ES3037865T3 - A composition comprising stem cell cultures - Google Patents

A composition comprising stem cell cultures

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ES3037865T3 ES23207671T ES23207671T ES3037865T3 ES 3037865 T3 ES3037865 T3 ES 3037865T3 ES 23207671 T ES23207671 T ES 23207671T ES 23207671 T ES23207671 T ES 23207671T ES 3037865 T3 ES3037865 T3 ES 3037865T3
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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos para estabilizar células y métodos para su uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Una composición que comprende cultivos de células madre
Antecedentes de la invención
Las células madre embrionarias (ESC) son células pluripotentes que tienen la capacidad de autorrenovarse indefinidamente y diferenciarse en todos los tipos celulares del cuerpo (Thomson, J.A. Y col., Science 282 (5391 ):1145-1147 (1998); Thomson, J.A. & Odorico, J.S., Trends Biotechnol 18 (2):53-57 (2000). Esta capacidad proporciona la esperanza de que las ESC se usen un día para reemplazar las células perdidas y dañadas, y proporcionar terapias más allá del alcance de los fármacos convencionales. Sin embargo, para realizar completamente los potenciales clínicos de las hESC, las condiciones de cultivo robustas definidas químicamente, sin alimento y animales, tienen que establecerse condiciones de cultivo robustas. Aunque se han informado varios medios definidos químicamente (Yao, S. y col., Proc Natl Acad Sci U S A 103 (18):6907-6912 (2006); Lu, J. y col., Proc Natl Acad Sci USA 103 (15):5688-5693 (2006); Ludwig, T.E. y col., Nat Biotechnol 24 (2):185-187 (2006)), todavía son en gran medida insatisfactorios debido al rendimiento subóptimo de las células en ellos. Especialmente en estas condiciones, cuando las células se pasan por tripsina a células individuales, experimentan muerte celular extensa. Se conocen varias rutas de señalización que median la autorrenovación de hESC, incluyendo FGF, TGF-p, Wnt, etc. (James, D. y col., Development 132 (6):1273-1282 (2005); Xu, R.H. y col., Nat Methods 2 (3):185-190 (2005); Beattie, G.M. y col., Stem Cells 23 (4):489-495 (2005); Greber, B., Lehrach, H., & Adjaye, J., Stem Cells 25 (2):455-464 (2007); Sato, N. y col., Nat Med 10 (1):55-63 (2004)). Sin embargo, ninguno de ellos parece actuar como un factor de supervivencia en este proceso, cuyo mecanismo molecular es elusivo. El documento WO 2007/109045 describe compuestos orgánicos heterocíclicos que se dice inhiben, regulan y/o modulan la tirosina y la serina/treonina quinasa y proteínas similares a las quinasas, tales como la quinasa RAF. El documento WO 02/056888 describe un ensayo para la identificación y comparación de compuestos que tienen actividad como moduladores de la expresión y liberación de TNF-a, IL-1 o IL-6 en humanos y animales en el que se emplea la modulación de la actividad catalítica de la PRAK (proteína quinasa activada/regulada por p38) para la identificación y comparación de los compuestos experimentales. El documento US 7.265.138 describe los ligandos del receptor vainilloide y su posible uso en el tratamiento de enfermedades.
La presente invención proporciona un método para mejorar la supervivencia y/o la proliferación celular, comprendiendo el método:
(a) obtener células aisladas que comprendan células madre; y
(b) poner en contacto las células aisladas con una cantidad de un compuesto suficiente para mejorar la supervivencia y/o la proliferación de las células en comparación con la ausencia del compuesto: donde el compuesto es un compuesto de fórmula (II):
o un racemato, diastereómero, tautómero o un isómero geométrico del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En la fórmula (II), L2 es alquileno C<1>-C<6>no sustituido; y es un número entero de 0 a 1; z es un número entero de 0 a 5; X es -N= o -CH=; R1 es hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>no sustituido; R3 y R4 son independientemente -C(O)NR14R15, -OR18, o alquilo C<1>-C<6>sustituido o no sustituido, en donde si z es mayor que 1, dos restos R3 se unen opcionalmente para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; R14 y R15 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; y R18 es hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>no sustituido.
La invención también proporciona una composición que comprende las células aisladas obtenidas utilizando el método de la invención y el compuesto de fórmula (II), o un racemato, diastereómero, tautómero o un isómero geométrico del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, L2 es metileno.
En algunas realizaciones, z es 2 y dos restos R3 en vértices adyacentes se unen para formar un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido.
En algunas realizaciones, z es 1.
En algunas realizaciones, R3 es -OR18, y R18 es hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>no sustituido.
En algunas realizaciones, L2 es metileno. X es -N= o -CH=; R1 es hidrógeno; y las letras z e y son 0.
En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula (II) tiene la fórmula:
En algunas realizaciones, el método permite la estabilización de una célula aislada in vitro. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto una célula animal con una cantidad suficiente de un compuesto de fórmula (II) para estabilizar la célula.
En algunas realizaciones, el método comprende además cambiar las condiciones o el entorno de la célula en presencia del compuesto, en donde la etapa de cambio en ausencia del compuesto daría como resultado un cambio en la programación celular de la célula. En algunas realizaciones, la etapa de cambio comprende al menos una de descongelar las células y disociar las células de otras células.
En algunas realizaciones, la célula es adherente. En algunas realizaciones, la célula está en suspensión.
En algunas realizaciones, el método comprende además determinar un fenotipo de la célula.
En algunas realizaciones, el método comprende aislar las células de un animal. En algunas realizaciones, el animal es un ser humano. En algunas realizaciones, el animal es un animal no humano.
También se describen en la presente memoria métodos para mejorar una afección en un animal. El método puede comprender administrar una cantidad suficiente de un compuesto de fórmula (II) a un animal que lo necesite para mejorar la afección.
La afección puede seleccionarse del grupo que consiste en daño tisular, accidente cerebrovascular y cáncer. El tejido puede seleccionarse del grupo que consiste en páncreas, hígado, intestino, pulmón y riñón.
La afección puede comprender al menos el rechazo parcial de un tejido u órgano trasplantado. El trasplante puede comprender el trasplante de médula ósea, sangre del cordón umbilical, células madre o progenitoras hematopoyéticas purificadas, células cardíacas, células neurales, células beta pancreáticas o células hepáticas.
En algunas realizaciones, el método comprende generar células madre aisladas e inducir la estabilización de la E-cadherina en las células madre aisladas, manteniendo de este modo la supervivencia celular.
En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto células madre aisladas con una cantidad de un compuesto de fórmula (II) suficiente para obtener una supervivencia de las células madre aisladas al menos 2 veces mejor que en ausencia del compuesto.
En algunas realizaciones, el método comprende cultivar células madre aisladas en una superficie, en donde una molécula que comprende un ectodominio de E-cadherina está fijada a la superficie.
En algunas realizaciones, la composición comprende células aisladas que comprenden una cantidad de un compuesto de fórmula (II) que estabiliza la E-cadherina en las células suficiente para obtener una supervivencia de las células aisladas al menos 2 veces mejor que en ausencia del compuesto.
En algunas realizaciones, las células se seleccionan del grupo que consiste en células madre, células madre inducidas y células madre pluripotentes.
En algunas realizaciones, la composición comprende células aisladas que comprenden una cantidad de fórmula (II) suficiente para obtener una supervivencia de las células aisladas al menos 2 veces mejor que en ausencia del compuesto.
En algunas realizaciones, las células se seleccionan del grupo que consiste en células madre, células madre inducidas y células madre pluripotentes.
En algunas realizaciones, el método comprende generar células aisladas; y activar la proteína cinasa C (PKC) en las células aisladas, manteniendo de este modo la supervivencia celular.
En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto una cantidad suficiente de 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) con las células aisladas para mejorar la supervivencia de las células en comparación con la tasa de supervivencia en ausencia de PMA.
En algunas realizaciones, la composición comprende células madre aisladas que comprenden una cantidad de activador de proteína quinasa C suficiente para obtener una supervivencia de las células madre aisladas al menos 2 veces mejor que en ausencia del activador de PKC.
Definiciones
Las abreviaturas utilizadas en la presente memoria tienen su significado convencional dentro de las técnicas químicas y biológicas.
El término “estabilizar una célula” se refiere a reducir o eliminar sustancialmente la respuesta de una célula a un cambio en las condiciones o el entorno al que está expuesta la célula. “ Reducir sustancialmente” en este contexto significa que la respuesta es al menos un 50 % menor que en ausencia de un componente estabilizante (por ejemplo, los compuestos de fórmula (II)).
El término “cambiar las condiciones o el entorno de una célula” se refiere a cambiar la temperatura, los medios de cultivo (por ejemplo, la fuente de carbono, la concentración de sal, el factor de crecimiento), disociar las células en células aisladas, descongelar células o cambiar de otro modo un factor del entorno inmediato de una célula. Como se analiza en la presente memoria, cambiar la condición o el entorno de una célula a menudo cambiará el fenotipo de la célula o la programación celular. Por ejemplo, las células madre, así como algunas otras células, cuando se aíslan se diferenciarán y/o mueren en respuesta a ciertos cambios tales como aislamiento, descongelación, etc. Por tanto, las condiciones cambiantes pueden reducir o eliminar la viabilidad celular mientras que las células estabilizadas como se describe en la presente memoria no tienen una viabilidad sustancialmente reducida bajo los mismos cambios de condición. El cambio en la programación celular también se puede controlar como respuesta de una célula a un estímulo específico que es característico de un determinado tipo de célula y/o como por la expresión de uno o un conjunto de genes o productos génicos característicos. Como ejemplo no limitativo, se sabe que las células madre pluripotentes humanas expresan al menos algunos, y opcionalmente todos, de los marcadores de la siguiente lista: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-cadherina, UTF-1, Oct4, Rex1 y Nanog. Tal expresión puede cambiar como una célula madre pierde pluripotencia o de otro modo diferenciarla. Una célula madre pluripotente humana estabilizada mantendría su patrón de expresión característico después de un cambio en la condición.
Una célula “ aislada” se ha separado sustancialmente o purificado de otras células de un organismo.
El término “disociar” células se refiere a un proceso de aislamiento de células de otras células o de una superficie (por ejemplo, la superficie de una placa de cultivo). Por ejemplo, las células se pueden disociar de un animal o tejido mediante métodos mecánicos o enzimáticos. Alternativamente, las células que se agregan in vitro pueden disociarse entre sí. En aún otra alternativa, las células adherentes se disocian de una placa de cultivo u otra superficie. Por tanto, la disociación puede implicar romper las interacciones celulares con la matriz extracelular (ECM) y los sustratos (por ejemplo, superficies de cultivo), o romper la ECM entre las células.
“Determinar un fenotipo de una célula” se refiere a evaluar una calidad o característica de la célula. Los fenotipos pueden incluir, por ejemplo, expresión génica característica de tipo celular, o patrones de expresión génica, respuesta de la célula a un estímulo o entorno, la capacidad de diferenciarse o desdiferenciarse, tiene una morfología particular, etc.
Cuando los grupos sustituyentes químicos se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes químicamente idénticos que resultarían de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, -CH<2>O- es equivalente a -OCH<2>-.
El término “alquilo” , por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena lineal (es decir, no ramificada) o ramificada, o una combinación de las mismas, que puede estar completamente saturada, mono o poliinsaturada y puede incluir radicales divalentes y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designado (es decir, C<1>-C<10>significa de uno a diez carbonos). Los ejemplos de radicales hidrocarbonados saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, npentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces 0 triples enlaces. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2- (butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo y los homólogos e isómeros superiores. Los grupos alquilo preferidos son grupos alquilo C<1>-<6>.
El término “alquileno” por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de un alquilo, como se ejemplifica, pero no limitado, por -CH<2>CH<2>CH<2>CH<2>-. Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, ilustrándose esos grupos con 10 o menos átomos de carbono en la presente invención. Un “alquilo inferior” o “alquileno inferior” es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que generalmente tiene ocho o menos átomos de carbono. Los grupos alquileno preferidos son grupos alquileno C<1>-<6>.
