ES3040063T3 - Combination of a protein kinase inhibitor and an additional chemotherapeutic agent - Google Patents

Abstract

Terapia combinada para el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Combinación de un inhibidor de proteína cinasa y un agente quimioterapéutico adicional

Antecedentes de la invención

La búsqueda de nuevos agentes terapéuticos se ha visto favorecida en gran medida en los últimos años por una mejor comprensión de la estructura de las enzimas y otras biomoléculas asociadas con las enfermedades. Una clase importante de enzimas que ha sido objeto de un extenso estudio son las proteínas cinasas.

Las proteínas cinasas constituyen una gran familia de enzimas estructuralmente relacionadas que son responsables del control de una variedad de procesos de transducción de señales dentro de la célula. Se cree que las proteínas cinasas han evolucionado a partir de un gen ancestral común debido a la conservación de su estructura y función catalítica. Casi todas las cinasas contienen un dominio catalítico de 250-300 aminoácidos similar. Las cinasas se pueden clasificar en familias por los sustratos que fosforilan (por ejemplo, proteína-tirosina, proteína-serina/treonina, lípidos, etc.).

La proteína cinasa dependiente de ADN (ADN-PK) es una serina/treonina proteína cinasa que se activa en conjunto con ADN. Los datos bioquímicos y genéticos muestran que DNA-PK consta de (a) una subunidad catalítica, que se llama ADN-PKcs, y (b) dos componentes reguladores (Ku70 y Ku80). En términos funcionales, ADN-PK es un constituyente crucial, por una parte, de la reparación de roturas de doble hebra de ADN (DSB) y, por otra parte, de la recombinación somática o V(D)J. Además, DNA-PK y sus componentes se conectan con una multiplicidad de procesos fisiológicos adicionales, incluyendo la modulación de la estructura de cromatina y el mantenimiento telomérico (Smith & Jackson (1999) Genes and Dev 13: 916; Goytisolo et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21: 3642; Williams et al. (2009) Cancer Res. 69: 2100).

El material genético humano en la forma de ADN se somete constantemente al ataque de especies reactivas de oxígeno (ROS), que se forman principalmente como subproductos del metabolismo oxidativo. Las ROS son capaces de provocar daños en el ADN en la forma de roturas de hebra individual. Las roturas de doble hebra pueden surgir si se presentan roturas previas de hebra individual en proximidad cercana. Además, se pueden provocar roturas de hebra individual y de doble hebra si la horquilla de replicación de ADN encuentra patrones de bases dañados. Además, las influencias exógenas, tal como la radiación ionizante (por ejemplo, radiación gamma o de partículas) y ciertos medicamentos anti-cáncer (por ejemplo, bleomicina) son capaces de provocar roturas de doble hebra de ADN. Las DSB se pueden presentar además como compuestos intermedios de la recombinación somática, un proceso que es importante para la formación de un sistema inmunitario funcional de todos los vertebrados. Si las roturas de doble hebra de ADN no se reparan o se reparan de manera incorrecta, se pueden presentar mutaciones y/o aberraciones cromosómicas, que en consecuencia pueden dar por resultado la muerte celular. A fin de contrarrestar los graves peligros resultantes de las roturas de doble hebra de ADN, las células eucariotas han desarrollado una cantidad de mecanismos para repararlas. Los eucariotas superiores usan predominantemente la llamada unión de extremos no homólogos, en la que la proteína cinasa dependiente de ADN adopta la función clave. Las investigaciones bioquímicas han mostrado que la ADN-PK se activa más efectivamente por la presentación de DSB de ADN. Las líneas celulares cuyos componentes de ADN-PK han mutado y no son funcionales demuestran ser sensibles a la radiación (Smith y Jackson, 1999).

Muchas enfermedades se asocian con respuestas celulares anormales, proliferación y evasión de muerte celular programada, activada por eventos mediados por proteína cinasa como se describe anteriormente y en la presente. En tanto que se ha realizado un progreso considerable en el desarrollo de inhibidores de proteína cinasa que son útiles como agentes terapéuticos hasta la fecha, sigue existiendo la necesidad de identificar qué tratamientos y condiciones particulares pueden permitir la expansión beneficiosa del potencial de los inhibidores de proteína cinasa.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona (S)-[2-cloro-4-fluoro-5-(7-morfolin-4-il-quinazolin-4-il)-fenil]-(6-metoxipiridazin-3-il)-metanol, que tiene la siguiente estructura y se designa Compuesto 1 de la siguiente manera:

0 una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento del cáncer de pulmón, en donde el tratamiento comprende administrar el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo con los agentes quimioterapéuticos etopósido y cisplatino.

El compuesto 1 se describe en detalle en la solicitud de patente publicada de Estados Unidos de América US 2016/0083401, publicada el 24 de marzo de 2016 (conocida en la presente como "la publicación '401. El compuesto 1 se designa como compuesto 136 en la tabla 4 de la publicación '401. El compuesto 1 es activo en una variedad de ensayos y modelos terapéuticos que demuestran la inhibición de ADN-PK (ver, por ejemplo, tabla 4 de la publicación '401). Por consiguiente, el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es útil para tratar uno o más trastornos asociados con la actividad de ADN-PK, como se describe en detalle en la presente, más adelante.

La presente invención, en particular, se refiere a los siguientes aspectos y realizaciones:

En primer lugar, se refiere al compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para usarse en el tratamiento del cáncer de pulmón en un paciente en necesidad de esto, que comprende administrar a este paciente el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en combinación con etopósido y cisplatino. En segundo lugar, se refiere a una combinación del compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y tanto etopósido como cisplatino para uso en el tratamiento del cáncer de pulmón.

En cualquier realización preferida, el compuesto 1 se puede administrar en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 800 mg, por ejemplo, en una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 800 mg.

El etopósido, por ejemplo, se puede administrar por vía intravenosa en una cantidad de aproximadamente 100 mg/m2.

Por ejemplo, el etopósido se puede administrar mediante infusión intravenosa durante aproximadamente 1 hora.

El cisplatino, por ejemplo, se puede administrar por vía intravenosa en una cantidad de aproximadamente a 75 mg/m2.

Por ejemplo, el cisplatino se puede administrar mediante infusión intravenosa durante aproximadamente 1 hora.

La siguiente información con respecto a una combinación del compuesto 1 y etopósido solo se proporciona como información de antecedentes.

Cuando se trata el cáncer en un paciente en necesidad de esto por la administración a dicho paciente del compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con etopósido solo, el efecto del compuesto 1 en combinación con etopósido es sinérgico, en donde las reducciones mieloides y linfoides inducidas por etopósido no se incrementan además por el compuesto 1.

Los cánceres para los cuales el tratamiento de combinación respectivamente de acuerdo con la presente invención es particularmente beneficioso se exponen en las realizaciones de ejemplo y los ejemplos comparativos, que también son pertinentes fuera y más allá de las condiciones experimentales particulares aplicadas. A mayor es la puntuación de sinergia, mayor es el efecto beneficioso. Por supuesto, puesto que el compuesto 1 es un inhibidor de ADN-PK, no se esperaría eficacia en células/tipos de cáncer con deficiencia de ADN-PK, como se confirmó por los datos experimentales que se muestran en la presente.

Las realizaciones adicionales que describen métodos para utilizar una combinación proporcionada se describen en detalle en la presente, más adelante.

Sin desear limitarse por la teoría, lo siguiente se puede derivar de los ejemplos presentados más adelante: Los datos experimentales mostrados en la presente demuestran la potenciación de etopósido por el compuesto 1 en un amplio intervalo de actividad. La ampliación del intervalo de actividad en comparación al agente individual sugiere que el compuesto 1 incrementa la especificidad de la acción de etopósido, ampliando de esta manera sus aplicaciones clínicas. Los resultados experimentales proporcionan además una fuerte evidencia de un mecanismo de letalidad sintética que surge de la combinación de etopósido con el compuesto 1.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la eficacia del compuesto 1 en combinación con radiación en seis modelos de xenoinjerto de ratón de cáncer humano (información de antecedentes).

La figura 2 muestra la eficacia del compuesto 1 en combinación con IR en un programa de tratamiento de 6 semanas en el modelo de xenoinjerto FaDu (información de antecedentes).

La figura 3 muestra la eficacia del compuesto 1 en combinación con IR en un programa de tratamiento de 6 semanas en el modelo de xenoinjerto NCI-H460 (información de antecedentes).

La figura 4A muestra la eficacia del compuesto 1 en combinación con etopósido/cisplatino en el modelo de xenoinjerto NCI-H526; la figura 4B muestra que administrar el compuesto 1 diariamente durante todo el estudio dio por resultado una mejor eficacia que separar el SoC y el tratamiento con el compuesto 1 por ya sea 7 h o días. La figura 5 muestra el cambio de peso corporal después del tratamiento con etopósido/ cisplatino y la combinación con el compuesto 1 en ratones.

La figura 6 muestra los conteos de reticulocitos y linfocitos bajo tratamiento con y recuperación de etopósido/cisplatino y la combinación con el compuesto 1.

La figura 7 muestra la eficacia de agente individual del compuesto 1 en el modelo de xenoinjerto LoVo deficiente en ruta de ATM (información de antecedentes).

La figura 8 muestra que el compuesto 1 inhibe la autofosforilación de ADN-PK (p-Ser2056) en tumor de xenoinjerto WM164 (información de antecedentes).

La figura 9 muestra los resultados de la combinación del compuesto 1 con etopósido en el ensayo de viabilidad de NCI-H460 (incubación de compuesto durante 72 h) (información de antecedentes).

La figura 10 muestra los resultados de la combinación del compuesto 1 con etopósido en el ensayo de viabilidad NCI-H460 (incubación de compuesto durante 168 h) (información de antecedentes).

