferón de tipo I) y los trastornos inmunitarios (p. ej., la enfermedad de Crohn y la lepra).

[1055] También revisamos la literatura en busca de nuevos hallazgos relacionados con los genes en nuestra lista original de 419 genes candidatos para la PML (Tabla 6) que se encontró que albergaban variantes genéticas de interés en nuestro análisis original de la matriz de datos CNV CGH y/o datos de WES en los 70 casos de PML en nuestra cohorte. Evidencia de apoyo (Magna M et al., 2014, PMID 24531836; Jiang R et al., 2014, PMID 25339669; Minguet S et al., 2017, PMID 28805811; Ratajczak M et al., 2018, PMID 29541038; Lee G et al., 2018, PMID 29674451) para genes vinculados a TLR4 (CXCL12, CXCR4, MYD88) en nuestra lista anterior de 435 genes (Tabla 6), más dos nuevos genes (CAV1 y HMGB1) en nuestra lista actualizada de 270 genes (Tabla 31). Finalmente, se agregó MB21D 1 (gen alias cGAS) a nuestra lista de genes actualizada (Tabla 31) sobre la base de su vínculo directo con TMEM173 (gen alias STING), que se incluyó en nuestra lista original de genes (Tabla 6); por ejemplo, como se destaca en una revisión reciente (Chen Q et al., 2016, PMID 27648547). Finalmente, ITSN1 fue incluido en nuestra lista de 270 genes (Tabla 31) basado en un estudio de apoyo (Burbage M., et al.2018, PMID 2933766), citado en este documento como datos funcionales de respaldo para uno de nuestros genes candidatos para PML descubiertos por CNV (ITSN2), además de otros tres estudios más recientes (Alvisi G et al., 2018, PMID 29599122; Dergai O et al., 2018, PMID 29851086; Gryaznova T et al., 2018, PMID 29958948).

[1057] Es bien sabido por los expertos en la técnica que muchos trastornos comunes tienen una base genética y pueden ser causados por una (autosómica, dominante relacionada con X o recesiva relacionada con X) o dos mutaciones (autosómica recesiva) en un gen, y que la o las mutaciones pueden ocurrir en cualquiera de los numerosos genes. Además, un número cada vez mayor de estudios genéticos revela que un determinado trastorno puede ser causado o modificado (por ejemplo, la edad de inicio o la gravedad) por múltiples variantes presentes en el genoma de un paciente. Por ejemplo, el autismo se ha relacionado con la presencia de dos o más variantes genéticas (CNV o SNV) dentro de un individuo (Marshall C et al., 2008, PMID 18252227; Yuen R et al.2015, PMID 25621899). La evidencia acumulada sugiere que un modelo de enfermedad monogénica para la desregulación inmune también proporciona una explicación incompleta de la patología. Por ejemplo, de Valles-Ibanez et al., 2018 (PMID 29867916) discuten la importancia de considerar otros modelos de enfermedades (p. ej., oligogénicos o poligénicos), particularmente porque la mayoría de los pacientes con CVID permanecen sin diagnosticar a pesar de la evaluación genética con enfoques de secuenciación del genoma completo o del exoma.

[1059] Con base en los avances en las tecnologías de secuenciación genética y las listas de genes de enfermedades en rápido crecimiento, muchos proveedores de pruebas genéticas ahora usan pruebas de panel de genes, que se usan para evaluar y brindar información clínica solo para el subconjunto de genes que se ha informado definitivamente que causan la enfermedad. Las pruebas de panel de genes se pueden realizar mediante métodos de captura del genoma solo para los genes de interés o realizando WES o WGS pero solo interpretando los genes de enfermedades relevantes (p. ejemplo una capturain silicode un subconjunto de los genes en el genoma humano). Los expertos en la técnica pueden apreciar que una prueba de predicción del riesgo genético de PML probablemente implicará la prueba de variantes genéticas perjudiciales en varios genes de desregulación inmunitaria y que se pueden agregar nuevos genes/variantes al panel de prueba a medida que se informen nuevos estudios sobre la inmunodeficiencia en pacientes con trastornos y/o pacientes con PML.

[1061] Hay varios proveedores de pruebas genéticas que ahora ofrecen pruebas de panel de genes. Un ejemplo de un proveedor comercial de varios paneles de genes de enfermedades diferentes es Invitae (San Francisco, CA). Dada su experiencia con las pruebas y la interpretación de una amplia variedad de paneles de genes (p. ej., cánceres hereditarios, trastornos metabólicos y trastornos cardiológicos), comparamos su conjunto de paneles de genes de inmunología con nuestras listas seleccionadas de genes candidatos para la PML (Tablas 6 y 31) para determinar si su panel de genes existente podría ser una opción potencial para evaluar el riesgo genético de desarrollar PML. A partir de junio de 2018, Invitae tenía un total de 210 genes en sus paneles de inmunología y 157 de estos ya estaban incluidos en nuestra primera lista de 435 genes candidatos para PML (Tablas 3, 6, 25A, 25B y 26) y 206 estaban presentes en la actualización de diciembre de 2017 de IUIS sobre inmunodeficiencias primarias (Bousfiha A et al., 2017, PMID 29226301; Picard C et al., 2017, PMID 29226302). Sin embargo, 3 genes (ACD, PMM2 y SLC7A7) en los paneles de genes de inmunología de Invitae no se encontraron en nuestros estudios de descubrimiento de genes basados en CNV o en los diversos recursos de curación descritos en este documento. Por lo tanto, para completar, incluimos estos 3 genes en nuestro panel actualizado de 270 genes (Tabla 31).

[1063] Hay 9 genes en la Tabla 31 que han tenido cambios en el símbolo del gen desde que se generaron los datos WES de PML, estos son (la lista actual de símbolos del gen RefSeq primero y el símbolo del gen de los datos de WES en segundo lugar):

[1066] ADA2 CECR1

[1068] ADGRL2 LPHN2

[1070] CXCL8 IL8

[1071] FAAP24 C19orf40

[1073] NSMCE3 NDNL2

[1075] OTULIN FAM105B

[1077] PRKN PARK2

[1079] STN1 OBFC1

[1081] WASHC5 KIAA0196

[1083] Variantes de transcripción y números de SEQ ID para los 270 genes de desregulación inmune adicionales (Tabla 31) se informan en la Tabla 32. No se encontraron variantes de transcripción de RefSeq para los genes IGHM e IGKC, por lo que se omiten de la Tabla 32.

[1085] Análisis de los datos de WES de la cohorte de PML para 270 genes de desregulación inmunitaria adicionales

[1086] Usando nuestros métodos anteriores para extraer variantes genéticas de los datos de WES en 70 casos de PML (descritos en este documento), hemos identificado varias variantes nuevas en un subconjunto de los 270 genes (véase las Tablas 32-37, 38 y 39) que pueden estar causando o contribuyendo a la afección inmunocomprometida de un paciente con PML. Como se hizo con los 435 genes de desregulación inmunitaria originales (Tablas 3, 6, 25A, 25B y 26), se utilizaron tres tipos de métodos de análisis genético para el nuevo conjunto de 270 genes (Tabla 31): 1) enfoque de resolución de casos, 2) análisis de carga de genes y 3) análisis de carga de variantes. Un total de 275 SNV (véase Tabla 33) en 113 de los 270 genes evaluados se identificaron en la cohorte de 70 casos de PML.