El término “ heteroalquilo” , por sí mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena estable o ramificada estable o radical hidrocarburo cíclico, o combinaciones de los mismos, que consiste en al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, N, P, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede cuaternizarse opcionalmente. El/los heteroátomo(s) O, N, P y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la que el grupo alquilo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, -CH<2>-CH<2>-O-CH<3>, -CH<2>-CH<2>-NH-CH<3>, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH<2>-S-CH<2>-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, - CH=CH-N(CH3)-CH<3>, O-CH<3>, -O-CH<2>-CH<3>y-CN. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tal como, por ejemplo, CH<2>-NH-OCH<3>y -CH2-O-Si(CH3)3. De manera similar, el término “ heteroalquileno” por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ilustra, pero no está limitado por, -CH<2>-CH<2>-S-CH<2>-CH<2>- y - CH<2>-S-CH<2>-CH<2>-NH-CH<2>-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar uno o ambos extremos de la cadena (por ejemplo, alquilenoxilo, alquilenodioxilo, alquilenamino, alquilendiamino, y similares). Además, en el caso de los grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, la orientación del grupo de enlace no está implícita en la dirección en la que se escribe la fórmula del grupo de unión. Por ejemplo, la fórmula -C(O)<2>R'- representa tanto -C(O)<2>R'- como -R'C(O)<2>-. Como se ha descrito anteriormente, los grupos heteroalquilo, como se utilizan en la presente memoria, incluyen los grupos que están unidos al resto de la molécula a través de un heteroátomo, tales como -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R", -OR', -SR', y/o -SO<2>R'. Cuando se menciona “ heteroalquilo” , seguido de menciones de grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares, se entenderá que los términos heteroalquilo y -NR'R" no son redundantes o mutuamente excluyentes. Más bien, los grupos heteroalquilo específicos se mencionan para añadir claridad. Por lo tanto, el término “ heteroalquilo” no debe interpretarse en la presente memoria como excluyente de grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares. Los grupos heteroalquilo preferidos son grupos heteroalquilo C<1>-<6>.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “ heteroalquileno” se refiere a un grupo heteroalquilo, tal como se ha definido anteriormente, que enlaza al menos otros dos grupos. Los dos restos unidos al heteroalquileno pueden estar unidos al mismo átomo o a diferentes átomos del heteroalquileno. Los grupos heteroalquileno preferidos son grupos heteroalquileno C<1>-<6>.
Los términos “cicloalquilo” y “ heterocicloalquilo” , por sí solos o en combinación con otros términos, representan, salvo que se indique lo contrario, versiones cíclicas de “alquilo” y “ heteroalquilo” , respectivamente. Además, para el heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la que el heterociclo se une al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1 -(1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo y similares. Un “cicloalquileno” y un “ heterocicloalquileno” se refieren a un radical divalente derivado de cicloalquilo y heterocicloalquilo, respectivamente. Los grupos cicloalquilo y heterocicloalquilo pueden ser grupos cicloalquilo C<3-8>y heterocicloalquilo C<3>-<8>, o bien grupos cicloalquilo C<5-8>y heterocicloalquilo C<5>-<8>.
Los términos “ halo” o “ halógeno” , por sí mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Además, términos como “ haloalquilo” incluyen monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término “ haloalquilo(Ci -C<4>)” debe entenderse como inclusivo de trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo y similares.
El término “ arilo” significa, a menos que se indique lo contrario, un sustituyente hidrocarbonado poliinsaturado, aromático, que puede ser un anillo único o múltiples anillos (preferiblemente de 1 a 3 anillos) que están fusionados o unidos covalentemente. El término “ heteroarilo” se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados entre N, O y S, en los que los átomos de nitrógeno y azufre están opcionalmente oxidados, y el átomo o átomos de nitrógeno están opcionalmente cuaternizados. Un grupo heteroarilo puede unirse al resto de la molécula a través de un carbono o un heteroátomo. Los ejemplos no limitativos de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1 -naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-quinoxalinilo, 5-indolilo, 1 -quinoxalinilo, 5-isoquinolil, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-isoquinolilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillo arilo y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos a continuación. “Arileno” y “ heteroarileno” se refieren a un radical divalente derivado de un arilo y un heteroarilo, respectivamente. Los grupos arilo de la presente invención tienen preferiblemente 5-12 miembros de anillo, más preferiblemente 6-10 miembros de anillo. Los grupos heteroarilo de la presente invención tienen preferiblemente 5-12 miembros de anillo, más preferiblemente 5-10 miembros de anillo.
En aras de la brevedad, el término “ arilo” , cuando se utiliza en combinación con otros términos (por ejemplo, ariloxilo, ariltioxilo, arilalquilo), incluye tanto los anillos arilo como los heteroarilo definidos anteriormente. Por lo tanto, el término “arilalquilo” debe entenderse como inclusivo de los radicales en los que un grupo arilo está unido a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares), incluidos los grupos alquilo en los que un átomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno) se ha reemplazado por, por ejemplo, un átomo de oxígeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3-(1-naftiloxi)propilo y similares).
El término “oxo” , tal como se utiliza en la presente memoria, significa un oxígeno que está doblemente unidos a un átomo de carbono.
El término “alquilsulfonilo” , tal como se utiliza en la presente memoria, significa una fracción que tiene la fórmula -S(O2)-R', donde R' es un grupo alquilo tal como se ha definido anteriormente. R' puede tener un número especificado de carbonos (por ejemplo, “ alquilsulfonilo C1-C4” ).
Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, “ alquilo” , “ heteroalquilo” , “arilo” y “ heteroarilo” ) debe entenderse como inclusivo de formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. A continuación se proporcionan sustituyentes a modo de ejemplo para cada tipo de radical.
Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluidos aquellos grupos a menudo denominados alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados de, pero sin limitarse a: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"Rm, -NR"C(O)<2>R', -NR-C(NR'R"Rm)=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)<2>R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2 en un número que varía de cero a (2m'+1), donde m' es el número total de átomos de carbono en dicho radical. R', R", Rm y R"" se refieren cada uno preferiblemente de forma independiente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos), grupos alquilo, alcoxilo o tioalcoxilo sustituidos o no sustituidos, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente del mismo modo que los grupos R', R", Rm y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos. Cuando R' y R" están unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 4, 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" incluye, pero no se limita a, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la exposición anterior de los sustituyentes, un experto en la técnica entenderá que el término “alquilo” incluye grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos distintos de los grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH<3>, -C(O)CF<3>, -C(O)CH<2>OCH<3>, y similares).
De manera similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo son variados y se seleccionan de, por ejemplo: halógeno, -OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"Rm, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"Rm, -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"Rm)=NR"", -NR-C(NR'R")=NRm, -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoro(C<1>-C<4>)alcoxi, y fluoro(C<1>-C<4>)alquilo, en un número que varía de cero al número total de valencias abiertas en el sistema de anillos aromáticos; y donde R', R", Rm y R"" se seleccionan preferiblemente independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente del mismo modo que los grupos R', R", R'" y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos.
Dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden formar opcionalmente un anillo de fórmula -T-C(O)-(CRR')q-U-, en donde T y U son independientemente -NR-, -O-, -CRR'- o un enlace sencillo, y q es un número entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo pueden sustituirse opcionalmente por un sustituyente de fórmula -A-(CH2)r-B-, en donde A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- o un enlace simple, y r es un número entero de 1 a 4. Uno de los enlaces simples del nuevo anillo así formado puede sustituirse opcionalmente por un enlace doble. Alternativamente, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden sustituirse opcionalmente por un sustituyente de fórmula -(CRR')s-X'-(C "Rm)d-, donde s y d son números enteros independientes de 0 a 3, y X' es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, o -S(O)2NR'-. Los sustituyentes R, R', R" y Rm se seleccionan preferiblemente de forma independiente entre hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “ heteroátomo” o “ heteroátomo anular” incluye oxígeno (O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P) y silicio (Si).
Un “grupo sustituyente” , tal como se utiliza en la presente memoria, significa un grupo seleccionado entre las siguientes moléculas:
(A) -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, oxo, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y
(B) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de:
(A) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y
(ii) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de:
(a) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido, y
(b) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido y heteroarilo no sustituido.
Un “ sustituyente de tamaño limitado” o “grupo sustituyente de tamaño limitado” , tal como se utiliza en la presente memoria, significa un grupo seleccionado entre todos los sustituyentes descritos anteriormente para un “grupo sustituyente” , en el que cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C4-C8 sustituido o no sustituido, y cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 4 a 8 miembros sustituido o no sustituido.
Un “sustituyente inferior” o “grupo sustituyente inferior” , tal como se utiliza en la presente memoria, significa un grupo seleccionado entre todos los sustituyentes descritos anteriormente para un “grupo sustituyente” , en el que cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C5-C7 sustituido o no sustituido, y cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido.
El término “sales farmacéuticamente aceptables” incluye las sales de los compuestos activos que se preparan con ácidos o bases relativamente no tóxicos, dependiendo de los sustituyentes particulares que se encuentren en los compuestos descritos en la presente memoria. Cuando los compuestos de fórmula (II) contienen funcionalidades relativamente ácidas, las sales de adición de bases se pueden obtener poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, ya sea pura o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables incluyen sal de sodio, potasio, calcio, amonio, amino orgánico o magnesio, o una sal similar. Cuando los compuestos de fórmula (II) contienen funcionalidades relativamente básicas, las sales de adición de ácido se pueden obtener poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, ya sea puro o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos como clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrogenocarbónico, fosfórico, monohidrogenofosfórico, dihidrogenofosfórico, sulfúrico, monohidrogenosulfúrico, yodhídrico o fosforoso y similares, así como también las sales derivadas de ácidos orgánicos relativamente no tóxicos como acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, bencenosulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metanosulfónico y similares. También se incluyen sales de aminoácidos tales como arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos como ácidos glucurónicos o galacturónicos y similares (véase, por ejemplo, Berge y col., “ Pharmaceutical Salts” , Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Determinados compuestos específicos de fórmula (II) contienen funcionalidades tanto básicas como ácidas que permiten que los compuestos se conviertan en sales de adición de base o ácido.
Por lo tanto, los compuestos de fórmula (II) pueden existir como sales con ácidos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de tales sales incluyen clorhidratos, bromhidratos, sulfatos, metanosulfonatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartratos (por ejemplo (+) -tartratos, (-) -tartratos o mezclas de los mismos incluyendo mezclas racémicas, succinatos, benzoatos y sales con aminoácidos tales como ácido glutámico. Estas sales pueden prepararse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Las formas neutras de los compuestos se regeneran preferiblemente poniendo en contacto la sal con una base o ácido y aislando el compuesto original de la manera convencional. La forma original del compuesto difiere de las diversas formas de sal en ciertas propiedades físicas, tales como la solubilidad en disolventes polares.
Los profármacos de los compuestos también se describen en la presente memoria y son aquellos compuestos que experimentan fácilmente cambios químicos en condiciones fisiológicas para proporcionar los compuestos de fórmula (II). Además, los profármacos se pueden convertir en los compuestos de fórmula (II) mediante métodos químicos o bioquímicos en un entorno ex vivo. Por ejemplo, los profármacos se pueden convertir lentamente en los compuestos de fórmula (II) cuando se colocan en un depósito de parche transdérmico con una enzima o reactivo químico adecuado.
Determinados compuestos de fórmula (II) pueden existir en formas no solvatadas así como en formas solvatadas, incluyendo formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y están comprendidas dentro del alcance de fórmula (II). Determinados compuestos de fórmula (II) pueden existir en múltiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas físicas son equivalentes para los usos contemplados por la presente invención.
Determinados compuestos de fórmula (II) poseen átomos de carbono asimétricos (centros ópticos) o dobles enlaces; los racematos, diastereómeros, tautómeros, isómeros geométricos e isómeros individuales están abarcados dentro del alcance de fórmula (II). Los compuestos de fórmula (II) no incluyen aquellos conocidos en la técnica por ser demasiado inestables para sintetizar y/o aislar.
Los compuestos de fórmula (II) también pueden contener proporciones no naturales de isótopos atómicos en uno o más de los átomos que constituyen dichos compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden radiomarcarse con isótopos radiactivos, tales como, por ejemplo, tritio (3H), yodo-125 (125I) o carbono-14 (14C). Todas las variaciones isotópicas de los compuestos de fórmula (II), ya sean radiactivas o no, están comprendidas dentro del alcance de fórmula (II).
