KR20180129804A - 프로스타글란딘 e2를 이용한 근육 재생을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

프로스타글란딘 e2를 이용한 근육 재생을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

프로스타글란딘 E2(PGE2) 화합물 또는 PGE2 신호전달을 활성화시키는 화합물에 근육 세포를 노출시킴으로써 근육 세포를 증식시키기 위한 조성물, 방법, 및 키트가 본원에 제공된다. 단독이거나 분리된 근육 세포와 조합된 PGE2 화합물을 투여함으로써 근육 위축, 디스트로피 및/또는 손상으로 고통받는 대상체에서 근육을 재생시키기 위한 방법이 또한 제공된다. 분리된 근육 세포와 조합된 PGE2 화합물은 근육 질병 또는 질환을 예방하기 위해 예방적으로 투여될 수 있다.

Description

프로스타글란딘 E2를 이용한 근육 재생을 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 3월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 62/303,979호, 및 2016년 6월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 62/348,116호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 개시내용은 모든 목적상 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
미연방 후원 연구 및 개발하에 만들어진 발명에 대한 권리에 대한 진술
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여되는 수여 번호 AG020961 하에 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
골격근에서, 노화는 점진적으로 손상된 재생 및 근육량, 근력 및 기능의 손실을 발생시킨다. 근육 기능의 손실은 계속 증가하는 노인 인구에서 운동의 심한 손실 및 손상된 삶의 질을 종종 발생시키는 주요한 공중 보건 문제이다. 근육 기능 저하의 주요 결정요인은 노화 과정에서 급성 손상 또는 상해 후에 근육을 재생시키는 골격근 줄기 세포(MuSC)의 손상된 능력이다. 예를 들어, 수술후 고정 또는 불용, 암 및 HIV 악액질, 근육퇴행위축, 급성 손상, 및 노화로 인한 상해, 손상, 및/또는 위축을 겪은 근육에서 근육 재생을 증가시킬 필요가 또한 있다. 상주 MuSC는 드물지만, 성인기에 걸쳐 근육, 예를 들어, 골격근, 평활근 및 심장 근육의 유지 및 수복에 필수적이다. 노화와 함께, 기능적 줄기 세포의 수가 감소하고, 따라서 MuSC의 수 및 기능을 증가시킬 필요가 있다.
디노프로스톤(dinoprostone)으로도 공지된 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 여성의 분만을 유도하고, 조혈 줄기 세포 이식을 증가시키는 것을 포함하여 다양한 임상 환경에서 사용되어 왔다. PGE2는 항응고제 및 항혈전제로 사용될 수 있다. 염증을 해소할 수 있는 지질 매개체로서의 PGE2의 역할이 또한 널리 공지되어 있다. 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)인 COX-1 및/또는 COX-2의 억제제는 주로 PGE2 생합성을 통해 프로스타노이드를 억제함으로써 염증을 억제한다.
PGE2는 사이클로옥시게나제(COX) 및 프로스타글란딘 E 신타제 효소에 의해 아라키돈산으로부터 합성된다. PGE2의 수준은 PGE2 분해 효소인 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)에 의해 생리학적으로 조절된다. 15-PGDH는 PGE2 15-OH의 15-케토 기로의 비활성화 전환을 촉매한다.
상해, 손상, 기능장애, 및/또는 위축 근육을 재생시키거나 회복시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 상해, 손상, 기능장애, 및/또는 위축 근육을 재생시키거나 회복시키기 위한 효과적인 치료가 당 분야에 필요하다. 본 발명은 상기 필요를 만족시키고, 이점을 또한 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 분리된 근육 줄기 세포 집단의 증식을 자극하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물과 함께 분리된 근육 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 두번째 양태에서, 분리된 근육 세포의 집단 및 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
본 발명의 세번째 양태에서, 분리된 근육 세포의 집단 및 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
네번째 양태에서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 대상체에서 근육 세포의 집단을 재생시키기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 대상체에서 근육 세포의 집단을 증가시키고/시키거나 근육 기능을 향상시키기 위해 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
다섯번째 양태에서, 근육 상해, 손상 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료할 필요가 있는 대상체에서 근육 상해, 손상 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 (i) 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체, 및 (ii) 분리된 근육 세포의 집단을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 및 장점은 하기 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1a-1h는 일시적 PGE2 처리가 생체 내에서 어린 MuSC 증식을 촉진하는 것을 제시한다. 도 1a: 어린 전경골근(TA) 손상(노텍신(notexin), NTX) 후의 PGE2 수준; 대조군은 ELISA에 의해 검정된 손상되지 않은 반대측 TA였다; (시점 당 n=4 마우스). 도 1b: RT-qPCR에 의한 노텍신 손상 후의 MuSC에 의한 PGE2 합성 효소(Ptges2 및 Ptges)의 발현, (시점 당 n=3 마우스). 도 1c: 비히클(-) 또는 PGE2(10 ng/ml)을 이용한 24시간 처리, 및 이후 7일까지의 하이드로겔 상에서의 배양(급성 처리) 후의 MuSC 수에서의 증가; (4개의 독립적 실험에서 m=12 마우스). 도 1d: EP4 길항제(ONO-AE3-208, 1 μM)의 부재 또는 존재하에서 비히클(-) 또는 PGE2(10 ng/ml)를 이용한 일시적 24시간 처리 후의 MuSC 수에서의 증가; (3개의 독립적인 실험에서 검정된 n=9 마우스). 도 1e-1g: EP4 널(null) MuSC의 증식. EP4f/f(널) MuSC를 GFP/루시페라제를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰고, Cre를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터(+Cre) 또는 Cre가 없는 렌티바이러스 벡터(-Cre; 빈 벡터)로 처리하여 EP4 대립유전자를 결실시켰다. 이후, MuSC를 24시간 동안 비히클(-) 또는 PGE2(10 ng/ml)로 처리하고, 3일 동안 하이드로겔 상에서 배양하였다. 도 1e: EP4-널 MuSC 분석을 도시하는 개략도. 도 1f: EP4 널 MuSC 수; (2개의 독립적 실험에서 n=6 마우스). 도 1g: 대표적 이미지. 막대(Bar)=40 μm; GFP, 녹색; mCherry, 적색. 도 1h: 하이드로겔에서 7일 동안 2일마다 비히클(-) 또는 PGE2(10 ng/ml)로 처리된 챠콜 스트리핑된 배지(charcoal stripped medium)에서의 배양 후의 MuSC 수; (3개의 기술적 복제물을 갖는 n=3 마우스). *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0005 ****P<0.0001. 다중 비교를 위한 본페로니 보정(Bonferroni correction)을 이용한 ANOVA 검정(도 1a, 1b, 1d, 및 1f); 쌍을 이룬 t-검정(도 1c); 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정(도 1h). 평균+s.e.m., n.s., 유의하지 않음.
도 2a-2j는 PGE2에 대한 노화된 MuSC의 이상 반응을 제시한다. 도 2a: 노화된 TA 손상(노텍신, NTX) 후의 PGE2 수준; 대조군은 ELISA에 의해 검정된 손상되지 않은 반대측 TA였다; (시점 당 n=4 마우스). 도 2b: ELISA에 의해 검정된 손상되지 않은 어린(n=7 마우스) 및 노화된 (n=5 마우스) 마우스의 TA에서의 PGE2 수준. 도 2c: 분해 효소 15-PGDH의 이의 비활성 PGE 대사물인 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2(PGEM)로의 전환을 통한 PGE2 분해대사를 제시하는 개략도. 도 2d: 질량분광법에 의해 정량된 PGEM의 수준; (연령 그룹 당 n=4 마우스). 도 2e: PGE2 분해 효소 15-PGDH(Hpgd)의 발현; (2개의 기술적 복제물을 갖는 n=3 마우스). 도 2f: 7일에서 검정된 비히클(-), PGE2(10 ng/ml) 또는 15-PGDH 억제제인 SW033291(1 μM; SW)을 이용한 급성 24시간 처리 후의 노화된 MuSC 수에서의 증가; (5개의 독립적인 실험에서 n=15 마우스). 도 2g: 하이드로겔에서 7일 동안 2일마다 비히클(-) 또는 PGE2(10 ng/ml)로 처리된 챠콜 스트리핑된 배지에서의 배양 후의 노화된 MuSC 수; (3개의 기술적 복제물을 갖는 n=3 마우스). 도 2h: MuSC에 대한 PGE2 효과를 도시하는 개략도. PGE2는 증식을 촉진하기 위해 EP4 수용체/cAMP(고리형 AMP) 신호전달 경로를 통해 작용한다. 노화된 MuSC에서, PGT(프로스타글란딘 전달체)에 의한 세포내 전달 후, PGE2 분해대사는 15-PGDH의 비활성 형태인 PGEM으로의 전환에 의해 매개된다. 도 2i: 대조군(좌측) 및 PGE2를 이용한 급성 처리 후(우측)에 대한 마이크로웰에서 48시간 동안의 시간-경과 현미경검사법으로 추적된 노화된 MuSC 클론으로부터의 궤적. 본래의 세포와 이의 신생 프로제니 각각의 궤적은 상이한 색으로 표현된다. 도 2j: 대조군(좌측, n=32 클론) 및 PGE2를 이용한 급성 처리 후(우측, n=45 클론)에 대한 시간-경과 현미경검사법에 의해 추적된 클론에서의 노화된 MuSC의 살아 있는 세포 개수(수)에서의 변화. 모든 시점에서 각각의 세대(G1-G6)의 살아 있는 세포의 비율은 100개의 단일 MuSC의 시작 집단으로 표준화된 세포 수로 제시된다. 살아 있는 세포 개수에서의 증가율은 4.0%(대조군) 및 5.4%(PGE2-처리)(상단 패널)였다. 대조군(좌측) 및 PGE2를 이용한 급성 처리 후(우측)에 대한 시간-경과 현미경검사법에 의해 추적된 클론에서의 노화된 MuSC의 사멸 세포 개수(수)에서의 변화. 모든 시점에서 각각의 세대(G1-G6)의 사멸된 세포의 비율은 100개의 단일 MuSC의 시작 집단으로 표준화된 세포 수로 제시된다. 사멸된 세포 개수에서의 증가율은 1.0%(대조군) 및 0.1%(PGE2-처리)(하단 패널)였다. *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0005. 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 이용한 ANOVA 검정(도 2a 및 2f); 만-휘트니 검정(도 2b, 2d, 2e, 및 2g). 평균±s.e.m., n.s., 유의하지 않음.
도 3a-3d는 급성 PGE2 처리가 생체 내에서 MuSC 착생 및 재생을 촉진하는 것을 제시한다. 도 3a: 도 1c에 기재된 바와 같은 비히클(-) 또는 PGE2를 이용한 급성 처리 후의 트랜스제닉 마우스로부터 분리된 배양된 GFP/luc-표지된 어린 MuSC(250개 세포)의 착생. 이식 계획(상단). 각각의 TA에 대해 복사 휘도(radiance)로 측정된 비-침습성 생물발광 영상화(BLI) 신호; (조건 당 n=5 마우스)(하단). 도 3b: EP4 대립유전자를 결실시키기 위해 배양물에서 Cre로 처리(+Cre)되거나 처리되지 않은(-Cre; 빈 벡터) GFP/luc-표지된 EP4 f /f MuSC(1,000개 세포)의 착생. EP4 f /f MuSC는 BLI에 대해 GFP/루시페라제를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 이식 개략도(상단). 이식 후 BLI 신호(조건 당 n=5 마우스)(하단). 도 3c: 비히클(-) 또는 dmPGE2와 공동 주사된 새로이 분류된 GFP/luc-표지된 어린 MuSC(250개 세포)의 착생. 이식 개략도(상단). 이식 후 BLI 신호; (비히클 및 dmPGE2 처리 각각에 대해 n=4 및 n=5 마우스). 도 3d: 비히클(-) 또는 dmPGE2와 공동 주사된 GFP/luc-표지된 노화된 MuSC(250개 세포)의 착생; (조건 당 n=3 마우스)(하단). 노화된 MuSC는 BLI에 대해 GFP/루시페라제를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 이식 개략도(상단). 평균 복사 휘도(p s-1 cm-2 sr-1)으로 표현되는 이식 후 BLI 신호. 각각의 조건에 대한 대표적 BLI 이미지. 막대=5mm (도 3a-3d). 데이터는 2개의 독립적 실험의 대표이다. * P<0.05, **P<0.001 및 ***P<0.0005. 그룹 비교를 위한 ANOVA 검정 및 피셔 검정에 의한 종점에 대한 유의한 차이. 평균 +s.e.m.
도 4a-4p는 PGE2 단독의 근내 주사가 MuSC 확장을 촉진하고, 재생을 개선시키고, 힘을 증가시키는 것을 제시한다. 어린: (도 4a-4d) 심독소(CTX) 손상 48시간 후 어린 마우스의 TA 근육에 비히클(-) 또는 dmPGE2를 주사하였다; (조건 당 n=3 마우스). 도 4a: 실험 절차의 개략도(상단). 심독소 손상 14일 후의 핵(DAPI; 청색), LAMININ(녹색) 및 PAX7(적색) 염색을 갖는 대표적 TA 횡단면(하단). 화살촉 표시는 PAX7+ MuSC를 나타낸다. 막대 = 40 μm. 도 4b: 어린 마우스로부터의 TA의 횡단면에서의 100개의 섬유 당 PAX7 발현 위성 세포의 면역형광에 의한 내인성 MuSC에서의 증가. 도 4c: 근육섬유 분석을 위한 백스터 알고리즘(Baxter Algorithms for Myofiber Analysis)을 이용하여 정량된 비히클(-, 빈 백색 막대) 및 dmPGE2 처리된(채워진 청색 막대) 어린 TA에서의 근육섬유 횡단면적(CSA). 도 4d: 작은(<1,000 μm2 CSA) 및 큰(>1,000 μm2 CSA) 근육섬유의 분포. (도 4e-4g) Pax7-루시페라제에 의해 검정된 내인성 MuSC에서의 증가. Pax7 CreERT2 ;Rosa26-LSL-Luc 마우스에 타목시펜(TAM)을 복막내 처리하고, TA를 심독소(CTX) 손상에 적용시키고, 3일 후에 비히클(-) 또는 dmPGE2를 주사하고, BLI에 의해 모니터링하였다; (조건 당 n=3 마우스). 도 4e: 실험 절차의 개략도. 도 4f: BLI(조건 당 n=3 마우스). 도 4g: 대표적 BLI 이미지. 막대=5mm. 노화: (도 4h-4k) 심독소(CTX) 손상 48시간 후 노화된 마우스의 TA에 비히클(-) 또는 dmPGE2를 생체 내 처리하였다; (조건 당 n=3 마우스). 도 4h: 실험 절차의 개략도(상단). 심독소 손상 14일 후의 핵(DAPI; 청색), LAMININ(녹색) 및 PAX7(적색) 염색을 갖는 대표적 TA 횡단면(하단). 화살촉 표시는 PAX7+ 근육 줄기 세포를 나타낸다. 막대 = 40 μm. 도 4i: 노화된 마우스에 대한 도 4b에서와 같은 내인성 MuSC에서의 증가. 도 4j: 노화된 TA에 대한 도 4c에서와 같은 근육섬유 횡단면적(CSA). 도 4k: 노화된 TA에 대한 도 4d에서와 같은 CSA의 분포. (도 4l-4p) 내리막 트레드밀 달리기 후의 근육 수축력으로서 생체 내에서 측정된 노화된 마우스에서의 근력의 증가. 마우스를 2주 연속 동안 20° 내리막 트레드밀 달리기에 적용시키고, 5주째에 힘을 검정하였다. 첫 주 동안, 노화된 마우스의 내측 및 외측 비복근(GA)에 비히클(-) 또는 dmPGE2를 주사하였다. 각각 5개의 기술적 복제물을 갖는, 비히클(-) 처리 또는 dmPGE2 처리 각각에 대한 n=10 또는 8 생물학적 복제물. 도 4l: 실험 개략도. 대표적 연축력(twitch force)(도 4m) 및 강축력(tetanic force)(도 4n). 특정 근육 연축력(도 4o) 및 특정 근육 강축력(도 4p)을 힘을 생리학적 횡단면적(PCSA)에 대해 표준화시킴으로써 계산하였다. 쌍을 이룬 t-검정(도 4b, 4d, 4i 및 4k); 그룹 비교를 위한 ANOVA 검정 및 피셔 검정에 의한 종점에 대한 유의한 차이(도 4f); 만-휘트니 검정(도 4o 및 4p). *P<0.05, **P<0.001 및 **** P<0.0001. 평균+s.e.m.
도 5a-5k는 PGE2가 MuSC 확장을 촉진하는 것을 제시한다. 도 5a: ELISA에 의해 검정된 바와 같은 반대측의 손상되지 않은 대조군에 비한 어린 마우스의 전경골근(TA) 뒷다리 근육에 대한 냉동손상 3일 후의 PGE2 수준; (조건 당 시점 당 n= 4 마우스). 도 5b: 24시간(d0 내지 d1) 동안 PGE2(10ng/ml) 또는 비히클(-)를 이용한 처리 후 1시간 동안 EdU(적색)로 표지되고, MYOGENIN(녹색)에 대해 염색된 분열하는 근육 줄기 세포(MuSC)의 대표 이미지. 막대는 40 μm를 나타낸다. 도 5c: (b)에서와 같은 EDU로 표지된 분열하는 MuSC의 백분율; (2개의 독립적인 실험에서 3개의 기술적 복제물을 갖는 n=6 마우스). 도 5d: 비히클(-) 또는 지정된 용량의 PGE2(1-200 ng/ml)를 이용한 처리 후의 대사 생활력 검정 VisionBlue에 의해 측정된 증식에서의 증가; (2개의 독립적인 실험에서 3개의 기술적 복제물을 갖는 n=6 마우스). 도 5e: 비히클(-) 또는 PGE2를 이용한 24시간 처리 후의 MuSC에 의한 프로스타글란딘 수용체(Ptger 1- 4)의 발현; (2개의 기술적 복제물을 갖는 n=3 마우스). 도 5f: 미처리 대조군(-)에 비한 1시간의 PGE2 처리 후 MuSC에서의 cAMP 수준에서의 증가; (2개의 독립적 실험에서 검정된 3개의 기술적 복제물을 갖는 n=6 마우스). 도 5g-5h: 비히클(-) 또는 PGE2를 이용한 24시간 처리 후의 MuSC에 의한 Pax7(도 5g) 및 미오게닌(도 5h)의 발현; (2개의 기술적 복제물을 갖는 n=3 마우스). 도 5i-5j: EP4 f/f MuSC를 GFP/루시페라제를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰고, Cre를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터(+Cre) 또는 Cre가 없는 렌티바이러스 벡터(-Cre; 빈 벡터)로 처리하여 EP4 대립유전자를 결실시켰다. 막대 그래프는 +Cre MuSC(도 5i) 및 GFP/Luc+ MuSC(도 5j)의 백분율을 제시한다. 도 5k: 2일마다 비히클(-) 또는 PGE2(10 ng/ml)로 보충된 챠콜 스트리핑된 소 태아를 함유하는 근육모세포 배지에서 7일 후 하이드로겔 배양에서의 MuSC의 대표 이미지. 바는 40 μm를 나타낸다. *P<0.05, **P<0.001 , ***P<0.0005. 쌍을 이룬 t-검정(도 5a, 5e, 5g, 및 5h); 만-휘트니 검정(도 5c). 평균+s.e.m., n.s., 유의하지 않음.