La figura 11 muestra los resultados de la combinación del compuesto 1 con etopósido en el ensayo de viabilidad de MO59K (ADN-PK tipo silvestre) (incubación de compuesto durante 72 h) (información de antecedentes). La figura 12 muestra los resultados de la combinación del compuesto 1 con etopósido en el ensayo de viabilidad de MO59K (ADN-PK tipo silvestre) (incubación de compuesto durante 168 h) (información de antecedentes). La figura 13 muestra los resultados de la combinación del compuesto 1 con etopósido en el ensayo de viabilidad de MO59J (deficiente en ADN-PK) (incubación de compuesto durante 168 h) (información de antecedentes). La figura 14 muestra los resultados de la combinación del compuesto 1 con etopósido en los paneles de líneas de células de cáncerin vitro(información de antecedentes).

La figura 15 muestra los resultados de la combinación del compuesto 1 con etopósido en paneles de líneas celulares de cáncerin vitro(información de antecedentes).

La figura 16 muestra los resultados sinérgicos de la combinación del compuesto 1 con etopósido.

La figura 17 muestra los resultados de la combinación del compuesto 1 en comparación a VX-984 con etopósido en el ensayo de viabilidad de MO59K (ADN-PK tipo silvestre) (incubación de compuesto durante 72 h) (información de antecedentes).

Descripción detallada de ciertas realizaciones de la invención

Como se describe en la presente, la presente invención proporciona el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con los agentes quimioterapéuticos etopósido y cisplatino para usarse de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2. Como también se describe en la presente, tratar el cáncer de pulmón comprende administrar a un paciente en necesidad de esto el inhibidor de ADN-PK, compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con etopósido y cisplatino.

Los términos "que comprende" e "que incluye" se utilizan en la presente en su sentido abierto y no taxativo a menos que se indique lo contrario.

Los términos “uno” y “una” y "el" y “la” y referencias similares en el contexto de la descripción de la invención (en especial en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se van a interpretar para cubrir tanto el singular como el plural, salvo que se indique lo contrario en la presente o se contradiga claramente por el contexto. Cuando se usa la forma plural para compuestos, sales, y similares, esto se entiende también como un compuesto individual, sal, o similar.

Como se usa en la presente, el término "en combinación" con respecto a la administración del compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el agente quimioterapéutico adicional significa que cada uno del compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el agente quimioterapéutico adicional se administran al paciente en cualquier orden (es decir, de manera simultánea o secuencialmente) o juntos en una composición, formulación o forma de dosificación unitaria individual. En algunas realizaciones, el término "combinación" significa que el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el agente terapéutico adicional, se administran de manera simultánea o secuencialmente. En ciertas realizaciones, el compuesto 1 , o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el agente terapéutico adicional, se administran simultáneamente en la misma composición que comprende el compuesto 1, o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el agente terapéutico adicional. En ciertas realizaciones, el compuesto 1, o sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y el agente terapéutico adicional, se administran simultáneamente en composiciones separadas (es decir, en donde el compuesto 1 , o sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y el agente terapéutico adicional se administran simultáneamente cada uno en una forma de dosificación unitaria separada). Se apreciará que el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el agente quimioterapéutico adicional se administran el mismo día o en días diferentes y en cualquier orden de acuerdo con un protocolo de dosificación apropiado.

El término "aproximadamente" o "de manera aproximada" tendrá el significado de dentro de 10%, por ejemplo dentro de 5%, de un valor o intervalo determinado.

Como se utiliza en la presente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de una sustancia (por ejemplo, un agente terapéutico, composición y/o formulación) que provoca una respuesta biológica deseada. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de una sustancia es una cantidad que es suficiente, cuando se administra como parte de un régimen de dosificación a un sujeto que padece de, o es susceptible a una enfermedad, condición, o trastorno, para tratar, diagnosticar, prevenir, y/o retardar el inicio de la enfermedad, condición, o trastorno. Como se apreciarán por aquellos expertos en la técnica, la cantidad efectiva de una sustancia puede variar dependiendo de factores tal como el criterio de valoración biológico deseado, la sustancia que se va a administrar, la célula o tejido diana, etc. Por ejemplo, la cantidad efectiva de compuesto en una formulación para tratar una enfermedad, condición, o trastorno es la cantidad que alivia, mejora, alivia, inhibe, previene, retarda el inicio, reduce la gravedad y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de la enfermedad, condición, o trastorno. En algunas realizaciones, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es al menos una cantidad mínima de un compuesto, o composición que contiene un compuesto, que es suficiente para tratar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con ADN-PK.

Los términos "tratar" o "que trata", como se usan en la presente, se refieren a aliviar, inhibir, retardar el inicio de, impedir, mejorar y/o aliviar de manera parcial o completamente una enfermedad o trastorno, o uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno. Como se usa en la presente, los términos "tratamiento", "tratar" y "que trata" se refieren a aliviar, inhibir, retardar de manera parcial o completamente el inicio de, impedir, mejorar y/o aliviar una enfermedad o trastorno, o uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno, como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el tratamiento se puede administrar después de que se han desarrollado uno o más síntomas. En algunas realizaciones, el término "tratar" incluye prevenir o detener la progresión de una enfermedad o trastorno. En otras realizaciones, el tratamiento se puede administrar en la ausencia de síntomas. Por ejemplo, el tratamiento se puede administrar a un individuo susceptible antes del inicio de los síntomas (por ejemplo, en vista de un historial de síntomas y/o en vista de factores genéticos u otros factores de susceptibilidad). El tratamiento también se puede continuar después de que los síntomas se hayan resuelto, por ejemplo para prevenir o retardar su recurrencia. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el término "tratar" incluye impedir la recaída o recurrencia de una enfermedad o trastorno.

La expresión "forma de dosificación unitaria", como se utiliza en la presente, se refiere a una unidad físicamente discreta de formulación terapéutica apropiada para el sujeto que se va a tratar. Sin embargo, se entenderá que el uso diario total de las composiciones de la presente invención se decidirá por el facultativo tratante dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis efectiva específico para cualquier sujeto u organismo particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; actividad del agente activo específico empleado; composición específica empleada; edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; tiempo de administración, y tasa de excreción del agente activo específico empleado; duración del tratamiento; fármacos y/o terapias adicionales utilizadas en combinación o coincidente con compuestos específicos empleados, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Como se describe en general anteriormente, la presente invención proporciona el inhibidor de ADN-PK (S)-[2-cloro-4-fluoro-5-(7-morfolin-4-il-quinazolin-4-il)-fenil]-(6-metoxipiridazin-3-il)-metanol, que tiene la siguiente estructura de compuesto 1:

o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para usarse de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.

Se entiende que aunque los métodos descritos en la presente pueden hacer referencia a formulaciones, dosis y regímenes/programas de dosificación del compuesto 1, estas formulaciones, dosis y/o regímenes/programas de dosificación son igualmente aplicables a cualquier sal farmacéuticamente aceptable del compuesto 1. Por consiguiente, en algunas realizaciones, una dosis o régimen de dosificación para una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se selecciona de cualquiera de las dosis o regímenes de dosificación para el compuesto 1 como se describe en la presente.

Agentes quimioterapéuticos adicionales

Como se describe en general anteriormente, la presente invención se refiere a terapias de combinación que utilizan el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y ambos agentes quimioterapéuticos etopósido y cisplatino para el tratamiento del cáncer de pulmón.

El etopósido forma un complejo ternario con el ADN y la enzima topoisomerasa II que ayuda en el desenrollamiento de ADN durante la replicación. Esto impide la re-ligadura de las hebras de ADN y provoca que las hebras de ADN se rompan. Las células de cáncer dependen de esta enzima más que las células sanas debido a que se dividen más rápidamente. Por lo tanto, el tratamiento con etopósido provoca errores en la síntesis de ADN y promueve la apoptosis de las células de cáncer. Sin desear limitarse por ninguna teoría particular, se cree que un inhibidor de ADN-PK bloquea una de las rutas principales para la reparación de DSB en ADN retardando de esta manera el proceso de reparación y conduciendo a una potenciación de la actividad antitumoral de etopósido.

Los platinos son agentes quimioterapéuticos basados en platino. Como se utiliza en la presente, el término "platino" se utiliza indistintamente con el término "agente platinante". Los agentes platinantes se conocen bien en la técnica. De acuerdo con la invención, el platino (o agente platinante) es cisplatino.

El cisplatino reticula el ADN celular de varias maneras diferentes interfiriendo con la división celular por mitosis. Los más notables entre los cambios en el ADN son las reticulaciones intra-hebra con bases de purina. Estas reticulaciones se reparan principalmente por la reparación por escisión de nucleótidos. El ADN dañado activa mecanismos de punto de control, que a su vez activan la apoptosis cuando la reparación resulta imposible.

Tratamiento

El compuesto 1 es un inhibidor competitivo de ATP potente y selectivo de ADN-PK, como se demuestra por estudios cristalográficos y de cinética enzimática. ADN-PK, junto con cinco factores de proteína adicionales (Ku70, Ku80, XRCC4, ligasa IV, y Artemis) desempeña una función crítica en la reparación de DSB mediante NHEJ. La actividad de cinasa de ADN-PK es esencial para la reparación adecuada y oportuna del ADN y la supervivencia a largo plazo de las células de cáncer (Salles et al., 2006; Dobbs et al., 2011). Sin desear limitarse por ninguna teoría particular, se cree que los efectos primarios del compuesto 1 son la supresión de la actividad de ADN-PK y la reparación de la rotura de doble hebra (DSB) de ADN, lo que conduce a la reparación alterada del ADN y la potenciación de la actividad antitumoral de los agentes que dañan el ADN.

Los datosin vitrodemostraron una sinergia del compuesto 1 en combinación con etopósido versus etopósido solo. Los resultados experimentales presentados en la presente proporcionan una fuerte evidencia de la potenciación del etopósido, en particular, por el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En ciertas realizaciones, se propone que la presente invención se use en un método para tratar el cáncer de pulmón en un paciente en necesidad de esto que comprende administrar a este paciente el compuesto 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en combinación con etopósido y cisplatino.

La presente invención se refiere al uso en el tratamiento del cáncer de pulmón, que incluye subtipos histológicos de este (por ejemplo, adeno, escamoso, de células grandes) en un paciente en necesidad de esto, que comprende administrar a este paciente el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con etopósido y cisplatino.