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Nuevas moléculas sintéticas de pequeño tamaño aumentan drásticamente la supervivencia de las células madre embrionarias (hESC) tras la disociación unicelular sin comprometer su autorrenovación a largo plazo ni su pleno potencial de desarrollo. (a) Estructuras químicas de Tiazovivina/Tzv y Pirintegrina/Ptn como se indica. (b) Tinción ALP de colonias de hESC que habían crecido a partir de células individuales disociadas sembradas en baja densidad y tratadas como se indica. (c) Razón de colonias positivas para ALP frente a células inicialmente sembradas totales. (d) Inmunotinción de hESC a largo plazo mantenida en medios que contenían Ptn o Tzv como se indica. (e) Secciones de 5 semanas de teratomas formados a partir de hESC expandidas a largo plazo mantenidas en medios que contenían Tzv (i, ii) o Ptn (iii, iv). Neuroepitelio (ectodermo), cartílago (mesodermo) y epitelio simple (endodermo) (i); neuroepitelio (ectodermo), epitelio simple y epitelio de tipo hepático (endodermo) (ii); neuroepitelio (ectodermo), cartílago (mesodermo) y epitelio tubular (endodermo) (iii); neuroepitelio (ectodermo), músculo esquelético (mesodermo) y epitelio tubular (endodermo) (iv). (f) Análisis de bandas G de hESC después de más de 20 pases, propagados en presencia de compuestos Ptn o Tzv. Si no se especifica, todas las hESC anteriores se cultivaron en el medio químicamente definido y libre de alimentador sobre las placas recubiertas con Matrigel.
Figura 2. Tzv estabiliza las E-cadherinas después de la disociación celular para proteger las hESC de la muerte en el cultivo en suspensión. (a) Análisis de muerte celular de hESC disociadas cultivadas en Matrigel o en suspensión tratada con o sin Ptn o Tzv. (b) Imágenes de contraste de fase de hESC cultivadas en placas no recubiertas tratadas con las moléculas indicadas. (c) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de E-cadherinas en hESC que se transfectaron con los ARNip específicos contra E-cadherina o GFP. (d) Análisis de muerte celular mediante tinción TUNEL de y (E) tinción ALP de hESC disociadas que se transfectaron con los ARNip específicos contra E-cadherina o GFP en presencia Tzv. (f) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de E-cadherinas de longitud completa en hESC antes y después de tripsina. (g) Un análisis de inmunotransferencia de tipo Western de curso temporal de expresión de E-cadherina de longitud completa en hESC después de disociación de tripsina y tratamiento con DMSO, Tzv o Ptn para el tiempo indicado. (h) Análisis de citometría de flujo del nivel de superficie de E-cadherina en hESC después del tratamiento con tripsina en presencia de Tzv. Se usó DMSO como control. (i) RT-PCR semicuantitativa de E-cadherina en hESC tratadas con o sin Tzv. (j) Análisis de endocitosis de E-cadherina en ausencia o presencia de Tzv. (k) Análisis de supervivencia celular de hESC cultivadas en concentraciones de BSA- o diferentes de placas recubiertas de quimera E-cad-Fc.
Figura 3. Ptn y Tzv protegen las hESC de la muerte celular en cultivo adherente después de la disociación manteniendo y reactivando la actividad de integrina. (a) Curva de crecimiento de hESC cultivadas en Matrigel con diferentes cursos de tiempo de tratamiento con Ptn y Tzv. Tratamiento del grupo 1, Ptn durante las primeras 24 h sólo; grupo 2, tratamiento de Ptn continuo durante todo el periodo de cultivo; grupo 3, tratamiento de Tzv durante las primeras 24 h sólo; grupo 4, tratamiento continuo de Tzv durante el cultivo; Para cada condición, se sembraron 10 x 104 células disociadas en placas por pocillo de una placa de 6 pocillos. (b) Imágenes de contraste de fase de hESC 12 horas después de la siembra en las diferentes matrices y tratadas con los compuestos indicados. (c) Las hESC disociadas se colocaron en placas recubiertas con Matrigel y se dejaron adherir durante 3 h en presencia de compuestos o junto con el anticuerpo de bloqueo de integrina p1 como se indica. El porcentaje de adhesión se calculó como se describe en los materiales y métodos. (d) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de la integrina p1 expresada por hESC antes y después del tratamiento con tripsina. (e) Un análisis de inmunotransferencia de tipo Western de curso temporal de la expresión de integrina en hESC después de la disociación de tripsina y el tratamiento con DMSO, Tzv o Ptn para el tiempo indicado. (f, g) Análisis por citometría de flujo (f), e inmunotinción (g) de las integrinas p1 en la conformación activa en hESC disociadas con tripsina después del tratamiento con Tzv o Ptn. (h, i) Adhesión celular (h) y tinción ALP (i) de hESC tratadas con o sin anticuerpo activador de p1, TS2/16. (j) Adhesión celular de hESC tratadas con Tzv o Ptn en combinación con o sin un inhibidor de PKC. (k) Inmunotinción de integrinas p1 en la conformación activa en hESC tratadas con o sin PMA (10 nM). (l, m) Adhesión celular (l) y tinción ALP (m) de hESC tratadas con los compuestos indicados.
Figura 4. Los receptores de los factores de crecimiento de PI-3K y ERK mediados por los receptores son la importante señalización de diferenciación y antidiferenciación generada a partir del nicho de hESC, respectivamente. (a) Análisis de muerte celular de hESC disociadas sembradas en Matrigel y tratadas como se indica. (b) La inmunotransferencia de tipo Western que muestra el estado de fosforilación de diferentes receptores del factor de crecimiento en hESC tratadas con Ptn durante 2 h. Se usó DMSO como control. (c ) Análisis de muerte celular de hESC disociadas en suspensión tratadas con las condiciones indicadas. (d) Inmunoprecipitación que muestra la interacción de E-cadherinas con el EGFR1 y Erb2. (e) Inmunotransferencia de tipo Western que muestra el estado de fosforilación de AKT en hESC tratadas con Ptn durante los periodos de tiempo indicados. (f) Inmunotransferencia de tipo Western que muestra el estado de fosforilación de AKT y ERK en presencia de Ptn o junto con el anticuerpo de bloqueo de integrina p1. (g) Inmunotransferencia de tipo Western que muestra el estado de fosforilación de AKT en hESC tratadas con Ptn o junto con los inhibidores de receptores indicados. (h) Análisis de muerte celular de hESC tratadas con Ptn o junto con inhibidor de PI-3K, o inhibidor de MEK durante 24 h. (i)Porcentaje de células negativas para SSEA4 después del tratamiento con inhibidor de MEK.
Las Figuras 5A y 5B muestran compuestos, incluidos compuestos de fórmula (II), que incluyen tiazovivina y derivados de la misma.
Las Figuras 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6F, 6G, 6H, 6I, 6J, 6K, 6L, 6M, 6N, 6O, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6U, 6V, 6W, 6X, 6Y, 6Z, 6AA, 6AB y 6AC muestran compuestos que incluyen pirintegrina y derivados de la misma.
Descripción detallada
I. Introducción
La presente invención proporciona (1) un método para mejorar la supervivencia y/o proliferación celular, y (2) una composición que comprende las células aisladas obtenidas utilizando dicho método y compuestos novedosos. Se proporciona una clase de compuestos químicos de moléculas pequeñas para su uso en la invención. Estos compuestos evitan la diferenciación de las células y promueven la supervivencia celular, incluido, aunque no de forma limitativa, cuando las células están aisladas o de cualquier otra manera fuera de su medio normal o medio tisular. Los compuestos son útiles como compuestos profilácticos y terapéuticos para una serie de indicaciones patológicas diferentes, incluidas, aunque no de forma limitativa, cáncer, daño tisular y accidente cerebrovascular.
II. Compuestos que promueven la supervivencia celular y/o antidiferenciación
En un aspecto, los compuestos utilizados en el método y la composición de la invención promueven la supervivencia celular y/o la antidiferenciación.
Los compuestos que promueven la supervivencia celular y/o la antidiferenciación tienen la fórmula (II):
En la fórmula (II), y es un número entero de 0 a 1 y z es un número entero de 0 a 5. X es -N= o -CH=.
R1 es hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>no sustituido y L2 es alquileno C<1>-C<6>no sustituido.
R3 y R4 son independientemente -C(O)NR14R15, -OR18, o alquilo C<1>-C<6>sustituido o no sustituido, en donde si z es mayor que 1, dos restos R3 se unen opcionalmente para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido. R14 y R15 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
R18 es hidrógeno o alquilo C<1>-C<6>no sustituido.
En algunas realizaciones, L2 es metileno no sustituido.
En otras realizaciones, el símbolo z puede ser 2. En otras realizaciones, dos restos R3 en vértices adyacentes se unen para formar un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido. El símbolo z también puede ser 1. R3 puede ser -OR18. En algunas realizaciones, L2 es metileno no sustituido, R1 es hidrógeno, y los símbolos z e y son 0.
En otras realizaciones, los compuestos tienen la fórmula:
(a veces llamada tiazovivina o “Tzv” ),
En algunas realizaciones, cada grupo sustituido descrito anteriormente en los compuestos de fórmula (II) está sustituido con al menos un grupo sustituyente. Más específicamente, en algunas realizaciones, cada alquilo sustituido, heteroalquilo sustituido, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo sustituido, arilo sustituido, heteroarilo sustituido, alquileno sustituido y/o heteroalquileno sustituido descritos anteriormente en los compuestos de fórmula (II) están sustituidos con al menos un grupo sustituyente. En otras realizaciones, al menos uno o todos estos grupos están sustituidos con al menos un grupo sustituyente de tamaño limitado. Alternativamente, al menos uno o todos estos grupos están sustituidos con al menos un grupo sustituyente inferior.
En otras realizaciones en los compuestos de Fórmula (II), cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C i -C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada alquileno sustituido o no sustituido es un alquileno C1-C20 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroalquileno sustituido o no sustituido es un heteroalquileno de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido.
En algunas realizaciones, cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C5-C7 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido, y/o cada alquileno sustituido o no sustituido es un alquileno C1-C8 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroalquileno sustituido o no sustituido es un heteroalquileno de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido.
En algunas otras realizaciones, los compuestos de fórmula (II) pueden estar sustituidos con alquilo C1-10, heteroalquilo C1-10, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"Rm, -NR"C(O)<2>R', -NR-C(NR'R"Rm)=NR"", -NR-C(NR'R")=NRm, -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, -NO2, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, en donde cada R', R", Rm y R"" hidrógeno, alquilo C1-10, heteroalquilo C1-10, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o grupos arilalquilo.
III. Métodos de uso
Los compuestos de fórmula (II) son útiles para una amplia variedad de propósitos. Por ejemplo, los compuestos promueven la supervivencia en situaciones (por ejemplo, para células aisladas) donde las células de otro modo pasarían a través de la apoptosis o de otro modo mueren. En algunas realizaciones, las células se estabilizan durante al menos un período de tiempo particular, por ejemplo, 10 minutos, 30 minutos, o 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48 o 96 horas. Además, los compuestos son útiles para mantener el estado actual de diferenciación de las células en condiciones donde las células de otro modo diferenciarían o cambiarían de otro modo su programación. Estos efectos conducen a un gran número de usos para los compuestos in vitro o in vivo.
A. Usos in vivo
Los compuestos de fórmula (II) son útiles para reducir el daño tisular y, por lo tanto, se pueden administrar para tratar, mejorar o prevenir el daño tisular. Un compuesto de fórmula (II) se puede administrar a un individuo que tiene, o está en riesgo de tener, daño tisular en un órgano interno. Los órganos internos incluyen, pero no se limitan a, cerebro, páncreas, hígado, intestino, pulmón, riñón o corazón, heridas, por ejemplo, por quemadura o corte. Por ejemplo, los compuestos de fórmula (II) pueden ser eficaces para reducir el tamaño del infarto en la reperfusión después de la isquemia. Por lo tanto, un compuesto de fórmula (II) se puede administrar a individuos con riesgo de tener, que tienen o que han tenido un accidente cerebrovascular. De manera similar, un compuesto de fórmula (II) se puede administrar a individuos con riesgo de tener, que tienen o que han tenido, un ataque cardíaco o daño cardíaco.
