ES3040993T3 - Monospecific and bispecific proteins with immune checkpoint regulation for cancer therapy - Google Patents

Abstract

Se proporcionan proteínas monoespecíficas que se unen específicamente a PD-L1. Algunas proteínas de ejemplo liberan la inhibición a través de PD-L1. Otras proteínas polivalentes de ejemplo comprenden al menos un sitio de unión a PD-L1. En ciertas realizaciones, los sitios de unión pueden estar conectados mediante una región constante de inmunoglobulina. También se proporcionan anticuerpos anti-PD-L1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas monoespecíficas y biespecíficas con regulación de puntos de control inmunitario para la terapia del cáncer

Antecedentes

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo. Más particularmente, la presente invención se refiere al anticuerpo para la terapia del cáncer.

Linfocitos T

Los dos tipos principales de linfocitos en humanos son T (derivados del timo) y B (derivados de la médula ósea). Estas células se derivan de células madre hematopoyéticas de la médula ósea y el hígado fetal que se han comprometido con la vía de desarrollo linfoide. La progenie de estas células madre sigue vías divergentes para madurar y convertirse en linfocitos B o T. El desarrollo de los linfocitos B humanos tiene lugar íntegramente dentro de la médula ósea. Los linfocitos T, por otro lado, se desarrollan a partir de precursores inmaduros que abandonan la médula y viajan a través del torrente sanguíneo hasta el timo, donde proliferan y se diferencian en linfocitos T maduros.

Los linfocitos T son los linfocitos citolíticos inmunitarios más abundantes (aproximadamente el 75 % de los linfocitos sanguíneos) y potentes. El papel de los linfocitos T efectores en la respuesta inmunitaria antitumoral está fuertemente respaldado por estudios invitroy la observación de que una alta infiltración de linfocitos T CD8+ en varios tipos de tumores se correlaciona con un pronóstico clínico favorable (Fridman et al., 2012 ). La activación de linfocitos T efectores no modificados requiere al menos tres señales complementarias: (i) interacción TCR-CD3/Ag-MHC con la ayuda de correceptores (CD4 o CD8); (ii) unión de moléculas coestimuladoras tales como CD80 o CD86 a CD28, CD40/CD40L; y (iii) moléculas accesorias como las citocinas.

La coestimulación o el suministro de dos señales distintas a los linfocitos T es un modelo ampliamente aceptado de activación linfocitaria de linfocitos T en reposo mediante células presentadoras de antígenos (APC) (Lafferty y Cunningham, 1975). Este modelo prevé además la discriminación entre lo propio y lo no propio y la tolerancia inmunitaria (Bretscher y Cohn, 1970; Bretscher, 1999; Jenkins y Schwartz, 1987). La señal primaria, o señal específica de antígeno, se transduce a través del receptor de linfocitos T (TCR) tras el reconocimiento del péptido antigénico extraño presentado en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La segunda señal o coestimuladora se suministra a los linfocitos T mediante moléculas coestimuladoras expresadas en células presentadoras de antígenos (APC) e induce a los linfocitos T a promover la expansión clonal, la secreción de citocinas y la función efectora (Lenschow et al., 1996). En ausencia de coestimulación, los linfocitos T pueden volverse refractarios a la estimulación antigénica, no generar una respuesta inmunitaria efectiva y, además, pueden provocar agotamiento o tolerancia a antígenos extraños.

Puntos de control inmunitario: PD-L1 y OX40

Los puntos de control inmunitario se refieren a un grupo de vías inhibidoras y estimuladoras iniciadas principalmente por la interacción ligando-receptor que conecta el sistema inmunitario, específicamente la inmunidad mediada por linfocitos T, para mantener la autotolerancia y modular la duración y amplitud de las respuestas fisiológicas en los tejidos periféricos para minimizar los daños tisulares colaterales normalmente (Pardoll, 2012). Las células tumorales se apropian de ciertas vías de puntos de control como un mecanismo importante de resistencia inmunitaria. Por ejemplo, el ligando de la proteína 1 de muerte celular programada, PD-L1, comúnmente está regulado positivamente en la superficie de las células tumorales de los cánceres humanos. La interacción de PD-L1 con su receptor, PD-1, expresado en linfocitos infiltrantes tumorales (TIL), específicamente en linfocitos T, inhibe la respuesta local mediada por linfocitos T para escapar de la vigilancia inmunitaria (Liang et al., 2006; Sznol y Chen, 2013). Por lo tanto, la inhibición de señales inmunosupresoras en las células cancerosas, o la estimulación agonista directa de los linfocitos T, da como resultado y/o induce una fuerte respuesta inmunitaria antitumoral sostenida. Estudios clínicos recientes sugirieron firmemente que el bloqueo de las proteínas de los puntos de control inmunitario a través de anticuerpos o moduladas por ligandos o receptores solubles son los enfoques más prometedores para activar la inmunidad antitumoral terapéutica (Topalian et al., 2014). Actualmente, la FDA ha aprobado anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos) para tratar enfermedades como los melanomas.

Otra molécula coestimuladora es el receptor OX40 (CD134), un miembro de la superfamilia TNFR, que está unido a la membrana y se expresa principalmente en linfocitos T CD4+ activados (Paterson et al., 1987). La señalización a través del receptor OX40 (en adelante "OX40") es coestimuladora de los linfocitos T efectores y provoca la proliferación de linfocitos T (Watts, 2005; Weinberg et al., 1994). Los estudios de OX40 sugieren que su función principal es dictar la cantidad de linfocitos T efectores que se acumulan en las respuestas inmunitarias primarias y, en consecuencia, gobernar la cantidad de linfocitos T de memoria que posteriormente se desarrollan y sobreviven (Croft, 2003). Varios estudiosin vitrohan demostrado que OX40 proporciona una señal coestimuladora que da como resultado una mayor proliferación de linfocitos T y producción de citocinas.

Inmunoterapia

Estudios recientes han destacado la eficacia terapéutica de la inmunoterapia, una clase de tratamientos contra el cáncer que utilizan el propio sistema inmunitario del paciente para destruir las células cancerosas. Dentro de un tumor, la presencia de una familia de moléculas reguladoras negativas, conocidas colectivamente como "inhibidores de puntos de control", puede inhibir la función de los linfocitos T para suprimir la inmunidad antitumoral. Los inhibidores de puntos de control, tales como CTLA-4 y PD-1, atenúan la proliferación de linfocitos T y la producción de citocinas. El bloqueo dirigido de CTLA-4 o PD-1 con anticuerpos monoclonales (mAb) antagonistas libera los "frenos" de los linfocitos T para estimular la inmunidad antitumoral. Generar respuestas óptimas de linfocitos T CD8 citotóxicos también requiere la activación del receptor de linfocitos T más coestimulación, que puede proporcionarse mediante la ligadura de miembros de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral, incluidos OX40 (CD134) y 4-1BB (CD137). OX40 es de particular interés ya que el tratamiento con un mAb anti-OX40 activador (agonista) aumenta la diferenciación de los linfocitos T y la función citolítica, lo que conduce a una inmunidad antitumoral mejorada contra una variedad de tumores. Cuando se usan como agentes únicos, estos fármacos pueden inducir potentes respuestas clínicas e inmunitarias en pacientes con enfermedad metastásica (Linch et al., 2015).

Nagaya et al. (2017; Oncotarget 8(5):8807-8817) describen la fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano que emplea un conjugado anticuerpo-fotoabsorbente para el tratamiento tumoral altamente selectivo. Precisamente, el anticuerpo monoclonal IgG1 anti-PD-L1 totalmente humano avelumab se conjuga con un fotoabsorbente para el tratamiento de tumores que expresan PD-L1.

Lee et al. (2017; Scientific Reports 7(1):5532) describen el mecanismo molecular del bloqueo de PD-1/PD-L1 mediante anticuerpos anti-PD-L1, incluyendo atezolizumab, durvalumab y avelumab, lo que permite dilucidar los epítopos precisos implicados y la base estructural del bloqueo. El documento WO 2017/193032 A2 proporciona moléculas o proteínas biespecíficas que se unen a dos epítopos y que son bivalentes para unirse a cada uno de los epítopos primero y segundo. El documento WO 2017/193032 A2 también proporciona métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, así como métodos para tratar o prevenir el cáncer en un sujeto mediante la administración de proteínas, moléculas de ácido nucleico o composiciones al sujeto.

El documento WO 2019/184909 A1 describe una nueva molécula de anticuerpo diseñada artificialmente que comprende un sitio de unión al antígeno de dominio único y un fragmento Fab de unión al antígeno. El documento W<o>2019/184909 A1 también proporciona un polinucleótido que codifica la molécula de anticuerpo, un vector que contiene el polinucleótido, una célula hospedadora que contiene el polinucleótido o el vector, un inmunoconjugado que contiene la molécula de anticuerpo y una composición farmacéutica que contiene la molécula de anticuerpo, así como el uso de la molécula de anticuerpo en inmunoterapia, o en la prevención y/o el diagnóstico de una enfermedad

Tan and Liu (2017, Protein & Cell 9(1):135-139) describen las características de unión a PD-L1 del anticuerpo monoclonal terapéutico durvalumab para su uso en el bloqueo de la vía de señalización PD-1/PD-L1.

