JP2019513010A - プロスタグランジンe2を用いる、筋再生のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、あらゆる目的のために開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる、2016年3月4日に出願された米国特許仮出願第62/303,979号および2016年6月9日に出願された米国特許仮出願第62/348,116号の優先権を主張する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金第AG020961号のもとで、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有している。
骨格筋では、加齢により、進行性の再生障害ならびに筋肉の量、強度、および機能の低下が起こる。筋機能の低下は、増え続ける高齢集団において、可動性の深刻な低下および生活の質の悪化をしばしば招く、重大な公衆衛生問題である。筋機能の衰えの主要決定因子は、急性傷害または加齢の過程での損傷後に骨格筋幹細胞(MuSC)が筋肉を再生する能力の障害である。また、例えば、手術後の固定または不使用、癌およびHIVの悪液質、筋ジストロフィー、急性傷害、および加齢が原因で損傷、傷害、および/または萎縮を有している筋肉において筋再生を増強することも必要とされている。常在MuSCは希少ではあるが、成人期の間に筋肉、例えば、骨格筋、平滑筋、および心筋を維持および修復するのに不可欠である。加齢に伴い、機能的な幹細胞の数は減少し、したがって、MuSCの数および機能を増大させる必要が高まる。
本発明の1つの局面において、単離された筋肉幹細胞群の増殖を促すための方法が、本明細書において提供される。この方法は、単離された筋細胞群を、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と共に培養する段階を含む。
I 序論
本発明は、プロスタグランジンE2(PGE2)が筋細胞の増殖および機能を改善することができるという発見にある程度基づいている。単独でまたは単離された筋細胞と組み合わせてPGE2を用いて、傷害、萎縮、または疾患に起因する筋肉損傷を修復することができる。実際に、PGE2で処理した筋細胞は、投与すると、筋再生の強化および筋機能の向上を示す。したがって、損傷した、傷ついた、または萎縮した筋肉の筋再生および若返りを促進するための新規な治療方法、組成物、およびキットが本明細書において提供される。
本発明の実践には、分子生物学の分野の慣用技術を使用する。本発明において有用な一般的方法を開示している基本的な指定図書にはSambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))が含まれる。
本明細書において使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、それらに与えられた意味を有している。
1つの局面において、単離された筋細胞群を、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と共に培養することにより、単離された筋細胞群の増殖、増大、および/または移植を促すための方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、単離された筋細胞群は、実質的に精製されているか、または精製されている(例えば、非筋細胞または関心対象ではない他の細胞から分離されている)。いくつかの例において、単離された筋細胞群は、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、単離された筋細胞群は、筋肉幹細胞、衛星細胞、ミオサイト、筋芽細胞、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む。
単離された筋細胞の増殖および/または移植を促すか、または促進するためのインビトロまたはエクスビボの方法が、本明細書において提供される。これらの方法は、単離された筋細胞群を、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、またはそれらの組み合わせと共に培養するか、またはそれらと接触させる段階を含む。化合物は、細胞を維持するか、または増殖させるのに使用される任意の培地に添加されてよい。
本明細書において提供される方法を用いて、ヒト対象のような対象において筋肉を再生または若返らせることができる。筋肉の再生は、筋肉幹細胞、衛星細胞、筋肉前駆細胞、およびそれらの任意の組み合わせから新しい筋線維を形成することを含む。これらの方法は、筋肉の修復および/または維持を強化または増強するのにも有用である。
本明細書において提供される方法を用いて、それを必要とする対象において、筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を予防または治療することができる。この方法は、筋肉の損傷、傷害、または萎縮が起こる可能性が高い対象に、予防的処置を提供し得る。いくつかの態様において、対象は、筋肉に影響を及ぼす二次的症状が生じる可能性がある病態または疾患を有している場合がある。他の態様において、対象は、筋肉の病態または疾患を治療するための外科的介入または治療的介入を受けており、本明細書において開示する方法は、再発またはぶり返しを予防または抑制するために使用される。いくつかの態様において、対象は、筋肉に影響を及ぼす本明細書において説明する病態または疾患のいずれか1つを有している。
いくつかの態様において、本発明の化合物は、PGE2、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合において、PGE2異化を減衰させる化合物は、15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ(15-PGDH)を不活性化もしくは妨害するか、または15-PGDHによる異化のために細胞内部にPGE2を輸送するプロスタグランジントランスポーターを不活性化もしくは妨害する、化合物、中和ペプチド、または中和抗体であってよい。プロスタグランジントランスポーターは、2310021C19Rik、MATR1、Matrin F/Q、OATP2A1、PGT、PHOAR2、SLC21A2、溶質輸送体有機アニオントランスポーターファミリーメンバー2A1、およびSLCO2A1としても公知である。
本発明の筋肉(筋原)細胞には、筋肉幹細胞、骨格筋幹細胞、平滑筋幹細胞、心筋幹細胞、筋肉衛星細胞、筋原性前駆細胞、筋原細胞、ミオサイト、筋芽細胞、筋管、有糸分裂後の筋管、多核性筋線維、および有糸分裂後の筋線維が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、単離された筋細胞は、筋肉幹細胞を含む。他の態様において、単離された筋細胞は、筋肉衛星細胞を含む。筋細胞は、骨髄由来幹細胞のような幹細胞に、または胚性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞に由来してよい。いくつかの態様において、単離された筋細胞には、脱分化筋細胞が含まれる。他の態様において、筋細胞は、いくつかの場合において、疾患に関連する遺伝子変異を訂正するように、遺伝子改変されている。
本発明の化合物は、対象の傷害部位もしくはその近くに局所的に、または全身に投与されてよい。いくつかの態様において、化合物は、例えば、腹腔内に、筋肉内に、動脈内に、経口的に、静脈内に、頭蓋内に、くも膜下腔内に、脊髄内に、病巣内に、鼻腔内に、皮下に、脳室内に、局所的に、かつ/または吸入によって投与されてよい。化合物は、関心対象の筋細胞と共に、同時または逐次的に投与されてよい。化合物が細胞と同時に投与される場合、化合物と細胞の両方が、同じ組成物中で投与されてよい。別々に投与される場合、化合物は、薬学的に許容される担体中で提供されてよい。いくつかの場合において、化合物は、細胞投与の前または後に投与される。
本発明の化合物および細胞を含む薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含んでよい。特定の局面において、薬学的に許容される担体は、一つには、投与される個々の組成物に基づいて、ならびに、その組成物を投与するのに使用される個々の方法に基づいて、決定される。したがって、本発明の薬学的組成物の多種多様の適切な製剤が存在する(例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Eastern, PA (1990))を参照されたい)。