El compuesto 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y las composiciones del mismo de acuerdo con las realizaciones de la presente invención, se administran usando cualquier cantidad y cualquier ruta de administración efectiva para tratar o disminuir la gravedad del trastorno proporcionado anteriormente. La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, edad, y condición general del sujeto, su modo de administración, y similares.

En algunas realizaciones, tratar el cáncer de pulmón, que incluye subtipos histológicos del mismo (por ejemplo, adeno, escamoso, de células grandes) en un paciente en necesidad de esto comprende administrar a este paciente el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 800 mg en combinación con cisplatino y etopósido.

En algunas otras realizaciones, tratar el cáncer de pulmón, que incluye subtipos histológicos del mismo (por ejemplo, adeno, escamoso, de células grandes) en un paciente en necesidad de esto comprende administrar a este paciente el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 800 mg en combinación con cisplatino y etopósido, en cantidades de acuerdo con las directrices de estándar de cuidado clínico local. En ciertas realizaciones, el cisplatino se administra por vía intravenosa en una cantidad de aproximadamente 50 a aproximadamente 75 mg/m2. En algunas realizaciones, el etopósido se administra por vía intravenosa en una cantidad de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 mg/m2. Más comúnmente, el cisplatino se administra a 75 mg/m2 y el etopósido a 100 mg/m2.

En ciertas realizaciones, el tratamiento del cáncer de pulmón, incluidos los subtipos histológicos de la misma (por ejemplo, adeno, escamosa, de células grandes) en un paciente en necesidad de esto comprende la administración a este paciente del compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con etopósido y cisplatino, en donde el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y etopósido y cisplatino se proporcionan como composiciones separadas para la administración simultánea o secuencial a este paciente.

En algunas realizaciones, tratar el cáncer de pulmón en un paciente en necesidad de esto comprende administrar a este paciente el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, seguido por la administración de cisplatino y entonces la administración de etopósido. En ciertas realizaciones, el compuesto 1 se administra aproximadamente 1-2, preferentemente aproximadamente 1,5 horas antes de la administración del cisplatino. En algunas realizaciones, el compuesto 1 se administra a este paciente QD. En ciertas realizaciones, el compuesto 1 se administra durante 5 días. En algunas realizaciones, el compuesto 1 se administra de aproximadamente 4 días a aproximadamente 3 semanas, durante aproximadamente 5 días, durante aproximadamente 1 semana, o durante aproximadamente 2 semanas.

En ciertas realizaciones, el cisplatino se administra mediante infusión intravenosa. En ciertas realizaciones, el cisplatino se administra mediante infusión intravenosa a aproximadamente 75 mg/m2 durante un período de 60 minutos. En algunas realizaciones, el etopósido se administra mediante infusión intravenosa. En ciertas realizaciones, el etopósido se administra mediante infusión intravenosa a aproximadamente 100 mg/m2 durante un período de 60 minutos.

En ciertas realizaciones, el etopósido se administra mediante infusión intravenosa el día 1 y entonces mediante infusión intravenosa o administración oral los días 2 y 3.

En algunas realizaciones, el tratamiento del cáncer de pulmón comprende administrar una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, una, dos, tres, o cuatro veces al día.

En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra diariamente.

En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra una vez al día ("QD").

En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra dos veces al día. En algunas realizaciones, la administración dos veces al día se refiere a un compuesto o composición que se administra "BID", o dos dosis equivalentes administradas en dos momentos diferentes en un día.

En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el compuesto 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra tres veces al día. En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, se administra "TID", o tres dosis equivalentes administradas en tres momentos diferentes en un día.

En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, se administra cuatro veces al día. En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el compuesto 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable de este, se administra "QID", o cuatro dosis equivalentes administradas en cuatro momentos diferentes en un día.

En algunas realizaciones, el compuesto 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a un paciente en condiciones de ayuno y la dosis diaria total es cualquiera de aquellas contempladas anteriormente y en la presente.

En algunas realizaciones, el compuesto 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a un paciente en condiciones de alimentación y la dosis diaria total es cualquiera de aquellas contempladas anteriormente y en la presente.

En algunas realizaciones, el compuesto 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable de este, se administra por vía oral.

En una realización preferida de administración de etopósido y el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el compuesto 1 se administra el mismo día y, por ejemplo, aproximadamente 2 horas antes del etopósido, o aproximadamente al mismo tiempo que el etopósido, o menos de 7 horas después del etopósido, por ejemplo, menos de 5, 3 o 1 hora después del etopósido.

Administración de agente quimioterapéutico adicional

En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento comprenden administrar una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quimioterapéutico una, dos, tres, o cuatro veces al día.

En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quimioterapéutico se administra una vez al día ("QD").

En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quimioterapéutico se administra dos veces al día. En algunas realizaciones, la administración dos veces al día se refiere a un compuesto o composición que se administra "BID", o dos dosis equivalentes administradas en dos momentos diferentes en un día.

En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quimioterapéutico se administra tres veces al día. En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quimioterapéutico se administra "TID", o tres dosis equivalentes administradas en tres momentos diferentes en un día.

En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quimioterapéutico se administra cuatro veces al día. En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quimioterapéutico se administra "QID", o cuatro dosis equivalentes administradas en cuatro momentos diferentes en un día. En algunas realizaciones, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quimioterapéutico se administra durante varios días (por ejemplo, 14, 21,28) con varios días entre el tratamiento (0, 14, 21, 28).

En algunas realizaciones, se administra un agente quimioterapéutico a un paciente en condiciones de ayuno y la dosis diaria total es cualquiera de las contempladas anteriormente y en la presente.

En algunas realizaciones, se administra un agente quimioterapéutico a un paciente en condiciones de alimentación y la dosis diaria total es cualquiera de las contempladas anteriormente y en la presente.

En algunas realizaciones, un agente quimioterapéutico se administra por vía oral por razones de conveniencia. En algunas realizaciones, cuando se administra por vía oral, se administra un agente quimioterapéutico con una comida y agua. En otra realización, el agente quimioterapéutico se dispersa en agua o jugo (por ejemplo, jugo de manzana o jugo de naranja) y se administra por vía oral como una suspensión. En algunas realizaciones, cuando se administra por vía oral, un agente quimioterapéutico se administra en un estado en ayunas.

Un agente quimioterapéutico también se puede administrar por vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, percutánea, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, sublingual, intracerebral, intravaginal, transdérmica, rectal, mucosa, por inhalación, o tópicamente a los oídos, nariz, ojos, o piel. El modo de administración se deja a la discreción del profesional de la salud, y puede depender en parte del sitio de la condición médica.

Composiciones farmacéuticamente aceptables del compuesto 1 y/o un agente quimioterapéutico

El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se puede proporcionar en una composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, se usa una composición farmacéuticamente aceptable de un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, una composición que comprende el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está separada de una composición que comprende un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un agente quimioterapéutico están presentes en la misma composición. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una composición que comprende el compuesto 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y tanto de etopósido como de cisplatino. En algunas realizaciones, una composición proporcionada que comprende el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y tanto etopósido como cisplatino se formula para administración oral. Los ejemplos de estas composiciones farmacéuticamente aceptables se describen adicionalmente a continuación y en la presente.

Las formas de dosificación líquida para administración oral incluyen, pero no se limitan a, elixires, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones farmacéuticamente aceptables. Además del compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y/o un agente quimioterapéutico, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica tal como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tal como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, semilla de algodón, maní, maíz, germen, oliva, ricino y aceites de ajonjolí), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tal como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones oleaginosas o acuosas inyectables estériles se pueden formular de acuerdo a la técnica conocida utilizando agentes humectantes o de dispersión adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una emulsión, suspensión o solución inyectable estéril en un diluyente o solvente no parenteralmente tóxico aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear están el agua, la solución de Ringer, el U.S. P. y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Con este propósito se puede emplear cualquier aceite no volátil blando, incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, se utilizan ácidos grasos como el ácido oleico en la preparación de inyectables.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o al incorporar agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes del uso.

A fin de prolongar el efecto del compuesto 1, y/o un agente quimioterapéutico adicional, a menudo es deseable ralentizar la absorción de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr por el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con pobre solubilidad en agua. La velocidad de absorción depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. De manera alternativa, la absorción retardada del compuesto 1 administrado por vía parenteral, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y/o un agente quimioterapéutico, se logra al disolver o suspender el compuesto en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se preparan al formar matrices de microcápsulas del compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y/o un agente quimioterapéutico, en polímeros biodegradables tal como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la relación de compuesto a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de compuesto. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y los poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan al atrapar el compuesto en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos corporales.

Las composiciones para la administración rectal o vaginal son preferentemente supositorios que se pueden preparar al mezclar los compuestos de esta invención con excipientes o portadores no irritantes adecuados tal como la mantequilla de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura corporal y por consiguiente se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.

Las formas de dosificación sólida para la administración oral incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos, y gránulos. En estas formas de dosificación sólida, el compuesto activo se mezcla con al menos excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, inerte, tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico, y/o a) agentes de relleno o extensores tal como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, b) agentes aglutinantes tal como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa, y acacia, c) humectantes tal como glicerol, d) agentes de desintegración tal como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio, e) agentes retardadores de solución tal como parafina, f) aceleradores de absorción tal como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tal como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tal como caolín y arcilla de bentonita, y i) lubricantes tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril-sulfato de sodio, y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, tabletas y píldoras, la forma de dosificación también puede comprender agentes amortiguadores.

Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como agentes de relleno en cápsulas de gelatina rellena suaves y duras que utilizan estos excipientes como lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas de dosificación sólida de tabletas, grageas, cápsulas, píldoras, y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tal como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también pueden ser de una composición que libera el ingrediente activo solamente, o preferentemente, en cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Ejemplos de composiciones de incrustación que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras.

Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como agentes de relleno en cápsulas de gelatina rellena suaves y duras que utilizan estos excipientes como lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y/o un agente quimioterapéutico, también puede estar en forma microencapsulada con uno o más excipientes como se indica anteriormente. Las formas de dosificación sólida de tabletas, grageas, cápsulas, píldoras, y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tal como recubrimientos entéricos de control de liberación y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. En estas formas de dosificación sólidas, el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y/o un agente quimioterapéutico, se puede mezclar con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Estas formas de dosificación también pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales diferentes de diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes de tableta y otros ayudantes de tableta tal como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, tabletas y píldoras, las formas de dosificación también puede comprender agentes amortiguadores. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también pueden ser de una composición que libera el ingrediente activo solamente, o preferentemente, en cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Ejemplos de composiciones de incrustación que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica del compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y/o un agente quimioterapéutico, incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, pulverizaciones, inhaladores o parches. El componente activo se mezcla bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualquier conservador o amortiguador necesario como se pueda requerir. También se contempla que la formulación oftálmica, las gotas para los oídos y las gotas para los ojos están dentro del alcance de esta invención. Adicionalmente, la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos, que tienen la ventaja adicionada de proporcionar la administración controlada de un compuesto al cuerpo. Estas formas de dosificación se pueden producir al disolver o dispensar el compuesto en el medio adecuado. Los potenciadores de absorción también se pueden utilizar para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad se puede controlar ya sea al proporcionar una membrana de control de velocidad o al dispersar el compuesto en una matriz polimérica o gel.

Ejemplificación

Los siguientes ejemplos ilustran la invención descrita anteriormente; sin embargo, no se propone que limiten el alcance de la invención de ninguna manera. Los efectos beneficiosos de los compuestos, combinaciones y composiciones farmacéuticas de la presente invención también se pueden determinar por otros modelos de prueba conocidos como tal por la persona experta en la técnica pertinente.

Ejemplo 1

Eficacia del compuesto 1 en combinación con radioterapia (información de antecedentes)

La pertinencia terapéutica de la inhibición de ADN-PK por el compuesto 1 se investigóin vivoen combinación con radiación ionizante (IR), un tratamiento inductor de DSB clínicamente establecido. El compuesto 1 se probó para la actividad en seis modelos de xenoinjerto de ratón de cáncer humano. Los modelos se eligieron entre diferentes indicaciones de cáncer (colon, pulmón, cabeza y cuello, páncreas) y subtipos histológicos (adeno, escamoso, célula grande). La radiación ionizante se administró utilizando un programa fraccionado de 2 Gy por día administrado durante cinco días consecutivos (dosis de radiación total = 10 Gy). El compuesto 1 se administró por vía oral 10 min antes de cada fracción de radiación (ONC397-1-2AZ, ONC397-1-3AZ, ONC397-1-4AZ, ONC3971-5AZ, ONC397-1-8AZ).

En todos los modelos, la administración oral del compuesto 1 dio por resultado una fuerte potenciación del efecto de radiación (figura 1 - Eficacia del compuesto 1 en combinación con radiación en seis modelos de xenoinjerto de ratón de cáncer humano). El efecto potenciador de radioterapia del compuesto 1 se cuantificó en los modelos probados en el momento de alcanzar el 400% de volumen inicial para los brazos de estudio de 150 mg/kg. Las gráficas de Kaplan-Meier resultantes se compararon por la prueba de rango logarítmico. Se encontró que la relación de mejora en este entorno de tratamiento estaba entre 1,5 (A549, HCT116) y 2,6 (NCI-H460) (tabla 1).

Tabla 1. Resumen de resultados de prueba de rango logarítmico usando el tiempo para alcanzar 400% de volumen de tumor inicial (TV400%) de modelos de xenoinjerto expuestos a radiación sola y radiación más el compuesto 1

Como se demostró en el modelo de xenoinjerto FaDu, cuyos resultados se resumen en la tabla 2, a continuación, estos efectos aumentaron al aplicar una dosis más alta del compuesto 1 o una dosis más alta de radiación. Por ejemplo, 100 mg/kg de compuesto 1 en combinación con una dosis diaria de 4 Gy (dosis total de 20 Gy) condujo a una respuesta completa (CR) en el modelo FaDu durante el período de observación de 92 días (ONC397-1-11AZ), y cuando los animales se irradiaron con una dosis diaria de 6 Gy (dosis total de 30 Gy) se observó una relación de potenciación de 2 con una dosis de compuesto 1 de 10 mg/kg (ONC397-1 -12AZ).

Tabla 2. Resumen de los resultados de prueba de rango logarítmico utilizando TV400% del modo de xenoinjerto FaDu después de la exposición a diferentes dosis de radiación y al compuesto 1.

El régimen de radioterapia estándar utilizado en la clínica es un programa de tratamiento fraccionado de 6 semanas (5 fracciones de 2 Gy IR por semana - 60 Gy en total). Para examinar el potencial terapéutico del compuesto 1, este régimen se aplicó en dos modelos de xenoinjerto de cáncer humano (FaDu y NCI-H460). El compuesto 1se administró por vía oral 10 min antes de cada fracción de radiación a dosis de 5, 10, 25 y 50 mg/kg en el FaDu (referirse a ONC397-1-13AZ) y 25 y 50 mg/kg en el estudio de NCI-H460 (ONC398-1-5aAZ).

En el estudio de FaDu, este tratamiento de combinación dio por resultado una fuerte inhibición del crecimiento tumoral en comparación a los tumores tratados con IR sola. Se observó una regresión tumoral completa en el 44% de los animales tratados con 10 mg/kg de compuesto 1 y los tumores no volvieron a crecer durante el período de estudio (113 días). A dosis de 25 y 50 mg/kg, el xenoinjerto de tumor retrocedió en los 10 animales y no recayó hasta el final del estudio (figura 2 - Eficacia del compuesto 1 en combinación con IR en un programa de tratamiento de 6 semanas en modelo de xenoinjerto FaDu).

El NCI-H460 se eligió como un modelo relativamente insensible al tratamiento con IR. Los tumores tratados sólo con IR, progresaron rápidamente bajo tratamiento. Sin embargo, los tumores tratados con el IR y el compuesto 1 retrocedieron durante el período de tratamiento y observación hasta aproximadamente el día 90 (figura 3 - Eficacia del compuesto 1 en combinación con IR en un programa de tratamiento de 6 semanas en el modelo de xenoinjerto NCI-H460). Los xenoinjertos de tumor en los ratones tratados con 50 mg/kg de ADN-Pki no excedieron su volumen inicial hasta el final del experimento en el día 110 (42 días de tratamiento más 68 días de observación).

En ambos estudios, el tratamiento fue en general bien tolerado. Durante el período de tratamiento, los animales en todos los grupos de tratamiento mostraron una pérdida de peso corporal moderada, probablemente debido a los procedimientos de tratamiento diarios: sonda oral, anestesia e IR durante un período de 6 semanas. La pérdida de peso corporal fue totalmente reversible.

Ejemplo 2

Eficacia del compuesto 1 en combinación con etopósido y cisplatino en el modelo de xenoinjerto de SCLC NCI-H526 humano

Para el estudio de xenoinjerto de eficacia se utilizaron ratones 1014-1-58/BKU00105 CD1 nu/nu hembra [ID de lote interno 04108; Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemania], de 6-8 semanas de edad. Para el estudio de hematología se utilizaron ratones CD1 hembra inmunocompetentes 1015-1-3/BKU00106 [lote interno ID1406; Janvier Labs, Genest-Saint-Isle, Francia], de 12 semanas de edad. Los ratones se aclimataron a las condiciones de alojamiento durante 1 semana. Se mantuvieron en grupos de 10 en jaulas de polisulfona Tipo III (42,5x26,6x15,5cm; Techniplast, Hohenpeissenberg). La ropa de cama consistía en astillas de álamo (E. Becker, Castrop-Rauxel). La temperatura ambiente fue de 24 /-2° C y la humedad relativa fue de 50+/-10% a 15 cambios de aire por hora. El agua potable (proporcionada ad libitum) se suplementó con 1 mg/mL de cloro y se ajustó a un pH de 6,5 con HCl. También se proporcionó dieta de mantenimiento estéril con alto contenido de proteínas para ratones inmunodeficientes (Ssniff, Soest, producto núm. V1244-72, esterilizado con y)ad libitum.El ciclo de luz se ajustó a 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los detalles del protocolo de estudio son los siguientes:

Para el estudio de xenoinjerto de eficacia, las células de carcinoma de pulmón de células pequeñas humanas 1014-1-58/BKU00105 NCI-H526 se obtuvieron del banco de células central Merck KGaA (criovial NCI-H526/5 17.03.2011). Las células crecieron en suspensión y se cultivaron en medio de crecimiento RPMI 1640 (Gibco Núm.

31870) incluido FCS al 10% (Biochrome Cat.: SO615, Lote0707W), L-Glutamina 2 mM (Gibco No. 25030), Piruvato de Sodio 1 mM (Gibco No. 11360) a 37°C, CO2 al 5% para obtener 2x108 células en total. Las células se lavaron entonces 3x con DPBS y se volvieron a suspender en DPBS (-Mg/-Ca) con Matrigel (BD, núm. de cat.: 354234) (1:1/v:v) a 2x107 células/ml. Entonces, la suspensión celular (100 pL/animal) se inoculó por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones de CD1 inmunodeficientes.

Soluciones

Todos los reactivos y agentes amortiguadores se almacenaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes y se utilizaron antes de la fecha de caducidad del lote.

El compuesto 1 se produjo en Merck KGaA Darmstadt, Alemania. Formulación: La respectiva cantidad de compuesto se pesó en un tubo "Precellys" [PEQ-Lab, 91-PCS-CK28R], vehículo de 1 ml (Methocel al 0,5% (K4M Premium USP/ EP; Colorcon), Tween20 al 0,25% (Merck, pedido núm.: 8170721000) en agente amortiguador de citrato de Na 300 mM pH 2,5). El tubo se colocó en un homogeneizador de tejidos "precellys 24" [Bertin technologies, Montigny le Bretonneux (FR)] y se molió dos veces a 6500 agitaciones durante 30 segundos. Después, la mezcla de compuesto se transfirió a un vial de vidrio apropiado y se adicionó vehículo para llevar la suspensión a su volumen final. Finalmente, la formulación (de color amarillo, suspensión muy fina) se agitó durante 10 min a 40 °C. Se preparó una preparación fresca una vez a la semana.