Anticuerpos biespecíficos/bifuncionales

Las moléculas biespecíficas, como los anticuerpos biespecíficos (BsAbs), permiten actuar simultáneamente sobre múltiples epítopos de la misma diana molecular o de diferentes dianas con un único agente terapéutico. Como terapias contra el cáncer, tienen el potencial de conferir actividades novedosas o más potentes, reducir el coste de los productos y facilitar el desarrollo de nuevos regímenes terapéuticos, a diferencia de una combinación de dos mAb (Chames y Baty, 2009; Hollander, 2009; Thakur y Lum, 2010). Recientemente, el catumaxomab, un anticuerpo biespecífico trifuncional dirigido a la molécula de adhesión de células epiteliales humanas (EpCAM) y CD3, ha demostrado un claro beneficio clínico en pacientes con carcinomatosis peritoneal de cánceres epiteliales (Heiss et al., 2010), y un anticuerpo biespecífico de acoplamiento a linfocitos T (BiTE) con doble especificidad para CD19 y CD3 también ha demostrado una actividad clínica prometedora en pacientes con neoplasias hematológicas que expresan CD19 (Bargou et al., 2008). A pesar del gran interés en el desarrollo de moléculas biespecíficas como terapias contra el cáncer, los desafíos técnicos en la producción de moléculas biespecíficas estables y activas han dificultado en el pasado la evaluación clínica de la mayoría de los formatos biespecíficos. Muchos formatos de anticuerpos diseñados, incluyendo un anticuerpo biespecífico tipo IgG, han comprometido la estabilidad o la solubilidad (Bargou et al., 2008; Demarest y Glaser, 2008; Lu et al., 2005). Además, se han implementado diversas estrategias para aumentar la calidad del producto y la estabilidad in vivo de las moléculas biespecíficas, incluyendo la PEGilación, la conjugación con seroalbúmina humana y la ingeniería del Fc (Muller et al., 2007; Ridgway et al., 1996). Los anticuerpos monocatenarios biespecíficos de la forma general descrita anteriormente ofrecen la ventaja de que la secuencia de nucleótidos que codifica los cuatro dominios V, dos enlaces y un espaciador puede incorporarse a un organismo hospedador de expresión adecuado bajo el control de un único promotor. Esto aumenta la flexibilidad en el diseño de estas construcciones, así como el grado de control del investigador durante su producción. Además, el Fc de la IgG constituye un andamiaje muy atractivo para el diseño de nuevas terapias, ya que contiene todas las funciones del anticuerpo, excepto la capacidad de unión. La ingeniería del Fc es importante para mejorar la eficacia de los anticuerpos biespecíficos. Por lo tanto, la conformación basada en IgG se utiliza en la presente invención para dos dianas independientes en células inmunitarias o células diana en inmunoterapia.

El direccionamiento a proteínas de puntos de control inmunitario es un enfoque prometedor para activar la inmunidad antitumoral. Las proteínas de puntos de control inmunitario, como PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, etc., se están evaluando clínicamente actualmente (Fig. 1). Datos preliminares con bloqueadores de proteínas de puntos de control inmunitario han demostrado su capacidad para potenciar la inmunidad antitumoral, con el potencial de producir respuestas clínicas duraderas. Sin embargo, a pesar de la notable eficacia clínica de estos agentes en diversas neoplasias malignas, se ha evidenciado que no son lo suficientemente activos en muchos pacientes. Numerosas vías inmunomoduladoras adicionales, así como factores inhibidores expresados o secretados por células mieloides y estromales en el microambiente tumoral, son dianas potenciales para la sinergia con el bloqueo de puntos de control inmunitario. Por lo tanto, la combinación de terapias anticancerosas o con anticuerpos biespecíficos ha sido esencial para lograr la remisión completa y la curación de pacientes con cáncer.

La idea de utilizar anticuerpos biespecíficos para redirigir eficientemente las células inmunitarias efectoras hacia células tumorales surgió en la década de los 80 (Karpovsky et al., 1984; Pérez et al., 1985; Staerz et al., 1985). Las estructuras biespecíficas generalmente se clasifican en dos grupos principales con diferentes propiedades farmacocinéticas, basadas en la ausencia o presencia de un fragmento Fc, moléculas similares a IgG y pequeños formatos biespecíficos recombinantes, la mayoría de ellos derivados de un fragmento variable monocatenarios (scFv). Debido a su tamaño compacto, los fragmentos de anticuerpos generalmente penetran en los tumores de manera más eficiente que las moléculas similares a IgG, pero esta ventaja se ve mitigada por una semivida sérica corta (pocas horas), lo que limita su absorción tumoral general y el tiempo de residencia (Goldenberg et al., 2007). Por el contrario, la presencia de un fragmento Fc, que se une a los receptores Fc neonatales, proporciona una semivida sérica prolongada (>10 días) a los formatos similares a IgG, favoreciendo la absorción y retención en el tumor, pero limita la penetración en el tumor.

Sumario

En el presente documento se investiga un anticuerpo con propiedades inmunomoduladoras y una excelente afinidad de unión a PD-L1 para el tratamiento de pacientes con cánceres, tales como cáncer de próstata, cáncer de pulmón, NSCLC, melanoma, linfoma, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, RCC o cáncer de ovario.

La presente invención proporciona un anticuerpo o una porción de unión al antígeno del mismo a PD-L1 como se define en las reivindicaciones.

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplos y pretenden proporcionar una explicación adicional de la invención tal como se reivindica.

Breve descripción de los dibujos

La invención se puede comprender mejor leyendo la siguiente descripción detallada, con referencia a los dibujos adjuntos, como sigue:

La Fig. 1 muestra puntos de control inmunitarios que modulan la inmunidad mediada por linfocitos T. Se podrían utilizar anticuerpos agonistas o antagonistas contra los puntos de control, tales como anti-ICOS, anti-CD28, anti-OX40 y anti-CD27, o anti-PD-1, anti-CTLA4, anti-LAG3, anti-BTLA, para construir la proteína de fusión bifuncional dependiendo de las aplicaciones.

Las Figs. 2A y 2B muestran la detección del clon de fago mediante ELISA directo para células HEK293 con expresión de PD-L1.

Las Figs. 3A y 3B muestran la detección del clon de fago mediante ELISA basado en células con células HEK293 con expresión de OX40.

La Fig. 4 muestra candidatos de anticuerpos purificados específicos para PD-L1 mediante SDS-PAGE con reactivo no reductor para revelar la integridad y la pureza.

La Fig. 5 muestra candidatos de anticuerpos purificados específicos para OX40 mediante SDS-PAGE con reactivo reductor o no reductor para revelar la integridad y la pureza (anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones).

La Fig. 6 muestra ejemplos de la actividad de unión directa al ligando de candidatos de anticuerpos anti-proteínas de puntos de control inmunitario y anti-PD-L1 frente a PD-L1 purificados. Los pocillos recubiertos previamente con ligando se incubaron primero con diversas concentraciones de candidatos de anticuerpos como se indica. Las proteínas unidas se detectaron a continuación con anticuerpo específico anti-Fab de IgG humana de cabra conjugado con HRP y se representaron gráficamente las lecturas de OD<450>.

La Fig. 7 muestra ejemplos de la actividad de unión directa al ligando de candidatos de anticuerpos anti-proteínas de puntos de control inmunitario y anti-OX40 frente a OX40 purificados. Los pocilios recubiertos previamente con ligando se incubaron primero con diversas concentraciones de candidatos de anticuerpos como se indica. Las proteínas unidas se detectaron a continuación con anticuerpo específico anti-Fab de IgG humana de cabra conjugado con HRP y se representaron gráficamente las lecturas de OD<450>(anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones).

La Fig. 8 muestra el análisis de flujo utilizando células 293 de expresión de PD-L1. Las células HEK293 con expresión de PD-L1 se incubaron primero con candidatos de anticuerpos purificados y los anticuerpos unidos se detectaron con anti-IgG humana de cabra conjugado con Alexa-488 (H+L), seguido del análisis con un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS).

La Fig. 9 muestra el análisis de flujo utilizando células 293 de expresión de OX40. Las células HEK293 con expresión de OX40 se incubaron primero con candidatos de anticuerpos anti-OX40 purificados y los anticuerpos unidos se detectaron con anti-IgG humana de cabra conjugado con Alexa-488 (H+L), seguido de análisis FACS. NS: sin tinción.