本明細書において説明する組成物の他の態様は、単離された筋細胞群と、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物(例えば、15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ(15-PGDH)阻害剤またはプロスタグランジントランスポーター(PTGもしくはSLCO2A1)阻害剤)、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物とを含むキットである。典型的には、キットは、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る容器を含み、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、および試験管を含んでよい。典型的には、ラベルがキットに付いており、ラベルは、任意の文書資料または記録資料を含み、これらは取扱い説明書またはキットの内容物を使用するための他の情報を提供する電子的またはコンピューターで読み取り可能な形態であってよい。
以下の実施例は、特許請求される本発明を例示するために提供されるが、それを限定するものではない。
本実施例は、PGE2シグナル伝達が、再生中の筋肉幹細胞の機能に必要とされることを示す。
マウス
本発明者らは、スタンフォード大学の学校ガイドラインおよび実験動物のケアに関する管理委員会(APLAC)に従って、すべての実験およびプロトコールを実施した。本発明者らは、老化筋肉の研究のために米国国立老化研究所(NIA)から野生型の高齢C57BL/6(18〜20ヶ月)マウスを入手し、Jackson研究室から野生型の若齢C57BL/6マウスを入手した。以前に説明されているようにして、二重トランスジェニックGFP/lucマウスを作製した1。簡単に説明すると、遍在性Actbプロモーターに調節されているホタルルシフェラーゼ(luc)導入遺伝子を発現するマウスを、FVB系統で維持した。遍在性UBCプロモーターに調節されている緑色蛍光タンパク質(GFP)導入遺伝子を発現するマウスを、C57BL/6系統で維持した。本発明者らは、NOD-SCID(Jackson研究室)レシピエントマウスへの同種異系移植実験のために、GFP/lucに由来する細胞を使用した。EP4flox/flox(EP4f /f)マウスは、K. Andreasson(スタンフォード大学)が親切に譲って下さった2。Jackson研究室から得たPax7CreERT2マウス(ストック番号017763)3とJackson研究室から得たRosa26-LSL-Luc(ストック番号005125)4を交雑することによって、二重トランスジェニックPax7CreERT2;Rosa26-LSL-Lucを生じさせた。本発明者らは、PCRに基づく適切な戦略によって、これらの遺伝子型を確認した。トランスジェニック系統に由来するマウスはすべて、若齢であった。すべての系統について、若齢マウスは、2〜4ヶ月齢であり、高齢マウスは18〜20ヶ月齢であった。これらの研究で使用したマウスはすべて、雌であった。
本発明者らは、以前に説明されているようにして、筋肉幹細胞を単離し高濃度化した1、5、6。簡単に説明すると、穏やかなコラゲナーゼ消化およびMACsディソシエーターによる切り刻みにより、多数の単一線維が解離するのを可能にし、続いて、ディスパーゼ消化によって、単核細胞をそれらのニッチから遊離させた。その後に、磁性ビーズカラム(Miltenyi)を用いて、造血系統を示している細胞および非筋細胞を細胞混合物から激減させた(CD45-/CD11b-/CD31-)。次いで、残存する細胞混合物をFACS解析に供して、CD34マーカーおよびα7-インテグリンマーカーを同時発現しているMuSCを選別した。本発明者らは、FlowJo v10.0を用いてフローサイトメトリー散布図を作成し解析した。各選別のために、本発明者らは、少なくとも3匹の無関係な雌のドナーマウスに由来するMuSC(それぞれ約5000個)を一緒にまとめた。
本発明者らは、以前に説明されているようにして1、5、6、FACS単離後すぐに、または細胞培養物から採取した後に、250個のMuSC(図3a、3c、および3d)または1,000個のMuSC(図3b)をレシピエントマウスの前脛骨筋(TA)筋肉に直接的に移植した。若年MuSCの研究の場合、本発明者らは、GFP/lucマウス(2〜4ヶ月齢)に由来する細胞を、後肢に放射線照射したNOD-SCIDマウスに移植した。老化MuSCの研究の場合、本発明者らは、以前に説明されているようにして5、移植前の培養2日目に24時間luc-IRES-GFPレンチウイルス(GFP/lucウイルス)を用いて形質導入された高齢C57BL/6マウス(18〜20ヶ月、NIH)に由来する細胞を移植した(詳細については、下記の「筋肉幹細胞培養、処理、およびレンチウイルス感染」のセクションを参照されたい)。筋肉幹細胞を移植する前に、本発明者らは、ケタミン(マウス1匹につき2.4mg)を腹腔内注射することによって、NOD-SCIDレシピエントマウスに麻酔をかけた。次いで、本発明者らは、後肢に線量18 Gyを1回放射線照射し、その際、体の残り部分は鉛のジグに入れて遮蔽した。本発明者らは、放射線照射から2日以内に移植を実施した。記載したように培養細胞を処理し(ビヒクルまたはPGE2処理10ng/ml)、PBS中0.5%トリプシンと共に37℃で2分間インキュベーションすることによってヒドロゲル培養物から採取し、血球計数器を用いて計数した。本発明者らは、所望の細胞濃度で細胞を0.1%ゼラチン/PBS中に再懸濁し、次いで、10μlの体積をTA筋肉に筋肉内注射することによって、それら(1つのTAにつき250個のMuSC)を移植した。新しいMuSC移植のために、本発明者らは、13nmolの16,16-ジメチルプロスタグランジンE2(dmPGE2)(Tocris、カタログ番号4027)またはビヒクル対照(PBS)と共に、選別した細胞を同時注射した。本発明者らは、同じマウスの反対側の下肢のTA筋肉に移植することによって、異なる条件に由来する細胞を比較した。移植後1ヶ月目に、本発明者らは、10μlのノテキシン(10μg/ml-1、Latoxan, France)を注射して、レシピエント筋肉を傷つけ、MuSCをインビボで活性化した。移植後8週目に、マウスを安楽死させ、解析のためにTAを採取した。
本発明者らは、以前に説明されているようにして1、5、6、Xenogen-100システムを用いて生物発光イメージング(BLI)を実施した。簡単に説明すると、本発明者らは、イソフルオラン吸入によってマウスに麻酔をかけ、腹腔内注射によって120μLのD-ルシフェリン(0.1mmol/kg-1、PBSに溶かして再構成、Caliper LifeSciences)を投与した。本発明者らは、ルシフェリン注射後5分の時点に、Fストップ=1.0で60秒の露出時間を用いて、BLIを取得した。デジタル画像を記録し、Living Imageソフトウェア(Caliper LifeSciences)を用いて解析した。本発明者らは、各後肢の全体にわたって配置された一貫した関心領域(ROI)を用いて画像を解析して、生物発光シグナルを算出した。本発明者らは、移植閾値を定める発光シグナル(単位:ラジアンス(ps-1 cm-2 sr-1))の値を104と算出した。このラジアンス閾値104は、以前に報告されている単位p/sの合計フラックス閾値にほぼ等しい。このBLI閾値は、1つまたは複数のGFP+筋線維の組織学的検出に対応している1、5、6。本発明者らは、移植後毎週、BLI画像化を実施した。
本発明者らは、TA筋肉への10μlのノテキシン(10μg/ml-1;Latoxan)または心臓毒(10μM;Latoxan)の筋肉内注射を伴う傷害モデルを使用した。寒冷傷害の場合、TA筋肉を覆っている皮膚に切開部を作り、液体窒素中で冷却した銅製プローブを3回の10秒間隔でTA筋肉にあてて、クリオプローブの各適用の間に筋肉を解凍状態にさせた。必要である場合、傷害後48時間目に、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2(dmPGE2)(13nmol、Tocris、カタログ番号4027)またはビヒクル対照(PBS)のいずれかをTA筋肉に注射した。反対側のTAを内部標準として使用した。本発明者らは、傷害後14日目に、解析のために組織を採取した。