[1088] El método de resolución de casos, que implica evaluar los datos de WES para cada paciente con PML en busca de SNV poco comunes y perjudiciales en comparación con un conjunto de control no seleccionado de datos de WES (datos disponibles públicamente del Exome Aggregation Consortium, exac.broadinstitute.org), se aplicó a los 70 casos de PML para los que se recopilaron datos de WES (véase la Tabla 7 para ID de la muestra, etnia, género y enfermedad primaria para cada caso). En el primer estudio de esta cohorte que involucró la evaluación de 435 genes (Tablas 3, 6, 25A, 25B y 26), los hallazgos de resolución de casos se informaron en las Tablas 7-10 donde la Tabla 7 informo la o las principales variaciones genéticas y el gen para cada caso en función de la frecuencia de la variante (< 1 en 100 de corte de frecuencia en comparación con los sujetos de ExAC) y la biología conocida del gen en el momento del estudio. Las soluciones posibles adicionales se informaron en las Tablas 8-10. Dada la creciente evidencia de múltiples variantes/genes que causan o contribuyen a la desregulación inmunológica, los resultados de resolución de casos para los 270 genes adicionales se dividieron en 4 tablas de la siguiente manera:

[1089] Tabla 34, SNV (het, hom, o het comp escalonadas) con una frecuencia de <= 1/1,000 sujetos de ExAC o son nuevas;

[1090] Tabla 35, SNV (het, hom, o het comp escalonadas) con una frecuencia de <= 1/100 pero > 1/1,000 sujetos de ExAC;

[1091] Tabla 36, SNV het no escalonadas con una frecuencia heterocigota compuesta potencial de <= 1/100 sujetos de ExAC (un subconjunto puede demostrar estar en trans con un trabajo de validación adicional); donde las SNV se denominan heterocigotas (het), homocigotas (hom) o heterocigotas compuestas (het comp). Como antes, la información de frecuencia para cada variante se evaluó de manera específica de la etnia (AFR, EUR o LAT). Las variantes se excluyeron del análisis si el número de alelos en los sujetos de ExAC para una etnia determinada era < 75 % del número máximo (∼10,300 para sujetos AFR, ~11,300 para sujetos LAT o ~66,500 para sujetos EUR). Se hizo una excepción para la variante CFHR3 crm1: 196759282, C>T, que tiene menor AN pero solo en sujetos de ExAC AFR. Otros estudios han informado que una eliminación que afecta a CFHR3 está presente con mayor frecuencia en sujetos de ascendencia africana (p. ej., véase Cantsilieris S et al.2018, PMID 29686068).

[1092] Observamos una eliminación CFHR3 recurrente (~56 Kb de tamaño) en nuestros sujetos de control NVE y casos de PML que se asignan a: crm1: 196742735-196799244 (GRCh37/hg19). Se encontraron pérdidas heterocigotas y homocigotas, pero solo se informan las eliminaciones homocigotas encontradas en los casos de PML en la Tabla 28A (SEQ ID 2200). La pérdida se superpone a la eliminación de 1000 Genomes Fase 3 esv3588469 (~80 Kb de tamaño): crm1:196728877-196808865 (GRCh37/hg19). Es posible que estas dos eliminaciones sean las mismas, lo que puede verificarse secuenciando los puntos de interrupción de la eliminación que se encuentran en nuestros controles de NVE y casos de PML. Observamos la eliminación de CFHR3 en el estado homocigoto en 52 controles de NVE (todos de ascendencia EUR) y 5 casos de PML (2 de ascendencia AFR y 1 LAT). Además, encontramos una SNV hom CFHR3 en nuestro análisis de carga variante (descrito en el presente documento, véase Tabla 38). Dada la alta frecuencia de la eliminación en la población general, es posible que algunos individuos llamados homocigotos para la SNV sean heterocigotos compuestos para la SNV y la eliminación. La naturaleza de la secuenciación de lectura corta significa que la homocigosidad para una variante se infiere si a) los datos son de calidad suficiente (cantidad suficiente de lecturas presentes) y b) solo se observa una de las dos secuencias posibles en una posición base dada. Sin embargo, si un individuo tiene solo un alelo (el otro ha sido eliminado), solo hay un "estado" posible en cada base dada. Esto se conoce como pérdida de heterocigosidad y es distinta de la homocigosidad. Por esta razón, el análisis del estado homocigoto para la SNV debe tratarse con cautela. Sin embargo, el estado heterocigoto compuesto (SNV más eliminación) puede tener las mismas consecuencias funcionales que la SNV homocigota. Se requeriría más trabajo de laboratorio para desconvolucionar los genotipos en esta cohorte.

[1093] Curiosamente, la eliminación de CFHR3 se ha relacionado con el síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), como se describe en un informe de caso reciente (Bitzan M. et al., 2018, PMID 29728803). Además, un informe de caso de 2015 (Gomez-Cibeira E et al., 2015, PMID 26718572) vincula aHUS con PML. No se reporto información genética para esta paciente con aHUS, pero ella desarrolló PML después de recibir eculizumab. Se aplicó un modelo de enfermedad recesiva o dominante de acuerdo a la información reportada en Tabla 31. Para los genes que tienen una entrada "desconocida" o "asociación", se supuso que el modelo de enfermedad era AD y/o AR. Además, si un modelo AD es actualmente el estándar para un gen dado (por ejemplo, en OMIM), no descartamos el potencial para un modelo AR. Por ejemplo, MBL2 se informa en la Tabla 31 como un gen modelo AD pero la Tabla 34 informa sobre una SNV homocigota raro (om) (cambio del aminoácido G57E) en el caso de PML15. El corte de frecuencia de < 1 en 100 se relajó para FAT4 SNV A807V (SEQ ID 3086) en las Tablas 35 y 36 ya que esta variante está presente como solución para múltiples casos de PML (PML09, PML28, PML31, PML32, PML37, PML65) en la Tabla 34. En los casos en que un caso de PML tenía 3 o más SNV, los cálculos de frecuencia fueron los siguientes: a) para una SNV hom emparejada con múltiples SNV het (p. ej., het comp obligados), la frecuencia por pares se calculó para la SNV hom y cada SNV het, y b) para 3 o más SNV het, la frecuencia por pares se calculó utilizando la SNV más rara emparejado con cada SNV de mayor frecuencia.

[1094] Se realizaron análisis de carga de genes y variantes en el conjunto actualizado de 270 genes (Tabla 31) de acuerdo con los métodos descritos en este documento para el conjunto original de 435 genes (Tablas 3, 6, 25A, 25B y 26). Los resultados se reportan en las siguientes tablas:

[1095] Tabla 37, resultados de la carga génica (mismos criterios utilizados para generar los resultados de la Tabla 13); Tabla 38, resultados de carga variante (mismos criterios utilizados para generar los resultados de la Tabla 14); Tabla 39, resultados de carga variante (mismos criterios utilizados para generar los resultados de la Tabla 15).

[1096] La mejor SNV en la Tabla 38 es CFHR3 crm1:196759282, C>T (rs138675433 en dbSNP compilación 150). El genotipo es homocigoto en tres casos de PML de ascendencia AFR y 3 de ascendencia EUR. Por lo tanto, hemos encontrado una eliminación homocigota (SEQ ID 2200) y una SNV homocigota (SEQ ID 3025) que afecta al gen CFHR3. Tanto la eliminación como la SNV se presentan con mayor frecuencia en sujetos de ascendencia AFR. Por lo tanto, el genotipado de ambas variantes en sujetos de control y pacientes con PML de diferentes ancestros ayudará a definir su papel en el aumento o la disminución del riesgo de PML. Esto es potencialmente muy relevante a la luz de un caso de PML en un paciente que tenía aHUS (Gomez-Cibeira E et al.2015, PMID 26718572) y el vínculo entre aHUS y el gen CFHR3 (Pouw R et al., 2018, PMID 29740447). Los hallazgos genéticos en el primer conjunto de 435 genes para los 70 casos de PML se resumieron en una variedad de formatos (véanse las Tablas 7-10 y 13-27). Los hallazgos genéticos en el conjunto actualizado de 270 genes se resumen en la Tabla 40 para los tres métodos de análisis. Para algunos casos de PML, una SNV puede aparecer en más de una tabla de resolución de casos (Tablas 34-36), tal como cuando un gen modelo de enfermedad 'desconocido' tiene 2 o más SNV y a una SNV determinada se le atribuye una solución del modelo AD y una solución del modelo AR. Sin embargo, los recuentos de casos totales de PML en la Tabla 40 corresponden a un número no redundante de casos de PML para reflejar con precisión el número total de casos de PML potencialmente resueltos por gen.