La Fig. 10 muestra el bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 con anticuerpos anti-PD-L1 purificados. Los anticuerpos purificados como se indica se aplicaron con PD-1-Fc biotinilado y células PD-L1-293F para evaluar la actividad de inhibición de la interacción PD-1/PD-L1. La unión de PD-1-Fc recombinante en células PD-L1-293F se detectó mediante estreptavidina-Alexa-488 y análisis mediante FACS.

Las Figs. 11A y 11B muestran que los candidatos de anticuerpos anti-PD-LI con 1 o 10 pg/ml estimulan la proliferación de linfocitos T e inducen la producción de IL-2 y/o IFN-<y>en un ensayo de reacción mixta de linfocitos (MLR) después de 3 días (Fig. 11A) o 5 días (Fig. 11B) de tratamiento con anticuerpos.

La Fig. 12A muestra la capacidad de candidatos de anticuerpos anti-OX40 para mejorar la activación de los linfocitos T CD3+ con respuesta a la dosis, así como con el anticuerpo de referencia. La Fig. 12B muestra la concentración de IL-2 e IFN-<y>humanos presentes en medios de cultivo celular después de 3 días de estimulación de linfocitos T humanos con anti-CD3 unido a la placa y varias concentraciones de candidatos de anticuerpos anti-OX40 (anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones).

Las Figs. 13A y 13B muestran la concentración de IL-2 humana (Fig. 13A) e IFN-<y>(Fig. 13B) presentes en medios de cultivo celular después de 3 días de estimulación de linfocitos T humanos con anti-CD3 unido a la placa y varias concentraciones de candidatos de anticuerpos específicos de OX40.

La Fig. 14 muestra la estructura de un Fc de cadena pesada de anticuerpo fusionado con un dominio scFv específico de OX40.

La Fig. 15 muestra ejemplos de análisis en gel PAGE de proteínas de fusión anticuerpos anti-punto de control inmunitario-OX40 humano. Se demostró que las proteínas de fusión purificadas, las proteínas de fusión anti-PD-L1-scFV de OX40 tienen un peso molecular de aproximadamente 220 kDa (no reductor), y la fusión de cadena pesada tiene aproximadamente 85 kDa y la cadena ligera es de aproximadamente 25 kDa (reductor) en ambas fusiones de anticuerpos (anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones).

Las Figs. 16A y 16B muestran que el anticuerpo biespecífico estimula sinérgicamente la activación de linfocitos T para la producción de IL-2 e IFN-y en un ensayo de reacción mixta de linfocitos (MLR) después de 3 días (Fig. 16A) o 5 días (Fig. 16B) con un tratamiento con mono-anticuerpo, anticuerpo combinado o anticuerpo biespecífico anti-PD-L1-scFV de OX40.

Las Figs. 17A a 17E respectivamente muestran la agregación y determinación de la pureza de anticuerpos biespecíficos, Ab anti-PD-L1-OX40 y Ab-V1 a V4 anti-PD-L1-OX40, con 5 enlazadores diferentes en scFv de o X40 (anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones).

La Fig. 18 muestra variantes de secuencia entre scFv del clon B17 de OX40 de Ab-V4 a V12 anti-PD-L1-OX40 (SEQ ID NO: 30-38) (anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones).

La Fig. 19 muestra ejemplos de análisis en gel PAGE de proteínas de fusión anticuerpos anti-punto de control inmunitario-OX40 humano. Se demostró que las proteínas de fusión purificadas, las proteínas de fusión Ab-V5 anti-PD-L1-OX40 tienen un peso molecular de aproximadamente 220 kDa (no reductor), y la fusión de la cadena pesada tiene aproximadamente 80 kDa y la cadena ligera es de aproximadamente 30 kDa (reductor) en ambas fusiones de anticuerpos (anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones).

La Fig. 20 muestra un diagrama de flujo que ilustra el método de ELISA para la evaluación de la actividad de unión de variantes de anticuerpos biespecíficos.

La Fig. 21 muestra la actividad de unión a PD-L1 humano de las variantes de anticuerpos biespecíficos y su EC50.

La Fig. 22 muestra la actividad de unión a OX40 humano de las variantes de anticuerpos biespecíficos y su EC50 (anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones).

La Fig. 23 muestra la estabilidad en suero exvivode la variante de anticuerpo biespecífico, Ab-V5 anti-PD-L1-OX40 (anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones).

Las Figs. 24A y 24B muestran la producción de IL-2 durante 3 días (Fig. 24A) y la producción de IFN-y durante 5 días (Fig. 24B) después de modular linfocitos T con un tratamiento con mono-anticuerpo, anticuerpo combinado o anticuerpo biespecífico Ab-V5 anti-PD-L1-OX40 (anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones). La Fig. 25 es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo biespecífico Ab-V5 anti-PD-L1-OX40 y el tratamiento con anticuerpo monoclonal sobre el crecimiento del tumor PC-3 en ratones Fox Chase SCID®Beige (anticuerpo no abarcado por la materia de las reivindicaciones).

Descripción detallada

La presente invención proporciona anticuerpos anti-PD-LI y fragmentos de unión al antígeno de los mismos; conjugados anticuerpo-fármaco de los mismos y determinados anticuerpos biespecíficos que los incorporan, como se define en las reivindicaciones. La divulgación técnica expuesta a continuación puede en algunos aspectos ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la divulgación que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo.

Generación de anticuerpos a partir de la biblioteca OmniMab

Para la generación de anticuerpos terapéuticos contra PD-L1 u OX40, se llevaron a cabo selecciones con la biblioteca de fagémidos OmniMab. La biblioteca de fagémidos ha sido generada por AP Biosciences Inc. (APBio Inc.) a partir de una colección de más de cien linfocitos B de donantes sanos. Hyperphage (M13K07ApNI, Progen, Heidelberg, Alemania) preparó los fagos para la primera ronda de análisis. Se aplicaron análisis en fase sólida y análisis de células contra PD-L1 u OX40 para la selección y el aislamiento de los ligantes específicos de PD-L1 u OX40 de la biblioteca OmniMab. La selección en fase sólida se realizó utilizando PD-L1-Fc u OX40-Fc humano recombinante (APBio Inc.) en la primera ronda de selección y luego se usaron PD-L1 u OX40 expresados por células HEK293 para un enriquecimiento de dos y tres rondas. Después de tres rondas de selección, los ligantes específicos de PD-L1 u OX40 se seleccionaron y aislaron mediante ELISA directo o ELISA basado en células con la proteína recombinante correspondiente (Figs. 2A, 2B, 3A y 3B). Se transfirieron proteínas recombinantes PD-L1-Fc previamente recubiertas o células 293 con expresión de OX40 con sobrenadante que contenía fagos rescatados durante 1 hora y se lavaron con PBS que contenía Tween-20 al 0,1 % tres veces. Los fagos unidos se detectaron mediante anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Roche) y se usó sustrato TMB para el desarrollo de la señal. Se registraron las lecturas de OD450. Los ligantes positivos se aislaron y se enviaron para secuenciación para confirmar la secuencia y diversidad de la cadena pesada y la cadena ligera. La región variable de cadena pesada y cadena ligera específica de PD-L1 u OX40 se describió a partir de la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 8: la SEQ ID NO: 1 es la cadena ligera del clon 6 de PD-L1, la SEQ ID NO: 2 es la región variable de la cadena pesada del clon 6 de PD-L1, la SEQ ID NO: 3 es la cadena ligera del clon 32 de PD-L1, la SEQ ID NO: 4 es la región variable de la cadena pesada del clon 32 de PD-L1, la SEQ ID NO: 5 es la cadena ligera del clon B17 de OX40, la SEQ ID NO: 6 es la región variable de la cadena pesada del clon B17 de OX40, la SEQ ID NO: 7 es la cadena ligera del clon B19 de OX40, la SEQ ID NO: 8 es la región variable de la cadena pesada del clon B19 de OX40. Como se muestra en las Figs. 2A, 2B, 3A y 3B, se aislaron varios clones que se sabe que son reconocidos específicamente por el antígeno correspondiente en comparación con el control negativo.

Subclonación y expresión/purificación de los ligantes específicos de PD-L1 u OX40 seleccionados como formato de IgG

Para facilitar la detección rápida de los ligantes específicos con funcionalidad en la activación de linfocitos T, las cadenas pesadas y ligeras de los ligantes positivos para una unión a PD-L1 u OX40 mediante ELISA se amplificaron, digirieron y subclonaron en un vector de expresión de IgG especializado APBio que porta la región constante de IgG4 (SEQ ID NO: 9). Después de la validación de la secuencia, los plásmidos se prepararon y transfectaron en células HEK293 para la expresión de anticuerpos con reactivo de transfección fectina para 293 (Invitrogen). Después de 4 días de cultivo, el anticuerpo secretado en un medio libre de suero se purifica por afinidad a partir del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de proteína G. Luego se concentra el anticuerpo purificado, seguido de diálisis en tampón de PBS. La concentración final de proteína dializada se determina mediante un espectrofotómetro NanoDrop2000 y la pureza e integridad se determinan mediante SDS-PAGE con o sin reactivo reductor como se muestra en las Figs. 4 y 5. La integridad de varios candidatos de anticuerpos purificados, ya sean específicos de PD-L1 o específicos de OX40, es normal en las células HEK293, así como en el anticuerpo de referencia, MPDL3280A para PD-L1 o GSK3174998 para OX40.

