ES3039622T3

ES3039622T3 - Inhibitors of 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase for muscle regeneration

Info

Publication number: ES3039622T3
Application number: ES17760893T
Authority: ES
Inventors: Helen M Blau; Andrew Tri Van Ho; Adelaida R Palla
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2016-03-04
Filing date: 2017-03-03
Publication date: 2025-10-23
Anticipated expiration: 2037-03-03
Also published as: EP4538365A3; AU2017225999B2; CN116716241A; KR20180129804A; JP2022116259A; BR112018017228A2; JP2024116386A; WO2017152044A1; DK3423067T3; EP3423067A1; US20240415849A1; AU2017225999A1; JP2019513010A; KR102387896B1; EP3423067B1; CN109072186B; EP4538365A2; CN109072186A; AU2024278535A1; EP3423067A4

Abstract

Se proporcionan composiciones, métodos y kits para la proliferación de células musculares mediante la exposición de estas a un compuesto de prostaglandina E2 (PGE2) o a un compuesto que activa la señalización de PGE2. También se proporcionan métodos para la regeneración muscular en sujetos con atrofia, distrofia o lesión muscular mediante la administración de un compuesto de PGE2 solo o en combinación con células musculares aisladas. El compuesto de PGE2, en combinación con las células musculares aisladas, puede administrarse profilácticamente para prevenir enfermedades o afecciones musculares. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa para la regeneración muscular

Antecedentes de la invención

En los músculos esqueléticos, el envejecimiento conduce a un deterioro progresivo de la regeneración y a la pérdida de masa, fuerza y función muscular. La pérdida de la función muscular es un importante problema de salud pública que con frecuencia conduce a una grave pérdida de movilidad y a un deterioro de la calidad de vida en una población de edad cada vez más avanzada. Uno de los principales factores determinantes del declive funcional del músculo es el deterioro de la capacidad de las células madre del músculo esquelético (MuSC, por sus siglas en inglés) para regenerar el músculo después de una lesión aguda o un daño en el curso del envejecimiento. También es necesario aumentar la regeneración muscular en los músculos que han sufrido daño, lesión y/o atrofia debidos a, por ejemplo, inmovilización postoperatoria o desuso, cáncer y caquexia por VIH, distrofias musculares, lesiones agudas y envejecimiento. Las MuSC residentes son raras pero esenciales para el mantenimiento y la reparación del músculo, por ejemplo, el músculo esquelético, el músculo liso y el músculo cardíaco a lo largo de la edad adulta. Con el envejecimiento, el número de células madre funcionales disminuye y, por lo tanto, aumenta la necesidad de potenciar el número y la función de las MuSC.

La prostaglandina E2 (PGE2), también conocida como dinoprostona, se ha empleado en diversos entornos clínicos incluyendo para inducir el parto en mujeres y para aumentar el trasplante de células madre hematopoyéticas. La PGE2 puede usarse como agente anticoagulante y antitrombótico. También es bien conocida la función de la PGE2 como mediador lipídico que puede resolver la inflamación. Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), inhibidores de la COX-1 y/o la COX-2, suprimen la inflamación inhibiendo los prostanoides, principalmente a través de la biosíntesis de PGE2.

La PGE2 se sintetiza a partir de ácido araquidónico mediante las enzimas ciclooxigenasa (COX) y prostaglandina E sintasa. Los niveles de PGE2 están regulados fisiológicamente por la enzima degradadora de PGE2, 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH). La 15-PGDH cataliza la conversión inactivadora del 15-OH de PGE2 en un grupo 15-ceto.

Sigue existiendo una necesidad en la técnica para tratamientos eficaces para regenerar o rejuvenecer músculo dañado, deteriorado, disfuncional y/o atrofiado en un sujeto que lo necesite. La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas.

El documento US 2013/0331389 divulga métodos y composiciones que inducen, aumentan y/o potencian la diferenciación de células madre endógenas y células progenitoras en un sujeto para reponer cardiomiocitos lesionados o dañados. El documento US 5.833.978 divulga el pretratamiento de cultivos de mioblastos con factores de crecimiento o tróficos antes del trasplante para tratar una miopatía. Costamagnaet al.(2015)Current Gene Therapy,15, 348-363 describe células madre adultas para su uso con fines terapéuticos para tratar modelos animales de degeneración muscular crónica. Otiset al.(2005)Experimental Cell Research,310, 417-425 sugiere que la vía de la COX2 es crítica para la proliferación de mioblastos en respuesta al estiramiento. Moet al.(2012)Recent Patents in Biotechnology,6, 223-229 divulga aplicaciones clínicas y funciones en la diferenciación miogénica de la PGE2.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, péptido neutralizante o anticuerpo neutralizante que inactiva o bloquea la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) para su uso en la regeneración de una población de células musculares y el tratamiento del daño muscular, la lesión muscular o la atrofia muscular en un sujeto que lo necesite.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la siguiente descripción detallada y las figuras.

Breve descripción de los dibujos

LasFIG. 1A-1Hmuestran que el tratamiento transitorio con PGE2 promueve la proliferación de MuSC jóvenesin vitro.FIG. 1A:Niveles de PGE2 después de una lesión del músculo tibial anterior (TA) joven (notexina, NTX); los controles son TA contralaterales no lesionados sometidos a ensayo mediante ELISA; (n = 4 ratones por punto temporal).FIG. 1B:Expresión de enzimas sintetizadoras de PGE2(Ptges2yPtges)por MuSC después de una lesión por notexina mediante RT-qPCR, (n = 3 ratones por punto temporal).FIG. 1C:Aumento del número de MuSC después de 24 h de tratamiento con vehículo (-) o PGE2 (10 ng/ml), y posterior cultivo en hidrogel hasta el día 7 (tratamiento agudo); (n = 12 ratones en 4 experimentos independientes).FIG. 1D:Aumento del número de MuSC después del tratamiento transitorio de 24 h con vehículo (-) o PGE2 (10 ng/ml) en ausencia o presencia de antagonista de EP4 (ONO-AE3-208, 1 pM); (n = 9 ratones sometidos a ensayo en 3 experimentos independientes).

FIG. 1E-1G:Proliferación de MuSC nuligénicas para EP4. Se transdujeron MuSCEP4f/f(nuligénicas) con un vector lentivírico que codificaba GFP/luciferasa y se trataron con vector lentivírico que codificaba Cre (+Cre) o sin (-Cre; vector vacío) para suprimir alelos deEP4.Posteriormente, se trataron MuSC con vehículo (-) o PGE2 (10 ng/ml) durante 24 h y se cultivaron en hidrogeles durante tres días.FIG. 1E:Esquema que representa el análisis de MuSC nuligénicas para EP4.FIG. 1F:Número de MuSC nuligénicas para EP4; (n = 6 ratones en 2 experimentos independientes).FIG. 1G:Imagen representativa. Barra = 40 pm; GFP, verde; mCherry, rojo.FIG. 1H:Número de MuSC después del cultivo en medio desprovisto de carbón tratado con vehículo (-) o PGE2 (10 ng/ml) cada dos días durante 7 días sobre hidrogeles; (n = 3 ratones con 3 réplicas técnicas). *P < 0,05, **P < 0,001, ***P < 0,0005 ****p < 0,0001. Ensayo ANOVA con corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples(FIG. 1A, 1B, 1Dy1F);ensayo t pareado(FIG. 1C);ensayo de Mann-Whitney(FIG. 1H).Medias e.t.m. n.s., no significativo.

LasFIG.2A-2Jmuestran una respuesta aberrante de las MuSC envejecidas a la PGE2.FIG. 2A:Niveles de PGE2 después de una lesión de TA envejecido (notexina, NTX); los controles son TA contralaterales no lesionados sometidos a ensayo mediante ELISA; (n = 4 ratones por punto temporal).FIG. 2B:Niveles de PGE2 en TA de ratones jóvenes (n = 7) y envejecidos (n = 5) no lesionados, analizados mediante ELISA.FIG. 2C:Esquema que muestra el catabolismo de la PGE2 a través de la enzima degradadora 15-PGDH a su metabolito PGE inactivo, 13,14-dihidro-15-ceto PGE2 (PGEM).FIG. 2D:Niveles de PGEM cuantificados mediante espectrometría de masas; (n = 4 ratones por grupo de edad).FIG. 2E:Expresión de la enzima degradadora de PGE2 15-PGDH(Hpgd);(n = 3 ratones con 2 réplicas técnicas).FIG. 2F:Aumento del número de MuSC envejecidas después de un tratamiento agudo de 24 h con vehículo (-), PGE2 (10 ng/ml) o el inhibidor de la 15-PGDH, SW033291 (1 pM; SW) sometido a ensayo el día 7; (n = 15 ratones en 5 experimentos independientes).FIG. 2G:Número de MuSC envejecidas después del cultivo en medio desprovisto de carbón tratado con vehículo (-) o PGE2 (10 ng/ml) cada dos días durante 7 días sobre hidrogeles; (n = 3 ratones con 3 réplicas técnicas).FIG.2H:Esquema que representa los efectos de la PGE2 sobre las MuSC. La PGE2 actúa a través de la vía de señalización del receptor de EP4/AMPc (AMP cíclico) para promover la proliferación. En MuSC envejecidas, después del transporte intracelular por el PGT (Transportador de prostaglandinas), el catabolismo de la<p>GE2 está mediado por la 15-PGDH hasta la forma inactiva, PGEM.FIG.2I:Trayectorias desde un clon de MuSC envejecidas rastreadas mediante microscopía de lapso de tiempo durante 48 h en un micropocillo para control (izquierda) y después del tratamiento agudo con PGE2 (derecha). La trayectoria de la célula original y de cada una de sus células de progenie recién nacidas se representa con un color diferente.FIG. 2J:Cambio en los recuentos de células vivas de MuSC envejecidas (números) en clones rastreados mediante microscopía de lapso de tiempo para el control (izquierda, n = 32 clones) y después del tratamiento agudo con PGE2 (derecha, n = 45 clones). La proporción de células vivas en cada generación (G1-G6) en todos los puntos temporales se muestra como número de células normalizado con respecto a una población de partida de 100 MuSC individuales. El aumento porcentual en el recuento de células vivas fue del 4,0 % (control) y del 5,4 % (tratadas con PGE2) (paneles superiores). Cambio en los recuentos de células muertas de MuSC envejecidas (números) en clones rastreados mediante microscopía de lapso de tiempo para el control (izquierda) y después del tratamiento agudo con PGE2 (derecha). La proporción de células muertas en cada generación (G1-G6) en todos los puntos temporales se muestra como número de células normalizado con respecto a una población de partida de 100 MuSC individuales. El aumento porcentual en el recuento de células muertas fue del 1,0 % (control) y del 0,1 % (tratadas con PGE2) (paneles inferiores). *P < 0,05, **P < 0,001, ***P < 0,0005. Ensayo ANOVA con corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples(FIG. 2Ay2F);ensayo de Mann-Whitney(FIG. 2B, 2D, 2Ey2G).Medias ± e.t.m. n.s., no significativo.

LasFIG. 3A-3Dmuestran que el tratamiento agudo con PGE2 promueve el injerto y la regeneraciónin vivode MuSC.FIG. 3A:Injerto de MuSC jóvenes cultivadas marcadas con GFP/luc (250 células) aisladas de ratones transgénicos después del tratamiento agudo con vehículo (-) o PGE2 como se describe en laFIG. 1C.Esquema de trasplante (arriba). Señal de formación de imágenes de bioluminiscencia (BLI, por sus siglas en inglés) no invasiva medida como radiancia para cada TA; (n = 5 ratones por condición) (abajo).FIG. 3B:Injerto de MuSCEP4f/fmarcadas con GFP/lue (1.000 células) tratadas con Cre (+Cre) o sin (-Cre; vector vacío) en cultivo para eliminar alelos deEP4.Se transdujeron MuSCEP4f/fcon un vector lentivírico que codifica GFP/luciferasa para BLI. Esquema de trasplante (arriba). Señales de BLI post-trasplante (n = 5 ratones por condición (abajo).FIG. 3C:

Injerto de MuSC jóvenes recién seleccionadas y marcadas con GFP/luc (250 células) coinyectadas con vehículo (-) o dmPGE2. Esquema de trasplante (arriba). Señales de BLI post-trasplante; (n = 4 y n = 5 ratones tratados con vehículo y dmPGE2, respectivamente).FIG.3D:Injerto de MuSC envejecidas marcadas con GFP/lue (250 células) coinyectadas con vehículo (-) o dmPGE2; (n = 3 ratones por condición) (abajo). Se transdujeron MuSC envejecidas con un vector lentivírico que codifica GFP/luciferasa para BLI. Esquema de trasplante (arriba). Señales de BLI post trasplante expresadas como radiancia promedio (p s_1 cirr2 s r1). Imágenes de BLI representativas para cada condición. Barra = 5 mm(FIG. 3A-3D).Los datos son representativos de dos experimentos independientes. * P < 0,05, **P < 0,001 y ***P < 0,0005. Ensayo ANOVA para comparaciones de grupos y diferencia significativa para criterios de valoración mediante ensayo de Fisher. Medias e.t.m.

LasFIG. 4A-4Pmuestran que la inyección intramuscular de PGE2 sola promueve la expansión de MuSC, mejora la regeneración y aumenta la fuerza. Joven:(FIG. 4A-4D)Se inyectaron músculos t A de ratones jóvenes con vehículo (-) o dmPGE2 48 h después de una lesión post-cardiotoxina (CTX); (n = 3 ratones por condición).FIG.

4A:Esquema del procedimiento experimental (arriba). Sección transversal de TA representativa (abajo) con núcleos (DAPI; azul), tinción de LAMININA (verde) y PAX7 (rojo) 14 días después de una lesión por cardiotoxina. Las puntas de flecha indican MuSC PAX7+. Barra = 40 pm.FIG. 4B:Aumento de MuSC endógenas mediante inmunofluorescencia de células satélite que expresan PAX7 por cada 100 fibras en secciones transversales de TA de ratones jóvenes.FIG. 4C:Áreas de sección transversal de miofibras (CSA, por sus siglas en inglés) en TA jóvenes tratados con vehículo (-, barra blanca abierta) y dmPGE2 (barra azul rellena) cuantificadas usando los Algoritmos de Baxter para el Análisis de Miofibras.FIG. 4D:Distribución de fibras musculares pequeñas ( < 1000 |jm2 CSA) y grandes (>1000 jm 2 CSA).(FIG. 4E-4G)Aumento de MuSC endógenas sometido a ensayo mediante Pax7-luciferasa. Se trataron ratonespax7CreERT2;Rosa26-LSL-Lucintraperitonealmente con tamoxifeno (TAM), las TA se sometieron a una lesión por cardiotoxina (CTX), se inyectaron con vehículo (-) o dmPGE23 días después y se controlaron mediante BLI; (n = 3 ratones por condición).FIG. 4E:Esquema del procedimiento experimental.FIG. 4F:BLI (n = 3 ratones por condición).FIG. 4G:Imagen representativa de BLI. Barra = 5 mm. Envejecidos:(FIG. 4H-4K)Los TA de ratones envejecidos se trataronin vivocon vehículo (-) o tratamiento con dmPGE248 h después de una lesión por cardiotoxina (CTX); (n = 3 ratones por condición).FIG. 4H:Esquema del procedimiento experimental (arriba). Sección transversal representativa de TA (abajo) con núcleos (DAPI; azul), tinción de LAMININA (verde) y PAX7 (rojo) 14 días después de una lesión por cardiotoxina. Las puntas de flecha indican células madre musculares PAX7+. Barra = 40 jm .FIG. 4I:Aumento de MuSC endógenas como en laFIG.

4Bpara ratones envejecidos.FIG. 4J:Área de sección transversal de miofibras (CSA) como en laFIG. 4Cpara TA envejecidos.FIG. 4K:Distribución de CSA como en laFIG. 4Dpara TA envejecidos.(FIG. 4L-4P)Aumento de la fuerza en ratones envejecidos medidoin vivocomo fuerza contráctil muscular después de una carrera en cinta rodante cuesta abajo. Se sometió a los ratones a una carrera en cinta rodante cuesta abajo de 20° durante 2 semanas consecutivas y se evaluó la fuerza en la semana 5. Durante la primera semana, se inyectó el gastrocnemio (GA) medial y lateral de ratones envejecidos con vehículo (-) o dmPGE2. n = 10 u 8 réplicas biológicas para tratados con vehículo (-) o tratados con dmPGE2, respectivamente, con 5 réplicas técnicas cada una.FIG. 4L:Esquema experimental. Fuerza de contracción representativa(FIG. 4M)y fuerza tetánica(FIG. 4N). Se calcularon las fuerzas de contracción muscular específicas(FIG. 4O)y la fuerza tetánica muscular específica(FIG. 4P)normalizando la fuerza a las áreas de sección transversal fisiológicas (PCSA, por sus siglas en inglés). Ensayo t pareado(FIG. 4B, 4D, 4Iy4K);Ensayo ANOVA para la comparación de grupos y diferencia significativa para el criterio de valoración mediante ensayo de Fisher(FIG. 4F);ensayo de Mann-Whitney(FIG. 4Oy4P).

*P < 0,05, **P < 0,001 y ****p < 0,0001. Medias e.t.m.