[1097] Uno de los principales genes resumidos en la Tabla 40 es FAT4, que es el único gen que tiene hallazgos genéticos informados para los tres tipos de análisis (resolución de casos, carga de genes, carga de variantes) como se informa en las Tablas 34-39. El gen FAT4 también tiene el mayor número de casos de PML potencialmente resueltos, 23 soluciones de acuerdo con las Tablas 34-36. Otros genes con un mayor número de soluciones de resolución de casos son: PRRC2A (22 soluciones), MSH5 (9 soluciones), LRRK2 (8 soluciones) y MX1 (8 soluciones). Las mutaciones autosómicas recesivas en el gen FAT4 (OMIM 612411) están involucradas en dos trastornos: Síndrome 2 de linfangiectasia-linfedema de Hennekam (OMIM 616006) y síndrome 2 de Van Maldergem 2 (OMIM 615546). El síndrome 2 de linfangiectasia-linfedema de Hennekam es de particular interés ya que una característica clínica de estos pacientes es la linfangiectasia intestinal, que se ha informado en un caso de PML (Gomez-Cibeira E et al., 2015, PMID 26718572), que también se menciona en el presente documento por el vínculo con el gen CFHR3 a través de la afección de aHUS del paciente con PML.

[1098] Otro gen importante en la Tabla 40 es LRRK2, que tiene 8 soluciones basadas en las Tablas 34-36 y fue significativa en el análisis de carga génica (Tabla 37). Inicialmente se descubrió que las variantes de LRRK2 (p. ej., la mutación de ganancia de función G2019S) causan o contribuyen a la enfermedad de Parkinson (PD), pero estudios adicionales han relacionado el gen LRRK2 con la función y los trastornos inmunitarios, como se informa en el presente documento y en Tabla 31 (véase citas de PMID). También encontramos un subconjunto de pacientes con PML que albergan un par de SNV LRRK2 (N299K, también conocido como N551K, SEQ ID 3192; R1398H, SEQ ID 3197), con genotipo heterocigoto u homocigoto (véase las Tablas 34 y 35), que se informa que protegen contra PD (p. ej., véase Ross O et al., 2011, PMID 21885347; Heckman M. et al.2014, PMID 23962496; Heckman M. et al.2016, PMID 27521182). Si una o ambas variantes modifican el riesgo de PML requerirá más estudios.

[1099] Tabla 28A: SEQ ID 2200-2203, cuatro CNV recurrentes

[1101]

[1102]

[1104] La Tabla 28A enumera las CNV recurrentes de interés en este estudio.

[1105] Tabla 28B: SRN 364-366, tres CNV recurrentes con valores de OR > =3 y FET <= 0.05 (SRN = CNV original ya que estas CNV son recurrentes)

[1106]

[1107]

[1109] La Tabla 28B enumera las CNV/subregiones de CNV de interés con valores de OR y FET.

[1110] Tabla 29: GN 491 y 492, ID del Gen del NCBI, descripciones, resumen de RefSeq para 2 de 3 genes de la Tabla 28A

[1111]

[1113] Tabla 29 enumera la información genética para los genes en la Tabla 28B

[1114] Tabla 30: SEQ ID 2204-2215, variantes de transcripción para los genes de la Tabla 29 (FUT8 y ZBTB20, la tercera CNV es intergénica)

[1115]

[1116]

[1119] Tabla 30 representa una lista no redundante de variantes de transcripción que corresponden a los genes de la Tabla 29

[1121] Tabla 31: GN 493-762, 270 genes candidatos de PML, lista actualizada de varias bases de datos públicas . e., PubMed

[1123]

[1124]

[1125]

[1126]

[1127]

[1128]

[1129]

[1130]

[1131]

[1132]

[1133]

[1134]

[1135]

[1137] La Tabla 31 representa una lista no redundante de 270 genes implicados en el sistema inmunitario que no figuran en la Tabla 6.

[1138] Tabla 32: SEQ ID 2300-2893, variantes de transcri ción ara los enes de la Tabla 31

[1139]

[1140]

[1141]

[1142]

[1143]

[1144]

[1145]

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[1150]

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[1159]

[1160]

[1161]

[1162]

[1163]

[1164]

[1166] La Tabla 32 representa una lista no redundante de variantes de transcripción que corresponden a los genes de la Tabla 31

[1167] Tabla 33: SEQ ID 3000-3274, lista SNV Tablas 34-36, 38, 39 con números de SEQ ID similares a Tabla 5)

[1169]

[1170]

[1171]

[1172]

[1173]

[1174]

[1175]

[1176]

[1178] Tabla 34: Las SNV de nivel 1 de resolución de caso (het, hom, o het comp escalonada) con frecuencia <=1/1,000 o nuevas

[1179]

[1180]

[1181]

[1182]

[1185] La Tabla 34 enumera la o las posibles causas de PML en el estudio, las SNV (het, hom o het comp escalonadas) para genes en Tabla 31 con frecuencia <=1/1.000 o nuevas.

[1187] Tabla 35: Las SNV de nivel 2 de resolución de caso (het, hom, o het comp escalonadas) con frecuencia <=1/1,00 pero >1/1,000

[1190]

[1191]

[1192]

[1193]

[1195] La Tabla 35 enumera la o las posibles causas de PML en el estudio, las SNV (het, hom o het comp escalonadas) para genes en la Tabla 31 con frecuencia <=1/1,00 pero >1/1,000.

[1196] Tabla 36: Las SNV het comp posibles no escalonadas de resolución de caso con frecuencia het comp

[1198] <=1/1,00

[1199]

[1200]

[1201]

[1202]

[1203]

[1204]

[1205]

[1207] La Tabla 36 enumera la o las posibles causas de PML en el estudio, las SNV het comp posibles no escalonadas para genes en la Tabla 31 con frecuencia <=1/100.

[1208] Tabla 37: Genes de car a énica mismos criterios ue en la Tabla 13

[1209]

[1211] Tabla 38: Las SNV de nivel 1 de carga variante (mismos criterios que en la Tabla 14)

[1212]

[1213] La Tabla 38 enumera el nivel superior de variantes que se encontraron significativas sobre la base del análisis de carga de variantes para los genes en la Tabla 31.

[1214] Tabla 39: Las SNV de nivel 2 de carga variante (mismos criterios que en la Tabla 15)

[1216]

[1217]

[1220] La Tabla 39 enumera el segundo nivel de variantes consideradas significativas sobre la base del análisis de carga de variantes para los genes en la Tabla 31.

[1222] Tabla 40: Resumen del subconjunto de genes que albergan variantes de interés en los 70 casos de PML (de las Tablas 34 - 39

[1224]

[1225]

[1226]

[1227]

[1229] Ejemplo 23 - Análisis de la interacción proteína-proteína

[1230] Este ejemplo contiene el análisis de las interacciones proteína-proteína (p. ej., análisis de vía) para los dos conjuntos de genes candidatos de PML: PML-435 (Tablas 6, 25A y 25B) y PML-270 (Tabla 31).