Los inventores han descubierto que los compuestos de fórmula (II) pueden prevenir la muerte celular, por ejemplo, en células epiteliales. Por ejemplo, los inventores dispersaron islotes pancreáticos/células beta humanas primarias en placas como células individuales en una placa de cultivo tisular que estaba recubierta con matrigel o laminina. En los medios de cultivo celular normales para células beta sin Tzv se produjo una muerte celular sustancial. Sin embargo, cuando se añadió Tzv al medio (1-2 mM), se inhibió la muerte celular. Se observó el mismo efecto para otras células primarias epiteliales, tales como las células neurales. En consecuencia, un compuesto de fórmula (II) se puede administrar a un individuo que necesita células beta y/o islotes pancreáticos, en donde la administración del compuesto da como resultado un aumento en la cantidad de células beta o islotes en el individuo.
Además, los compuestos de fórmula (II) son eficaces para aumentar el flujo sanguíneo e inhibir las respuestas inflamatorias. Por ejemplo, los compuestos de fórmula (II) mejoran la adhesión y la migración de los monocitos a través de las monocapas de las células endoteliales y, por lo tanto, pueden aliviar las respuestas inflamatorias (datos no mostrados). Por lo tanto, un compuesto de fórmula (II) se puede administrar a un individuo (por ejemplo, que tiene isquemia cerebral) que necesita un aumento del flujo sanguíneo y/o una disminución de la inflamación. Aquellos que necesitan inflamación reducida incluyen individuos con enfermedad inflamatoria o con una enfermedad mediada por una afección inflamatoria. Las enfermedades inflamatorias ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, osteoartritis, tendinitis o bursitis, artritis gotosa, polimialgia reumática, fibromialgia, enfermedad inflamatoria pélvica y artritis, incluida la artritis reumatoide
Los compuestos de fórmula (II) pueden utilizarse para tratar o mejorar el cáncer. En algunos casos, un compuesto de fórmula (II) puede administrarse para tratar el cáncer, por ejemplo, carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, y linfoma de Burkitt, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer hepatobiliar, cáncer de vesícula biliar, cáncer del intestino delgado, cáncer rectal, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pene, cáncer de uretra, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, cáncer vaginal, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer de tiroides, cáncer de paratiroides, cáncer suprarrenal, cáncer endocrino pancreático, cáncer carcinoide, cáncer de hueso, cáncer de piel, retinoblastomas, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (véase, CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V.T. y col. eds 1997) para cánceres adicionales).
La metástasis de células cancerosas es típicamente un proceso que implica transición epitelial a mesenquimatosa/EMT (por ejemplo, de células de tipo epitelial a células tipo fibroblastos). Los inventores han descubierto que los compuestos de fórmula (II) (es decir, Tvz) pueden inducir MET (el proceso inverso de EMT) e inhibir EMT, lo que indica que los compuestos son eficaces para reducir o prevenir la metástasis del cáncer. En consecuencia, un compuesto de fórmula (II) se puede administrar a un individuo que tiene o está en riesgo de tener metástasis de cáncer. Por ejemplo, los inventores han descubierto que los compuestos de fórmula (II) inhiben la metástasis de cánceres epiteliales incluidos, aunque no de forma limitativa, cáncer de mama y carcinoma hepatocelular.
Un compuesto de fórmula (II) se puede administrar a un individuo que tiene, o está en riesgo de tener, hipertensión y/o aterosclerosis.
Los compuestos de fórmula (II) (es decir, Tvz) son eficaces para promover la regeneración axonal y la recuperación funcional en el sistema nervioso central lesionado. Por ejemplo, los inventores han descubierto que la Tvz puede promover el crecimiento de neuritas a partir de células neuronales primarias de ratones. Se realizó un análisis de Tzv (3 pM) en explantes corticales P1 de ratón, con el crecimiento de los axones como lectura del resultado. Se añadió Tzv al medio 20 minutos después de la siembra, con DMSO como control. Los explantes se observaron durante 4 días en cultivo. La Tzv mostró un efecto muy pronunciado en la promoción del crecimiento de los axones, que fue notable a partir de 1 div. En consecuencia, un compuesto de fórmula (II) se puede administrar a un individuo que tiene una lesión del sistema nervioso central o que necesita o de cualquier otra manera se beneficiaría de la regeneración axonal.
Un compuesto de fórmula (II) puede administrarse a un individuo que tiene diabetes, resistencia a la insulina o que de cualquier otra manera necesita promover la supervivencia de las células beta, o con riesgo de tener pérdida de la función de las células beta.
Los compuestos de fórmula (II) también encuentran uso para mejorar los síntomas negativos de, o mejorar de cualquier otra manera, el trasplante de órganos, células o tejidos. Como se explica en la presente memoria, los compuestos de fórmula (II) son eficaces para estabilizar y mantener la programación contextual de las células. Por lo tanto, un compuesto de fórmula (II) se puede administrar durante y después del trasplante de células, tejido o un órgano a un individuo. Los ejemplos de trasplante incluyen, pero no se limitan a, trasplante de médula ósea, sangre de cordón umbilical, células madre/progenitoras hematopoyéticas purificadas, células cardíacas, células neurales, células beta pancreáticas y células hepáticas.
B. Usos in vitro
Los compuestos de fórmula (II) son eficaces para estabilizar las células expuestas a una amplia variedad de condiciones. Muchas células animales, cuando se aíslan (en suspensión o alternativamente, cuando se adhieren) pierden la viabilidad, pasan por apoptosis y/o cambian de programación (por ejemplo, células madre cuando se aíslan, a menudo mueren o se diferencian). Los compuestos de fórmula (II), cuando se mezclan con dichas células, son eficaces para prevenir dichas respuestas celulares a los cambios ambientales. En algunas realizaciones, las células se aíslan de un animal y se ponen en contacto con un compuesto de fórmula (II) en una cantidad suficiente para evitar la pérdida de viabilidad celular y/o cambios en la programación celular. En algunas realizaciones, dichas células aisladas son útiles para el diagnóstico ya que las células conservan fenotipos que de otro modo serían perdidos debido a la respuesta de la célula al proceso de aislamiento y aislamiento en sí mismo. Los fenotipos conservados ilustrativos pueden incluir, por ejemplo, patrones de expresión génica, capacidad de respuesta celular a un estímulo, ligando o fármaco, viabilidad celular.
La estabilidad de una población celular se puede controlar, por ejemplo, monitorizando la expresión de productos génicos. Por ejemplo, determinados productos génicos son específicos de tejido o de tipo celular y pueden monitorizarse antes y después de un cambio en el estado o entorno (por ejemplo, cambiar el medio celular, descongelar de células, aislamiento de células de otras células, etc.) para determinar si el cambio afecta la programación celular. En algunas realizaciones, se ponen en contacto células a punto de someterse a un cambio de condición o entorno, o relativamente poco después (por ejemplo, en el trascurso de 1 minuto, 5 minutos, una hora, etc., dependiendo de las circunstancias) del cambio, con un compuesto de fórmula (II) en una cantidad suficiente para que uno o más marcadores de expresión celular permanezcan sustancialmente iguales. “Sustancialmente la misma” dependerá del contexto y se entenderá en la técnica. En algunas realizaciones, “sustancialmente igual” significa que la expresión de un producto génico asociado con un tipo de célula específico no cambia más de aproximadamente el 10 %, el 20 % o el 30 % después de un tratamiento particular a la célula (por ejemplo, en comparación con la expresión antes del tratamiento).
En algunas realizaciones, el método de la invención promueve la supervivencia y la antidiferenciación en células madre ex vivo. Por ejemplo, los inventores han descubierto que los compuestos de fórmula (II) (es decir, Tzv) son eficaces para promover la supervivencia y antidiferenciación en células madre embrionarias humanas, células madre embrionarias de ratón, células madre neurales múltiples, células madre cutáneas, células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre estromales y células madre epiteliales al poner en contacto las células con un compuesto de fórmula (II) inmediatamente después del aislamiento de las células.
En consecuencia, en algunas realizaciones, la composición comprende células aisladas en contacto con una cantidad suficiente de un compuesto de fórmula (II) para estabilizar las células, por ejemplo, para prevenir o reducir las respuestas celulares a cambios en las condiciones (por ejemplo, aislamiento de un tejido, descongelación de las células, etc.). En algunas realizaciones, por ejemplo, las células aisladas en contacto con un compuesto de fórmula (II) están en un estado congelado o líquido. En algunas realizaciones, las células aisladas se descongelan de un estado congelado mientras están en contacto con una cantidad suficiente de un compuesto de fórmula (II) para prevenir o reducir el daño o la diferenciación celular.
Los ejemplos de células madre adecuadas para su uso en la invención incluyen células madre pluripotentes, células madre embrionarias, células madre inducidas (células iPS). Las células madre ejemplares también incluyen células madre embrionarias humanas, células madre embrionarias de ratón, múltiples células madre neurales, células madre de la piel, células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre estromales y células madre epiteliales. Las células descritas en la presente memoria pueden ser células humanas o células no humanas. En algunas realizaciones, las células madre son células madre humanas. En algunas realizaciones, las células madre son células madre de ratón, perro, vaca, cerdo, rata o primate no humano.
La capacidad de mantener la viabilidad celular y la programación celular permite métodos mejorados de cribado y diagnóstico de fármacos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una célula se analiza para determinar una respuesta en presencia de al menos un compuesto de fórmula (II), manteniendo de este modo la viabilidad de la célula, y se pone en contacto adicionalmente con al menos uno de una pluralidad de agentes (por ejemplo, una biblioteca química) y después se monitorea para determinar una respuesta. Se conoce una amplia gama de métodos de cribado. Este método encuentra un beneficio particular para su uso con células que de otro modo tendría una viabilidad deficiente en las condiciones del método de cribado (por ejemplo, donde es conveniente utilizar células aisladas, células en suspensión, células adhesivas, etc.). La respuesta celular puede ser cualquier respuesta deseada. Algunas respuestas en ensayos de cribado basados en células incluyen, pero no se limitan a, la expresión de un gen (por ejemplo, basándose en la expresión de un gen indicador o cuantificada por PCR u otra tecnología de detección), viabilidad celular o pérdida de la misma, inducción de apoptosis, etc.
Los agentes utilizados en los métodos de selección pueden ser, por ejemplo, compuestos orgánicos pequeños (por ejemplo, peso molecular inferior a 10.000 daltons, por ejemplo, inferior a 8000, 6000, 4000, 2000 daltons), lípidos, azúcares, polipéptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleótidos, ADN, ARN, ribozimas, ARN inhibidor corto (ARNip), microARN (miARN), etc.).
En algunas realizaciones, los ensayos están diseñados para cribar grandes bibliotecas combinatorias al automatizar las etapas del ensayo y proporcionar compuestos de cualquier fuente conveniente a los ensayos, que se ejecutan típicamente en paralelo (por ejemplo, en formatos de microtitulación o en placas de micropocillos en ensayos robóticos). Las bibliotecas combinatorias pueden ser completamente aleatorias o comprender miembros que contienen una estructura central basada en uno o más compuestos conductores prometedores. Las bibliotecas combinatorias pueden ser completamente sintéticas o pueden incluir algunos o todos los miembros que se derivan de fuentes naturales, incluidos, por ejemplo, bacterias, hongos, plantas, insectos y vertebrados (por ejemplo, Xenopus (rana) o Anguilla (anguila)) y animales no vertebrados (por ejemplo, Strongylocentrotus (erizo de mar) o moluscos). Véase también, Boldi, Combinatorial Synthesis of Natural Product Based Libraries, 2006, CRC Press.
En una realización, los métodos de cribado de alto rendimiento implican proporcionar una biblioteca química o peptídica combinatoria que contiene un gran número de posibles compuestos terapéuticos (moduladores potenciales o compuestos de ligando). Tales “bibliotecas químicas combinatorias” o “bibliotecas de ligandos” se criban después en uno o más ensayos, como se describe en la presente memoria, para identificar esos miembros de biblioteca (especies o subclases químicas particulares) que muestran una actividad característica deseada. Los compuestos identificados de este modo pueden servir como “compuestos conductores” convencionales o pueden utilizarse por sí mismos como agentes terapéuticos potenciales o reales.
Una biblioteca química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis química o síntesis biológica, combinando un número de “bloques de construcción” químicos tales como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal tal como una biblioteca de polipéptidos se forma combinando un conjunto de bloques de construcción química (aminoácidos) de cada manera posible para una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Los millones de compuestos químicos pueden sintetizarse a través de dicha mezcla combinatoria de componentes básicos químicos.