도 6a-6c는 프로스타글란딘 및 PGE2 대사물을 검출하기 위한 어린 근육 및 노화된 근육의 질량분광법 분석을 제시한다. 도 6a: 분석되는 프로스타글란딘(PGE2, PGF2α 및 PGD2) 및 PGE2 대사물(15-케토 PGE2 및 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2)의 화학 구조, 화학식, 정확한 질량 및 분자량. 내부 표준 PGF2α-D9 및 PGE2-D9을 모든 복합 표준에 첨가하였다. 도 6b: 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화-탠덤 질량분광법(LC-ESI-MS/MS) 분석을 위한 보정선을 0.1 ng/ml 내지 500 ng/ml의 최종 농도로 스톡 용액을 희석시킴으로써 제조하였다. 표준 곡선 방정식 및 상관 계수가 각각의 표준에 대해 제시된다. 도 6c: 대표적 크로마토그램. 개별 피크는 분석되는 프로스타글란딘 및 이의 대사물의 우수한 크로마토그래피 해상도를 나타낸다. cps, 초 당 수.
도 7a-7g는 노화된 MuSC가 PGE2 처리에 반응하여 증식 및 세포 생존을 증가시키는 것을 제시한다. 도 7a-7c: qRT-PCR에 의해 측정된 mRNA 수준을 어린 MuSC 및 노화된 MuSC에 대해 Gapdh로 표준화시켰다; (2개의 기술적 복제물을 갖는 n=3 마우스). 도 7a: Slco2α1 유전자에 의해 인코딩된 프로스타글란딘 전달체(PGT). 도 7b: PGE2 합성 효소, Ptges 및 Ptges2. 도 7c: 유전자 Ptger1 -4에 의해 인코딩된 EP1-4 수용체. 도 7d: 비히클(-) 또는 PGE2 처리를 이용한 24시간 처리 후의 MuSC에서의 Pax7 mRNA 수준; (2개의 기술적 복제물을 갖는 n=3 마우스). 도 7e: 비히클(-; 상단) 또는 PGE2(하단)를 이용한 급성 처리 후의 시간-경과 현미경검사법에 의해 추적된 단일 노화 MuSC 클론. 각각의 클론에 대해, 48시간의 시간 경과 추적 후 살아 있는(빈 막대) 및 사멸된(흑색 막대) 세포의 결과 수가 제시된다. 도 7f: 48시간 동안의 비히클(-) 또는 일시적 PGE2 처리에 대해 시간-경과 현미경검사로 평가된 추적된 살아 있는 노화된 MuSC의 증식 곡선. 도 7g: 비히클(-) 또는 PGE2를 이용한 24시간 처리 후 노화된 MuSC에 대한 아폽토시스 Annexin V+의 흐름세포측정법 분석, 하이드로겔 상에서의 성장 7일 후 분석됨; (3개의 독립적 실험에서 n=9 마우스). α=0.05에서의 만-휘트니 검정(도 7a-7d) 및 쌍을 이룬 t-검정(도 7g). 평균+s.e.m., n.s., 유의하지 않음.
도 8a-8b는 근육 횡단면적의 근육섬유 분석을 위한 백스터 알고리즘을 제시한다. 도 8a: 심독소(CTX) 손상 48시간 후 비히클(-) 또는 PGE2를 이용하여 생체 내 처리된 어린 마우스의 전경골근 근육섬유의 대표적 횡단면 이미지. 이미지는 LAMININ, 녹색 및 DAPI, 청색을 이용한 염색을 제시한다. 도 8b: 손상 14일 후 근육섬유의 가로 단면의 횡단면적(CSA)(하단)을 결정하기 위해 근육섬유 분석을 위한 백스터 알고리즘에 의해 분석된 도 8a로부터의 해당 분절 이미지. 막대는 40 μm를 나타낸다.
도 9a-9g는 MuSC에서 PGE2 수용체의 결실이 손상 후 골격근의 재생 및 힘을 감소시키는 것을 제시한다. 타목시펜으로 처리된 Pax7-특이적 EP4 조건부 넉아웃 마우스(Pax7 CreERT2 ; EP4 fl /fl )의 전경골근(TA)이 노텍신 손상 6일 후(도 9c-9d), 21일 후(도 9b 및 9e), 및 14일 후(도 9f 및 9g)에 검정되었다; (조건 당 n=3 마우스). 도 9a: 실험 개략도. 도 9b: 손상 후 대조군 또는 EP4 KO 마우스로부터의 분류된 MuSC(α7+ CD34+ lin-)에서의 Ptger4(EP4 수용체)의 발현. 도 9c: 대표적 TA 횡단면. DAPI, 청색; 배아 미오신 중쇄(eMyHC), 적색. 막대 = 40 μm. 도 9d: eMyHC+ 섬유의 백분율. 도 9e: 대조군 및 Pax7-특이적 EP4 넉아웃 TA에서의 근육섬유 횡단면적(CSA). 도 9f: 노텍신 손상 14일 후의 근육 연축력 및 (도 9g) 근육 강축력. 만-휘트니 검정(도 9b, 9c, 9f, 및 9g); 그룹 비교를 위한 ANOVA 검정 및 피셔 검정에 의한 각각의 bin에 대한 유의한 차이(도 9e). *P<0.05, ***P<0.0005, 및 ****P<0.0001. 평균+s.e.m.
도 10a-10c는 재생의 초기 시점에서 근육에서의 내인성 PGE2 신호전달의 차단이 재생 및 힘을 감소시키는 것을 제시한다. 전경골근(TA)으로의 심독소 손상 후의 비히클(-) 또는 NSAID(인도메타신)을 이용한 주사 후의 비-침습성 생물발광 영상화(BLI)에 의한 타목시펜(TAM)으로 처리된 Pax7 CreERT2 ;Rosa26 - LSL -Luc 마우스에서 검정된 내인성 MuSC; (조건 당 n=3 마우스). 도 10a: 실험 개략도. 도 10b: BLI(조건 당 n=3 마우스). 도 10c: 노텍신 손상 14일 후의 근육 연축력(비히클-처리에 대해 n=8 및 NSAID-처리에 대해 10). 그룹 비교를 위한 ANOVA 검정 및 피셔 검정에 의한 종점에 대한 유의한 차이(도 10b). 만-휘트니 검정(도 10c). *P<0.05, **P<0.001 , ***P<0.0005, 및 ****P<0.0001. 평균+s.e.m.
I. 서문
본 발명은 부분적으로 프로스타글란딘 E2(PGE2)가 근육 세포 증식 및 기능을 개선시킬 수 있다는 발견을 기초로 한다. 단독이거나 분리된 근육 세포와 조합된 PGE2는 손상, 위축, 또는 질병으로 인한 근육 상해를 수복하기 위해 사용될 수 있다. 사실, PGE2-처리된 근육 세포는 투여시 향상된 근육 재생 및 개선된 근육 기능을 나타낸다. 이와 같이, 근육 재생 및 상해, 손상, 또는 위축 근육의 회복을 촉진하기 위한 새로운 치료 방법, 조성물, 및 키트가 본원에 제공된다.
II. 총론
본 발명의 실시는 분자생물학 분야의 통상적인 기술을 이용한다. 본 발명에서의 일반적인 사용 방법을 개시하는 기본 텍스트는 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegier, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, , eds., 1994)]을 포함한다.
핵산에 대해, 크기는 킬로베이스(kb), 염기쌍(bp), 또는 뉴클레오티드(nt)로 제공된다. 단일-가닥 DNA 및/또는 RNA의 크기는 뉴클레오티드로 제공될 수 있다. 이들은 아가로스 또는 아크릴아미드 젤 전기영동, 시퀀싱된 핵산, 또는 공개된 DNA 서열로부터 유래된 추정치이다. 단백질에 대해, 크기는 킬로달톤(kDa) 또는 아미노산 잔기수로 제공된다. 단백질 크기는 젤 전기영동, 시퀀싱된 단백질, 유도된 아미노산 서열, 또는 공개된 단백질 서열로부터 추정된다.
상업적으로 이용 가능하지 않은 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 문헌[Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)]에 기재된 바와 같이 자동 합성기를 이용하여 문헌[Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)]에 처음 기재된 고상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 정제는 임의의 당 분야에서 인정된 전략, 예를 들어, 문헌[Pearson and Reanier, J. Chrom . 255: 137-149 (1983)]에 기재된 바와 같은 천연 아크릴아미드 젤 전기영동 또는 음이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 수행된다.
III. 정의
본원에서 사용되는 바와 같은 하기 용어는 달리 특정되지 않는 한 이들에 기인되는 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 단수 관사 또는 정관사는 하나의 구성원을 갖는 양태를 포함할 뿐만 아니라 하나 초과의 구성원을 갖는 양태를 포함한다. 예를 들어, 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 상기 세포를 포함하며, "제제"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 1개 이상의 제제에 대한 언급을 포함하며, 기타 사항도 마찬가지이다.
용어 "프로스타글란딘 E2" 또는 "PGE2"는 사이클로옥시게나제(COX) 효소 및 말단 프로스타글란딘 E 신타제(PGES)를 통해 아라키돈산을 통해 합성될 수 있는 프로스타글란딘을 나타낸다. PGE2는 혈관확장, 염증, 및 수면/깸 주기의 조절을 포함하는 다수의 생물학적 기능에서 역할을 한다.
용어 "프로스타글란딘 E2 수용체 효능제" 또는 "PGE2 수용체 효능제"는 임의의 PGE2 수용체에 결합하고 이를 활성화시킴으로써 PGE2 신호전달 경로를 자극할 수 있는 화합물, 소분자, 폴리펩티드, 생물학적 생성물 등을 나타낸다.
용어 "PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물"은 PGE2의 분해를 저하시키거나 감소시킬 수 있는 화합물, 소분자, 폴리펩티드, 생물학적 생성물 등을 나타낸다.
용어 "PGE2 억제를 중화시키는 화합물"은 PGE2 합성, 활성, 분비, 기능 등의 억제제를 차단하거나 방해할 수 있는 화합물, 소분자, 폴리펩티드, 생물학적 생성물 등을 나타낸다.
화합물의 문맥에서 용어 "유도체"는 제공된 화합물의 아미드, 에테르, 에스테르, 아미노, 카르복실, 아세틸, 및/또는 알콜 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "배아 줄기 세포-유래 근육 세포" 또는 "ESC-유래 근육 세포"는 배아 줄기 세포로부터 유래되거나, 이로부터 분화되는 근육 세포를 나타낸다.
용어 "유도된 다능성 줄기-세포 유래 근육 세포" 또는 "iPSC-유래 근육 세포"는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래되거나, 이로부터 분화되는 근육 세포를 나타낸다.
세포의 문맥에서 용어 "분리된"은 본래의 조직(예를 들어, 근육 조직)에서 천연 발생하는 다른 세포 유형 또는 다른 세포 물질로부터 적어도 부분적으로 분리되고/되거나 정제된 관심 단일 세포 또는 관심 세포 집단을 나타낸다. 근육 세포가 아닌 세포가 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 특정 경우에, 적어도 약 99% 존재하지 않는 경우에 근육 세포의 집단이 "분리된" 것이다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 형광-활성화 세포 분류로 측정될 수 있다.
용어 "자가"는 이후에 개체로 재도입되는 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질(예를 들어, 세포)을 나타낸다.
용어 "동종이형"은 물질이 도입되는 개체와 동일 종의 상이한 동물로부터 유래되는 임의의 물질(예를 들어, 세포)을 나타낸다. 하나 이상의 유전자좌의 유전자가 동일하지 않은 경우 둘 이상의 개체가 서로 동종이형인 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 동일 종의 개체로부터의 동종이형 물질은 항원적으로 상호작용하기에 유전적으로 충분히 상이할 수 있다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 질병의 하나 이상의 증상의 개선; 상기 증상이 발생하기 전의 상기 증상 소견의 예방; 질병 진행의 늦춤 또는 완전한 예방(재발 에피소드 사이의 더 긴 기간, 증상 악화의 늦춤 또는 예방 등에 의해 명백할 수 있음); 완화 기간 발생의 향상; 질병의 진행성-만성 단계에서 야기되는 비가역적 손상의 늦춤(일차 및 이차 단계 둘 모두); 상기 진행성 단계의 발생의 지연; 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나를 나타낸다.
용어 "투여하다", "투여하는" 또는 "투여"는 본원에 기재된 화합물 및 세포와 같은 제제 또는 조성물의 원하는 생물학적 작용 부위로의 전달을 가능하게 하기 위해 이용될 수 있는 방법을 나타낸다. 이들 방법은 비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 피하, 복막내, 근내, 동맥내, 혈관내, 심장내, 수막강내, 비내, 피내, 유리체내 등), 경점막 주사, 경구 투여, 좌약으로서의 투여, 및 국소 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 질병 또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 예방하거나 경감시키기 위해 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포의 치료적 유효량을 투여하기 위한 추가 방법을 인지할 것이다.
용어 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량" 또는 "유효량"은 이롭거나 원하는 임상 효과를 발생시키기에 충분한 화합물, 치료제(예를 들어, 세포), 및/또는 약학적 약물의 양을 나타낸다. 치료적 유효량 또는 용량은 환자의 연령, 크기, 질병의 유형 또는 정도, 질병의 단계, 재생 세포의 투여 경로, 이용되는 보충 요법의 유형 또는 정도, 진행 중인 질병 과정 및 원하는 치료 유형(예를 들어, 공격적 대 통상적 치료)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 각각의 환자에 대해 개별적인 요인을 기초로 할 것이다. 본원에 기재된 바와 같은 약학적 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량은 세포 배양 및 동물 모델로부터 초기에 추정될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 방법에서 결정된 IC50 값은 동물 모델에서 시작점으로 작용할 수 있는 반면, 동물 모델에서 결정된 IC50 값은 인간에서 치료적 유효 용량을 발견하는데 이용될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 유기체에 유의한 자극을 야기시키지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 파괴하지 않는 담체 또는 희석제를 나타낸다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 인간을 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 포유동물은 뮤린, 래트, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
화합물의 투여의 맥락에서 용어 "급성 노출"은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체, 또는 세포로의 화합물의 일시적 또는 간단한 적용을 나타낸다. 일부 구현예에서, 급성 노출은 치료 과정 또는 연장된 기간에 걸친 화합물의 단일 투여를 포함한다.
화합물의 투여의 맥락에서 용어 "간헐적 노출"은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체, 또는 세포로의 화합물의 반복적 적용을 나타내며, 적용 사이에 원하는 기간이 경과한다.
화합물의 투여의 맥락에서 용어 "급성 요법"은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체로의 화합물의 일시적 또는 간단한 적용, 또는 대상체, 예를 들어, 인간 대상체로의 화합물의 반복 적용을 나타내며, 적용 사이에 원하는 기간(예를 들어, 1일)이 경과한다. 일부 구현예에서, 급성 요법은 치료 과정 또는 연장된 기간에 걸친 대상체로의 화합물의 급성 노출(예를 들어, 단일 용량)을 포함한다. 다른 구현예에서, 급성 요법은 대상체로의 화합물의 간헐적 노출(예를 들어, 반복 용량)을 포함하며, 각각의 노출 사이에 원하는 기간이 경과한다.
화합물의 투여의 맥락에서 용어 "연속 노출"은 연장된 기간에 걸친 대상체, 예를 들어, 인간 대상체, 또는 세포로의 화합물의 반복된 만성 적용을 나타낸다.
화합물의 투여의 맥락에서 용어 "만성 요법"은 화합물의 양 또는 수준이 선택된 기간에 걸쳐 실질적으로 일정하도록 하는 연장된 기간에 걸친 대상체, 예를 들어, 인간 대상체로의 화합물의 반복된 만성 적용을 나타낸다. 일부 구현예에서, 만성 요법은 연장된 기간에 걸친 대상체로의 화합물의 연속 노출을 포함한다.
IV. 구현예의 상세한 설명
일 양태에서, 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물과 함께 분리된 근육 세포 집단을 배양함으로써 분리된 근육 세포 집단의 증식, 확장, 및/또는 착생을 자극하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 실질적으로 정제되거나 정제된다(예를 들어, 비-근육 세포 또는 관심 대상이 아닌 다른 세포로부터 분리됨). 일부 예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
분리된 근육 세포의 집단은 대상체로부터 획득될 수 있다. 다른 구현예에서, 분리된 근육 세포는 세포주, 예를 들어, 일차 세포주로부터 유래된다. 일부 예에서, 대상체는 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는다. 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병은 급성 근육 손상, 열상, 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DO), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, PGE2 유도체는 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함한다. 다른 구현예에서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물은 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 15-PGDH에 의한 분해대사를 위해 세포 내부로 PGE2를 전달하는 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 단계는 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함한다. 화합물은 급성 방식으로 1회 분리된 세포에 노출될 수 있다. 다른 경우에, 화합물은 노출 사이에 시간이 경과하는 방식으로 1회 초과의 시점에서 분리된 세포에 노출될 수 있다. 또 다른 경우에, 화합물은 세포와 직접 접촉하는 화합물의 수준이 미리 선택된 양 이하로 떨어지지 않도록 분리된 세포에 연속적으로 노출될 수 있다.
특정 구현예에서, 대상체에서 근육 세포 착생을 촉진하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 대상체에서 근육 세포의 착생을 촉진하기 위해 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물과 함께 분리된 근육 세포 집단을 배양하거나 접촉시키고; 배양되거나 접촉된 근육 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 분리된 근육 세포의 집단 및 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 조성물 중 임의의 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 대상체에서 근육 세포의 집단을 재생시키기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 대상체에서 근육 세포의 집단을 증가시키고/시키거나 대상체에서 근육 기능을 향상시키기 위해 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
관련 양태에서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 대상체에서 근육 세포 집단의 증식 및/또는 확장을 자극하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 대상체에서 근육 세포의 집단을 증가시키고/시키거나 대상체에서 근육 기능을 향상시키기 위해 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 근육 세포의 집단은 근육 세포의 내인성 집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 근육 세포의 집단은 대상체에게 투여된(예를 들어, 주사되거나 이식된) 분리된 근육 세포의 집단을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 근육 세포의 집단은 근육 세포의 내인성 집단 및 대상체에게 투여된 분리된 근육 세포의 집단 둘 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병은 급성 근육 손상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 근육 세포의 집단은 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 경우에, 근육 세포의 집단은 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
일부 구현예에서, PGE2 유도체는 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함한다.