El etopósido VP-16 se obtuvo de Selleck Chemicals LLC, Cat Núm. SI225-07. El etopósido se formuló de la siguiente manera: Se adicionaron 2 ml de Chremophor a 12 mg de etopósido y se sometieron a tratamiento con ultrasonido para disolver. Se adicionaron 2 ml de etanol al 100% y se mezclaron. Entonces se adicionaron 24 ml de agua destilada y se sometieron a tratamiento con ultrasonido. Concentración final de VP-16 = 0,4 mg/ ml. Se preparó una preparación fresca una vez por semana.

El cisplatino se obtuvo de Metac GmbH, Infusiones 50 mg/ 100 ml (0,5 mg/ ml); entrega 2015/02/12, Lote.-Núm. M130845B. El cisplatino se diluyó hasta la concentración de aplicación final utilizando solución salina al 0,9% (Braun, Reg.-ID.:6726174.00.00). Se preparó una preparación fresca una vez por semana.

A continuación se expone el resumen del tratamiento:

Procedimiento del estudio

Inoculación de células tumorales: La suspensión de células NCI-H526 humanas se inoculó por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones CD1 nu/nu en un volumen de 100 pL de DPBS (-Mg/-Ca) con Matrigel (1:1/v:v) y una concentración de 2x107 células/ml.

Identificación de animales: Todos los animales se identificaron individualmente utilizando transpondedores electrónicos NONATEC implantados subcutáneamente (LUTRONIC, Luxemburgo). La implantación se realizó en la espalda con aguja hipodérmica (calibre 18) después de la reducción de gérmenes de la piel con alcohol al 70%. Un lector electrónico permitió la identificación de cada animal individual con el número de código correspondiente. Mediciones y cálculos de tumor: Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 96-214 mm3, los animales se aleatorizaron en 7 grupos de tratamiento con 10 animales cada uno. La longitud (L) y el ancho (W) del tumor se midieron dos veces por semana con calibradores. El volumen de tumor se calculó utilizando la fórmula LxW2/2. Los datos se recolectaron en Study AdvantageMR (sistema de recolección de datos).

Peso corporal: El peso corporal se monitoreó dos/tres veces por semana.

Tratamiento: dosificación y programación según lo anterior. El compuesto 1 administrado de acuerdo con 3 programas diferentes:

1) Diariamente durante todo el estudio y concomitante con SoC

2) Diariamente durante todo el estudio, en los días de combinación de SoC, tiempo de configuración de 7 h entre el tratamiento de SoC y la aplicación del compuesto 1

3) Aplicación sólo en días sin tratamiento con etopósido

Muestreo y procesamiento de sangre para hematología: La sangre se recolectó utilizando una Microbeta Sarstedt 500 K3E (Tri-Kalium-EDTA) REF20.1341, Lote.4074501: Los tubos se colocaron inmediatamente en un mezclador de rodillos (mezclador de rodillos Stuart SRT9D) y se rodaron hasta el análisis. El análisis hematológico se realizó utilizando el analizador Sysmex xT-2000iV, ubicado en A32/113.

Detección del compuesto 1 y etopósido en plasma de ratón: La sangre se recolectó como se indica en 11.3 (BKU00113) y 11.5 (BKU00105), respectivamente.

La determinación cuantitativa del compuesto 1 en plasma de ratón se realizó utilizando el ensayo HPLC-MS/MS en cumplimiento general con los procedimientos descritos en el Procedimiento Operativo Estándar SO-ABC-6 80.45.16.051 y las referencias proporcionadas en el mismo.

Criterios de valoración

Valor T/C: La capacidad de un tratamiento para inhibir el crecimiento tumoral se evaluó al final de cada estudio al calcular el valor de % T/C de acuerdo con las siguientes fórmulas:

% T/C delta > 0 cálculo (media): [(tratamiento de volumen de tumor final - tratamiento de volumen de tumor inicial)/(control de volumen de tumor final - control de volumen de tumor inicial)] x 100]

% T/C delta < 0 (regresión) cálculo (media): [(fin del tratamiento de volumen de tumor - inicio del tratamiento de volumen de tumor)/inicio del tratamiento de volumen de tumor] x 100

Estasis: Estasis definida como tumores que demostraron un tamaño más pequeño o más grande (< -50% y < 25%) al final del experimento con relación a ese del inicio del tratamiento

Regresiones parciales: La regresión parcial se definió como tumores que demostraron un tamaño más pequeño (< 50%) al final del experimento con relación a ese del inicio del tratamiento.

Regresiones completas: Las remisiones completas se definieron como tumores que ya no eran palpables.

Retardo de crecimiento tumoral: La diferencia en días para que los tumores tratados versus los de control alcancen un volumen especificado, usualmente 1 cm3 pero podría ser menor.

Toxicidad: El cambio de peso corporal en % denota la diferencia entre el peso al inicio del tratamiento y el final del tratamiento. Los cambios de peso corporal durante el curso del tratamiento son particularmente importantes, puesto que se considera una medida de la presencia o ausencia de toxicidad relacionada con el tratamiento. Una dosis que produce un cambio de peso corporal del 20% (media del grupo) o > 10% de muertes por fármacos se consideró una dosis excesivamente tóxica. Los pesos corporales de los animales incluyeron los pesos de tumores.

Conteo de células de sangre

Análisis estadístico

Los datos de eficacia se han analizado por RM-ANCOVA y comparaciones por pares de los datos de volumen de tumor de los respectivos grupos de combinación con los datos de volumen de tumor del grupo de tratamiento sólo de SoC.

Los datos de hematología se evaluaron por comparaciones múltiples de RM-ANOVA y Bonferroni después de la prueba que compara los conteos de células sanguíneas de los respectivos grupos de combinación con los conteos de células sanguíneas del grupo de tratamiento sólo de SoC.

El efecto terapéutico del compuesto 1 en combinación con el régimen estándar de atención (SoC) de etopósido y cisplatino se probó en el modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón de células pequeñas humano NCI-H526 en ratones sin pelaje. Los animales se trataron con tres ciclos de quimioterapia de 1 semana que constaban de cisplatino (3 mg/kg una vez a la semana) y etopósido (4 mg/kg durante tres días consecutivos por semana). La combinación con el compuesto 1 (50 mg/kg) fue en tres programas diferentes. 1) El compuesto 1 se aplicó diariamente durante todo el estudio y de manera concomitante con etopósido en los respectivos días. 2) El compuesto 1 se aplicó diariamente durante todo el estudio 7 horas después del tratamiento con etopósido en los respectivos días. 3) El compuesto 1 se separó del tratamiento con etopósido y sólo se aplicó en los días en que no se administró etopósido. En el brazo de combinación del estudio, el compuesto 1 se administró además de quimioterapia (50 mg/kg diariamente durante todo el período de estudio, extendiendo las tres semanas de quimioterapia.

En combinación con etopósido y cisplatino, el compuesto 1 muestra una actividad antitumoral significativamente potenciada en el modelo de xenoinjerto de ratón SCLC NCI-H526 humano (figura 4A - Eficacia del compuesto 1 en combinación con etopósido/ cisplatino en el modelo de xenoinjerto NCI-H526 (volumen de tumor medio izquierdo y volúmenes de tumor individuales derecho)) (referirse a ONC1014-1-58AZ). La adición del compuesto 1 al régimen de SoC de etopósido y cisplatino dio por resultado una eficacia adicional en comparación al grupo de tratamiento de SoC. Al final del período de tratamiento de SoC (día 21), el volumen de tumor medio del grupo de combinación (n=10) fue de 50 mm3, una disminución de aproximadamente el 67% en comparación al volumen inicial, en tanto que el volumen de tumor medio del grupo de SoC (n=10) incrementó en 30% a aproximadamente 200 mm3. El día 28, 9/10 animales en el brazo de combinación estaban libres de progresión, 4/10 mostraban respuesta completa, de los cuales 3/10 enfermedad estable y 1/10 regresión. En el grupo de SoC, 8/10 animales mostraron enfermedad progresiva. La figura 4B muestra que la administración del compuesto 1 diariamente durante todo el estudio dio por resultado una mejor eficacia que la separación del SoC y el tratamiento con el compuesto 1 por ya sea 7 h o días.

La terapia de SoC indujo la pérdida de peso corporal en los animales (figura 5 - Cambio de peso corporal después del tratamiento con etopósido/ cisplatino y la combinación con el compuesto 1 en ratones). La combinación de SoC con el compuesto 1 condujo a una pérdida de peso corporal adicional. Todos los animales se complementaron con un suministro de alimentos habilitado (DietGelMR Boost mezclado con agua) de principio a fin del estudio para mantener la pérdida de peso corporal en un intervalo moderado y estabilizar su condición general. Después de la terminación del tratamiento con SoC al final del ciclo de quimioterapia 3 (d21), los animales se recuperaron a pesar de la administración continua del compuesto 1.

En paralelo con el efecto antitumoral de la combinación de etopósido/cisplatino/Compuesto 1, se investigó el efecto en células mieloides y linfoides en ratones inmunocompetentes (referirse a ONC1015-1-3AZ). Los animales se trataron a las mismas dosis y programas que en el estudio antitumoral, pero sólo durante dos semanas. Se determinó el conteo de células de sangre bajo tratamiento (días 5 y 11) y durante la recuperación (días 18 y 24). Figura 6 - Los conteos de reticulocitos y linfocitos bajo tratamiento con y recuperación de etopósido/cisplatino y la combinación con el compuesto 1 muestran que los reticulocitos y linfocitos se redujeron significativamente después del tratamiento con etopósido y cisplatino. La adición del compuesto 1 no afectó significativamente la reducción de células sanguíneas ni la fase de recuperación. Se observaron efectos similares para los eosinófilos y no se observaron efectos significativos para los neutrófilos y las plaquetas. Puesto que la supresión mieloide y linfoide es una de las toxicidades limitantes de la dosis del régimen de etopósido/cisplatino en pacientes, la ausencia demostrada de cualquier toxicidad adicional significativa es un resultado positivo.