LasFIG. 5A-5Kmuestran que la PGE2 promueve la expansión de MuSC.FIG. 5A:Niveles de PGE2 el día 3 después de una criolesión de músculos tibiales anteriores (TA) de extremidades posteriores de ratones jóvenes en comparación con controles no lesionados contralaterales, analizados mediante ELISA; (n = 4 ratones por punto temporal por condición).FIG. 5B:Imagen representativa de células madre musculares (MuSC) en división marcadas con EdU (rojo) durante 1 h después del tratamiento con PGE2 (10 ng/ml) durante 24 h (d0 a d1) o vehículo (-), y teñidas para MIOGENINA (verde). La barra representa 40 jm .FIG. 5C:Porcentaje de MuSC en división marcadas con EDU como en (b); (n = 6 ratones con 3 réplicas técnicas en dos experimentos independientes).FIG. 5D:Aumento de la proliferación medida mediante el ensayo de viabilidad metabólica VisionBlue después del tratamiento con vehículo (-) o dosis indicadas de PGE2 (1-200 ng/ml); (n = 6 ratones con 3 réplicas técnicas en dos experimentos independientes).FIG. 5E:Expresión de receptores de prostaglandinas(Ptger 1-4)por MuSC después de 24 h de tratamiento con vehículo (-) o PGE2; (n = 3 ratones con 2 réplicas técnicas).FIG. 5F:Aumento de los niveles de AMPc en las MuSC después de 1 h de tratamiento con PGE2 con respecto a los controles no tratados (-); (n = 6 ratones con 3 réplicas técnicas sometidas a ensayo en 2 experimentos independientes).FIG. 5G-5H:Expresión dePax7(f Ig . 5G)yMiogenina(FIG. 5H)por MuSC después de 24 h de tratamiento con vehículo (-) o PGE2; (n = 3 ratones con 2 réplicas técnicas).FIG. 5I-5J:Se transdujeron MuSCEP4f/fcon un vector lentivírico que codificaba GFP/luciferasa y se trataron con vector lentivírico que codificaba Cre (+Cre) o sin (-Cre; vector vacío) para suprimir alelos deEP4.Los gráficos de barras muestran el porcentaje de MuSC Cre(FIG. 5I)y MuSC GFP/Luc+(FIG. 5J).FIG. 5K:Imagen representativa de MuSC en cultivo de hidrogel después de 7 días en medio de mioblastos que contenía suero bovino fetal despojado de carbón suplementado con vehículo (-) o PGE2 (10 ng/ml) cada dos días. La barra representa 40 jm . *P < 0,05, **P < 0,001, ***P < 0,0005. Ensayo t pareado(FIG. 5A, 5E, 5Gy5H);ensayo de Mann-Whitney(FIG. 5C).

Medias e.t.m. n.s., no significativo.

LasFIG. 6A-6Cmuestran un análisis por espectrometría de masas de músculo joven y envejecido para detectar prostaglandinas y metabolitos de PGE2.FIG. 6A:Estructuras químicas, fórmula química, masa exacta y peso molecular de las prostaglandinas analizadas (PGE2, PGF2a y PGD2) y de los metabolitos de PGE2 (15-ceto PGE2 y 13,14-dihidro-15-ceto PGE2). Los patrones internos PGF2a-D9 y PGE2-D9 se añadieron a todos los patrones compuestos.FIG.6B:Se prepararon líneas de calibración para el análisis por cromatografía de líquidos- ionización por electronebulización-espectrometría de masas en tándem (CL-IEN-EM/EM) diluyendo las soluciones madre a concentraciones finales de 0,1 ng/ml a 500 ng/ml. Se muestran las ecuaciones de la curva patrón y los coeficientes de correlación para cada patrón.FIG. 6C:Cromatograma representativo. Los picos separados muestran una excelente resolución cromatográfica de las prostaglandinas analizadas y sus metabolitos. rps, recuentos por segundo.

LasFIG. 7A-7Gmuestran que las MuSC envejecidas aumentan la proliferación y la supervivencia celular en respuesta al tratamiento con PGE2.FIG. 7A-7C:Los niveles de ARNm medidos mediante qRT-PCR se normalizaron aGapdhpara MuSC jóvenes y envejecidas; (n = 3 ratones con 2 réplicas técnicas).FIG. 7A:

Transportador de prostaglandina (PGT) codificado por el genSlco2a1.FIG. 7B:Enzimas sintetizadoras de PGE2,PtgesyPtges2.FIG. 7C:Receptores EP1-4 codificados por los genesPtgerl-4.FIG. 7D:Niveles de ARNm dePax7en MuSC después de 24 h de tratamiento con vehículo (-) o tratamiento con PGE2; (n = 3 ratones con 2 réplicas técnicas).FIG. 7E:Clones de MuSC envejecidas individuales rastreados mediante microscopía de lapso de tiempo después del tratamiento agudo con vehículo (-; arriba) o PGE2 (abajo). Para cada clon se muestra el número resultante de células vivas (barra abierta) y muertas (barra negra) después de 48 h de rastreo de lapso de tiempo.FIG. 7F:Curva de proliferación de MuSC vivas envejecidas evaluadas mediante microscopía de lapso de tiempo para vehículo (-) o tratamiento transitorio con PGE2 durante 48 h.FIG. 7G:Análisis por citometría de flujo de Anexina V+ apoptótica en MuSC envejecidas después de 24 h de tratamiento con vehículo (-) o PGE2 y analizadas 7 días después de su crecimiento en hidrogeles; (n = 9 ratones en 3 experimentos independientes). Ensayo de Mann-Whitney(FIG. 7A-7D)y ensayo t pareado(FIG. 7G)a a = 0,05. Medias e.t.m. n.s., no significativo.

LasFIG. 8A-8Bmuestran los algoritmos de Baxter para el análisis de miofibras del área de sección transversal del músculo.FIG. 8A:Imágenes en sección transversal representativas de miofibras de tibial anterior de ratones jóvenes tratadosin vivocon vehículo (-) o PGE248 h después de una lesión por cardiotoxina (CTX). Las imágenes muestran la tinción con LAMININA, verde y DAPI, azul.FIG. 8B:Las imágenes de segmentación correspondientes de laFIG. 8Aanalizadas mediante los Algoritmos de Baxter para el Análisis de Miofibras para determinar el área de la sección transversal (CSA) de secciones tranversales de miofibras (abajo) en el día 14 después de la lesión. La barra representa 40 pm.

LasFIG. 9A-9Gmuestran que la supresión del receptor EP4 de PGE2 en MuSC disminuye la regeneración y la fuerza del músculo esquelético después de una lesión. Se sometieron a ensayo tibiales anteriores (TA) de ratones con inactivación condicional de EP4 específica de Pax7(Pax7CreERT2;EP4fl/fl)tratados con tamoxifeno 6(FIG. 9C-9D),21(FIG. 9By9E)y 14(FIG. 9Fy9G)días después de una lesión con notexina; (n = 3 ratones por condición).

FIG.9A:Esquema experimental.FIG.9B:Expresión dePtger4(receptor EP4) en MuSC seleccionadas (a7+ CD34+ lin-) de ratones control o KO (inactivación, del inglésknock-out)de EP4 después de la lesión.FIG. 9C:Sección transversal de TA representativa. DAPI, azul; Cadena pesada de miosina embrionaria (eMyHC, por sus siglas en inglés), rojo. Barra = 40 pm.FIG. 9D:Porcentaje de fibras eMyHC+.FIG. 9E:Áreas de sección transversal de miofibras (CSA) en TA de control y con inactivación de EP4 específica de Pax7.FIG. 9F:Fuerzas de contracción muscular y(FIG. 9G)fuerza tetánica muscular el día 14 después de una lesión con notexina. Ensayo de Mann-<Whitney>(F<i>G.9B, 9C, 9F<y 9G); Ensayo ANOVA para la comparación de grupos y diferencia significativa para>cada segmento mediante ensayo de Fisher(FIG. 9E).* P < 0,05, ***P < 0,0005 y ****p < 0,0001. Medias e.t.m.

LasFIG. 10A-10Cmuestran que el bloqueo de la señalización endógena de PGE2 en el músculo en un punto temporal temprano de la regeneración reduce la regeneración y la fuerza. MuSC endógenas sometidas a ensayo en ratonesPax7CreERT2;Rosa26-LSL-Luctratados con tamoxifeno (TAM) mediante formación de imágenes de bioluminiscencia (BLI) no invasiva después de la inyección con vehículo (-) o AINE (Indometacina) después de una lesión por cardiotoxina en el Tibial anterior (TA); (n = 3 ratones por condición).FIG. 10A:Esquema experimental.

FIG. lOB:BLI; (n = 3 ratones por condición).FIG. 10C:Fuerzas de contracción muscular el día 14 después de una lesión por notexina (n = 8 para los tratados con vehículo y 10 para los tratados con AINE). Ensayo ANOVA para la comparación de grupos y diferencia significativa para el criterio de valoración mediante ensayo de Fisher(FIG.

10B).Ensayo de Mann-Whitney(FIG. 10C).* P < 0,05, **P < 0,001, ***P < 0,0005 y ****P < 0,0001. Medias e.t.m.

Descripción detallada de la invención

I. Introducción

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la prostaglandina E2 (PGE2) puede mejorar la proliferación y la función de las células musculares. Por ello, en el presente documento se proporciona un compuesto, péptido neutralizante o anticuerpo neutralizante que inactiva o bloquea la 15-PGDH para su uso en la regeneración de una población de células musculares y el tratamiento del daño muscular, la lesión muscular o la atrofia muscular en un sujeto que lo necesite.

II. General

La puesta en práctica de esta invención utiliza técnicas habituales en el campo de la biología molecular. Los textos básicos que desvelan los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook y Russell,Molecular Cloning, A Laboratory Manual(3.a ed. 2001); Kriegler,Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(1990); yCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelet al.,eds., 1994)).

Para los ácidos nucleicos, los tamaños se proporcionan en kilobases (kb), pares de bases (pb) o nucleótidos (nt). Los tamaños ADN y/o ARN monocatenarios pueden proporcionarse en nucleótidos. Se trata de estimaciones derivadas de la electroforesis en gel de agarosa o acrilamida, de ácidos nucleicos secuenciados o de secuencias de ADN publicadas. Para las proteínas, los tamaños se expresan en kilodaltons (kDa) o en número de restos de aminoácidos. Los tamaños de las proteínas se estiman a partir de electroforesis en gel, de proteínas secuenciadas, de secuencias de aminoácidos derivadas o de secuencias de proteínas publicadas.

Los oligonucleótidos que no están disponibles en el mercado pueden sintetizarse químicamente, por ejemplo, de acuerdo con el método del triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage y Caruthers,Tetrahedron Lett.22:1859-1862 (1981), usando un sintetizador automatizado, como se describe en Van Devanteret al., Nucleic Acids Res.12:6159-6168 (1984). La purificación de los oligonucleótidos se realiza usando cualquier estrategia reconocida en la técnica, por ejemplo, electroforesis en gel de acrilamida nativa o cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de intercambio aniónico, como se describe en Pearson y Reanier,J. Chrom.255: 137-149 (1983).

III. Definiciones

Como se usan en el presente documento, los siguientes términos tienen los significados asignados a los mismos a menos que se especifique otra cosa.

Los términos "un", "una", o "el/la", como se usan en el presente documento, no sólo incluyen aspectos con un miembro, sino que también incluyen aspectos con más de un miembro. Por ejemplo, las formas en singular "un", "una", y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "el agente" incluye la referencia a uno o más agentes conocidos por los expertos en la materia y así sucesivamente.

La expresión "prostaglandina E2" o "PGE2" se refiere a la prostaglandina que puede sintetizarse a través del ácido araquidónico a través de las enzimas ciclooxigenasas (COX) y las prostaglandina E sintasas (PGES) terminales. La PGE2 desempeña una función en numerosas funciones biológicas, incluyendo la vasodilatación, la inflamación y la modulación de los ciclos de sueño/vigilia.

Las expresiones "agonista del receptor de prostaglandina E2" o "agonista del receptor de PGE2" se refieren a un compuesto químico, molécula pequeña, polipéptido, producto biológico, etc., que puede unirse y activar cualquier receptor de PGE2, estimulando de este modo la vía de señalización de la PGE2.

La expresión "compuesto que atenúa el catabolismo de la PGE2" se refiere a un compuesto químico, molécula pequeña, polipéptido, producto biológico, etc., que pueden reducir o disminuir la descomposición de la PGE2. En el contexto de la invención, un "compuesto que atenúa el catabolismo de la PGE2" se refiere a un compuesto, péptido neutralizante o anticuerpo neutralizante que inactiva o bloquea la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH).

La expresión "compuesto que neutraliza la inhibición de la PGE2" se refiere a un compuesto químico, molécula pequeña, polipéptido, producto biológico, etc., que puede bloquear o interferir con un inhibidor de la síntesis, la actividad, la secreción, la función y similares, de la PGE2.

El término "derivado", en el contexto de un compuesto, incluye, pero sin limitación, derivados de amida, éter, éster, amino, carboxilo, acetilo y/o alcohol de un compuesto dado.

La expresión "célula muscular derivada de célula madre embrionaria" o "célula muscular derivada de ESC" se refiere a una célula muscular que deriva de o se diferencia a partir de una célula madre embrionaria.

La expresión "célula muscular derivada de célula madre pluripotente inducida" o "célula muscular derivada de iPSC" se refiere a una célula muscular que deriva o se diferencia a partir de una célula madre pluripotente inducida.

El término "aislado", en el contexto de las células, se refiere a una única célula de interés o a una población de células de interés, al menos parcialmente aislada y/o purificada de otros tipos celulares u otro material celular con el que se encuentra de forma natural en el tejido de origen (por ejemplo, tejido muscular). Una población de células musculares está "aislada" cuando está al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos de aproximadamente el 98 % y, en determinados casos, al menos aproximadamente el 99 % libre de células que no son células musculares. La pureza puede medirse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante clasificación de células activada por fluorescencia.

El término "autólogo" se refiere a cualquier material (por ejemplo, una célula) derivado del mismo individuo al que posteriormente se le va a reintroducir.

El término "alógeno" se refiere a cualquier material (por ejemplo, una célula) derivado de un animal diferente de la misma especie que el individuo al que se le introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alógenos entre sí cuando los genes de uno o más locus no son idénticos. En algunos aspectos, el material alógeno de individuos de la misma especie puede ser suficientemente diferente genéticamente para interactuar antigénicamente.

Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a uno cualquiera de los siguientes: mejorar uno o más síntomas de la enfermedad; prevenir la manifestación de dichos síntomas antes de que ocurran; ralentizar o evitar por completo la progresión de la enfermedad (como puede evidenciarse por períodos más largos entre episodios de reaparición, ralentización o prevención del empeoramiento de los síntomas, etc.); potenciar el inicio de un período de remisión; ralentizar el daño irreversible provocado en la fase progresiva-crónica de la enfermedad (tanto en la fase primaria como en la secundaria); retardar el inicio de dicha fase progresiva; o cualquier combinación de los mismos.

El término "administrar", "administrando" o "administración" se refiere a los métodos que pueden usarse para permitir el suministro de agentes o composiciones tales como los compuestos y células que se describen en el presente documento a un sitio deseado de acción biológica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intravascular, intracardíaca, intratecal, intranasal, intradérmica, intravítrea y similares), inyección transmucosa, administración oral, administración en forma de supositorio y administración tópica. Un experto en la materia conocerá adicionalmente métodos para administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos y/o células que se describen en el presente documento para prevenir o aliviar uno o más síntomas asociados a una enfermedad o afección.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto, agente terapéutico (por ejemplo, células) y/o fármaco que sea suficiente para producir un efecto clínico beneficioso o deseado. Una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz puede basarse en factores individuales de cada paciente, incluyendo, pero sin limitación, la edad del paciente, el tamaño, el tipo o el alcance de la enfermedad, la fase de la enfermedad, la vía de administración de las células regenerativas, el tipo o el alcance de la terapia suplementaria utilizada, el proceso de la enfermedad en curso y el tipo de tratamiento deseado (por ejemplo, tratamiento agresivo frente a convencional). Las cantidades terapéuticamente eficaces de un compuesto o composiciones farmacéuticas, como se describen en el presente documento, puede estimarse inicialmente a partir de cultivos celulares y modelos animales. Por ejemplo, los valores de CI<50>determinados en métodos de cultivo celular pueden servir como punto de partida en modelos animales, mientras que los valores de CI<50>determinados en modelos animales pueden usarse para encontrar una dosis terapéuticamente eficaz en seres humanos.

La expresión "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador o diluyente que no provoca una irritación significativa a un organismo y no suprime la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado.

Los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documentos para referirse a un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, murinos, ratas, simios, seres humanos, animales de granja, animales de deporte y mascotas.

La expresión "exposición aguda", en el contexto de la administración de un compuesto, se refiere a una aplicación temporal o breve de un compuesto a un sujeto, por ejemplo, sujeto humano, o células. En algunas realizaciones, una exposición aguda incluye una única administración de un compuesto en el transcurso de un tratamiento o durante un período de tiempo prolongado.

La expresión "exposición intermitente", en el contexto de la administración de un compuesto, se refiere a la aplicación repetida de un compuesto a un sujeto, por ejemplo, sujeto humano, o células, en donde transcurre un período de tiempo deseado entre las aplicaciones.

La expresión "pauta aguda", en el contexto de la administración de un compuesto, se refiere a una aplicación temporal o breve de un compuesto a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, o a una aplicación repetida de un compuesto a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, en donde transcurre un período de tiempo deseado (por ejemplo, 1 día) entre aplicaciones. En algunas realizaciones, una pauta aguda incluye una exposición aguda (es decir, una dosis única) de un compuesto a un sujeto durante el curso del tratamiento o durante un período de tiempo prolongado. En otras realizaciones, una pauta aguda incluye la exposición intermitente (es decir, dosis repetidas) de un compuesto a un sujeto en el que transcurre un período de tiempo deseado entre cada exposición.

