ES3036152T3

ES3036152T3 - Pharmaceutical preparation

Info

Publication number: ES3036152T3
Application number: ES19190372T
Authority: ES
Inventors: Ian Cottingham; Daniel Plaksin; Richard Boyd White
Original assignee: Ferring BV
Current assignee: Ferring BV
Priority date: 2009-10-05
Filing date: 2010-10-04
Publication date: 2025-09-15
Anticipated expiration: 2030-10-04
Also published as: SI2486051T1; EP2486051A1; US20180030107A1; KR102489143B1; EP3611185B1; MX2012003951A; JP2016074680A; US10526390B2; US20200247863A1; CN102549011A; RU2724528C2; JP2023075144A; AR079876A1; JP6176924B2; JP2018076296A; IL218548A0; KR20210141771A; RU2012112907A; KR20190028823A; ES2798258T3

Abstract

Preparaciones que incluyen hCG recombinante (r hCG). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación farmacéutica

La presente invención se refiere a gonadotropinas para su uso en el tratamiento de la infertilidad. En particular, se refiere a la gonadotropina coriónica humana (hCG).

Las gonadotropinas son un grupo de hormonas glicoproteicas heterodiméricas que regulan la actividad gonadal en los machos y las hembras. Incluyen la hormona foliculoestimulante (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina coriónica (CG).

La gonadotropina coriónica humana (hCG) es segregada naturalmente por la glándula pituitaria anterior y funciona para apoyar el desarrollo folicular y la ovulación. La hCG comprende una subunidad alfa de 92 aminoácidos, también común a las otras hormonas glicoproteicas LH y FSH, y una subunidad beta de 145 aminoácidos exclusiva de la hCG, que determina la especificidad de la hormona. Cada subunidad se modifica traduccionalmente mediante la adición de restos de hidratos de carbono complejos. La subunidad alfa contiene sitios de glicosilación unidos en 2-N en los aminoácidos 52 y 78, y la subunidad beta contiene sitios de glicosilación unidos en 2-N en los aminoácidos 13 y 30, y cuatro sitios de glicosilación unidos en O en los aminoácidos 121, 127, 132 y 138.

La hCG extraída de la orina de mujeres embarazadas [Choragon (Ferring)] se ha utilizado durante muchos años en el tratamiento de la infertilidad. La producción de hCG extraída de la orina implica la recolección y el procesamiento de grandes cantidades de orina. Está disponible una versión recombinante de hCG, Ovitrelle (Serono). Esta se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO). El producto de hCG recombinante conocido tiene un perfil farmacocinético diferente al hCG producido a partir de orina humana. Es deseable tener un producto de hCG que replique o imite más estrechamente el perfil farmacocinético del producto producido a partir de la orina humana.

Existe una heterogeneidad considerable asociada a los preparados de hCG que se refiere a diferencias en las cantidades de las diversas isoformas presentes. Las isoformas de hCG individuales presentan secuencias de aminoácidos idénticas, pero se diferencian en el grado en el que se modifican postraduccionalmente; isoformas particulares se caracterizan por heterogeneidad de las estructuras ramificadas de hidrato de carbono y diferentes cantidades de incorporación de ácido siálico (un azúcar terminal), ambos de los cuales parecen influir en la bioactividad de la isoforma específica.

La glicosilación de hCG natural es muy compleja. Los glicanos en la hCG hipofisaria derivada de forma natural pueden contener una amplia gama de estructuras que pueden incluir combinaciones de glicanos bi-, tri- y tetra-antenarios. Los glicanos pueden portar modificaciones adicionales: fucosilación del núcleo, glucosamina bisecante, cadenas extendidas con acetil-lactosamina, sialilación parcial o completa, sialilación con enlaces a2,3 y a2,6, y galactosamina sulfatada sustituida para galactosa. Además, existen diferencias entre las distribuciones de las estructuras de glicanos en los sitios de glicosilación individuales.

La glicosilación de los productos de hCG recombinante (''rhCG'') refleja el intervalo de glicosil-transferasas presentes en la línea celular hospedante. El producto de rhCG existente, Ovitrelle, deriva de células de ovario de hámster chino modificadas genéticamente (células CHO). El intervalo de modificaciones de glicano en rhCG derivada de CHO está más limitado que el encontrado en los productos naturales, derivados de orina. Los ejemplos de heterogeneidad de glicanos reducidos encontrada en rhCG derivada de CHO incluyen una ausencia de glucosamina bisecante y un contenido reducido de fucosilación del núcleo y extensiones de acetil-lactosamina. Además, las células CHO sólo son capaces de añadir ácido siálico usando el enlace a2,3 (Kagawaet al.,1988, Takeuchiet al.,1988, Svenssonet al.,1990). Esto es diferente de la hCG producida naturalmente que contiene glicanos con una mezcla de ácido siálico unido a2,3 y a2,6.

Se ha demostrado que un preparado de FSH recombinante (Organon) se diferencia en las cantidades de FSH con un punto isoeléctrico (pl) inferior a 4 (consideradas las isoformas ácidas) cuando se compara con FSH de hipófisis, suero u orina posmenopáusica (Ulloa-Aguirre et al. 1995). La cantidad de isoformas ácidas en los preparados de orina de FSH fue mucho mayor en comparación con los productos recombinantes, Gonal-f (Serono) y Puregon (Organon) (Andersen et al. 2004). Esto debe reflejar un menor contenido molar de ácido siálico en la rFSH, puesto que el contenido de glicano negativamente cargado modificado con sulfato es bajo en FSH. El menor contenido de ácido siálico, en comparación con FSH natural, es una característica de ambos productos de FSH disponibles comercialmente y, por lo tanto, debe reflejar una limitación en el proceso de fabricación (Bassett y Driebergen, 2005). El tiempo de vida circulatorio de FSH se ha documentado para materiales de una variedad de fuentes. Algunos de estos materiales se han fraccionado basándose en la carga molecular global, caracterizada por su pl, en la que más ácido equivale a una carga negativa más alta. El principal contribuyente a la carga molecular general es el contenido siálico total de cada molécula de FSH. Por ejemplo, rFSH (Organon) tiene un contenido de ácido siálico de aproximadamente 8 moles/mol, mientras que FSH derivada de orina tiene un contenido de ácido siálico más elevado (de Leeuw et al. 1996). Las velocidades de aclaramiento plasmático correspondientes en la rata son 0,34 y 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al. 2003). En otro ejemplo en el que una muestra de FSH recombinante se dividió en fracciones de pI alto y bajo, disminuyó la potencia in vivo de la fracción de pl alto (menor contenido de ácido siálico) y tuvo una vida media plasmática más corta (D'Antonio et al. 1999). Los solicitantes han descubierto que, de forma similar a FSH, el producto de hCG recombinante conocido, derivado de CHO (por ejemplo, Ovitrelle), también tiene una cantidad menor de hCG con un punto isoeléctrico (pI) inferior a 4 (consideradas las isoformas ácidas) que la hCG urinaria, lo que también refleja un menor contenido de ácido siálico del producto de rhCG conocido en comparación con la hCG urinaria.

El contenido de ácido siálico total de hCG y rhCG no es directamente comparable, puesto que los ácidos siálicos se unen comúnmente en dos formas. hCG hipofisaria/ sérica/ urinaria contiene ácido siálico tanto unido en a2,3 como en a2,6, con una predominancia del primero. Sin embargo, los recombinantes derivados de células CHO solo contienen a2,3 (Kagawaet al.,1988, Takeuchiet al.,1988, Svenssonet al.,1990). En otras palabras, las proteínas recombinantes expresadas usando el sistema CHO se diferenciarán de sus homólogos naturales en el tipo de enlaces del ácido siálico terminal. Esta es otra diferencia entre los productos naturales y los recombinantes actuales, además del menor contenido general de ácido siálico de estos últimos, y es una consideración importante en la producción de productos biológicos para uso farmacéutico, ya que los restos de hidratos de carbono pueden contribuir a los atributos farmacológicos de la molécula.