[1231] Se generó una lista integrada de los principales genes de PML candidatos a partir de los tres métodos de análisis utilizados en este documento: 1) enfoque de resolución de casos (p. ej., Tablas 7-9 y 34-36); 2) análisis de carga genética (p. ej., tablas 13 y 37); y 3) análisis de carga variante para los principales hallazgos (p. ej., nivel 1, Tablas 14 y 38) y hallazgos de segundo nivel (por ejemplo, nivel 2, Tablas 15 y 39). Se aplicó una métrica de puntuación de genes (véase Tabla 42 para los resultados) de la siguiente manera: 1) resolución de casos, se sumó para cada gen el número total de casos únicos de PML potencialmente resueltos, 2) carga genética, se informa el número de etnias que se encontró que eran significativas para un gen determinado (p. ej., si los casos de AFR y EUR fueron significativos en sus respectivos análisis, entonces el número informado es 2), 3) carga de variantes (nivel 1 o nivel 2), se informa el número de etnias que resultaron ser significativas para una variante dada, y 4) puntuación total del gen, la suma de las etapas 1-3 (resolución de casos, carga de genes y carga de variantes) se sumaron para obtener la puntuación total de un gen determinado en el que un número más alto es un gen candidato más fuerte (por ejemplo, FAT4 fue el gen de mayor puntuación con una puntuación total de genes de 29). Se encontró que un total de 255 genes (derivados de las Tablas 6, 25A, 25B y 31) tenían variantes de interés en el conjunto de 70 casos de PML para los que se obtuvieron datos de WES y de CGH matriz. Se estableció una puntuación de genes de >3 como punto de corte para el análisis de vías, lo que arrojó los 74 genes que se informan en la Tabla 42.

[1232] El análisis de vía se realizó en el conjunto de 74 genes informados en la Tabla 42 usando el recurso de la base de datos de String (Szklarczyk D et al., 2017, PMID 27924014). Se utilizaron configuraciones predeterminadas excepto para la "puntuación de interacción mínima requerida", que se estableció en "confianza alta" (la configuración predeterminada es "confianza media").

[1233] El análisis de la base de datos de String arrojó tres redes de interacción principales:

[1234] 1) Red de 24 genes (el resultado se representa en la Figura 14 y se anota en Tabla 42): BLK, CARD11, CFTR, EGF, IFIH1, ITSN2, MAVS, MMP9, MX1, NFKB1, NLRX1, NOD1, NOD2, OAS1, OAS2, PIK3CD, PLAU, PLCG2, RNF125, SAMD9, TEK, TICAM1, TLR4, ZAP70;

[1235] 2) red de 13 genes: ATM, ATR, BLM, DCLRE1C, LRRK2, MDC1, MLH1, MSH5, POLE, PRKDC, RANBP2, RNF168, RTEL1; y

[1236] 3) red de 3 genes: C7, C8A, C8B.

[1237] Tabla 42 Análisis de las interacciones proteína-proteína

[1239]

[1240]

[1241]

[1244] La Tabla 42 contiene los resultados de puntuación de genes, los genes que se encuentran en la red de 24 genes, además de las 5 principales vías de ontología génica (GO) "Proceso biológico" (basadas en los valores de "tasa de descubrimiento falso" informadas en la salida de la base de datos de String) y las vías GO adicionales representativas de interés. Los encabezados de columna y los resultados de GO se informan a continuación:

[1246] Símbolo del gen de RefSeq, informa los genes de las Tablas 6, 25A, 25B y 31 que tenían una "Puntuación total de genes " >= 3.

[1247] La fuente de genes, informa la o las tablas fuente originales de genes de desregulación inmunitaria.

[1248] La resolución de casos, informa el número total de casos únicos de PML que se resuelven potencialmente mediante el enfoque de resolución de casos (descrito en este documento para las Tablas 7-9 y 34-36).

[1249] La carga génica, informa el número de etnias (AFR, EUR y/o LAT) que se encontraron con el método de carga génica (descrita en el presente documento para Tablas 13 y 37).

[1250] El nivel 1 de carga variante, informa el número de etnias (AFR, EUR y/o LAT) que se encontraron con el método de carga variante (descrito en el presente documento para las Tablas 14 y 38).

[1251] El nivel 2 de carga variante, informa la cantidad de etnias (AFR, EUR y/o LAT) que se encontraron con el método de carga variante (descrito en el presente documento para las Tablas 15 y 39).

[1252] La puntuación génica total, informa la suma de las entradas de resolución de casos, carga genica, nivel 1 de carga variante y nivel 2 de carga variante (descritas en este documento), en las que solo se incluyeron genes con una puntuación >=3.

[1253] La red de 24 genes, identifica los genes (etiquetados con una X) que se encuentran en la red más grande del análisis de la base de datos de String (descrito en este documento), véase la Figura 14 para ver una representación gráfica.

[1255] Los siguientes 9 encabezados de columna enumeran los números de identificación GO de "ID de la vía" e identifican los genes (marcados con una X) que se encontraron en cada vía del conjunto total de 74 genes en la Tabla 42. También se incluye a continuación la "descripción de la vía" GO, el "recuento en el conjunto de genes" (número de genes de la Tabla 42), y la "tasa de descubrimiento falso" (valor de asociación):

[1257] GO:0002250, respuesta inmune adaptativa, 13 genes, 1.12e-10

[1258] GO:0045087, respuesta inmune innata, 23 genes, 1.35e-10

[1259] GO:0006955, respuesta inmune, 26 genes, 1.54e-10

[1260] GO:0002252, proceso efector inmune, 16 genes, 2.70e-09

[1261] GO:0002253, activación de la respuesta inmune, 16 genes, 2.70e-09

[1262] GO:0042113, activación de células B, 9 genes, 5.24e-07

[1263] GO:0032479, regulación de la producción de interferón tipo I, 8 genes, 3.70e-06

[1264] GO:0030217, diferenciación de células T, 7 genes, 6.65e-05

[1265] GO:0006958, activación del complemento, vía clásica, 4 genes, 6.10e-04

[1267] Ejemplo 24 - Análisis de variantes nocivas/protectoras

[1269] Los datos de WES sobre los 70 casos de PML también se analizaron en busca de variantes que ocurren a una tasa estadísticamente significativa entre los 705 genes totales (435 del análisis original y 270 del segundo análisis) que se han identificado en el presente documento como desempeñando un papel en la desregulación inmunitaria. En este análisis, "estadísticamente significativo" puede tener un valor P de FET, después de la corrección de Bonferroni, de P < 4.95E<-6>. Los criterios de inclusión incluyeron cualquier SNV que mostrara significancia estadística en uno o más grupos étnicos (europeo, africano o latino) o en todos los grupos. Algunas de estas variantes pueden ocurrir con alta frecuencia entre los 70 casos de PML. Algunas de estas variantes pueden ocurrir en pacientes con HIV, MS u otras enfermedades como las descritas en este documento, o cualquier combinación de las mismas. La observación de estas variantes en los 70 casos de PML sugiere que puede haber un vínculo entre estas variantes y la PML. La Tabla 43 enumera variantes perjudiciales estadísticamente significativas (como la variante 18-60052034-AC, SEQ ID NO.1287), observadas en los 70 casos de PML con datos de WES. La Tabla 44 enumera variantes protectoras estadísticamente significativas observadas en los 70 casos de PML con datos de WES. Encabezados de columna: Variante; Gen; PML total; Etnias; Enfermedades; Valores P de FET: EUR; Valores P de FET: AFR; Valores P de FET: LAT; Valores P de FET: TODOS; Relaciones de probabilidades: EUR; Relaciones de probabilidades: AFR; Relaciones de probabilidades: LAT; Relaciones de probabilidades: TODAS.