La expresión "exposición continua", en el contexto de la administración de un compuesto, se refiere a una aplicación repetida y crónica de un compuesto a un sujeto, por ejemplo, sujeto humano, o células, durante un período de tiempo prolongado.

La expresión "pauta crónica", en el contexto de la administración de un compuesto, se refiere a una aplicación repetida y crónica de un compuesto a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, a lo largo de un período de tiempo prolongado de manera que la cantidad o el nivel del compuesto sea sustancialmente constante a lo largo de un período de tiempo seleccionado. En algunas realizaciones, una pauta crónica incluye una exposición continua de un compuesto a un sujeto durante un período de tiempo prolongado.

Descripción detallada de las realizaciones

El sujeto tiene una afección o enfermedad asociada a un daño, lesión o atrofia muscular. La afección o enfermedad asociada a un daño, lesión o atrofia muscular puede seleccionarse del grupo que consiste en lesión muscular aguda, desgarro o traumatismo, lesión del tejido blando de la mano, distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de cinturas, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), distrofia muscular distal (DD), miopatías hereditarias, distrofia muscular miotónica (DMM), miopatías mitocondriales, miopatía miotubular (MM), miastenia grave (MG), insuficiencia cardíaca congestiva, parálisis periódica, polimiositis, rabdomiólisis, dermatomiositis, caquexia por cáncer, caquexia por SIDA, caquexia cardíaca, incontinencia urinaria inducida por estrés y sarcopenia.

En la invención, el compuesto que atenúa el catabolismo de la PGE2 comprende un compuesto, péptido neutralizante o anticuerpo neutralizante que inactiva o bloquea la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH).

La invención proporciona una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, péptido neutralizante o anticuerpo neutralizante que inactiva o bloquea la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) para su uso en un método de regeneración de una población de células musculares y tratamiento del daño muscular, la lesión muscular o la atrofia muscular en un sujeto que lo necesite. El método puede incluir administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto y un portador farmacéuticamente aceptable para aumentar la población de células musculares en el sujeto y/o para potenciar la función muscular en el sujeto.

En un aspecto relacionado, la invención estimula la proliferación y/o expansión de una población de células musculares en un sujeto que tiene una afección o enfermedad asociada a daño, lesión o atrofia muscular. El método puede incluir administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto y un portador farmacéuticamente aceptable para aumentar la población de células musculares en el sujeto y/o para potenciar la función muscular en el sujeto.

En algunas realizaciones, la población de células musculares comprende una población endógena de células musculares. En otras realizaciones, la población de células musculares comprende una población de células musculares aisladas que se ha administrado (por ejemplo, inyectado o trasplantado) al sujeto. En otras realizaciones más, la población de células musculares comprende tanto una población endógena de células musculares como una población de células musculares aisladas que se ha administrado al sujeto.

En algunas realizaciones, la afección o enfermedad asociada a un daño, lesión o atrofia muscular se selecciona del grupo que consiste en lesión muscular aguda o traumatismo, lesión del tejido blando de la mano, distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de cinturas, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), distrofia muscular distal (DD), miopatías hereditarias, distrofia muscular miotónica (DMM), miopatías mitocondriales, miopatía miotubular (MM), miastenia grave (MG), insuficiencia cardíaca congestiva, parálisis periódica, polimiositis, rabdomiólisis, dermatomiositis, caquexia por cáncer, caquexia por SIDA, caquexia cardíaca, incontinencia urinaria inducida por estrés y sarcopenia.

En algunas realizaciones, la población de células musculares comprende células musculares esqueléticas, células de músculo liso, células de músculo cardiaco, células musculares derivadas de células madre embrionarias, células musculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas, células musculares desdiferenciadas o una combinación de las mismas. En algunos casos, la población de células musculares comprende células madre musculares, células satélite, miocitos, mioblastos, miotubos, miofibras o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la etapa de administrar el compuesto comprende la administración oral, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intradérmica, subcutánea, intravenosa o intracardíaca. En algunos casos, el compuesto se administra de acuerdo con una pauta aguda. En determinadas instancias, la pauta aguda comprende una exposición aguda (por ejemplo, una única dosis) del compuesto al sujeto. En otras instancias, la pauta aguda comprende una exposición intermitente (es decir, dosis repetidas) del compuesto al sujeto. Como ejemplo no limitante, una pauta aguda de PGE2 puede comprender una serie de dosis intermitentes (por ejemplo, diarias) de PGE2 durante un período de tiempo deseado (por ejemplo, durante el transcurso de 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días).

En otras realizaciones, la etapa de administración comprende además administrar al sujeto una población de células musculares aisladas. La población de células musculares aisladas puede ser autóloga al sujeto. La población de células musculares aisladas puede ser alógena al sujeto. En algunas instancias, la población de células musculares aisladas se purifica sustancialmente o se purifica. En otras instancias, la población de células musculares aisladas se cultiva con el compuesto antes de ser administradas al sujeto. La etapa de cultivar la población de células musculares aisladas con el compuesto puede incluir la exposición aguda, intermitente o continua de la población de células musculares aisladas al compuesto. La administración de la población de células musculares aisladas puede comprender inyectar o trasplantar las células al sujeto. La población de células musculares aisladas y el compuesto pueden administrarse al sujeto concomitantemente. Como alternativa, la población de células musculares aisladas y el compuesto pueden administrarse al sujeto secuencialmente.

La invención proporciona una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, péptido neutralizante o anticuerpo neutralizante que inactiva o bloquea la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) para su uso en un método de regeneración de una población de células musculares y tratamiento del daño muscular, la lesión muscular o la atrofia muscular en un sujeto que lo necesite. El método puede incluir administrar al sujeto (i) una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto y un portador farmacéuticamente aceptable, y (ii) una población de células musculares aisladas, para prevenir o tratar la afección o enfermedad asociada al daño, lesión o atrofia muscular.

En un aspecto relacionado, la invención estimula la proliferación y/o expansión de una población de células musculares en un sujeto que tiene una afección o enfermedad asociada a daño, lesión o atrofia muscular mediante la administración al sujeto de (i) una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto y un portador farmacéuticamente aceptable, y (ii) una población de células musculares aisladas. En algunas realizaciones, la población de células musculares comprende una población endógena de células musculares. En otras realizaciones, la población de células musculares comprende la población de células musculares aisladas que se ha administrado (por ejemplo, inyectado o trasplantado) al sujeto. En otras realizaciones más, la población de células musculares comprende tanto una población endógena de células musculares como la población de células musculares aisladas que se ha administrado al sujeto. En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto comprende una cantidad que es suficiente para aumentar la población de células musculares endógenas en el sujeto y/o para aumentar la población de células musculares aisladas que se ha administrado al sujeto y/o para potenciar la función muscular en el sujeto.

En algunas realizaciones, la población de células musculares comprende células musculares esqueléticas, células de músculo liso, células de músculo cardiaco, células musculares derivadas de células madre embrionarias, células musculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas, células musculares desdiferenciadas o una combinación de las mismas. En algunos casos, la población de células musculares comprende células madre musculares, células satélite, miocitos, mioblastos, miotubos, miofibras o combinaciones de los mismos. La población de células musculares aisladas puede purificarse sustancialmente o purificarse.

En algunas realizaciones, la población de células musculares aisladas se cultiva con el compuesto antes de ser administradas al sujeto. En algunos casos, el cultivo de la población de células musculares aisladas con el compuesto comprende la exposición aguda, intermitente o continua de la población de células musculares aisladas al compuesto.

En algunas realizaciones, la población de células musculares aisladas es autóloga al sujeto. En otras realizaciones, la población de células musculares aisladas es alógena al sujeto.

La administración del compuesto puede ser administración oral, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intradérmica, subcutánea, administración intravenosa o intracardíaca. En algunos casos, el compuesto se administra de acuerdo con una pauta aguda. En determinadas instancias, la pauta aguda comprende una exposición aguda (por ejemplo, una única dosis) del compuesto al sujeto. En otras instancias, la pauta aguda comprende una exposición intermitente (es decir, dosis repetidas) del compuesto al sujeto. Como ejemplo no limitante, una pauta aguda de PGE2 puede comprender una serie de dosis intermitentes (por ejemplo, diarias) de PGE2 durante un período de tiempo deseado (por ejemplo, durante el transcurso de 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días). La administración de la población de células musculares aisladas puede incluir inyectar o trasplantar las células al sujeto. El compuesto y la población de células musculares aisladas pueden administrarse al sujeto concomitantemente. Opcionalmente, el compuesto y la población de células musculares aisladas pueden administrarse al sujeto secuencialmente.

En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto tiene o está en riesgo de tener la afección o enfermedad asociada al daño, lesión o atrofia muscular. En algunos casos, la afección o enfermedad asociada a un daño, lesión o atrofia muscular se selecciona del grupo que consiste en lesión muscular aguda o traumatismo, lesión del tejido blando de la mano, distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de cinturas, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), distrofia muscular distal (DD), miopatías hereditarias, distrofia muscular miotónica (DMM), miopatías mitocondriales, miopatía miotubular (MM), miastenia grave (MG), insuficiencia cardíaca congestiva, parálisis periódica, polimiositis, rabdomiólisis, dermatomiositis, caquexia por cáncer, caquexia por SIDA, caquexia cardíaca, incontinencia urinaria inducida por estrés y sarcopenia.

A. Regeneración de células musculares dañadas en un sujeto

Las composiciones que se proporcionan en el presente documento pueden usarse para regenerar o rejuvenecer un músculo en un sujeto, tal como un sujeto humano. La regeneración del músculo incluye formar nuevas fibras musculares a partir de células madre musculares, células satélite, células progenitoras musculares y cualquier combinación de las mismas. Las composiciones también son útiles para potenciar o aumentar la reparación y/o el mantenimiento musculares.

Los compuestos de PGE2 de la presente invención pueden administrarse a un sujeto que experimente degeneración o atrofia muscular. La atrofia muscular puede incluir la pérdida de masa y/o fuerza muscular. Puede afectar a cualquier músculo de un sujeto. En algunos casos, el sujeto que necesita las composiciones que se proporcionan en el presente documento presenta o experimenta pérdida muscular debido a, por ejemplo, la edad, la inactividad, una lesión, una enfermedad y cualquier combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, los compuestos pueden activar la proliferación de células musculares, la diferenciación y/o la fusión de las células musculares. En algunos casos, el tejido muscular se regenera. En otros casos, la función muscular (por ejemplo, la masa muscular, la fuerza muscular y/o la contracción muscular) se restablece o se potencia. En algunos casos, se mejoran la debilidad y la atrofia musculares.

El músculo dañado puede ser cualquier músculo del cuerpo, incluyendo, pero sin limitación, complejo de músculos pectorales, dorsal ancho, teres mayor y subescapular, braquiorradial, bíceps, braquial, pronador cuadrado, pronador redondo, flexor radial del carpo, flexor cubital del carpo, flexor superficial de los dedos, flexor profundo de los dedos, flexor corto del pulgar, oponente del pulgar, aductor del pulgar, flexor corto del pulgar, iliopsoas, psoas, recto abdominal, recto femoral, glúteo mayor, glúteo medio, isquiotibiales mediales, gastrocnemio, isquiotibiales laterales, mecanismo del cuádriceps, aductor largo, aductor corto, aductor mayor, gastrocnemio medial, gastrocnemio lateral, sóleo, tibial posterior, tibial anterior, flexor largo de los dedos, flexor corto de los dedos, flexor largo del dedo gordo, extensor largo del dedo gordo, músculos de la mano, músculos del brazo, músculos del pie, músculos de la pierna, músculos pectorales, músculos del estómago, músculos de la espalda, músculos del glúteo, músculos del hombro, músculos de la cabeza y el cuello, músculos faciales, músculos oculofaríngeos y similares.

Los sujetos que necesitan regeneración muscular pueden tener lesiones musculoesqueléticas (por ejemplo, fracturas, distensiones, esguinces, lesiones agudas, lesiones por uso excesivo y similares), daños postraumáticos en las extremidades o la cara, lesiones deportivas, postfracturas en ancianos, lesiones del tejido blando de la mano, atrofia muscular (por ejemplo, pérdida de masa muscular), distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker, distrofia muscular congénita de Fukuyama (DMCF), distrofia muscular de cinturas (DMC), distrofia muscular congénita, distrofia muscular fascioescapulohumeral (DMFH), distrofia muscular miotónica, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular distal, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, miotonía congénita, distrofia miotónica, otras distrofias musculares, enfermedad de desgaste muscular, tal como caquexia debida al cáncer, enfermedad renal en fase terminal (ERFT), síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), debilidad muscular postquirúrgica, debilidad muscular postraumática, sarcopenia, inactividad (por ejemplo, desuso muscular o inmovilidad), deficiencia del esfínter uretral, deficiencia del esfínter uretral, enfermedades neuromusculares y similares.

Los ejemplos no limitantes de enfermedades neuromusculares incluyen, pero sin limitación, deficiencia de maltasa ácida, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Andersen-Tawil, distrofia muscular de Becker, miotonía congénita de Becker, miopatía de Bethlem, atrofia muscular bulboespinal, deficiencia de carnitina, deficiencia de carnitina palmitilo transferasa, enfermedad del núcleo central, miopatía centronuclear, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, distrofia muscular congénita, síndromes miasténicos congénitos, distrofia miotónica congénita, enfermedad de Cori, deficiencia de la enzima Debrancher, enfermedad de Dejerine-Sottas, dermatomiositis, distrofia muscular distal, distrofia muscular de Duchenne, distrofia miotónica, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, miopatías endocrinas, enfermedad de Eulenberg, distrofia muscular facioescapulohumeral, miopatía distal tibial, ataxia de Friedreich, distrofia muscular congénita de Fukuyama, glucogenosis de tipo 10, glucogenosis de tipo 11, glucogenosis de tipo 2, glucogenosis de tipo 3, glucogenosis de tipo 5, glucogenosis de tipo 7, glucogenosis de tipo 9, miopatía distal de Gowers-Laing, miositis con cuerpos de inclusión hereditaria, miopatía hipertiroidea, miopatía hipotiroidea, miositis con cuerpos de inclusión, miopatías hereditarias, distrofia muscular congénita con deficiencia de integrina, atrofia muscular espino-bulbar, atrofia muscular espinal, deficiencia de lactato deshidrogenasa, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, enfermedad de McArdel, distrofia muscular congénita con deficiencia de merosina, enfermedades metabólicas del músculo, miopatía mitocondrial, miopatía distal de Miyoshi, enfermedad de la motoneurona, enfermedad músculoojo-cerebro, miastenia grave, deficiencia de mioadenilato desaminasa, miopatía miofibrilar, deficiencia de miofosforilasa, miotonía congénita, distrofia muscular miotónica, miopatía miotubular, miopatía nemalínica, miopatía distal de Nonaka, distrofia muscular oculofaríngea, paramiotonía congénita, síndrome de Pearson, parálisis periódica, deficiencia de fosfofructocinasa, deficiencia de fosfoglicerato cinasa, deficiencia de fosfoglicerato mutasa, deficiencia de fosforilasa, polimiositis, enfermedad de Pompe, oftalmoplejía externa progresiva, atrofia muscular espinal, distrofia muscular congénita de Ullrich, miopatía distal de Welander, miopatía relacionada con ZASP y similares.

La atrofia muscular (por ejemplo, pérdida de masa muscular) puede estar provocada por o asociada a, por ejemplo, envejecimiento normal (por ejemplo, sarcopenia), anomalías genéticas (por ejemplo, mutaciones o polimorfismos de un solo nucleótido), mala alimentación, mala circulación, pérdida de soporte hormonal, desuso del músculo por falta de ejercicio (es decir, reposo en cama, inmovilización de un miembro con una escayola, etc.), envejecimiento, daños en el nervio que inerva el músculo, poliomielitis, esclerosis lateral amiotrófica (ELA o enfermedad de Lou Gehrig), insuficiencia cardíaca, hepatopatía, diabetes, obesidad, síndrome metabólico, enfermedades desmielinizantes (por ejemplo, esclerosis múltiple, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, encefalomielitis, neuromielitis óptica, adrenoleucodistrofia y síndrome de Guillian-Barre), denervación, fatiga, fatiga muscular inducida por el ejercicio, fragilidad, enfermedad neuromuscular, debilidad, dolor crónico y similares.

En algunos aspectos, en el presente documento se proporciona la regeneración del músculo en un sujeto que lo necesite mediante la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, péptido neutralizante o anticuerpo neutralizante que inactiva o bloquea la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) y un portador farmacéuticamente aceptable, para aumentar la población de células musculares y/o para potenciar la función muscular en el sujeto. La población de células musculares en el sujeto puede incluir células musculares esqueléticas, células de músculo liso, células de músculo cardiaco, células musculares derivadas de células madre embrionarias, células musculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas, células musculares desdiferenciadas o cualquier combinación de las mismas. Adicionalmente, las células musculares en el sujeto pueden ser células madre musculares, células satélite, miocitos, mioblastos, miotubos, miofibras o cualquier combinación de los mismos. El compuesto puede administrarse al sujeto mediante administración oral, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intradérmica, subcutánea, intravenosa o intracardíaca. En algunos casos, el compuesto se administra directamente al músculo disfuncional, lesionado, dañado y/o atrofiado. El compuesto puede administrarse de acuerdo con una pauta aguda (por ejemplo, dosificación única o intermitente) o una pauta crónica (por ejemplo, dosificación continua).