La preparación y el cribado de bibliotecas químicas combinatorias son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes US-5.663.046; 5.958.792; 6.185.506; 6.541.211; 6.721.665. Dichas bibliotecas químicas combinatorias incluyen, aunque no de forma limitativa, bibliotecas de péptidos (véase, por ejemplo, la patente US-5.010.175; Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991); Houghton, y col., Nature 354:84-88 (1991); y Combinatorial Peptide Library Protocols, Cabilly, ed., 1997, Humana Press. También se pueden utilizar otras sustancias químicas para generar bibliotecas de diversidad química. Dichas químicas incluyen, aunque no de forma limitativa: peptoides (por ejemplo, publicación PCT n.° WO 91/19735), péptidos codificados (por ejemplo, la publicación PCT Wo 93/20242), biooligómeros aleatorios (por ejemplo, publicación PCT n.° Wo 92/00091), benzodiazepinas (por ejemplo, la patente US- 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara y col., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con andamiaje de glucosa (Hirschmann y col., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas análogas de pequeñas bibliotecas de compuestos (Chen y col., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994j; Combinatorial Libraries: Synthesis, Screening and Application Potential, Cortese, ed., 1995, Walter De Gruyter Inc; y Obrecht and Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, 1998, Elsevier Science Ltd), oligocarbamates (Cho y col., Science 261:1303 (1993)), and/or peptidyl phosphonates (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)), bibliotecas de ácido nucleicos (véase Ausubel, infra, Sambrook y Russell, infra y las patentes US-6.955.879; 6.841.347; 6.830.890; 6.828.098; 6.573.098; y 6,399,334), bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (véase, por ejemplo, las patentes US- 5.539.083; 5.864.010 y 6.756.199), bibliotecas de anticuerpos (véase, por ejemplo, Vaughn y col., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (véase, por ejemplo, Liang y col., Science, 274:1520-1522 (1996); la patente US-5.593.853; y Solid Support Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial Carbohydrate Libraries, Seeberger, ed., 2004, John Wiley & Sons (E-book)), pequeñas bibliotecas de moléculas orgánicas (véase, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, 18 de enero, página 33 (1993) y la patente US-5.288.514; isoprenoides, la patente US-5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, la patente estadounidense n.° 5.549.974; pirrolidinas, las patentes estadounidenses n.os 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, patente estadounidense n.° 5.506.337 y similares). Véase también, Combinatorial Library Design and Evaluation: Principles, Software Tools, and Applications in Drug Discovery, Ghose, y col., eds., 2001, Marcel Dekker; Molecular Diversity and Combinatorial Chemistry: Libraries and Drug Discovery, Chaiken y Janda, eds., 1996, Oxford Univ Pr.; y Combinatorial Library Methods and Protocols, English, ed., 2002, Humana Press.
Los dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, Advanced Chem Tech, Louisville KY., Symhony, Rainin, Woburn, MA, Applied Biosystems, Foster City, CA., Millipore, Bedford, MA y Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
En algunas realizaciones, los ensayos de cribado pueden llevarse a cabo convenientemente en placas de pocillos múltiples (por ejemplo, 96 pocillos, 384 pocillos, etc.) en donde cada agente a analizar se prueba individualmente en un solo pocillo. En algunas realizaciones, se prueban dos o más agentes candidatos en una sola mezcla de reacción.
C . Dianas alternativas para obtener efectos similares
Como se describe en detalle en los ejemplos siguientes, los inventores han aprendido sobre el papel de varios productos génicos en la respuesta celular a los compuestos de fórmula (II) y esto ha llevado al descubrimiento de que las células también se pueden estabilizar manipulando los productos génicos como se explica a continuación.
1. E-cadherina
Los inventores han descubierto que el aumento de la expresión de E-cadherina mejora la supervivencia de las células madre. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el método estabiliza y/o aumenta la expresión de E-cadherina en una célula, estabilizando de este modo la célula de un cambio de condiciones que de cualquier otra manera sería perjudicial para la viabilidad de la célula. La estabilización de E-cadherina puede incluir, por ejemplo, poner en contacto las células con un compuesto que aumenta la expresión de E-cadherina o de alguna manera protege E-cadherina de la escisión proteolítica.
En algunas realizaciones, el método comprende cultivar células madre (incluidas, aunque no de forma limitativa, células madre embrionarias humanas o de ratón) en un recipiente que tiene una superficie recubierta con una proteína que comprende al menos un ectodominio de E-cadherina, opcionalmente unido a otro componente tal como una proteína de fusión, estabilizando de este modo las células (por ejemplo, manteniendo o aumentando la viabilidad de las células y/o manteniendo la programación celular). Un ectodominio es la parte de una proteína de membrana que se extiende en el espacio extracelular (el espacio fuera de una célula). En algunas realizaciones, los ectodominios son la parte de una proteína que inicia el contacto con la superficie que conduce a la transducción de señales. El ectodominio de E-cadherina se describe en, por ejemplo, Ito y col., Oncogene 18(50):7080-90 (1999) En algunas realizaciones, al menos el ectodominio de E-cadherina se fusiona con una secuencia polipeptídica dimerizante, permitiendo de este modo dímeros estabilizados del ectodominio. Un “polipéptido dimerizante” se refiere a una secuencia de aminoácidos que forma homodímeros, permitiendo de este modo la dimerización de dos polipéptidos. Los polipéptidos dimerizantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un fragmento IgG Fc. En algunas realizaciones, las células madre (incluidas, aunque no de forma limitativa, células madre embrionarias humanas o de ratón, células madre pluripotentes, células iPS) se disocian entre sí y se cultivan en un recipiente que tiene una superficie recubierta con una proteína que comprende al menos un ectodominio de E-cadherina, opcionalmente unido a otro componente tal como una proteína de fusión, estabilizando de este modo las células en la mejora de la tasa de supervivencia de las células en comparación con la tasa de supervivencia de células tratadas de manera similar cultivadas en un recipiente que carece del recubrimiento de polipéptido.
2. Proteína cinasa C
En algunas realizaciones, el método comprende estabilizar células poniendo en contacto las células con un activador de proteína quinasa C. Como se explica en la presente memoria, el tratamiento de hESC disociadas con un activador de proteína cinasa C cultivado en presencia de una matriz de matrigel dio como resultado una adhesión celular y formación de colonias significativamente mejoradas, mejorendo de este modo la viabilidad celular. En consecuencia, en algunas realizaciones, la viabilidad celular se mejora cultivando células en presencia de un activador de la proteína quinasa C, mejorando de este modo la viabilidad, el crecimiento y/o la adhesión celular. En algunas realizaciones, un activador de la proteína quinasa C se pone en contacto con una población de células madre en una cantidad suficiente para mejorar la viabilidad y/o la supervivencia y/o la adhesión celular. Las células madre ejemplares incluyen células madre pluripotentes, células madre embrionarias, células madre inducidas (células iPS) o tal como se describe de otro modo en la presente memoria. Los activadores de proteína cinasa C ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, ésteres de forbol (por ejemplo, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) o ésteres de forbol como se describe en la publicación de patente estadounidense n.° 20080226589) o agonistas peptídicos (por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.165.977).
3. Integrina p1
En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto las células con un activador de integrina p1. Como se explica en la presente memoria, el tratamiento de hESC disociadas con un activador de integrina p1, donde las células se cultivan en lamina dio como resultado una adhesión celular y formación de colonias significativamente mejoradas, mejorendo de este modo la viabilidad celular. En consecuencia, en algunas realizaciones, la viabilidad celular se mejora cultivando células en presencia de un activador de integrina p1, mejorando de este modo la viabilidad, el crecimiento y/o la adhesión celular. En algunas realizaciones, un activador de integrina p1 se pone en contacto con una población de células madre en una cantidad suficiente para mejorar la viabilidad y/o la supervivencia y/o la adhesión celular. Las células madre ejemplares incluyen células madre pluripotentes, células madre embrionarias, células madre inducidas (células iPS) o tal como se describe de otro modo en la presente memoria. Los activadores de integrina p1 ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, un anticuerpo activador de integrina p1 como, por ejemplo, TS2/16 (comercializado, por ejemplo, por Thermo Scientific, Rockfield, Ill.).
IV. Poblaciones celulares
Como se describe en la presente memoria, la presente invención proporciona una composición que comprende las células aisladas obtenidas mediante el método de la invención y uno o más compuestos de fórmula (II), que incluyen, aunque no de forma limitativa, Tzv.
En algunas realizaciones, el compuesto está en la mezcla a una concentración suficiente para mantener la viabilidad o la programación celular en respuesta a un cambio del entorno celular o afección (por ejemplo, descongelación). Por ejemplo, en algunas realizaciones, los compuestos están en una concentración de al menos 0,1 nM, por ejemplo, al menos 1, 10, 100, 1000, 10000 o 100000 nM, por ejemplo, entre 0,1 nM y 100000 nM, por ejemplo, entre 1 nM y 10000 nM, por ejemplo, entre 10 nM y 10000 nM, por ejemplo, entre 1-10 pM. En algunas realizaciones, las mezclas se encuentran en un recipiente sintético (por ejemplo, un tubo de ensayo, una placa de Petri, etc.). Las células son células aisladas (no forman parte de un animal). En algunas realizaciones, las células son células o células adherentes en suspensión. En algunas realizaciones, las células se aíslan o disocian de una muestra de tejido (por ejemplo, una biopsia) de un animal (humano o no humano), se colocan en un recipiente y se ponen en contacto con uno o más compuestos de fórmula (II).
Las células pueden cultivarse posteriormente y opcionalmente insertarse de nuevo en el mismo animal o en un animal diferente, opcionalmente después de que las células se hayan estimulado para diferenciarse en un tipo de célula o linaje particular, o después de la introducción de un casete de expresión recombinante en las células.
V. Cultivo de células
Las células se pueden cultivar según cualquier método conocido en la técnica. Las células se pueden cultivar en suspensión o como células adherentes según sea apropiado.
En algunas realizaciones, las células madre se cultivan en contacto con células alimentadoras. Las células alimentadoras ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, células de fibroblastos, por ejemplo, células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). Los métodos de cultivo de células en células alimentadoras son conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, las células se cultivan en ausencia de células alimentadoras. Las células, por ejemplo, pueden unirse directamente a una superficie de cultivo sólido (por ejemplo, una placa de cultivo), por ejemplo, a través de un anclaje molecular. Los anclajes moleculares ejemplares incluyen, pero no se limitan a, matrigel, una matriz extracelular (ECM), análogos de ECM, laminina, fibronectina o colágeno. Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que esta es una lista no limitativa y que pueden utilizarse otras moléculas para unir células a una superficie sólida. Los métodos para la unión inicial de las correas a la superficie sólida son conocidos en la técnica.
VI. Formulaciones y métodos de administración
Las formulaciones (por ejemplo, que comprenden un compuesto de fórmula (II)), incluidas, aunque no de forma limitativa, adecuadas para la administración, incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes.
Las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, por vía oral, nasal, tópica, intravenosa, intraperitoneal o intratecal. Las formulaciones de compuestos pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitarias o multidosis, tales como ampollas y viales. Las soluciones y suspensiones se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo descrito anteriormente. Los moduladores también se pueden administrar como parte de un alimento o fármaco preparado.
La dosis administrada a un paciente debe ser suficiente para inducir una respuesta beneficiosa en el sujeto a lo largo del tiempo. El nivel de dosis óptimo para cualquier paciente dependerá de una variedad de factores que incluyen la eficacia del modulador específico empleado, la edad, el peso corporal, la actividad física y la dieta del paciente, en una posible combinación con otros fármacos, y en la gravedad de la enfermedad o afección en cuestión. El tamaño de la dosis también estará determinado por la existencia, naturaleza y extensión de cualquier efecto secundario adverso que acompañe a la administración de un compuesto o vector particular en un sujeto particular.
Al determinar la cantidad eficaz de un principio activo a administrar un médico puede evaluar los niveles plasmáticos circulantes del compuesto o agente, la toxicidad del compuesto o agente, y la producción de anticuerpos anti compuesto o agente. En general, el equivalente de dosis de un compuesto o agente es de aproximadamente 1 ng/kg a 10 mg/kg para un sujeto típico.
VII. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar la invención reivindicada.
Ejemplo 1:
Las hESC de este ejemplo son hESC de referencia.