本発明者らは、以前に説明されているようにして5、6、組織学的検査のためにレシピエントTA筋組織を採取し調製した。本発明者らは、抗ラミニン一次抗体(Miliipore、クローンA5、カタログ番号05-206、1:200)および抗PAX7一次抗体(Santa Craz Biotechnology、カタログ番号sc-81648、1:50)と共に、次いでAlexaFluor二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories、1:200)と共に、横断切片をインキュベーションした。本発明者らは、DAPI(Invitrogen)を用いて核を対比染色した。本発明者らは、Plan NeoFluar 10x/0.30NA対物レンズまたはPlan NeoFluar 20x/0.75NA対物レンズ(Carl Zeiss)の付いたAxioPlan2落射蛍光顕微鏡(Carl Zeiss Microimaging)およびSlideBook(3i)ソフトウェアによって管理されるORCA-ERデジタルカメラ(Hamamatsu Photonics)を用いて、画像を取得した。これらの画像を、同じ実験からの全画像に対して一貫したコントラスト調整を用いてAdobe Photoshopによってトリミングした。Adobe Illustratorを用いて複合画像を作成した。本発明者らは、MetaMorph画像解析ソフトウェア(Molecular Devices)を用いてPAX7 陽性細胞の数を解析し、線維を特定し画像中の線維を区分して各線維の面積を解析する筋線維解析のためのバクスターアルゴリズムを用いて、線維面積を解析した。PAX7定量のために、本発明者らは、TAの少なくとも2mmの深さに及ぶ連続切片を検査した。線維面積のために、上記の各マウスについて、400個超の筋線維を含むラミニン染色した筋線維の断面の少なくとも10個の視野を取り込んだ。データ解析は盲検化された。画像取得およびスコア付けを実施する調査員は、解析されるサンプル群に与えられた処理条件を知らなかった。
本発明者らは、以前に説明されているようにして6合成されたPEG前駆物質から、ポリエチレングリコール(PEG)ヒドロゲルを作った。簡単に説明すると、本発明者らは、MuSCを培養し培養中の幹細胞の運命を維持するための最適条件である厚さ1mmの堅さ12kPa(ヤング率)のヒドロゲルを実現するための公開されている配合を用いることによって、ヒドロゲルを製造した6。本発明者らは、以前に説明されているようにして、クローン増殖実験のために12kPaのヒドロゲルマイクロウェルアレイを作った6。本発明者らは、12ウェルまたは24ウェルの培養プレートの表面領域を覆うように、すべてのヒドロゲルを切り、付着させた。
単離後、本発明者らは、DMEM/F10(50:50)、15%FBS、2.5ng-1/ml線維芽細胞増殖因子-2(FGF-2、bFGFとしても公知)、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む筋原細胞培養培地中にMuSCを再懸濁した。本発明者らは、表面積1cm2当たり細胞500個の密度でMuSC懸濁液を播種した。本発明者らは細胞培養物を5%CO2中37℃で維持し、培地を毎日交換した。PGE2処理、15-PGDH阻害剤処理、およびEP4受容体アンタゴニスト処理を研究するために、本発明者らは、1〜200ng/mlのプロスタグランジンE2(Cayman Chemical)(図面の凡例で指定されていない限り、10ng/mlが、使用した標準濃度であった)、および/もしくは1μM EP4アンタゴニスト(ONO-AE3-208, Cayman Chemical)、または1μM 15-PGDH阻害剤(SW033291、Cayman Chemical)を、コラーゲンでコーティングされたシャーレで培養されたMuSCに最初の24時間、添加した。次いで、細胞をトリプシン処理し、ヒドロゲルに細胞を再び播種してさらに6日間培養した。処理はすべて、溶媒(DMSO)ビヒクル対照と比較した。除去済み血清アッセイ法のために、本発明者らは、DMEM/F10(50:50)、15%チャコール処理済みFBS(Gibco、カタログ番号12676011)、2.5ng/ml-1 bFGF、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む培地に、単離MuSCを再懸濁した。図面に注釈をつけた場合、本発明者らは、除去済み血清細胞培地に1.5μg/mlインスリン(Sigma、I0516)および0.25μMデキサメタゾン(Sigma、D8893)をさらに追加した。これらの実験のために、MuSCをヒドロゲル上で培養し、培地を交換する度に(2日毎)、ビヒクル(DMSO)または10ng/ml PGE2(Cayman Chemical)を培養物に添加した。7日後に、増殖(下記を参照されたい)を調べた。
別段の注釈がない限り、本発明者らは、1週間の培養後にすべてのMuSC培養アッセイ法および移植を実施した。老化MuSCの移植を研究する場合、本発明者らは、以前に説明されているようにして3、培養中に24時間、MuSCを伸長因子1aプロモーター駆動性luc-IRES-GFPをコードするレンチウイルス(GFP/lucウイルス)に感染させた。EP4f/fMuSCを研究する場合、本発明者らは、前述(筋肉幹細胞単離)のようにMuSCを単離し、全細胞をGFP/lucウイルスに感染させ、それらの一部を、培養中に24時間、pLM-CMV-R-Creをコードするレンチウイルス(mCherry/Creウイルス)に同時感染させた。pLM-CMV-R-Creは、Michel Sadelainから頂いた(Addgeneプラスミド27546番)7。本発明者らは、老化MuSC(250個の細胞)またはEP4f/fMuSC(1,000個の細胞)を、NOD-SCIDレシピエントマウスの若い(2〜4ヶ月)18gy放射線照射済TAに移植した。インビトロ増殖アッセイ法のために、感染後にEP4f/fMuSCをヒドロゲル上に播き、ビヒクル(DMSO)または10ng/ml PGE2で24時間処理し、3日後に増殖を調べた。感染後48時間目に、倒立型蛍光顕微鏡(Carl Zeiss Microimaging)を用いて、細胞のGFPおよび/またはmCherryの発現を調べた。MuSCは、FACSによってマウスから新たに単離し、最長で1週間の期間、培養状態におき、従って、マイコプラズマ汚染は評価されていない。
増殖を調べるために、本発明者らは、3種の異なるアッセイ法(血球計数器、VisionBlue、およびEdU)を使用した。それぞれについて、本発明者らは、平らなヒドロゲル(血球計数器およびVisionBlue)またはコラーゲンでコーティングしたプレート(EdUアッセイ法)上に、表面積1cm2当たり細胞500個の密度でMuSCを播種した。血球計数器で細胞数を計数する場合、本発明者らは、PBS中0.5%トリプシンと共に37℃で5分間インキュベーションすることによって、指定の時点に細胞を採取し、血球計数器を用いて少なくとも3回、それらを定量した。さらに、本発明者らは、培養時の細胞増殖の読み取りとして、VisionBlue迅速細胞生存度蛍光アッセイ法キット(BioVision、カタログ番号K303)を用いた。簡単に説明すると、本発明者らは、培地に溶かした10% VisionBlueと共にMuSCを3時間インキュベーションし、Ex=530〜570nm、Em=590〜620nmで蛍光プレートリーダー(Infinite M1000 PRO、Tecan)を用いて蛍光強度を測定した。本発明者らは、Click-iT EdU Alexa Fluor 555画像化キット(Life Technologies)を用いて増殖を調べた。簡単に説明すると、本発明者らは、固定前に1時間、生細胞をEdU(20μM)と共にインキュベーションし、抗ミオゲニン(Santa Cruz、カタログ番号sc576、1:250)と一緒に製造業者のガイドラインに従って核を染色して、分化を調べた。本発明者らは、DAPI(Invitrogen)を用いて核を対比染色した。本発明者らは、Plan NeoFluar 10x/0.30NA対物レンズまたはPlan NeoFluar 20x/0.75NA対物レンズ(Carl Zeiss)の付いたAxioPlan2落射蛍光顕微鏡(Carl Zeiss Microimaging)およびSlideBook(3i)ソフトウェアによって管理されるORCA-ERデジタルカメラ(Hamamatsu Photonics)を用いて、画像を取得した。本発明者らは、MetaMorph画像解析ソフトウェア(Molecular Devices)を用いてEdU陽性細胞を定量した。データ解析は盲検化され、細胞のスコア付けを実施する調査員は、解析されるサンプル群に与えられた処理条件を知らなかった。