En algunas realizaciones, al sujeto también se le administra una población de células musculares aisladas (o aisladas y purificadas) que son autólogas o alógenas al sujeto. Las células pueden aislarse y/o purificarse mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia. Las células pueden ser una población homogénea o heterogénea de células musculares.

En algunas realizaciones, las células se estimulan para su proliferación cultivándolas con el compuesto de PGE2 antes de administrárselas al sujeto. Las células pueden exponerse al compuesto de forma aguda, intermitente o continua durante el cultivoin vitro.En algunos casos, la población de células musculares aumenta en al menos aproximadamente el 1 %, al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente el 500 %, al menos aproximadamente el 1000 % o más después del cultivo con el compuesto de PGE2.

Para regenerar o reparar el músculo en el sujeto, el compuesto y las células musculares aisladas se administran al sujeto concomitantemente. En algunas realizaciones, el compuesto y las células musculares cultivadas se administran al sujeto concomitantemente. En otras realizaciones, el compuesto y las células musculares aisladas se administran al sujeto secuencialmente. En otras realizaciones más, el compuesto y las células musculares cultivadas se administran al sujeto secuencialmente.

Las composiciones que se describen en el presente documento pueden usarse para aumentar el número de fibras musculares en al menos aproximadamente el 1 %, al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente el 500 %, al menos aproximadamente el 1000 % o más. En algunas realizaciones, las composiciones pueden aumentar el crecimiento de un músculo dañado, lesionado, atrofiado o degenerado.

B. Prevención o tratamiento de una afección o enfermedad muscular

Las composiciones que se proporcionan en el presente documento pueden usarse en métodos para prevenir o tratar una afección o enfermedad asociada a daño, lesión o atrofia muscular en un sujeto que lo necesite. El método puede proporcionar un tratamiento profiláctico a un sujeto susceptible de experimentar daño, lesión o atrofia muscular. En algunas realizaciones, el sujeto puede tener una afección o enfermedad con posibles síntomas secundarios que afecten al músculo. En otras realizaciones, el sujeto se ha sometido a una intervención quirúrgica o terapéutica para tratar la afección o enfermedad muscular y el método que se desvela en el presente documento se usa para prevenir o inhibir la reaparición o recaída. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una cualquiera de las afecciones o enfermedades que se describen en el presente documento que afectan al músculo.

Como se usan en el presente documento, el término "tratamiento" o "tratar" abarca la administración de compuestos y/o células en una forma apropiada antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad y/o después de las manifestaciones clínicas, u otras manifestaciones de la afección o enfermedad para reducir la gravedad de la enfermedad, detener la progresión de la enfermedad o eliminar la enfermedad. La expresión "prevención de" o "prevenir" una enfermedad incluye prolongar o retrasar la aparición de los síntomas de la afección o enfermedad, preferentemente en un sujeto con susceptibilidad aumentada a la afección o enfermedad.

El método puede incluir administrar al sujeto (i) una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, péptido neutralizante o anticuerpo neutralizante que inactiva o bloquea la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) y un portador farmacéuticamente aceptable, y (ii) una población de células musculares aisladas, para prevenir o tratar la afección o enfermedad asociada al daño, lesión o atrofia muscular. Las células musculares pueden ser autólogas o alógenas al sujeto.

El compuesto puede administrarse por vía oral, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía intraarterial, por vía intradérmica, por vía subcutánea, por vía intravenosa o por inyección intracardíaca. El compuesto puede administrarse de acuerdo con una pauta aguda (por ejemplo, dosificación única o intermitente) o una pauta crónica (por ejemplo, dosificación continua). Las células musculares aisladas pueden administrarse mediante inyección o trasplante. En algunas realizaciones, el compuesto y las células se administran juntos o concomitantemente. En otras realizaciones, el compuesto y las células se administran secuencialmente. En algunos casos, el compuesto se administra antes que las células. En otros casos, las células se administran antes que el compuesto.

Las células musculares aisladas pueden purificarse sustancialmente o purificarse antes de la inyección o el trasplante en el sujeto. Las células también pueden expandirse o estimularse para que proliferen en cultivo antes de su administración. Como se describen en el presente documento, las células musculares aisladas, incluyendo las células musculares esqueléticas, células de músculo liso, células de músculo cardiaco, células musculares derivadas de células madre embrionarias, células musculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas, células musculares desdiferenciadas, células madre musculares, células satélite, mioblastos, miocitos, miotubos, miofibras y cualquier combinación de los mismos, pueden cultivarse con los compuestos de la presente invención. Al exponer el compuesto a las células de forma aguda, de forma intermitente o de forma continua, las células musculares proliferan y aumentan en número. Las células expandidas pueden trasplantarse a un sujeto que experimenta lesión, lesión o atrofia muscular.

C. Compuestos

La composición comprende un compuesto, péptido neutralizante o anticuerpo neutralizante que inactiva o bloquea la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH)).

D. Células musculares aisladas

Las células musculares (miógenas) incluyen, pero sin limitación, células madre musculares, células madre del músculo esquelético, células madre del músculo liso, células madre del músculo cardíaco, células satélite musculares, células precursoras miógenas, células miógenas, miocitos, mioblastos, miotubos, miotubos postmitóticos, miofibras multinucleadas y fibras musculares postmitóticas. En algunas realizaciones, las células musculares aisladas abarcan células madre musculares. En otras realizaciones, las células musculares aisladas incluyen células satélite musculares. Las células musculares pueden derivar de una célula madre, tal como una célula madre derivada de la médula ósea, o de una célula madre pluripotente, tal como una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida. En algunas realizaciones, las células musculares aisladas incluyen células musculares desdiferenciadas. En otras realizaciones, las células musculares se han modificado genéticamente para, en algunos casos, corregir mutaciones genéticas asociadas a la enfermedad.

Las células satélite son pequeñas células progenitoras mononucleares que pueden residir dentro de tejido muscular. Estas células pueden ser inducidas a proliferar y diferenciarse en células musculares y, en algunas instancias, se fusionan con las fibras musculares. Durante lesiones o daños musculares, las células satélite quiescentes (por ejemplo, células satélite que no se están diferenciando ni están experimentando división celular en el presente) y las células madre musculares pueden activarse para proliferar y/o migrar fuera del nicho de células madre musculares. Las células satélite y las células madre musculares también pueden diferenciarse en miocitos, mioblastos u otros tipos de células musculares.

Se describen métodos y protocolos para generar células musculares a partir de células madre embrionarias, por ejemplo, en Hwanget al., PLoS One,2013, 8(8):e72023; y Darabiet al., Cell Stem Cell,2012, 10(5):610-9. Se describen métodos y protocolos para generar células musculares a partir de células madre pluripotentes inducidas, por ejemplo, en Darabiet al., Cell Stem Cell,2012, 10(5):610-9; Tanet al., PLoS One,2011; y Mizunoet al., FASEB J ,2010, 24(7):2245-2253.

En algunas realizaciones, las células musculares se obtienen mediante biopsia de un músculo tal como un músculo maduro o adulto, por ejemplo, cuádriceps, glúteo mayor, bíceps, tríceps o cualquier músculo de un individuo. El músculo puede ser un músculo esquelético, músculo liso o músculo cardíaco. Pueden encontrarse descripciones detalladas de métodos de aislamiento de células madre de músculo liso, por ejemplo, en el documento U.S. 8.747.838 y la Publicación de solicitud de patente de los EE. UU. N.° 20070224167. Se describen en detalle métodos de aislamiento de células musculares de interés tales como células madre musculares o células satélite de tejido muscular, por ejemplo, en Blanco-Boseet al., Exp. Cell Res.,2001, 26592:212-220.

Los métodos para purificar una población de células musculares de interés, por ejemplo, células madre musculares, células satélite musculares, miocitos, mioblastos, miotubos y/o miofibras incluyen seleccionar, aislar o enriquecer una célula que tiene un marcador de superficie celular específico o un polipéptido específico que se expresa en la superficie celular de la célula muscular de interés. Se describen marcadores de superficie celular útiles en, por ejemplo, Fukadaet al., Front. Physiol.,2013, 4:317. Pueden realizarse métodos de clasificación celular tales como citometría de flujo, por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés); separación celular por perlas magnéticas, por ejemplo, clasificación celular activada magnéticamente (MACS, por sus siglas en inglés) y otros métodos de clasificación celular basados en anticuerpos para aislar o separar las células musculares de interés de otros tipos celulares.

La población aislada de células musculares de interés puede expandirse o multiplicarse usando métodos basados en cultivos convencionales. Se encuentran métodos para cultivar células musculares en, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 5.324.656. En algunos casos, las células se cultivan en un armazón o gel tal como un hidrogel.

E. Métodos de administración

Los compuestos utilizados en la presente invención pueden administrarse por vía local en el sitio de la lesión o cerca de él, o por vía sistémica. En algunas realizaciones, los compuestos pueden administrarse, por ejemplo, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía intraarterial, por vía oral, por vía intravenosa, por vía intracraneal, por vía intratecal, por vía intramedular, por vía intralesional, por vía intranasal, por vía subcutánea, por vía intracerebroventricular, por vía tópica y/o por inhalación. El compuesto puede administrarse simultánea o secuencialmente con las células musculares de interés. Cuando el compuesto se administra simultáneamente con las células, tanto el compuesto como las células pueden administrarse en la misma composición. Cuando se administran por separado, el compuesto puede proporcionarse en un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el compuesto se administra antes o después de la administración de las células.

En algunas realizaciones, el compuesto se administra de acuerdo con una pauta aguda. En determinadas instancias, el compuesto se administra al sujeto una sola vez. En otras instancias, el compuesto se administra en un punto temporal dado y se administra de nuevo en un segundo punto temporal. En otras instancias más, el compuesto se administra al sujeto repetidamente (por ejemplo, una o dos veces al día) como dosis intermitentes durante un período de tiempo corto (por ejemplo, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, una semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, un mes o más). En algunos casos, el tiempo entre administraciones de compuesto es de aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, una semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, un mes o más. En otras realizaciones, el compuesto se administra de forma continua o crónica de acuerdo con una pauta crónica durante un período de tiempo deseado. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse de manera que la cantidad o el nivel del compuesto sea sustancialmente constante a lo largo de un período de tiempo seleccionado.

La administración de las células musculares aisladas a un sujeto puede lograrse mediante métodos generalmente utilizados en la técnica. En algunas realizaciones, la administración es por trasplante o inyección tal como inyección intramuscular. El número de células introducidas tendrá en cuenta factores tales como el sexo, la edad, el peso, el tipo de enfermedad o trastorno, la fase del trastorno, el porcentaje de las células deseadas en la población celular (por ejemplo, la pureza de la población celular) y el número de células necesario para producir el resultado deseado. Generalmente, para administrar las células con fines terapéuticos, las células se proporcionan a una dosis farmacológicamente eficaz. Por "cantidad farmacológicamente eficaz" o "dosis farmacológicamente eficaz" se entiende una cantidad suficiente para producir el efecto fisiológico deseado o una cantidad capaz de conseguir el resultado deseado, particularmente para tratar la afección o enfermedad, incluyendo reducir o eliminar uno o más síntomas o manifestaciones de la afección o enfermedad. Las dosis farmacológicamente eficaces también se aplicarán a los compuestos terapéuticos utilizados en combinación con las células, como se describe en el presente documento.

Las células pueden administrarse en una sola inyección o a través de inyecciones sucesivas a lo largo de un período de tiempo definido suficiente para generar un efecto terapéutico. Pueden inyectarse diferentes poblaciones de células musculares cuando el tratamiento implica inyecciones sucesivas. Puede usarse un portador farmacéuticamente aceptable, como se describe adicionalmente a continuación, para la inyección de las células en el sujeto. Éstas normalmente comprenden, por ejemplo, solución salina tamponada (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato) o medio de cultivo celular basal no suplementado o medio como se conoce en la técnica.

El compuesto y/o las células de la presente invención pueden inyectarse directamente en cualquier número de músculos del cuerpo, tales como, por ejemplo, el músculo bíceps; el músculo tríceps; el músculo braquiorradial; el músculo braquial (braquial anterior); los flexores de muñeca del compartimento superficial; el músculo deltoides; el bíceps femoral, el grácil, los músculos semitendinoso y los semimembranoso de los isquiotibiales; el recto femoral, músculos vasto lateral, vasto medial y vasto intermedio del cuádriceps; el gastrocnemio (lateral y medial), tibial anterior y los múculos sóleos de las pantorrillas; los músculos pectoral mayor y pectoral menor del tórax; el músculo dorsal ancho de la parte superior de la espalda; los romboides (mayor y menor); los músculos trapecios que abarcan el cuello, los hombros y la espalda; los músculos rectos abdominales del abdomen; y los músculos glúteo mayor, glúteo medio y glúteo menor de los glúteos.

F. Composiciones farmacéuticas

La composición farmacéutica utilizada en la presente invención puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable. En determinados aspectos, los portadores farmacéuticamente aceptables se determinan, en parte, por la composición particular que se administre, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia diversidad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (véase, por ejemplo,REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18.a Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)).

Como se usa en el presente documento, "portador farmacéuticamente aceptable" comprende cualquiera de los portadores convencionales farmacéuticamente aceptados conocidos por los expertos habituales en la materia para formular composiciones farmacéuticas. Por lo tanto, las células o los compuestos, por sí solos, tal como estando presentes como sales farmacéuticamente aceptables, o como conjugados, pueden prepararse como formulaciones en diluyentes farmacéuticamente aceptables; por ejemplo, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), etanol acuoso o soluciones de glucosa, manitol, dextrano, propilenglicol, aceites (por ejemplo, aceites vegetales, aceites animales, aceites sintéticos, etc.), celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato de calcio, gelatina, polisorbato 80 o similares, o como formulaciones sólidas en excipientes apropiados.

Las composiciones farmacéuticas con frecuencia comprenden además uno o más tampones (es decir, solución salina neutra tamponada o solución salina tamponada con fosfato), hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, etc.), bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, solutos que hacen que la formulación sea isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes, conservantes, agentes aromatizantes, agentes edulcorantes y compuestos colorantes, según proceda.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación y en dicha cantidad que será terapéuticamente eficaz. La cantidad que ha de administrarse depende de una diversidad factores, incluyendo, por ejemplo, la edad, el peso corporal, la actividad física y la dieta del individuo, la afección o enfermedad que ha de tratarse, y la fase o la gravedad de la afección o enfermedad. En determinadas realizaciones, el tamaño de la dosis también puede determinarse mediante la existencia, la naturaleza y la extensión de cualquier efecto secundario adverso que acompañe a la administración de uno o más agentes terapéuticos particulares en un individuo particular.

Se entenderá, sin embargo, que el nivel de dosis y la frecuencia de dosificación específicos para cualquier paciente particular puede variarse y dependerán de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese compuesto, la edad, el peso corporal, las características hereditarias, el estado de salud general, el sexo, la dieta, el modo y el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad de la afección particular y el hospedador que se somete a la terapia.

En determinadas realizaciones, la dosis del compuesto puede adoptar la forma de sólido, semisólido, polvo liofilizado o formas farmacéuticas líquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, píldoras, gránulos, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retención, cremas, pomadas, lociones, geles, aerosoles, espumas o similares, preferentemente en formas farmacéuticas unitarias adecuadas para la administración sencilla de dosificaciones precisas.

Como se usan en el presente documento, la expresión "forma farmacéutica unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para seres humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un agente terapéutico calculada para producir el inicio, la tolerabilidad y/o los efectos terapéuticos deseados, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado (por ejemplo, una ampolla). Además, pueden prepararse formas farmacéuticas más concentradas, a partir de las que después pueden producirse formas farmacéuticas unitarias más diluidas. Las formas farmacéuticas más concentradas contendrán por lo tanto sustancialmente más de, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces la cantidad del compuesto terapéutico.

Los expertos en la materia conocen métodos para preparar dichas formas farmacéuticas (véase, por ejemplo,REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,citado anteriormente). Las formas farmacéuticas incluyen normalmente un portador o excipiente farmacéutico convencional y pueden incluir adicionalmente otros agentes medicinales, portadores, adyuvantes, diluyentes, potenciadores de la permeabilidad de los tejidos, solubilizantes y similares. Los excipientes adecuados pueden adaptarse a la forma farmacéutica particular y la vía de administración mediante métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo,REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, citado anteriormente).

Los ejemplos de excipientes adecuados incluyen, pero sin limitación, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, solución salina, jarabe, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y ácidos poliacrílicos tales como los Carbopoles, por ejemplo, Carbopol 941, Carbopol 980, Carbopol 981, etc. Las formas farmacéuticas pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes; agentes de suspensión; agentes conservantes, tales como metil-, etil- y propilhidroxibenzoatos (es decir, los parabenos); agentes de ajuste del pH, tales como ácidos y bases inorgánicos y orgánicos; agentes edulcorantes; y agentes aromatizantes. Las formas farmacéuticas pueden comprender también perlas de polímeros biodegradables, dextrano y complejos de inclusión de ciclodextrina.

Para la administración oral, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser en forma de comprimidos, cápsulas, emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, pulverizaciones, pastillas para chupar, polvos y formulaciones de liberación sostenida. Los excipientes adecuados para la administración oral incluyen las calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.