일부 구현예에서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물은 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 화합물을 투여하는 단계는 경구, 복막내, 근내, 동맥내, 피내, 피하, 정맥내, 또는 심장내 투여를 포함한다. 일부 경우에, 화합물은 급성 요법에 따라 투여된다. 특정 예에서, 급성 요법은 대상체로의 화합물의 급성 노출(예를 들어, 단일 용량)을 포함한다. 다른 예에서, 급성 요법은 대상체로의 화합물의 간헐적 노출(예를 들어, 반복 용량)을 포함한다. 비제한적인 예로서, 급성 PGE2 요법은 원하는 기간(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일의 과정)에 걸쳐 PGE2의 일련의 간헐적(예를 들어, 매일) 용량을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 투여 단계는 대상체에 분리된 근육 세포 집단을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 분리된 근육 세포의 집단은 대상체에 대해 자가 근육 세포 집단일 수 있다. 분리된 근육 세포의 집단은 대상체에 대해 동종이형 근육 세포 집단일 수 있다. 일부 예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 실질적으로 정제되거나 정제된다. 다른 예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 대상체에 투여되기 전에 화합물과 함께 배양된다. 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 단계는 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함할 수 있다. 분리된 근육 세포 집단을 투여하는 것은 대상체로 세포를 주사하거나 이식하는 것을 포함할 수 있다. 분리된 근육 세포 집단 및 화합물은 동시에 대상체에 투여될 수 있다. 대안적으로, 분리된 근육 세포 집단 및 화합물은 순차적으로 대상체에 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 근육 상해, 손상 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료할 필요가 있는 대상체에서 근육 상해, 손상 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 (i) 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체, 및 (ii) 분리된 근육 세포의 집단을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
관련 양태에서, (i) 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체, 및 (ii) 분리된 근육 세포의 집단을 대상체에 투여함으로써 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 대상체에서 근육 세포 집단의 증식 및/또는 확장을 자극하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 근육 세포의 집단은 근육 세포의 내인성 집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 근육 세포의 집단은 대상체에게 투여된(예를 들어, 주사되거나 이식된) 분리된 근육 세포의 집단을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 근육 세포의 집단은 근육 세포의 내인성 집단 및 대상체에게 투여된 분리된 근육 세포의 집단 둘 모두를 포함한다. 특정 구현예에서, 화합물의 치료적 유효량은 대상체에서 내인성 근육 세포의 집단을 증가시키고/시키거나, 대상체에 투여된 분리된 근육 세포의 집단을 증가시키고/시키거나, 대상체에서 근육 기능을 향상시키기에 충분한 양을 포함한다.
일부 구현예에서, PGE2 유도체는 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함한다. 일부 예에서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물은 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 근육 세포의 집단은 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 경우에, 근육 세포의 집단은 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 분리된 근육 세포의 집단은 실질적으로 정제되거나 정제된다.
일부 구현예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 대상체에 투여되기 전에 화합물과 함께 배양된다. 일부 경우에, 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 것은 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함한다.
일부 구현예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 대상체에 대해 자가 근육 세포 집단이다. 다른 구현예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 대상체에 대해 동종이형 근육 세포 집단이다.
화합물의 투여는 경구, 복막내, 근내, 동맥내, 피내, 피하, 정맥내, 또는 심장내 투여일 수 있다. 일부 경우에, 화합물은 급성 요법에 따라 투여된다. 특정 예에서, 급성 요법은 대상체로의 화합물의 급성 노출(예를 들어, 단일 용량)을 포함한다. 다른 예에서, 급성 요법은 대상체로의 화합물의 간헐적 노출(예를 들어, 반복 용량)을 포함한다. 비제한적인 예로서, 급성 PGE2 요법은 원하는 기간(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일의 과정)에 걸쳐 PGE2의 일련의 간헐적(예를 들어, 매일) 용량을 포함할 수 있다. 분리된 근육 세포 집단의 투여는 대상체에 세포를 주사하거나 이식하는 것을 포함할 수 있다. 화합물 및 분리된 근육 세포 집단은 동시에 대상체에 투여될 수 있다. 선택적으로, 화합물 및 분리된 근육 세포 집단은 순차적으로 대상체에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖거나, 발병할 위험이 있는 것으로 의심된다. 일부 경우에, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병은 급성 근육 손상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
A. 근육 세포의 증식 또는 착생을 자극하기 위한 방법
분리된 근육 세포의 증식 및/또는 착생을 자극하거나 촉진하기 위한 시험관 내 또는 생체 외 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 또는 이들의 조합물과 함께 분리된 근육 세포 집단을 배양하거나 접촉시키는 것을 포함한다. 화합물은 세포를 유지시키거나 증식시키기 위해 사용되는 임의의 배양 배지에 첨가될 수 있다.
화합물은 PGE2 신호전달을 모방하거나, 활성화시키거나, 자극할 수 있는 임의의 소분자, 프로드러그, 생물학적 생성물 등일 수 있다. 일부 경우에, 화합물은 PGE2(즉, 디노프로스톤), 합성 PGE2 유도체(예를 들어, 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2; dmPGE2), 합성 PGE2 유사체, 합성 PGE2 변이체, 또는 근육-특이적 PGE2 변이체이다. 다른 경우에, 화합물은 PGE2 프로드러그, 예를 들어, 근육 세포에 노출되거나 근육 세포에 근접하는 경우 약리학적으로 활성인 PGE2 약물로 대사될 수 있는 PGE2의 프로드러그이다. 또 다른 경우에, 화합물은 PGE2 수용체 1, PGE2 수용체 2, PGE2 수용체 3, 및 PGE2 수용체 4를 포함하는 PGE2 수용체 중 어느 하나의 효능제일 수 있다. 효능제는 하나 이상의 PGE2 수용체에 특이적으로 결합하거나 이를 활성화시킬 수 있다. 일부 경우에, 화합물은 PGE2 분해대사를 약화시키거나, 방해하거나, 억제하거나, 감소시키는 화합물, 예를 들어, PGE2를 분해하거나 대사시키는 효소, 예를 들어, 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물 또는 중화(차단) 항체일 수 있다. 다른 경우에, 화합물은 PGE2 및/또는 PGE2 합성, 활성 및/또는 분비의 억제를 차단하거나, 방해하거나, 대항한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 화합물은 정지 근육 세포를 포함하는 근육 세포의 증식을 촉발할 수 있다. 분리된 근육 세포의 집단은 근육 세포의 적어도 약 90%가 단일 유형의 근육 세포가 되도록 하는 순수하거나 실질적으로 순수한 근육 세포의 집단일 수 있다. 다른 구현예에서, 집단은 세포의 약 90% 미만이 한 유형의 세포인 근육 세포의 혼합물이다. 일부 예에서, 근육 세포는 대상체로부터 수거된 골격근 세포, 평활근 세포, 및/또는 심장 근육 세포를 포함한다. 다른 예에서, 근육 세포는 배아 줄기 세포, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포, 예를 들어, 인간 유도 다능성 줄기 세포로부터 생성되거나 분화된다. 또 다른 예에서, 근육 세포는 탈분화 근육 세포이다. 일부 구현예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 예를 들어, 분리된 근육 세포는 근육 줄기 세포의 순수하거나 실질적으로 순수한 집단일 수 있다. 대안적으로, 분리된 근육 세포는 위성 세포의 순수하거나 실질적으로 순수한 집단일 수 있다. 다른 예에서, 분리된 근육 세포는 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 임의의 조합물의 이종성 혼합물일 수 있다. 이와 같이, 혼합물은 근육 줄기 세포 및 위성 세포, 및 선택적으로 근육세포를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 근육 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포는 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병은 급성 근육 손상, 열상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 근감소증 또는 이들의 임의의 조합이다.
특정 구현예에서, 대상체에서 근육 세포 착생을 촉진하기 위한 생체 외 방법이 제공된다. 상기 방법은 대상체에서 근육 세포의 착생을 촉진하기 위해 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물과 함께 분리된 근육 세포 집단을 배양하거나 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 배양되거나 접촉된 근육 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 대상체에 대해 자가 근육 세포 집단이다. 다른 예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 대상체에 대해 동종이형 근육 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 대상체는 배양되거나 접촉된 근육 세포가 대상체에 투여되기 전, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 화합물이 투여될 수 있다. 일부 예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 대상체에 투여되는 동일한 화합물과 함께 배양되거나 접촉된다. 다른 예에서, 분리된 근육 세포의 집단은 대상체에 투여되는 화합물과 상이한 화합물과 함께 배양되거나 접촉된다.
근육 세포는 복합 흉근(musculi pectoralis complex), 광배근, 대원근 및 견갑하근, 상완요골근, 이두근, 상완근, 방형회내근, 원형회내근, 요측수근굴근, 척측수근굴근, 표재지굴근, 심수지굴근, 단수무지굴근, 무지대립근, 엄지모음근, 단수무지굴근, 장요근, 허리근, 복직근, 대퇴직근, 대둔근, 중둔근, 내측 슬건, 비복근, 외측 슬건, 대퇴사두근 기전, 장수내전근, 단내전근, 대내전근, 내측비복근, 외측비복근, 가자미근, 후경골근, 전경골근, 장지굴근, 단지굴근, 장족무지굴근, 장족무지신근, 손 근육, 팔 근육, 발 근육, 다리 근육, 가슴 근육, 배 근육, 등 근육, 엉덩이 근육, 어깨 근육, 두경부 근육 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 신체의 임의의 근육으로부터 획득될 수 있다.
일부 구현예에서, 근육 세포는 특정 근육으로부터 획득되고, 본원에 개시된 방법에 따라 확장된 후, 동일 근육으로 다시 이식되거나, 대안적으로 상이한 근육으로 이식된다. 일부 경우에, 근육 세포의 공급원 및 이식 부위는 대상체의 동일 근육이다. 다른 경우에, 근육 세포의 공급원 및 이식 부위는 대상체의 상이한 근육이다. 다른 경우에, 근육 세포의 공급원 및 이식 부위는 상이한 대상체로부터의 동일 유형의 근육이다. 또 다른 경우에, 근육 세포의 공급원 및 이식 부위는 상이한 대상체로부터의 상이한 유형의 근육이다.
본원에 개시된 화합물은 분리된 근육 세포와 급성으로, 간헐적으로 또는 연속적으로 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은 일정 기간 동안 단일 용량으로 세포에 노출된다. 다른 구현예에서, 화합물은 투여 사이에 일정 기간, 예를 들어, 1일, 2일, 1주 또는 그 이상 경과하도록 하여 적어도 2회 이상의 용량으로 세포에 노출된다. 일부 구현예에서, 화합물은, 예를 들어, 일정 기간에 걸쳐 화합물 농도 또는 세포에 대한 효과에서 변화 없이 세포에 만성적으로 또는 연속적으로 노출된다.
B. 대상체에서 상해를 입은 근육 세포를 재생시키기 위한 방법
본원에 제공된 방법은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에서 근육을 재생시키거나 회복시키기 위해 이용될 수 있다. 근육의 재생은 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육 전구 세포, 및 이들의 임의의 조합물로부터 새로운 근육 섬유를 형성시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 근육 수복 및/또는 유지를 향상시키거나 증대시키는데 유용하다.
본 발명의 PGE2 화합물은 근육 변성 또는 위축을 겪는 대상체에 투여될 수 있다. 근육 위축은 근육 질량 및/또는 근력의 손실을 포함할 수 있다. 이는 대상체의 임의의 근육에 영향을 줄 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 조성물, 방법, 및 키트를 필요로 하는 대상체는, 예를 들어, 연령, 비활성, 손상, 질병, 및 이들의 임의의 조합으로 인해 근육 손실을 나타내거나 경험한다.
일부 구현예에서, 화합물은 근육 세포 증식, 분화, 및/또는 근육 세포의 융합을 활성화시킬 수 있다. 일부 경우에, 근육 조직은 재생된다. 다른 경우에, 근육 기능(예를 들어, 근육량, 근력 및/또는 근육 수축)은 회복되거나 향상된다. 일부 경우에, 근육 약화 및 위축이 개선된다.
손상된 근육은 복합 흉근, 광배근, 대원근 및 견갑하근, 상완요골근, 이두근, 상완근, 방형회내근, 원형회내근, 요측수근굴근, 척측수근굴근, 표재지굴근, 심수지굴근, 단수무지굴근, 무지대립근, 엄지모음근, 단수무지굴근, 장요근, 허리근, 복직근, 대퇴직근, 대둔근, 중둔근, 내측 슬건, 비복근, 외측 슬건, 대퇴사두근 기전, 장수내전근, 단내전근, 대내전근, 내측비복근, 외측비복근, 가자미근, 후경골근, 전경골근, 장지굴근, 단지굴근, 장족무지굴근, 장족무지신근, 손 근육, 팔 근육, 발 근육, 다리 근육, 가슴 근육, 배 근육, 등 근육, 엉덩이 근육, 어깨 근육, 두경부 근육, 안면 근육, 안구인두 근육 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 신체의 임의의 근육일 수 있다.
근육 재생을 필요로 하는 대상체는 근골격 손상(예를 들어, 골절, 염좌, 삠, 급성 손상, 과용 손상 등), 수족 또는 안면에 대한 외상후 손상, 운동선수 손상, 노인에서의 골절후, 연조직 수의 외상, 근육 위축(예를 들어, 근육량의 손실), 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 후쿠야마 선천성 근이영양증(FCMD), 지대형 근이영양증(LGMD), 선천성 근이영양증, 안면견갑상완 근이영양증(FHMD), 근긴장성 근이영양증, 안구인두 근이영양증, 원위 근이영양증, 에머리-드레이푸스 근이영양증, 선천성 근육긴장증, 근육긴장퇴행위축, 다른 근육퇴행위축, 근육 소모 질병, 예를 들어, 암, 말기 신질환(ESRD), 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 또는 만성폐쇄폐병(COPD)으로 인한 악액질, 수술후 근쇠약, 외상후 근쇠약, 근감소증, 비활성(예를 들어, 근육 불용 또는 부동), 요도괄약근 결핍, 요도괄약근 결핍, 신경근 질병 등을 가질 수 있다.
신경근 질병의 비제한적인 예는 산성 말타제 결핍, 근육위축가쪽경화증, 안데르센-타윌 증후군(Andersen-Tawil syndrome), 베커 근육 디스트로피, 베커 선천성 근긴장증, 베들렘 근병증, 구척수 근위축증, 카르니틴 결핍, 카르니틴 팔미틸 트랜스페라제 결핍, 중심핵병, 중심핵근육병증, 샤르코-마리-투스병, 선천성 근이영양증, 선천성 근무력 증후군, 선천성 근육긴장성 이영양증, 코리병, 가지제거효소 결핍, 데저린-소타스병, 피부근육염, 원위 근이영양증, 뒤시엔느 근위축증, 근긴장성 근이영양증, 에머리-드레이푸스 근이영양증, 내분비 근육병증, 오일렌부르그병, 안면견갑상완 근이영양증, 경골 원위 근이영양증, 프리이드라이히 운동실조, 후쿠야마 선천성 근이영양증, 글리코겐증 타입 10, 글리코겐증 타입 11, 글리코겐증 타입 2, 글리코겐증 타입 3, 글리코겐증 타입 5, 글리코겐증 타입 7, 글리코겐증 타입 9, 고워-라잉 말단근병증, 유전성 봉입체 근육염, 갑상선기능항진 근육병증, 갑상선기능저하 근육병증, 봉입체 근육염, 유전성 근육병증, 인테그린-결핍성 선천성 근이영양증, 척수-연수 근위축증, 척수근위축증, 락테이트 데하이드로게나제 결핍, 램버트-이튼 근무력증 증후군, 맥아들병(McArdel disease), 메로신-결핍성 선천성 근이영양증, 근육의 대사 질병, 사립체근육병증, 미요시 말단근병증, 운동 뉴런병, 근육-눈-뇌병, 중증근육무력증, 미오아데닐레이트 데아미나제 결핍, 근육섬유 근육병증, 근육인산분해효소 결핍, 선천성 근육긴장증, 긴장성 근이영양증, 근세관성 근육병증, 네말린 근육병증, 노나카 말단근병증, 안구인두 근이영양증, 선천성 이상근긴장증, 피어슨 증후군, 주기마비, 포스포프룩토키나제 결핍, 포스포글리세레이트 키나제 결핍, 포스포글리세레이트 뮤타제 결핍, 인산화효소 결핍, 다발근육염, 폼페병, 진행성 외안근 마비, 척수근위축증, 울리히 선천성 근이영양증, 웰란더 말단 근병증, ZASP-관련 근육병증 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
근 위축(예를 들어, 근육 소모)은, 예를 들어, 정상 노화(예를 들어, 근감소증), 유전적 이상(예를 들어, 돌연변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형태), 불량한 영양, 불량한 순환, 호르몬 지원의 상실, 운동 부족으로 인한 근육의 불용(예를 들어, 침상안정, 깁스에서의 사지 고정 등), 노화, 근육을 자극하는 신경에 대한 손상, 회색질척수염, 근육위축가쪽경화증(ALS 또는 루게릭병), 심장기능상실, 간질환, 당뇨병, 비만, 대사 증후군, 탈수초 질병(예를 들어, 다발경화증, 샤르코-마리-투스병, 펠리체우스-메르츠바허병, 뇌척수염, 시신경척수염, 부신백색질형성장애, 및 길랑-바레 증후군), 탈신경, 피로, 운동-유발 근육 피로, 취약, 신경근육병, 쇠약, 만성 동통 등에 의해 야기되거나 이와 관련될 수 있다.