Ejemplo 3

El tratamiento con el compuesto 1 de agente individual inhibe el crecimiento de xenoinjerto LoVo (información de antecedentes)

Se ha reportado recientemente que las células tumorales con componentes disfuncionales de la vía de reparación del ADN pueden ser adictas a ADN-PK, lo que sugiere que los inhibidores de ADN-PK pueden tener actividad de agente único en tumores deficientes en la reparación del ADN (Riabinska et al., 2013, Dietlein et al., 2014). Se probó el efecto del compuesto 1 en el crecimiento de xenoinjertos de carcinoma de colon LoVo establecidos que se conoce que son deficientes en la función de la ruta de ATM debido a la mutación en la proteína MRE11. La administración de tres semanas del inhibidor de ADN-PK a ratones portadores de tumores condujo a una inhibición del crecimiento tumoral dependiente de la dosis con supresión del crecimiento casi completa a 150 mg/kg (figura 7 - Eficacia de agente individual del compuesto 1 en el modelo de xenoinjerto LoVo deficiente en la ruta de ATM) (referirse a ONCEFF-14-001AZ).

Ejemplo 4

Efectos farmacodinámicosin vivodel compuesto 1 (información de antecedentes)

Después de la inducción de DSB por radioterapia u otros agentes que dañan el ADN, la subunidad catalítica de ADN-PK (ADN-PKc) se autofosforila en varios residuos de serina y treonina. Ser2056 es uno de los sitios de autofosforilación más prominentes y mejor estudiados. Debido a que la fosforilación de Ser2056 (p-Ser2056) se correlacionó bien con el estado de activación de ADN-PK, se eligió como el biomarcador farmacodinámico (PD). Se establecieron dos formatos de ensayo diferentes para medir p-Ser2056 en tejido tumoral: Formato de ELISA y MSD. A fin de detectar la señal fiable de secuencia, se utilizó IR a 50 Gy para el ensayo ELISA y 10 Gy para el ensayo de MSD más sensible. La inhibición dependiente de la dosis de la fosforilación de ADN-PK inducida por IR (Ser2056) por el compuesto 1 se demostró en los modelos de xenoinjerto humano FaDu y HCT116 por ELISA (referirse a ONC101305BCS) y WM164 por el ensayo de MSD. Los ratones con tumores WM164 establecidos recibieron el compuesto 110 minutos antes de 10 Gy de IR y se midieron los niveles de ADN-PK (p-Ser2056) en el tejido tumoral (PD) en varios puntos de tiempo y se correlacionaron con la concentración en plasma (PK) de compuesto 1. La autofosforilación de ADN-PK se incrementó después de IR mostrando una estimulación máxima entre 1 y 2 horas. La coadministración de IR y el compuesto 1 (25 mg/kg) condujo a la inhibición de la autofosforilación de ADN-PK en el tejido tumoral con efectos más fuertes que corresponden a una alta exposición de plasma del compuesto 1. El nivel inhibido fue por debajo a ese de los animales tratados con vehículo debido a la inhibición del nivel basal de fosforilación de ADN-PK (p-Ser2056) (figura 8 - el compuesto 1 inhibe la autofosforilación de ADN-PK (p-Ser2056) en el tumor de xenoinjerto WM164) (referirse a ONC20140508CS).

Ejemplo 5

El compuesto 1 en combinación con etopósido o cisplatino se probó en las siguientes líneas celulares de cáncer para la inhibición de células tumorales: carcinoma de pulmón humano (NCI-H460), glioblastoma humano (MO59K y MO59J) y carcinoma de células escamosas humano de faringe (FaDu). A continuación se exponen detalles del protocolo de ensayo y el material utilizado.

Materiales y Fuentes

Placa de 96 pocillos de superficie Nuncon (cultivo celular) Nunc

DMEM Pan Biotech GmbH

RPMI Gibco

HAM F12 Pan Biotech GmbH

Piruvato de sodio Gibco

L-Glutamina Gibco

Aminoácido no esencial SIGMA

PBS (10x) Dulbecco Gibco

Placas de microtítulo de 96 pocillos (polipropileno) Nunc

AlamarBlue Serotec

FCS (suero bovino fetal) Biochrom

Solución de tripsina/EDTA 10x Biochrom AG

Frasco de cultivo de 75 cm DB Falcon

Etopósido SIGMA

Cisplatino SIGMA

DMEM/F12 (1:1) Gibco

Alamar blue Serotec

NCI-H460 Carcinoma de pulmón humano; ATCC HTB177

MO59K Glioblastoma humano: ATCC CRL-2365

MO59J Glioblastoma humano ATCC CRL-2366

FaDu Carcinoma humano de células escamosas de faringe; ATCC HTB43

Instrumentos

Concentraciones del artículo de prueba

Las células se colocaron en placas en un volumen de 180 pl/pocillo en placas de 96 pocilios: (FaDu: 1000 células/pocillo (168h); NCI-H460 3000 células/pocillo (72h) y 1000 células/pocillo (l68h); MO59J: 5000 células/pocillo (72h) y 2000 células/pocillo (168h); MO59K: 2000 c/pocillo (72h) y 1000 células/pocillo (168h)) y se incubaron a 37°C y CO2 pertinente durante 24h horas. Se adicionaron 20 pl por pocillo de medio que incluía diluciones en serie de compuesto 1 y/o etopósido o cisplatino a las placas de cultivo y la incubación se continuó adicionalmente durante 3 días (72h) o 7 días (168h) a 37°C y CO<2>pertinente. El compuesto 1 se preincubó durante 30 minutos antes de adicionar etopósido o cisplatino.

Las células se colocaron en placas en un volumen de 200 pl por pocillo (FaDu: 1000 células/pocillo (168h); NCI-H460 3000 células/pocillo (72h) y 1000 células/pocillo (l68h); MO59J: 5000 células/pocillo (72h) y 2000 células/pocillo (168h); MO59K: 2000 c/pocillo (72h) y 1000 células/pocillo (168h)). Después de 24 h de incubación a 37°C, el compuesto 1, etopósido o cisplatino se dispensaron al usar el dispensador digital HP D300 (y el software de dispensación incluido). Las placas se incubaron adicionalmente durante 3 días (72h) o 7 días (168h) a 37°C y CO<2>pertinente.

Al final del período de incubación del compuesto, se adicionaron 20 pl de reactivo AlamarBlue por pocillo y las placas de 96 pocillos se incubaron adicionalmente hasta siete horas. La absorción se determinó a 540 nm utilizando lector Tecan Connect y Magelan 7.

0% de efecto = células tratadas con DMSO; -100% de efecto= sin células

Resultados

El compuesto 1 mostró una inhibición mejorada de la viabilidad de las células NCI-H460, FaDu y MO59K (ADN-PK tipo silvestre)in vitroal usar la combinación con etopósido (figuras 9, 11 y 12).

El compuesto 1 se compara favorablemente con otro inhibidor de ADN-PK, VX984, que requiere concentraciones más altas de etopósido para llegar al mismo % de efecto, como se ilustra en la figura 17. VX-984 representa el compuesto 8-[(1S)-2-[[6-(4,6-dideuterio-2-metilpirimidin-5-il)pirimidin-4-il]amino]-1-metiletil]quinolina-4-carboxamida, como se divulga en WO 2013/163190, por ejemplo.

Las células MO59J, que son deficientes en ADN-PK (1), no mostraron este efecto de combinación del compuesto 1 con etopósido en condiciones comparables (figura 13). No se observó ningún efecto de combinación significativo del compuesto 1 junto con cisplatino en la viabilidad de NCI-H460 (figuras 10).

Ejemplo 6 (información de antecedentes)

Los efectos sobre el crecimiento celular del tratamiento con etopósido en combinación con el compuesto 1 se analizaron en un panel de las siguientes líneas celulares: A110L, A-427, A529L, A549, BEN, CACO<2>, CALU-1, Calu-3, CALU6, COLO205, COLO-677, COLO678, COLO-699, COR-L311, COR-L88, DLD1, DMS 114, DMS 153, DMS 454, DMS 53, DV-90, EBC-1, EPLC-272H, H-2171, H69V, HCC-15, HCC2935, HCC-366, HCC-44, HCC-827, HCT116, HCT15, HLC-1, HLF-a, H-MESO-1, HT29, IA-LM, IMR90, JU77, LC-2/ad, LK-2, LO68, LOVO, LS123, LS411N, LU65, Lu99B, LUDLU-1, LXF-289, MIAPACA2, MS-1, MSTO-211H, NCI-H1048, NCI-H1105, NCI-H1299, NCI-H146, NCI-H1563, NCI-H1568, NCI-H1573, NCI-H1581, NCI-H1651, NCI-H1694, NCI-H1734, NCI-H1755, NCI-H1792, NCI-H1838, NCI-H1869, NCI-H1876, NCI-H1882, NCI-H1915, NCI-H196, NCI-H1975, NCI-H2029, NCI-H2030, NCI-H2066, NCI-H2073, NCI-H2081, NCI-H2085, NCI-H211, NCI-H2110, NCI-H2122, NCI-H2126, NCI-H2141, NCI-H2170, NCI-H2172, NCI-H2196, NCI-H226, NCI-H2286, NCI-H2291, NCI-H23, NCI-H2342, NCI-H2347, NCI-H2405, NCI-H2444, NCIH292, NCIH358M, NCI-H446, NCIH460, NCI-H508, NCI-H520, NCI-H522, NCI-H524, NCI-H596, NCI-H647, NCI-H661, NCI-H69, NCI-H774, NCIH82, NCI-H841, NGP, PC-9, RKO, SCLC-21 h, SHP-77, SK-CO-1, SK-MES-1, SNU-C1, SW1116, SW1417, SW1463, SW48, SW620, SW837, SW 900, SW948, T3M-11, T3M-12, T84, A110L, A-427, A529L, A549, BEN, CACO2, CALU-1, Calu-3, CALU6, COLO205, COLO-677, COLO678, COLO-699, COR-L311, COR-L88, DLD1, DMS 114, DMS 153, DMS 454, DMS 53, DV-90, EBC-1, EPLC-272H, H-2171, H69V, HCC-15, HCC2935, HCC-366, HCC-44, HCC-827, HCT116, HCT15, HLC-1, HLF-a, H-MESO-1, HT29, IA-LM, IMR90, JU77, LC-2/ad, LK-2, LO68, LOVO, LS123, LS411N, LU65, Lu99B, LUDLU-1, LXF-289, MIAPACA2, MS-1, MSTO-211H, NCI-H1048, NCI-H1105, NCI-H1299, NCI-H146, NCI-H1563, NCI-H1568, NCI-H1573, NCI-H1581, NCI-H1651, NCI-H1694, NCI-H1734, NCI-H1755, NCI-H1792, NCI-H1838, NCI-H1869, NCI-H1876, NCI-H1882, NCI-H1915, NCI-H196, NCI-H1975, NCI-H2029, NCI-H2030, NCI-H2066, NCI-H2073, NCI-H2081, NCI-H2085, NCI-H211, NCI-H2110, NCI-H2122, NCI-H2126, NCI-H2141, NCI-H2170, NCI-H2172, NCI-H2196, NCI-H226, NCI-H2286, NCI-H2291, NCI-H23, NCI-H2342, NCI-H2347, NCI-H2405, NCI-H2444, NCIH292, NCIH358M, NCI-H446, NCIH460, NCI-H508, NCI-H520, NCI-H522, NCI-H524, NCI-H596, NCI-H647, NCI-H661, NCI-H69, NCI-H774, NCIH82, NCI-H841, NGP, PC-9, RKO, SCLC-21h, SHP-77, SK-CO-1, SK-MES-1, SNU-C1, SW1116, SW1417, SW1463, SW48, SW620, SW837, SW 900, SW948, T3M-11, T3M-12, y T84. Se compararon los efectos del tratamiento de combinación y monoterapia para los dos tejidos principales de origen, colon y pulmón, pero para algunos aspectos también se consideran los datos de las cuatro líneas celulares derivadas de pleura.