La dosis terapéuticamente eficaz también puede proporcionarse en una forma liofilizada. Dichas formas farmacéuticas pueden incluir un tampón, por ejemplo, bicarbonato, para su reconstitución antes de la administración o el tampón puede incluirse en la forma farmacéutica liofilizada para su reconstitución con, por ejemplo, agua. La forma farmacéutica liofilizada puede comprender además un vasoconstrictor adecuado, por ejemplo, epinefrina. La forma farmacéutica liofilizada puede proporcionarse en una jeringa, opcionalmente envasada junto con el tampón para reconstituir, de manera que la forma farmacéutica reconstituida pueda administrarse inmediatamente a un individuo.

IV. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invención reivindicada. Sólo las secciones que implican el uso de un inhibidor de la 15-PGDH pertenecen a la invención.

Ejemplo 1: El suministro agudo de prostaglandina E2 aumenta la regeneración y la fuerza del músculo esquelético en ratones envejecidos.

Este ejemplo ilustra que la señalización de la PGE2 es necesaria para la función de las células madre musculares durante la regeneración.

Los ancianos experimentan un desgaste muscular esquelético progresivo y un fallo regenerativo que disminuye la movilidad y la calidad de vida12. Para la regeneración muscular son cruciales las células madre musculares adultas (MuSC) que residen en nichos de los tejidos musculares, preparadas para responder a los daños y reparar los músculos esqueléticos durante toda la vida3'8. Durante el envejecimiento, la proporción de MuSC funcionales disminuye notablemente, obstaculizando la regeneración muscular9-13. Hasta ahora, no existen agentes terapéuticos en uso clínico dirigidos a las MuSC para combatir este declive regenerativo. En el presente caso, los presentes inventores identificaron un inmunomodulador natural, la prostaglandina E2 (PGE2), como regulador potente de la función de las MuSC esencial para la regeneración muscular. Los presentes inventores descubrieron que el receptor de PGE2, EP4, es esencial para la proliferaciónin vitroy el injertoin vivoen ratones de MuSC. En MuSC de ratones envejecidos, la vía de la p GE2 está desregulada debido a un defecto molecular intrínseco de la célula, la enzima degradadora de prostaglandinas (15-PGDH) elevada que inactiva la PGE2. Este defecto se supera mediante la exposición aguda transitoria de las MuSC a una PGE2 estable resistente a la degradación, la 16,16-dimetil PGE2 (dmPGE2), concomitante con el trasplante de MuSC en músculos lesionados. De manera destacable, una única inyección intramuscular de dmPGE2 basta para acelerar la regeneración, lo que es evidente por un aumento temprano del número de MuSC endógenas y del tamaño de las miofibras después de la lesión. Asimismo, la capacidad de generación de fuerza de los músculos de ratones envejecidos aumentó en respuesta a la regeneración inducida por el ejercicio y a una pauta de tratamiento aguda con dmPGE2. Los hallazgos de los presentes inventores revelan una indicación terapéutica novedosa de la PGE2 como potente inductor de la regeneración y la fuerza musculares.

Para contrarrestar el declive del potencial regenerativo muscular, los presentes inventores buscaron agentes terapéuticos que se dirigieran a las MuSC, también conocidas como células satélite, una población de células madre dedicada a la regeneración muscular3-8. Puesto que una respuesta inflamatoria y fibroadipogénica transitoria desempeña una función crucial en la regeneración muscular14-17, los presentes inventores trataron de identificar moduladores inflamatorios inducidos por lesiones que pudieran superar el declive relacionado con la edad de la función de las MuSC. Un análisis de la base de datos de transcriptoma de los presentes inventores reveló que el receptorPtger4para PGE2, un mediador lipídico natural y potente durante la inflamación aguda18, se expresaba a niveles altos en MuSC recién aisladas. En lisados de tejido muscular, los presentes inventores detectaron un aumento de los niveles de PGE2 tres días después de la lesión de los músculos de ratones jóvenes (2-4 meses) mediante paradigmas de lesión convencionales que implicaban la inyección de notexina o la criolesión(FIG. 1AyFIG. 5A), y una regulación positiva concomitante de sus enzimas sintetizadoras,PtgesyPtges2(FIG. 1B). Esta ventana temporal temprana y transitoria coincide con la cinética bien documentada de la expansión de MuSC y la acumulación de citocinas inflamatorias después de la lesión81516. Para determinar si el tratamiento con PGE2 potenciaba el comportamiento de las MuSC, los presentes inventores purificaron por FACS las MuSC de músculos de las extremidades posteriores de ratones jóvenes (2-4 meses)6 y las colocaron en hidrogeles de 12 kpa de rigidez para mantener la función de las células madre19. Los presentes inventores descubrieron que la p GE2 (10 ng/ml) aumentaba la división celular sometida a ensayo mediante la incorporación de EDU(FIG. 1B-1D)y que una exposición aguda de 1 día a la PGE2 inducía un aumento de 6 veces en el número de MuSC con respecto a los controles una semana después(FIG. 1C).

Se sabe que la PGE2 señaliza a través de cuatro receptores acoplados a proteínas G (Ptger1-4; EP1-4)1820, pero no se ha descrito anteriormente la expresión de estos receptores en las MuSC. Un análisis de los niveles de transcripción de los diferentes receptores (Ptger1-4) reveló que los únicos receptores regulados positivamente después del tratamiento con PGE2 de las MuSC sonPtgerlyPtger4(FIG. 5E).Las MuSC estimuladas con PGE2 tenían un AMPc intracelular elevado1820 confirmando que la PGE2 señaliza a través de EP4 para promover la proliferación y un estado transcripcional de las células madre(FIG. 5F-5H). En presencia de un antagonista de EP4, ONO-AE3-208, la proliferación inducida por PGE2 se vio atenuada(FIG. 1D). Sin embargo, la especificidad de PGE2 para EP4 se demostró más claramente en MuSC que carecían del receptor después de la ablación condicional mediada por cre(FIG. 1E-1GyFIG. 5I-5J). De hecho, incluso en presencia de medios ricos en factores de crecimiento, estas MuSC nuligénicas para EP4 no proliferaron. Por último, los presentes inventores descubrieron que el crecimiento de las MuSC se detenía mediante la exposición a un medio con suero despojado de carbón21, dividido tras la adición de PGE2(FIG. 1HyFIG.5K). Por lo tanto, PGE2/EP4 destaca como necesaria y suficiente para la proliferación de MuSC.

Los presentes inventores intentaron determinar si la PGE2 podría mejorar los defectos regenerativos musculares anteriormente publicados para MuSC envejecidas9-13. A diferencia de los músculos de ratones jóvenes (2-4 meses), los daños provocados por la notexina en músculos envejecidos (18-20 meses) no condujeron a un aumento de la síntesis de PGE2. En cambio, los niveles de PGE2 en estado estacionario en el músculo envejecido permanecieron inalterados después de la lesión(FIG. 2A)y eran significativamente mayores que en los músculos tibiales anteriores (TA) de extremidades jóvenes(FIG. 2B). La hipótesis de los presentes inventores era que la PGE2 en el músculo envejecido podría ser disfuncional debido a un defecto catabólico. De hecho, cuando los presentes inventores analizaron la PGE2 presente en tejidos musculares de TA jóvenes y envejecidos mediante espectrometría de masas, descubrieron que la cantidad relativa de la forma inactiva, 13,14-dihidro-15-ceto PGE2 (PGEM), aumentó significativamente en los envejecidos(FIG. 2C-2DyFIG. 6A-6C).Esto se debió a un aumento concomitante de 7 veces en los niveles de ARNm que codifica la enzima degradadora de PGE2 (15-PGDH), la etapa inicial en la conversión de PGE2 en su forma inactiva(FIG. 2E).Por el contrario, los niveles relativos del transportador de prostaglandinas (PGT), las enzimas sintetizadoras de PGE2 y el receptor EP4 no difirieron entre MuSC jóvenes y envejecidas(FIG. 7A-7C). Adicionalmente, cuando las MuSC envejecidas se expusieron a un pulso de 1 día de PGE2 o a un inhibidor de la 15-PGDH (SW033291)22, se superaron los efectos de la 15-PGDH y se observó el aumento característico de la proliferación y el mantenimiento de la expresión de Pax7(FIG.2FyFIG.7D). Igual que las jóvenes, las MuSC envejecidas no consiguieron proliferar en un medio compuesto por suero despojado de carbón, pero se rescataron mediante la adición de PGE2 sola(FIG. 2G).Los presentes inventores supusieron que en las MuSC envejecidas, la vía de la PGE2 está desregulada debido a un defecto molecular intrínseco de la célula, 15-PGDH elevada que pueden ser superada en cultivo mediante exposición aguda a PGE2 o SW(FIG. 2H).

Puesto que las MuSC envejecidas son heterogéneas10, los presentes inventores buscaron determinar el efecto de la PGE2 a nivel unicelular. El análisis clonal puede revelar diferencias que quedan enmascaradas por el análisis de la población en su conjunto. En consecuencia, los presentes inventores realizaron una microscopía de lapso de tiempo a largo plazo en "micropocillos" de hidrogel de MuSC envejecidas expuestas transitoriamente a PGE2 durante 1 día y MuSC de control no tratadas. Los datos se recogieron durante un período de 48 h y después se analizaron usando los algoritmos de Baxter de los presentes inventores para el Rastreo celular y la Reconstrucción de linajes descritos anteriormente101923. Los presentes inventores observaron un aumento notable del número acumulado de células en respuesta a la PGE2, a lo largo de 6 generaciones para los clones más robustos(FIG. 2I-2J).Los números de células por clon después del tratamiento con PGE2 aumentaron significativamente debido a un marcado aumento de la proliferación(FIG. 2I-2JyFIG. 7E-7F)que se acompañó de una profunda reducción de la muerte celular(FIG. 2JyFIG. 7E-7G).Estos efectos sinérgicos condujeron a los aumentos observados en el número de MuSC envejecidas en respuesta a la PGE2.

Para someter a ensayo si el tratamiento transitorio de MuSC jóvenes con PGE2 aumenta la regeneración, los presentes inventores trasplantaron MuSC cultivadas y tratadas con PGE2 en músculos lesionados de las extremidades posteriores de ratones. Para controlar la dinámica de la regeneración a lo largo del tiempo de manera cuantitativain vivo,los presentes inventores capitalizaron un ensayo de formación de imágenes de bioluminiscencia (BLI) sensible y cuantitativo que habían desarrollado anteriormente para controlar la función de las MuSC después del trasplante61019. Se aislaron MuSC de ratones transgénicos jóvenes (2-4 meses) que expresaban GFP y luciferasa (ratones GFP/Luc), se expusieron a un tratamiento agudo de 1 día con PGE2, se recogieron y se trasplantaron el día 7. Se trasplantaron cantidades equivalentes de MuSC tratadas con dmPGE2 y de control (250 células) en miembros posteriores lesionados de ratones NOD-SCID jóvenes (2-4 meses). Después del tratamiento agudo con PGE2, la capacidad regenerativa de las MuSC jóvenes se potenció en un orden de magnitud cuando se evaluó mediante BLI(f Ig .3A).

Por el contrario, después del trasplante de un número 4 veces mayor de MuSC cultivadas que carecían del receptor EP4 debido a la ablación condicional(FIG.3B),la señal de BLI que se detectó inicialmente disminuyó progresivamente hasta niveles inferiores al umbral de significación(FIG. 3B).

Asimismo, cuando se realizó una lesión con notexina en el modelo en ratón de supresión específica de células madre musculares de EP4(Pax7CreERT2;EP4fm)(FIG. 9A-9B),la regeneración muscular se vio alterada, como se observó por el elevado número de fibras positivas para la cadena pesada de miosina embrionaria (eMHC)(FIG. 9C-9D).Esto se acompañó de la reducción del área de sección transversal de las fibras del ratón en el grupoPax7CreR12; EP4fl/f,evaluada al final del punto temporal de regeneración (día 21)(FIG.9E).También se detectó una reducción significativa del resultado de fuerza (tétanos) el día 14 después de la lesión(FIG. 9F-9G).Por lo tanto, la señalización de PGE2 a través del receptor EP4 es necesaria para la regeneraciónin vivode MuSC.

Para someter a ensayo si la inyección directa de PGE2 sin cultivo podría ser eficaz para promover la regeneraciónin vivo,los presentes inventores coinyectaron PGE2 junto con MuSC recién aisladas. Para todos los experimentos posteriores de inyecciónin vivo,los presentes inventores usaron una forma modificada y más estable de PGE2, la 16,16-dimetil PGE2 (dmPGE2)24. Los presentes inventores hipotetizaron que para los experimentos con MuSC envejecidas, la administración de la dmPGE2 modificada resistente a 15-PGDH era particularmente importante, ya que la 15-PGDH está significativamente elevada en las MuSC envejecidas(FIG. 2E)24. Usando dmPGE2, los presentes inventores observaron un injerto significativamente potenciado de MuSC jóvenes y envejecidas con respecto a los controles que aumentó adicionalmente en respuesta a la lesión por notexina, un ensayo riguroso bien aceptado de la función de las células madre(FIG. 3C-3D). Por lo tanto, el suministro de dmPGE2 junto con poblaciones de células MuSC basta para aumentar la regeneración.

Los presentes inventores postularon que el suministro de PGE2 sola podría estimular la regeneración muscular. Para someter a ensayo esto, se lesionaron músculos de ratones jóvenes con cardiotoxina y tres días después se inyectó un bolo de dmPGE2 en los músculos de las extremidades posteriores de ratones jóvenes. Los presentes inventores observaron un aumento (60 ± 15 %) de MuSC endógenas que expresaban PAX7 en el nicho clásico de células satélite debajo de la lámina basal y encima de las miofibras catorce días después de la lesión(FIG. 4A-4B),mientras que dmPGE2 no tenía ningún efecto en ausencia de lesión. Además, en este punto temporal temprano, la distribución de las miofibras se desplazó hacia tamaños más grandes, evaluados como área de sección transversal usando los Algoritmos de Baxter para el Análisis de Miofibras, lo que sugiere que la regeneración se ve acelerada por la PGE2(FIG. 4C-4DyFIG. 8A-8B).Además, los presentes inventores rastrearon la respuesta a la lesión y a la dmPGE2 de las MuSC endógenas mediante la expresión de luciferasa usando un modelo de ratón transgénico,Pax7creERT2,Rosa26-LSL-Luc(FIG. 4E).Los datos de BLI concordaban con los datos histológicos(FIG. 4F-4G).

Los presentes inventores sometieron a ensayo los efectos de inyectar indometacina, un antiinflamatorio no esteroideo (AINE) y un inhibidor de la COX2 que reduce la síntesis de PGE2, sobre la regeneración muscular. Tras la inyección de indometacina en los músculos de las extremidades posteriores del mismo modelo de ratónPax7creERT2;Rosa26-LSL-Luctres días después de la lesión por cardiotoxina, los presentes inventores observaron una disminución significativa de la actividad luciferasa indicativa de un deterioro de la activación y regeneración de las células madre musculares(FIG. 10A-10B).La inyección de indometacina en los músculos lesionados por cardiotoxina también provocó una pérdida significativa de la fuerza de contracción en comparación con el grupo de control evaluado el día 14 después de la lesión(FIG. 10C). En ratones envejecidos, los presentes inventores también detectaron un aumento sustancial (24 ± 2 %) del número de MuSC endógenas(FIG. 4H-4I), y un aumento concomitante de los tamaños de las miofibras(FIG.4J-4K)catorce días después de la lesión después de una única inyección de dmPGE2. Por lo tanto, la exposición exclusiva a dmPGE2 influye en la magnitud y el curso temporal de la reparación endógena.

Como la prueba definitiva, los presentes inventores determinaron si la regeneración potenciada por dmPGE2 podría conducir a un aumento de la fuerza muscular después de una lesión natural inducida por una carrera en cinta rodante cuesta abajo. En este escenario, el daño se provocó mediante una carrera diaria de 10 minutos en una cinta rodante cuesta abajo de 20 grados de inclinación25. Durante la primera semana, los ratones envejecidos del grupo de tratamiento corrieron durante 5 días seguidos y se les inyectó a diario dmPGE2 después del ejercicio. Durante la segunda semana, los ratones envejecidos del grupo de tratamiento corrieron durante 5 días consecutivos pero no recibieron ningún tratamiento adicional(FIG. 4L).Se compararon la fuerza de contracción y la fuerza tetánica específicas de los músculos gastrocnemios de ratón tratados con dmPGE2 y no tratados (GA) y ambas aumentaron significativamente(FIG. 4M-4P). Por lo tanto, una exposición aguda a dmPGE2 concurrente con una lesión inducida por el ejercicio puede conferir un aumento significativo de la fuerza del músculo envejecido.

Los presentes inventores han descubierto una nueva indicación para la PGE2 en la regeneración del músculo esquelético. Estudios anteriores sobre los efectos de la PGE2 sobre el músculo esquelético han demostrado que altera la proliferación, la fusión, la degradación de proteínas y la diferenciación de mioblastos en cultivo tisular26-30. Por lo tanto, estos estudios difieren del de los presentes inventores ya que los mioblastos son progenitores que han perdido la función de células madre. Las células satélite (MuSC) son cruciales para el desarrollo y la regeneración3-831 y su número aumenta al correr o con otro ejercicio de intensidad alta en ratones jóvenes y envejecidos y en seres humanos1532-36. Se ha publicado que los agentes antiinflamatorios no esteroideos atenúan el aumento de MuSC inducido por el ejercicio1532-16. Los datos de los presentes inventores aportan pruebas novedosas de que los efectos beneficiosos de la oleada transitoria temprana de inflamación que caracteriza la regeneración muscular eficaz15 se deben en parte a la PGE2 y a su receptor EP4, que son esenciales y suficientes para la proliferación y el injerto de las MuSC. En el caso de los tejidos hematopoyéticos, hepáticos y colónicos, recientemente se ha demostrado que el suministro del inhibidor de la 15-PGDH, SW033291, potencia la regeneración22. De manera destacable, la PGE2 y sus análogos se han utilizado con seguridad en pacientes humanos durante décadas, por ejemplo, para inducir el parto37 y para promover el trasplante de células madre hematopoyéticas38 allanando el camino para su uso clínico en el reestablecimiento de los músculos después de una lesión. En resumen, los hallazgos de los presentes inventores demuestran que una pauta aguda de p GE2 basta para potenciar de forma rápida y robusta la regeneración del daño inducido por el ejercicio y superar las limitaciones asociadas a la edad, lo que conduce a un aumento de la fuerza.