Es deseable por lo tanto tener un producto de rhCG que replique o imite más estrechamente el perfil farmacocinético y farmacocinético del producto producido a partir de la orina humana. Es deseable por lo tanto tener un producto de rhCG que tenga propiedad o propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con el producto recombinante conocido.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona hCG recombinante ("rhCG" o "rechCG") que incluye sialilación a2, 3 y sialilación a2, 6, en la que la hCG recombinante incluye estructuras mono-, di-, tri- y tetra-sialiladas. La rhCG puede incluir además opcionalmente sialilación a2, 8. La rhCG (o preparado de rhCG) según la invención puede tener un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico a moles de proteína] de 15 mol/mol o mayor, por ejemplo de 15 mol/mol a 25 mol/mol, por ejemplo de 17 mol/mol a 24 mol/mol, por ejemplo de 17,7 mol/mol a 23 mol/mol, por ejemplo de 18 mol/mol a 22 mol/mol, por ejemplo de 19 mol/mol a 21 mol/mol, por ejemplo de 19 mol/mol a 20 mol/mol. La rhCG (o preparado de rhCG) según la invención puede tener 10% o más de la sialilación total que es sialilación a2,3. Por ejemplo, 45% a 80% de la sialilación total puede ser a2,3-sialilación, por ejemplo, 50% a 70% de la sialilación total puede ser a2,3-sialilación, por ejemplo, 55 a 65% de la sialilación total puede ser a2,3-sialilación. Por ejemplo, 65 a 85% de la sialilación total puede ser a2,3-sialilación. La rhCG (o preparado de rhCG) de la invención puede tener 50% o menos de la sialilación total que es sialilación a2,6. Por ejemplo, 20-55% de la sialilación total puede ser a2,6-sialilación, por ejemplo, 30-50% de la sialilación total puede ser a2,6-sialilación, por ejemplo, 35-45% de la sialilación total puede ser a2,6-sialilación. Por ejemplo, 15-35% de la sialilación total puede ser sialilación a2,6. La rhCG (o preparado de rhCG) de la invención puede tener 5% o menos de la sialilación total que es sialilación a2,8, por ejemplo 0 a 4%, por ejemplo 0,1-4% de la sialilación total puede ser sialilación a2,8. La rhCG (o preparado de rhCG) de la invención puede no tener sialilación a2,8.

Los solicitantes han desarrollado una hCG recombinante derivada de humano que tiene un perfil más ácido que el producto derivado de CHO, Ovitrelle, y que tiene un mayor contenido de ácido siálico. Los solicitantes han descubierto que el tipo de enlace del ácido siálico, a2,3 o a2,6, puede tener una gran influencia sobre el aclaramiento biológico de hCG. Estirpes celulares humanas, a diferencia de líneas celulares de CHO, pueden expresar hCG recombinante con ácidos siálicos unidos tanto por enlaces a2,3 como a2,6.

hCG recombinante con una mezcla de ácido siálico unido tanto en a2,3 como en a2,6 se preparó genomanipulando una línea celular humana para expresar tanto rhCG como a2,3 sialiltransferasa (Ejemplos 4, 5a y 5b). El producto expresado es muy ácido, y porta una mezcla de ácidos siálicos unidos tanto en a2,3 como en a2,6; estos últimos vienen proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena. Esto tiene dos ventajas con respecto a rhCG expresada en células CHO convencionales: en primer lugar, el material está más altamente sialilado debido a las actividades combinadas de las dos sialiltransferasas; y en segundo lugar, el material se parece mucho a hCG natural. Es probable que esto sea biológicamente más apropiado en comparación con los productos recombinantes derivados de células CHO que han producido sólo ácido siálico unido en a2,3 y tienen un contenido de ácido siálico reducido.

Los solicitantes han descubierto sorprendentemente que rhCG de la invención puede replicar o imitar más estrechamente el perfil fisioquímico y farmacocinético del producto urinario humano natural que otros productos recombinantes. En otras palabras, la rhCG de la invención puede estar más próxima a la hCG "natural". Esto puede tener ventajas significativas referentes a la dosis, etc. Además, un producto más "natural" o más "humano" puede ser más deseable para el paciente, que puede desear la terapia, aunque en un sentido artificial, que sea lo más "natural" posible. Puede haber otras ventajas (por ejemplo, ventajas farmacocinéticas) en un producto de hCG recombinante que tiene una estructura de hidrato de carbono (por ejemplo, glicano) que es más próxima a la hCG natural (por ejemplo, urinaria humana) que otros productos recombinantes. La invención es así una versión recombinante de hCG que porta una mezcla de ácido a2,3 y a2,6 siálico e incluye estructuras mono-, di-, tri- y tetra-sialiladas. Por lo tanto, se asemeja mucho más a hCG natural. Se espera que el uso de este compuesto para la estimulación ovárica controlada, en técnicas de FIV, e inducción de la ovulación, dé como resultado una estimulación más natural del ovario en comparación con los productos recombinantes existentes.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona hCG recombinante ("rhCG" o "rechCG") (y/o un preparado de hCG recombinante) que incluye sialilación a2, 3 y sialilación a2, 6, en la que la hCG recombinante incluye estructuras mono-, di-, tri- y tetra-sialiladas. La rhCG (o preparado de rhCG) puede incluir opcionalmente además sialilación a2, 8.

Aquí, la expresión "preparado de hCG recombinante" incluye un preparado para, por ejemplo, uso farmacéutico que incluye hCG recombinante. En realizaciones de la invención, la rhCG puede estar presente como una única isoforma o como una mezcla de isoformas.

La rhCG (o preparado de rhCG) según la invención puede tener un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico a moles de proteína] de 15 mol/mol o mayor (Ejemplo 8), por ejemplo de 15 mol/mol a 25 mol/mol, por ejemplo de 17 mol/mol a 24 mol/mol, por ejemplo de 17,7 mol/mol a 23 mol/mol, por ejemplo de 18 mol/mol a 22 mol/mol, por ejemplo de 19 mol/mol a 21 mol/mol, por ejemplo de 19 mol/mol a 20 mol/mol. La rhCG de la invención se puede producir o expresar en una línea celular humana.

