TW201632198A - 藥學製劑 - Google Patents

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Abstract

包含重組hCG(r hCG)之製劑。

Description

藥學製劑 發明領域
本發明係有關於用於治療不孕症之促性腺激素。尤其係有關於人類絨毛膜促性腺激素(hCG)。
發明背景
促性腺激素係調節男性與女性的性腺功能之一群異型二聚體醣蛋白荷爾蒙。其等包括濾泡刺激素(FSH)、黃體成長激素(LH)及絨毛膜促性腺激素(CG)。
人類絨毛膜促性腺激素(hCG)係天然地由腦下垂體前葉所分泌，及其功能係支撐濾泡發育與排卵。hCG包含亦為其他醣蛋白荷爾蒙LH與FSH所共有之一種92個胺基酸的α次單元，及hCG所特有及決定荷爾蒙特異性之一種145個胺基酸的β次單元。各種次單元係藉由添加複合醣殘基而進行後轉譯改質。α次單元在第52與78個胺基酸含有2-N-鍵結型醣基化位址，β次單元在第13與30個胺基酸含有2-N-鍵結型醣基化位址及在第121、127、132與138個胺基酸含有四個O-鍵結型醣基化位址。
多年來已在不孕症治療中使用萃取自孕婦尿液 的hCG[輝凌(Ferring)公司之柯雷岡(Choragon)]。自尿液萃取hCG之生產作用涉及收集與處理大量的尿液。可取得一種重組形式的hCG艾澤(Ovitrelle)(雪蘭諾(Serono)公司)。其係在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現。已知的重組hCG產物所具有的藥物動力學廓型係不同於自人類尿液所生產的hCG。擁有更準確複製或模擬自人類尿液所生產的產物之藥物動力學廓型之一種hCG產物係有利的。
在hCG製劑存在顯著的非均一性，其係與不同異構體的存在量之差異相關。個別的hCG異構體展現相同的胺基酸序列，但差異在於其等經後轉譯改質的程度；特定異構體之特徵在於醣分支結構之非均一性與所納入之不同量的唾液酸(一種末端糖)，該二者似乎均影響該特異性異構體的生物活性。
天然hCG的醣基化作用非常複雜。天然所衍生的腦下垂體hCG中之醣基，可含有可包括二、三與四觸角醣基的組合物之廣範圍的結構。該等醣基可進行進一步的改質作用：核心海藻糖基化作用、等分葡萄糖胺、以乙醯基乳糖胺延伸之鏈、部分或完全的唾液酸糖苷化作用、具α 2,3與α 2,6鍵結之唾液酸糖苷化作用及以硫酸化半乳糖取代半乳糖。而且，尚存在個別醣基化位址的醣基結構分布之間之差異。
重組hCG(“rhCG”)產物之醣基化作用，係反映宿主細胞株中所存在的醣苷基轉移酶之範圍。現存的rhCG產物艾澤(Ovitrelle)，係衍生自工程化中國倉鼠卵巢細胞(CHO 細胞)。相較於在衍生自尿液的天然產物中所發現者，CHO所衍生的rhCG中之醣基改質範圍較為有限。在CHO所衍生的rhCG中所發現之醣基非均一性降低之實例，係包括缺少等分葡萄糖胺及核心海藻糖基化作用與乙醯基乳糖胺延伸作用之含量降低。此外，CHO細胞僅能使用α 2,3鍵結添加唾液酸(Kagawa等人於1988年乙文、Takeuchi等人於1988年乙文、Svensson等人於1990年乙文)。此係與所含有的醣基具有α 2,3與α 2,6鍵結型唾液酸的混合物之天然所產生的hCG不同。
當相較於腦下垂體、血清或停經後尿液之FSH時，已顯明一種重組FSH製劑(歐嘉隆(Organon)公司)所具有之等電點(pI)低於4的FSH(視為酸性異構體)之量不同(Ulloa-Aguirre等人於1995年乙文)。相較於重組產物果納芬(Gonal-f)(雪蘭諾(Serono)公司)與保妊康(Puregon)(歐嘉隆(Organon)公司)(Andersen等人於2004年乙文)，尿液FSH製劑中之酸性異構體的量顯著較高。其必定反映在rFSH中之較低的唾液酸莫耳含量，因FSH中之經硫酸鹽改質之帶負電醣基的含量低。