Determinación de la actividad de unión de candidatos de IgG específicos de PD-L1 y OX40 mediante ELISA directo A continuación, se aplicaron candidatos de anticuerpos purificados contra PD-L1 u OX40 (candidatos de anticuerpos anti-PD-LI o candidatos de anticuerpos anti-OX40) para la caracterización de la unión mediante ELISA en PD-L1-Fc o OX40-Fc humano en una configuración recubierta directamente. Las Figuras 6 y 7 mostraron el resultado de unión de ELISA para anticuerpos anti-PD-L1 y anti-OX40, respectivamente. Para los anticuerpos específicos de PD-L1, la mayoría de los candidatos mostraron una actividad de unión similar o mejor con el anticuerpo de referencia (Ab de Ref, MPDL3280A, Roche).

Se dializó la quimera de Fc de IgG 1 de PD-L1 u OX40 humana purificada (PD-L1-Fc u OX40-Fc, APBio) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se ajustó a 1 mg/ml y después se diluyó con PBS hasta una concentración final de 1 |jg/ml. Se recubrieron placas de 96 pocillos Nunc-Immuno Maxisorp con 0,1 ml por pocillo de quimera recombinante PD-L1-Fc u OX40-Fc, dejando pocillos vacíos para controles de unión no específica y se incubaron a 4 °C durante la noche. Se eliminó la solución de quimera de PD-L1-Fc u OX40-Fc y las placas se lavaron tres veces con 0,4 ml de tampón de lavado (Tween-20 al 0,1 % en PBS). Se agregaron 0,4 ml de tampón de bloqueo (leche en polvo baja en grasa al 5 % en PBS) a todos los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con mezcla. Se eliminó el tampón de bloqueo y las placas se lavaron tres veces con 0,4 ml de tampón de lavado. Se prepararon diluciones en serie de los anticuerpos de prueba anti-PD-L1 o anti-OX40 en PBS y se agregaron 0,1 ml de Ab diluido por pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se eliminó la solución de anticuerpos y las placas se lavaron tres veces con 0,4 ml de tampón de lavado por pocillo. Se diluyó anticuerpo anti-F(ab')<2>de IgG humana, específico de F(ab')<2>, de cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immunoresearch n.° 109-036-097) 1:2000 con PBS y se añadió 0,1 ml por pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron con 0,4 ml de tampón de lavado por pocillo. Se agregó 0,1 ml de reactivo TMB (Invitrogen) y se incubó durante 1 a 5 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo 0,05 ml de HCl 1 N y se leyó la absorbancia a 450 nm en un Bio-Tek Spectra. La EC50 calculada para los candidatos de anticuerpos anti-PD-L1 para PD-L1 mostró que la mayoría de los candidatos poseen una buena actividad de unión, así como MPDL3280A (Ab de Ref) mediante ELISA directo (Fig. 6). Por el contrario, la mayoría de los candidatos de anticuerpos anti-OX40 mostraron una actividad de unión mucho menor en comparación con el anticuerpo de referencia (Ab de Ref, GSK3174998) (Fig. 7). Las proteínas de fusión de Fc usadas en el presente documento son de origen humano y, por lo tanto, se espera que no sean inmunogénicas y se puedan usar como agentes terapéuticos en humanos.

Determinación de la actividad de unión para candidatos de IgG específicos de PD-L1 y OX40 mediante FACS

También se aplicaron candidatos de anticuerpos purificados (candidatos de anticuerpos anti-PD-L1 o candidatos de anticuerpos anti-OX40) para citometría de flujo para determinar y comparar la actividad de unión con células HEK293 con expresión de PD-L1 u OX40. Las Figuras 8 y 9 muestran la actividad de unión de los candidatos de anticuerpos correspondientes indicados por FACS con células HEK293 con PD-L1 u OX40 expresadas de forma estable.

En el análisis FACS de células 293 con expresión estable de PD-L1 teñidas con candidatos de anticuerpos anti-PD-L1 para examinar la actividad de unión de PD-L1, las células de expresión estable se incubaron con 1 jg/m l de candidatos de anticuerpos anti-PD-L1 purificados, anticuerpo de referencia (Ab de Ref, MPDL3280A) o con anticuerpo isotipo como control negativo en hielo durante 1 hora. Las células se lavaron tres veces con 1x PBS y luego se incubaron con anti-IgG humana de cabra (H+L) conjugado con Alexa-488 (Invitrogen Inc.) en hielo durante 1 hora adicional. Después de la tinción, las células se lavaron tres veces con 1x PBS, se resuspendieron en 1x PBS/FBS al 2 % antes de analizarlas mediante FACS Calibur (BD Biosciences, Inc.) y FlowJo (TreeStar, LLC). En el mismo escenario, la actividad de unión de candidatos de anticuerpos anti-OX40 para células HEK293 con OX40 expresado en forma estable en la Fig. 9 también se ejecutó con una estrategia similar y se analizó como se describió anteriormente. Como se muestra en la Fig. 8, la mayoría de los candidatos de anticuerpos anti-PD-L1 poseen una buena actividad de unión, así como el anticuerpo de referencia. Esto indicó que los clones de fagos seleccionados de la biblioteca OmniMab efectivamente reconocen el PD-L1 nativo en las células.

Este fenómeno también se observa para candidatos de anticuerpos anti-OX40 como se muestra en la Fig. 9. En el análisis FACS del clon 2D5 de células 293 con expresión estable de OX40 teñidas con candidatos de anticuerpos anti-OX40 purificados para examinar la actividad de unión de OX40, se incubaron células con expresión estable con 2 jg/m l de Ab de referencia anti-OX40 (ref. de OX40) o Ab de referencia anti-CD137 (ref. de CD137) como anticuerpo de control en hielo durante 1 hora. Las células se lavaron tres veces con 1x PBS y a continuación se incubaron con anti-IgG humana de cabra (H+L) conjugado con Alexa-488 (Invitrogen Inc.) en hielo durante 1 hora adicional. Después de la tinción, las células se lavaron tres veces con 1x PBS, se resuspendieron en 1x PBS/FBS al 2 % antes de analizarlas mediante FACS Calibur (BD Biosciences, Inc.) y FlowJo (TreeStar, LLC).

Unión de competición de ligandos (ensayo ELISA)

Los candidatos de anticuerpos se sometieron al ensayo de selectividad y afinidad de unión usado para evaluar los candidatos de anticuerpos anti-PD-L1 de la presente invención en cuanto a su capacidad para bloquear la unión de PD-L1 a PD-1.

Se ensayó la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de la quimera PD-L1-Fc humana (PD-L1-Fc) a PD1/His humana recombinante (hPD-1/His) mediante ELISA. Se dializó hPD-1/His (APBio) recombinante purificada a 1 mg/ml en PBS y luego se diluyó a 5 pg/ml en PBS. Se recubrió una placa de 96 pocilios Nunc Maxisorp con 250 ng de hPD-1/His por pocillo en PBS durante la noche. Se eliminó la solución de hPD-1/His y las placas se lavaron tres veces con 0,4 ml de tampón de lavado (Tween-20 al 0,1 % en PBS). Se agregaron 0,4 ml de tampón de bloqueo (leche en polvo baja en grasa al 5 % en PBS) a todos los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con mezcla. Durante la etapa de bloqueo, las reservas de anticuerpos se diluyeron en un intervalo de 200 nM a 0 nM en PBS con una dilución en serie de 2 veces. La quimera PD-L1-Fc recombinante purificada se diluyó a 4 pg/ml en PBS. Las placas recubiertas con PD-1/His se lavaron tres veces con 0,2 ml de tampón de lavado (Tween 20 al 0,1 % en PBS). Se añadieron diluciones de anticuerpos de 60 pl (candidatos de anticuerpos anti-PD-L1 o Ab de Ref MPDL3280A) solas con 60 pl de quimera PD-L1-Fc y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron como se describió anteriormente. Se diluyó anticuerpo específico de Fc de IgG humana con peroxidasa de rábano picante, 1:2000 en PBS, se añadieron 100 pl de la solución resultante a los pocillos de la placa lavada y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron como se describió anteriormente, se agregaron 100 pl de solución de sustrato TMB a cada pocillo y se incubaron durante 10 minutos. La reacción se detuvo con 50 pl de HCl 1 N y se leyó la absorbancia a 450 nm usando un lector Bio-Tek y se muestra en la Fig. 10. Se ha demostrado que los candidatos de anticuerpos parciales inhiben la interacción entre PD-PD-L1 mediante ELISA de competición. La mayoría de los candidatos de anticuerpos revelaron una actividad de bloqueo similar en comparación con el anticuerpo de referencia (Ab de Ref, MPDL3280A).