Para mejorar las condiciones del medio químicamente definidas y descubrir el mecanismo molecular de la muerte de hESC después de la disociación de células individuales, se realiza un cribado fenotípico de alto rendimiento de 50.000 compuestos sintéticos para identificar moléculas pequeñas que promueven la supervivencia de hESC después de la disociación de tripsina. A partir del cribado, se identificaron dos clases químicas que aumentaron significativamente la supervivencia celular tras la disociación y también mantuvieron la morfología de las colonias de hESC y la expresión de la fosfatasa alcalina (ALP). Otras optimizaciones químicas y análisis de actividad dieron como resultado el descubrimiento de dos moléculas principales, un tiazol 2,4 disustituido (denominado tiazovivina/Tzv) y una pirimidina 2,4 disustituida (denominada pirintegrina/Ptn) (Fig.1 a), para caracterizaciones funcionales y mecanísticas adicionales.
Los compuestos marcados con un asterisco (*) en la Tabla 1 no son compuestos según la fórmula (II). ;;Tabla 1. Datos de actividad ;; ; ; ;;; El compuesto Tzv o Ptn mejora la supervivencia de hESC individuales más de 20 veces en placa recubierta con Matrigel después de la disociación enzimática (Figura 1 b, c). Las hESC se habían sometido a pases en serie en medio definido químicamente que contenía Tzv o Ptn durante más de 20 generaciones. En tales condiciones, las células mantuvieron homogéneamente la morfología característica de las hESC, la expresión de marcadores de pluripotencia típicos y el cariotipo normal (Figura 1d, e). Cuando estas células se inyectaron en ratones nude (desnudos o sin pelo), generaron teratomas complejos que consistían en los tres tejidos primarios de la capa germinal (Fig. 1f). Estos resultados, confirmado con varias líneas de hESC independientes, demostraron de manera colectiva y convincente que ambos compuestos podrían promover sustancialmente la supervivencia de hESC sin comprometer la autorrenovación y la potencia de desarrollo completa. ;;Se sabe que las hESC son difíciles de formar cuerpos embrioides (EB) en el cultivo en suspensión después de la disociación de células individuales debido a la extensa muerte celular. Por tanto, también se probó si Tzv o Ptn podría promover la supervivencia de hESC disociadas en suspensión. Curiosamente, Tzv mejoró enormemente la supervivencia de hESC en cultivos tanto adherentes como en suspensión. Por el contrario, Ptn solo promovió la supervivencia de hESC en cultivo adherente (por ejemplo, en placa recubierta con Matrigel), pero no tuvo efecto en el cultivo en suspensión (Figura 2a). Estas observaciones sugieren que al menos dos mecanismos distintos están implicados en estos dos tipos de muerte celular en condiciones ECM/Matrigel o en suspensión, y esa función de Tzv y Ptn de manera diferente. Las hESC formaron agregados de células de hielo cuando se crecieron en suspensión y en presencia de Tzv (Figura 2b), y podrían diferenciarse en diversos linajes (datos no mostrados). Debido a que la agregación celular a menudo se media a través de las adherencias de células celulares y la E-cadherina es la molécula de adhesión celular de células primarias, así como muy expresada en hESC (Eastham, A.M. y col., Cancer Res 67 (23):11254-11262 (2007), se probó el efecto de un anticuerpo específico de bloqueo de E-cadherina en la formación de agregados multicelulares. Cuando las células se cultivaron en presencia del anticuerpo, la supervivencia celular y la formación de agregados grandes y compactos inducidos por el tratamiento de Tzv se inhibieron gravemente, lo que indica que la supervivencia celular y el ensamblaje de agregados multicelulares inducidos por Tzv implican E-cadherina funcional (Figura 2b). Además, la inactivación de E-cadherina por ARNip específicos en hESC redujo drásticamente la supervivencia celular inducida por el tratamiento de Tzv y disminuyó significativamente el número de colonias positivas para ALP (Figura 2c, d,e). Estos resultados sugieren que Tzv mejora la supervivencia de hESC en suspensión, actuando presumiblemente a través de la adhesión celular-célula mediada por E-cadherina. ;;A continuación, examinó la expresión de E-cadherina en hESC después de la disociación de tripsina. Se encontró que la mayoría de la E-cadherina de longitud completa se había escindido después de la disociación de tripsina (Figura 2f). Esta observación fue consistente con el informe de que la región extracelular de E-cadherina tiene un sitio de escisión endoproteolítica cerca del dominio transmembrana (Damsky, C.H. y col., Cell 34 (2):455-466 (1983)). En las células no tratadas con Tzv, la E-cadherina de longitud completa recién sintetizada apareció 1 h después del tratamiento enzimático y desapareció después de 4 h, lo que sugiere que las E-cadherinas recién sintetizadas en hESC disociadas no eran estables. Sin embargo, en células tratadas con Tzv, la expresión de E-cadherina aumentó significativamente (Figura 20 g). Además, el análisis de citometría de flujo reveló que las E-cadherinas de superficie celular en hESC aumentaron significativamente por Tzv (Figura 2h). Por tanto, es probable que Tzv afecte la adhesión celular modulando el nivel de superficie celular de las E-cadherinas. La RT-PCR semicuantitativa reveló cantidades comparables de transcripciones de E-cadherina en controles control y células tratadas con Tzv (Figura 2i), lo que sugiere que la diferencia en los niveles de proteína E-cadherina no se debe a niveles de transcripción alterados. Es probable que Tzv ejerce su efecto a través de la estabilización de E-cadherina en la superficie celular. Finalmente, el ensayo de endocitosis reveló que la internalización de E-cadherinas estaba significativamente bloqueada por Tzv. Estos resultados indican que Tzv regula las actividades de E-cadherina a través de la inhibición de la endocitosis de E-cadherinas (Figura 2j). ;;La disociación celular-célula por tripsina conduce a una rápida escisión y posterior desestabilización de E-cadherinas. Se planteó la hipótesis de que la estabilidad de E-cadherina también podría estar mediada por su interacción homofílica entre las células. Por lo tanto, la ligación homofílica de las E-cadherinas con ligandos recombinantes puede estabilizar las E-cadherinas y afectar la supervivencia de hESC. Para probar esta hipótesis, se recubrieron placas con una proteína quimera de E-cadherina-Fc dimérica que contenía el ectodominio de E-cadherina fusionado con el fragmento Fc de IgG (Ecad-Fc). Sorprendentemente, las hESC disociadas unidas a la superficie recubierta y su tasa de supervivencia aumentaron significativamente de una manera dependiente de la dosis (Figura 2 k), lo que confirma que la adhesión celular-célula mediada por E-cadherina es un regulador importante para la supervivencia de hESC. ;Tanto Tzv como Ptn tienen un efecto drástico sobre la supervivencia de hESC cultivadas en placas recubiertas con Matrigel. Dicho efecto promotor de la supervivencia parece poco probable debido a la influencia sobre el crecimiento celular y puede atribuirse en gran medida al aumento de la capacidad de adhesión celular después de los procesos de disociación celular y siembra (Figura 3a, b). De hecho, las hESC disociadas que se trataron con Tzv o Ptn mostraron una adhesión dramáticamente aumentada a Matrigel o laminina. Por el contrario, la adhesión de las hESC a la gelatina o polilisina (Figura 3b y datos no mostrados), que no implica integrinas, no se vio afectada por el tratamiento con Ptn o Tzv. El componente principal de Matrigel es laminina, y se informó que la integrina p1 del receptor de laminina se expresa altamente en hESC (Xu, C. y col., Nat Biotechnol 19 (10):971-974 (2001)). Para probar si Ptn o Tzv actúa a través de la integrina p1, se pretrataron células con un anticuerpo de bloqueo contra la integrina p1, y se observó que el aumento de la unión celular inducida por el tratamiento del compuesto fue completamente anulado. Esto sugiere que Tzv y Ptn median la adhesión celular a sustratos de ECM a través de la integrina p1 (Figura 3c). ;;Para obtener información sobre el mecanismo de la regulación de integrina p1 por Tzv y Ptn, se investigó si el efecto de los compuestos se debe a cambios de expresión de integrina. A diferencia de E-cadherina, la integrina p1 no fue escindida por tripsina. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western reveló que el efecto de los compuestos fue poco probable debido a las expresiones aumentadas de integrina p1. Por tanto, es probable que Tzv y Ptn afecten la adhesión celular modulando la actividad de integrina (Figura 3 d, e). Para examinar los efectos del tratamiento compuesto sobre la actividad de la integrina (31, utilizamos el anticuerpo monoclonal HUTS-21, que se une específicamente A la forma activada de la integrina p1 (Luque, A. et al., J Biol Chem 271 (19):11067-11075 (1996). En particular, el tratamiento con compuestos aumentó el nivel de unión a HUTS-21 (Figura 3f, g). Estos resultados sugieren colectivamente que Tzv y Ptn aumentan la adhesión celular por la modulación dentro de salida de la actividad de integrina. ;;Si ambos productos químicos potencian la adhesión celular convirtiendo las integrinas en una conformación activa, el tratamiento de células con el anticuerpo activador de integrina, que bloquea las integrinas en una conformación activa, debe tener un efecto similar a los compuestos. De hecho, cuando se sembraron hESC disociadas en laminina en presencia de TS2/16, un anticuerpo activador a integrina p1 (van de Wiel-van Kenade, E. et al., J cell Biol 117 (2):461-470 (1992), la adhesión celular aumentó significativamente y las células formaron un mayor número de colonia en comparación con el control (Figura 3h, i). Estos resultados sugieren que la mayor adhesión, que se produce cuando las células se tratan con estos compuestos, implica un mecanismo que induce la activación de integrina. ;;Para diseccionar aún más el mecanismo molecular mediante el cual Tzv y Ptn regulan la actividad de la integrina, examinamos los efectos de varios inhibidores de la ruta. Se encontró que bisindolilmaleimida I, un inhibidor específico de PKC, podría antagonizar la mayor adhesión celular inducida por Ptn, pero no tuvo efecto sobre la adhesión celular inducida por Tzv. Esto sugiere que PKC puede mediar la acción de Ptn pero no Tzv (Figura 3j). Para confirmar aún más el papel de PKC sobre la supervivencia de hESC, se trataron hESC disociadas con agonista de PKC forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). El tratamiento de PMA provocó la activación de integrina, así como un aumento sustancial en la adhesión celular y la formación de colonias (Figura 3k, l, m). ;;El destino de las células madre está influenciado por su nicho celular, que consiste en factores de crecimiento, interacción celular-ECM e interacción célula-célula. El hecho de que la supervivencia de las hESC dependa en gran medida de la interacción célula-célula y/o célula-ECM, reveló la importancia de este nicho in vitro para las hESC, no reconocido hasta ahora. Más importante aún, las expresiones de proteínas intrínsecas celulares (por ejemplo, ecadherinas e integrinas) y mecanismos reguladores (por ejemplo, estabilización de proteínas y activación), no solo responden a, sino también son componentes de nicho esenciales, lo que sugiere que las células madre poseen capacidad intrínseca para construir su propio nicho en ausencia de otros factores extrínsecos o tipos de células, que sin embargo pueden participar y potenciar el mecanismo de nicho autorregulador de las células. ;;La interacción entre el entorno físico/estructural y el factor de crecimiento juega un papel muy importante en la regulación del destino celular (Comoglio, P.M., Boccacilo, C.,&Trusolino, L., Curr Opin Cell Biol 15 (5):565-571 (2003). Para examinar si los factores de crecimiento están implicados en la supervivencia de hESC mediada por integrina, se trataron hESC disociadas con Tzv o Ptn junto con inhibidores de receptor de factor de crecimiento altamente específicos individuales. Encontramos que la inhibición química de FGFR, IGFR, EGFR1 o Erb2 disminuyó en gran medida el efecto promotor de supervivencia inducido por el tratamiento con Tzv o Ptn (Figura 4a). Además, Ptn aumentó significativamente la fosforilación del receptor del factor de crecimiento, lo que sugiere que se requiere el acoplamiento de los