本発明者らは、以前に説明されているようにして5、6、低速度撮影顕微鏡検査法によってクローン筋肉幹細胞の増殖を調べた。簡単に説明すると、本発明者らは、単離した老化MuSCをPGE2(Cayman Chemical)またはビヒクル(DMSO)で24時間処理した。ヒドロゲル上で5日間増殖させた後、細胞を、直径600μmのヒドロゲルマイクロウェル中に表面積1cm2当たり細胞500個の密度で再度播種した。低速度撮影顕微鏡検査法のために、本発明者らは、単細胞を含む上記のウェルにおける細胞増殖を播種後12時間目(0日)から始めて2日目までモニターし、個別仕様の環境制御チャンバーおよび電動式載物台を備えたPALM/AxioObserver Z1システム(Carl Zeiss MicroImaging)を用いて倍率10倍で3分毎に画像を記録した。本発明者らは、取得時間間隔の間に1日おきに培地を交換した。本発明者らは、細胞トラッキングおよび系統復元のためのバクスターアルゴリズムを用いて一連の低速度撮影画像を解析して、単細胞を特定および追跡し、系統樹を作成した5、6、8〜10。
上式で、c0は、開始時の細胞数である。モデルとなる曲線は、図7Fにおいて実際の細胞数と共にプロットしている。
本発明者らは、RNeasyマイクロキット(Qiagen)を用いてMuSCからRNAを単離した。筋肉試料の場合、本発明者らは、組織を液体窒素中で急速凍結し、乳鉢および乳棒を用いて組織を均質化し、続いて注射器および針で粉砕し、次いでトリゾール(Invitrogen)を用いてRNAを単離した。本発明者らは、SensiFAST(商標)cDNA合成キット(Bioline)を用いて、各試料に由来する全mRNAからcDNAを逆転写した。本発明者らは、ABI 7900HTリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)においてSYBR Green PCRマスターミックス(Applied Biosystems)またはTaqMan Assays(Applied Biosystems)を用いるRT-PCRにcDNAを供した。本発明者らは、95℃で10分間、次いで95℃で15秒および60℃で1分のサイクルを40回で、試料を循環させた。相対的な転写物レベルを定量するために、本発明者らは、2-ΔΔCtを用いて処理試料および未処理試料を比較し、その結果をGapdhと比べて表した。SYBR Green qRT-PCRのために、本発明者らは以下のプライマー配列を使用した
TaqManユニバーサルPCRマスターミックス試薬キット(Applied Biosystems)と共に、TaqManアッセイ法(Applied Biosystems)を製造業者の取扱い説明書に従って用いて、試料中のPax7、ミオゲニン、Slco2a1 (PGT)、Ptger3、およびPtger4を定量した。転写物レベルは、Gapdhレベルと比べて表した。SYBRグリーンqPCRの場合、Gapdh qPCRを用いてインプットcDNA試料を標準化した。Taqman qPCRの場合、マルチプレックスなqPCRによって、標的シグナル(FAM)を内部のGapdhシグナル(VIC)に基づいて個別に標準化することができた。
筋肉を採取し、インドメタシン(5.6μg/ml)を含む氷冷PBS中ですすぎ、液体窒素中で急速凍結した。凍結した試料を液体窒素中で微粉砕した。この粉末を、500μlの溶解緩衝液(50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、4mM CaCl、1.5% Triton X-100、プロテアーゼインヒビター、および小球菌ヌクレアーゼ)を入れたエッペンドルフチューブに移し、次いで、組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。上清のPGE2レベルをPGE2 ELISAキット(R&D Systems、カタログ番号KGE004B)を用いて測定し、BCAアッセイ法(BioRad)によって測定したタンパク質総量と比べて表し、PGE2のngとして表した。各試料は、2つ1組で、2回の独立した実験のそれぞれにおいて調べた。
MuSCをDMSO(ビヒクル)またはPGE2(10ng/ml)で1時間処理し、製造業者(Promega)によって最適化されたcAMP-Gloアッセイ法プロトコールに従って環状AMPレベルを測定した。各試料は、3つ1組で、2回の独立した実験において調べた。
本発明者らは、ビヒクル(DMSO)またはPGE2(10ng/ml)による最初の短期的(24時間)処理後、ヒドロゲル上で7日間培養した後、MuSCのアポトーシスの読み取りとして、アネキシンVを調べた。本発明者らは、製造業者のプロトコールに従ってFITCアネキシンVアポトーシス検出キット(Biolegend、カタログ番号640914)を使用した。本発明者らは、NIH S10共用機器助成金(S10RR027431-01)を用いて購入した共用FACS設備において、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences)を用いるFACS LSR IIサイトメーターによって、細胞のアネキシンVを解析した。
分析物:
プロスタグランジン標準物質―PGF2α;PGE2;PGD2:15-ケトPGE2;13,14-ジヒドロ15-ケトPGE2;PGE2-D4;およびPGF2α-D9―はすべて、Cayman Chemicalから購入した。PGE2-D4内部標準のために、3位および4位を合計4個の重水素原子で標識した。PGF2α-D9の場合、17位、18位、19位、および20位を合計9個の重水素原子で標識した。
分析物原液(5mg/mL)をDMSO中で調製した。これらの原液をアセトニトリル/水(体積比1:1)で段階的に希釈して、一連の標準使用液を得、これらを用いて較正曲線を作り出した。10uLの各準使用液を200μLのホモジナイゼーション緩衝液(アセトン/水 体積比1:1;酸化防止のための0.005%BHT)に添加し、続いて10uLの内部標準溶液(3000 ng/mL、それぞれPGF2α-D9およびPGE2-D4)を追加することによって、較正曲線を作成した。較正曲線は、各試料セットを用いて新しく作成した。較正曲線の範囲:PGE2および13,14-ジヒドロ15-ケトPGE2の場合、0.05ng/mL〜500ng/mL;PGD2およびPGF2αの場合、0.1ng/mL〜500ng/mL;ならびに15-ケトPGE2の場合、0.025ng/mL〜500ng/mL。
抽出手順は、Prasain et al.11のものを改変し、アセトンタンパク質沈殿とそれに続く2段階液液抽出を含んだ;後者の段階は、LC-MS/MSの感度を高める。ブチルヒドロキシトルエン(BHT)および窒素(N2)ガス下での蒸発を用いて、酸化を防止した。
多くのプロスタグランジンは、質量が同じであり断片化パターンが類似している位置異性体であるため、クロマトグラフィー分離が不可欠である。2つのSRMトランジション―1つのクオンティフィアおよび1つのクオリフィア―を各分析物に対して慎重に選択した。特徴的なクオリフィアイオン強度比および保持時間は、標的分析物を確認するのに不可欠であった。解析はすべて、LC-20ADXRプロミネンス液体クロマトグラフおよび8030三連四重極型質量分析計 (Shimadzu)を用いるネガティブエレクトロスプレーLC-MS/MSによって実施した。HPLC条件:Acquity UPLC BEH C18 2.1x100mm、粒径1.7umのカラムを50℃、流速0.25mL/分で作動させた。移動相は、A:0.1%酢酸水溶液およびB:アセトニトリルに溶かした0.1%酢酸からなった。溶離プロファイル:最初に35%Bで5分間保持し、続いて、3分間で35%から40%まで、次いで3分間で40%から95%までの勾配;合計実行時間は14分であった。注入体積は20μLであった。これらのHPLC条件を用いて、本発明者らは、関心対象の分析物のベースライン分離を実現した。