Estimulación mejorada de la activación de los linfocitos T mediante la inhibición de la interacción PD-1:ligando PD-L1 para el anticuerpo anti-PD-L1

La vía de señalización de PD-1 inhibe las señales coestimuladoras moderadas de TCR/CD28, reduciéndose primero la producción de citocinas sin una disminución en la proliferación de linfocitos T. A medida que las señales coestimuladoras de TCR/CD28 se debilitan, domina la vía PD-1, con una gran reducción en la producción de citocinas acompañada de una reducción en la proliferación. Por consiguiente, para confirmar que tras la inhibición de PD-1 mediante la inhibición de la interacción con PD-L1, los anticuerpos humanos de la invención mejoran la activación de los linfocitos T, se realizan reacciones mixtas de linfocitos (MLR).

Se enriquecieron monocitos de sangre completa humana con el cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos RosetteSep™ (N.° Cat. 15068) y se cultivaron en medio de diferenciación, RPMI 1640 con FBS al 10 %, 100 ng/ml (1000 U/ml) de GM-CSF, 100 ng/ml (500 U/ml) durante 6 días. La diferenciación de células dendríticas (DC) de monocitos se verificó mediante DC-SIGN-PE, anti-CD14 conjugado con Ab FITC, anti-CD83 conjugado con Ab PE o anti-CD80 conjugado con Ab FITC para validar la diferenciación y se usó como APC en MLR.

Se aislaron linfocitos T CD4+ alogénicos de sangre completa humana mediante el cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ humanos RosetteSep™ (N.° Cat. 15062). La pureza de los linfocitos T CD4+ se comprobó con Ab APC conjugado con anti-CD4 para garantizar que la pureza sea superior al 95 % y luego se marcaron con CFSE 1 pM (kit de proliferación celular de CFSE CellT race™, Life T echnologies, N.° Cat. C34554) para ensayo de proliferación de linfocitos T. Se usaron linfocitos T CD4+ marcados para cultivar conjuntamente con DC inmaduras con diferentes candidatos de anticuerpos como se indica durante 3 y 5 días para ver si los candidatos de anticuerpos podían restaurar la activación de los linfocitos T mediante el bloqueo de la interacción entre PD-1 y PD-L1. Después de 3 y 5 días de incubación, el sobrenadante se recogió para cuantificar citocinas, tal como IL-2 e IFN-<y>, mediante ELISA. Se predice que la adición de candidatos de anticuerpos anti-PD-L1 (clones 6, 32, 28, 51, 64, 27 y 37) a cultivos de células dendríticas inmaduras más linfocitos T alogénicos dará como resultado un aumento en la proliferación de linfocitos T y citocinas, en comparación con los cultivos tratados con IgG isotipo (iso n.°1, n.°2) y se muestra en las Figs. 11A y 11B. La producción de IL-2 e IFN-<y>aumenta significativamente en las MLR en comparación con el tratamiento con anticuerpos isotipo después de 3 días (Fig. 11A) o 5 días (Fig. 11B) de tratamiento con anticuerpos, especialmente para el clon 6 del anticuerpo anti-PD-L1. El incremento de citocinas sigue siendo evidente después de 5 días de tratamiento con anticuerpos y es similar al anticuerpo de referencia (ref), MPDL3280A. Esto indicó que el clon 6 del anticuerpo anti-PD-L1 debería ser uno de los posibles candidatos para el compuesto de anticuerpo biespecífico.

Ensayo de actividad agonista del anticuerpo anti-OX40

El anticuerpo anti-OX40 no está abarcado por la materia de las reivindicaciones. Para activar la coestimulación de OX40 de la proliferación de linfocitos T y la producción de citocinas, los candidatos de anticuerpos purificados se examinaron funcionalmente para determinar su capacidad para mejorar la producción de citocinas, la proliferación y para inducir la proliferación en linfocitos T CD3+ humanos. El anticuerpo anti-CD3 (OKT3, BioLegend N.° Cat. 317304) y los candidatos de anticuerpos anti-OX40 (clones B6, B70, B120, A4, B17, B19 y B30), el anticuerpo de referencia (GSK3174998) o los anticuerpos de isotipo (iso n.° 1, n.° 2) se recubrieron en la placa de 96 pocillos Maxisorp. Mientras tanto, se aislaron linfocitos T CD3+ humanos no diferenciados de sangre humana de voluntarios adultos sanos utilizando un cóctel de enriquecimiento de linfocitos T humanos RosetteSep™ comercializado (STEMCELL N.° Cat.

15061) como lo describe el fabricante. Los linfocitos T CD3+ aislados se marcaron luego mediante CFSE (kit de proliferación celular de CFSE CellTrace™, Life Technologies, N.° Cat. C34554) y se sembraron a razón de 1 x 106 células/ml en el pocillo recubierto previamente con anticuerpo que contenía medio RPMI 1640, suero bovino fetal al 10 % y L-glutamina 2,5 mM para determinar la proliferación celular y la producción de citocinas. Después de 3 días de cultivo, las células se recogieron para un ensayo de proliferación mediante citometría de flujo y luego se analizó el medio para determinar la producción de IL-2 e IFN-<y>mediante ELISA de cuantificación.

En la Fig. 12A se muestra la detección de candidatos de anticuerpos anti-OX40 con actividad agonista en la activación de linfocitos T. Todos los candidatos de anticuerpos anti-OX40 mostraron la capacidad de mejorar la activación de los linfocitos T CD3+ con respuesta a la dosis, así como el anticuerpo de referencia. El tratamiento con dosis más altas de anticuerpos mostró obviamente una mayor actividad de activación de linfocitos T. Mientras tanto, la producción de citocinas (Fig. 12B), tales como IL-2 e IFN-<y>, también reveló una respuesta de activación de linfocitos T similar, especialmente para el clon principal B17 del candidato de anticuerpo anti-OX40. La citocina es altamente inductora después del tratamiento de 3 días con el clon B17 candidato del anticuerpo anti-OX40. La mejora es mucho mayor que la del tratamiento con anticuerpos de referencia; este clon B17 implicado debería ser uno de los candidatos para la construcción de anticuerpos biespecíficos.

Como los datos muestran en las Figs. 13A y 13B, ambos candidatos de anticuerpos anti-OX40, clones B17 y B19, mostraron una mejor actividad agonista en el ensayo después de 3 días de tratamiento con candidatos de anticuerpos anti-OX40 (B17 o B19). Tanto la producción de IL-2 como la producción de IFN-<y>muestran una mejora obvia tras el tratamiento con anticuerpos y revelaron una correlación dependiente de la función. Se registraron producciones más altas de citocinas en el tratamiento con dosis más altas de anticuerpos.

Para evaluar la actividad agonista de los candidatos de anticuerpos OX40, B17 y B19, también se determinó la EC50, además de realizar un ensayo de actividad agonista y se registró la producción de citocinas para comparación.

Construcción, expresión y purificación del anticuerpo anti-PD-L1-scFv de OX40

El anticuerpo anti-OX40 no está abarcado por la materia de las reivindicaciones. Dado que el biespecífico está diseñado como un formato basado en IgG fusionada con scFv, la estructura del anticuerpo anti-punto de control inmunitario con Fc fusionado terminalmente con scFv de OX40. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos anti-punto de control inmunitario inhibidores, tales como anti-PD-LI, anti-PD-1, anti-CTLA4, anti-LAG3, etc., o anticuerpos estimuladores, tales como anti-CD28, anti-CD137, anti-CD27, anti-ICOS, etc. Se coloca un enlazador entre el Fc del anticuerpo y el scFv de OX40 para generar el anticuerpo biespecífico como se representa en la Fig. 14.

En alguna realización, el clon 6 candidato de anticuerpo anti-PD-LI se asigna a la forma IgG, por otro lado, el candidato de anticuerpo anti-OX40 se transformaría como formato de scFv para fusionarse en el extremo C terminal de la región Fc en el clon 6 del candidato de anticuerpo anti-PD-LI. La transformación del anticuerpo al formato de scFv podría dar como resultado la reducción de la actividad o especificidad de unión; por lo tanto, se usaron varios candidatos de anticuerpos anti-OX40 para la transformación de scFv. Construcción de anticuerpo anti-PD-LI bifuncional fusionado en Fc con scFv de OX40 de longitud completa (SEQ ID NO: 10 como clon A4, SEQ ID NO: 11 como clon B17, SEQ ID NO: 12 como clon B19 o SEQ ID n O: 13 como clon B120). Se colocó un enlazador peptídico flexible corto, (GGGGS)<2>(SEQ ID NO: 14), por ejemplo, entre el extremo C terminal de la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-L1 de la región Fc y el módulo del extremo N terminal de scFv de OX40 para asegurar el plegamiento correcto y minimizar el impedimento estérico. Las secuencias codificantes de los anticuerpos anti-PD-L1-scFv de OX40 se muestran en la SEQ ID NO: 16 (scFv del clon B17 de OX40 de cadena pesada del clon 6 anti-PD-L1) y NO. 17 (scFv del clon B19 de OX40 de cadena pesada del clon 6 anti-PD-L1). Las proteínas de fusión de Fc del anticuerpo construido fueron lideradas por un péptido señal (SEQ ID NO: 15) y expresadas por células de mamífero, y purificadas a partir del sobrenadante del cultivo celular transfectado mediante cromatografía de proteína G de 1 etapa. Como se muestra en la Fig. 15, se puede obtener una pureza superior al 90 % en un proceso de purificación de una sola etapa y muestra que las proteínas de fusión purificadas tienen el peso molecular correcto (Mw = 220 kD).