La rhCG (o preparado de rhCG) según la invención puede tener 10% o más de la sialilación total que es sialilación a2,3. Por ejemplo, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80 o 90% o más de la sialilación total puede ser sialilación a2,3. La rhCG (o preparado de rhCG) puede incluir sialilación a2,3 en una cantidad que es de 45 a 80% de la sialilación total, por ejemplo, 50 a 70% de la sialilación total, por ejemplo, 55 a 65% de la sialilación total. La rhCG (o preparacdo de rhCG) puede incluir preferiblemente sialilación a2,3 en una cantidad que es de 65 a 85% de la sialilación total, por ejemplo de 70 a 80% de la sialilación total, por ejemplo de 71 a 79% de la sialilación total. La rhCG (o preparado de rhCG) de la invención puede tener 50% o menos de la sialilación total que es sialilación a2,6. Por ejemplo, 45, 40, 30, 20, 10, 5% o menos de la sialilación total puede ser sialilación a2,6. La rhCG (o preparado de rhCG) puede incluir sialilación en a2,6 en una cantidad que es de 20-55% de la sialilación total, por ejemplo, de 30-50% de la sialilación total, por ejemplo, de 35-45% de la sialilación total. La rhCG (o preparado de rhCG) puede incluir preferiblemente sialilación a2,6 en una cantidad que es de 15 a 35% de la sialilación total, por ejemplo de 20 a 30% de la sialilación total, por ejemplo de 21 a 29% de la sialilación total. La rhCG (o preparado de rhCG) de la invención puede tener 5% o menos de la sialilación total que es sialilación a2,8. Por ejemplo, 2,5% o menos de la sialilación total puede ser sialilación a2,8. La rhCG (o preparado de rhCG) puede incluir preferiblemente sialilación a2,8 en una cantidad que es de 0 a 4% de la sialilación total, por ejemplo 0,1 a 4% de la sialilación total, por ejemplo de 0,5 a 3% de la sialilación total, por ejemplo de 0,5 a 2,5% de la sialilación total. La rhCG (o preparado de rhCG) de la invención puede no tener sialilación a2,8. Por sialilación se entiende la cantidad de restos siálicos presentes en las estructuras de hidratos de carbono de hCG. La a2,3-sialilación significa sialilación en la posición 2,3 (como es bien conocido en la técnica), y la a2,6-sialilación en la posición 2,6 (también bien conocida en la técnica). Así, "% de sialilación total puede ser sialilación a2,3" se refiere al % del número total de restos de ácido siálico presentes en la hCG que están sialilados en la posición 2,3. La expresión "% de sialilación total que es sialilación a2,6" se refiere al % del número total de restos de ácido siálico presentes en la hCG que están sialilados en la posición 2,6.

La rhCG (o preparado de rhCG) según la invención puede tener un contenido de ácido siálico (cantidad de sialilación por molécula de hCG) (basado en la masa de proteína, en vez de la masa de proteína más hidrato de carbono) de 6% o más (por ejemplo, entre 6% y 15%, por ejemplo entre 7% y 13%, por ejemplo entre 8% y 12%, por ejemplo entre 11% y 15%, por ejemplo entre 12% y 14%) en masa.

La hCG recombinante expresada en células de ovario de hámster chino (CHO) incluye exclusivamente sialilación a 2, 3.

La rhCG de la invención se puede producir o expresar en una línea celular humana. Esto puede simplificar (y hacer más eficiente) el método de producción debido a que la manipulación y el control de, por ejemplo, el medio de crecimiento celular para retener la sialilación puede ser menos crítico que con los procedimientos conocidos. El método también puede ser más eficiente debido a que hay menos rhCG básica producida que en la producción de productos de rhCG conocidos; se produce rhCG más ácida y la separación/eliminación de hCG básica es menos problemática. La rhCG se puede producir o expresar en una línea celular Per.C6, una línea celular derivada de Per.C6, o una línea celular Per.C6 modificada. La línea celular se puede modificar usando a2,3-sialiltransferasa. La rhCG puede incluir ácidos siálicos unidos en a2,6 (sialilación a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena [de la línea celular]. Alternativa o adicionalmente, la línea celular se puede modificar usando a2,6-sialiltransferasa.

La rhCG se puede producir utilizando a2,3-sialiltransferasa. La rhCG puede incluir ácidos siálicos unidos en a2,6 (sialilación a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena. La rhCG se puede producir utilizando a2,3- y/o a2,6-sialiltransferasa.

La rhCG y/o un preparado de rhCG se pueden producir según el método como se describe aquí, que comprende la etapa de producir o expresar la rhCG en una línea celular humana, por ejemplo una línea celular Per.C6, una línea celular derivada de Per.C6, o una línea celular Per.C6 modificada, por ejemplo una línea celular que se ha modificado usando a2,3-sialiltransferasa.

La estructura de rhCG contiene restos de glicano. La ramificación puede ocurrir con el resultado de que el glicano puede tener 1,2, 3, 4 o más residuos de azúcar terminales o "antenas", como se conoce bien en la técnica. La rhCG de la invención puede tener glicanos con presencia de sialilación en estructuras mono-antenarias y/o di-antenarias y/o tri-antenarias y/o tetra-antenarias. La rhCG incluye estructuras de glicano mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas, por ejemplo con cantidades relativas como las siguientes: 0,1-4% de mono-sialiladas; 35 - 45% disialiladas; 0,5 - 8% tri-sialiladas, y 0 - 1% tetra-sialiladas (por ejemplo, como se muestra por el análisis WAX de glicanos cargados, como se expone en el Ejemplo 8 D). La rhCG recombinante de la invención incluye estructuras mono (1S), di (2S), tri (3S) y tetra (4S) sialiladas. Por ejemplo, las cantidades relativas de estructuras sialiladas estaban en las siguientes relaciones (1S:2S:4S:4S): 0,2-1%: 35-40%: 2,5-7%: 0,5-1% (por ejemplo, como se muestra mediante el análisis WAX de glicanos cargados, como se expone en el Ejemplo 8 D).

La rhCG de la presente invención se puede producir (por ejemplo, expresar) en una línea celular humana. La rhCG puede incluir sialilación a2,3 y a2,6. La rhCG se puede producir o expresar en una línea celular Per.C6, una línea celular derivada de Per.C6, o una línea celular Per.C6 modificada. La línea celular se puede modificar usando a2,3-sialiltransferasa. La rhCG puede incluir ácidos siálicos unidos en a2,6 (sialilación a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena [de la línea celular]. Alternativa o adicionalmente, la línea celular se puede modificar usando a2,6-sialiltransferasa. La rhCG (o preparado de rhCG) según la invención puede tener un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico a moles de proteína] de 15 mol/mol o mayor, por ejemplo de 15 mol/mol a 25 mol/mol, por ejemplo de 17 mol/mol a 24 mol/mol, por ejemplo de 17,7 mol/mol a 23 mol/mol, por ejemplo de 18 mol/mol a 22 mol/mol, por ejemplo de 19 mol/mol a 21 mol/mol, por ejemplo de 19 mol/mol a 20 mol/mol. La rhCG (o preparado de rhCG) puede tener 10% o más de la sialilación total que es a2,3-sialilación, por ejemplo 45% a 80% de la sialilación total puede ser a2,3-sialilación, por ejemplo, 50% a 70% de la sialilación total puede ser a2,3-sialilación, por ejemplo 55 a 65% de la sialilación total puede ser a2,3-sialilación. Por ejemplo, 65-85% de la sialilación total puede ser sialilación a2,3. La rhCG (o preparado de rhCG) de la invención puede tener 50% o menos de la sialilación total que es sialilación a2,6. Por ejemplo, 20-55% de la sialilación total puede ser a2,6-sialilación, por ejemplo, 30-50% de la sialilación total puede ser a2,6-sialilación, por ejemplo, 35-45% de la sialilación total puede ser a2,6-sialilación. Por ejemplo, 15-35% de la sialilación total puede ser sialilación a2,6. La rhCG (o preparado de rhCG) de la invención puede tener 5% o menos de la sialilación total que es sialilación a2,8, por ejemplo 0 a 4%, por ejemplo 0,5-4% de la sialilación total puede ser sialilación a2,8. La rhCG (o preparado de rhCG) de la invención puede no tener sialilación a2,8.

De acuerdo con la presente invención, en un aspecto adicional, se proporciona una composición farmacéutica que comprende rhCG que incluye a2,3-sialilación y a2,6-sialilación (por ejemplo, como se expuso anteriormente), en la que la hCG recombinante incluye estructuras mono-, di-, tri- y tetra-sialiladas. La hCG recombinante puede producirse o expresarse en una línea celular humana. La línea celular puede modificarse utilizando a2,3-sialiltransferasa. La hCG recombinante puede incluir a2,6-sialilación proporcionada por la actividad de sialiltransferasa endógena. La composición farmacéutica puede comprender además FSH y/o LH. La FSH puede obtenerse por cualquier medio conocido en la técnica. La FSH, como se usa aquí, incluye FSH derivada de humano y recombinante. La FSH derivada de humano se pueden purificar de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina) por cualquier método conocido en la técnica. La FSH puede ser FSH recombinante - por ejemplo expresada en una línea celular humana. Los métodos de expresión y purificación de FSH recombinante son bien conocidos en la técnica.