高齢マウス(18ヶ月)を、2週間連続の下り坂トレッドミル走行に供した。第1週の間、マウスは5日間毎日走り、6日目および7日目に休息した。第1週の間の各トレッドミル走行後2時間目に、各マウスの両脚の各(外側および内側の)腓腹筋(GA)筋肉に、PBS(ビヒクル対照)または13nM dmPGE2(実験群)のいずれかの1回分を注射した。第2週の間、マウスを5日間のトレッドミル走行のみに供した。トレッドミル走行は、Exer3/6 (Columbus Instruments)を用いて実施した。マウスは、7メートル/分の速度で始めて、20°の下り坂のトレッドミルを10分間走った。3分後から、速度を1メートル/分ずつ速くして、最終速度を14メートル/分とした。電気的刺激にも関わらずトレッドミル上に動物がとどまることができない状態として定義される極度疲労が、独立した対照の高齢マウス群において12分の中央値で観察されたことから、10分間の走行時間を選択した。力の測定は、以前に公開されているプロトコールに基づいて、第5週にGA筋肉において行った5。簡単に説明すると、各マウスについて、GAを露出させるために切開部を作った。本発明者らは、無傷のアキレス腱を伴う踵骨を切断し、腱-骨複合体を細い金属製フックを用いて300C-LRフォーストランスデューサー(Aurora Scientific)に取り付けた。筋肉および腱は、生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム)溶液で定期的にぬらすことによって、湿った状態に保った。下肢は、脚への血液供給を損なわないように金属製クランプを用いて膝より下の部分を固定した。力の測定手順の間ずっと、マウスには吸入麻酔薬(2%イソフルオラン)を与え、加熱ランプによって体温を維持した。いずれの測定においても、本発明者らは、所定の超最大刺激電圧で0.1msのパルスを使用した。GA筋肉は、2mAの定電流を送る(方形波幅0.1ms)双極電気刺激カフを用いて、近位坐骨神経を介して刺激した。単収縮力測定の場合、1回の0.1msパルスによってGA筋肉を刺激し、強縮力測定の場合、150Hz、0.3秒のパルスの列でGA筋肉を刺激した。本発明者らは、各筋肉に対して5回の単収縮力測定、次いで5回の強縮力測定を実施した。その際、1群当たりn=5匹のマウスを用い、各測定の間に2〜3分回復させた。データはPCI-6251取得カード(National Instruments)を用いて集め、Matlabで解析した。本発明者らは、対照群とPGE2処理実験群とで類似している筋肉の生理学的断面積(PCSA)に基づいて力の測定値を標準化することによって、単位当たりの力の値を算出した(表2)。PCSA(単位mm2で測定)は、以下の式に従って算出した12:
PCSA(mm2)=[質量(g)×Cosθ]÷[p(g/mm3)×線維長(mm)]
上式で、θは、線維の羽状角であり、pは筋密度(0.001056g/mm3)である。
本発明者らは、少なくとも3回の独立した実験において細胞培養実験を実施し、各実験では3つの生物学的レプリケートをまとめた。通常、本発明者らは、少なくとも2回の独立した実験においてMuSC移植実験を実施し、その際、条件1つにつき少なくとも合計3〜5回の移植を行った。本発明者らは、対応のあるt検定を実験のために用い、対照試料はインビトロでは同じ実験から、またはインビボでは反対側の肢筋肉から得た。ノンパラメトリックなマンホイットニーの検定を使用して、未処理群(-)と処理群(PGEまたはdmPGE2)との有意差をα=0.05を用いて判定した。図の凡例に示したようにボンフェローニ補正を用いて決定した有意レベルまたはフィッシャーの検定を用いて、多重比較のためにANOVAまたは多重t検定を実施した。別段の説明がないかぎり、データは、平均値±平均値の標準誤差として示す。
本実施例は、PGE2を注射された高齢マウスにおいて腓腹筋の単位当たり単収縮力が増大していることを示す。高齢マウス(18ヶ月齢)を、10日間毎日、極度疲労するまでトレッドミル走行に供した。トレッドミル走行は、Exer3/6 (Columbus Instruments)を用いて実施した。マウスは、10メートル/分の速度で始めて、20°の下り坂のトレッドミルを走行した。3分後から、速度を1メートル/分ずつ速くして、最終速度を20メートル/分とした。極度疲労を、電気的刺激にも関わらずトレッドミル上に動物がとどまることができない状態と定義した。各トレッドミル走行後2時間目に、各マウスの両方の腓腹筋にPBS(対照群)または3nM PGE2(実験群)のいずれかを注射した。最後のトレッドミル走行後4週目に、所定の超最大刺激電圧で0.1msのパルスを1回与え、300C-LRフォーストランスデューサー(Aurora Scientific)を用いて、力の測定を実施した。
本発明によって開示される主題に基づいて提供される例示的態様には、特許請求の範囲および以下の態様が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
1. 単離された筋細胞群を、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と共に培養する段階
を含む、単離された筋細胞群の増殖を促すための方法。
2. 単離された筋細胞群が精製される、態様1記載の方法。
3. 単離された筋細胞群が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、態様1または2記載の方法。
4. 単離された筋細胞群が、筋肉幹細胞、衛星細胞、ミオサイト、筋芽細胞、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む、態様1〜3のいずれか1つに記載の方法。
5. 単離された筋細胞群が対象から得られる、態様1〜4のいずれか1つに記載の方法。
6. 対象が、筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を有している、態様5記載の方法。
7. 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患が、急性の筋肉の傷害または外傷、手の軟部組織傷害、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、遺伝性ミオパシー、筋緊張性筋ジストロフィー(MDD)、ミトコンドリアミオパシー、筋細管ミオパシー(MM)、重症筋無力症(MG)、鬱血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解症、皮膚筋炎、癌性悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、および筋肉減弱症からなる群より選択される、態様6記載の方法。
8. PGE2誘導体が16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む、態様1〜7のいずれか1つに記載の方法。
9. PGE2異化を減衰させる化合物が、
15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ(15-PGDH)を不活性化もしくは妨害するか、またはプロスタグランジントランスポーター(PTGもしくはSLCO2A1)を不活性化もしくは妨害する、化合物、中和ペプチド、または中和抗体
を含む、態様1〜7のいずれか1つに記載の方法。
10. 単離された筋細胞群を化合物と共に培養する段階が、該単離された筋細胞群を短期的に、間欠的に、または連続的に該化合物に曝露することを含む、態様1〜9のいずれか1つに記載の方法。
11. 対象において筋細胞の移植を促進するために、単離された筋細胞群を、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の有効量と共に培養する段階、ならびに
培養した筋細胞を該対象に投与する段階
を含む、対象において筋細胞移植を促進するための方法。
12. 単離された筋細胞群が精製される、態様11記載の方法。
13. 単離された筋細胞群が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、態様11または12記載の方法。
14. 単離された筋細胞群が、筋肉幹細胞、衛星細胞、ミオサイト、筋芽細胞、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む、態様11〜13のいずれか1つに記載の方法。
15. 単離された筋細胞群が、前記対象に対して自己由来である、態様11〜14のいずれか1つに記載の方法。
16. 単離された筋細胞群が、前記対象に対して同種異系である、態様11〜14のいずれか1つに記載の方法。
17. 前記対象が、筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を有している、態様11〜16のいずれか1つに記載の方法。
18. 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患が、急性の筋肉の傷害または外傷、手の軟部組織傷害、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、遺伝性ミオパシー、筋緊張性筋ジストロフィー(MDD)、ミトコンドリアミオパシー、筋細管ミオパシー(MM)、重症筋無力症(MG)、鬱血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解症、皮膚筋炎、癌性悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、および筋肉減弱症からなる群より選択される、態様17記載の方法。
19. PGE2誘導体が16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む、態様11〜18のいずれか1つに記載の方法。