일부 양태에서, 대상체에서 근육 세포의 집단을 증가시키고/시키거나 근육 기능을 향상시키기 위해 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 대상체에 투여함으로써 근육을 재생시킬 필요가 있는 대상체에서 근육을 재생시키기 위한 방법이 본원에 제공된다. 대상체에서의 근육 세포의 집단은 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 또한, 대상체에서의 근육 세포는 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다. 화합물은 경구, 복막내, 근내, 동맥내, 피내, 피하, 정맥내, 또는 심장내 투여에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 일부 경우에, 화합물은 기능이상, 손상, 상해 및/또는 위축 근육에 직접 투여된다. 화합물은 급성 요법(예를 들어, 단일 또는 간헐적 투여) 또는 만성 요법(예를 들어, 연속 투여)에 따라 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에는 또한 대상체에 대해 자가이거나 동종이형인 분리된(또는 분리되고 정제된) 근육 세포의 집단이 투여된다. 세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 분리되고/되거나 정제될 수 있다. 세포는 근육 세포의 균질 또는 비균질 집단일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 대상체에게 투여하기 전에 세포를 PGE2 화합물과 함께 배양함으로써 증식하도록 자극된다. 세포는 시험관 내 배양 동안 화합물에 급성, 간헐적 또는 연속적으로 노출될 수 있다. 일부 경우에, 근육 세포의 집단은 PGE2 화합물과의 배양 후에 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 200%, 적어도 약 500%, 적어도 약 1000%, 또는 그 초과만큼 증가한다.
대상체에서 근육을 재생하거나 수복하기 위해, 본 발명의 화합물 및 분리된 근육 세포는 대상체에 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 화합물 및 배양된 근육 세포는 대상체에 동시에 투여된다. 다른 구현예에서, 화합물 및 분리된 근육 세포는 대상체에 순차적으로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 화합물 및 배양된 근육 세포는 대상체에 순차적으로 투여된다.
본원에 기재된 방법은 근육 섬유의 수를 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 200%, 적어도 약 500%, 적어도 약 1000% 또는 그 초과만큼 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상해, 손상, 위축, 또는 변성 근육의 성장을 증가시킬 수 있다.
C. 근육에 영향을 미치는 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 방법
본원에 제공된 방법은 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료할 필요가 있는 대상체에서 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 이용될 수 있다. 상기 방법은 근육 상해, 손상 또는 위축을 경험할 가능성이 있는 대상체에게 예방적 치료를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 근육에 영향을 미치는 가능한 이차 증상을 갖는 질환 또는 질병을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 대상체는 근육 질환 또는 질병을 치료하기 위해 외과적 또는 치료적 시술을 받았고, 본원에 개시된 방법은 반복 또는 재발을 예방하거나 억제하기 위해 이용된다. 일부 구현예에서, 대상체는 근육에 영향을 미치는 본원에 기재된 질환 또는 질병 중 어느 하나를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질병 중증도를 감소시키거나, 질병 진행을 중지시키거나, 질병을 제거하기 위한 질병 증상의 발생 전 및/또는 질환 또는 질병의 임상 소견, 또는 다른 소견 후에 적절한 형태의 화합물 및/또는 세포의 투여를 포함한다. 용어 질병의 "예방" 또는 질병을 "예방하는"은 바람직하게는 질환 또는 질병에 대해 증가된 감수성을 갖는 대상체에서 질환 또는 질병의 증상의 발생을 연장시키거나 지연시키는 것을 포함한다.
상기 방법은 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 (i) 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체, 및 (ii) 분리된 근육 세포의 집단을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 근육 세포는 대상체에 대해 자가 또는 동종이형 근육 세포일 수 있다.
화합물은 경구, 복막내, 근내, 동맥내, 피내, 피하, 정맥내 투여되거나, 심장내 주사에 의해 투여될 수 있다. 화합물은 급성 요법(예를 들어, 단일 또는 간헐적 투여) 또는 만성 요법(예를 들어, 연속 투여)에 따라 투여될 수 있다. 분리된 근육 세포는 주사 또는 이식에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물 및 세포는 함께 또는 동시에 투여된다. 다른 구현예에서, 화합물 및 세포는 순차적으로 투여된다. 일부 경우에, 화합물은 세포 전에 투여된다. 다른 경우에, 세포는 화합물 전에 투여된다.
분리된 근육 세포는 대상체로의 주사 또는 이식 전에 실질적으로 정제되거나 정제될 수 있다. 세포는 또한 투여 전에 배양물에서 확장되거나 증식하도록 자극될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 분리된 근육 세포, 예를 들어, 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육모세포, 근육세포, 근육대롱, 근육섬유, 및 이들의 임의의 조합물이 본 발명의 화합물과 함께 배양될 수 있다. 세포에 화합물을 급성으로, 간헐적으로 또는 연속적으로 노출시킴으로써, 근육 세포는 증식하고, 수가 증가한다. 확장된 세포는 근육 상해, 손상 또는 위축을 경험하는 대상체로 이식될 수 있다.
D. 프로스타글란딘 E2( PGE2 ) 화합물
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 PGE2, PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물은 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 15-PGDH에 의한 분해대사를 위해 세포 내부로 PGE2를 전달하는 프로스타글란딘 전달체를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체일 수 있다. 프로스타글란딘 전달체는 또한 2310021C19Rik, MATR1, Matrin F/Q, OATP2A1, PGT, PHOAR2, SLC21A2, 용질 담체 유기 음이온 전달체 패밀리 일원 2A1, 및 SLC02A1로도 공지되어 있다.
PGE2 수용체 효능제는 소분자 화합물, PGE2 수용체에 특이적으로 결합하는 활성화 항체 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은 PGE2 유도체 또는 유사체이다. 일부 구현예에서, 화합물은 PGE2 프로드러그이다. PGE2의 프로드러그는, 예를 들어, 투여 부위 또는 근육 재생 부위에서, 또는 프로드러그가 근육 세포에 노출되는 경우 약리학적으로 활성인 PGE2 약물로 대사될 수 있다.
특정 구현예에서, 화합물은 이의 안정성, 활성, 분해에 대한 내성, 근육 세포로의 전달(예를 들어, 세포 흡수 촉진), 및/또는 근육 세포에서의 보유(예를 들어, 흡수 후에 근육 세포로부터의 분비를 감소시킴)를 증가시키는 PGE2에 대한 하나 이상의 변형을 함유하는 PGE2 유도체 또는 유사체이다.
비제한적으로, PGE2 유도체 및 유사체의 예는 2,2-디플루오로-16-페녹시-PGE2 화합물, 2-데카르복시-2-하이드록시메틸-16-플루오로-PGE2 화합물, 2-데카르복시-2-하이드록시메틸-11-데옥시-PGE2 화합물, 19(R)-하이드록시 PGE2, 16,16-디메틸 PGE2, 16,16-디메틸 PGE2 p-(p-아세트아미도벤즈아미도)페닐 에스테르, 11-데옥시-16,16-디메틸 PGE2, 9-데옥시-9-메틸렌-16,16-디메틸 PGE2, 9-데옥시-9-메틸렌 PGE2, 부타프로스트(butaprost), 설프로스톤(sulprostone), 엔프로스틸(enprostil), PGE2 세리놀(serinol) 아미드, PGE2 메틸 에스테르, 16-페닐 테트라노르(tetranor) PGE2, 5-트랜스-PGE2, 15(S)-15-메틸 PGE2, 및 15(R)-15-메틸 PGE2를 포함한다. 추가의 PGE2 유도체 및 유사체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,409,911호에 기재되어 있다.
PGE2 유도체 및 유사체의 추가의 비제한적인 예는 하이드록시 사이클로펜타논 고리가 헤테로사이클릭 고리에 의해 대체되고, 불포화 알파-알케닐 사슬이 펜에틸 사슬로 치환된 문헌[Zhao et al. (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17:6572-5 (2007))]에 기재된 더욱 안정한 PGE2 유사체인 PGE2의 히단토인 유도체, 문헌[Ungrin et al. (Mol . Pharmacol ., 59: 1446-56 (2001))]에 기재된 PGE2 유사체, 문헌[Tanami et al. (Bioorg . Med . Chem . Lett ., 8: 1507-10 (1998))]에 기재된 PGE2의 13-데하이드로 유도체, 및 미국 특허 번호 8,546,603호 및 8,158,676호에 기재된 치환된 사이클로펜탄을 포함한다.
일부 구현예에서, 화합물은 PGE2 수용체, 예를 들어, EP1 수용체, EP2 수용체, EP3 수용체, 및 EP4 수용체의 효능제이다. PGE2 수용체 효능제의 비제한적인 예는 ONO-DI-004, ONO-AE1-259, ONO-AE-248, ONO-AE1-329, ONO-4819CD(Ono Pliarmaceiitical Co., Japan), L-902688(Cayman Chemical), CAY10598(Cayman Chemical), 및 CP-533536(Pfizer)을 포함한다. 추가의 PGE2 수용체 효능제는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,410,591호; 6,610,719호; 6,747,037호; 7,696,235호; 7,662,839호; 7,652,063호; 7622,475호; 및 7,608,637호에 기재되어 있다.
E. 분리된 근육 세포
본 발명의 근육(근원) 세포는 근육 줄기 세포, 골격근 줄기 세포, 평활근 줄기 세포, 심장 근육 줄기 세포, 근육 위성 세포, 근원 전구 세포, 근원 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 유사분열후 근육대롱, 다핵 근육섬유, 및 유사분열후 근육 섬유를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 분리된 근육 세포는 근육 줄기 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 분리된 근육 세포는 근육 위성 세포를 포함한다. 근육 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 골수 유래 줄기 세포, 또는 다능성 줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리된 근육 세포는 탈분화 근육 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 근육 세포는, 일부 경우에, 질병-관련 유전자 돌연변이를 교정하기 위해 유전적으로 변형된 것이다.
위성 세포는 근육 조직 내에 존재할 수 있는 작은 단핵 전구 세포이다. 이들 세포는 증식하고, 근육 세포로 분화하도록 유도될 수 있으며, 일부 예에서, 근육 섬유에 융합될 수 있다. 근육 상해 또는 손상 동안, 정지 위성 세포(예를 들어, 현재 분화를 하지 않거나 세포 분열을 겪지 않는 위성 세포) 및 근육 줄기 세포는 활성화되어 증식하고/하거나 근육 줄기 세포 니쉬(niche)에서 이주할 수 있다. 위성 세포 및 근육 줄기 세포는 또한 근육세포, 근육모세포, 또는 다른 근육 세포 유형으로 분화할 수 있다.
배아 줄기 세포로부터 근육 세포를 생성시키기 위한 방법 및 프로토콜은, 예를 들어, 문헌[Hwang et al., PLoS One, 2013, 8(8):e72023; 및 Darabi et al., Cell Stem Cell, 2012, 10(5):610-9]에 기재되어 있다. 유도된 다능성 줄기 세포로부터 근육 세포를 생성시키기 위한 방법 및 프로토콜은, 예를 들어, 문헌[Darabi et al., Cell Stem Cell, 2012, 10(5):610-9; Tan et al., PLoS One, 2011; 및 Mizuno et al., FASEB J., 2010, 24(7):2245-2253]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 근육 세포는 근육, 예를 들어, 성숙한 근육 또는 성인 근육, 예를 들어, 대퇴사두근, 대둔근, 이두근, 삼두근, 또는 개인으로부터의 임의의 근육으로부터 생검에 의해 획득된다. 근육은 골격근, 평활근, 또는 심장 근육일 수 있다. 평활근 줄기 세포를 분리하는 방법의 상세한 설명은, 예를 들어, 미국 특허 8,747,838호, 및 미국 특허 출원 공개 번호 20070224167호에서 발견될 수 있다. 근육 조직으로부터 관심 근육 세포, 예를 들어, 근육 줄기 세포 또는 위성 세포를 분리하는 방법은, 예를 들어, 문헌[Blanco-Bose et al., Exp . Cell Res., 2001, 26592:212-220]에 상세히 기재되어 있다.
관심 근육 세포, 예를 들어, 근육 줄기 세포, 근육 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 및/또는 근육섬유의 집단을 정제하기 위한 방법은 관심 근육 세포의 세포 표면에서 발현되는 특이적인 세포 표면 마커 또는 특이적인 폴리펩티드를 갖는 세포에 대해 선택하거나, 분리하거나, 농축하는 것을 포함한다. 유용한 세포 표면 마커는, 예를 들어, 문헌[Fukada et al., Front. Physiol, 2013, 4:317]에 기재되어 있다. 다른 세포 유형으로부터 관심 근육 세포를 분리하거나 단리시키기 위해 세포 분류 방법, 예를 들어, 흐름세포측정법, 예를 들어, 형광-활성화 세포 분류(FACS); 자기 비드 세포 분리, 예를 들어, 자기-활성화 세포 분류(MACS), 및 다른 항체-기반 세포 분류 방법이 수행될 수 있다.
관심 근육 세포의 분리된 집단은 통상적인 배양-기반 방법을 이용하여 확장되거나 증식될 수 있다. 근육 세포를 배양하기 위한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,324,656호에서 발견된다. 일부 경우에, 세포는 스캐폴드 또는 젤, 예를 들어, 하이드로젤에서 배양된다.
F. 투여 방법
본 발명의 화합물은 대상체의 손상 부위 또는 손상 부위 근처에서 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은, 예를 들어, 복막내, 근내, 동맥내, 경구, 정맥내, 두개내, 수막강내, 척수내, 병변내, 비내, 피하, 뇌실내, 국소, 및/또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 상기 화합물은 관심 근육 세포와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 화합물이 세포와 동시에 투여되는 경우, 화합물 및 세포 둘 모두는 동일 조성물로 투여될 수 있다. 별개로 투여되는 경우, 화합물은 약학적으로 허용되는 담체 중에 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은 세포의 투여 전 또는 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 화합물은 급성 요법에 따라 투여된다. 특정 예에서, 화합물은 대상체에 1회 투여된다. 다른 예에서, 화합물은 한 시점에서 투여되고, 두번째 시점에서 다시 투여된다. 또 다른 예에서, 화합물은 짧은 기간(예를 들어, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 또는 그 초과)에 걸쳐 간헐적 용량으로 반복적으로(예를 들어, 매일 1회 또는 2회) 대상체에 투여된다. 일부 경우에, 화합물 투여 사이의 시간은 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월 또는 그 초과이다. 다른 구현예에서, 화합물은 원하는 기간에 걸쳐 만성 요법에 따라 연속적으로 또는 만성적으로 투여된다. 예를 들어, 화합물은 화합물의 양 또는 수준이 선택된 기간에 걸쳐 실질적으로 일정하도록 투여될 수 있다.
대상체로의 분리된 근육 세포의 투여는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 이식 또는 주사, 예를 들어, 근내 주사에 의해 이루어진다. 도입되는 세포의 수는 성별, 연령, 체중, 질병 또는 장애의 유형, 장애의 단계, 세포 집단에서의 원하는 세포의 백분율(예를 들어, 세포 집단의 순도), 및 원하는 결과를 발생시키는데 필요한 세포 수와 같은 요인을 고려할 것이다. 일반적으로, 치료 목적을 위해 세포를 투여하기 위해, 세포는 약리학적으로 효과적인 용량으로 제공된다. "약리학적 유효량" 또는 "약리학적 유효 용량"은 원하는 생리학적 효과를 발생시키기에 충분한 양 또는 원하는 결과, 특히 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 소견을 감소시키거나 제거하는 것을 포함하는 질환 또는 질병을 치료하기 위한 원하는 결과를 달성할 수 있는 양이다. 약리학적 유효 용량은 또한 본원에 기재된 바와 같이 세포와 조합하여 사용되는 치료 화합물에도 적용될 것이다.
세포는 1회의 주사로, 또는 치료 효과를 발생시키기에 충분한 규정된 기간에 걸친 연속적인 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료가 연속 주사를 포함하는 경우 상이한 근육 세포의 집단이 주사될 수 있다. 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체가 대상체로의 세포의 주사를 위해 사용될 수 있다. 이들은 통상적으로, 예를 들어, 완충 염수(예를 들어, 인산염 완충 염수) 또는 보충되지 않은 기본 세포 배양 배지, 또는 당 분야에 공지된 바와 같은 배지를 포함할 것이다.
신체의 임의의 수의 근육, 예를 들어, 이두근; 삼두근; 상완요골근; 상완근(위팔근); 표재 구획 손목굴근; 삼각근; 슬건의 대퇴이두근, 박근, 반건형근 및 반막상근; 사두근의 대퇴직근, 외측광근, 내측광근 및 중간광근; 장딴지의 비복근(외측 및 내측), 전경골근, 및 가자미근; 가슴의 대흉근 및 소흉근; 윗등의 광배근; 능형근(대 및 소); 목, 어깨 및 등에 걸쳐 있는 등세모근; 배의 복직근; 및 엉덩이의 대둔근, 중둔근 및 소둔근에 본 발명의 화합물 및/또는 세포가 직접 주사될 수 있다.
G. 약학적 조성물
본 발명의 화합물 및 세포의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 이용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다(예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Eastern, PA (1990)] 참조).
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학적 조성물을 제형화하는데 있어서 당업자에게 공지된 임의의 표준의 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 따라서, 약학적으로 허용되는 염으로 제공되는 것과 같이 그 자체이거나 컨쥬게이트로서의 세포 또는 화합물은 약학적으로 허용되는 희석제, 예를 들어, 염수, 인산염 완충 염수(PBS), 수성 에탄올, 또는 글루코스의 용액, 만니톨, 덱스트란, 프로필렌 글리콜, 오일(예를 들어, 식물성 오일, 동물 오일, 합성 오일 등), 미정질 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록실프로필 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 포스페이트, 젤라틴, 폴리소르베이트 80 등에서의 제형으로, 또는 적절한 부형제 중 고체 제형으로 제조될 수 있다.
약학적 조성물은 종종 하나 이상의 완충제(예를 들어, 중성 완충 염수 또는 인산염 완충 염수), 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어, 글리신, 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 부틸화된 하이드록시아니솔 등), 정균제, 킬레이트제, 예를 들어, EDTA 또는 글루타티온, 제형이 수용자의 혈액과 등장성, 저장성 또는 약하게 고장성이 되도록 하는 용질, 현탁제, 증점제, 보존제, 착향제, 감미제, 및 착색 화합물을 적절하게 추가로 포함할 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여 제형과 양립되는 방식으로 그리고 치료적으로 효과적일 양으로 투여된다. 투여되는 양은, 예를 들어, 개인의 연령, 체중, 신체 활동, 및 식이, 치료되는 질환 또는 질병, 및 질환 또는 질병의 단계 또는 중증도를 포함하는 다양한 요인에 좌우된다. 특정 구현예에서, 용량의 크기는 또한 특정 개인에서 치료제(들)의 투여를 수반하는 임의의 유해한 부작용의 존재, 특성, 및 정도에 의해 결정될 수 있다.
그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특정 용량 수준 및 투여 빈도는 가변적일 수 있고, 이용되는 특정 화합물의 활성, 대사 안정성 및 상기 화합물의 작용 길이, 연령, 체중, 유전적 특징, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 방식 및 시간, 배출 속도, 약물 조합, 특정 질환의 중증도, 및 치료를 받는 숙주를 포함하는 다양한 요인에 좌우될 것이 이해될 것이다.