La LH puede obtenerse por cualquier medio conocido en la técnica. La LH, como se usa en el presente documento, incluye LH derivada de humano y recombinante. La LH derivada de humano se pueden purificar de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina) por cualquier método conocido en la técnica. Los métodos de expresión y purificación de LH recombinante son conocidos en la técnica.

La composición farmacéutica puede ser para el tratamiento de la infertilidad, por ejemplo, para su uso en, por ejemplo, tecnologías de reproducción asistida (ART), inducción de la ovulación o inseminación intrauterina (IIU). La composición farmacéutica se puede usar, por ejemplo, en indicaciones médicas en las que se usan preparados de hCG conocidos. La presente invención también proporciona el uso de rhCG y/o un preparado de rhCG descrito aquí (según aspectos de la invención) para, o en la fabricación de un medicamento para, el tratamiento de la infertilidad. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular en composiciones bien conocidas para cualquier vía de administración de fármacos, por ejemplo, oral, rectal, parenteral, transdérmica (por ejemplo, tecnología de parche), intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, pomadas o gotas) o como un espray yugal o nasal. Una composición típica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como disolución acuosa, excipientes no tóxicos, que incluyen sales y conservantes, tampones y similares, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoquinta edición (Matt Publishing Company, 1975), en las páginas 1405 a 1412 y 1461 - 87, y the National Formulary XIV, decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975), entre otros.

Ejemplos de soportes, diluyentes, disolventes o vehículos farmacéuticos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva), y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo.

Las composiciones de la presente invención también pueden contener aditivos, tales como, pero no se limitan a, conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. Se pueden incluir agentes antibacterianos y antifúngicos para prevenir el crecimiento de microbios e incluyen, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. Además, puede desearse incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares.

En algunos casos, para efectuar la acción prolongada, es deseable ralentizar la absorción de hCG (y otros principios activos, si están presentes) de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr usando una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. La velocidad de absorción de hCG depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de combinación de hCG administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo la combinación de hCG en un vehículo de aceite.

Se pueden preparar formas de liberación prolongada inyectables formando matrices microencapsuladas de la hCG (y otros agentes, si están presentes) en polímeros biodegradables, tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación entre hCG y polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de hCG. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen polivinilpirrolidona, poli(ortoésteres), poli(anhídridos), etc. También se preparan formulaciones inyectables de liberación prolongada atrapando la hCG en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos del cuerpo.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de uso. Las formulaciones inyectables se pueden suministrar en cualquier recipiente adecuado, por ejemplo, vial, jeringa precargada, cartuchos de inyección, y similares.

Las formulaciones inyectables se pueden suministrar como un producto que tiene composiciones farmacéuticas que contienen hCG (opcionalmente con FSH, LH, etc.). Si existe más de un principio activo (es decir, hCG y, por ejemplo, FSH o LH), estos pueden ser adecuados para administración por separado o juntos. Si se administran por separado, la administración puede ser secuencial. El producto se puede suministrar en cualquier envase apropiado. Por ejemplo, un producto puede contener varias jeringas precargadas que contienen hCG, FSH, o una combinación de tanto FSH como hCG, envasándose las jeringas en un envase de blíster u otro medio para mantener la esterilidad. Un producto puede contener opcionalmente instrucciones para usar las formulaciones de FSH y hCG.

El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan según práctica rutinaria en este campo. Véase GOODMAN y GILMAN, THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7.a ed. En una realización preferida, las composiciones de la invención se suministran como composiciones para administración parenteral. Se conocen en la técnica métodos generales para la preparación de las formulaciones parenterales, y se describen en REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, más arriba, en las páginas 780-820. Las composiciones parentales se pueden suministrar en formulación líquida o como un sólido que se mezclará con un medio inyectable estéril justo antes de la administración. En una realización especialmente preferida, las composiciones parentales se suministran en forma unitaria de administración para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos y a los dibujos adjuntos en los que:

la Figura 1 muestra un mapa de plásmidos del vector de expresión phCGalfa/beta;

la Figura 2 muestra el vector de expresión de a2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4);

la Figura 3 muestra el vector de expresión de a2,6-sialiltransferasa (ST6GAL1);

la Figura 4 muestra la detección de isoformas de rhCG en preparados de hCG recombinante derivadas de líneas celulares humanas de acuerdo con la invención (pista 3, 4) mediante IEF teñido con azul de Coomassie, en comparación con preparaciones de la técnica anterior (pista 1, 2);

la Figura 5 muestra las velocidades de aclaramiento metabólico (MCR) de muestras de hCG derivadas de Per.C6 modificadas mediante a2,3-sialiltransferasa;

la Figura 6 muestra las MCR a largo plazo de muestras de Per.C6 modificadas con a2,3 sialiltransferasa.

Selección de secuencias

hCG humana

La región codificante del gen para el polipéptido hCG alfa se usó según Fiddes y Goodman (1979). La secuencia se almacena como AH007338, y en el momento de la construcción no había otras variantes de esta secuencia proteica. La secuencia se denomina aquí como SEQ ID 1.

La región codificante del gen para el polipéptido hCG beta se usó según Fiddes y Goodman (1980). La secuencia se almacena como NP_000728, y es consistente con las secuencias proteicas de CGbeta3, CGbeta5 y CGbeta7. La secuencia se denomina en el presente documento como SEQ ID 2

Sialiltransferasa

a2,3-Sialiltransferasa - La región codificante del gen para beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (a2,3-sialiltransferasa, ST3GAL4) se usó según Kitagawa y Paulson (1994). La secuencia está depositada como L23767 y se denomina en el presente documento como SEQ ID 3.

a2,6-Sialiltransferasa - La región codificante del gen para beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (a2,6-sialiltransferasa, ST6GAL1) se usó según Grundmannet al.(1990). La secuencia está depositada como NM_003032 y se denomina en el presente documento como SEQ ID 4.

Ejemplos

Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión de hCG

La secuencia codificante del polipéptido hCG alfa (AH007338, SEQ ID 1) y del polipéptido hCG beta (NP_000728, SEQ ID 2) se amplificó por PCR usando las combinaciones de cebadores CGa-fw y CGa-rev y CGb-fw y CGb-rec, respectivamente.

CGa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3'

CGa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3'

CGb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGGAGATGTTCCAGGGGCTGC -3'

CGb-rev 5'- CCGGGTTAACTTATTGTGGGAGGATCGGGG-3'

El ADN de hCG beta amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción ^ sc I yHpaIy se insertó en los sitios ^ sc I yHpaIen el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de selección de neomicina. Similarmente, el ADN de hCG alfa se digirió con SamHI yNheIy se insertó en los sitios SamHI y NheI en el vector de expresión que ya contenía el ADN del polipéptido de hCG beta.

El ADN del vector se utilizó para transformar la cepa DH5a deE. coli.Se seleccionaron colonias para la amplificación y, del número que incluía el vector que contenía tanto hCG alfa como beta, se seleccionaron veinte para la secuenciación. Todas las colonias seleccionadas para secuenciación contuvieron las secuencias correctas según SEQ ID 1 y SEQ ID 2. El plásmido phCG A+B se seleccionó para la transfección (Figura 1).

Ejemplo 2 Construcción del vector de expresión de ST3

La secuencia codificante de beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3, L23767, SEQ ID 3) se amplificó por PCR usando la combinación de cebadores 2,3STfw y 2,3STrev.