20. PGE2異化を減衰させる化合物が、
15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ(15-PGDH)を不活性化もしくは妨害するか、またはプロスタグランジントランスポーター(PTGもしくはSLCO2A1)を不活性化もしくは妨害する、化合物、中和ペプチド、または中和抗体
を含む、態様11〜18のいずれか1つに記載の方法。
21. 単離された筋細胞群を化合物と共に培養する段階が、単離された筋細胞群を短期的に、間欠的に、または連続的に化合物に曝露することを含む、態様11〜20のいずれか1つに記載の方法。
22. 単離された筋細胞群と、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物とを含む、組成物。
23. 単離された筋細胞群が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、態様22記載の組成物。
24. 単離された筋細胞群が、筋肉幹細胞、衛星細胞、ミオサイト、筋芽細胞、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む、態様22または23記載の組成物。
25. 薬学的に許容される担体をさらに含む、態様22〜24のいずれか1つに記載の組成物。
26. 態様22〜25のいずれか1つに記載の組成物および取扱い説明書を含む、キット。
27. 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を有している対象において筋細胞群を再生するための方法であって、
該対象において筋細胞群を増加させるおよび/または筋機能を強化するために、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療的有効量と、薬学的に許容される担体とを、該対象に投与する段階
を含む、方法。
28. 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患が、急性の筋肉の傷害または外傷、手の軟部組織傷害、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、遺伝性ミオパシー、筋緊張性筋ジストロフィー(MDD)、ミトコンドリアミオパシー、筋細管ミオパシー(MM)、重症筋無力症(MG)、鬱血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解症、皮膚筋炎、癌性悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、および筋肉減弱症からなる群より選択される、態様27記載の方法。
29. 筋細胞群が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、態様27または28記載の方法。
30. 筋細胞群が、筋肉幹細胞、衛星細胞、ミオサイト、筋芽細胞、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む、態様27〜29のいずれか1つに記載の方法。
31. PGE2誘導体が16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む、態様27〜30のいずれか1つに記載の方法。
32. PGE2異化を減衰させる化合物が、
15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ(15-PGDH)を不活性化もしくは妨害するか、またはプロスタグランジントランスポーター(PTGもしくはSLCO2A1)を不活性化もしくは妨害する、化合物、中和ペプチド、または中和抗体
を含む、態様27〜30のいずれか1つに記載の方法。
33. 前記化合物を投与する段階が、経口、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、静脈内、または心臓内投与を含む、態様27〜32のいずれか1つに記載の方法。
34. 前記化合物が、短期的治療計画に従って投与される、態様27〜33のいずれか1つに記載の方法。
35. 投与する段階が、単離された筋細胞群を前記対象に投与することをさらに含む、態様27〜34のいずれか1つに記載の方法。
36. 単離された筋細胞群が、前記対象に対して自己由来である、態様35記載の方法。
37. 単離された筋細胞群が、前記対象に対して同種異系である、態様35記載の方法。
38. 単離された筋細胞群が精製される、態様35〜37のいずれか1つに記載の方法。
39. 単離された筋細胞群が、前記対象に投与される前に前記化合物と共に培養される、態様35〜38のいずれか1つに記載の方法。
40. 単離された筋細胞群を化合物と共に培養することが、該単離された筋細胞群を短期的に、間欠的に、または連続的に該化合物に曝露することを含む、態様39記載の方法。
41. 単離された筋細胞群を投与する段階が、該細胞を前記対象に注射または移植することを含む、態様35〜40のいずれか1つに記載の方法。
42. 単離された筋細胞群および前記化合物が前記対象に同時に投与される、態様35〜41のいずれか1つに記載の方法。
43. 単離された筋細胞群および前記化合物が前記対象に逐次的に投与される、態様35〜41のいずれか1つに記載の方法。
44. (i) 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を予防または治療するために、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療的有効量ならびに薬学的に許容される担体と、(ii)単離された筋細胞群とを、対象に投与する段階
を含む、それを必要とする対象において、筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を予防または治療するための方法。
45. PGE2誘導体が16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む、態様44記載の方法。
46. PGE2異化を減衰させる化合物が、
15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ(15-PGDH)を不活性化もしくは妨害するか、またはプロスタグランジントランスポーター(PTGもしくはSLCO2A1)を不活性化もしくは妨害する、化合物、中和ペプチド、または中和抗体
を含む、態様44記載の方法。
47. 単離された筋細胞群が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、態様44〜46のいずれか1つに記載の方法。
48. 単離された筋細胞群が、筋肉幹細胞、衛星細胞、筋芽細胞、ミオサイト、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む、態様44〜47のいずれか1つに記載の方法。
49. 単離された筋細胞群が精製される、態様44〜48のいずれか1つに記載の方法。
50. 単離された筋細胞群が、前記対象に投与される前に前記化合物と共に培養される、態様44〜49のいずれか1つに記載の方法。
51. 単離された筋細胞群を化合物と共に培養することが、該単離された筋細胞群を短期的に、間欠的に、または連続的に該化合物に曝露することを含む、態様50記載の方法。
52. 単離された筋細胞群が、前記対象に対して自己由来である、態様44〜51のいずれか1つに記載の方法。
53. 単離された筋細胞群が、前記対象に対して同種異系である、態様44〜51のいずれか1つに記載の方法。
54. 前記化合物を投与する段階が、経口、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、静脈内、または心臓内投与を含む、態様44〜53のいずれか1つに記載の方法。
55. 前記化合物が、短期的治療計画に従って投与される、態様44〜54のいずれか1つに記載の方法。
56. 単離された筋細胞群を投与する段階が、該細胞を前記対象に注射または移植することを含む、態様44〜55のいずれか1つに記載の方法。
57. 前記化合物および単離された筋細胞群が前記対象に同時に投与される、態様44〜56のいずれか1つに記載の方法。
58. 前記化合物および単離された筋細胞群が前記対象に逐次的に投与される、態様44〜56のいずれか1つに記載の方法。
59. 前記対象が、筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を有していると推測されるか、またはそれを発症するリスクを有している、態様44〜58のいずれか1つに記載の方法。