REFERENCIAS

1 Di Monaco, M., Vallero, F., Di Monaco, R. y Tappero, R.Prevalence of sarcopenia and its association with osteoporosis in 313 older women following a hip fracture. Archives of Gerontology and Geriatrics52, 71-74 (2010).

2 Ruiz, J. R.et al. Association between muscular strength and mortality in men: prospective cohort study.Bmj 337, a439, doi:10.1136/bmj.a439 (2008).

3 Chakkalakal, J. V., Jones, K. M., Basson, M. A. y Brack, A. S.The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature490, 355-360, doi:10.1038/nature11438 (2012).

4 Mauro, A.Satellite cell o f skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol9, 493-495 (1961).

5 Montarras, D.et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science309, 2064-2067, doi:10.1126/science.1114758 (2005).

6 Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S. y Blau, H. M.Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature456, 502-506, doi:10.1038/nature07384 (2008).

7 Kuang, S., Gillespie, M. A. y Rudnicki, M. A.Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell stem cell2, 22-31, doi:10.1016/j.stem.2007.12.012 (2008).

8 Shi, X. y Garry, D. J.Muscle stem cells in development, regeneration, and disease. Genes & development20, 1692-1708, doi:10.1101/gad.1419406 (2006).

9 Bernet, J. D.et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nature medicine20, 265-271, doi:10.1038/nm.3465 (2014).

10 Cosgrove, B. D.et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nature medicine20, 255-264, doi:10.1038/nm.3464 (2014).

11 Price, F. D.et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature medicine20, 1174-1181, doi:10.1038/nm.3655 (2014).

12 Sousa-Victor, P.et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature506, 316-321, doi:10.1038/nature13013 (2014).

13 Tierney, M. T.et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nature medicine20, 1182-1186, doi:10.1038/nm.3656 (2014).

14 Arnold, L.et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. The Journal of experimental medicine204, 1057-1069, doi:10.1084/jem.20070075 (2007).

15 Chazaud, B.Inflammation during skeletal muscle regeneration and tissue remodeling: application to exerciseinduced muscle damage management. Immunol Cell Biol94, 140-145, doi:10.1038/icb.2015.97 (2016).

16 Joe, A. W.et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature cell biology12, 153-163, doi:10.1038/ncb2015 (2010).

17 Tidball, J. G.Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration. Compr Physiol1, 2029-2062, doi:10.1002/cphy.c100092 (2011).

18 Ricciotti, E. y FitzGerald, G. A.Prostaglandins and Inflammation. Arteriesclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology31, 986-1000 (2011).

19 Gilbert, P. M.et al. Substrate elasticity regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture. Science329, 1078-1081, doi:10.1126/science.1191035 (2010).

20 Korotkova, M. y Lundberg, I. E.The skeletal muscle arachidonic acid cascade in health and inflammatory disease. Nature reviews. Rheumatology10, 295-303, doi:10.1038/nrrheum.2014.2 (2014).

21 Smethurst, M. y Williams, D. C.Levels of prostaglandin E and prostaglandin F in samples of commercial serum used for tissue culture. Prostaglandins13, 719-722 (1977).

22 Zhang, Y.et al. Inhibition of the prostaglandin-degrading enzyme 15-PGDH potentiates tissue regeneration. Science348, aaa2340 (2015).

23 Magnusson, K. E., Jalden, J., Gilbert, P. M. y Blau, H. M.Global linking of cell tracks using the Viterbi algorithm. IEEE transactions on medical imaging34, 911-929, doi:10.1109/TMI.2014.2370951 (2015).

24 Ohno, H., Morikawa, Y. y Hirata, F.Studies on 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase with various prostaglandin analogues. Journal of biochemistry84, 1485-1494 (1978).

25 Sacco, A.et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell143, 1059-1071, doi:10.1016/j.cell.2010.11.039 (2010).

26 Baracos, V., Rodemann, H. P., Dinarello, C. A. y Goldberg, A. L.Stimulation of muscle protein degradation and prostaglandin E2 release by leukocytic pyrogen (interleukin-1). A mechanism for the increased degradation of muscle proteins during fever. The New England journal of medicine308, 553-558, doi:10.1056/NEJM198303103081002 (1983).

27 Beaulieu, D.et al. Abnormal prostaglandin E2 production blocks myogenic differentiation in myotonic dystrophy. Neurobiology of disease45, 122-129, doi:10.1016/j.nbd.2011.06.014 (2012).

28 Mo, C., Romero-Suarez, S., Bonewald, L., Johnson, M. y Brotto, M.Prostaglandin E2: from clinical applications to its potential role in bone- muscle crosstalk and myogenic differentiation. Recent patents on biotechnology6, 223 229 (2012).

29 Mo, C.et al. Prostaglandin E2 promotes proliferation of skeletal muscle myoblasts via EP4 receptor activation. Cell cycle14, 1507-1516, doi:10.1080/15384101.2015.1026520 (2015).

30 Rodemann, H. P. y Goldberg, A. L.Arachidonic acid, prostaglandin E2 and F2 alpha influence rates of proteinturnover in skeletal and cardiac muscle. J Biol Chem 257,1632-1638 (1982).

31 Pawlikowski, B., Pulliam, C., Betta, N. D., Kardon, G. y Olwin, B. B.Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal muscle5, 42, doi:10.1186/s13395-015-0067-1 (2015).

32 Crameri, R. M.et al. Changes in satellite cells in human skeletal muscle after a single bout of high intensity exercise. The Journal of physiology558, 333-340, doi:10.1113/jphysiol.2004.061846 (2004).

33 Darr, K. C. y Schultz, E.Exercise-induced satellite cell activation in growing and mature skeletal muscle. Journal of applied physiology63, 1816-1821 (1987).

34 Dreyer, H. C., Blanco, C. E., Sattler, F. R., Schroeder, E. T. y Wiswell, R. A.Satellite cell numbers in young and older men 24 hours after eccentric exercise. Muscle y nerve33, 242-253, doi:10.1002/mus.20461 (2006).

35 Mackey, A. L.et al. The influence of anti-inflammatory medication on exercise-induced myogenic precursor cell responses in humans. Journal of applied physiology103, 425-431, doi:10.1152/japplphysiol.00157.2007 (2007).

36 Paulsen, G., Mikkelsen, U. R., Raastad, T. y Peake, J. M.Leucocytes, cytokines and satellite cells: what role do they play in muscle damage and regeneration following eccentric exercise ? Exercise immunology review18, 42-97 (2012).

37 Thomas, J., Fairclough, A., Kavanagh, J. y Kelly, A. J.Vaginal prostaglandin (PGE2 and PGF2a) for induction of labour at term. The Cochrane database of systematic reviews6, CD003101, doi:10.1002/14651858.CD003101.pub3 (2014).

38 North, T. E.et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature447, 1007-1011 (2007).

MÉTODOS

Ratones

Los presentes inventores realizaron todos los experimentos y protocolos de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Stanford y el Panel Administrativo sobre el Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC, por sus siglas en inglés). Los presentes inventores obtuvieron ratones C57BL/6 de tipo silvestre envejecidos (18-20 meses) del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los EE. UU. (NIA, por sus siglas en inglés) para estudios de envejecimiento muscular y ratones C57BL/6 de tipo silvestre jóvenes del Laboratorio Jackson. Se generaron ratones doblemente transgénicos GFP/luc como se ha descrito anteriormente1. Resumiendo, en la cepa FVB se mantuvieron ratones que expresaban un transgén de luciferasa de luciérnaga (luc) bajo la regulación del promotor ubicuo Actb. En la cepa C57BL/6 se mantuvieron ratones que expresaban un transgén de proteína verde fluorescente (GFP) bajo la regulación del promotor ubicuo UBC. Los presentes inventores usaron células de GFP/luc para experimentos de trasplante alógeno en ratones receptores NOD-SCID (Jackson Laboratory). Los ratonesEP4fiox/flox (EP4f/f)fueron un amable obsequio de K. Andreasson (Universidad de Stanford)2. Se generaron ratones doblemente transgénicosPax7CreERT2;Rosa26-LSL-Luccruzando ratonesPax7CreERT2obtenidos de Jackson Laboratory (N.° de inventario 017763)3 yRosa26-LSL-Lucobtenidos de Jackson Laboratory (N.° de inventario 005125)4. Los presentes inventores validaron estos genotipos mediante estrategias adecuadas basadas en PCR. Todos los ratones procedentes de cepas transgénicas eran de corta edad. Los ratones jóvenes tenían 2-4 meses de edad y los envejecidos 18-20 meses de edad para todas las cepas. Todos los ratones utilizados en estos estudios eran hembras.

Aislamiento de células madre musculares

Los presentes inventores aislaron y enriquecieron células madre musculares como se ha descrito anteriormente156. Resumiendo, una digestión suave con colagenasa y el picado mediante el Disociador de MAC permitieron disociar numerosas fibras individuales, seguido de digestión con dispasa para liberar las células mononucleadas de sus nichos. Posteriormente, se agotaron de la mezcla celular las células que expresaban el linaje hematopoyético y las células no musculares (CD45'/CD11b'/CD31') usando una columna de perlas magnéticas (Miltenyi). Después, la mezcla celular restante se sometió a un análisis por FACS para clasificar las MuSC que coexpresaban los marcadores CD34 y a7-integrina. Los presentes inventores generaron y analizaron gráficos de dispersión de citometría de flujo usando FlowJo v10.0. Para cada clasificación, los presentes inventores agruparon MuSC (~5.000 cada una) de al menos tres ratones hembra donantes independientes.

Trasplante de células madre musculares

Los presentes inventores trasplantaron 250 MuSC (Fig. 3a, 3c y 3d) o 1.000 MuSC (Fig. 3b) inmediatamente después del aislamiento por FACS o después de la recogida del cultivo celular directamente en los músculos tibiales anteriores (TA) de ratones receptores como se ha descrito anteriormente156. Para estudios de MuSC jóvenes, los presentes inventores trasplantaron células de ratones GFP/luc (2-4 meses de edad) a ratones NOD-SCID irradiados en la extremidad posterior. Para estudios de MuSC envejecidas, los presentes inventores trasplantaron células de ratones C57BL/6 envejecidos (18-20 meses, NIH) que se transdujeron con un lentivirus luc-IRES-GFP (virus GFP/luc) el día 2 de cultivo durante un período de 24 h antes del trasplante, como se ha descrito anteriormente5 (véase a continuación la sección "Cultivo, tratamiento e infección lentivírica de células madre musculares" para más detalles). Antes del trasplante de células madre musculares, los presentes inventores anestesiaron ratones receptores NOD-SCID con ketamina (2,4 mg por ratón) mediante inyección intraperitoneal. Después, los presentes inventores irradiaron los miembros posteriores con una única dosis de 18 Gy, con el resto del cuerpo protegido en una plancha de plomo. Los presentes inventores realizaron trasplantes dentro de los 2 días siguientes a la irradiación.

Las células cultivadas se trataron como se indica (tratadas con vehículo o PGE2 10 ng/ml) y se recogieron de los cultivos en hidrogel mediante incubación con tripsina al 0,5 % en PBS durante 2 min a 37 °C y se contaron usando un hemocitómetro. Los presentes inventores resuspendieron las células a las concentraciones celulares deseadas en gelatina/PBS al 0,1 % y, después, las trasplantaron (250 MuSC por TA) mediante inyección intramuscular en los músculos TA en un volumen de 10 pl. Para el trasplante de MuSC frescas, los presentes inventores coinyectaron las células seleccionadas con 13 nmol de 16,16-dimetil prostaglandina E2 (dmPGE2) (Tocris, N.° de catálogo 4027) o vehículo de control (PBS). Los presentes inventores compararon células de diferentes condiciones mediante trasplante en los músculos TA de las patas contralaterales de los mismos ratones. Un mes después del trasplante, los presentes inventores inyectaron 10 pl de notexina (10 pg ml-1; Latoxan, Francia) para lesionar los músculos receptores y activar las MuSCin vivo.Ocho semanas después del trasplante, se practicó la eutanasia a los ratones y se recogieron los TA para su análisis.

Formación de imágenes de bioluminiscencia

Los presentes inventores obtuvieron imágenes de bioluminiscencia (BLI) usando un sistema Xenogen-100, como se ha descrito anteriormente156. Resumiendo, los presentes inventores anestesiaron ratones mediante inhalación de isoflurano y les administraron 120 pl de D-luciferina (0,1 mmol kg-1, reconstituida en PBS; Caliper LifeSciences) mediante inyección intraperitoneal. Los presentes inventores obtuvieron BLI usando una exposición de 60 s a F-parada = 1,0 a los 5 minutos después de la inyección de luciferina. Las imágenes digitales se registraron y se analizaron con el software Living Image (Caliper LifeSciences). Los presentes inventores analizaron imágenes con una región de interés (ROI, por sus siglas en inglés) uniforme situada sobre cada miembro posterior para calcular una señal de bioluminiscencia. Los presentes inventores calcularon un valor de señal de bioluminiscencia en radiancia (p s-1 cm-2 s r1) de 104 para definir un umbral de injerto. Este umbral de radiancia de 104 es aproximadamente equivalente al umbral de flujo total en p/s publicado anteriormente. Este umbral de BLI corresponde a la detección histológica de una o más miofibras GFP+156. Los presentes inventores obtuvieron imágenes de BLI cada semana después del trasplante.

Lesión muscular

Los presentes inventores usaron un modelo de lesión que implicaba la inyección intramuscular de 10 pl de notexina (10 pg ml-1; Latoxan) o cardiotoxina (10 pM; Latoxan) en el músculo TA. Para la criolesión, se realizó una incisión en la piel que recubre el músculo TA y se colocó una sonda de cobre, se enfrió en nitrógeno líquido, se aplicó al músculo TA durante tres intervalos de 10 s, permitiendo que el músculo se descongele entre cada aplicación de la criosonda. Cuando se indicó, 48 h después de la lesión, se inyectó o bien 16,16-Dimetil Prostaglandina E2 (dmPGE2) (13 nmol, Tocris, N.° de catálogo 4027) o un vehículo de control (PBS) en el músculo TA. La pierna contralateral se usó como patrón interno. Los presentes inventores recogieron tejidos 14 días después de la lesión para su análisis.

Para los experimentos con ratonesPax7CreERT2; Rosa26-LSL-Luc,los presentes inventores trataron ratones con cinco inyecciones intraperitoneales diarias consecutivas de tamoxifeno para activar la expresión de luciferasa bajo el control del promotorPax7.Una semana después de la última inyección de tamoxifeno, los ratones se sometieron a una inyección intramuscular de 10 pl de cardiotoxina (10 pM; Latoxan), que se designó como día 0 del ensayo. Tres días después, se inyectó en el músculo TA 13 nmol de dmPGE2 (13 nmol) o control de vehículo (PBS). La pierna contralateral se usó como patrón interno. Se sometió a ensayo la bioluminiscencia los días 3, 7, 10 y 14 después de la lesión.

Histología de tejidos

Los presentes inventores recogieron y prepararon tejidos musculares de TA receptores para histología como se ha descrito anteriormente56. Los presentes inventores incubaron secciones transversales con anti-LAMININA (Millipore, clon A5, N.° de catálogo 05-206, 1:200) y anticuerpos primarios anti-PAX7 (Santa Cruz Biotechnology, N.° de catálogo sc-81648, 1:50) y después con anticuerpos secundarios AlexaFluor (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 1:200). Los presentes inventores contratiñeron núcleos con DAPI (Invitrogen). Los presentes inventores obtuvieron imágenes con un microscopio epifluorescente AxioPlan2 (Carl Zeiss Microimaging) con objetivos Plan NeoFluar 10*/0,30NA o 20*/0,75NA (Carl Zeiss) y una cámara digital ORCA-ER (Hamamatsu Photonics) controlada por el software SlideBook (3i). Las imágenes se recortaron usando Adobe Photoshop con ajustes de contraste uniformes en todas las imágenes del mismo experimento. Las imágenes compuestas se generaron usando Adobe Illustrator. Los presentes inventores analizaron el número de células PAX7 positivas usando el software de análisis de imágenes MetaMorph (Molecular Devices) y el área de las fibras usando los algoritmos de Baxter para el análisis de miofibras que identificaban las fibras y segmentaban las fibras en la imagen para analizar el área de cada fibra. Para la cuantificación de PAX7, los presentes inventores examinaron secciones en serie que abarcaban una profundidad de al menos 2 mm del TA. Para el área de fibras, se capturaron al menos 10 campos de secciones transversales de miofibras teñidas con LAMININA que abarcaban más de 400 miofibras para cada ratón, como anteriormente. Los análisis de los datos fueron con ocultación. Los investigadores que realizaron la obtención de imágenes y la puntuación desconocían la condición del tratamiento administrado a los grupos de muestras analizados.