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'

El ADN de ST3 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción SamHI y AflII y se insertó en los sitios SamHI y AflII en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se describe previamente, y se secuenció. El clon pST3#1 (Figura 2) contenía la secuencia correcta según SEQ ID 3, y se seleccionó para la transfección.

Ejemplo 3 Construcción del vector de expresión de ST6

La secuencia codificante de beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID 4) se amplificó por PCR usando la combinación de cebadores 2,6STfw y 2,6STrev.

2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3'

2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3'

El ADN de ST6 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción SamHI y M II y se insertó en los sitios SamHI yAf/IIen el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se describe previamente, y se secuenció. El clon pST6#11 (Figura 3) contenía la secuencia correcta según SEQ ID 4, y se seleccionó para la transfección.

Ejemplo 4 Expresión estable de phCG A+B en células PER.C6. Transfección, aislamiento y cribado de clones.

Se generaron clones de Per.C6 que produjeron hCG expresando ambas cadenas polipeptídicas de hCG a partir de un solo plásmido (véase el Ejemplo 1).

Para obtener clones estables, se usó con la construcción phCG A+B un agente de transfección basado en liposomas. Se seleccionaron clones estables en medios de selección de Per.C6 complementado con 10% de FCS y que contenía G418. Tres semanas después de la transfección, crecieron clones resistentes a G418. Se seleccionó un total de 389 clones para el aislamiento. Los clones aislados se cultivaron en medio de selección hasta el 70-80% de confluencia. Los sobrenadantes se ensayaron para determinar el contenido de proteína de hCG usando un ELISA selectivo de hCG, y para la actividad farmacológica en el receptor de hCG en la línea celular clonada, usando un ensayo de acumulación de cAMP. Los clones (118) que expresan la proteína funcional progresaron para la expansión de cultivo a 24 pocillos, 6 pocillos y matraces T80.

Los estudios para determinar la productividad y calidad del material de 47 clones se iniciaron en matraces T80 para generar material suficiente. Las células se cultivaron en medios complementados como se describió previamente durante 7 días, y el sobrenadante se recogió. La productividad se determinó utilizando el ELISA selectivo de hCG. Se determinó el perfil isoeléctrico del material (usando el método descrito en el Ejemplo 6). La información del IEF se usó para seleccionar clones para el análisis de la velocidad de aclaramiento metabólico. Los clones con suficiente productividad y calidad se seleccionaron para la producción de sialiltransferasa mediante ingeniería genética.

Ejemplo 5a El nivel de sialilación aumenta en células que sobreexpresan a2,3-sialiltransferasa. Expresión estable de pST3 en células PER.C6 que expresan hCG; Aislamiento por transfección y detección de clones.

Los clones de Per.C6 que producían hCG altamente sialilada se generaron expresando a2,3 sialiltransferasa a partir de plásmidos diferentes (véase el Ejemplo 2) en células Per.C6 que ya expresaban ambas cadenas polipeptídicas de hCG (véase el Ejemplo 4). Clones producidos a partir de células PER.C6®, como se ha expuesto en el Ejemplo 4, se seleccionaron por sus características, que incluyen productividad, buen perfil de crecimiento, producción de proteína funcional, y hCG producida que incluía cierta sialilación.

Se generaron clones estables como se describe previamente en el Ejemplo 4. Los clones del programa de a2,3-sialiltransferasa se aislaron, expandieron y analizaron. El número final de clones para el estudio a2,3 fue cinco. Los clones de a2,3-sialiltransferasa se adaptaron a medios sin suero y condiciones de suspensión.

Como antes, los clones se analizaron utilizando un ELISA selectivo de hCG, respuesta funcional en una línea celular receptora de hCG, IEF (Ejemplo 6). También se evaluaron la velocidad de aclaramiento metabólico (Ejemplo 9) y el bioensayo de hCG USP (Ejemplo 10). Los resultados se compararon con una hCG recombinante disponible comercialmente (Ovitrelle, Serono) y las líneas celulares parentales de hCG Per.C6. Las muestras representativas se muestran en los Ejemplos y las Figuras.

En conclusión, la expresión de hCG junto con a2,3-sialiltransferasa en células Per.C6 da como resultado niveles elevados de hCG sialilada en comparación con células que sólo expresan hCG.

Ejemplo 5b Expresión estable de pST3 en células PER.C6 que expresan hCG - un método diferente

El heterodímero alfa beta producido anteriormente (Ejemplo 4) tenía un bajo nivel de sialilación, lo que resultó en un perfil de IEF muy básico. Como se indicó anteriormente (Ejemplo 5a), la expresión de hCG junto con a2,3-sialiltransferasa en células Per.C6 da como resultado niveles elevados de hCG sialilada en comparación con células que sólo expresan hCG.

Se realizó una doble transfección de los genes de las subunidades alfa y beta de hCG junto con el gen de la enzima a2,3 sialiltransferasa en células Per.C6 en formato de cultivo celular en suspensión. Las líneas celulares se generaron cotransfectando el vector de hCG (alfa/beta dual, Ejemplo 1) y el vector que codifica a2,3-sialiltransferasa (Ejemplo 2) en condiciones sin suero. Clones producidos a partir de células PER.C6® se seleccionaron por sus características, que incluyen productividad, buen perfil de crecimiento, producción de proteína funcional, y hCG producida que incluía cierta sialilación. Los clones se aislaron, se expandieron y se analizaron.

Como antes, los clones se analizaron utilizando un ELISA selectivo de hCG, respuesta funcional en una línea celular receptora de hCG, IEF (Ejemplo 6). También se evaluaron la velocidad de aclaramiento metabólico (Ejemplo 9) y el bioensayo de hCG USP (Ejemplo 10). Los resultados se compararon con una hCG recombinante disponible comercialmente (Ovitrelle, Serono) y las líneas celulares parentales de hCG Per.C6. Las muestras representativas se muestran en los Ejemplos y Figuras (véanse los Ejemplos 6, 9, 10, Figs 4 y 5). La hCG recombinante producida por los clones (es decir, hCG recombinante según la invención) tiene una sialilación significativamente mejorada (es decir, en promedio, más isoformas de hCG con altos números de ácidos siálicos), en comparación con la hCG expresada sin a2,3-sialiltransferasa y Ovitrelle (véanse los Ejemplos 6 y 8, Fig. 4).

Ejemplo 6 Análisis del punto isoeléctrico pl de isoformas de hCG producidas por Per.C6 mediante isoelectroenfoque.

La electroforesis se define como el transporte de moléculas cargadas a través de un disolvente por un campo eléctrico. La movilidad de una molécula biológica a través de un campo eléctrico dependerá de la intensidad de campo, la carga neta en la molécula, el tamaño y la forma de la molécula, la fuerza iónica y las propiedades del medio a través del cual migran las moléculas.

El isoelectroenfoque (IEF) es una técnica electroforética para la separación de proteínas basada en su pl. El pl es el pH al que una proteína no tiene carga neta y no migrará en un campo eléctrico. El contenido de ácido siálico de las isoformas de hCG altera sutilmente el punto pI para cada isoforma, que puede ser explotado usando esta técnica para visualizar las isoformas de hCG producidas por Per.C6 de cada clon.

Los puntos isoeléctricos de las isoformas de hCG producidas por Per.C6 en sobrenadantes de cultivo celular se analizaron usando isoelectroenfoque. Los medios de cultivo celular de los clones de hCG producida por Per.C6 se produjeron como se describe en los Ejemplos 4, 5a y 5b.