60. 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患が、急性の筋肉の傷害または外傷、手の軟部組織傷害、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、遺伝性ミオパシー、筋緊張性筋ジストロフィー(MDD)、ミトコンドリアミオパシー、筋細管ミオパシー(MM)、重症筋無力症(MG)、鬱血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解症、皮膚筋炎、癌性悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、および筋肉減弱症からなる群より選択される、態様44〜59のいずれか1つに記載の方法。
本発明者らは、RNeasyマイクロキット(Qiagen)を用いてMuSCからRNAを単離した。筋肉試料の場合、本発明者らは、組織を液体窒素中で急速凍結し、乳鉢および乳棒を用いて組織を均質化し、続いて注射器および針で粉砕し、次いでトリゾール(Invitrogen)を用いてRNAを単離した。本発明者らは、SensiFAST(商標)cDNA合成キット(Bioline)を用いて、各試料に由来する全mRNAからcDNAを逆転写した。本発明者らは、ABI 7900HTリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)においてSYBR Green PCRマスターミックス(Applied Biosystems)またはTaqMan Assays(Applied Biosystems)を用いるRT-PCRにcDNAを供した。本発明者らは、95℃で10分間、次いで95℃で15秒および60℃で1分のサイクルを40回で、試料を循環させた。相対的な転写物レベルを定量するために、本発明者らは、2-ΔΔCtを用いて処理試料および未処理試料を比較し、その結果をGapdhと比べて表した。SYBR Green qRT-PCRのために、本発明者らは以下のプライマー配列を使用した
TaqManユニバーサルPCRマスターミックス試薬キット(Applied Biosystems)と共に、TaqManアッセイ法(Applied Biosystems)を製造業者の取扱い説明書に従って用いて、試料中のPax7、ミオゲニン、Slco2a1 (PGT)、Ptger3、およびPtger4を定量した。転写物レベルは、Gapdhレベルと比べて表した。SYBRグリーンqPCRの場合、Gapdh qPCRを用いてインプットcDNA試料を標準化した。Taqman qPCRの場合、マルチプレックスなqPCRによって、標的シグナル(FAM)を内部のGapdhシグナル(VIC)に基づいて個別に標準化することができた。
Claims (60)
- 単離された筋細胞群を、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物と共に培養する段階
を含む、単離された筋細胞群の増殖を促すための方法。 - 単離された筋細胞群が精製される、請求項1記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、筋肉幹細胞、衛星細胞、ミオサイト、筋芽細胞、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1記載の方法。
- 単離された筋細胞群が対象から得られる、請求項1記載の方法。
- 対象が、筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を有している、請求項5記載の方法。
- 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患が、急性の筋肉の傷害または外傷、手の軟部組織傷害、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、遺伝性ミオパシー、筋緊張性筋ジストロフィー(MDD)、ミトコンドリアミオパシー、筋細管ミオパシー(MM)、重症筋無力症(MG)、鬱血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解症、皮膚筋炎、癌性悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、および筋肉減弱症からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
- PGE2誘導体が16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む、請求項1記載の方法。
- PGE2異化を減衰させる化合物が、
15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ(15-PGDH)を不活性化もしくは妨害するか、またはプロスタグランジントランスポーター(PTGもしくはSLCO2A1)を不活性化もしくは妨害する、化合物、中和ペプチド、または中和抗体
を含む、請求項1記載の方法。 - 単離された筋細胞群を化合物と共に培養する段階が、該単離された筋細胞群を短期的に、間欠的に、または連続的に該化合物に曝露することを含む、請求項1記載の方法。
- 対象において筋細胞の移植を促進するために、単離された筋細胞群を、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の有効量と共に培養する段階、ならびに
培養した筋細胞を該対象に投与する段階
を含む、対象において筋細胞移植を促進するための方法。 - 単離された筋細胞群が精製される、請求項11記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項11記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、筋肉幹細胞、衛星細胞、ミオサイト、筋芽細胞、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む、請求項11記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、前記対象に対して自己由来である、請求項11記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、前記対象に対して同種異系である、請求項11記載の方法。
- 前記対象が、筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を有している、請求項11記載の方法。
- 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患が、急性の筋肉の傷害または外傷、手の軟部組織傷害、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、遺伝性ミオパシー、筋緊張性筋ジストロフィー(MDD)、ミトコンドリアミオパシー、筋細管ミオパシー(MM)、重症筋無力症(MG)、鬱血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解症、皮膚筋炎、癌性悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、および筋肉減弱症からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
- PGE2誘導体が16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む、請求項11記載の方法。
- PGE2異化を減衰させる化合物が、
15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ(15-PGDH)を不活性化もしくは妨害するか、またはプロスタグランジントランスポーター(PTGもしくはSLCO2A1)を不活性化もしくは妨害する、化合物、中和ペプチド、または中和抗体
を含む、請求項11記載の方法。 - 単離された筋細胞群を化合物と共に培養する段階が、単離された筋細胞群を短期的に、間欠的に、または連続的に化合物に曝露することを含む、請求項11記載の方法。
- 単離された筋細胞群と、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物とを含む、組成物。
- 単離された筋細胞群が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項22記載の組成物。