Fabricación de hidrogeles

Los presentes inventores fabricaron hidrogeles de polietilenglicol (PEG) a partir de precursores de PEG, sintetizados como se ha descrito anteriormente6. Resumiendo, los presentes inventores produjeron hidrogeles usando la formulación publicada para conseguir hidrogeles de 12 kPa (módulo de Young) de rigidez en 1 mm de grosor, que es la condición óptima para cultivar MuSC y mantener el destino de las células madre en cultivo6. Los presentes inventores fabricaron matrices de micropocillos de hidrogel de 12 kPa para experimentos de proliferación clonal, como se ha descrito anteriormente6. Los presentes inventores cortaron y adhirieron todos los hidrogeles para cubrir el área superficial de placas de cultivo de 12 o 24 pocillos.

Cultivo, tratamiento e infección lentivírica de células madre musculares

Después del aislamiento, los presentes inventores resuspendieron las MuSC en medio de cultivo de cálulas miógenas que contenía DMEM/F10 (50:50), FBS al 15 %, factor de crecimiento de fibroblastos-2 2,5 ng ml-1 (FGF-2 también conocido como bFGF) y penicilina-estreptomicina al 1 %. Los presentes inventores sembraron suspensiones de MuSC a una densidad de 500 células por cm2 de superficie. Los presentes inventores mantuvieron los cultivos celulares a 37 °C en CO<2>al 5 % y cambiaron el medio a diario. Para los estudios de tratamiento con PGE2, inhibidor de la 15-PGDH y antagonistas del receptor EP4, los presentes inventores añadieron Prostaglandina E2 1-200 ng/ml (Cayman Chemical) (a menos que se especifique en las leyendas de las figuras, 10 ng/ml fue la concentración convencional utilizada), y/o antagonista de EP4 1 pM (ONO-AE3-208, Cayman Chemical) o inhibidor de la 15-PGDH 1 pM (SW033291, Cayman Chemical) a las MuSC cultivadas en placas recubiertas con colágeno durante las primeras 24 h. Después, las células se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en hidrogeles durante 6 días adicionales de cultivo. Todos los tratamientos se compararon con su control de vehículo de disolvente (DMSO). Para ensayos en suero despojado, los presentes inventores resuspendieron MuSC aisladas en medio que contenía DMEM/F10 (50:50), FBS desprovisto de carbón al 15 % (Gibco, N.° de cat. 12676011), bFGF 2,5 ng ml-1 y penicilina-estreptomicina al 1 %. Cuando se indica en la figura, los presentes inventores añadieron adicionalmente insulina 1,5 pg/ml (Sigma, I0516) y dexametasona 0,25 pM (Sigma, D8893) al medio celular de suero despojado. Para estos experimentos, las MuSC se cultivaron en hidrogeles y se añadió vehículo (DMSO) o PGE2 10 ng/ml (Cayman Chemical) a los cultivos con cada cambio de medio (cada dos días). La proliferación (véase más adelante) se sometió a ensayo 7 días después.

Los presentes inventores realizaron todos los ensayos de cultivo y trasplantes de MuSC después de 1 semana de cultivo, a menos que se indique otra cosa. Para estudios de trasplante de MuSC envejecidas, los presentes inventores infectaron MuSC con lentivirus que codificaban el factor de elongación-1a impulsado por promotor luc-IRES-GFP (virus GFP/luc) durante 24 h en cultivo como se ha descrito anteriormente3. Para estudios de MuSCEP4f/f,los presentes inventores aislaron MuSC como se ha descrito anteriormente (Aislamiento de células madre musculares) e infectaron todas las células con el virus GFP/luc y un subconjunto de ellas se coinfectó con un lentivirus que codificaba pLM-CMV-R-Cre (virus mCherry/Cre) durante 24 h en cultivo. pLM-CMV-R-Cre fue un regalo de Michel Sadelain (plásmido Addgene N.° 27546)7. Los presentes inventores trasplantaron MuSC envejecidas (250 células) o MuSCEP4f/f(1.000 células) en TA jóvenes (2-4 meses) irradiados con 18-gy de ratones receptores NOD-SCID. Para ensayos de proliferaciónin vitro,se sembraron en placa MuSCEP4f/fsobre hidrogeles después de la infección y se trataron durante 24 h con vehículo (DMSO) o PGE2 10 ng/ml, y la proliferación se sometió a ensayo 3 días después. Se analizó la expresión de GFP y/o mCherry en las células 48 h después de la infección usando un microscopio de fluorescencia invertido (Carl Zeiss Microimaging). Las MuSC se aíslan en fresco de los ratones mediante FACS y se ponen en cultivo durante un período máximo de una semana, por lo que no se evalúa la contaminación por micoplasma.

Ensayos de proliferación

Para someter a ensayo la proliferación, los presentes inventores usaron tres ensayos diferentes (hemocitómetro, VisionBlue y EdU). Para cada uno, los presentes inventores sembraron MuSC sobre hidrogeles planos (hemocitómetro y VisionBlue) o placas recubiertas con colágeno (ensayo EdU) a una densidad de 500 células por cm2 de superficie. Para el recuento del número de células en el hemocitómetro, los presentes inventores recogieron células en los puntos temporales indicados mediante incubación con tripsina al 0,5 % en PBS durante 5 min a 37 °C y las cuantificaron usando un hemocitómetro al menos 3 veces. Adicionalmente, los presentes inventores usaron el kit de ensayo fluorométrico de viabilidad celular VisionBlue Quick (BioVision, N.° de catálogo K303) como lectura del crecimiento celular en cultivo. Resumiendo, los presentes inventores incubaron MuSC con VisionBlue al 10 % en medio de cultivo durante 3 h y midieron la intensidad de fluorescencia en un lector de placas de fluorescencia (Infinite M1000 PRO, Tecan) a Ex = 530-570 nm, Em = 590-620 nm. Los presentes inventores analizaron la proliferación usando el kit de formación de imágenes Click-iT EdU Alexa Fluor 555 (Life Technologies). Resumiendo, los presentes inventores incubaron células vivas con EdU (20 pM) durante 1 h antes de la fijación y tiñeron los núcleos de acuerdo con las directrices del fabricante junto con anti-MIOGENINA (Santa Cruz, N.° de catálogo sc576, 1:250) para someter a ensayo la diferenciación. Los presentes inventores contratiñeron núcleos con DAPI (Invitrogen). Los presentes inventores obtuvieron imágenes con un microscopio epifluorescente AxioPlan2 (Carl Zeiss Microimaging) con objetivos Plan NeoFluar 10*/0,30NA o 20*/0,75NA (Carl Zeiss) y una cámara digital O<r>CA-ER (Hamamatsu Photonics) controlada mediante el software SlideBook (3i). Los presentes inventores cuantificaron las células positivas para EdU usando el software MetaMorph Image Analysis (Molecular Devices). Los análisis de los datos fueron con ocultación, en los que los investigadores que realizaron la puntuación de las células desconocían la condición del tratamiento administrado a los grupos de muestras analizados.

Análisis de la proliferación y el destino de células madre musculares clónales

Los presentes inventores evaluaron la proliferación de células madre musculares clónales mediante microscopía de lapso de tiempo como se ha descrito anteriormente56. Resumiendo, los presentes inventores trataron MuSC envejecidas aisladas con PGE2 (Cayman Chemical) o vehículo (DMSO) durante 24 h. Después de cinco días de crecimiento en hidrogeles, a una densidad de 500 células por cm2 de superficie en micropocillos de hidrogel de 600 pm de diámetro. Para la microscopía de lapso de tiempo, los presentes inventores controlaron la proliferación celular en los pocillos con células individuales desde 12 h (día 0) hasta dos días después de la siembra y registraron imágenes cada 3 minutos con un aumento de 10* usando un sistema PALM/AxioObserver Z1 (Carl Zeiss Microlmaging) con una cámara de control ambiental personalizada y una platina motorizada. Los presentes inventores cambiaron el medio cada dos días entre los intervalos de tiempo de obtención. Los presentes inventores analizaron secuencias de imágenes de lapso de tiempo usando los Algoritmos de Baxter para el Rastreo celular y la Reconstrucción de linajes para identificar y rastrear células individuales y generar árboles de linajes568-10.

En las secuencias de lapso de tiempo se distinguieron las células viables de las muertas basándose en el límite de contraste de fase y el mantenimiento o la pérdida de motilidad, respectivamente. Los presentes inventores descubrieron que las tasas de proliferación (división) y muerte en las dos condiciones variaban con el tiempo, Por lo tanto, los presentes inventores estimaron las tasas correspondientes al primer y al segundo intervalo de 24 h por separado. Los valores se estimaron usando las ecuaciones descritas en 6 y se encuentran en la Tabla 1. Los presentes inventores indicaron las tasas de proliferación en los dos intervalos p24 y p48 y las correspondientes tasas de mortalidadd24y d48. Como ejemplo, la tasa de proliferación en la condición tratada durante el segundo intervalo de 24 h es del 5,38 % por hora. La Tabla 1 (a continuación) muestra que las tasas de proliferación y muerte en las dos condiciones son similares en el primer intervalo de tiempo, y que la diferencia en el número de células al final del experimento se debe a diferencias tanto en las tasas de división como en las tasas de mortalidad durante el segundo intervalo de tiempo. Los recuentos celulares modelados en los dos intervalos de tiempo vienen dados por

c(t) Eo exp((p24 - d 24)t) 0 < t < 24

(c(24) exp((p48 - d 48) ( í - 24)) 24 < í < 48

donde c<0>es el número de células al inicio. Las curvas modeladas se representan gráficamente junto con los recuentos celulares reales en laFIG. 7F.

Tabla 1. T im r lif r i n m r li por horas.

E2 0,0475 0,0538 0,0067 0,0012

El análisis de los datos fue con ocultación. Los investigadores que realizaron la obtención de imágenes y la puntuación desconocían la condición del tratamiento proporcionado a los grupos de muestras analizados.

RT-PCR cuantitativa

Los presentes inventores aislaron ARN de las MuSC usando el kit RNeasy Micro Kit (Qiagen). Para muestras de músculo, los presentes inventores congelaron el tejido en nitrógeno líquido, homogeneizaron los tejidos usando un mortero y una mano de mortero, seguido de trituración con jeringa y aguja, y después aislaron el ARN usando Trizol (Invitrogen). Los presentes inventores realizaron la transcripción inversa del ADNc a partir del ARNm total de cada muestra usando el kit de síntesis de ADNc SensiFAST™ (Bioline). Los presentes inventores sometieron el ADNc a RT-PCR usando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) o ensayos TaqMan (Applied Biosystems) en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7900HT (Applied Biosystems). Los presentes inventores ciclaron las muestras a 95 °C durante 10 min y, después, 40 ciclos a 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min. Para cuantificar los niveles relativos de transcripción, los presentes inventores usaron 2-AACt para comparar muestras tratadas y no tratadas y expresaron los resultados con respecto aGapdh.Para qRT-PCR SYBR Green, los presentes inventores usaron las siguientes secuencias de cebadores:Gapdh,directo 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3', inverso 5'-CCCTTTTGGCTCCACCCT-3';Hpgd,directo 5'-TCCAGT GTGATGT GGCTGAC -3', inverso 5'-ATTGTT CACGCCTGCATTGT-3';Ptges,directo 5'-GCTGTCATCACAGGCCAGA-3', inverso 5'-CTCCACATCTGGGTCACTCC-3';Ptges2,directo 5'-CTCCTACAGGAAAGTGCCCA-3', inverso 5'-ACCAGGTAGGTCTTGAGGGC -3';Ptgerl,directo 5'-GT GGT GTCGTGCAT CT GCT-3', inverso, 5'-CCGCTGCAGGGAGTTAGAGT-3', andPtger2,directo 5'-ACCTTCGCCAT ATGCTCCTT-3', inverso 5'-GGACCGGTGGCCTAAGTATG-3'. Los presentes inventores usaron ensayos TaqMan (Applied Biosystems) para cuantificarPax7, Miogenina, Slco2a1(PGT),Ptger3yPtger4en muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el kit de reactivos TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Los niveles de transcripción se expresaron con respecto a los niveles deGapdh.Para qPCR SYBR Green, se usóGapdh qPCRpara normalizar las muestras de ADNc de entrada. Para qPCR Taqman, la qPCR múltiple permitió normalizar las señales diana (FAM) individualmente por sus señales deGapdh(VIC) internas.

ELISA de PGE2

Se recogió músculo, se aclaró en PBS helado que contenía indometacina (5,6 |jg/ml) y se congeló en nitrógeno líquido. Las muestras congeladas se pulverizaron en nitrógeno líquido. El polvo se transfirió a un tubo Eppendorf con 500 j l de tampón de lisado (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl 4 mM, Tritón X-100 al 1,5 %, inhibidores de proteasas y nucleasa micrococócica), y después se homogeneizó usando un homogeneizador de tejidos. El nivel de PGE2 del sobrenadante se midió usando un kit de ELISA de PGE2 (R&D Systems, N.° de catálogo KGE004B) y se expresó con respecto a la proteína total medida mediante ensayo de BCA (BioRad) y se expresó como ng de p GE2. Cada muestra se analizó por duplicado y en cada uno de dos experimentos independientes.

Ensayo de la actividad de AMPc

Se trataron MuSC con DMSO (vehículo) o PGE2 (10 ng/ml) durante 1 h y se midieron los niveles de AMP cíclico de acuerdo con el protocolo de ensayo AMPc-Glo optimizado por el fabricante (Promega). Cada muestra se analizó por triplicado y en dos experimentos independientes.

Citometría de flujo

Los presentes inventores analizaron la Anexina V como indicador de apoptosis para MuSC después de 7 días de cultivo sobre hidrogeles, después de un tratamiento agudo inicial (24 h) de vehículo (DMSO) o PGE2 (10 ng/ml). Los presentes inventores usaron el kit FITC Anexina V Apoptosis Detection Kit (Biolegend, N.° de cat. 640914) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los presentes inventores analizaron las células para determinar la Anexina V en un citómetro FACS LSR II usando el software FACSDiva (BD Biosciences) en la Instalación FACS compartida, adquirida usando una subvención de instrumentos compartidos S10 (S10RR027431-01) de los NIH.

Espectrometría de masas

Analitos:

Todos los patrones de prostaglandinas (PGF2a; PGE2; PGD2; 15-ceto PGE2; 13,14-dihidro 15-ceto PGE2; PGE2-D4; y PGF2a-D9) se obtuvieron en Cayman Chemical. Para el patrón interno PGE2-D4, las posiciones 3 y 4 se marcaron con un total de cuatro átomos de deuterio. Para PGF2a D9, las posiciones 17, 18, 19 y 20 se marcaron con un total de nueve átomos de deuterio.

Preparación de la curva de calibración:

Se prepararon soluciones madre de analitos (5 mg/ml) en DMSO. Estas soluciones madre se diluyeron en serie con acetonitrilo/agua (1:1 v/v) para obtener una serie de soluciones de trabajo patrón, que se usaron para generar la curva de calibración. Las curvas de calibración se prepararon añadiendo 10 ul de cada solución de trabajo patrón en 200 j l de tampón de homogeneización (acetona/agua 1:1 v/v); BHT al 0,005 % para impedir la oxidación) seguido de la adición de 10 ul de solución de patrón interno (3000 ng/ml de cada una PGF2a-D9 y PGE2-D4). Se preparó una curva de calibración en fresco con cada conjunto de muestras. Intervalos de la curva de calibración: para PGE2 y 13,14-dihidro 15-ceto PGE2, de 0,05 ng/ml a 500 ng/ml; para PGD2 y PGF2a, de 0,1 ng/ml a 500 ng/ml; y para 15-ceto PGE2, de 0,025 ng/ml a 500 ng/ml.

Procedimiento de extracción:

El procedimiento de extracción se modificó a partir del de Prasainet al.11 e incluía la precipitación de proteínas con acetona seguida de la extracción líquido-líquido en 2 etapas; esta última etapa potencia la sensibilidad de CL-EM/EM. Se usó hidroxitolueno butilado (BHT) y evaporación con nitrógeno gaseoso (N2) para impedir la oxidación.

Se recogieron tejidos sólidos, se pesaron y se congelaron con nitrógeno líquido. El tejido muscular se combinó con perlas de homogeneización y 200 j l de tampón de homogeneización en un tubo de polipropileno y se procesó en un homogeneizador FastPrep 24 (MP Biomedicals) durante 40 segundos a una velocidad de 6 m/s. Después de la homogeneización, se añadieron 10 j l de solución de patrón interno (3000 ng/ml) al homogeneizado tisular seguido de ultrasonidos y agitación durante 10 minutos. Las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf limpio. Se añadieron 200 j l de hexano a la muestra, seguido de agitación durante 15 minutos, después, centrifugación. Las muestras se congelaron a -80 °C durante 40 minutos. La capa de hexano se vertió fuera de la capa acuosa inferior congelada y se desechó. Después de la descongelación, se añadieron 25 j l de ácido fórmico 1 N a la capa acuosa inferior y las muestras se agitaron con formación de vórtice. Para la segunda extracción, se añadieron 200 j l de cloroformo a la fase acuosa. Las muestras se agitaron durante 15 minutos para garantizar una extracción completa. Se realizó una centrifugación para separar las capas. La capa inferior de cloroformo se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf y se evaporó a sequedad con nitrógeno a 40 °C. El residuo seco se reconstituyó en 100 j l de acetonitrilo/acetato de amonio 10 mM (2:8 v/v) y se analizó mediante CL-EM/EM.