Estimulación mejorada de la activación de linfocitos T para candidatos de anticuerpos biespecíficos anti-PD-L1-scFv de OX40 en MLR

El anticuerpo anti-OX40 no está abarcado por la materia de las reivindicaciones. Para determinar la cooperación sinérgica del anticuerpo biespecífico para mejorar la activación de los linfocitos T mediante la inhibición de la interacción entre PD-1 y PD-L1 y la activación agonista de la señalización de OX40, se aplicaron los candidatos de anticuerpos biespecíficos, anti-PD-L1-scFv de OX40, en MLR como se describió anteriormente. Luego se registró la producción de<i>L-2 e IFN-<y>después de 3 o 5 días de tratamiento con anticuerpos. Se aplicó mono-anticuerpo, anticuerpo combinado o anticuerpo biespecífico en cantidades iguales o moles iguales para comparar el efecto sinérgico en la mejora de la activación de los linfocitos T y se usó el isotipo de IgG como control negativo. Como muestran los datos en las Figs. 16A y 16B, los candidatos de anticuerpos anti-PD-L1 solos mostraron una inducción significativa de IL-2 después de 3 días de tratamiento, así como el anticuerpo de referencia, MPDL3280A; por el contrario, los candidatos de anticuerpos anti-OX40 no pueden aumentar obviamente la regulación positiva de la producción de citocinas, ya sea después de 3 días o 5 días de tratamiento con anticuerpos. Esto concuerda con el anticuerpo de referencia, GSK3174998. Sin embargo, la combinación de anticuerpos anti-OX40 y anticuerpos anti-PD-L1 mostró una regulación positiva significativa de la producción de citocinas después de 3 y 5 días de tratamiento con anticuerpos. El efecto sinérgico también se observa en el tratamiento de candidatos de anticuerpos biespecíficos y el incremento de la producción de citocinas es similar al tratamiento combinado. Esto indicó que los candidatos de anticuerpos biespecíficos anti-PD-LI-scFv de OX40 también funcionan como tratamiento de combinación de anticuerpos sin pérdida de ninguna actividad de unión en la transformación de scFv.

Determinación de la agregación y la pureza de anticuerpos biespecíficos.

El anticuerpo biespecífico no está abarcado por la materia de las reivindicaciones. Dado que el Ab anti-PD-L1-scFv de B17 clon 6 de OX40 reveló una pureza inferior (74,07 %) mediante análisis de SEC-HPLC después de una purificación por cromatografía de proteína A en una sola columna, se generaron, por lo tanto, varias variantes de anticuerpos para mejorar la pureza y reducir la agregación del anticuerpo biespecífico en la presente invención. Los enlazadores descritos anteriormente se usaron para reemplazar el enlazador en scFv de B17 de OX40 en el anticuerpo biespecífico, Ab anti-PD-L1-OX40 (SEQ ID NO: 16), y se produjeron como Ab-V1 a V4 anti-PD-L1-OX40 (SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 21) en las células CHO. A continuación, esas variantes se purificaron y analizaron mediante una columna de SEC-HPLC XBridge Protein BEH (Waters, N.° Cat. 186007640). Los datos se resumieron como se muestra a continuación en la Tabla 1, una de las variantes de anticuerpo biespecífico, Ab-V4 anti-PD-L1-OX40, reveló una mejora significativa de la pureza del anticuerpo. La pureza aumenta del 74,07 al 92,27 %. Por lo tanto, se utilizó Ab-V4 anti-PD-L1-OX40 para modificar aún más para mejorar la pureza del anticuerpo.

Tabla 1. Diferentes enlazadores en scFv de B17 de OX40

Para caracterizar la distribución de tamaños de los anticuerpos biespecíficos, las muestras se cargaron en una columna de SEC-HPLC XBridge Protein BEH (Waters, de N.° Cat. 186007640) utilizando un módulo de separaciones Waters Alliance 2695. El pico de proteína se detectó a 280 nm utilizando un detector de PDA Water 2996. La fase móvil fue fosfato de sodio isocrático 25 mM (Sigma, N.° Cat. 04272 y N.° Cat. 04269) con NaCl 200 mM (AMRESCO, N.° Cat. 0241), pH 6,8, a un caudal de 0,4 ml/min. Los porcentajes de pico se determinaron por las porciones del área de pico como se muestra en las Figs. 17A a 17E.

El Ab-V4 anti-PD-L1-OX40 reveló una mejora significativa de la pureza (Fig. 17E). El anticuerpo biespecífico se modificó adicionalmente en el fragmento scFv de B17 de OX40 para mejorar nuevamente la pureza. Varios residuos en el scFv de B17 de OX40 mostrado en la Fig. 18 se sustituyeron con aminoácidos diferentes y las variantes de cadena pesada se emparejaron con la cadena ligera del clon 6 anti-PD-L1 para generar varias variantes de anticuerpos biespecíficos, a partir de Ab-V5 a V12 anti-PD-L1-OX40 (SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 29), y luego se expresaron y purificaron como se mencionó anteriormente. La pureza de las variantes de anticuerpos biespecíficos se resumió como se muestra a continuación en la Tabla 2; el anti-PD-L1-scFv de OX40 V5 reveló la mejor pureza en esas variantes de anticuerpos. La pureza se eleva hasta el 96,46 %. Esto mostró una pureza superior para el anticuerpo biespecífico modificado y también reveló una buena capacidad de desarrollo para este anticuerpo biespecífico en el futuro. Como se muestra en la Fig. 19, la integridad del Ab-V5 anti-PD-L1-OX40 también se analizó mediante SDS-PAGE y mostró una buena integridad en condiciones reductoras y no reductoras.

Tabla 2. Pureza del anticuer o

continuación

Mientras tanto, las variantes de anticuerpos biespecíficos modificadas también se aplicaron para la evaluación de la actividad de unión para PD-L1 y OX40 humanos mediante ELISA directo como se muestra en la Fig. 20. Todas las variantes de anticuerpos biespecíficos indicadas mostraron la misma actividad de unión a PD-L1 humano (Fig. 21), esta actividad de unión es similar con el anticuerpo anti-PD-L1 6. Este fenómeno también se observó en el ensayo de unión de OX40 humano (Fig. 22). Solo el Ab-V10 anti-PD-L1-OX40 mostró una actividad de unión más débil para el OX40 humano en comparación con otras variantes. Esto indicaba que la modificación de scFv de OX40 no afecta a la actividad de unión de OX40. La actividad de unión se conserva para PD-L1 u OX40. Dado que el Ab-V5 anti-PD-L1-OX40 reveló una pureza de anticuerpo superior y una actividad de unión para PD-L1 y OX40, se eligió el Ab-V5 anti-PD-L1-OX40 por su estabilidad en el suero.

Estabilidad en suero exvivo

La estabilidad se evaluó en suero humano (BioreclamationlVT, N.° Cat. HMSRM), así como en suero de especies preclínicas relevantes: mono rhesus (BioreclamationlVT, N.° Cat. RHSSRM), y ratón CD1 (BioreclamationlVT, N.° Cat. MSESRM). Las muestras se agregaron a suero de diferentes especies hasta una concentración final de 15 pg/ml y se incubaron en un baño de agua a 37 °C. Se recogieron muestras de suero después de tiempos de incubación de 0, 1, 2, 3, 7, 10 y 14 días y se almacenaron congeladas a -80 °C hasta su análisis.