該二種商品化FSH產物之特性在於唾液酸含量係低於天然FSH，及因此必定反映製程中之一限制(Bassett與Driebergen於2005年乙文)。已就來自多種來源的物質記錄FSH的循環壽命。該等物質中之一部分已基於如特徵在於其等的pI之整體分子電荷而份化，其中酸性越高係相等於負電越高。整體分子電荷之主要貢獻者係各FSH分子的唾液酸總含量。例如，rFSH(歐嘉隆(Organon)公司) 所具有的唾液酸含量約為8莫耳/莫耳，而尿液所衍生的FSH具有較高的唾液酸含量(deLeeuw等人於1996年乙文)。大鼠中之對應的血漿廓清速率為0.34與0.14毫升/分鐘(Ulloa-Aguirre等人於2003年乙文)。在將一重組FSH試樣分成高與低pI部分之另一實例中，高pI(唾液酸含量較低)部分之活體內效力降低及其具有較短的血漿半衰期(D’Antonio等人於1999年乙文)。本案申請者已發現，類似於FSH，CHO所衍生之已知重組hCG產物(如艾澤(Ovitrelle))所具有的等電點(pI)低於4(視為酸性異構體)之hCG的量亦低於尿液hCG，亦反映已知的rhCG產物之唾液酸含量係低於尿液hCG。
hCG與rhCG的唾液酸總含量並非可直接相比，因唾液酸一般以二種方式鍵結。腦下垂體/血清/尿液之hCG同時含有α 2,3與α 2,6鍵結型唾液酸，及以前者佔多數。然而，CHO細胞所衍生的重組體僅含有α 2,3(Kagawa等人於1988年乙文、Takeuchi等人於1988年乙文、Svensson等人於1990年乙文)。換言之，使用CHO系統所表現之重組蛋白的末端唾液酸鍵結類型，將與其等的天然對應體不同。此係在天然與目前的重組產物之間除了重組產物具有較低的整體唾液酸含量之外的另一差異，及為用於藥學用途的生物製劑生產作用之一相重要考量，因醣部分可能影響該分子的藥理屬性。
因此擁有更準確複製或模擬自人類尿液所生產的產物之生理化學與藥物動力學廓型之一種rhCG產物係有 利的。有利地係擁有一或多項優於已知重組產物的藥物動力學性質之一種rhCG產物。
發明概要
如本發明提供包括α 2,3唾液酸糖苷化作用與α 2,6唾液酸糖苷化作用及選擇性地α 2,8唾液酸糖苷化作用之重組hCG(“rhCG”或“rechCG”)。如本發明之rhCG(或rhCG製劑)可具有15莫耳/莫耳以上的唾液酸含量[以唾液酸莫耳數相對於蛋白質莫耳數之比例表示]，例如自15莫耳/莫耳至25莫耳/莫耳，例如自17莫耳/莫耳至24莫耳/莫耳，例如自17.7莫耳/莫耳至23莫耳/莫耳，例如自18莫耳/莫耳至22莫耳/莫耳，例如自19莫耳/莫耳至21莫耳/莫耳，例如自19莫耳/莫耳至20莫耳/莫耳。如本發明之rhCG(或rhCG製劑)所具有的總唾液酸糖苷化作用中之10%以上可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用。例如，總唾液酸糖苷化作用中之45%至80%可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用，例如總唾液酸糖苷化作用中之50%至70%可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用，例如總唾液酸糖苷化作用中之55至65%可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用，例如總唾液酸糖苷化作用中之65至85%可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用。本發明之rhCG(或rhCG製劑)所具有的總唾液酸糖苷化作用中之50%以下可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用。