[1270]

[1271]

[1272]

[1273] Tabla 44: Resumen de las variantes protectoras estadísticamente significativas que se han observado en los 70 casos de PML con los datos de WES

[1274]

[1275]

[1276]

[1278] Ejemplo 25 - Descripción de datos de secuencias adicionales

[1279] El archivo de secuencia 56969-701.601 ST25.txt contiene información genómica para:

[1280] 1. La información de la secuencia genética a la que se hace referencia en el Ejemplo 4 (las SEQ ID 1-2177); 2. SEQ ID 2200-2203 son las distintas secuencias de CNV para las CNV en la Tabla 28A;

[1281] 3. SEQ ID 2204-2215 son la extensión genómica completa de las secuencias de transcripción para las transcripciones en la Tabla 30;

[1282] 4. SEQ ID 2300-2893 son la extensión genómica completa de las secuencias de transcripción para las transcripciones en la Tabla 32;

[1283] 5. SEQ ID 3000-3274 son las variantes de secuencia enumeradas en la Tabla 33;

[1284] 6. SEQ ID 3275-3281 son la extensión genómica completa de las secuencias de transcripción para las transcripciones en la Tabla 49;

[1285] 7. SEQ ID 3300-3351 son las variantes de secuencia enumeradas en la Tabla 45A;

[1286] 8. SEQ ID 3400-3467 son las variantes de secuencia enumeradas en la Tabla 45B;

[1287] 9. SEQ ID 3500-3526 son las variantes de secuencia enumeradas en la Tabla 45C.

[1288] Tabla 45A: SEQ ID 3300-3351, lista de SNV Tabla 43 con números de SEQ ID

[1291]

[1292]

[1294] Tabla 45B: SEQ ID 3400-3467, lista de SNV Cuadro 44 con números de SEQ ID

[1295]

[1296]

[1297]

[1299] Tabla 45C: SEQ ID 3500-3526, listado de SNV Tabla 50A con números de SEQ ID

[1300]

[1301]

[1303] Tabla 48: GN 763-765, ID del gen de NCBI, descripciones, resumen de RefSeq para 3 genes de análisis de car a de variantes de todos los enes Tabla 50A

[1306]

[1308] Tabla 49: SEQ ID 3275-3281, lista no redundante de variantes de transcripción que corresponden a los genes en la Tabla 48

[1309]

[1312] Ejemplo 26 - Cohortes de replicación y descubrimiento de PML

[1314] La cohorte de 70 casos de PML cuyo análisis se describió anteriormente (p. ej., los resultados genéticos informados en la Tabla 7) puede considerarse una cohorte de 'Descubrimiento' (Dis). Se realizó un estudio adicional en una cohorte de "Replicación" (Rep) que comprendía 115 casos adicionales de PML. Estos 115 casos se obtuvieron de 4 fuentes diferentes, de las cuales solo una era la misma que una de las fuentes de la cohorte de Dis. La Tabla 46 enumera la información de los 185 casos de PML (cohorte de Dis = 70 casos, cohorte de Rep = 115 casos). Como se hizo para la cohorte de Dis de PML (Ejemplo 3), se obtuvieron datos de WES en los 115 casos de Rep de PML. A diferencia de la cohorte de Dis, no se realizó aCGH en la cohorte de Rep. Sin embargo, los expertos en la materia saben que las CNV (p. ej., las informadas en las Tablas 1 y 28A) se pueden detectar por otros métodos además de aCGH. Por ejemplo, las CNV recurrentes informadas en la Tabla 1 y/o Tabla 28A pueden, en algún momento, detectarse fácilmente en la cohorte de Rep utilizando métodos basados en PCR (p. ej., ensayos de PCR de fragmentos de unión).

[1316] Para confirmar la ascendencia de cada caso de PML, que fue informado por el médico, se generaron datos de WGS (Gencove, NY, EE.UU.) en el ADN genómico de los 185 casos. La plataforma Gencove utiliza secuenciación de paso bajo a una profundidad de lectura de 0.1x que produce datos suficientes (sobre la base de los SNP) para determinar el origen étnico y la "exclusividad" de una muestra. Estos datos permitieron determinar:

[1318] A. Origen étnico real, en lugar de confiar en el origen étnico informado por el médico;

[1319] B. Si alguna de las 185 muestras de PML eran duplicados. Debido a que la PML es un trastorno raro, es posible que los individuos afectados hayan sido vistos varias veces por diferentes centros médicos. Ninguna de las 185 muestras resultó estar duplicada.

[1321] Gencove informa las siguientes categorías de ascendencias/etnias (el nombre completo sigue a la abreviatura entre paréntesis): Américas (AMÉRICAS), judío asquenazí (ASHKENAZI), Bengala (BENGALÍ), África central (CAFRICA), Asia central (CASIA), África del Este (EAFRICA), Asia del Oeste (EASIA), Mediterráneo oriental (EMED), Finlandia (FINLANDIA), subcontinente indio central (INDPAK), norte de África (NAFRICA), norte y centro de Asia (NCASIA), Oriente Medio (NEAREAST), noreste de Asia (NEASIA), noreste de Europa (NEEUROPE), norte y centro de Europa (NEUROPE), norte de Italia (NITALY), Islas Británicas del Norte (NNEUROPE), Oceanía (OCEANÍA), África Meridional (SAFRICA), Escandinavia (SCANDINAVIA), Sudeste Asiático (SEASIA), Subcontinente Indio Meridional (SSASIA), Europa Sudoccidental (SWEUROPE), Anatolia, Cáucaso, Meseta iraní (TURK-IRAN-CAUCASUS), y África Occidental (WAFRICA). Para simplificar la interpretación de las variantes de pacientes con PML utilizando bases de datos públicas, tales como gnomAD y el proyecto 1000 genomas (TGP), las etnias de Gencove se combinaron para determinar el porcentaje más alto de ascendencia europea (correspondiente a NFE en gnomAD y EUR en TGP) o ascendencia africana (correspondiente a AFR en gnomAD y en TGP). Se combinaron las siguientes etnias de Gencove: NFE/EUR = (MSED+ NEEUROPE+ NEUROPE NITALY+ NNEUROPE SCANDINAVIA SWEUROPE) y AFR = (CAFRICA EAFRICA+NAFRICA+ SAFRICA+ WAFRICA). La mayoría de los pacientes con PML se podían asignar fácilmente como etnia NFE/EUR o AFR, pero algunos individuos se agruparon de acuerdo con su etnia más cercana (p. ej., los pacientes con ascendencia predominantemente ASHKENAZI y TURK-IRAN-CAUCASUS se asignaron como NFE/EUR).

[1323] Tabla 46: Lista completa de 185 casos de PML en las cohortes de Descubrimiento (n = 70) y Replicación (n =

[1325] 115)

[1328]

[1329]

[1330]

[1331]

[1332]

[1334] La Tabla 46 representa el conjunto completo de pacientes con PML en las cohortes de Descubrimiento (Dis) o Replicación (Rep). La cohorte de Dis es equivalente a los pacientes enumerados en la Tabla 7 excepto para PML67, para el cual no se disponía de suficiente ADN para generar datos de WES. La Tabla 46 también enumera la ID de la muestra, el género, la ID Expt aCGH (también informada en la Tabla 11), enfermedad primaria y etnia primaria (basado en el análisis de ascendencia de Gencove). Además de la MS y el HIV, las categorías de enfermedades primarias incluían cánceres sanguíneos (principalmente leucemias y linfomas) y otras (afecciones diversas como anemia, linfopenia, sarcoidosis y pacientes trasplantados).

[1335] Ejemplo 27 – Fuente de información de análisis de secuencia actualizado

[1336] Los métodos de secuenciación y análisis de secuencias de alto rendimiento se desarrollan continuamente para mejorar la calidad de los datos y los resultados. Se utilizó un nuevo enfoque, que complementa el enfoque anterior, para el análisis de los datos de WES de la cohorte de Dis y Rep. La llamada DeepVariant (DV) de Google (github.com/google/deepvariant) se usó para llamadas de variantes (véase Poplin et al., (2018) Nat Biotechnol. nov; 36 (10): 983-987). Usando GRCh37 como genoma de referencia, los archivos BAM alineados con BWA para cada muestra de PML (cohorte de Dis o Rep) se ejecutaron a través de la llamada de DV. Los criterios de inclusión de variantes fueron: DP ≥ 10 (las profundidades del sitio se calcularon nuevamente directamente a partir de los archivos BAM, con restricciones para Calidad de la Base > 10 y Calidad de mapeo > 20, y DP < 10 se trataron como "NA"), VAF > 0.2 para llamadas heterocigotas (VAF < 0.2 fueron tratadas como "NA"), y VAF > 0.8 para llamadas homocigotas (VAF < 0.8 fueron tratadas como llamadas heterocigotas). La anotación de las variantes de llamadas de DV se realizó utilizando dbNSFP (véase Liu et al. (2016) Hum Mutat.2016 Mar; 37(3): 235-41).