CL-EM/EM:

Puesto que muchas prostaglandinas son isómeros posicionales con masas idénticas y tienen patrones de fragmentación similares, la separación cromatográfica es fundamental. Se seleccionaron cuidadosamente dos transiciones de SRM, una cuantificadora y otra calificadora, para cada analito. Las relaciones de intensidad de iones calificadores y los tiempos de retención distintivos fueron esenciales para autentificar los analitos diana. Todos los análisis se realizaron mediante CL-EM/EM de electronebulización negativa usando un cromatógrafo de líquidos de prominencia LC-20AD<xr>y un espectrómetro de masas 8030 de triple cuadrupolo (Shimadzu). Condiciones de HPLC: Acquity UPLC BEH C182,1 x 100 mm, la columna de 1,7 um de tamaño de partícula se operó a 50 °C con un caudal de 0,25 ml/min. Las fases móviles consistían en A: ácido acético al 0,1 % en agua y B: ácido acético al 0,1 % en acetonitrilo. Perfil de elución: retención inicial al 35 % de B durante 5 minutos, seguida de un gradiente del 35 %-40 % en 3 minutos, después 40 %-95 % en 3 minutos; el tiempo de ejecución total fue de 14 minutos. El volumen de inyección fue de 20 ul. Usando estas condiciones de HPLC, los presentes inventores consiguieron una separación basal de los analitos de interés.

Para la cuantificación se usó el control de reacción seleccionado (SRM, por sus siglas en inglés). Las transiciones de masa fueron las siguientes: PGD2: m/z 351,10 ^ m/z 315,15 (cuantificador) y m/z 351,10 ^ m/z 233,05 (calificador); PGE2: m/z 351,10 ^ m/z 271,25 (cuantificador) y m/z 351,10 ^ m/z 315,20 (calificador); PGF2a: m/z 353,10 ^ m/z 309,20 (cuantificador) y m/z 353,10 ^ m/z 193,20 (calificador); 15 ceto-PGE2: m/z 349,30 ^ m/z 331,20 (cuantificador) y m/z 349,30 ^ m/z 113,00 (calificador); 13, 14-dihidro 15-ceto PGE2: m/z 351,20 ^ m/z 333,30 (cuantificador) y m/z 351,20 ^ m/z 113,05 (calificador); PGE2-D4: m/z 355,40 ^ m/z 275,20; y PGF2a-D9: m/z 362,20 ^ m/z 318,30. El tiempo de permanencia fue de 20-30 ms.

El análisis cuantitativo se realizó usando LabSolutions LCMS (Shimadzu). Para la cuantificación se usó un método de patrón interno: Se usó PGE2-D4 como patrón interno para la cuantificación de PGE2, 15-ceto PGE2 y 13, 14-dihidro 15-ceto PGE2. PGF2a-D9 fue el patrón interno para la cuantificación de PGD2 y PGF2a. Las curvas de calibración fueron lineales (R > 0,99) en el intervalo de concentración usando un factor de ponderación de 1/X2 donde X es la concentración. Las concentraciones de patrón retrocalculadas fueron de ±15 % desde los valores nominales, y de ±20 % en el límite inferior de cuantificación (LLOQ, por sus siglas en inglés).

Medición de la fuerza muscular in vivo

Se sometió a ratones de edad avanzada (18 meses) a una carrera en cinta rodante cuesta abajo durante 2 semanas consecutivas. Durante la semana 1, los ratones corrieron a diario durante 5 días y descansaron los días 6 y 7. Dos horas después de cada carrera en cinta rodante durante la semana 1, cada músculo gastrocnemio (GA) (lateral y medial) de ambas patas de cada ratón se inyectó con una dosis de PBS (control de vehículo) o dmPGE2 13 nM (grupo experimental). Durante la semana 2, los ratones se sometieron a 5 días de carrera en cinta rodante solamente. La carrera en cinta rodante se realizó usando el Exer3/6 (Columbus Instruments). Los ratones corrieron durante 10 minutos en la cinta a 20 grados cuesta abajo, comenzando a una velocidad de 7 metros/min. Después de 3 min, la velocidad se incrementó en 1 metro/minuto hasta alcanzar una velocidad final de 14 metros/minuto. Se eligió un tiempo de ejecución de 10 minutos, ya que la extenuación, definida como la incapacidad del animal para permanecer en la cinta rodante a pesar de los pinchazos eléctricos, se observó a una mediana de 12 minutos en un grupo independiente de ratones envejecidos de control. Las mediciones de fuerza se realizaron en los músculos GA en la semana 5 basándose en un protocolo publicado anteriormente5. Resumiendo, para cada ratón, se realizó una incisión para exponer el GA. Los presentes inventores seccionaron el hueso calcáneo con el tendón de Aquiles intacto y el complejo tendón-hueso se fijó a un transductor de fuerza 300C-LR (Aurora Scientific) con un gancho metálico fino. Los músculos y tendones se mantuvieron húmedos mojándolos periódicamente con solución salina (cloruro de sodio al 0,9 %). El miembro inferior se inmovilizó por debajo de la rodilla mediante una abrazadera metálica sin comprometer el riego sanguíneo de la pierna. El ratón estuvo bajo anestesia inhalada (isoflurano al 2 %) durante todo el procedimiento de medición de la fuerza y la temperatura corporal se mantuvo mediante una lámpara de calor. En todas las mediciones, los presentes inventores usaron pulsos de 0,1 ms a un voltaje de estimulación supramáximo predeterminado. Los músculos GA se estimularon a través del nervio ciático proximal usando un manguito de estimulación eléctrica bipolar que suministraba una corriente constante de 2 mA (anchura de pulso cuadrada de 0,1 ms). Los músculos GA se estimularon con un único pulso de 0,1 ms para las mediciones de la fuerza de contracción y con un tren de pulsos de 150 Hz durante 0,3 s para las mediciones de la fuerza tetánica. Los presentes inventores realizaron cinco mediciones de contracción y, después, cinco mediciones tetánicas en cada músculo, con 2-3 min de recuperación entre cada medición con n = 5 ratones por grupo. Los datos se recogieron con una tarjeta de obtención PCI-6251 (National Instruments) y se analizaron en Matlab. Los presentes inventores calcularon los valores de fuerza específicos normalizando las mediciones de fuerza por las áreas de sección transversal fisiológicas del músculo (PCSA), que fueron similares entre el grupo de control y el grupo experimental tratado con PGE2 (Tabla 2). El PCSA (medida en mm2) se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación12:PCSA (mm2) = [masa (g) x Cos 6]^ [p(g/mm3) x longitud de la fibra (mm)],donde9es el ángulo de penación de la fibra ypes la densidad muscular (0,001056 g/mm3).

Análisis estadísticos

Los presentes inventores realizaron experimentos de cultivo celular en al menos tres experimentos independientes en los que se agruparon tres réplicas biológicas en cada uno. En general, los presentes inventores realizaron experimentos de trasplante de MuSC en al menos dos experimentos independientes, con al menos 3-5 trasplantes totales por condición. Los presentes inventores usaron un ensayo t pareado para los experimentos en los que las muestras de control procedían del mismo experimentoin vitroo de músculos de la extremidad contralateralin vivo.Se usó un ensayo no paramétrico de Mann-Whitney para determinar la diferencia de significación entre los grupos no tratados (-) frente a los tratados (PGE o dmPGE2) usando a = 0,05. Se realizó un ANOVA o un ensayo t múltiple para comparaciones múltiples con un nivel de significación determinado usando la corrección de Bonferroni o con el ensayo de Fisher, como se indica en las leyendas de las figuras. A menos que se describan de otro modo, los datos se muestran como la media ± e.t.m.

REFERENCIAS DE MÉTODOS:

1 Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S. y Blau, H. M.Self-renewal and expansión of single transplanted muscle stem cells. Nature456, 502-506, doi:10.1038/nature07384 (2008).

2 Schneider, A.et al. Generation of a conditional allele of the mouse prostaglandin EP4 receptor. Genesis40, 7 14, doi:10.1002/gene.20048 (2004).

3 Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A. y Kardon, G.Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development138, 3625-3637, doi:10.1242/dev.064162 (2011).

4 Safran, M.et al. Mouse reporter strain for noninvasive bioluminescent imaging of cells that have undergone Cremediated recombination. Molecular imaging2, 297-302 (2003).

5 Cosgrove, B. D.et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nature medicine20, 255-264, doi:10.1038/nm.3464 (2014).

6 Gilbert, P. M.et al. Substrate elasticity regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture. Science329, 1078-1081, doi:10.1126/science.1191035 (2010).

7 Papapetrou, E. P.et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology29, 73-78, doi:10.1038/nbt.1717 (2011).

8 Chenouard, N.et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature methods11, 281-289, doi:10.1038/nmeth.2808 (2014).

9 Magnusson, K. E., Jalden, J., Gilbert, P. M. y Blau, H. M.Global linking of cell tracks using the Viterbi algorithm. IEEE transactions on medical imaging34, 911-929, doi:10.1109/TMI.2014.2370951 (2015).

10 Maska, M.et al. A benchmark for comparison of cell tracking algorithms. Bioinformatics30, 1609-1617, doi:10.1093/bioinformatics/btu080 (2014).

11 Prasain, J. K., Hoang, H. D., Edmonds, J. W. y Miller, M. A.Prostaglandin extraction and analysis in Caenorhabditis elegans. Journal of visualized experiments: JoVE,doi:10.3791/50447 (2013).

12 Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S. y Lieber, R. L.Relationship between muscle fiber types and sizes and muscle architectural properties in the mouse hindlimb. J Morphol221, 177-190, doi:10.1002/jmor.1052210207 (1994).

Tabla 2. Área de la sección transversal fisiológica (PCSA) del gastrocnemio envejecido en la semana 5 después del ejercicio.

ID de ratón Pata Ángulo de penación 6 Coseno(6) Longitud de Masa de PCSA (grado) fibra GA (medial+lateral)

(mm) (g) (mm2) Control-1Izquierdo 21 0,93 6,88 0,18 23,13 Derecho 21 0,93 6,64 0,18 23,82Control-2Izquierdo 26 0,90 4,03 0,16 33,79 Derecho 22 0,93 5,34 0,16 26,31Control-3Izquierdo 21 0,93 4,52 0,15 29,34 Derecho 23 0,92 4,59 0,17 32,28Control-4Izquierdo 24 0,91 5,07 0,14 23,89 Derecho 23 0,92 4,75 0,13 23,86ID de ratón Pata Ángulo de penación 6 Coseno(0) Longitud de Masa de PCSA (grado) fibra GA (medial+lateral)

(mm)__________ (g)_________ (mm2)

Control-5Izquierdo 19 0,95 6,07 0,16 17,75 Derecho 18 0,95 6,05 0,15 10,25

dmPGE2-1Izquierdo 12 0,98 7,60 0,25 30,47 Derecho Daño de tendón - - - -dmPGE2-2Izquierdo 12 0,96 4,85 0,16 30,56 Derecho 16 0,91 4,80 0,14 26,55dmPGE2-3Izquierdo 14 0,97 5,89 0,17 26,52 Derecho 13 0,94 5,63 0,14 22,94dmPGE2-4Izquierdo 14 0,97 6,67 0,14 19,29 Derecho 13 0,97 7,74 0,16 19,07dmPGE2-5Izquierdo 11 0,98 5,56 0,17 28,42 Derecho 11 0,98 5,54 0,16 26,85Control prom. 25,09 dmPGE2 25,63 prom.

Ejemplo 2: Aumento de las fuerzas musculares después de la inyección de prostaglandina E2 (PGE2) (un ejemplo de referencia)

Este ejemplo muestra un aumento de la fuerza de contracción específica de los músculos gastrocnemios en ratones envejecidos inyectados con PGE2. Los ratones envejecidos (18 meses de edad) se sometieron a diario a carreras en cinta rodante hasta la extenuación durante 10 días. La carrera en cinta rodante se realizó usando el Exer3/6 (Columbus Instruments). Los ratones corrieron en la cinta a 20 grados cuesta abajo, comenzando a una velocidad de 10 metros/min. Después de 3 min, la velocidad se incrementó en 1 metro/minuto hasta alcanzar una velocidad final de 20 metros/min. La extenuación se definió como la incapacidad del animal para permanecer en la cinta rodante a pesar de los pinchazos eléctricos. 2 h después de cada carrera en cinta rodante, los dos músculos gastrocnemios de cada ratón se inyectaron con PBS (grupo de control) o con PGE23 nM (grupo experimental). La medición de la fuerza se realizó 4 semanas después de la última carrera en cinta rodante usando un transductor de fuerza 300C-LR (Aurora Scientific) con un único pulso de 0,1 ms a una intensidad de estimulación supramáxima predeterminada.

En lasFIG. 4M-4Nse proporcionan trazos representativos de fuerza muscular en bruto de músculos gastrocnemios individuales. La fuerza muscular y los impulsos de sincronización se registraron a través de una tarjeta de obtención PCI-6251 (National Instruments) y se analizaron usando Matlab. LasFIG. 4O-4Pmuestran los valores de fuerza muscular específicos que se calcularon normalizando las mediciones de fuerza con el área de sección transversal fisiológica del músculo. Los valores de fuerza de contracción específica (kN/m2) se representan mediante el gráfico de cajas y bigotes que muestra los valores mínimo, máximo y de mediana. Se realizaron cinco mediciones repetidas de cada músculo. N = 4 para el grupo de control y n = 5 para el grupo inyectado con PGE2. ** representa un valor estadístico significativo de p < 0,005 mediante el ensayo bilateral de Mann Whitney.

Listado informal de secuencias

Gapdh,directo

5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3' (SEQ ID NO: 1)

Gapdh,inverso

5'-CCCTTTTGGCTCCACCCT-3' (SEQ ID NO: 2)

Hpgd,directo

5'-TCCAGTGTGATGTGGCTGAC-3' (SEQ ID NO: 3)

Hpgd,inverso

5'-ATTGTTCACGCCTGCATTGT-3' (SEQ ID NO: 4)

Ptges,directo

5'-GCTGTCATCACAGGCCAGA-3' (SEQ ID NO: 5)

Ptges,inverso

5-CTCCACATCTGGGTCACTCC-3' (SEQ ID NO: 6)

Ptges2,directo

5'-CTCCTACAGGAAAGTGCCCA-3' (SEQ ID NO: 7)

Ptges2,inverso

5-ACCAGGTAGGTCTTGAGGGC-3' (SEQ ID NO: 8)

Ptgerl,directo

5-GTGGTGTCGTGCATCTGCT-3' (SEQ ID NO: 9)

Ptgerl,inverso

5'-CCGCTGCAGGGAGTTAGAGT-3' (SEQ ID NO: 10)

Ptger2,directo

5'-ACCTTCGCCATATGCTCCTT-3' (SEQ ID NO: 11)

Ptger2,inverso

5'-GGACCGGTGGCCTAAGTATG-3' (SEQ ID NO: 12)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, péptido neutralizante o anticuerpo neutralizante que inactiva o bloquea la 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) para su uso en la regeneración de una población de células musculares y el tratamiento del daño muscular, la lesión muscular o la atrofia muscular en un sujeto que lo necesite.

2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en donde la composición se administra al sujeto que lo necesite a través de administración oral, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intradérmica, subcutánea, intravenosa o intracardíaca.

3. La composición para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde la composición se administra al sujeto que la necesita mediante una exposición aguda, una exposición intermitente, una pauta crónica o una exposición continua.

4. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el daño muscular, la lesión muscular o la atrofia muscular se selecciona del grupo que consiste en lesión muscular aguda o traumatismo, lesión del tejido blando de la mano, distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de cinturas, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), distrofia muscular distal (DD), miopatías hereditarias, distrofia muscular miotónica (DMM), miopatías mitocondriales, miopatía miotubular (MM), miastenia grave (MG), insuficiencia cardíaca congestiva, parálisis periódica, polimiositis, rabdomiólisis, dermatomiositis, caquexia por cáncer, caquexia por SIDA, caquexia cardíaca, incontinencia urinaria inducida por estrés, sarcopenia, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, atrofia muscular espinal y distrofia muscular facioescapulohumeral.

5. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto induce la proliferación de una población de células madre musculares.

6. La composición para el uso de la reivindicación 5, en donde la población de células madre musculares comprende células miógenas, células satélite, células progenitoras musculares o una combinación de las mismas.

7. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la composición se administra mediante administración intramuscular que comprende una inyección intramuscular en un músculo seleccionado del grupo que consiste en el músculo bíceps; el músculo tríceps; el músculo braquiorradial; el músculo braquial; los flexores de muñeca del compartimento superficial; el músculo deltoides; el bíceps femoral; el grácil; los músculos semitendinoso y los semimembranoso de los isquiotibiales; el recto femoral; músculos vasto lateral; vasto medial y vasto intermedio del cuádriceps; el gastrocnemio (lateral y medial); tibial anterior; los músculos sóleos de las pantorrillas; los músculos pectoral mayor y pectoral menor del tórax; el músculo dorsal ancho de la parte superior de la espalda; los romboides (mayor y menor); los músculos trapecios que abarcan el cuello, los hombros y la espalda; los músculos rectos abdominales del abdomen; y los músculos glúteo mayor, glúteo medio y glúteo menor de los glúteos.

8. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el daño muscular, la lesión muscular o la atrofia muscular es un daño del músculo esquelético, una lesión del músculo esquelético o una atrofia del músculo esquelético.

9. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la composición se administra mediante administración oral.

10. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.