例如，總唾液酸糖苷化作用中之20至55%可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用，例如，總唾液酸糖苷化作用中之30至50%可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用，例如，總唾液酸糖苷化作用 中之35至45%可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用。例如總唾液酸糖苷化作用中之15至35%可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用。本發明之rhCG(或rhCG製劑)所具有的總唾液酸糖苷化作用中之5%以下可為α 2,8-唾液酸糖苷化作用，例如總唾液酸糖苷化作用中之0至4%及如0.1至4%可為α 2,8-唾液酸糖苷化作用。本發明之rhCG(或rhCG製劑)可不具有α 2,8-唾液酸糖苷化作用。
本案申請者已研發出一種自人類所衍生的重組hCG，其廓型係比CHO所衍生的產物艾澤(Ovitrelle)更具酸性，及其具有較高的唾液酸含量。本案申請者的研究顯示唾液酸鍵結類型即α 2,3-或α 2,6-，對於hCG的生物廓清作用可具有重大的影響。相對於CHO細胞株，人類細胞株所表現之重組hCG可具有藉由α 2,3與α 2,6二種鍵結所連接的唾液酸。
具有α 2,3與α 2,6鍵結型唾液酸的混合物之重組hCG，係藉由工程設計人類細胞株以同時表現rhCG與α 2,3唾液酸轉移酶(第4、5a及5b例)而製成。所表現的產物係具高度酸性及具有α 2,3與α 2,6鍵結型唾液酸的混合物；後者係藉由內源性唾液酸轉移酶活性所提供。其具有優於習用CHO細胞中所表現的rhCG之二項優點：首先因為該二唾液酸轉移酶的合併活性，該物質的唾液酸糖苷化程度較高；及其次該物質更準確地類似天然的hCG。相較於僅產生α 2,3鍵結型唾液酸及具有減少的唾液酸含量之CHO細胞所衍生的重組產物而言，其似乎在生物學上更加適當。
本案申請者已意外地發現，相較於其他重組產物，本發明之rhCG可更準確複製或模擬天然的人類尿液產物之生理化學與藥物動力學廓型。換言之，本發明之rhCG可更接近“天然的”hCG。其在給藥等方面可具有顯著優點。此外，對於可能希望雖是人造但仍盡可能“天然”的療法之病患而言，一種更“天然的”或更“人類”的產物可能更適合需要。相較於其他重組產物而言，具有更接近天然(如人類尿液)hCG的醣(如醣基)結構之一種重組hCG產物，可能具有其他優點(如藥物動力學優點)。
本發明因此係一種重組形式的hCG，其具有α 2,3與α 2,6唾液酸的混合物及因此更準確地近似天然hCG。預期在控制性卵巢刺激作用、在IVF技術及誘發排卵中使用該化合物，將產生相較於現存的重組產物而言之更天然的卵巢刺激作用。
如本發明提供包括α 2,3唾液酸糖苷化作用與α 2,6唾液酸糖苷化作用之重組hCG(“rhCG”或“rechCG”)(及/或一種重組hCG製劑)。該rhCH或rhCG製劑可選擇性地進一步包括α 2,8唾液酸糖苷化作用。
在此之“重組hCG製劑”一詞，係包括用於如藥學用途之包含重組hCG的一製劑。在本發明的實施例中，該rhCG可以單一異構體之形式或以多種異構體的一混合物形式存在。
如本發明之rhCG(或rhCG製劑)可具有15莫耳/莫耳以上的唾液酸含量[以唾液酸莫耳數相對於蛋白質莫耳 數之比例表示](第8例)，例如自15莫耳/莫耳至25莫耳/莫耳，例如自17莫耳/莫耳至24莫耳/莫耳，例如自17.7莫耳/莫耳至23莫耳/莫耳，例如自18莫耳/莫耳至22莫耳/莫耳，例如自19莫耳/莫耳至21莫耳/莫耳，例如自19莫耳/莫耳至20莫耳/莫耳。本發明的rhCG可在人類細胞株中產生或表現。