[1338] Los análisis de carga de variantes se realizaron usando criterios similares a los que se usaron para las variantes informadas en las Tablas 14, 15, 38 y 39, excepto que las variantes de llamadas de DV para los casos de PML se usaron como entrada. Las cohortes de Dis y Rep se analizaron por separado, y se generaron archivos de salida separados para variantes heterocigotas (het) y homocigotas (hom). Para simplificar, los genes enumerados en las Tablas 6, 25A, 25B, 26 y 31 se combinaron en una lista no redundante de 705 genes. La lista de 705 genes se comparó con todos los genes que se encontraron en los informes de anotación para las dos cohortes (Dis y Rep), lo que arrojó una lista de genes no redundantes de 663 genes que se usaron para los análisis de carga de variantes de fuente de información de DV. Además de los análisis de 663 genes, se generó un conjunto paralelo de análisis de todos los genes (todos los ~ 20,000 genes del genoma humano). Para resumir, para cada variante observada, se hizo un recuento total de la cantidad de individuos en las cohortes de PML que poseían la variante, y esto se hizo de manera similar para comparar en tres cohortes de población diferentes no seleccionadas: exoma de gnomAD (datos de WES), genoma de gnomAD (datos de WGS) y exoma de TGP (datos de WES). Se calcularon la prueba exacta de Fisher (FET) y la relación de probabilidades (OR) para identificar variantes estadísticamente significativas con los valores de OR más altos.

[1340] Tabla 47: 663 enes analizados ara los 185 casos de PML fuente de información de DV

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[1362] Para la lista de 663 genes en la Tabla 47, se proporcionan los siguientes: Símbolo del gen de RefSeq, si el gen está incluido en la lista IUIS-334 (Picardo et al., (2018) J Clin Immunol.38(1):96-128; Bousfiha et al., (2018) J Clin Immunol. 38(1): 129-143), el modelo de enfermedad, las tablas con referencias cruzadas que también enumeran un subconjunto de los 663 genes y el número de gen.

[1363] Se pueden utilizar criterios más estrictos para la designación del modelo de enfermedad. Por ejemplo, la Tabla 6 utiliza modelos de enfermedad AR, AD, XLR y XLD basados en las entradas OMIM independientemente de si la enfermedad genética es un trastorno de inmunodeficiencia clásico. Mientras, la Tabla 47 enumera las entradas AR, AD, XLR y XLD solo para aquellos genes que están en la lista de genes IUIS-334. Por ejemplo, el gen PKHD1 causa la enfermedad renal poliquística AR y figura como una enfermedad AR en la Tabla 6 pero con un modelo de enfermedad "desconocido" en la Tabla 47. Sin embargo, los expertos en la técnica entienden que, a menudo, se agregan fenotipos de enfermedades adicionales al cuadro clínico una vez que se identifican más pacientes. En Burgmaier et al., 2019 (Sci Rep. 9(1): 7919), se informa que los pacientes tienen los fenotipos inmunitarios de trombocitopenia, anemia y leucopenia.

[1364] Ejemplo 28 - Datos de resumen de carga de variantes de la fuente de información de DV

[1365] Las principales variantes de los análisis de carga de variantes se identificaron sobre la base de los criterios de filtrado que se aplicaron a las cohortes de PML de Dis y Rep (incluido un subconjunto de anotación funcional), seguido de la determinación del subconjunto de variantes filtradas que se encontraron en ambas cohortes. Los criterios de filtrado utilizados fueron:

[1366] A.663 genes (archivos het y hom), IMPACTO = ALTO o MODERADO, ≥ 2 casos EUR o ≥ 1 caso AFR, FET ≤ 0.1, OR > 1

[1367] B. Todos los genes (archivos het y hom) utilizaron 3 conjuntos de filtros:

[1368] 1. IMPACTO = ALTO, ≥ 3 casos EUR o ≥ 1 caso AFR, FET ≤ 0.05, OR > 1

[1369] 2. IMPACTO = MODERADO, CLASE VARIANTE = eliminación o inserción, ≥ 3 casos EUR o ≥ 1 caso AFR, FET ≤ 0.05, OR > 1

[1370] 3. IMPACTO = MODERADO, CLASE VARIANTE = SNV, PolyPhen = dañino y SIFT = D (nocivo), ≥ 3 casos EUR o ≥ 2 casos AFR, FET ≤ 0.05, OR > 1

[1371] Después de encontrar el conjunto de variantes superpuestas para las cohortes de Dis y Rep de acuerdo con los filtros anteriores, se evaluó más la biología de los genes utilizando PubMed y se clasificaron de la siguiente manera: 1 = biología fuerte, 2 = biología media, 3 = biología desconocida. También se excluyeron variantes para: 1) recuentos de casos de PML muy altos (más probable que sean falsos positivos), 2) alta frecuencia en una etnia pero no en la otra (mayor probabilidad de que la variante sea benigna en comparación con una variante que es rara tanto en la etnia EUR como en la AFR), y 3) presencia en un gen del cromosoma X (dichas variantes son difíciles de interpretar ya que se debe tener en cuenta el género). Las 27 variantes principales de este conjunto de análisis y criterios de filtrado se enumeran en las Tablas 50A y 50B.

[1372] Tabla 50A: Las 27 variantes rinci ales de los análisis de car a de variantes de fuente de información de DV

[1374]

[1375]

[1377] Tabla 50B: Las 27 variantes principales de los análisis de carga de variantes de la fuente de información de DV, distribución de casos de PML or cohorte Dis Re etnia EUR AFR

[1378]

[1379]

[1382] Ejemplo 29 - Análisis estadístico de carga de variante de la fuente de información de DV

[1384] El conjunto de 27 variantes de los análisis de carga de variantes de la fuente de información de DV (véase las Tablas 50A y 50B) se clasificó en función de los valores de FET y OR para cuatro tipos de análisis: solo EUR, solo AFR, EUR+AFR normalizado (norm.) donde los tamaños de la cohorte de gnomAD se ajustaron para que coincidan con la proporción relativa de casos de PML EUR (NFE en gnomAD) y AFR en la cohorte total (n = 185), y EUR+ AFR sumados (sum.) donde los datos del sujeto para las cohortes de NFE y AFR de gnomAD simplemente se sumaron. Se realizaron tres conjuntos de análisis estadísticos utilizando tres recursos disponibles públicamente (exoma de gnomAD, genoma de gnomAD y exoma de TGP), pero solo los análisis del exoma de gnomAD se presentan en las tablas 51 a 62, ya que los resultados fueron comparables para casi todas las variantes. Para cada conjunto de 3 tablas (nivel 1, nivel 2 y niveles 1 y 2 combinados), se calcularon FET y OR para las 27 variantes, las variantes se clasificaron en OR (descendente) y se excluyeron las variantes con FET > 0.05. Para las variantes de Nivel 1 (Tablas 51, 54, 57 y 60), se dio preferencia a las variantes con OR > 3 y solo una frecuencia moderada en los casos de PML (p. ej., PRAM119-8564523-T-G se consideró demasiado frecuente). Las "lecturas" enumeradas en las tablas corresponden a los recuentos de lectura en los datos de secuenciación (p. ej., el número de individuos muestreados para la variante). Las Tablas 51 y 54 también tienen un intervalo de Panel en el que a las 7 principales variantes EUR y las 10 principales variantes AFR se les asigna un intervalo que se usa en las Tablas 63A-64B.