Las muestras de hCG de Per.C6 se separaron en geles de IEF Novex® que contenían 5% de poliacrilamida en condiciones nativas en un gradiente de pH 3,0 - 7,0 en una disolución de anfolito de pH 3,0 - 7,0. Las proteínas se visualizaron utilizando tinción azul de Coomassie, utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

La Figura 4 muestra la detección de isoformas de rhCG por IEF teñido con azul Coomassie en composiciones de acuerdo con la invención (Pista 3, 10 pg, y Pista 4, 15 pg) y la composición derivada de CHO de la técnica anterior, Ovitrelle (Pista 1, Ovitrelle, 10 pg, y Pista 2, Ovitrelle, 15 pg). Las bandas representan isoformas de hCG que contienen diferentes cantidades de moléculas de ácido siálico. Usando este método, se identificaron clones que producían isoformas de hCG con un mayor número de moléculas de ácido siálico. La Figura 4 indica que las hCG recombinantes derivadas de líneas celulares humanas modificadas con a2,3-sialiltransferasa (composiciones de acuerdo con la invención) tienen un perfil más ácido que Ovitrelle.

Ejemplo 7 Análisis de enlaces de ácido siálico de Per.C6 hCG

Se analizaron glicoconjugados usando un método de diferenciación de glicanos basado en lectina. Con este método, se pueden caracterizar las glicoproteínas y los glicoconjugados unidos a nitrocelulosa. Las lectinas reconocen selectivamente un resto particular, por ejemplo, ácido siálico unido en a2,3. Las lectinas aplicadas se conjugan con el hapteno esteroideo digoxigenina que permite la detección inmunológica de las lectinas unidas.

hCG producida por Per.C6 purificada a partir de un clon parental (sin sialiltransferasa adicional), y un clon modificado con a2,3-sialiltransferasa se separaron usando técnicas de SDS-PAGE estándar. Se usó una hCG recombinante disponible comercialmente (Ovitrelle, Serono) como estándar.

Se analizó ácido siálico usando el kit de diferenciación de glicanos DIG (Cat. n.° 11 210 238 001, Roche) según las instrucciones del fabricante. Reacciones positivas con aglutinina de Sambucus nigra (SNA) indicaron ácido siálico unido terminalmente (2-6). Reacciones positivas con aglutinina II de Maackia amurensis (MAA): indicaron ácido siálico unido terminalmente (a2-3)

En resumen, el clon parental contenía bajos niveles de ácido siálico tanto a2,3 como a2,6. Los clones modificados con a2,3-sialiltransferasa contenían altos niveles de enlaces a2,3 de ácido siálico y bajos niveles de enlaces a2,6 de ácido siálico. El control estándar Ovitrelle sólo contiene enlaces a2,3 de ácido siálico. Esto está de acuerdo con lo que se conoce sobre las proteínas recombinantes producidas en células de ovario de hámster chino (CHO) (Kagawaet al.,1988, Takeuchiet al.,1988, Svenssonet al.,1990).

En conclusión, la modificación de células Per.C6 hCG con a2,3-sialiltransferasa aumentó satisfactoriamente el número de moléculas de ácido siálico conjugadas con la hCG en la muestra.

Ejemplo 8A y 8B Cuantificación de ácido siálico total

El ácido siálico es un hidrato de carbono unido a proteína considerado un monosacárido y se produce en combinación con otros monosacáridos como galactosa, manosa, glucosamina, galactosamina y fucosa. El ácido siálico total en rhCG purificada según la invención se midió utilizando un método basado en el método de Stanton et. al. (J. Biochem. Biophys. Methods. 30 (1995), 37 - 48).

Ejemplo 8A

Se midió el contenido total de ácido siálico de hCG recombinante producida por Per.C6 modificada con a2,3-sialiltransferasa (por ejemplo, Ejemplo 5a, Ejemplo 5b), y se encontró que era mayor que 15 mol/mol, [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico a moles de proteína], por ejemplo mayor que 18 mol/mol, por ejemplo 19,1 mol/mol. Esto se puede comparar con Ovitrelle, que tiene un contenido total de ácido siálico de 17,6 mol/mol.

Ejemplo 8B

Se midió el contenido total de ácido siálico de hCG recombinante producida por Per.C6 modificada con a2,3-sialiltransferasa 080019-19 (preparada mediante los métodos del Ejemplo 5b anterior), y se encontró que era 20 mol/mol, [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico a moles de proteína]. Nuevamente, esto puede compararse favorablemente con Ovitrelle, que tiene un contenido total de ácido siálico de 17,6 mol/mol. Este Ejemplo (080019-19) se probó para cuantificar las cantidades relativas de ácido a2,3 y a2,6 siálico (Ejemplo 8C).Ejemplo 8C Cuantificación de cantidades relativas de ácido a2,3 y a2,6 siálico

Las cantidades porcentuales relativas de ácido a2,3 y a2,6 siálico en rhCG purificada [Ejemplo (080019-19) y otros dos Ejemplos preparados mediante los métodos del Ejemplo 5] se midieron utilizando técnicas conocidas: HPL<c>con fase normal (NP).

Para cuantificar el ácido alfa 2,3 y 2,6 siálico en los glicanos enlazados en O se realizó el siguiente análisis. Los glicanos enlazados en O se escindieron de la muestra de hCG utilizando un kit Orela Glycan Release, y se separaron mediante NP-HPLC. Se digirieron muestras de los glicanos extraídos y reunidos (extraídos como antes) con diferentes sialidasas para determinar los enlaces. Esta degradación enzimática de glicanos se realizó utilizando alfa 2-3,6,8 sialidasa y alfa 2-3, sialidasa. Los glicanos digeridos enzimáticamente se separaron entonces nuevamente en la columna NP, y los O-glicanos se identificaron en la NP-HPLC utilizando estándares preparados. Los porcentajes relativos se calcularon y se muestran en la siguiente tabla (SA = Ácido Siálico).

Se encontró que los porcentajes relativos estaban en los intervalos 55% - 65% (por ejemplo, 59%) para la sialilación a2,3; y 35 a 45% (por ejemplo, 41%) para la sialilación a2,6.

Ejemplo 8D Cuantificación de cantidades relativas de estructuras sialiladas mono-, di-, tri- y tetra-antenariasUsando técnicas conocidas, se midieron las cantidades porcentuales relativas de estructuras mono-, di-, tri- y tetrasialiladas en glicanos extraídos de rhCG purificada (las tres muestras usadas en el Ejemplo 8C).

Cada muestra de rhCG se inmovilizó (bloque de gel), se lavó, se redujo, se alquiló y se digirió con PNGasa F durante la noche. A continuación, se extrajeron los N-glucanos y se procesaron. Los N-glucanos para el análisis de NP-HPLC y WAX-HPLC se marcaron con el fluoróforo 2AB como se detalló en Royle et al.

Se llevó a cabo HPLC de intercambio aniónico débil (WAX) para separar los N-glucanos por carga (Ejemplo 8C) como se explican en Royle et al., con un patrón de N-glicano de fetuína como referencia. Los glucanos se eluyeron según el número de ácidos siálicos que contuvieron. Todas las muestras incluyeron estructuras mono(1S), di(2S), tri(3S) y tetra(4S)-sialiladas. Se descubrió que las cantidades relativas de estructuras sialiladas estaban en las siguientes relaciones (1S:2S:4S:4S): 0,1-4%: 35-45%: 0,5-8%: 0-1 %.

Un ejemplo preferido, 080019-19, incluyó estructuras mono(1S), di(2S), tri(3S) y tetra(4S)-sialiladas. Las cantidades relativas de estructuras sialiladas estaban en las siguientes relaciones (1S:2S:4S:4S): 0,1-4%: 35-45%: 0,5-8%: 0-1 %.