En general, la combinación de etopósido con el compuesto 1 demostró un incremento en la inhibición de crecimiento para las líneas celulares analizadas. Los efectos de la combinación son sinérgicos para la mayoría de las líneas celulares en la combinación con el compuesto 1.

A continuación se exponen detalles del protocolo de ensayo.

Se analizaron 128 líneas celulares con dosis variables de etopósido (2,44E-09M, 9,77E-09M, 3,91E-08M, 1,56E-07M, 6,25E-07M, 2,50E-06M, 1,00E-05M) y dosis fijas del compuesto 1 (0,3 qM). Los efectos de inhibición del crecimiento del agente individual, así como del tratamiento de combinación, se midieron por ONCOLEAD.

Los datos de inhibición del crecimiento en relación con un control no tratado se recibieron como medidas individuales y se han modelado como una curva de respuesta a la dosis de 4 parámetros utilizando el paquete DRC en R (1). Las concentraciones de inhibidor al 50% de inhibición del crecimiento (GI50) se obtuvieron utilizando el punto de cruce de la curva de respuesta a la dosis con el nivel de inhibición de crecimiento de 50%.

El área relativa por encima de la curva de respuesta a la dosis (relAOC o AOC) se obtuvo como el área por encima de la curva de respuesta a la dosis en el intervalo de dosis entre 1E-3M y 1E-10M.

Los efectos de la combinación de etopósido con el compuesto 1 se calcularon bajo el supuesto de modos de acción independientes de los compañeros de combinación. La sinergia del efecto de tratamiento se evaluó utilizando el modelo de independencia de BLISS (2) como el exceso promedio sobre la combinación lineal de los efectos de los tratamientos de monoterapia en los diferentes puntos de datos medidos. Las puntuaciones de sinergia fueron proporcionadas por ONCOLEAD.

Los efectos del tratamiento se resumen como área por encima de la curva de respuesta a la dosis (AOC) o como la concentración necesaria para alcanzar el 50% de inhibición del crecimiento con relación a las células de control (GI50). Se obtuvieron valores de AOC para 122 líneas celulares de los tres tejidos principales de origen, colon, pulmón y pleura. La sensibilidad contra el tratamiento de combinación es mayor en casi todos los casos (120/122), lo que se indica por barras rojas más largas en la gráfica de relación de AOC en la figura 14 (efecto antitumoral del compuesto 1 en combinación con etopósido en los paneles de líneas celulares de cáncer de pulmón y colonin vitro).La figura 15 representa el efecto antitumoral del compuesto 1 en combinación con etopósido en los paneles de líneas celulares de cáncer de pulmón y colonin vitro.

La mediana de concentración de etopósido necesaria para alcanzar GI50 se desplaza en líneas celulares de cáncer de pulmón de: 0,32qM para monoterapia a 0,04qM en combinación con el compuesto 1.

La concentración media de etopósido necesaria para alcanzar GI50 se desplaza en líneas celulares de cáncer de colon de 0,7 qM para monoterapia a 0,12qM en combinación con el compuesto 1.

La mediana de concentración de etopósido necesaria para alcanzar GI50 se desplaza en líneas celulares de mesotelioma de 1 qM para monoterapia a 0,11qM en combinación con el compuesto 1.

El desplazamiento de GI50 para los cuatro subtipos principales de tumores de pulmón, carcinoma de células pequeñas, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y carcinoma de células grandes en la combinación de etopósido con el compuesto 1, tanto los carcinomas de células escamosas como los de células grandes se sensibilizan igualmente al tratamiento de combinación. La combinación en esas dos indicaciones da por resultado una concentración 12,8 veces menor de etopósido necesaria para alcanzar GI50 cuando se administra en combinación con el compuesto 1.

Las puntuaciones de sinergia fueron proporcionadas por ONCOLEAD como exceso medio sobre la combinación lineal de los efectos de monoterapia sobre las mediciones individuales.

Las distribuciones de puntuación de sinergia para los tratamientos de combinación del compuesto 1 se muestran en la figura 16 como gráficas de dispersión de puntos de datos de líneas celulares individuales. Los niveles de sinergia dentro de 10% por encima o por debajo de los efectos de combinación lineal podrían verse como efecto 'cercano a lineal'.

Como se muestra en la figura 16, 15 de 20 colon, 2 de 4 pleura (no mostrado), y 58 de 97 líneas celulares de pulmón muestran un efecto sinérgico entre etopósido y compuesto 1. Las otras líneas celulares muestran un efecto de combinación lineal o casi lineal de aquellos dos compuestos.

Ejemplo 7 (información de antecedentes)

El compuesto 1 se evaluó para determinar el desplazamiento en la actividad de etopósido en múltiples líneas celulares de cáncer. El compuesto 1 se usó en solución de DMSO en las siguientes concentraciones: 150 nM, 300 nM, y 1pM. Se usó etopósido en solución de DMSO en las siguientes concentraciones: 10 pM, 2,5 pM, 630 nM, 156 nM, 39 nM, 9,8 nM, y 2,4 nM.

Las líneas celulares se compraron directamente de las colecciones de líneas celulares ATCC, NCI, CLS y DSMZ. Se preparó un banco maestro y alícuotas de trabajo. Las células utilizadas para el estudio de potenciaciónin vitroutilizando un panel de líneas celulares de 200+ habían experimentado menos de 20 pasajes. Para garantizar la ausencia de contaminación potencial o asignación incorrecta, todas las líneas celulares se probaron por análisis de STR. La ausencia de micoplasma y contaminación por SMRV se confirmó para todas las líneas celulares utilizadas en los estudios.

Las líneas celulares se cultivaron en los medios recomendados por los proveedores en la presencia de 100 U/ml de penicilina G y 100 pg/ml de estreptomicina suplementada con FCS al 10%. RPMl 1640 y DMEM se complementaron con L-glutamina 2 mM y piruvato de Na 1 mM.

El medio MEM de Earle tenía además 1% de NEAA. Algunas líneas celulares requirieron suplementos adicionales como suero de caballo al 2,5%, hidrocortisona, transferrina, beta-estradiol, se-lenita y 1 unidad/ml de insulina.

El medio RPMl se usó para cultivar las siguientes líneas celulares: 5637, 22RV1, 786O, A2780, A431, A549, ACHN, ASPC1, BT20, BXPC3, CAKI1, CLS439, COLO205, COLO678, DLD1, DU145, EFO21, EJ28, HCT15, HS578T, IGROV1, JAR, LOVO, MCF7, MDAMB231, MDAMB435, MDAMB436, MDAMB468, MHHES1, MT3, NCIH292, NCIH358M, NCIH460, NCIH82, OVCAR3, OVCAR4, PANC1005 (adición de insulina), PBMC, PC3, RDES, SF268, SF295, SKBR3, SKMEL28, SKMEL5, SKOV3, SW620, U2OS, UMUC3, UO31, GRANTA-519, SU-DHL-6, SU-DHL-10, RAMOS, MINO, HL-60, K-562, THP-1, L-363, WSU-NHL, y MV4-11. Las siguientes líneas celulares de cáncer de pulmón y colorrectal se cultivaron RPMI:

NCI-H23 NCI-H1838 NCI-H2347 LS411N H-2171 NCI-H2122 NCI-H1915 NCI-H1299 COR-L88 COLO-677 DV-90 NCI-H69 MS-1 NCI-H211 NCI-H524 SCLC-21h COR-L311 T3M-12 NCI-H146 NCI-H2030 NCI-H1792 HCC-44 H69V NCIH292 COLO678 NCI-H508 SNU-C1

El medio DMEM se utilizó para cultivar A204, A375, A673, C33A, CASKI, HCT116, HEPG2, HS729, HT29, J82, MG63, MIAPACA2 (adición de suero de caballo), PANC1, PLCPRF5, RD, SAOS2, SKLMS1, SKNAS, SNB75, T24, yTE671.

Se utilizó medio MEM de Earle para CACO2, CALU6, HEK293, HELA, HT1080, IMR90, JEG3, JIMT1, SKHEP1, SKNSH, y U87MG.