receptores del factor de crecimiento para la supervivencia celular mediada por integrina (Figura 4b). De manera similar, la inhibición de FGFR, IGFR, EGFR1 o Erb2 también abolió enormemente la supervivencia de hESC inducida por Tzv en cultivo en suspensión. Además, la unión inducida por Tzv de E-cadherinas al EGFR1 y ERB2, lo que indica el papel importante de los receptores del factor de crecimiento en la supervivencia celular mediada por E-cadherina (Figura 4c, d). ;;La señalización de fosfatidilinositol-3-cinasa (PI-3K) y MAPK/ERK son reguladores principales para la autorrenovación de hESC (Armstrong, L. y col., Hum Mol Genet 15 (11):1894-1913 (2006); Ping, N.R. y col., J Biol Chem 279 (46):48063-48070 (2004); Pyle, A.D., Lock, L.F., & Donovan, P.J., Nat Biotechnol 24 (3):344-350 (2006); Li, J. y col., Differentiation 75 (4):299-307 (2007)). La fosforilación de ERK y AKT, un efector descendente de PI-3K, se incrementó tras el tratamiento de hESCs disociadas con Ptn, y este incremento fue abolido por el anticuerpo bloqueador de integrinas (Figura 4e,f). Además, la activación de AKT y ERK por Ptn fue bloqueada por inhibidores de FGFR, IGFR, EGFR o Erb2 (Figura 4 g y datos no mostrados). La inhibición química de la acción de PI-3K antagonizó significativamente el efecto de supervivencia inducido por Ptn (Figura 4 h). La inhibición de ERK no tuvo un efecto dramático en la supervivencia inducida por Ptn pero indujo la diferenciación de las hESC (Figura 4i). Estos resultados demostraron que la activación de PI-3K es una importante señalización de supervivencia y la activación de ERK es una señalización antidiferenciación generada por el nicho a través de la activación de los receptores del factor de crecimiento. ;;En resumen, identificamos dos nuevas moléculas pequeñas sintéticas con distintos mecanismos de acción a partir de una pantalla fenotípica de alto rendimiento que mejora en gran medida la supervivencia de hESC después de la disociación de células individuales. Tales herramientas químicas y herramientas biológicas recién identificadas a través de caracterizaciones mecanicistas (por ejemplo, Ecad-Fc recombinante definida para la unión de hESC en cultivo adherente; los anticuerpos activadores para la supervivencia y unión de células mejoradas) permitirían un cultivo de hESC más robusto y facilitarían significativamente las aplicaciones de hESC tales como el direccionamiento de genes o el descubrimiento de fármacos. Más importante aún, las caracterizaciones mecanicistas en profundidad descubiertas mecanismos de nicho previamente no reconocidos que se requieren para mantener la supervivencia y proliferación de hESC. Tal nicho consiste en interacción mediada por E-cadherina entre las propias hESC, la interacción celular-ECM mediada por integrina y factores de crecimiento. Estudios anteriores han apuntado a un papel importante de los factores de crecimiento en la autorrenovación de las hESC. Sin embargo, la activación completa de la señalización del factor de crecimiento no requiere solo la presencia de los factores de crecimiento y los receptores, sino también una interacción con un microambiente particular. Cuando este entorno físico/estructural se destruye, los factores de crecimiento solos no son suficientes para la autorrenovación de las ESC. ;;Recientemente, se ha informado que los fibroblastos diferenciados generados a partir de hESC en cultivo de autorrenovación crearon un nicho in vitro para las hESC (Bendall, S.C. y col., Nature 448 (7157):1015-1021 (2007)). En nuestras y otras condiciones de medio químicamente definidas, muy rara vez observamos tales células diferenciadas en cultivo a largo plazo, lo que sugiere que dicho nicho artificial podría crearse debido a las diferencias de medios. Sin embargo, los estudios de los investigadores revelan mecanismos de nicho celulares (es decir, interacción célula-célula) y no celulares (es decir, de ECM y factor de crecimiento celular) autónomos únicos para la supervivencia y autorrenovación de hESC, que probablemente pueden desempeñar un papel importante en el control del destino de las células madre adultas in vivo. ;;La disociación celular-célula por tripsina condujo a no solo la desestabilización de la E-cadherinas sino también la inactivación de las integrinas, lo que indica que la señalización que mantiene la actividad de la integrina es sensible al tratamiento enzimático. Los medios acondicionados con células alimentadoras (con suero rico en factor de crecimiento) no proporcionaron mucha protección contra la muerte celular después de la disociación de células individuales. Además, el hecho de que la siembra celular de alta densidad también induce un aumento en la adhesión/supervivencia celular sugiere que la señalización requerida para mantener la actividad de la integrina puede no provenir de factores secretados sino en lugar de interacciones físicas célula-célula. Tzv inhibe la endocitosis de E-cadherina y, por tanto, protege las células de la muerte en suspensión. De manera similar, al inhibir la endocitosis, Tzv puede mantener la actividad de la integrina mediante la estabilización de la señalización de la superficie celular. Por otro lado, Ptn puede imitar la señalización corriente abajo de la interacción física célula-célula para activar PKC. La identificación de la diana de la futuro de Ptn puede desprender nueva luz sobre el mecanismo por el cual la adhesión celular-célula regula la interacción celular-ECM. Nuestra investigación también ejemplificó la viabilidad y el avance del cribado químico de alto rendimiento en estudios de células madre. El desarrollo y la aplicación adicionales de tal enfoque químico en las células madre indudablemente conducirán a la identificación de nuevas moléculas pequeñas adicionales e información mecanicista para controlar con precisión el destino celular in vitro e in vivo. ;;Métodos ;;Cultivo celular ;;Las líneas ESC humanas H1, HUES7 y HUES9 se cultivaron en células alimentadoras MEF irradiadas en DMEM-F12 complementado con L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 1 x, reemplazo de suero al 20 % (Invitrogen) y factor de crecimiento de fibroblastos básico 10 ng/ml (Invitrogen). El cultivo de hESC químicamente definido y sin alimentador ha sido descrito con anterioridad (Yao, S. y col., Proc Natl Acad Sci USA 103 (18):6907-6912 (2006)). En resumen, las hESC se cultivaron en placas de cultivo de tejidos recubiertas con Matrigel en N2B27-CDM (DMEM-F12 complementado con 1x suplementos de N2, 1x suplementos de B27, L-glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 0,11 mM, 1x aminoácidos no esenciales y 0,5 mg/ml de BSA (fracción V)) y 20 ng/ml de bFGF. Las ESC humanas se pasaron cada 5-6 días con tripsina al 0,05 %. ;;Para los ensayos de supervivencia clonal, se diluyeron hESC individuales a densidad clonal y se sembraron en placa recubierta con Matrigel de 96 pocillos. Para los ensayos de supervivencia de baja densidad, se sembraron 500 células en placa recubierta con Matrigel de 96 pocillos. Para visualizar las colonias de hESC, los cultivos se fijaron en paraformaldehído al 4 % en PBS durante 5 min, se lavaron una vez en PBS, después se tiñeron para la actividad de fosfatasa alcalina como se describe en las instrucciones del fabricante. Las colonias positivas para ALP se contaron en un microscopio invertido. ;;Reactivos ;;El kit de detección de ALP y los anticuerpos de integrina fueron de Chemicon. Se adquirieron AG825 (inhibidor de Erb2), AG1478 (inhibidor de EGFR), PPP (inhibidor de IGFR1) de Calbiochem. Se utilizaron anticuerpos producidos contra la cola intracitoplasmática de E-cadherinas (Transduction Laboratories, Lexington, KY) para la inmunoprecipitación. El anticuerpo TS2/16 era de Pierce Los anticuerpos contra el dominio extracelular de la molécula de cadherina E eran de Zymed (Carlsbad). Los anticuerpos contra la cinasa regulada por señal extracelular/MAPK, EGFR1, ERBB2, GADPH y forma fosforilada de AKT fueron de Cell Signaling. El anticuerpo monoclonal de ratón antifosfotirosina (clon 4G-10) fue de Upstate Biotechnology. Ptn y Tzv se añadieron al medio de cultivo a 2 pM. ;;Cribado químico de alto rendimiento. ;;Para el cribado se utilizaron las líneas hESC tripsinables HUES7 o HUES9. Las hESC se cultivaron en medios químicamente definidos en la placa recubierta de Matrigel, tal y como se ha descrito anteriormente. Después las células hESC se sembraron a razón de 4.000 células por pocillo en placas de 384 pocillos recubiertas de Matrigel. Después de 1 h cuando las células se sedimentaron, se añadieron compuestos de una biblioteca de 50.000 heterociclos discretos a cada pocillo (concentración final 2 pM). Después de 6 días adicionales de incubación, en los que los medios y los compuestos se cambiaron el día 3, las células se tiñeron para la expresión de ALP y se examinaron para determinar la morfología de colonias compactas. ;;Análisis de inmunotinción. ;;La inmunotinción se realizó como se ha descrito anteriormente (Yao, S. y col., Proc Natl Acad Sci USA 103 (18):6907-6912 (2006)). Brevemente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente (TA) durante 15 min. A continuación, las células se incubaron a TA en tampón de bloqueo durante 1 hora. La incubación de anticuerpos primarios se llevó a cabo durante la noche a 4 °C. Los siguientes anticuerpos disponibles en el mercado se utilizaron a una concentración de 1:100 en tampón de bloqueo; Anti-SSEA4, anti-Oct4 (Chemicon??) Anti-Nanog (Chemicon). La tinción se visualizó utilizando anticuerpos secundarios conjugados con FITC, cy3 o cy5 (Jackson ImmunoResearch). ;;Formación de teratomas y cariotipado. ;;Los experimentos de formación de teratomas se realizaron inyectando de 3-5 millones de hESCs (mantenidas en presencia de los compuestos Tvz o Ptn) bajo la cápsula renal de ratones desnudos. Después de 4-5 semanas, todos los ratones desarrollaron teratomas, que se retiraron y después se analizaron inmunohistológicamente por The Scripps Research Institute Research Histology Service and Animal Resources. Las células tratadas con los compuestos se cariotiparon mediante bandas G estándar en el Laboratorio de Citogenética del Hospital Infantil de Oakland. No se encontró ninguna anomalía cromosómica en los 10 núcleos seleccionados al azar. ;;Ensayo TUNEL ;;Las hESC en diferentes tratamientos se disociaron mediante tripsina y se fijaron mediante paraformaldehído al 4 %. Y la tinción se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante (MBL Laboratories, Watertown, MA). Después de la tinción, las muestras se analizaron por citometría de flujo mediante el uso de un citómetro de flujo FACS Calibur (BD). ;;Análisis de citometría de flujo;;Para evaluar la expresión de E-cadherina, integrina activada y SSEA4, las células disociadas (3x105) se lavaron con PBS y se resuspendieron en PBS que contenía suero de cabra al 2 %. Después, las células se incubaron con el anticuerpo apropiado durante 1 h a 4 0C, se lavaron con la solución de bloqueo y se marcaron con anticuerpo secundario conjugado con FITC durante 30 min a 4 0C. A continuación, las células se lavaron y se analizaron en un citómetro de flujo FACS Calibur. ;;Ensayo de adhesión celular ;;Los ensayos de adhesión celular se realizaron en placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas con Matrigel. Después de la tripsina, las hESC se resuspendieron en los medios definidos químicamente que contenían los compuestos deseados. Después, las células se añadieron a los pocillos de microtitulación y se incubaron durante 3 h a 37 0C. Las células sueltas y no unidas se retiraron mediante agitación y lavado, y las restantes se fijaron inmediatamente. Los pocillos se lavaron 3 veces con 200 pl de H<2>O y las células adheridas se tiñeron con Crystal Violet (Sigma). A continuación se midió la absorbancia de cada pocillo a 570 nm. Para los experimentos con anticuerpos de bloqueo, las células se preincubaron con anticuerpos en hielo durante 30 min y se realizaron ensayos de adhesión en presencia de anticuerpos. Cada muestra se analizó independientemente tres veces. ;;Ensayo de endocitosis ;;Se incubaron hESC con 1,5 mg/ml de 2-(biotinamido) etil-ditiopropionato de sulfosuccinimidilo (sulfo-NHS-SS-biotina) (Pierce Chemical Co.) en hielo, seguido de lavado y enfriamiento. La endocitosis de E-cadherina se inició mediante la depleción de Ca2+ y la incubación a 37 0C. A continuación, las