특정 구현예에서, 화합물의 용량은 고체, 반고체, 동결건조된 분말, 또는 액체 투여 형태, 예를 들어, 바람직하게는 정확한 투여량의 간단한 투여에 적합한 단위 투여 형태의 정제, 환약, 펠렛, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액, 에멀젼, 좌약, 정체 관장제, 크림, 연고, 로션, 젤, 에어로졸, 포움 등의 형태를 취할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단위 투여 형태"는 인간 및 다른 포유동물에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며, 각각의 단위는 적합한 약학적 부형제(예를 들어, 앰풀)와 회합된 원하는 발생, 내성, 및/또는 치료 효과를 발생하도록 계산된 소정량의 치료제를 함유한다. 또한, 더욱 농축된 투여 형태가 제조될 수 있으며, 이로부터 더욱 희석된 단위 투여 형태가 이후에 생성될 수 있다. 따라서, 더욱 농축된 투여 형태는 실질적으로 더 많은, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 이상의 양의 치료 화합물을 함유할 것이다.
상기 투여 형태를 제조하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기] 참조). 투여 형태는 통상적으로 퉁상적인 약학적 담체 또는 부형제를 포함하며, 다른 약제, 담체, 애쥬번트, 희석제, 조직 투과 향상제, 가용화제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적절한 부형제는 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 특정 투여 형태 및 투여 경로에 대해 맞춤화될 수 있다(예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기] 참조).
적합한 부형제의 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 트래거캔쓰, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 염수, 시럽, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 및 폴리아크릴산, 예를 들어, 카르보폴, 예를 들어, 카르보폴 941, 카르보폴 980, 카르보폴 981 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 투여 형태는 윤활제, 예를 들어, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 및 무기질유; 습윤제; 유화제; 현탁제; 보존제, 예를 들어, 메틸-, 에틸-, 및 프로필-하이드록시-벤조에이트(즉, 파라벤); pH 조절제, 예를 들어, 무기 및 유기 산 및 염기; 감미제; 및 착향제를 추가로 포함할 수 있다. 투여 형태는 또한 생물분해성 중합체 비드, 덱스트란, 및 사이클로덱스트린 포함 복합체를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위해, 치료적 유효 용량은 정제, 캡슐, 에멀젼, 현탁액, 용액, 시럽, 스프레이, 로젠지, 분말, 및 지속-방출 제형의 형태로 존재할 수 있다. 경구 투여를 위한 적합한 부형제는 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함한다.
치료적 유효 용량은 또한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 상기 투여 형태는 투여 전에 재구성을 위한 완충제, 예를 들어, 바이카르보네이트를 포함할 수 있거나, 완충제가, 예를 들어, 물을 이용한 재구성을 위한 동결건조된 투여 형태로 포함될 수 있다. 동결건조된 투여 형태는 적합한 혈관수축제, 예를 들어, 에피네프린을 추가로 포함할 수 있다. 동결건조된 투여 형태는 선택적으로 재구성을 위한 완충액과 함께 패키징된 주사기 내에 제공될 수 있어, 재구성된 투여 형태가 즉시 개인에게 투여될 수 있다.
H. 키트
본원에 기재된 조성물의 다른 구현예는 분리된 근육 세포의 집단 및 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물(예를 들어, 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH) 억제제 또는 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1) 억제제), PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 키트이다. 키트는 통상적으로 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있는 용기를 함유하며, 이는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함할 수 있다. 표지가 통상적으로 키트에 동반되며, 이는 키트 내용물의 사용에 대한 설명서 또는 다른 정보를 제공하는 임의의 서면 또는 전자 또는 컴퓨터 판독가능 형태일 수 있는 기록 자료를 포함한다.
V. 실시예
하기 실시예는 예시를 위해 제공되지만, 청구된 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1: 노화된 마우스에서 골격근 재생 및 근력을 증가시키는 급성 프로스타글란딘 E2 전달.
본 실시예는 PGE2 신호전달이 재생 동안 근육 줄기 세포 기능에 필요하다는 것을 예시한다.
고령자는 운동성 및 삶의 질을 감소시키는 진행성 골격근 소모 및 재생 실패로 고통받는다1 ,2. 근육 재생에 중요한 것은 근육 조직의 니쉬에 존재하고, 손상에 반응하도록 유지되고, 생애 전체에 걸쳐 골격근을 수선하는 성인 근육 줄기 세포(MuSC)이다3 -8. 노화 동안, 기능성 MuSC의 비율은 현저히 감소하여, 근육 재생을 방해한다9-13. 현재까지, 이러한 재생 감소에 대항하기 위해 MuSC를 표적으로 하는 임상적으로 사용되는 치료제가 없다. 본원에서, 본 발명자는 근육 재생에 필수적인 MuSC 기능의 강력한 조절인자로서 천연 면역조절제인 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 확인한다. 본 발명자는 PGE2 수용체인 EP4가 시험관 내에서의 MuSC 증식 및 마우스에서의 생체 내 착생에 필수적인 것을 발견하였다. 노화된 마우스의 MuSC에서, PGE2 경로는 세포 고유의 분자 결함인 PGE2를 비활성으로 만드는 상승된 프로스타글란딘 분해 효소(15-PGDH)로 인해 조절이 불가능해진다. 이러한 결함은 손상된 근육으로의 MuSC 이식과 함께 안정적인 분해 내성 PGE2인 16,16-디메틸 PGE2(dmPGE2)에 대한 MuSC의 일시적 급성 노출에 의해 극복된다. 특히, 손상 후 내인성 MuSC 수 및 근육섬유 크기에서의 초기 증가에 의해 명백하게 dmPGE2 단독의 단일 근육내 주사가 재생을 가속화하는데 충분하다. 또한, 운동 유도 재생 및 급성 dmPGE2 치료 요법에 반응하여 노화된 마우스의 근력 발생 능력이 증가되었다. 본 발명의 결과는 근육 재생 및 근력의 강력한 유도제로서의 PGE2에 대한 새로운 치료 징후를 나타낸다.
근육 재생 잠재성의 감소에 대항하기 위해, 본 발명자는 근육 재생 전용인 줄기 세포 집단인 위성 세포로도 공지된 MuSC를 표적으로 하는 치료제를 찾았다3 -8. 일시적 염증 및 섬유지방생성 반응이 근육 재생에서 중요한 역할을 하므로14 -17, 본 발명자는 MuSC 기능에서 연령-관련 감소를 극복할 수 있는 손상에 의해 유도된 면역 조절제를 확인하고자 했다. 본 발명자의 전사체 데이터베이스의 분석은 급성 염증 동안 천연적이고 강력한 지질 매개체인 PGE2에 대한 Ptger4 수용체18가 새로이 분리된 MuSC에서 높은 수준으로 발현된 것을 나타내었다. 근육 조직 용해질에서, 본 발명자는 노텍신(notexin) 주사 또는 냉동손상을 수반하는 표준 손상 패러다임에 의한 어린(2 내지 4개월) 마우스 근육에 대한 손상 3일 후에 PGE2의 수준에서의 급상승(도 1a 및 도 5a), 및 이의 합성 효소인 Ptges 및 Ptges2의 동반 상향조절(도 1b)을 검출하였다. 이러한 초기 및 일시적 시간대는 손상 후 MuSC 확장 및 염증성 사이토카인 축적의 널리 기록된 동역학과 일치한다8 ,15,16. PGE2 처리가 MuSC 거동을 향상시켰는지 결정하기 위해, 본 발명자는 어린 마우스(2 내지 4개월)의 뒷다리 근육으로부터 MuSC를 FACS 정제하고6, 이를 12 kpa 강성도의 하이드로겔에 플레이팅하여 줄기 세포 기능을 유지시켰다19. 본 발명자는 PGE2(10ng/ml)가 EDU 혼입에 의해 검정시 세포 분열을 증가시키고(도 1b-1d), PGE2에 대한 급성 1일 노출이 1주 후의 대조군에 비해 MuSC의 수에서 6배의 증가를 유도(도 1c)한 것을 발견하였다.
PGE2는 4개의 G-단백질 결합 수용체(Ptger1-4; EP1-4)를 통해 신호하는 것으로 공지되어 있으나18 ,20, MuSC에서의 이들 수용체의 발현은 이전에 기재된 적이 없다. 상이한 수용체(Ptger1-4)의 전사물 수준의 분석은 MuSC의 PGE2 처리 후에 상향조절된 수용체가 단지 Ptger1 및 Ptger4인 것을 나타내었다(도 5e). PGE2 자극된 MuSC는 세포내 cAMP를 상승시켰고18 ,20, 이는 PGE2가 증식 및 줄기 세포 전사 상태를 촉진하기 위해 EP4를 통해 신호하는 것을 확증한다(도 5f-5h). EP4 길항제인 ONO-AE3-208의 존재하에서, PGE2에 의해 유도된 증식은 둔화되었다(도 1d). 그러나, EP4에 대한 PGE2의 특이성은 cre-매개 조건부 제거 후 수용체가 결핍된 MuSC에서 가장 명백히 나타났다(도 1e-1g 및 도 5i-5j). 실제로, 성장 인자-풍부 배지의 존재하에서도, 이들 EP4-널 MuSC는 증식에 실패했다. 최종적으로, 본 발명자는 MuSC 성장이 챠콜 스트리핑된 혈청을 갖는 배지에 대한 노출에 의해 중지되고21, PGE2의 첨가시 분열됨을 발견하였다(도 1h 및 도 5k). 따라서, PGE2/EP4는 MuSC 증식에 필요하고 충분한 것으로 두드러진다.
본 발명자는 PGE2가 노화된 MuSC에 대해 이전에 보고된 근육 재생 결함을 개선시킬 수 있는지 결정하고자 하였다9 -13. 어린 마우스 근육(2 내지 4개월)과의 대조에 의해, 노화된 근육(18 내지 20개월)에 대한 노텍신 손상은 PGE2 합성의 증가를 발생시키지 않았다. 대신, 노화된 근육에서의 항정 상태 PGE2 수준은 손상 후에 변화되지 않고 유지되었으며(도 2a), 이는 어린 사지 전경골근(TA) 근육에서보다 유의하게 높았다(도 2b). 본 발명자는 노화된 근육에서의 PGE2가 분해대사 결함으로 인해 기능이상이 될 수 있다고 가정하였다. 실제로, 본 발명자가 질량분광법에 의해 어린 TA 근육 조직 및 노화된 TA 근육 조직에 존재하는 PGE2를 분석한 경우, 본 발명자는 비활성화 형태인 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2(PGEM)의 상대량이 노화된 TA 근육 조직에서 유의하게 증가된 것을 발견하였다(도 2c-2d 및 도 6a-6c). 이는 PGE2의 이의 비활성화 형태로의 전환에서의 초기 단계인 PGE2 분해 효소(15-PGDH)를 인코딩하는 mRNA의 수준에서의 동반적인 7배의 증가로 인한 것으로 판명되었다(도 2e). 대조적으로, 프로스타글란딘 전달체(PGT), PGE2 합성 효소, 및 EP4 수용체의 상대 수준은 어린 MuSC와 노화된 MuSC 사이에 상이하지 않았다(도 7a-7c). 또한, 노화된 MuSC가 PGE2의 1일 펄스 또는 15-PGDH의 억제제(SW033291)에 노출된 경우22, 15-PGDH의 효과는 극복되었고, 증식에서의 특징적인 증가 및 Pax7 발현의 유지가 관찰되었다(도 2f 및 도 7d). 어린 MuSC와 마찬가지로, 노화된 MuSC는 챠콜 스트리핑된 혈청이 포함된 배지에서 증식하는데 실패하였으나, PGE2 단독의 첨가에 의해 구제되었다(도 2g). 본 발명자는 노화된 MuSC에서, PGE2 또는 SW에 대한 급성 노출에 의해 배양에서 극복될 수 있는 세포 고유의 분자 결함인 상승된 15-PGDH로 인해 PGE2 경로가 조절되지 않는 것으로 추측하였다(도 2h).
노화된 MuSC는 이종성이므로10, 본 발명자는 단일 세포 수준에서의 PGE2의 효과를 결정하고자 하였다. 클론 분석은 전체적인 집단의 분석에 의해 가려진 차이를 밝혀낼 수 있다. 따라서, 본 발명자는 1일 동안 PGE2에 일시적으로 노출된 단일한 노화된 MuSC 및 처리되지 않은 대조군 MuSC의 하이드로겔의 '마이크로웰'에서의 장기간의 시간-경과 현미경검사를 수행하였다. 데이터를 48시간의 기간에 걸쳐 수집한 후, 본 발명자의 이전에 기재된 세포 추적 및 계통 재건을 위한 백스터 알고리즘(Baxter Algorithms for Cell Tracking and Lineage Reconstruction)을 이용하여 분석하였다10,19,23. 본 발명자는 가장 강한 클론에 대해 6세대에 걸친 PGE2에 대해 반응한 누적 세포 수에서의 현저한 증가를 관찰하였다(도 2i-2j). PGE2 처리 후 클론 당 세포의 수는 세포 사멸의 상당한 감소(도 2j 및 도 7e-7g)를 동반하는 증식에서의 현저한 증가(도 2i-2j 및 도 7e-7f)로 인해 유의하게 증가되었다. 이들 상승작용적 효과는 PGE2에 반응하여 노화된 MuSC 수에서의 관찰되는 증가를 발생시켰다.
PGE2를 이용한 어린 MuSC의 일시적 처리가 재생을 증가시키는지의 여부를 시험하기 위해, 본 발명자는 배양된 PGE2 처리 MuSC를 마우스의 손상된 뒷다리 근육에 이식하였다. 생체 내에서 정량적 방식으로 시간 경과에 따라 재생의 동역학을 모니터링하기 위해, 본 발명자는 이식후 MuSC 기능을 모니터링하기 위해 본 발명자가 이전에 개발한 민감한 정량적 생체발광 영상화(BLI) 검정을 활용하였다6 ,10,19. MuSC를 GFP 및 루시페라제를 발현하는 어린 트랜스제닉 마우스(2 내지 4개월)(GFP/Luc 마우스)로부터 분리하고, 급성 1일 PGE2 처리에 노출시키고, 수거하고, 7일째에 이식하였다. 동등한 수의 dmPGE2 처리 MuSC 및 대조군 MuSC(250개의 세포)를 어린(2 내지 4개월) NOD-SCID 마우스의 손상된 뒷다리에 이식하였다. PGE2를 이용한 급성 처리 후, 어린 MuSC 재생 능력은 BLI에 의해 평가될 때 한 자릿수만큼 향상되었다(도 3a). 대조적으로, 조건부 제거로 인해 EP4 수용체가 결핍된 4배 더 많은 수의 배양된 MuSC의 이식 후(도 3b), 초기에 검출된 BLI 신호는 유의성 임계치 이하의 수준으로 점진적으로 감소하였다(도 3b).
또한, EP4의 근육 줄기 세포 특이적 결실의 마우스 모델(Pax7 CreERT2 ; EP4 fl /fl )에서 노텍신 손상이 수행된 경우(도 9a-9b), 배아 미오신 중쇄(eMHC) 양성 섬유의 상승된 수에 의해 관찰되는 바와 같이 근육 재생이 손상되었다(도 9c-9d). 이는 재생 시점의 종점(21일)에서 평가된 Pax7 CreERT2 ;EP4 fl /fl 그룹에서 마우스 섬유의 횡단면적에서의 감소를 동반하였다(도 9e). 힘 산출(강축력)에서의 유의한 감소가 또한 손상 14일 후에 검출되었다(도 9f-9g). 따라서, EP4 수용체를 통한 PGE2 신호전달이 생체 내에서 MuSC 재생에 필요하다.
배양 없이 PGE2의 직접 주사가 생체 내에서 재생을 촉진하는데 효과적일 수 있는지 시험하기 위해, 본 발명자는 새로이 분리된 MuSC와 함께 PGE2를 공동 주사하였다. 모든 이후의 생체 내 주사 실험에서, 본 발명자는 PGE2의 변형된 더욱 안정한 형태인 16,16-디메틸 PGE2(dmPGE2)를 사용하였다24. 본 발명자는 노화된 MuSC 실험에 대해, 15-PGDH가 노화된 MuSC에서 유의하게 상승됨에 따라 변형된 15-PGDH-내성 dmPGE2의 전달이 특히 중요한 것으로 가정하였다(도 2e)24. dmPGE2를 이용하여, 본 발명자는 줄기 세포 기능의 널리 받아들여지는 엄격한 시험인 노텍신 손상에 반응하여 추가로 증가된 대조군에 비한 어린 MuSC 및 노화된 MuSC의 유의하게 향상된 착생을 관찰하였다(도 3c-3d). 따라서, MuSC 세포 집단과 함께 dmPGE2의 전달은 재생을 증가시키기에 충분하다.
본 발명자는 PGE2 단독의 전달이 근육 재생을 자극할 수 있다고 가정하였다. 이를 시험하기 위해, 어린 마우스의 근육을 심독소(cardiotoxin)로 손상시키고, 3일 후에, dmPGE2의 볼루스를 어린 마우스의 뒷다리 근육에 주사하였다. 본 발명자는 손상 14일 후 기저판 아래의 전형적인 위성 세포 니쉬 및 정상(atop)의 근육섬유에서 내인성 PAX7-발현 MuSC에서의 증가(60 ± 15%)를 관찰한 반면(도 4a-4b), dmPGE2는 손상의 부재하에서 효과가 없었다. 또한, 이러한 초기 시점에서, 근육섬유의 분포는 근육섬유 분석을 위한 백스터 알고리즘을 이용하여 횡단면적으로 평가시 더 큰 크기로 이동하였고, 이는 재생이 PGE2에 의해 가속화됨을 암시한다(도 4c-4d 및 도 8a-8b). 또한, 본 발명자는 트래스제닉 마우스 모델인 Pax7 CreERT2 ;Rosa26 - LSL -Luc를 이용하여 루시페라제 발현에 의해 내인성 MuSC의 손상 및 dmPGE2에 대한 반응을 추적하였다(도 4e). BLI 데이터는 조직학적 데이터와 일치하였다(도 4f-4g).
본 발명자는 근육 재생에 대해 비스테로이드 항염증제(NSAID)인 인도메타신 및 PGE2 합성을 감소시키는 COX2의 억제제를 주사하는 효과를 시험하였다. 심독소 손상 3일 후 동일한 Pax7 CreERT2 ;Rosa26 - LSL -Luc 마우스 모델의 뒷다리 근육으로의 인도메타신 주사시, 본 발명자는 근육 줄기 세포 활성화 및 재생에서의 손상을 나타내는 루시페라제 활성에서의 유의한 감소를 관찰하였다(도 10a-10b). 심독소-손상 근육으로의 인도메타신의 주사는 또한 손상 14일 후에 평가된 대조군에 비해 연축력에서의 유의한 손실을 발생시켰다(도 10c). 노화된 마우스에서, 본 발명자는 또한 단일 dmPGE2 주사 후 손상 14일 후에 내인성 MuSC의 수에서의 실질적 증가(24 ± 2%), 및 근육섬유 크기에서의 동반적 증가(도 4j-4k)를 검출하였다. 따라서, dmPGE2에 대한 단독 노출은 내인성 수복의 크기 및 시간 경과에 영향을 미친다.