Cuantificación de ELISA tipo sándwich

El anticuerpo anti-OX40 y los anticuerpos biespecíficos no están abarcados por la materia de las reivindicaciones. Se recubrió oX40-Fc en una placa de ELISA (N<u>N<c>, N.° Cat. 442404) con 100 pl a razón de 1 pg/ml en PBS y se incubó durante la noche a 4 °C. El tampón de lavado se preparó como PBS con Tween-20 al 0,1 % (Sigma, N.° Cat. P2287-500 ml) y el tampón de bloqueo se preparó como BSA al 1 % (UniRegión, N.° Cat. UR-BSA001-100G) en tampón de lavado. Las muestras de suero se prepararon con una dilución de 10 veces con una dilución en serie de 3x en tampón de bloqueo y los patrones se prepararon a 10 nM con una dilución en serie de 3x en tampón de bloqueo. El PD-L1-Fc biotinilado se marcó con el kit de conjugación Biotin Fast (Abcam, N.° Cat. ab201796) utilizando un protocolo estándar y se preparó a 30 nM en tampón de bloqueo. Se preparó estreptavidina-HRP (Abcam, N.° Cat. ab7403) a razón de 1 pg/ml en tampón de bloqueo. Todas las muestras se agregaron a cada pocillo para 100 pl después de que las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Desarrollo de TMB con 100 pl de solución de TMB (Invitrogen, N.° Cat. 00-2023) durante 2 minutos y se detuvo con 100 pl de solución de HCl 1 N (Merck, N.° Cat. 1.00317.1000). La absorción a una OD de 450 nm se leyó mediante un lector de ELISA (Biotek, Powerwave XS).

Se eligió el Ab-V5 anti-PD-L1-OX40 para la estabilidad en suero ex vivo debido a su pureza superior y actividad de unión a PD-L1 y OX40. Los anticuerpos biespecíficos purificados se mezclaron con suero de diferentes especies, tal como humano, ratón o mono. Después de varios días de cultivo, se recogieron muestras y analizaron mediante ELISA tipo sándwich para determinar la cantidad de anticuerpos. Como se muestra en la Fig. 23, el Ab-V5 anti-PD-L1-OX40 todavía mostraba una buena estabilidad en suero después de 14 días de cultivo a 37 °C. La concentración del anticuerpo sigue siendo superior al 70 %, ya sea en humanos, ratones o monos. Esto indicaba que el anticuerpo también tiene una buena estabilidad en suero.

Para medir la capacidad del Ab-V5 anti-PD-L1-OX40 para modular la capacidad de respuesta de los linfocitos T, los linfocitos T purificados se cultivarán con células dendríticas alogénicas, preparadas cultivando monocitos en GM-CSF e IL-4 durante unos días. Se configuraron placas paralelas para permitir la recogida de sobrenadantes el día 3 y el día 5 para medir IL-2 e IFN-<y>respectivamente usando un kit ELISA comercial. Como mostraron los datos en las Fig. 24A y 24B, la producción de IL-2 e IFN-y está altamente regulada positivamente en el tratamiento con anticuerpos biespecíficos (V5), así como en el tratamiento combinado después de 3 o 5 días de tratamiento con anticuerpos. Además, la mejora es obviamente superior al tratamiento con Ab anti-PD-L1 o Ab anti-OX40 solos. Esto implicaba que el anticuerpo biespecífico modificado, V5, todavía posee la actividad agonista, así como el tratamiento combinado sin pérdida de funcionalidad y podría desarrollarse como un anticuerpo terapéutico para diversos tumores sólidos o cánceres en el futuro.

Actividad antitumoral del anticuerpo biespecífico (modeloin vivo)

La falta de reactividad cruzada en roedores de PD-L1 y OX40 en anticuerpos biespecíficos impidió el uso de modelos tumorales de xenoinjerto humano o singénico murino estándar para la evaluación de la eficacia de los anticuerpos contra tumores humanos. En consecuencia, se generó un nuevo modelo de ratón con tumor xenogénico huPBL-SCID-Bg utilizando un ratón SCID-Bg (CB.17/Icr.Cg PkrdcscidLystbg/CrI), que alberga linfocitos T y B murinos que carecen de la mutación beige (Bg) y linfocitos NK funcionales. La eficacia en tumores humanos de los anticuerpos biespecíficos se evaluó utilizando este modelo como se describe a continuación.

Se obtuvo próstata humana PC-3 de la American Type Culture Collection y se cultivó en RPMI-1640 (Invitrogen) con L-glutamina, piruvato sódico, penicilina/estreptomicina y suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (FBS, Gibco N.° Cat. 10437). Las células se cultivaron hasta confluencia en matraces Falcon T-150. Posteriormente, las células se tripsinizaron (tripsina 0,25 % -EDTA; Invitrogen) y el crecimiento se amplió hasta un número de células suficiente para la inoculación. Se aislaron linfocitos de sangre periférica (PBMC) de sangre heparinizada usando Lymphoprep™ de acuerdo con el protocolo del fabricante (STEMCELL Technologies Inc.). Las suspensiones de células contadas se combinaron de manera que cada ratón recibió una inyección de 0,75 x 106 PBMC y 3 x 106 células tumorales en una única inyección en bolo de 0,1 ml en PBS. Para facilitar el crecimiento de las células tumorales en el ratón, se mezclaron otros 0,1 ml de matrigel con la suspensión celular combinada y luego se inyectó inmediatamente en los ratones preparados.

Para cada ratón, se inyectaron por vía subcutánea 0,2 ml de volumen de la suspensión celular combinada en el flanco derecho del animal. Después de 14 días de inoculación, se forma el tumor sólido y alcanza alrededor de 250 a 300 mm3 y el anticuerpo biespecífico (3 mg/kg de Ab-V5 anti-PD-L1-OX40), el anticuerpo de referencia anti-PD-L1 (Ab de Ref, MPDL3280A) o el anticuerpo de control (isotipo) se administra dos veces por semana durante tres semanas con inyección intraperitoneal (i.p.). La medición del tumor se realizó mediante un calibrador Pressier dos veces por semana, así como la administración de la muestra de prueba durante la duración de los experimentos y también se registraron los pesos corporales. El volumen del tumor se calculó usando el siguiente cálculo: largo X ancho2 X 0,44 = volumen (mm3) y se representó en la Fig. 25. Los ratones fueron retirados del estudio en el caso de que el volumen del tumor alcanzara 2000 mm3 o que el animal perdiera el 20 % de su peso corporal antes de terminar el experimento. Se observaron resultados similares cuando se midieron los tumores el día 7 después de la inoculación y los animales se dividieron aleatoriamente de acuerdo con el volumen del tumor. Para el estudio con animales, cada grupo estaba formado por 6 ratones. Como muestran los datos en la Fig. 25, el anticuerpo biespecífico mostró una eficacia antitumoral significativa en el modelo de ratón xenoinjertado con PC-3. El tamaño del tumor se reduce 18 días después de la inoculación del tumor, así como del anticuerpo de referencia anti-PD-L1, y continúa reduciéndose por debajo de 100 mm3. Se demostró preliminarmente que el modelo de ratón xenoinjertado con PC-3 es un anticuerpo biespecífico antitumoral y se reveló su potencial para ser un candidato a fármaco terapéutico en el futuro.

En conjunto, estos resultados indicaron que el anticuerpo biespecífico mantiene el bloqueo de su punto de control inmunitario en la señalización de PD-1/PD-L1 y su actividad agonista para la señalización de OX40. Se están llevando a cabo estudios para investigar más a fondo la actividad biológica de estas proteínas utilizando un modelo animal adecuado, tal como el tumor PC-3 en el modelo NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtmLwjl/SzJ (NSG) humanizado.

La región Fc en la presente invención podría ser de cualquier isotipo, subclase, alotipo o mutante modificado de inmunoglobulina, tal como fragmento(s) Fc de botón y ojal.

Ejemplos

Los anticuerpos anti-PD-L1 de la invención se pueden incorporar en anticuerpos biespecíficos. Los ejemplos siguientes pertenecen a construcciones biespecíficas que comprenden un resto de unión del anticuerpo anti-PD-L1 del clon 6 y un resto de unión del anticuerpo anti-OX40 del clon B17.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos IgG que se unen a PD-L1 y OX40

Ciertos anticuerpos proporcionados por la presente invención se generaron originalmente a partir de la unión de Fab a PD-L1 u OX40 humano. Los Fab se seleccionaron de una biblioteca de presentación en fagos, la biblioteca de fagémidos OmniMab tras una selección alterna de las proteínas de fusión Fc correspondientes (PD-L1-Fc u OX40-Fc) y células que expresan la proteína humana correspondiente (PD-L1 u OX40). Después de la detección por ELISA directo o ELISA basado en células, los clones positivos se secuenciaron para determinar la cadena pesada y la cadena ligera. Estos Fab incluían aquellos que están designados como "OM-PD-L1-6" y "OM-PDL1-32", etc. para PD-L1; "OM-OX40-A4", "OM-OX40-B17" y "OM-OX40-B19", etc. para OX40. Los anticuerpos anti-PD-L1 PD-L1-Clon 3, PD-L1-Clon 6 y PD-L1-Clon 32 divulgados en esta solicitud se generaron a partir de "OM-PD-L1-6" y "OM-PDL1-32". Mientras tanto, los candidatos de anticuerpos anti-OX40 OX40-A4, OX40-B17 y OX40-B19 divulgados en esta solicitud se generaron a partir de "OM-OX40-A4", "OM-OX40-B17" y "OM-OX40-B19" en células HEK293 o células CHO-S. Y el anticuerpo biespecífico dirigido a PD-L1 y OX40 simultáneamente se diseñó como anticuerpo anti-PD-L1 6-scFv B17 de OX40 y anticuerpo anti-PD-L1 6- scFv B19 de OX40. La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un Fab dado son idénticas a la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada, respectivamente.