Ejemplo 9 Determinación de las velocidades de aclaramiento metabólico de rhCG

Para determinar la velocidad de aclaramiento metabólico (MCR) de muestras de Per.C6 hCG modificadas usando a2,3- sialiltransferasa (por ejemplo Ejemplo 5a, 5b), a ratas hembra conscientes (3 animales por clon) se le inyectó en la vena de la cola en el tiempo cero un bolo de rhCG (1 - 10 pg/rata, basado en cuantificación de muestras por ELISA, DRG EIA 1288). Se tomaron muestras de sangre (400 pl) de la punta de la cola 1,2, 4, 8, 12, 24 y 32 horas después de la inyección de la muestra de prueba. Se recogió suero por centrifugación, y se ensayó para el contenido de hCG por ELISA (DRG EIA 1288). La MCR de muestras de Per.C6 hCG modificadas usando a2,3-sialiltransferasa mostró que la vida media fue similar al estándar (Figura 5). La Figura 6 muestra que otras muestras de hCG modificadas utilizando a2,3-sialiltransferasa pueden tener una vida media mejorada en comparación con el estándar (Figura 6).

Ejemplo 10 - Bioensayo de hCG según USP

Se llevó a cabo un bioensayo de hCG para evaluar la actividad específica de hCG. La actividad se midió según USP (Monografías USP: Chorionic Gonadotropin, USPC Official 8/1/09-11/30/09), utilizando Ovitrelle como estándar. Ovitrelle tiene una actividad biológica de 26000 Ul/mg (Curr Med Res Opin. Dic 2005; 21(12): 1969 - 76). El límite de aceptación fue >21 000 UI de hCG/mg. La actividad biológica de una muestra de hCG recombinante derivada de una línea celular humana diseñada con a2,3-sialiltransferasa (que tiene un contenido de ácido siálico de 19,1 mol/mol -véase el Ejemplo 8) fue 27.477 UI de hCG/mg.

Ejemplo 11 Resumen de la producción y purificación

Se desarrolló un procedimiento para producir hCG recombinante en células PER.C6 que se cultivaron en suspensión en medio sin suero. El procedimiento se describe a continuación, y se aplicó a varias líneas celulares PER.C6 productoras de hCG.

Se preparó hCG recombinante a partir del clon a2,3 usando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976).

Para la producción de PER.C6-hCG, las líneas celulares se adaptaron a un medio sin suero, es decir, Excell 525 (JRH Biosciences). Las células se cultivaron en primer lugar para formar una monocapa 70%-90% confluente en un matraz de cultivo T80. En la pasada, las células se resuspendieron en el medio libre de suero, Excell 525 L-glutamina 4 mM, a una densidad celular de 0,3x106células/ml. Se pusieron 25 ml de suspensión celular en un matraz agitador de 250 ml, y se agitaron a 100 rpm a 37 °C en 5% de CO2. Tras alcanzar una densidad celular > IxI06 células/ml, las células se subcultivaron hasta obtener una densidad celular de 0,2 o 0,3x106 células/ml, y se cultivaron adicionalmente en frascos agitadores a 37 °C con un 5% de CO2 y 100 rpm.

Para la producción de hCG, las células se transfirieron a un medio de producción sin suero, es decir, VPRO (JRH Biosciences), que soporta el crecimiento de células PER.C6 hasta densidades celulares muy altas (normalmente > 107 células/ml en un cultivo por lotes). Las células se cultivaron primero en > 1 x 106 células/ml en Excell 525, después, se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm, y posteriormente se suspendieron en medio VPRO L-glutamina 6 mM a una densidad de 1 x 106 células/ml. A continuación, las células se cultivaron en un matraz agitador durante 7-10 días a 37 °C, 5% de CO2 y 100 rpm. Durante este periodo, las células crecieron hasta una densidad de > 107 células/ml. El medio de cultivo se recogió después de que la viabilidad celular empezara a disminuir. Las células se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm, y el sobrenadante se utilizó para la cuantificación y purificación de hCG. La concentración de hCG se determinó utilizando ELISA (DRG EIA 1288).

Posteriormente, la purificación de hCG se llevó a cabo usando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976). Esto se logró por cromatografía en DEAE celulosa, filtración en gel en Sephadex G100, cromatografía de adsorción en hidroxiapatita y electroforesis preparativa en poliacrilamida.

Durante todos los procedimientos cromatográficos, la presencia de hCG recombinante inmunorreactiva se confirmó por RIA (DRG EIA 1288) e IEF (Ejemplo 6).

Referencias

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69(2), 379-389.

SEQ ID 1

Polipéptido de gonadotropina coriónica humana alfa

Número de acceso AH007338

Secuencia nucleotídica de hCG alfa

1 ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGT

GTTTCTGCAT

61 GTTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACA

GGAAAACCCA

121 TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT

CTCTAGAGCA

181 TATCCCACTC CACTAAGGTC CAAGAAGACG ATGTTGGTCC AAAAGAAC GT

CACCTCAGAG

241 TCCACTTGCT GTGTAGCTAA AT CATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG

TTTCAAAGTG

301 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTA A

Secuencia proteica de hCG alfa

1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS C E L T N IT IA I EKEECRFCIS INTTWCAGYC