최종 시험으로서, 본 발명자는 dmPGE2 향상 재생이 내리막 트레드밀 달리기(downhill treadmill-running)에 의해 유도된 자연 손상 후에 근력을 증가시킬 수 있는지 결정하였다. 이러한 시나리오에서, 손상은 내리막 트레드밀 20도 경사에서의 매일 10분의 달리기에 의해 유발되었다25. 1주 동안, 처리 그룹의 노화된 마우스가 연속적으로 5일 동안 달렸고, 운동 후 dmPGE2를 매일 주사하였다. 2주 동안, 처리 그룹의 노화된 마우스가 5일 연속 동안 달렸으나, 추가 처리를 받지는 않았다(도 4l). 특정 연축력 및 강축력을 dmPGE2 처리 및 미처리 마우스 비복근(GA)에 대해 비교하였고, 둘 모두 유의하게 증가되었다(도 4m-4p). 따라서, 운동-유도 손상과 동시적인 dmPGE2에 대한 급성 노출은 노화된 근력에서 유의한 증가를 제공할 수 있다.
본 발명자는 골격근 재생에서의 PGE2에 대한 새로운 징후를 발견하였다. 골격근에 대한 PGE2 효과의 이전 연구는 조직 배양에서 근육모세포의 증식, 융합, 단백질 분해, 및 분화를 변경시키는 것을 제시하였다26 -30. 따라서, 이들 연구는 근육모세포가 줄기 세포 기능이 손실된 전구세포임에 따라 본 발명의 연구와 상이하다. 위성 세포(MuSC)는 발달 및 재생에 중요하며3 -8,31, 이들의 수는 어린 마우스 및 노화된 마우스 및 인간에서 달리기 및 다른 고강도 운동에 의해 증가된다15 ,32-36. 비스테로이드 항염증제는 MuSC에서 운동 유도된 증가를 약화시키는 것으로 보고되어 있다15 ,32-36. 본 발명의 데이터는 효과적인 근육 재생을 특징으로 하는 염증의 초기의 일시적 파동의 이로운 효과15가 부분적으로 PGE2 및 이의 수용체 EP4로 인한 것으로, 이는 MuSC 증식 및 착생에 필수적이고 충분하다는 새로운 증거를 제공한다. 조혈, 간, 및 결장 조직에 대해, 15-PGDH의 억제제인 SW033291의 전달이 최근에 재생을 향상시키는 것으로 밝혀졌다22. 특히, PGE2 및 이의 유사체는, 예를 들어, 노동을 유도하고37, 손상 후 근육을 회복시키는데 있어서의 이의 임상적 사용을 가능하게 하는 조혈 줄기 세포 이식을 촉진38하기 위해 수십년 동안 인간 환자에서 안전하게 사용되어 왔다. 요약하면, 본 발명의 결과는 급성 PGE2 요법이 운동-유도 상해의 재생을 신속하고 확실히 향상시키고, 연령-관련 제한을 극복하여 근력을 증가시키기에 충분한 것을 제시한다.
참고문헌
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방법
마우스
본 발명자는 스탠포드 대학의 기관 지침 및 실험 동물 관리에 대한 행정 패널(APLAC)에 따라 모든 실험 및 프로토콜을 수행하였다. 본 발명자는 노화된 근육 연구를 위해 미국 국립 노화 연구소(NIA)로부터 야생형의 노화된 C57BL/6(18 내지 20개월) 마우스를 획득하였고, 잭슨 연구소(Jackson Laboratory)로부터 어린 야생형 C57BL/6 마우스를 획득하였다. 이중-트랜스제닉 GFP/luc 마우스를 이전에 기재된 바와 같이 생성시켰다1. 간단히, 편재성 Actb 프로모터의 조절하에서 반딧불이 루시페라제(luc) 트랜스진을 발현하는 마우스를 FVB 계통으로 유지시켰다. 편재성 UBC 프로모터의 조절하에서 녹색 형광 단백질(GFP) 트랜스진을 발현하는 마우스를 C57BL/6 계통으로 유지시켰다. 본 발명자는 NOD-SCID(Jackson Laboratory) 수용자 마우스로의 동종이형 이식 실험을 위해 GFP/luc로부터의 세포를 사용하였다. EP4 flox/flox (EP4 f/f ) 마우스는 K. 안드레아슨(K. Andreasson)(스탠포드 대학)의 친절한 선물이었다2. 이중-트랜스제닉 Pax7 CreERT2 ;Rosa26 - LSL -Luc를 잭슨 실험실로부터 획득된 Pax7 CreERT2 마우스(Stock # 017763)3와 잭슨 실험실로부터 획득된 Rosa26 - LSL -Luc(Stock # 005125)4를 교배하여 생성시켰다. 본 발명자는 적절한 PCR-기반 전략에 의해 이들 유전자형을 검증하였다. 트랜스제닉 계통으로부터의 모든 마우스는 어린 연령의 마우스였다. 모든 계통에 대해 어린 마우스는 2 내지 4개월령의 마우스였고, 노화된 마우스는 18 내지 20개월령의 마우스였다. 이들 연구에 사용된 모든 마우스는 암컷이었다.
근육 줄기 세포 분리
본 발명자는 이전에 기재된 바와 같이 근육 줄기 세포를 분리하고 농축시켰다1,5,6. 간단히, 가벼운 콜라게나제 소화 및 MACs Dissociator에 의한 다짐(mincing)은 다수의 단일 섬유가 해리될 수 있도록 하고, 이후 디스파제 소화에 의해 이들의 니쉬로부터 단핵 세포가 방출될 수 있도록 한다. 이후, 자기 비드 컬럼(Miltenyi)을 이용하여 조혈 계통 발현 및 비-근육 세포(CD45-/CD11b-/CD31-)에 대해 세포 혼합물을 고갈시켰다. 이후, 나머지 세포 혼합물을 CD34 및 α7-인테그린 마커를 공동 발현하는 MuSC를 분류하기 위해 FACS에 적용시켰다. 본 발명자는 FlowJo v10.0을 이용하여 흐름세포 측정법 산점도를 생성시키고 분석하였다. 각각의 분류에 대해, 적어도 3마리의 독립적인 공여자 암컷 마우스로부터의 MuSC(각각 약 5,000개)를 함께 푸울링하였다.
근육 줄기 세포 이식
본 발명자는 이전에 기재된 바와 같이 FACS 분리 직후 또는 세포 배양으로부터의 수집 후에 250개의 MuSC(도 3a, 3c 및 3d) 또는 1,000개의 MuSC(도 3b)를 수용자 마우스의 전경골근(TA)에 직접 이식하였다1 ,5,6. 어린 MuSC 연구를 위해, 본 발명자는 GFP/luc 마우스(2 내지 4개월령)로부터의 세포를 뒷다리 조사된 NOD-SCID 마우스에 이식하였다. 노화된 MuSC 연구를 위해, 본 발명자는 이전에 기재된 바와 같이 이식 전 24시간의 기간 동안 배양 2일째에 luc-IRES-GFP 렌티바이러스(GFP/luc 바이러스)로 형질도입된 노화된 C57BL/6 마우스(18 내지 20개월, NIH)로부터의 세포를 이식하였다5(세부사항에 대해 하기 "근육 줄기 세포 배양, 처리 및 렌티바이러스 감염" 섹션 참조). 근육 줄기 세포의 이식 전, 본 발명자는 복막내 주사에 의해 케타민(마우스 당 2.4 mg)으로 NOD-SCID 수용자 마우스를 마취시켰다. 이후, 본 발명자는 신체 나머지는 납 지그(jig)로 차폐하면서 단일한 18 Gy 선량으로 뒷다리를 조사하였다. 본 발명자는 조사 2일 이내에 이식을 수행하였다.
배양된 세포를 지정된 바와 같이 처리하고(비히클 또는 PGE2 처리 10ng/ml), 37℃에서 2분 동안 PBS 중 0.5% 트립신과의 인큐베이션에 의해 하이드로겔 배양물로부터 수집하고, 혈구계를 이용하여 계수하였다. 본 발명자는 0.1% 젤라틴/PBS 중에 원하는 세포 농도로 세포를 재현탁한 후, 10 μl 부피로 TA 근육으로의 근내 주사에 의해 이들을 이식하였다(TA 당 250개의 MuSC). 신선한 MuSC 이식을 위해, 본 발명자는 분류된 세포를 13 nmol의 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2(dmPGE2)(Tocris, catalog # 4027) 또는 비히클 대조군(PBS)과 함께 공동 주사하였다. 본 발명자는 동일한 마우스에서 반대측 다리의 TA 근육으로의 이식에 의해 상이한 조건의 세포를 비교하였다. 이식 1개월 후, 본 발명자는 수용자 근육을 손상시키고, 생체 내에서 MuSC를 활성화시키기 위해 10 μl의 노텍신(10 μg ml-1; Latoxan, France)을 주사하였다. 이식 8주 후, 마우스를 안락사시키고, 분석을 위해 TA를 수집하였다.
생물발광 영상화
본 발명자는 이전에 기재된 바와 같이 Xenogen-100 시스템을 이용하여 생물발광 영상화(BLI)를 수행하였다1 ,5,6. 간단히, 본 발명자는 이소플루오란 흡입을 이용하여 마우스를 마취시키고, 복막내 주사에 의해 120 μl의 D-루시페린(0.1 mmol kg-1, PBS 중에 재구성됨; Caliper LifeSciences)을 투여하였다. 본 발명자는 루시페린 주사 5분 후에 F-stop=1.0에서 60초 노출을 이용하여 BLI를 획득하였다. 디지털 이미지를 기록하고, Living Image 소프트웨어(Caliper LifeSciences)를 이용하여 분석하였다. 본 발명자는 생물발광 신호를 계산하기 위해 각각의 뒷다리 위에 위치된 일관된 관심 영역(ROI)을 갖는 이미지를 분석하였다. 본 발명자는 착생 임계치를 규정하기 위해 104의 복사 휘도(p s-1 cm-2 sr-1) 값의 생물발광 신호를 계산하였다. 104의 이러한 복사 휘도 임계치는 이전에 보고된 p/s의 전체 플럭스 임계치와 대략 동등하다. 이러한 BLI 임계치는 하나 이상의 GFP+ 근육섬유의 조직학적 검출에 해당한다1 ,5,6. 본 발명자는 이식 후에 매주 BLI 영상화를 수행하였다.
근육 손상
본 발명자는 TA 근육으로의 10 μl의 노텍신(10 μg ml-1; Latoxan) 또는 심독소(10 μm; Latoxan)의 근내 주사를 수반하는 손상 모델을 이용하였다. 냉동손상을 위해, TA 근육을 덮고 있는 피부에 절개부를 만들고, 액체 질소에서 냉각된 구리 프로브를 3회의 10초 간격으로 TA 근육에 적용하였고, 냉동프로브(cryoprobe)의 각각의 적용 사이에 근육을 해동시켰다. 지정된 경우, 손상 48시간 후, 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2(dmPGE2)(13 nmol, Tocris, catalog # 4027) 또는 비히클 대조군(PBS)을 TA 근육에 주사하였다. 반대측 TA를 내부 대조군으로 이용하였다. 본 발명자는 분석을 위해 손상 14일 후에 조직을 수거하였다.
Pax7 CreERT2 ; Rosa26 - LSL -Luc 마우스 실험을 위해, 본 발명자는 Pax7 프로모터의 조절하에서 루시페라제 발현을 활성화시키기 위해 타목시펜의 5일 연속의 매일 복막내 주사로 마우스를 처리하였다. 마지막 타목시펜 주사 1주일 후, 마우스를 10 μl의 심독소(10 μM; Latoxan)를 근내 주사하였고, 본 발명자는 이를 검정 0일로 지정하였다. 3일 후, 13 nmol의 dmPGE2(13 nmol) 또는 비히클 대조군(PBS)을 TA 근육에 주사하였다. 반대측 TA를 내부 대조군으로 이용하였다. 손상 3, 7, 10 및 14일 후에 생물발광을 검정하였다.
조직 조직학
본 발명자는 이전에 기재된 바와 같이 조직학을 위해 수용자 TA 근육 조직을 수거하고 제조하였다5 ,6. 본 발명자는 횡단면을 항-LAMININ(Miliipore, 클론 A5, catalog # 05-206, 1:200) 및 항-PAX7(Santa Craz Biotechnology, catalog # sc-81648, 1:50) 일차 항체 및 이후 AlexaFluor 이차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, 1:200)와 함께 인큐베이션하였다. 본 발명자는 DAPI(Invitrogen)로 핵을 대조염색하였다. 본 발명자는 SlideBook(3i) 소프트웨어에 의해 제어되는 Plan NeoFluar 10x/0.30NA 또는 20x/0.75NA 대물렌즈(Carl Zeiss) 및 ORCA-ER 디지털 카메라(Hamamatsu Photonics)를 갖는 AxioPlan2 에피형광 현미경(Carl Zeiss Microimaging)으로 이미지를 획득하였다. 동일한 실험으로부터의 모든 이미지에 걸쳐 일관된 대조 조정과 함께 Adobe Photoshop을 이용하여 이미지를 잘라내었다. Adobe Illustrator를 이용하여 이미지 합성물을 생성시켰다. 본 발명자는 MetaMorph Image Analysis 소프트웨어(Molecular Devices)를 이용하여 PAX7 양성 세포의 수를 분석하였고, 각각의 섬유의 영역을 분석하기 위해 이미지 내의 섬유를 확인하고 섬유를 분할하는 근육섬유 분석을 위한 백스터 알고리즘을 이용하여 섬유 영역을 분석하였다. PAX7 정량화를 위해, 본 발명자는 TA의 적어도 2mm의 깊이에 걸쳐 연속 섹션을 검사하였다. 섬유 영역의 경우, 400개 이상의 근육섬유를 포함하는 LAMININ-염색된 근육섬유 횡단면의 적어도 10개의 필드가 상기와 같이 각각의 마우스에 대해 포착되었다. 데이터 분석은 맹검이었다. 영상 획득 및 스코어링을 수행하는 연구자들은 분석되는 샘플 그룹에 제공된 처리 조건을 인지하지 못했다.
하이드로겔 제작
본 발명자는 이전에 기재된 바와 같이 합성된 PEG 전구체로부터의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 하이드로겔을 제작하였다6. 간단히, 본 발명자는 MuSC를 배양하고, 배양 상태의 줄기 세포 운명을 유지하기에 최적의 조건인 1 mm 두께의 12-kPa(탄성 계수) 강성 하이드로겔을 달성하기 위해 공개된 공식을 이용하여 하이드로겔을 생성하였다6. 본 발명자는 이전에 기재된 바와 같이 클론 증식 실험을 위해 12-kPa의 하이드로겔 마이크로웰 어레이를 제작하였다6. 본 발명자는 12-웰 또는 24-웰 배양 플레이트의 표면적을 포함하도록 모든 하이드로겔을 절단하고 부착시켰다.
근육 줄기 세포 배양, 처리 및 렌티바이러스 감염
분리 후, 본 발명자는 DMEM/F10(50:50), 15% FBS, 2.5 ng ml-1 섬유모세포 성장 인자-2(bFGF로도 공지된 FGF-2) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 근원 세포 배양 배지에 MuSC를 재현탁시켰다. 본 발명자는 표면적 cm2 당 500개 세포의 밀도로 MuSC 현탁액을 시딩하였다. 본 발명자는 5% CO2에서 37℃에서 세포 배양을 유지시켰고, 배지를 매일 교환하였다. PGE2, 15-PGDH 억제제 및 EP4 수용체 길항제 처리 연구를 위해, 본 발명자는 처음 24시간 동안 콜라겐 코팅된 접시 상에서 배양된 MuSC에 1-200 ng/ml 프로스타글란딘 E2(Cayman Chemical)(도면의 범례에 특정되지 않는 경우, 10 ng/ml가 사용된 표준 농도임), 및/또는 1 μM EP4 길항제(ONO-AE3-208, Cayman Chemical), 또는 1 μM 15-PGDH 억제제(SW033291, Cayman Chemical)를 첨가하였다. 이후, 세포를 트립신 처리하고, 세포를 추가 6일의 배양을 위해 하이드로겔 상에 재시딩하였다. 모든 처리를 이들의 용매(DMSO) 비히클 대조군과 비교하였다. 스트리핑된 혈청 검정을 위해, 본 발명자는 DMEM/F10(50:50), 15% 챠콜 스트리핑된 FBS(Gibco, cat # 12676011), 2.5 ng ml-1 bFGF 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 배지에 분리된 MuSC를 재현탁하였다. 도면에서 알 수 있듯이, 본 발명자는 스트리핑된 혈청 세포 배지에 1.5 μg/ml 인슐린(Sigma, I0516) 및 0.25 μM 덱사메타손(Sigma, D8893)을 추가로 첨가하였다. 이들 실험을 위해, MuSC를 하이드로겔에서 배양하고, 비히클(DMSO) 또는 10 ng/ml PGE2(Cayman Chemical)를 모든 배지 변경(2일마다)과 함께 배양물에 첨가하였다. 증식(하기 참조)을 7일 후에 검정하였다.
본 발명자는 달리 명시하지 않는 한 배양 1주일 후에 모든 MuSC 배양 검정 및 이식을 수행하였다. 노화된 MuSC 이식 연구를 위해, 본 발명자는 이전에 기재된 바와 같이 배양 상태로 24시간 동안 신장 인자-1α 프로모터-유래 luc-IRES-GFP를 인코딩하는 렌티바이러스(GFP/luc 바이러스)로 MuSC를 감염시켰다3. EP4 f /f MuSC 연구를 위해, 본 발명자는 상기 기재된 바와 같이 MuSC를 분리하고(근육 줄기 세포 분리), 모든 세포를 GFP/luc 바이러스로 감염시키고, 이들의 서브셋을 배양 상태로 24시간 동안 pLM-CMV-R-Cre를 인코딩하는 렌티바이러스(mCherry/Cre 바이러스)로 공동감염시켰다. pLM-CMV-R-Cre는 미첼 사델라인(Michel Sadelain)(Addgene plasmid # 27546)의 선물이었다7. 본 발명자는 어린(2 내지 4개월) NOD-SCID 수용자 마우스의 18-gy 조사된 TA에 노화된 MuSC(250개의 세포) 또는 EP4 f /f MuSC(1,000개의 세포)를 이식하였다. 시험관내 증식 검정을 위해, EP4 f /f MuSC를 감염 후에 하이드로겔에 플레이팅하고, 비히클(DMSO) 또는 10 ng/ml PGE2로 24시간 동안 처리하고, 3일 후에 증식을 검정하였다. 세포를 도립 형광 현미경(Carl Zeiss Microimaging)을 이용하여 감염 48시간 후에 GFP 및/또는 mCherry 발현에 대해 검정하였다. MuSC는 FACS에 의해 마우스로부터 새로이 분리되고, 1주의 최대 기간 동안 배양 상태로 두었고, 따라서 미코플라스마 오염은 평가되지 않는다.