Ejemplo 2. Uniónin vitrode anti-PD-LI-scFV de OX40 a su diana correspondiente

Se construyó el anticuerpo biespecífico anti-PD-L1-OX40 como se muestra en la Fig. 14 y se expresó en las células HEK293 o células CHO-S. El medio que contenía el anticuerpo biespecífico se purificó por afinidad a partir del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía con proteína G. A continuación se concentró el anticuerpo purificado, seguido de diálisis en tampón de PBS y se analizó mediante SDS-PAGE como se muestra en la Fig. 15. Para probar la unión directa de las proteínas de fusión purificadas a PD-L1 u OX40 en ELISA, se recubrieron 100 ng/pocillo con PD-L1 u OX40 recombinante en una placa ELISA de 96 pocillos. A continuación se agregaron a cada pocillo varias concentraciones de anti-PD-L1-scFV de OX40 purificado y se incubaron durante 1 hora. Después del lavado, se añadió a cada pocillo una dilución 1:5000 de conjugado anti-Fab con HRP (Jackson Immunochemicals) y se incubó durante otra hora. Después del lavado final, se añadió sustrato TMB (Invitrogen Inc.) y se midió la absorbancia de OD a 450 nm. Se calculan los datos analizados mediante ajuste de curva sigmoidea utilizando GraphPad Prism 5 y EC50.

Ejemplo 3. Especificidad de unión al antígeno de anti-PD-L1-scFV de OX40 mediante análisis FACS

Para probar la especificidad de unión del anticuerpo anti-PD-L1-scFV de OX40, se tiñeron células 293, de expresión estable de PD-L1, A549 o WiDr estimuladas con IFN-<y>con 1 pg/ml de anticuerpo anti-PD-L1-scFV de OX40 durante 1 hora en hielo antes de lavar tres veces con 1x PBS. Las proteínas de fusión de anticuerpos unidas se detectaron con anti-IgG humana de cabra (H+L) conjugado con Alexa-488 seguido de análisis FACS. Se utilizó anticuerpo isotipo como control negativo para la prueba. Los resultados mostraron que el anti-PD-L1-scFV de OX40 mantiene su especificidad de unión al antígeno en comparación con el anti-PD-L1 solo. La especificidad de unión del anticuerpo anti-PD-L1-scFV de OX40 también se probó utilizando células 293 de expresión estable de OX40.

Ejemplo 4. Efecto inmunomoduladorin vitrode proteínas bifuncionales

Para medir la capacidad de los anticuerpos anti-PD-L1-scFV de OX40 para modular la capacidad de respuesta de los linfocitos T, los linfocitos T purificados se cultivarán con células dendríticas alogénicas, preparadas cultivando monocitos en GM-CSF e IL-4 durante unos días. Se configuraron placas paralelas para permitir la recogida de sobrenadantes el día 3 y el día 5 para medir IL-2 e IFN-y respectivamente usando un kit ELISA comercial. El anti-PD-L1 humanizado de Genentech/Roche, MPDL3280A, se producirá internamente y se utilizará como control positivo. Como muestran los datos en las Figs. 16A y 16B, la producción de IL-2 e IFN-<y>está altamente regulada positivamente en el tratamiento con anticuerpos biespecíficos, así como en el tratamiento combinado después de 3 o 5 días de tratamiento con anticuerpos. Especialmente, el anticuerpo biespecífico compuesto por el clon 6 del anticuerpo anti-PD-L1 y el clon B17 del anticuerpo anti-OX40 (Ab anti-PD-L1-scFV B17 de OX40) o una combinación (Ab anti-PD-L1 clon 6 más Ab anti-OX40 clon B17) mostró que la potenciación de la activación de los linfocitos T es mayor que la combinación de anti-PD-L1 y anti-OX40 de referencia (Ab de Ref anti-PD-L1 más Ab de Ref anti-OX40). Esto indicaba que el anticuerpo B17 anti-OX40 puede poseer una unión de epítopo especial para dar como resultado una mejor actividad agonista en comparación con el anticuerpo anti-OX40 de referencia, GSK3174998.

Ejemplo 5. Expansión de leucocitos humanos inducida por anticuerpos biespecíficosin vivo

La falta de reactividad cruzada detectable de los anticuerpos anti-PD-L1 o anti-OX40 con anti-PD-L1 o anti-OX40 murinos y el requisito de la presencia de células inmunitarias humanas requirió el desarrollo de modelos para la evaluación funcional in vivo de los anticuerpos biespecíficos. Los ratones con la constitución genética NOD que portan la mutación de inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y la deficiencia en la cadena gamma común del receptor de IL-2 (comúnmente denominada NSG) son capaces de soportar el injerto de una gran cantidad de leucocitos de sangre periférica humana (huPBL) y mantener el injerto durante al menos 30 días (King et al., 2008). Este modelo de ratón, también conocido como modelo huPBL-NSG, se utilizó para evaluar el efecto funcional de la administración sistémica invivode los anticuerpos en las células inmunitarias humanas.

Específicamente, se transfirieron adoptivamente 6 millones de PBMC humanas recién aisladas mediante inyección intravenosa a ratones huPBL-NSG. Nueve días después de las inyecciones de PBMC, a los animales se les administró una dosis única de 1 mg/kg de mono-anticuerpo, anticuerpo biespecífico o anticuerpo de control de isotipo IgG4 mediante inyección intraperitoneal. En los días 24 a 28 después del injerto de PBMc , las PBMC se tiñeron con anticuerpos contra CD45 humano y murino evaluados mediante citometría de flujo. Se utilizaron perfiles de dispersión frontal y lateral para determinar el tipo de linfocitos. Los anticuerpos biespecíficos pudieron mejorar la expansión de los leucocitos humanos, como lo demuestra el aumento de la proporción de linfocitos CD45+ humanos en la sangre periférica de los ratones injertados. Para cada grupo, n ^ 6 ratones.

Ejemplo 6. Inhibición del crecimiento de células tumorales PC-3 o A498 en huPBL-NSG mediante el anticuerpo anti-PD-L1-scFV de OX40

Se puede utilizar la línea celular de cáncer de próstata humano positiva para PD-L1, PC-3 (ATCC n.° CRL-1435) o la línea celular de cáncer de riñón, A498 (ATCC® HTB-44™) para establecer modelos de xenoinjerto en ratones huPBLNSG. Para la formación de tumores, se inyectarán por vía subcutánea 3 x 106 células PC-3 (o células A498)/ratón en ratones huPBL-NSG como se describió anteriormente. Para evaluar los efectos inhibidores sobre el crecimiento del tumor, se administrarán por vía intravenosa diferentes concentraciones de anticuerpo anti-PD-L1-scFV de OX40, anticuerpo de referencia o anticuerpo isotipo de 0,1 a 3 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas en los ratones después de 14 días de la implantación de las células tumorales. El crecimiento del tumor se medirá dos veces por semana hasta 5 semanas como se describe en el modelo de ratones Fox Chase SCID®Beige.

Ejemplo 7. Evaluación farmacocinética de anti-PD-L1-scFV de OX40 en ratones y monos

Se administrarán 10-40 mg/kg de proteínas bifuncionales, anti-PD-L1-scFV de OX40 en ratones o monos mediante inyección subcutánea o inyección intravenosa. Se tomarán muestras de suero en diferentes momentos después de la inyección hasta 15 días. Las concentraciones de la proteína de fusión Fc en las muestras de suero se determinarán mediante un ensayo ELISA tipo sándwich.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une a PD-L1 que comprende:

un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera que comprende los aminoácidos 1-111 de la SEQ ID NO: 1.

2. Un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une a PD-L1 que comprende:

un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena ligera que comprende los aminoácidos 1-110 de la SEQ ID NO: 3.

3. Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende:

un agente terapéutico; y

un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se une a PD-L1 de la reivindicación 1 o 2, en donde el agente terapéutico está covalentemente conjugado con el anticuerpo o la porción de unión al antígeno del mismo mediante un enlazador.

4. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o la porción de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2.

5. Un anticuerpo biespecífico que comprende al menos una cadena polipeptídica, que comprende:

(a) un sitio de unión a PD-L1 que comprende un anticuerpo o una porción de unión al antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2; y

(b) un sitio de unión a OX40, que comprende

una región variable de cadena pesada con al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 1-108 de la SEQ ID NO: 5; o

una región variable de cadena pesada con al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 1-108 de la SEQ ID NO: 7; o

una región variable de cadena pesada con al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 128-246 de la SEQ ID NO: 10 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 1-112 de la SEQ ID NO: 10; o

una región variable de cadena pesada con al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 124-241 de la SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena ligera con al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 1-108 de la SEQ ID NO: 13.