YTRDLVYKDP

61 ARPKIQ KTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSD3T

DCTVRGLGPS

121 YCSFGEMKE

SEQ ID 2

Polipéptido de gonadotropina coriónica humana beta

Número de acceso NP_000728

Secuencia nucleotídica de hCG beta

Secuencia nucleotídica

1 ATGGAGATGT TCCAGGGGCT GCTGCTGTTG CTGCTGCTGA GCATGGGCGG GACATGGGCA

61 TCCAAGGAGC CGCTTCGGCC ACGGTGCCGC CCCATCAATG CCACCCTGGC TGTGGAGAAG

121 GAGGGCTGCC CCGTGTGCAT CACCGTCAAC ACCACCATCT GTGCCGGCTA CTGCCCCACC

181 ATGACCCGCG TGCTGCAGGG GGTCCTGCCG GCCCTGCCTC AGGTGGTGTG CAACTACCGC

241 GATGTGCGCT TCGAGTCCAT CCGGCTCCCT GGCTGCCCGC GCGGCGTGAA CCCCGTGGTC

301 TCCTACGCCG TGGCTCTCAG CTGTCAATGT GCACTCTGCC GCCGCAGCAC CACTGACTGC

3 61 GGGGGTCCCA AGGACCACCC CTTGACCTGT GATGACCCCC GCTTCCAGGA CTCCTCTTCC

421 TCAAAGGCCC CTCCCCCCAG CCTTCCAAGT CCATCCCGAC TCCCGGGGCC CTCGGACACC

4 81 CCGATCCTCC CACAATAA

Secuencia proteica de hCG beta

1 MEMFQGLLLL LLLSMGGTWA 3KEPLRPRCR P INATLAVEK EGCPVCITVN TTIC AG YCPT

61 MTRVLQGVLP ALPQ W C N YR DVRFESIRLP GCPRGVNPW SYAVALSCQC ALCRRSTTDC

121 GGPKDHPLTC DDPRFQD5SS SKAPPPSLFS PSRLPGPSDP P IL P Q

SEQ ID 3

Beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4

Número de acceso L23767

Secuencia nucleotídica de ST3GAL4

1 ATGTGTCCTG CAGGCTGGAA GCTCCTGGCC ATGTTGGCTC TGGTCCTGGT CGTCATGGTG

61 TGGTATTCCA TCTCCCGGGA AGACAGGTAC ATCGAGCTTT TTTATTTTCC CATCCCAGAG

121 AAGAAGGAGC CGTGCCTCCA GGGTGAGGCA GAGA G CAA G G CCTCTAAGCT CTTTGGCAAC

181 TACTCCCGGG ATCAGCCCAT CTTCCTGCGG GTTGAGGATT ATTTCTGGGT CAAGACGCCA

241 TCTGCTTACG AGCTGCCCTA TGGGACCAAG GGGAGTGAGG ATCTGCTCCT CCGGGTGCTA

3 01 GCCATCACCA GCTCCTCCAT CCCCAAGAAC ATCCAGAGCC TCAGGTGCCG CCGCTGTGTG

361 GTCGTGGGGA ACGGGCACCG GCTGCGGAAC AGCTCACTGG GAGATGCCAT CAACAAGTAC

421 GATGTGGTCA TCAGATTGAA CAATGCCCCA GTGGCTGGCT ATGAGGGTGA CGTGGGCTCC

4 81 AAGACCACCA TGCGTCTCTT CTACCCTGAA TCTGCCCACT TCGACCCCAA AGTAGAAAAC

541 AACCCAGACA CACTCCTCGT CCTGGTAGCT TTCAAGGCAA TGGACTTCCA CTGGATTGAG

601 ACCATCCTGA GTGATAAGAA GCGGGTGCGA AAGGGTTTCT GGAAACAGCC TCCCCTCATC

661 TGGGATGTCA ATCCTAAACA GATTCGGATT CTCAACCCCT TCTTCATGGA GATTGCAGCT

721 GACAAACTGC TGAGCCTGCC AATGCAACAG CGACGGAAGA TTAAGCAGAA GCCCACCACG

781 GGCCTGTTGG CCATCACGCT GGCCCTCCAC CTCTGTGACT TGGTGCACAT TGCCGGCTTT

841 GGCTACCCAG ACGCCTACAA CAAGAAGCAG ACCATTCACT ACTATGAGCA GATCACGCTC

901 AAGTCCATGG CGGGGTCAGG CCATAATGTC TCCCAAGAGG CCCTGGCCAT TAAGCGGATG

961 CTGGAGATGG GAGCTATCAA GAACCTCACG TCCTTCTGA

Secuencia proteica de ST3GAL4

1 MCPAGWKLLA M LALVLW M V WYSISREDRY IE L F Y F P I PE RKEPCLQGEA ESKASKLFGN

61 YSRD Q PIFLR LEDYFWVKTP 5AYELPYGTK GSEDLLLRVL A IT 5 S 5 IP K N IQSLRCRRCV

121 WGNGHRLRN SSLGDAINKY D W IR L N N A P VAGYEGDVG3 KTTMRLFYPE SAHFDPKVEN

181 NPDTLLVLVA FKAMDFHWIE TILSD KKRVR KGFWKQPPLI WDVNPKQIRT LNPFFM EIAA

241 DKLLSLPMQQ PRKIKQKPTT GLLATTLALH LCDLVHIAGF GYPDAYNKRQ T IH Y Y E Q IT L

301 KSMAGSGHNV SQEALAIKRM LEMGAIKNLT SF

SEQ ID 4

Beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1

Número de acceso NM_003032

Secuencia nucleotídica de ST6GAL1

1 ATGATPCACA CCAACCTGAA GAAAAAGTTC AGCTGCGGCG PCCTGGTCI'P TCPTCPGTTP 61 GCAGTCATCP GTGGGTGGAA GGAAAAGAAG AAAGGGAGTT ACTATGATPC CTPTAAATTG 121 CAAACCAAGG AATGCCAGGT GGTAAAGAG1 CTGGGGAAAT 1GGCCATGGG GTCTGAGTCC 181 CAGTCPGTAP CCTCAAGCAG CACCCAGGAC CCCCACAGGG GCCGCCAGAC CC1CGGCAG1 241 CGCAGAGGCC TAGCCAAGGC CAAACCAGAG GCCTCCTTCC AGGTGTGGAA CAAGGACAGC 301 TCTTCCAAAA ACCPTATCCC GAGGCTGCAA AAGATCGGGA AGAATGACCG AAGCATGAAC 361 AAGTACAAAG TGTCCTACAA GGGGCCAGGA CCAGGCATCA AGTGCAGTGC AGAGGCCCTG 421 CGCTGCCACC TCCGGGACCA 1GTGAATGTA TCCATGGTAG AGGTCACAGA TTYTCCCTTC 481 AATACCTCTG AATGGGAGGG PTATCTGCCC AAGGAGAGCA 1TAGGACCAA GGCTGGGCCP 541 TGGGGCAGGT GTGCTGT1GT GGCGTCAGCG GGATC1CTGA AGTCC1CCCA AC1AGGCAGA 601 GAAA1CGATG ATCA1GACGC AGGCCTGAGG GIGAAIGGGG CACCCACAGC CAACT1CCAA 661 CAAGA1GTGG GCACAAAAAC YACCATTCGC CTGATGAACT CTCAGYTGGY TACCACAGAG 721 AAGCGCTTCC TCAAAGACAG TTTGTACAAG GAAGGAATCC GAATTGTATG GGACCCATCG 781 GTATACCACT CAGATATCCC AAAGTGG1AC CAGAA1CCGG ATTATAATTP GTTTAACAAC 841 TACAAGACTT ATCGTAAGCT GCACCCCAAG CAGCCCGTTT ACATCCTCAA GCCCCAGATG 901 CCTTGGGAGC TATGGGACAT 1CTTCAAGAA ATCTCCCCAG AAGAGATTCA GCCAAACCCC 961 CCATCCTCTG GGAYGCTYGG YATCATCATC ATGATGACGC YGTGTGACCA GGYGGAYATY 1021 YATGAGYTCC TCCCATCCAA GCGCAAGACT GACGTGTGCT ACTAC1ACCA GAAGT1CTTC 1081 GATAGGGCCT GCACGAGGGG GGCCTACCAC CCGCTGCTCT ATGAGAAGAA TTTGGGGAAG 1141 CATC1CAACC AGGGCACAGA YGAGGACATC TACCTGCTTG GAAAAGCCAC ACTGCCTGGC 1201 TTCCGGñCCA PYCACTGCTA A

Op-

Secuencia proteica de ST6GAL1

1 MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF A V IC W K E R K KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS

61 QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWMKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN

121 KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVWV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP

181 W GRCAWSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE

241 KRFLKDSLYN EG ILIVW DPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYTT.KPQM

301 PWELWDILQE IS P E E IQ P N P P S S G M LG III MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF

361 DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende gonadotropina coriónica humana recombinante (hCG) que comprende a2,3-sialilación y a2,6-sialilación, en la que la hCG recombinante incluye estructuras mono, di, tri y tetrasialiladas.

2. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la hCG recombinante se produce o expresa en una línea celular humana.

3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que la línea celular se modifica utilizando a2,3-sialiltransferasa.

4. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la hCG recombinante incluye a2,6 sialilación proporcionada por la actividad de sialiltransferasa endógena.

5. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la hCG recombinante tiene cantidades relativas de estructuras sialiladas en la relación 0,2-1 estructuras mono-sialiladas: 35-40 estructuras di-sialiladas: 2,5-7 estructuras tri-sialiladas: 0,5-1 estructuras tetra-sialiladas.

6. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además FSH y/o LH.

7. hCG recombinante que incluye a2,3- y a2,6-sialilación, en la que la hCG recombinante incluye estructuras mono, di, tri y tetrasialiladas.

8. hCG recombinante según la reivindicación 7 producida o expresada en una línea celular Per.C6, en la que la línea celular se ha modificado utilizando a2,3-sialiltransferasa.

9. hCG recombinante que incluye a2,3- y a2,6-sialilación producida o expresada en una línea celular Per.C6, en la que la línea celular se ha modificado utilizando a2,3-sialiltransferasa.

10. hCG recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, que incluye ácidos siálicos unidos en a2,6 proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena.

11. Una composición farmacéutica que comprende hCG recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. Una composición farmacéutica según la reivindicación 11, que comprende además FSH y/o LH.

13. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 11 o 12, para su uso en el tratamiento de la infertilidad.