El medio DMEM/F12 se usó para NCI-H2066, NCI-H2029, NCI-H2444, H-MESO-1, NCI-H2085, LC-2/ad, DMS114, NCI-H2126, SW948, T84, NCI-H2405, SW1463, SW1116, A110L, T3M-11, JU77, NCI-H596, NCI-H1048, NCI-H226, NCI-H2073, HLF-a, NCI-H2342, NCI-H1734, NCI-H2196, DMS454, NCI-H1882, NCI-H1876, HCC2935, NCI-H2286, NCI-H2110, NCI-H2291, IA-LM, NCI-H1755, NCI-H522, SW1417, SW837, SW48, NCI-H520, COLO-699, BEN, NCI-H1573, NCI-H1975, NCI-H2170, HCC-827, LO68, NCI-H841, SHP-77, SW900, LXF-289, NCI-H661, NCI-H1581, HCC-15, SK-MES-1, NCI-H647, LUDLU-1, HLC-1, EBC-1, LU65, CALU-1, PC-9, A-427, LK-2, MSTO-211H, Lu99B, NCI-H2141, NCI-H1105, NCI-H774, NCI-H1694, NCI-H2081, NCI-H1869, Calu-3, EPLC-272H, HCC-366 ,DMS 53, NCI-H1651, NCI-H2172, NCI-H1563, NCI-H1568, NCI-H446, A529L, NCI-H196, DMS 153, y NGP.

Las células se cultivaron en una atmósfera de CO<2>al 5% en una incubadora NB-203-XXL (N-Biotec, Corea del Sur).

El crecimiento celular y el tratamiento se realizaron en placas de microtítulo de 96 pocillos CELLSTARMR (Greiner Bio-One, Alemania). Las células cosechadas de cultivos de fase exponencial por tripsinización o por división (en el caso de células que crecen en suspensión) se colocaron en placas en 90 pl de medio a densidades de siembra óptimas. La densidad de siembra óptima para cada línea celular se determinó para asegurar el crecimiento exponencial durante la duración del experimento. Todas las células que crecen sin agentes anticancerosos eran subconfluentes al final del tratamiento, como se determina por inspección visual.

Las diluciones de compuesto en DMSO se realizaron en placas de MTP de 0,5 ml de 96 pocilios (Greiner Bio-One, Alemania). Los compuestos entonces se diluyeron 1:100 en medio RPMI.

90 pl de células, después de un período de precrecimiento de 48 horas, se trataron al mezclar con 10 pl del medio que contenía el compuesto (lo que dio por resultado una concentración final de DMSO de 0,1%). Las células se dejaron crecer a 37°C durante 72 (o 120) horas.

Además, todos los experimentos contenían unas pocas placas con células que se analizaron inmediatamente después del período de recuperación de 48 horas. Estas placas contenían información sobre el número de células, Tz, en el tiempo cero (ver 3.5.1), es decir, antes del tratamiento, y sirvieron para calcular la citotoxicidad.

En el caso de la combinación, ambos agentes se mezclaron juntos en DMSO a volúmenes iguales, tal que la concentración final de DMSO fue de 0,2%.

Las mediciones se realizaron utilizando un protocolo de tinción de proteína total [Vichai y Kirtikara, 2006]. Las células se fijaron a la superficie por adición de TCA al 10% (para células de crecimiento adherentes) o TCA al 50% (para células de crecimiento semiadherentes o células que crecen en suspensión). Después de una hora de incubación a 4 °C, las placas se lavaron dos veces con 200 pl de agua desionizada y se secaron. Las células se tiñeron entonces con 100 pl de 0,04% p/v de SRB. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 30 min y se lavaron seis veces con ácido acético al 1% para remover la mancha no unida. Las placas se dejaron secar a temperatura ambiente y el SRB unido se solubilizó con 100 pl de base Tris 10 mM. La densidad óptica se midió a 492, 520 y 560 nm utilizando un lector de placas Deelux-LED96 (Deelux Labortechnik GmbH, Alemania).

Los cálculos de ajuste de curva no lineal se realizaron utilizando algoritmos y herramientas de visualización desarrolladas internamente. Los algoritmos son similares a aquellos descritos anteriormente [DeLean et al., 1978] y se complementaron con el error cuadrático medio o modelo de MSE.

Esto se puede comparar a aplicaciones comerciales, por ejemplo, el algoritmo "205" de XLfit (ID Business Solutions Ltd., Guildford, Reino Unido). Los cálculos incluyeron las curvas de respuesta a la dosis con la mejor línea de aproximación, un intervalo de confianza del 95% para el efecto del 50% (ver más abajo).

Una forma común de expresar el efecto de un agente anti-cáncer es medir la viabilidad celular y la supervivencia en la presencia del agente de prueba como % T/C x 100. La relación entre la viabilidad y la dosis se denomina curva de respuesta a la dosis. Dos valores principales se utilizan para describir esta relación sin necesidad de mostrar la curva: la concentración de agentes de prueba que da un valor de % T/C de 50%, o 50% de inhibición de crecimiento (IC50), y un valor de % T/C de 10%, o 90% de inhibición de crecimiento (IC90).

Usando estas mediciones, las respuestas celulares se pueden calcular para la inhibición incompleta del crecimiento celular (GI), la inhibición completa del crecimiento celular (TGI) y la pérdida neta de células (LC) debido a la actividad del compuesto. La inhibición de crecimiento del 50% (GI50) se calcula como 100 x [(Ti - Tz)/(C - Tz)] = 50. Esta es la concentración de fármaco que causa una reducción del 50% en comparación al incremento neto de proteína en las células de control durante el período de incubación del fármaco. En otras palabras, GI50 es IC50 corregido para el tiempo cero. De manera similar a IC90, los valores de GI90 calculados también se reportan para todos los compuestos probados. El TGI se calculó a partir de Ti = Tz. LC50, es la concentración de fármaco que provoca una reducción de 50% en la proteína medida al final del período de incubación del fármaco en comparación a esa del comienzo. Se calculó como 100 x [(Ti-Tz)/Tz] = -50.

La actividad de etopósido y compuesto 1 se investigó previamente en un panel de 81 líneas de células de cáncer que representan 17 tipos de tejido tumoral, más PBMC en reposo, no proliferantes (82 líneas celulares totales), que se utilizaron para detectar la actividad más allá de afectar la proliferación celular.

El etopósido mostró una actividad amplia, de más de 1000 veces, que varía de 30 nM en líneas celulares JEG3 a más de 10 pM, por ejemplo, JIMT1 y COLO678. Para 3 líneas celulares, los valores de GI50 solo se pudieron estimar por encima de 10 pM, y para 14 líneas celulares no se pudo registrar actividad por encima de 10 pM (incluyendo PBMC en reposo).

El compuesto 1 mostró un intervalo de actividad estrecho pero de más de 20 veces, de 500 nM en un conjunto de líneas celulares a más de 10 pM. Para algunas líneas celulares, los valores de GI50 sólo se pudieron estimar por encima de 10 pM. No se pudo detectar actividad en PBMC en reposo.

El efecto general de la combinación del compuesto 1 y etopósido se evaluó al comparar los valores de GI50 solos y en combinación. La adición del compuesto 1 incrementó significativamente tanto el intervalo de actividad como la potencia de etopósido en combinación. La tabla 3 resume la actividad de etopósido sola y en combinación con el compuesto 1. El * o * marcan las concentraciones probadas más bajas o más altas. Etopósido-compuesto 1-150nM y el etopósido-compuesto 1-1uM se probaron en un panel de 93 líneas celulares. Se probó el etopósidocompuesto 1-300 nM en un panel de 127 líneas celulares enriquecidas para líneas celulares de cáncer de pulmón y colorrectal y con 120 horas de tratamiento. En los paréntesis [] se muestran los resultados del tratamiento de 120 horas. Tanto uM como pM representan micromolar.

Tabla 3

Tabla 4 proporciona la potenciación de etopósido y compuesto 1 calculada como GI50 (panel de 93 líneas celulares .

Tabla 5 Potenciación de etopósido y compuesto 1 calculada como GI50 (panel de 127 líneas celulares)

Ejemplo 8

Fase Ib: Los sujetos recibirán el compuesto 1 en el nivel de dosis asignado. En el día 1 de cada ciclo, después de la ingesta oral del compuesto 1, se administrará primero cisplatino, seguido por etopósido. En todos los casos, el compuesto 1 se debe administrar aproximadamente 1,5 horas antes de la quimioterapia. En los días 2 y 3 de cada ciclo, el compuesto 1 debe tomarse por vía oral QD preferentemente por la mañana. La dosis del compuesto 1 se modificará de acuerdo con las reglas de incremento en las dosis descritas en este protocolo.

Se administrará cisplatino y etopósido de acuerdo con las directrices locales. Más comúnmente, el cisplatino se administra a 75 mg/m2 durante una infusión iv de 60 minutos el día 1, seguido por etopósido administrado a 100 mg/m2 durante una infusión iv de 60 minutos. En los días 2 y 3 de cada ciclo, el etopósido se puede administrar como ya sea infusión intravenosa u oral de acuerdo con las directrices locales.

Fase II: Los sujetos se aleatorizarán para recibir cisplatino y etopósido en combinación con placebo o compuesto 1 en la RP2D identificada en la parte de fase Ib del ensayo. En el día 1 de cada ciclo, después de la ingesta oral del compuesto 1/placebo, se administrará primero cisplatino, seguido por etopósido. En todos los casos, el compuesto 1 se debe administrar aproximadamente 1,5 horas antes de la quimioterapia. En los días 2 y 3 de cada ciclo, el compuesto 1 debe tomarse por vía oral QD preferentemente por la mañana. Se administrará cisplatino y etopósido de acuerdo con las directrices locales. Más comúnmente, cisplatino se administra a 75 mg/m2 durante una infusión iv de 60 minutos en el día 1 seguido por etopósido administrado a 100 mg/m2 durante una infusión iv de 60 minutos. En los días 2 y 3 de cada ciclo, el etopósido se puede administrar como ya sea infusión intravenosa u oral de acuerdo con las directrices locales.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES 1. El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

   para usarse en el tratamiento del cáncer de pulmón, en donde el tratamiento comprende administrar el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo tanto con etopósido como con cisplatino.
2. 2. Una combinación del compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

   y tanto con etopósido como con cisplatino para usarse en el tratamiento de cáncer de pulmón.