[1385] Tabla 51: 7 variantes EUR (nivel 1) con valores de FET y OR

[1386]

[1388] Tabla 52: 9 variantes EUR nivel 2 con valores de FET OR

[1390]

[1392] Tabla 53: 16 variantes EUR niveles 1 2 con valores de FET OR

[1395]

[1396]

[1398] Tabla 54: 10 variantes AFR nivel 1 con valores de FET OR

[1400]

[1402] Tabla 55: 3 variantes AFR nivel 2 con valores de FET OR

[1404]

[1407] Tabla 56: 13 variantes AFR niveles 1 2 con valores de FET OR

[1410]

[1411] Tabla 57: 13 variantes EUR+AFR nivel 1 con valores FET OR normalizados

[1414]

[1416] Tabla 58: 8 variantes EUR+AFR nivel 2 con valores de FET OR normalizados

[1417]

[1419] Tabla 59: 21 Variantes EUR+AFR niveles 1 2 con valores de FET OR normalizados

[1421]

[1422]

[1424] Tabla 60: 12 variantes EUR AFR nivel 1 con valores de FET OR sumados

[1426]

[1428] Tabla 61: 11 variantes EUR AFR nivel 2 con valores de FET OR sumados

[1429]

[1430]

[1432] Tabla 62: 23 variantes EUR+AFR niveles 1 2 con valores de FET OR sumados

[1433]

[1435] Ejemplo 30 - Paneles de variantes con evaluación de rendimiento diagnóstico e impacto en la poblaciónLos paneles de variantes que consisten en las 7 principales variantes EUR (Tabla 51) y las 10 variantes principales de AFR (Tabla 54) fueron evaluados por su rendimiento diagnóstico no redundante en los casos de PML (p. ej., un caso de PML con ≥ 2 variantes del panel se contó solo una vez). Estos paneles se evaluaron de manera similar en datos de exoma de TGP de 440 sujetos AFR y 436 EUR, cuyos archivos BAM con referencia GRCh37 se descargaron y volvieron a analizar utilizando la fuente de información de DV. Las Tablas 63A y 64A muestran los resultados para casos de PML EUR y AFR frente a controles de TGP, respectivamente, en los que la frecuencia del panel de PML corresponde al rendimiento del diagnóstico y el índice de frecuencia refleja el nivel de enriquecimiento de las variantes del panel en los casos de PML. Los valores de FET y OR corresponden al número de casos de PML y controles de TGP que tienen una o más de 3 variantes, 4 variantes, etc. para un panel determinado.

[1436] Las Tablas 63B y 64B contienen los resultados de la evaluación del impacto en la población como se describe en Tonk et al., (2016) Pharmacogenomics J.17(4): 386-392, para lo siguiente: Sensibilidad, Especificidad, Valor predictivo positivo (PPV), Valor predictivo negativo (NPV), Frecuencia atribuible a la población (PAF), Número necesario a tratar (NNT) y Número necesario para el genotipo (NNG).

[1437] Tabla 63A: Panel de 7 variantes de EUR, rendimiento dia nóstico valores de FET OR

[1439]

[1441] Tabla 63B: Panel de 7 variantes de EUR, evaluación del im acto en la oblación

[1443]

[1445] Tabla 64A: Panel de 10 variantes de AFR, rendimiento dia nóstico valores de FET OR

[1448]

[1449]

[1451] Tabla 64B: Panel de 10 variantes AFR, evaluación del im acto en la oblación

[1454]

[1456] Ejemplo 31 - Paneles de variantes con información resumida

[1457] La Tabla 65 muestra el desglose de los casos de PML con una variante del conjunto de 17 variantes (7 EUR y 10 AFR, Tablas 51 y 54). En general, se distribuyen entre géneros, etnias y enfermedades primarias. Por ejemplo, las 7 variantes EUR se encuentran en dos o más enfermedades primarias (MS, HIV, cánceres sanguíneos, otros). Por el contrario, aproximadamente la mitad de las 10 variantes de AFR se encuentran solo en pacientes con PML por HIV, pero esto no es sorprendente dada la gran proporción de casos de PML por HIV AFR (48 de 49) en la cohorte de PML (véase la Tabla 46).

[1458] La Tabla 66 enumera los números de ID de dbSNP para el conjunto de 17 variantes (7 EUR y 10 AFR, Tablas 51 y 54), junto con los números PMID de PubMed para respaldar la biología en la bibliografía (véanse también la Tablas 6 y 31 para citaciones adicionales de PMID para un subconjunto de los genes).

[1459] Tabla 65: Paneles de 7 variantes EUR y 10 variantes AFR, distribución de casos de PML por cohorte, género, etnia y enfermedad primaria

[1460]

[1461]

[1463] Tabla 66: Paneles de 7 variantes EUR 10 variantes AFR, ID de dbSNP biolo ía de aoo

[1464]

[1465]

[1467] Ejemplo 32 - Información actualizada de medicamentos

[1468] Los medicamentos inmunosupresores son una clase amplia y en expansión de compuestos terapéuticos, que incluye versiones genéricas de productos biológicos (denominados biosimilares). Los medicamentos, como los que están en el mercado que pueden estar relacionados con el riesgo de PML, ahora o en el futuro, incluyen pero no se limitan a: fumarato de diroximel (p. ej., VUMERITY), siponimod (p. ej., MAYZENT), golimumab (p. ej., SIMPONI), elotuzumab (p. ej., EMPLICITI), idebenona, ravulizimab-cwvz (p. ej., (ULTOMIRIS), letrozol (p. ej., FEMARA), voriconazol (p. ej., VFEND), dalfampridina (p. ej., AMPYRA), ambrisentán (p. ej., LETAIRIS), pegfilgrastim (p. ej., NEULASTA), simvastatina, hormona adrenocorticotrópica, ácido lipoico y oxcarbazepina. Los medicamentos inmunosupresores que se encuentran en ensayos clínicos que pueden ser vinculados con el riesgo de PML antes o después de la aprobación del fármaco incluyen, pero no se limitan a: elezanumab, nerispirdina, daprolizumab pegol, etrolizumab, abrilumab, evobrutinib, amiselimod, ceralifimod, clemastina, sunfenon epigalocatequina-galato y andrografólidos (una hierba medicinal botánica también conocida como IB-MS).

[1469] Además, otras moléculas de interés incluyen, pero no se limitan a, BNZ-1, IMU-838, SAR442168/PRN2246, BIIB033, BIIB059, BIIB061, AJM300, EK-12 (una combinación de neuropéptidos de metencefalina y tridecactida) y CHS-131.

[1470] Algunos medicamentos de interés como medicamentos inmunosupresores tienen nombres alternativos informados en las bases de datos de la FDA, tales como fingolimod frente a clorhidrato de fingolimod, mofetil micofenolato frente a clorhidrato de mofetil micofenolato, tacrolimus frente a tacrolimus anhidro, bendamustina frente a clorhidrato de bendamustina, doxorrubicina frente a clorhidrato de doxorrubicina y certolizumab frente a certolizumab pegol.

[1471] Algunos tratamientos contra el HIV también se han relacionado con casos de PML en la base de datos de la FDA, tales como ritonavir (p. ej., NORVIR), enfuvirtida (p. ej., FUZEON) y maraviroc (p. ej., SELZENTRY). Los medicamentos y/o moléculas de interés aprobados que tienen el mismo mecanismo de acción que el natalizumab y, por lo tanto, pueden vincularse con la PML incluyen, pero no se limitan a, levocabastina, TR-14035 y R-411.