- 単離された筋細胞群が、筋肉幹細胞、衛星細胞、ミオサイト、筋芽細胞、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む、請求項22記載の組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項22記載の組成物。
- 請求項22記載の組成物および取扱い説明書を含む、キット。
- 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を有している対象において筋細胞群を再生するための方法であって、
該対象において筋細胞群を増加させるおよび/または筋機能を強化するために、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療的有効量と、薬学的に許容される担体とを、該対象に投与する段階
を含む、方法。 - 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患が、急性の筋肉の傷害または外傷、手の軟部組織傷害、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、遺伝性ミオパシー、筋緊張性筋ジストロフィー(MDD)、ミトコンドリアミオパシー、筋細管ミオパシー(MM)、重症筋無力症(MG)、鬱血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解症、皮膚筋炎、癌性悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、および筋肉減弱症からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
- 筋細胞群が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項27記載の方法。
- 筋細胞群が、筋肉幹細胞、衛星細胞、ミオサイト、筋芽細胞、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む、請求項27記載の方法。
- PGE2誘導体が16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む、請求項27記載の方法。
- PGE2異化を減衰させる化合物が、
15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ(15-PGDH)を不活性化もしくは妨害するか、またはプロスタグランジントランスポーター(PTGもしくはSLCO2A1)を不活性化もしくは妨害する、化合物、中和ペプチド、または中和抗体
を含む、請求項27記載の方法。 - 前記化合物を投与する段階が、経口、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、静脈内、または心臓内投与を含む、請求項27記載の方法。
- 前記化合物が、短期的治療計画に従って投与される、請求項27記載の方法。
- 投与する段階が、単離された筋細胞群を前記対象に投与することをさらに含む、請求項27記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、前記対象に対して自己由来である、請求項35記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、前記対象に対して同種異系である、請求項35記載の方法。
- 単離された筋細胞群が精製される、請求項35記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、前記対象に投与される前に前記化合物と共に培養される、請求項35記載の方法。
- 単離された筋細胞群を化合物と共に培養することが、該単離された筋細胞群を短期的に、間欠的に、または連続的に該化合物に曝露することを含む、請求項39記載の方法。
- 単離された筋細胞群を投与する段階が、該細胞を前記対象に注射または移植することを含む、請求項35記載の方法。
- 単離された筋細胞群および前記化合物が前記対象に同時に投与される、請求項35記載の方法。
- 単離された筋細胞群および前記化合物が前記対象に逐次的に投与される、請求項35記載の方法。
- (i) 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を予防または治療するために、プロスタグランジンE2(PGE2)、PGE2プロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2異化を減衰させる化合物、PGE2阻害を無効にする化合物、その誘導体、その類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療的有効量ならびに薬学的に許容される担体と、(ii)単離された筋細胞群とを、対象に投与する段階
を含む、それを必要とする対象において、筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を予防または治療するための方法。 - PGE2誘導体が16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む、請求項44記載の方法。
- PGE2異化を減衰させる化合物が、
15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ(15-PGDH)を不活性化もしくは妨害するか、またはプロスタグランジントランスポーター(PTGもしくはSLCO2A1)を不活性化もしくは妨害する、化合物、中和ペプチド、または中和抗体
を含む、請求項44記載の方法。 - 単離された筋細胞群が、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋細胞、人工多能性幹細胞由来筋細胞、脱分化筋細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項44記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、筋肉幹細胞、衛星細胞、筋芽細胞、ミオサイト、筋管、筋線維、またはそれらの組み合わせを含む、請求項44記載の方法。
- 単離された筋細胞群が精製される、請求項44記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、前記対象に投与される前に前記化合物と共に培養される、請求項44記載の方法。
- 単離された筋細胞群を化合物と共に培養することが、該単離された筋細胞群を短期的に、間欠的に、または連続的に該化合物に曝露することを含む、請求項50記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、前記対象に対して自己由来である、請求項44記載の方法。
- 単離された筋細胞群が、前記対象に対して同種異系である、請求項44記載の方法。
- 前記化合物を投与する段階が、経口、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、静脈内、または心臓内投与を含む、請求項44記載の方法。
- 前記化合物が、短期的治療計画に従って投与される、請求項44記載の方法。
- 単離された筋細胞群を投与する段階が、該細胞を前記対象に注射または移植することを含む、請求項44記載の方法。
- 前記化合物および単離された筋細胞群が前記対象に同時に投与される、請求項44記載の方法。
- 前記化合物および単離された筋細胞群が前記対象に逐次的に投与される、請求項44記載の方法。
- 前記対象が、筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患を有していると推測されるか、またはそれを発症するリスクを有している、請求項44記載の方法。
- 筋肉の損傷、傷害、または萎縮を伴う病態または疾患が、急性の筋肉の傷害または外傷、手の軟部組織傷害、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、遠位型筋ジストロフィー(DD)、遺伝性ミオパシー、筋緊張性筋ジストロフィー(MDD)、ミトコンドリアミオパシー、筋細管ミオパシー(MM)、重症筋無力症(MG)、鬱血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解症、皮膚筋炎、癌性悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、および筋肉減弱症からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
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