증식 검정
증식을 검정하기 위해, 본 발명자는 3개의 상이한 검정(혈구계, VisionBlue, 및 EdU)를 이용하였다. 각각에 대해, 본 발명자는 표면적 cm2 당 500개 세포의 밀도로 평면 하이드로겔(혈구계 및 VisionBlue) 또는 콜라겐-코팅된 플레이트(EdU 검정)에 MuSC를 시딩하였다. 혈구계 세포수 계수를 위해, 본 발명자는 37℃에서 5분 동안 PBS 중 0.5% 트립신과의 인큐베이션에 의해 지정된 시점에 세포를 수거하였고, 이들을 혈구계를 이용하여 적어도 3회 정량하였다. 또한, 본 발명자는 배양 상태인 세포 성장에 대한 판독으로서 VisionBlue Quick Cell Viability Fluorometric Assay Kit(BioVision, catalog # K303)를 이용하였다. 간단히, 본 발명자는 3시간 동안 배양 배지 중에서 10% VisionBlue와 함께 MuSC를 인큐베이션하고, Ex= 530-570nm, Em=590-620nm에서 형광 플레이트 판독기(Infinite M1000 PRO, Tecan)에서 형광 강도를 측정하였다. 본 발명자는 Click-iT EdU Alexa Fluor 555 Imaging 키트(Life Technologies)를 이용하여 증식을 검정하였다. 간단히, 본 발명자는 고정 전에 1시간 동안 살아 있는 세포를 EdU(20 μM)와 인큐베이션하고, 분화를 검정하기 위해 항-MYOGENIN(Santa Cruz, catalog # sc576, 1:250)과 함께 제조업체의 지침에 따라 핵을 염색하였다. 본 발명자는 DAPI(Invitrogen)로 핵을 대조염색하였다. 본 발명자는 SlideBook(3i) 소프트웨어에 의해 제어되는 Plan NeoFluar 10x/0.30NA 또는 20x/0.75NA 대물렌즈(Carl Zeiss) 및 ORCA-ER 디지털 카메라(Hamamatsu Photonics)를 갖는 AxioPlan2 에피형광 현미경(Carl Zeiss Microimaging)으로 이미지를 획득하였다. 본 발명자는 MetaMorph Image Analysis 소프트웨어(Molecular Devices)를 이용하여 EdU 양성 세포를 정량하였다. 데이터 분석은 맹검이었고, 여기서 세포 스코어링을 수행하는 연구자들은 분석되는 샘플 그룹에 제공된 처리 조건을 인지하지 못했다.
클론 근육 줄기 세포 증식 및 운명 분석
본 발명자는 이전에 기재된 바와 같이 시간-경과 현미경검사법에 의해 클론 근육 줄기 세포 증식을 검정하였다5 ,6. 간단히, 본 발명자는 24시간 동안 PGE2(Cayman Chemical) 또는 비히클(DMSO)로 분리된 노화된 MuSC를 처리하였다. 하이드로겔에서의 5일의 성장 후, 세포를 600 μm 직경을 갖는 하이드로겔 마이크로웰에서 표면적 cm2 당 500개 세포의 밀도로 재시딩하였다. 시간-경과 현미경검사법을 위해, 본 발명자는 시딩 후 12시간(0일)에서 시작하여 2일까지 단일 세포를 갖는 웰에 대해 세포 증식을 모니터링하였고, 맞춤 환경 제어 챔버 및 전동식 스테이지를 갖는 PALM/AxioObserver Zl 시스템(Carl Zeiss Microimaging)을 이용하여 10X 배율로 3분마다 이미지를 기록하였다. 본 발명자는 획득 시간 간격 사이에 배지를 격일로 교환하였다. 본 발명자는 단일 세포를 확인하고 추적하고, 계통수를 발생시키기 위해 세포 추적 및 계통 재건을 위한 백스터 알고리즘을 이용하여 시간-경과 이미지 시퀀스를 분석하였다5 ,6,8-10.
살아 있는 세포 및 사멸한 세포를 각각 상-대조 경계 및 운동성 유지 또는 손실을 기초로 하여 시간-경과 시퀀스에서 구별하였다. 본 발명자는 2개의 조건에서의 증식(분열) 및 사멸의 비율이 시간 경과에 따라 가변적인 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자는 첫번째 및 두번째 24시간 간격에 대한 비율을 개별적으로 추정하였다. 값을 문헌6에 기재되고, 표 1에서 발견되는 방정식을 이용하여 추정하였다. 본 발명자는 2개의 간격 p24 및 p48에서의 증식률 및 상응하는 사망률 d24 및 d48을 표시한다. 예로서, 두번째 24시간 간격 동안의 처리된 조건에서의 증식률은 시간 당 5.38%이다. 표 1(하기)은 2개의 조건에서의 증식률 및 사망률이 첫번째 시간 간격에서 유사하고, 실험 종료시의 세포 수에서의 차이가 두번째 시간 간격 동안 분열 속도 및 사망률 둘 모두에서의 차이로 인한 것임을 제시한다. 2개의 시간 간격에서의 모델링된 세포 수는 하기에 의해 제공된다:
Figure pct00004
상기 식에서, c0는 발병시 세포의 수이다. 모델링된 곡선은 도 7f에서 실제 세포수와 함께 작도된다.
표 1. 시간 당 추정된 증식률 및 사망률.
Figure pct00005
데이터 분석은 맹검이었다. 영상 획득 및 스코어링을 수행하는 연구자들은 분석되는 샘플 그룹에 제공된 처리 조건을 인지하지 못했다.
정량적 RT- PCR
본 발명자는 RNeasy Micro Kit(Qiagen)를 이용하여 MuSC로부터 RNA를 분리하였다. 근육 샘플에 대해, 본 발명자는 액체 질소에서 조직을 급속 동결시키고, 막자사발과 막자 및 이후 주사기 및 바늘 분쇄를 이용하여 조직을 균질화시킨 후, Trizol(Invitrogen)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 본 발명자는 SensiFAST™cDNA Synthesis Kit(Bioline)를 이용하여 각각의 샘플로부터의 전체 mRNA로부터 cDNA를 역전사하였다. 본 발명자는 ABI 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosvstems)에서 SYBR Green PC Master Mix(Applied Biosystems) 또는 TaqMan Assays(Applied Biosystems)을 이용하여 cDNA를 RT-PCR에 적용하였다. 본 발명자는 10분 동안 95℃에서 샘플을 순환시키고, 15초 동안 95℃및 1분 동안 60℃에서 40회 순환시켰다. 상대 전사물 수준을 정량하기 위해, 본 발명자는 처리된 샘플 및 처리되지 않은 샘플을 비교하기 위해 2-ΔΔCt를 이용하였고, Gapdh에 비한 결과로 표현하였다. SYBR Green qRT-PCR을 위해, 본 발명자는 다음과 같은 프라이머 서열을 사용하였다: Gapdh, 전방향 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3', 역방향 5'-CCCTTTTGGCTCCACCCT-3'; Hpgd, 전방향 5'- TCCAGTGTGATGTGGCTGAC-3', 역방향 5'-ATTGTTCACGCCTGCATTGT-3'; Ptges, 전방향 5'- GCTGTCATCACAGGCCAGA-3', 역방향 5'-CTCCACATCTGGGTCACTCC-3'; Ptges2, 전방향 5'-CTCCTACAGGAAAGTGCCCA-3', 역방향 5'-ACCAGGTAGGTCTTGAGGGC-3'; Ptger1, 전방향 5' GTGGTGTCGTGCATCTGCT-3', 역방향 5' CCGCTGCAGGGAGTTAGAGT-3', 및 Ptger2, 전방향 5'-ACCTTCGCCATATGCTCCTT-3', 역방향 5'-GGACCGGTGGCCTAAGTATG-3'. TaqMan Universal PCR Master Mix 시약 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 제조업체의 설명서에 따라 샘플에서 Pax7, 미오게닌(Myogenin), Slco2α1(PGT), Ptger3 및 Ptger4를 정량하기 위해 TaqMan Assays(Applied Biosystems)를 이용하였다. 전사물 수준을 Gapdh 수준에 비해 표현하였다. SYBR Green qPCR을 위해, 투입 cDNA 샘플을 표준화하기 위해 Gapdh qPCR을 이용하였다. Taqman qPCR을 위해, 다중 qPCR은 표적 신호(FAM)가 이들의 내부 Gapdh 신호(VIC)에 의해 개별적으로 표준화되는 것을 가능하게 한다.
PGE2 ELISA
근육을 수거하고, 인도메타신(5.6 μg/ml)을 함유하는 얼음 냉각된 PBS에서 헹구고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 동결된 샘플을 액체 질소에서 분쇄하였다. 분말을 500 μl의 용해질 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 4 mM CaCl, 1.5% Triton X-100, 프로테아제 억제제 및 미세구균 뉴클레아제)을 갖는 에펜도르프 튜브로 옮긴 후, 조직 균질화기를 이용하여 균질화시켰다. 상층액의 PGE2 수준을 PGE2 ELISA Kit(R&D Systems, catalog # KGE004B)를 이용하여 측정하고, BCA 검정(BioRad)에 의해 측정된 전체 단백질에 비해 표현하고, PGE2의 ng으로 표현하였다. 각각의 샘플을 이중으로 및 2개의 독립적 실험 각각으로 검정하였다.
cAMP 활성 검정
MuSC를 1시간 동안 DMSO(비히클) 또는 PGE2(10 ng/ml)로 처리하고, 고리형 AMP 수준을 제조업체(Promega)에 의해 최적화된 cAMP-Glo Assay 프로토콜에 따라 측정하였다. 각각의 샘플을 삼중으로 및 2개의 독립적 실험으로 검정하였다.
흐름세포측정법
본 발명자는 비히클(DMSO) 또는 PGE2(10 ng/ml)의 초기 급성(24시간) 처리 후 하이드로겔 상에서의 배양 7일 후에 MuSC에 대한 아폽토시스의 판독으로서 Annexin V를 검정하였다. 본 발명자는 제조업체의 프로토콜에 따라 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit(Biolegend, cat # 640914)를 사용하였다. 본 발명자는 NIH S10 Shared Instrument Grant(S10RR027431-01)를 이용하여 구입한 Shared FACS Facility 내의 FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 FACS LSR II 세포측정기에서 Annexin V에 대해 세포를 분석하였다.
질량분광법
분석물:
모든 프로스타글란딘 표준 PGF2α; PGE2; PGD2: 15-케토 PGE2; 13,14-디하이드로 15-케토 PGE2; PGE2-D4; 및 PGF2α-D9을 Cayman Chemical.로부터 구입하였다. PGE2-D4 내부 표준에 대해, 위치 3 및 4를 전체 4개의 중수소 원자로 표지하였다. PGF2α-D9에 대해, 위치 17, 18, 19 및 20을 전체 9개의 중수소 원자로 표지하였다.
보정 곡선 제조:
분석물 스톡 용액(5 mg/mL)을 DMSO에서 제조하였다. 이들 스톡 용액을 아세토니트릴/물(1:1 v/v)로 연속 희석하여 일련의 표준 작업 용액을 획득하고, 이를 이용하여 보정 곡선을 생성시켰다. 10 uL의 각각의 표준 작업 용액을 200 μL의 균질화 완충액(아세톤/물 1:1 v/v; 산화를 방지하기 위한 0.005% BHT)으로 스파이킹한 후, 10 uL의 내부 표준 용액(3000 ng/mL의 각각의 PGF2α-D9 및 PGE2-D4)를 첨가하여 보정 곡선을 제조하였다. 보정 곡선을 각각의 세트의 샘플로 새로이 제조하였다. 보정 곡선 범위: PGE2 및 13,14-디하이드로 15-케토 PGE2에 대해, 0.05 ng/mL 내지 500 ng/mL; PGD2 및 PGF2α에 대해, 0.1 ng/mL 내지 500 ng/mL; 및 15-케토 PGE2에 대해, 0.025 ng/mL 내지 500 ng/mL.
추출 절차:
추출 절차를 문헌[Prasain et al]11의 추출 절차로부터 변형시켰고, 이는 아세톤 단백질 침전 후 2-단계 액체-액체 추출을 포함하였고; 후자의 단계는 LC-MS/MS 민감성을 향상시킨다. 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT) 및 질소(N2) 가스 하에서의 증발을 산화를 방지하기 위해 이용하였다.
고체 조직을 수거하고, 칭량하고, 액체 질소로 급속 동결시켰다. 근육 조직을 폴리프로필렌 튜브에서 균질화 비드 및 200 μL의 균질화 완충액과 조합하고, 6 m/s의 속도에서 40초 동안 FastPrep 24 균질화기(MP Biomedicals)에서 가공하였다. 균질화 후, 10 μL의 내부 표준 용액(3000 ng/mL)을 조직 균질액에 첨가한 후, 음파 처리하고, 10분 동안 진탕하였다. 샘플을 원심분리하고, 상층액을 깨끗한 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 200 μL의 헥산을 샘플에 첨가한 후, 15분 동안 진탕한 후, 원심분리하였다. 샘플을 40분 동안 -80℃에서 동결시켰다. 헥산 층을 동결된 하부 수성층으로부터 부어서 폐기하였다. 해동 후, 25 μL의 1N 포름산을 하부 수성층에 첨가하고, 샘플을 볼텍싱하였다. 두번째 추출을 위해, 200 μL의 클로로포름을 수성상에 첨가하였다. 샘플을 15분 동안 진탕하여 완전한 추출을 보장하였다. 원심분리를 수행하여 층을 분리시켰다. 하부 클로로포름 층을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고, 40℃에서 질소하에서 증발 건조시켰다. 건조 잔여물을 100 μL 아세토니트릴/10 mM 암모늄 아세테이트(2:8 v/v)에서 재구성하고, LC-MS/MS로 분석하였다.
LC-MS/MS:
많은 프로스타글란딘은 동일한 질량을 갖는 위치 이성질체이고, 유사한 단편화 패턴을 가지므로, 크로마토그래피 분리가 중요하다. 2개의 SRM 전이(1개의 정량자(quantifier) 및 1개의 정성자(qualifier))를 각각의 분석물에 대해 조심스럽게 선택하였다. 특이한 정성자 이온 강도 비율 및 체류 시간이 표적 분석물을 입증하는데 필수적이었다. 모든 분석물을 LC-20ADXR 돌출(prominence) 액체 크로마토그래프 및 8030 삼중 사중극 질량분광기(Shimadzu)를 이용하여 음성 전기분무 LC-MS/MS로 수행하였다. HPLC 조건: Acquity UPLC BEH C18 2.1x100 mm, 1.7 um 입자 크기 컬럼을 0.25 mL/min의 유량으로 50℃에서 수행하였다. 이동상은 A: 물 중 0.1% 아세트산 및 B: 아세토니트릴 중 0.1% 아세트산으로 구성되었다. 용리 프로파일: 5분 동안 35% B에서 최초 유지 후, 3분 동안 35%-40%의 구배 후, 3분 동안 40%-95%; 전체 수행 시간은 14분이었다. 주입 부피는 20 uL였다. 이들 HPLC 조건을 이용하여, 본 발명자는 관심 분석물의 기준선 분리를 달성하였다.
선택된 반응 모니터링(SRM)을 정량화에 사용하였다. 질량 전이는 다음과 같았다: PGD2: m/z 351.10 → m/z 315.15 (정량자) 및 m/z 351.10 → m/z 233.05 (정성자); PGE2: m/z 351.10 → m/z 271.25 (정량자) 및 m/z 351.10 → m/z 315.20 (정성자); PGF2α: m/z 353.10 → m/z 309.20 (정량자) 및 m/z 353.10 → m/z 193.20 (정성자); 15 케토-PGE2: m/z 349.30 → m/z 331.20 (정량자) 및 m/z 349.30 → m/z 113.00 (정성자); 13,14-디하이드로 15-케토 PGE2: m/z 351.20 → m/z 333.30 (정량자) 및 m/z 351.20 → m/z 113.05 (정성자); PGE2-D4: m/z 355.40 → m/z 275.20; 및 PGF2α-D9: m/z 362.20 → m/z 318.30. 드웰 시간(Dwell time)은 20-30 ms였다.
LabSolutions LCMS(Shimadzu)를 이용하여 정량 분석을 수행하였다. 정량화를 위해 내부 표준 방법을 이용하였다: PGE2-D4를 PGE2, 15-케토 PGE2, 및 13,14-디하이드로 15-케토 PGE2의 정량을 위한 내부 표준으로 사용하였다. PGF2α-D9는 PGD2 및 PGF2α의 정량을 위한 내부 표준이었다. 보정 곡선은 X가 농도인 1/X2의 가중치 인자를 이용하여 농도 범위에 걸쳐 선형(R>0.99)이었다. 역 계산된 표준 농도는 공칭 값에서 ±15%였고, 정량 하한(LLOQ)에서 ±20%였다.