[1472] Tabla 67: Eem los de biosimilares

[1475]

[1476]

[1477]

[1479] Si bien en el presente documento se han mostrado y descrito realizaciones preferidas de la presente invención, será obvio para los expertos en la técnica que dichas realizaciones se proporcionan únicamente a modo de ejemplo. Las siguientes reivindicaciones definen el alcance de la invención.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Natalizumab para su uso en el tratamiento de una afección en un sujeto que necesita terapia con medicamentos inmunosupresores,

en el que el sujeto tiene un riesgo reducido de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) debido a una infección del cerebro por el virus de John Cunningham (JCV),

en el que la disminución del riesgo del sujeto se debe a la ausencia de una variación genómica seleccionada del grupo que consiste en: chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A; chr9:137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A,

en el que la posición del cromosoma de la variación genómica se define con respecto a UCSC hg19.

2. Natalizumab para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la variación genómica es chr1:57409459, C>A, en el que la posición cromosómica de la variación genómica se define con respecto a UCSC hg19.

3. Natalizumab para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la variación genómica es chr9:137779251, G>A, en el que la posición cromosómica de la variación genómica se define con respecto a UCSC hg19.

4. Natalizumab para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la variación genómica es chr1:160769595, AG>A, en el que la posición cromosómica de la variación genómica se define con respecto a UCSC hg19.

5. Natalizumab para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la afección es una enfermedad autoinmune,

opcionalmente en la que:

(i) la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Addison, encefalitis antireceptor de NMDA, síndrome de antisintetasa, anemia aplásica, anemias autoinmunes, anemia hemolítica autoinmune, pancreatitis autoinmune, enfermedad de Behcet, trastornos de la piel ampollosa, enfermedad celíaca - esprúe ( enteropatía sensible al gluten), síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, leucemia linfocítica crónica, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, enfermedad de Devic, eritroblastopenia, síndrome de Evans, glomeruloesclerosis segmentaria focal, granulomatosis con poliangitis, enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, enfermedades autoinmunes mediadas por IgA, enfermedad relacionada con IgG4, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis idiopática juvenil, esclerosis múltiple, miastenia grave, mieloma, linfoma no Hodgkin, síndrome de Opsoclonus myoclonus (OMS), penfigoide, pénfigo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, polimiositis, psoriasis, aplasia pura de glóbulos rojos, artritis reactiva, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjögren, lupus eritematoso sistémico, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, diabetes tipo I, colitis ulcerosa, vasculitis, vitíligo y combinaciones de las mismas;

(ii) la enfermedad autoinmune es esclerosis múltiple o enfermedad de Crohn; o

(iii) la enfermedad autoinmune es una forma recurrente de esclerosis múltiple.

6. Natalizumab para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la afección es esclerosis múltiple.

7. Natalizumab para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la afección es enfermedad de Crohn.

8. Natalizumab para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

(i) el natalizumab se administra mediante infusión intravenosa;

(ii) se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab;

(iii) se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab cada cuatro semanas;

(iv) se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa cada cuatro semanas;

(v) se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa cada seis semanas;

(vi) se administran aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg de natalizumab mediante infusión intravenosa cada ocho semanas; o

(vii) el natalizumab se administra por vía subcutánea.

9. Natalizumab para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias genómicas del sujeto se determinan mediante una prueba genética que comprende detectar la variación genómica en una muestra de ácido polinucleico obtenida del sujeto, opcionalmente en el que: (i) la prueba genética comprende analizar un genoma completo o el exoma completo del sujeto;

(ii) la prueba genética comprende analizar información de ácido nucleico que ya se ha obtenido para un genoma completo o un exoma completo del sujeto;

(iii) la prueba genética comprende analizar la información de ácido nucleico que ya se ha obtenido para un genoma completo o un exoma completo del sujeto, en la que la información de ácido nucleico se obtiene de un análisisin silico;

(iv) el sujeto es un sujeto humano; o

(v) la muestra de ácido polinucleico comprende un ácido polinucleico de sangre, saliva, orina, suero, lágrimas, piel, tejido o cabello del sujeto.

10. Natalizumab para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la prueba genética comprende análisis de micromatrices, PCR, secuenciación, hibridación de ácido nucleico o cualquier combinación de los mismos, opcionalmente en el que:

(i) el análisis de micromatrices se selecciona del grupo que consiste en un análisis de matriz de hibridación genómica comparativa (CGH) y un análisis de matriz SNP, o

(ii) la secuenciación se selecciona del grupo que consiste en secuenciación de firma masivamente paralela (MPSS), secuenciación de polony, pirosecuenciación 454, secuenciación de Illumina, secuenciación de Illumina (Solexa) utilizando la preparación de la biblioteca Genómica 10X, secuenciación SOLiD, secuenciación de semiconductores de iones, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación heliscópica de una sola molécula, secuenciación en tiempo real de una sola molécula (SMRT), secuenciación RNAP, secuenciación de ADN de nanoporos, secuenciación por hibridación y secuenciación de microfluidos de Sanger.

11. Natalizumab para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la variación genómica es una SNV heterocigota o una SNV homocigota.

12. Natalizumab para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

(a) el natalizumab es para ser administrado con un agente que reduce la carga viral de JCV en el sujeto; o (b) el natalizumab es para ser administrado antes de, o junto con un agente que reduce la carga viral en el sujeto,

opcionalmente en el que:

(i) el natalizumab se administra después de que se reduce la carga viral; o

(ii) el agente que reduce la carga viral es un agente que se dirige al JCV.

13. Un método para reducir el riesgo de que un sujeto desarrolle leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) que comprende

(a) probar en un sujeto la presencia de una variación genómica seleccionada del grupo que consiste en: chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A; chr9:137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A, en el que la posición en el cromosoma de la variación genómica se define con respecto a UCSC hg19; (b) determinar que el sujeto tiene la variación genómica, y

(c) desaconsejar la administración de natalizumab al sujeto que se determinó que tenía la variación genómica, opcionalmente en el que

(i) el asesoramiento comprende advertir que está contraindicada la administración de natalizumab;

(ii) el asesoramiento comprende advertir que la administración de natalizumab aumenta el riesgo de que el sujeto desarrolle leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML);

(iii) el asesoramiento comprende advertir que la administración de natalizumab es un factor que aumenta el riesgo de que el sujeto desarrolle leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML).

14. Un método para identificar a un sujeto que tiene riesgo de desarrollar leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) que comprende:

(a) analizar una muestra de ácido polinucleico del sujeto para una variación genómica seleccionada de un grupo que consiste en: chr1:57409459, C>A; chr22:35806756, G>A; chr21:45708278, G>A; chr9:137779251, G>A y chr1:160769595, AG>A en el que la posición del cromosoma de la variación genómica se define con respecto a UCSC hg19;

(b) establecer la presencia de la variación genética en la muestra de ácido polinucleico; y

(c) identificar al sujeto como de alto riesgo de desarrollar PML;

en el que el sujeto está inmunodeprimido,

en el que el sujeto tiene HIV, ha recibido un trasplante de órgano o padece una afección seleccionada de cáncer, una neoplasia maligna hematológica, una enfermedad autoinmune o linfocitopenia CD4+ idiopática (ICL).

15. Natalizumab para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o el método de la reivindicación 13 o 14, que comprende además analizar la presencia de JCV en una muestra biológica del sujeto, en el que el análisis de la presencia de JCV comprende una prueba de anticuerpos contra JCV o prueba de bandas oligoclonales de IgM del CSF,

opcionalmente en el que:

el análisis de la presencia de JCV comprende analizar al sujeto con la prueba de anticuerpos contra JCV, en la que la prueba de anticuerpos contra JCV detecta o no la presencia de JCV, o

la prueba de anticuerpos contra JCV comprende poner en contacto un reactivo de detección de JCV con una muestra biológica del sujeto, en el que opcionalmente el reactivo de detección de JCV se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-JCV, un cebador específico de JCV y combinaciones de los mismos.