células se incubaron en dos lavados de 20 minutos de solución de glutatión (glutatión 60 mM, NaCl 0,83 M, con NaOH 0,83 M y BSA al 1 % añadida antes de su uso) a 0 0C que eliminó todos los grupos de biotina de la superficie celular. Las proteínas biotiniladas restantes se secuestraron dentro de las células por endocitosis y, por lo tanto, se protegieron de la eliminación de glutatión. Las proteínas biotiniladas se recuperaron en perlas de estreptavidina y se analizaron mediante SDS-PAGE. Se detectaron E-cadherinas mediante inmunotransferencia. Se usó como referencia el nivel total de E-cadherina superficial antes de la endocitosis. ;;Ejemplo 2: Síntesis de N-bencil-2-(pirimidin-4-ilamino)tiazol-4-carboxamida (tiazovivina) ;;Síntesis química ;Usando los ejemplos de síntesis química presentados a continuación y los métodos de síntesis química generalmente conocidos en la técnica, un experto es capaz de preparar los compuestos descritos en la presente memoria (es decir, los compuestos de fórmula (II)). ;;Todos los productos químicos obtenidos comercialmente se utilizaron sin purificación adicional. Los espectros de RMN se registraron en un instrumento Bruker (400 MHz). Los desplazamientos químicos (5) se midieron en ppm y las constantes de acoplamiento (J se indican en Hz. Se realizó CL/EM mediante cromatografía de líquidos de fase inversa-espectrómetro de masas Agilent 1100 equipo CL/EM con fuente de ionización API-ES. Se realizó cromatografía de líquidos de alta presión con una columna C18 con un gradiente lineal del 10 % de disolvente A (acetonitrilo con 0,035 % de ácido trifluoroacético) en disolvente B (agua con 0,05 % de ácido trifluoroacético) al 90 % de A en siete minutos y medio, seguido de dos minutos y medio de elución con 90 % de A. ;;Síntesis de N-bencil-2-(pirimidin-4-ilamino)tiazol-4-carboxamida (tiazovivina) ;;La bencilamina se cargó en resina de poliestireno funcionalizada con 4-formil-3,5-dimetoxifenoximetilo (PAL) mediante aminación reductora para proporcionar resina de PAL-bencilamina. Véase, Ding, S.; Grey, N. S. Wu, X.; Ding, Q.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1594-1596. Se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente un matraz de reacción que contenía resina PAL-bencilamina (200 mg, 0,2 mmol), ácido 2-bromotiazol-4-carboxílico (83 mg, 0,4 mmol), cloruro bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BOP-Cl) (153 mg, 0,6 mmol) y diisopropiletilamina (0,17 ml, 1 mmol) en DMF (3 ml). La resina se lavó con metanol, diclorometano y se secó al vacío proporcionando la resina PAL-N-bencil-2-bromotiazol-4-carboxamida, que se añadió a continuación a un vial de reacción secado con llama, seguida de 4-aminopirimidina (95 mg, 1 mmol), Pd2(dba)3 (46 mg, 0,05 mmol), Xantphos (87 mg, 0,15 mmol) y NaOtBu (192 mg, 2 mmol). El vial se tapó y desgasificó con seguridad y, a continuación, se cargó con argón y dioxano anhidro (1,5 ml). La reacción se agitó durante 24 horas a 90 0C. La resina se lavó con solución de dietilditiocarbamato de sodio (0,05 M en DMF), metanol y diclorometano y se secó al vacío. La resina se escindió posteriormente con el cóctel de escisión TFA:CH<2>Cl<2>:H<2>O (45:55:5) (2 ml) durante 2 h. La resina se filtró, el filtrado se recogió y se evaporó al vacío para dar el crudo, que se purificó por HPLC para dar el compuesto del título (30 mg, 48 %). ;;; ;;; N-Bencil-2-(pirimidin-4-ilamino)tiazol-4-carboxamida ;;Masa exacta calculada para C15H13N5OS: 311,1, encontrado CL/EM m/z = 334,1 (M+Na+). ;;<1>H NMR (400 MHz, ds-DMSO) 4,49 (d, J= 6,3 Hz, 2H), 5,76 (s, 1H), 7,21-7,27 (m, 2H), 7,30-7,34 (m, 4H), 7,85 (s, 1H), 8,45 (t, J= 6,3 Hz, 1H), 8,51 (d, J= 6,1 Hz, 1H), 8,94 (s, 1H). ;;Ejemplo 3: Síntesis de derivados de tiazovivina ;;; ;;; Se precargaron aminas adecuadas R1NH<2>en resina de poliestireno funcionalizada con 4-formil-3,5-dimetoxifenoximetil (PAL) mediante aminación reductora para dar resina PAL-bencil amina. Una mezcla de resina de PAL-bencilamina (200 mg, 0,2 mmol, 1,0 eq.), ácido 2-bromotiazol carboxílico 1 (0,4 mmol, 2, 0 eq.), cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BOP-Cl) (0,6 mmol, 3, 0 eq.) y diisopropiletilamina (1 mmol, 5,0 eq.) en DMF anhidro (3 ml) durante 24 h a temperatura ambiente. La resina se lavó con metanol, diclorometano y se secó al vacío, tras lo cual se añadió a un vial de reacción secado con llama, seguido de R2NH<2>correspondiente (1 mmol, 5,0 eq.), Pd2(dba)3 (0,05 mmol), Xantphos (0,15 mmol) y NaOtBu (2 mmol, 10,0 eq.). El vial se tapó y desgasificó con seguridad y, a continuación, se cargó con argón y dioxano anhidro (1,5 ml). La reacción se agitó durante 24 horas a 90 0C. La resina se lavó con solución de dietilditiocarbamato de sodio (0,05 M en DMF), metanol y diclorometano y se secó al vacío. La resina se escindió posteriormente con cóctel de escisión: TFA:CH<2>Cl<2>:H<2>O = 45:55:5 (2 ml) durante 2 h. La resina se filtró y el filtrado se recogió y se evaporó al vacío proporcionando el producto bruto que se purificó a continuación mediante HPLC proporcionando el compuesto del título deseado 3. Los compuestos marcados con un asterisco (*) en la tabla siguiente no son compuestos según la fórmula (II).
Ejemplo de referencia 4: Síntesis de N-(ciclopropilmetil)-4-(4-(6-hidroxi-3, 4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidin-2-ilamino)bencenosulfonamida (pirintegrina)
El matraz de reacción que contenía 2,4-dicloropirimidina (372 mg, 2,5 mmol), 6-metoxi-1,2,3,4-tetrahidroquinolina (489 mg, 3 mmol) y diisopropiletilamina (0,52 ml, 3 mmol) en n-butanol (10 ml) se calentó a 40 0C durante toda la noche. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna flash para dar 2-cloro-4-(6-metoxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidina (551 mg, 80 %). A continuación, este producto intermedio (250 mg, 0,91 mmol) se disolvió en diclorometano y se trató con BBr3 (1 M en diclorometano) (1 ml, 1 mmol) a -78 °C. La mezcla de reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó durante 1 h, se vertió en agua y se extrajo con diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida proporcionando 2-cloro-4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidina (154 mg, 65 %). A una solución agitada de 2-cloro-4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidina (29 mg, 0,11 mmol) y 4-amino-W-(ciclopropilmetil)bencenosulfonamida (27 mg, 0,12 mmol) en DMF (0,5 ml) se le agregó ácido p-toluenosulfónico (2 M en dioxano) (55 pl, 0,11 mmol) . La mezcla de reacción se agitó a 90 °C durante la noche y se purificó por HPLC para dar el compuesto del título (27 mg, 56 %).
W-(Ciclopropilmetil)-4-(4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidin-2-ilamino)bencenosulfonamida
Masa exacta calculada para C23H25N5O3S: 451,2, encontrado CL/EM m/z = 452,3 (M+H+).
<1>H NMR (400 MHz, da-DMSO) 0,05-0,09 (m, 2H), 0,32-0,36 (m, 2H), 0,75-0,81 (m, 1H), 1,90-1,95 (m, 2H), 2,64 (t, J= 6,4 Hz, 4H), 3,93 (t, J= 6,5 Hz, 2H), 6,59 (d, J= 7,1 Hz, 1H), 6,66-6,70 (m, 2H), 7,25-7,28 (m, 1H), 7,64 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,82 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 8,01 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 10,79 (s, 1H).
Ejemplo de referencia 5: Síntesis de derivados de pirintegrina
A una mezcla de 2,4-dicloropirimidina 4 (1,0 eq.), R1NH<2>(1,2 eq.) y diisopropiletilamina (1,2 eq.) en n-butanol se la calentó a 80 0C durante la noche. El disolvente se evaporó, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida para dar el producto intermedio 10 con un excelente rendimiento (>80 %), que después se trató con R2NH<2>(1,2 eq.) en DMF se añadió p ácido p-toluenosulfónico (2 M en dioxano) (1,2 eq.). La mezcla de reacción se agitó a 90 °C durante la noche, y después se purificó directamente por HPLC preparativa para dar derivados de estirenina 11 en excelentes rendimientos.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES i.Un método para mejorar la supervivencia y/o la proliferación celular, comprendiendo el método: (a) obtener células aisladas que comprendan células madre; y (b) poner en contacto las células aisladas con una cantidad de un compuesto suficiente para mejorar la supervivencia y/o la proliferación de las células en comparación con la ausencia del compuesto: en donde el compuesto es un compuesto de fórmula (II):
    en donde, L<2>es alquileno C1-C6 no sustituido; y es un número entero de 0 a 1; z es un número entero de 0 a 5; X es -N= o -CH=; R<1>es hidrógeno o alquilo C1-C6 no sustituido; R<3>y R<4>son independientemente -C(O)NR<14>R<15>, -OR<18>, o alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, en donde si z es mayor que 1, dos restos R<3>se unen opcionalmente para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; R<14>y R<15>son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido; y R<18>es hidrógeno o alquilo C1-C6 no sustituido; o un racemato, diastereómero, tautómero o un isómero geométrico del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde, en el compuesto de fórmula (II): (i) z es un número entero de 0 a 2; y/o (ii) R<3>es -C(O)NR<14>R<15>, -OR<18>o alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, en donde el alquilo C1-C<6>sustituido está sustituido con halógeno, y en donde si z es 2, dos restos R<3>se unen opcionalmente para formar un heterocicloalquilo C<3>-C<8>no sustituido que tiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, N, P, Si y S; y/o (iii) R<4>es -OR<18>; y/o (iv) R<14>y R<15>son independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6 no sustituido; y/o (v) el alquilo y el alquileno son saturados y tienen una cadena lineal o ramificada, o una combinación de los mismos.
  3. 3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la etapa de contacto comprende además modular la actividad de integrina.
  4. 4. El método de la reivindicación 3, en donde la etapa de contacto comprende modular la actividad de la integrina P1.
  5. 5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la etapa de contacto comprende poner en contacto las células aisladas con una cantidad de un compuesto de fórmula (II) suficiente para mejorar la supervivencia de las células en al menos 2 veces en comparación con la ausencia del compuesto.
  6. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las células aisladas (a) están en cultivos adherentes; o (b) están en cultivos en suspensión; o (c) son células disociadas individuales; o (d) son células agregadas. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la etapa de contacto comprende además hacer pasar las células en cultivos que comprenden el compuesto. El método de la reivindicación 7, en donde la etapa de hacer pasar consiste en hacer pasar las células durante al menos 20 generaciones. El método de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde los cultivos: (a) son químicamente definidos; y/o (b) son cultivos acondicionados exentos de células alimentadoras o sin células alimentadoras; y/o (c) están exentos de productos de origen animal. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde las células puestas en contacto: (a) permanecen homogéneas; y/o (b) mantienen la pluripotencia; y/o (c) expresan marcadores de pluripotencia; y/o (d) mantienen un cariotipo normal; y/o (e) son capaces de autorrenovarse; y/o (f) tienen una muerte celular reducida; y/o (g) son capaces de formar teratomas; y/o (h) tienen una diferenciación celular reducida; y/o (i) son capaces de diferenciarse en tres capas germinales primarias; y/o (j) son capaces de diferenciación específica de linaje; y/o (k) son capaces de formar cuerpos embrioides después de la disociación de células individuales; y/o (l) tienen una mayor capacidad de adhesión celular después de la disociación de una célula individual. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
    o un racemato, diastereómero, tautómero o un isómero geométrico del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el compuesto es
    o un racemato, diastereómero, tautómero o un isómero geométrico del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Una composición que comprende las células aisladas obtenidas utilizando el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y el compuesto de fórmula (II), o un racemato, diastereómero, tautómero o un isómero geométrico del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
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