생체 내 근력 측정
노화된 마우스(18개월)를 2주 연속 동안 내리막 트레드밀 달리기에 적용시켰다. 1주 동안, 마우스는 5일 동안 매일 달렸고, 6일 및 7일에 휴식했다. 1주 동안 각각의 트레드밀 달리기 2시간 후, 각각의 마우스의 양 다리로부터의 각각(외측 및 내측)의 비복근(GA)에 일정 용량의 PBS(비히클 대조군) 또는 13nM dmPGE2(실험군)를 주사하였다. 2주 동안, 마우스를 5일의 트레드밀 달리기에만 적용시켰다. Exer3/6(Columbus Instruments)을 이용하여 트레드밀 달리기를 수행하였다. 마우스를 7 미터/min의 속도로 시작하여 20도 내리막으로 트레드밀에서 10분 동안 달리게 하였다. 3분 후, 속도를 14 미터/min의 최종 속도로 1 미터/min만큼 증가시켰다. 전기 자극(electrical prodding)에도 불구하고 트레드밀 상에서 동물이 머무르지 못하는 것으로 정의되는 탈진으로서 10분의 달리기 시간을 선택하였고, 독립적인 대조군의 노화된 마우스 그룹에서 12분의 중앙값을 관찰하였다. 힘 측정은 이전에 공개된 프로토콜을 기초로 하여 5주에서 GA 근육에 대해 수행하였다5. 간단히, 각각의 마우스에 대해, 절개를 수행하여 GA를 노출시켰다. 본 발명자는 온전한 아킬레스건을 갖는 종골을 절단하고, 힘줄-골 복합체를 얇은 금속 후크를 갖는 300C-LR 힘 변환기(Aurora Scientific)에 부착시켰다. 근육 및 힘줄을 염수(0.9% 염화나트륨) 용액으로 주기적으로 습윤시켜 습기를 유지시켰다. 다리로의 혈액 공급을 손상시키지 않으면서 금속 클램프로 무릎 아래에 하지를 고정시켰다. 마우스를 전체 힘 측정 절차 동안 흡입 마취(2% 이소플루오란)하에 두고, 체온을 가열 램프에 의해 유지시켰다. 모든 측정에서, 본 발명자는 소정의 최대초과 자극 전압에서 0.1-ms 펄스를 이용하였다. GA 근육을 2 mA의 일정한 전류(사각 펄스 폭 0.1 ms)를 전달하는 양극 전기 자극 커프를 이용하여 근위 좌골 신경을 통해 자극하였다. GA 근육을 연축력 측정을 위해 단일한 0.1-ms 펄스, 및 강축력 측정을 위해 0.3 s 펄스에 대한 150 Hz의 트레인으로 자극하였다. 본 발명자는 그룹 당 n=5 마우스를 이용하여 각각의 측정 사이에 2-3분 회복을 가지면서 각각의 근육에 대해 5회의 연축력 및 이후 5회의 강축력 측정을 수행하였다. 데이터를 PCI-6251 획득 카드(National Instruments)를 이용하여 수집하고, Matlab에서 분석하였다. 본 발명자는 근육 생리학적 횡단면적(PCSA)에 의해 힘 측정을 표준화시킴으로써 특정 힘 값을 계산하였고, 이는 대조군과 실험 PGE2 처리 그룹 사이에 유사하였다(표 2). PCSA(mm2로 측정됨)를 하기 방정식에 따라 계산하였다12:
PCSA ( mm 2 ) = [질량 (g) x Cos θ ] ÷[ρ(g/ mm 3 ) x 섬유 길이 (mm)],
상기 식에서, θ는 섬유의 우모각(pennation angle)이고, ρ는 근육 밀도(0.001056 g/mm3)이다.
통계 분석
본 발명자는 3개의 생물학적 복제물이 각각 푸울링되는 적어도 3개의 독립적 실험으로 세포 배양 실험을 수행하였다. 일반적으로, 본 발명자는 조건 당 적어도 3-5개의 전체 이식물을 이용하여 적어도 2개의 독립적인 실험으로 MuSC 이식물 실험을 수행하였다. 본 발명자는 대조군 샘플이 시험관 내에서 동일한 실험으로부터 또는 생체 내에서 반대측 사지 근육으로부터 유래되는 실험에 대해 쌍을 이룬 t-검정을 이용하였다. α=0.05를 이용하여 미처리(-) 대 처리(PGE 또는 dmPGE2) 그룹 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해 비-파라미터 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정을 이용하였다. ANOVA 또는 다중 t-검정을 본페로니 보정(Bonferroni correction)을 이용하여 결정된 유의성 수준 또는 도면 범례에 표시된 바와 같은 피셔 검정을 이용하여 다중 비교를 위해 수행되었다. 달리 기재하지 않는 한, 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 제시된다.
방법 참고문헌:
Figure pct00006
Figure pct00007
표 2. 운동 5주 후 노화된 비복근의 생리학적 횡단면적(PCSA).
Figure pct00008
실시예 2: 프로스타글란딘 E2( PGE2 ) 주사 후의 증가된 근력.
본 실시예는 PGE2가 주사된 노화된 마우스에서 비복근의 특정 연축력에서의 증가를 제시한다. 노화된 마우스(18개월령)를 10일 동안 매일 탈진때까지 트레드밀에 적용시켰다. Exer3/6(Columbus Instruments)을 이용하여 트레드밀 달리기를 수행하였다. 마우스를 10 미터/min의 속도로 시작하여 20도 내리막으로 트레드밀에서 달리게 하였다. 3분 후, 속도를 20 미터/min의 최종 속도로 1 미터/min만큼 증가시켰다. 탈진을 전기 자극에도 불구하고 동물이 트레드밀에 머무르지 못하는 것으로 정의하였다. 각각의 트레드밀 달리기 2시간 후, 각각의 마우스의 둘 모두의 비복근에 PBS(대조군) 또는 3 nM PGE2(실험군)를 주사하였다. 힘 측정을 소정의 최대초과 자극 강도에서 단일한 0.1 ms 펄스를 갖는 300C-LR 힘 변환기(Aurora Scientific)를 이용하여 마지막 트레드밀 달리기 4주 후에 수행하였다.
단일 비복근의 대표적인 미가공 근력 추적이 도 4m-4n에 제공된다. 근력 및 동기화 펄스를 PCI-6251 획득 카드(National Instruments)를 통해 기록하고, Matlab을 이용하여 분석하였다. 도 4o-4p는 근육 생리학적 횡단면적으로 힘 측정을 표준화하여 계산된 특정 근력 값을 제시한다. 특정 연축력 값(kN/m2)는 최소, 최대, 및 중앙 값을 제시하는 박스 및 휘스커 플롯(Box and Whiskers plot)으로 표시된다. 각각의 근육으로부터 5회의 반복 측정이 이루어졌다. 대조군에 대해 N=4; PGE2 주사 그룹에 대해 n=5. **는 양측 만 휘트니 검정에 의한 p<0.005의 통계적 유의 값을 나타낸다.
VI. 예시적 구현예
본원에 개시된 주제에 따라 제공되는 예시적 구현예는 청구항 및 하기 구현예를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
1. 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물과 함께 분리된 근육 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 분리된 근육 세포 집단의 증식을 자극하기 위한 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 정제된 것인 방법.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
4. 구현예 1 내지 구현예 3 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
5. 구현예 1 내지 구현예 4 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체로부터 획득되는 방법.
6. 구현예 5에 있어서, 대상체가 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 방법.
7. 구현예 6에 있어서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병이 급성 근육 손상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
8. 구현예 1 내지 구현예 7 중 어느 하나에 있어서, PGE2 유도체가 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함하는 방법.
9. 구현예 1 내지 구현예 7 중 어느 하나에 있어서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물이 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함하는 방법.
10. 구현예 1 내지 구현예 9 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 것이 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함하는 방법.
11. 대상체에서 근육 세포의 착생을 촉진하기 위해 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물과 함께 분리된 근육 세포 집단을 배양하는 단계; 및 배양된 근육 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 근육 세포 착생을 촉진하기 위한 방법.
12. 구현예 11에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 정제된 것인 방법.
13. 구현예 11 또는 구현예 12에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
14. 구현예 11 내지 구현예 13 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
15. 구현예 11 내지 구현예 14 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 자가 근육 세포 집단인 방법.
16. 구현예 11 내지 구현예 14 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 동종이형 근육 세포 집단인 방법.
17. 구현예 11 내지 구현예 16 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 방법.
18. 구현예 17에 있어서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병이 급성 근육 손상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
19. 구현예 11 내지 구현예 18 중 어느 하나에 있어서, PGE2 유도체가 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함하는 방법.
20. 구현예 11 내지 구현예 18 중 어느 하나에 있어서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물이 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함하는 방법.
21. 구현예 11 내지 구현예 20 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 것이 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함하는 방법.
22. 분리된 근육 세포의 집단 및 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 조성물.
23. 구현예 22에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는 조성물.
24. 구현예 22 또는 구현예 23에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함하는 조성물.
25. 구현예 22 내지 구현예 24 중 어느 하나에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
26. 구현예 22 내지 구현예 25 중 어느 하나의 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
27. 대상체에서 근육 세포의 집단을 증가시키고/시키거나 근육 기능을 향상시키기 위해 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 대상체에서 근육 세포 집단을 재생시키기 위한 방법.
28. 구현예 27에 있어서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병이 급성 근육 손상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
29. 구현예 27 또는 구현예 28에 있어서, 근육 세포의 집단이 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
30. 구현예 27 내지 구현예 29 중 어느 하나에 있어서, 근육 세포의 집단이 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
31. 구현예 27 내지 구현예 30 중 어느 하나에 있어서, PGE2 유도체가 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함하는 방법.
32. 구현예 27 내지 구현예 30 중 어느 하나에 있어서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물이 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함하는 방법.
33. 구현예 27 내지 구현예 32 중 어느 하나에 있어서, 화합물을 투여하는 것이 경구, 복막내, 근내, 동맥내, 피내, 피하, 정맥내, 또는 심장내 투여를 포함하는 방법.
34. 구현예 27 내지 구현예 33 중 어느 하나에 있어서, 화합물이 급성 요법에 따라 투여되는 방법.
35. 구현예 27 내지 구현예 34 중 어느 하나에 있어서, 투여가 대상체에 분리된 근육 세포 집단을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
36. 구현예 35에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 자가 근육 세포 집단인 방법.
37. 구현예 35에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 동종이형 근육 세포 집단인 방법.
38. 구현예 35 내지 구현예 37 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 정제된 것인 방법.
39. 구현예 35 내지 구현예 38 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 투여되기 전에 화합물과 함께 배양되는 방법.
40. 구현예 39에 있어서, 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 것이 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함하는 방법.
41. 구현예 35 내지 구현예 40 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단을 투여하는 것이 대상체로 세포를 주사하거나 이식하는 것을 포함하는 방법.
42. 구현예 35 내지 구현예 41 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단 및 화합물이 동시에 대상체에 투여되는 방법.
43. 구현예 35 내지 구현예 41 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단 및 화합물이 순차적으로 대상체에 투여되는 방법.
44. 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 (i) 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체, 및 (ii) 분리된 근육 세포의 집단을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 근육 상해, 손상 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료할 필요가 있는 대상체에서 근육 상해, 손상 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 방법.
45. 구현예 44에 있어서, PGE2 유도체가 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함하는 방법.
46. 구현예 44에 있어서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물이 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함하는 방법.
47. 구현예 44 내지 구현예 46 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
48. 구현예 44 내지 구현예 47 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육모세포, 근육세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
49. 구현예 44 내지 구현예 48 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 정제된 것인 방법.
50. 구현예 44 내지 구현예 49 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 투여되기 전에 화합물과 함께 배양되는 방법.
51. 구현예 50에 있어서, 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 것이 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함하는 방법.
52. 구현예 44 내지 구현예 51 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 자가 근육 세포 집단인 방법.
53. 구현예 44 내지 구현예 51 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 동종이형 근육 세포 집단인 방법.
54. 구현예 44 내지 구현예 53 중 어느 하나에 있어서, 화합물을 투여하는 것이 경구, 복막내, 근내, 동맥내, 피내, 피하, 정맥내, 또는 심장내 투여를 포함하는 방법.
55. 구현예 44 내지 구현예 54 중 어느 하나에 있어서, 화합물이 급성 요법에 따라 투여되는 방법.
56. 구현예 44 내지 구현예 55 중 어느 하나에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단을 투여하는 것이 대상체로 세포를 주사하거나 이식하는 것을 포함하는 방법.
57. 구현예 44 내지 구현예 56 중 어느 하나에 있어서, 화합물 및 분리된 근육 세포의 집단이 동시에 대상체에 투여되는 방법.
58. 구현예 44 내지 구현예 56 중 어느 하나에 있어서, 화합물 및 분리된 근육 세포의 집단이 순차적으로 대상체에 투여되는 방법.
59. 구현예 44 내지 구현예 58 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖거나, 발병할 위험이 있는 것으로 의심되는 방법.
60. 구현예 44 내지 구현예 59 중 어느 하나에 있어서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병이 급성 근육 손상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
전술한 본 발명은 이해의 명료함을 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 기재되었으나, 당업자는 첨부된 청구항의 범위 내에서 특정한 변화 및 변형이 실시될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 본원에 제공된 각각의 참고문헌은 각각의 참고문헌이 참조로서 개별적으로 포함되는 것과 동일한 정도로 전체내용이 참조로서 포함된다.
정보 서열 목록
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MUSCLE REGENERATION USING PROSTAGLANDIN E2 <130> 1038885 <140> PCT/US2017/020650 <141> 2017-03-03 <150> US 62/303,979 <151> 2016-03-04 <150> US 62/348,116 <151> 2016-06-09 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Gapdh forward primer <400> 1 ttcaccacca tggagaaggc 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Gapdh reverse primer <400> 2 cccttttggc tccaccct 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Hpgd forward primer <400> 3 tccagtgtga tgtggctgac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Hpgd reverse primer <400> 4 attgttcacg cctgcattgt 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ptges forward primer <400> 5 gctgtcatca caggccaga 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ptges reverse primer <400> 6 ctccacatct gggtcactcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ptges2 forward primer <400> 7 ctcctacagg aaagtgccca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ptges2 reverse primer <400> 8 accaggtagg tcttgagggc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ptger1 forward primer <400> 9 gtggtgtcgt gcatctgct 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ptger1 reverse primer <400> 10 ccgctgcagg gagttagagt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ptger2 forward primer <400> 11 accttcgcca tatgctcctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ptger2 reverse primer <400> 12 ggaccggtgg cctaagtatg 20

Claims (60)

  1. 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물과 함께 분리된 근육 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 분리된 근육 세포 집단의 증식을 자극하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 정제된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체로부터 획득되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 대상체가 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병이 급성 근육 손상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, PGE2 유도체가 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물이 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 것이 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함하는 방법.
  11. 대상체에서 근육 세포의 착생을 촉진하기 위해 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물과 함께 분리된 근육 세포 집단을 배양하는 단계; 및 배양된 근육 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 근육 세포 착생을 촉진하기 위한 방법.
  12. 제11항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 정제된 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 자가 근육 세포 집단인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 동종이형 근육 세포 집단인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 대상체가 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병이 급성 근육 손상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  19. 제11항에 있어서, PGE2 유도체가 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함하는 방법.
  20. 제11항에 있어서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물이 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함하는 방법.
  21. 제11항에 있어서, 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 것이 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함하는 방법.
  22. 분리된 근육 세포의 집단 및 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함하는 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  26. 제22항의 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  27. 대상체에서 근육 세포의 집단을 증가시키고/시키거나 근육 기능을 향상시키기 위해 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는 대상체에서 근육 세포 집단을 재생시키기 위한 방법.
  28. 제27항에 있어서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병이 급성 근육 손상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 근육 세포의 집단이 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 근육 세포의 집단이 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육세포, 근육모세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  31. 제27항에 있어서, PGE2 유도체가 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함하는 방법.
  32. 제27항에 있어서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물이 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함하는 방법.
  33. 제27항에 있어서, 화합물을 투여하는 것이 경구, 복막내, 근내, 동맥내, 피내, 피하, 정맥내, 또는 심장내 투여를 포함하는 방법.
  34. 제27항에 있어서, 화합물이 급성 요법에 따라 투여되는 방법.
  35. 제27항에 있어서, 투여가 대상체에 분리된 근육 세포 집단을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 자가 근육 세포 집단인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 동종이형 근육 세포 집단인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 정제된 것인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 투여되기 전에 화합물과 함께 배양되는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 것이 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함하는 방법.
  41. 제35항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단을 투여하는 것이 대상체로 세포를 주사하거나 이식하는 것을 포함하는 방법.
  42. 제35항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단 및 화합물이 동시에 대상체에 투여되는 방법.
  43. 제35항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단 및 화합물이 순차적으로 대상체에 투여되는 방법.
  44. 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위해 (i) 치료적 유효량의 프로스타글란딘 E2(PGE2), PGE2 프로드러그, PGE2 수용체 효능제, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물, PGE2 억제를 중화시키는 화합물, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체, 및 (ii) 분리된 근육 세포의 집단을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 근육 상해, 손상 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료할 필요가 있는 대상체에서 근육 상해, 손상 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 방법.
  45. 제44항에 있어서, PGE2 유도체가 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2를 포함하는 방법.
  46. 제44항에 있어서, PGE2 분해대사를 약화시키는 화합물이 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 비활성화시키거나 차단하거나, 프로스타글란딘 전달체(PTG 또는 SLC02A1)를 비활성화시키거나 차단하는 화합물, 중화 펩티드, 또는 중화 항체를 포함하는 방법.
  47. 제44항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 골격근 세포, 평활근 세포, 심장 근육 세포, 배아 줄기 세포-유래 근육 세포, 유도된 다능성 줄기 세포-유래 근육 세포, 탈분화 근육 세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  48. 제44항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 근육 줄기 세포, 위성 세포, 근육모세포, 근육세포, 근육대롱, 근육섬유, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  49. 제44항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 정제된 것인 방법.
  50. 제44항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 투여되기 전에 화합물과 함께 배양되는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 분리된 근육 세포 집단과 함께 화합물을 배양하는 것이 화합물에 대한 분리된 근육 세포 집단의 급성, 간헐적, 또는 연속 노출을 포함하는 방법.
  52. 제44항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 자가 근육 세포 집단인 방법.
  53. 제44항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단이 대상체에 대해 동종이형 근육 세포 집단인 방법.
  54. 제44항에 있어서, 화합물을 투여하는 것이 경구, 복막내, 근내, 동맥내, 피내, 피하, 정맥내, 또는 심장내 투여를 포함하는 방법.
  55. 제44항에 있어서, 화합물이 급성 요법에 따라 투여되는 방법.
  56. 제44항에 있어서, 분리된 근육 세포의 집단을 투여하는 것이 대상체로 세포를 주사하거나 이식하는 것을 포함하는 방법.
  57. 제44항에 있어서, 화합물 및 분리된 근육 세포의 집단이 동시에 대상체에 투여되는 방법.
  58. 제44항에 있어서, 화합물 및 분리된 근육 세포의 집단이 순차적으로 대상체에 투여되는 방법.
  59. 제44항에 있어서, 대상체가 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖거나, 발병할 위험이 있는 것으로 의심되는 방법.
  60. 제44항에 있어서, 근육 상해, 손상, 또는 위축과 관련된 질환 또는 질병이 급성 근육 손상 또는 외상, 연조직 수의 외상, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근육 디스트로피, 팔다리이음근육 디스트로피, 근육위축가쪽경화증(ALS), 원위근이영양증(DD), 유전 근육병증, 근육긴장퇴행위축(MDD), 사립체근육병증, 근세관성 근육병증(MM), 중증근육무력증(MG), 울혈성심장기능상실, 주기마비, 다발근육염, 횡문근융해, 피부근육염, 암 악액질, AIDS 악액질, 심장 악액질, 스트레스 유발 요실금, 및 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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