如本發明之rhCG(或rhCG製劑)所具有的總唾液酸糖苷化作用中之10%以上可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用。例如，總唾液酸糖苷化作用中之20、30、40、45、50、55、60、70、80或90%以上可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用。該rhCG(或rhCG製劑)所包括的α 2,3-唾液酸糖苷化之量可為總唾液酸糖苷化作用中之自45%至80%，例如總唾液酸糖苷化作用中之50%至70%，例如總唾液酸糖苷化作用中之55至65%。該rhCG(或rhCG製劑)所包括的α 2,3-唾液酸糖苷化之量可為總唾液酸糖苷化作用中之自65至85%，例如總唾液酸糖苷化作用中之自70至80%，例如總唾液酸糖苷化作用中之自71至79%。本發明之rhCG(或rhCG製劑)所具有的總唾液酸糖苷化作用中之50%以下可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用。例如總唾液酸糖苷化作用中之45、40、30、20、10、5%以下可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用。該rhCG(或rhCG製劑)所包括的α 2,6-唾液酸糖苷化之量可為總唾液酸糖苷化作用中之自20至55%，例如總唾液酸糖苷化作用中之30至50%，例如總唾液酸糖苷化作用中之35至45%。該rhCG(或rhCG製劑)所包括的α 2,6-唾液酸糖苷化之量可為總唾液酸 糖苷化作用中之自15至35%，例如總唾液酸糖苷化作用中之自20至30%，例如總唾液酸糖苷化作用中之自21至29%。本發明之rhCG(或rhCG製劑)所具有的總唾液酸糖苷化作用中之5%以下可為α 2,8-唾液酸糖苷化作用。例如總唾液酸糖苷化作用中之2.5%以下可為α 2,8-唾液酸糖苷化作用。該rhCG(或rhCG製劑)所包括的α 2,8-唾液酸糖苷化之量可為總唾液酸糖苷化作用中之自0至4%，例如總唾液酸糖苷化作用中之0.1至4%，例如總唾液酸糖苷化作用中之自0.5至3%，例如總唾液酸糖苷化作用中之自0.5至2.5%。本發明之rhCG(或rhCG製劑)可不具有α 2,8-唾液酸糖苷化作用。唾液酸糖苷化作用一詞係指存在於hCG醣結構上之唾液酸殘基的量。α 2,3-唾液酸糖苷化作用係指在2,3位置之唾液酸糖苷化作用(如技藝中眾所周知)，而α 2,6唾液酸糖苷化作用係位於2,6位置(亦如技藝中眾所周知)。因此，“總唾液酸糖苷化作用中可為α 2,3唾液酸糖苷化作用的百分比”，係指存在於hCG的唾液酸殘基總數中之在2,3位置唾液酸糖苷化的百分比。“總唾液酸糖苷化作用中可為α 2,6唾液酸糖苷化作用的百分比”一詞，係指存在於hCG的唾液酸殘基總數中之在2,6位置唾液酸糖苷化的百分比。
如本發明之rhCG(或rhCG製劑)所具有的唾液酸含量(每個hCG分子之唾液酸糖苷化的量)可為以質量為基礎(以蛋白的質量而非蛋白加上醣的質量為基礎)之6%以上(如介於6%與15%之間、如介於7%與13%之間、如介於8%與12%之間、如介於11%與15%之間、如介於12%與14%之 間)。
在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現的重組hCG，則僅包括α 2,3唾液酸糖苷化作用。
本發明的rhCG可在人類細胞株中產生或表現。此可簡化(及使其更有效率)生產方法，在對於例如細胞生長培養基進行操縱與控制以保留唾液酸糖苷化方面，可能不像已知製程那般具關鍵性。該方法亦可能更有效率，因為所產生的鹼性rhCG係少於已知rhCG產物之生產作用；產生酸性較高的rhCG，及鹼性hCG的分離作用/移除作用較不會造成問題。rhCG可在一種Per.C6細胞株、一種Per.C6所衍生的細胞株或一種改質的Per.C6細胞株中產生或表現。可使用α 2,3-唾液酸轉移酶將該細胞株改質。rhCG可包括藉由[該細胞株的]內源性唾液酸轉移酶活性所提供之α 2,6鍵結型唾液酸(α2,6唾液酸糖苷化作用)。任擇地或另外地，可使用α 2,6-唾液酸轉移酶將該細胞株改質。
可使用α 2,3-唾液酸轉移酶產生rhCG。該rhCG可包括藉由內源性唾液酸轉移酶活性所提供之α 2,6鍵結型唾液酸(α2,6唾液酸糖苷化作用)。可使用α 2,3-及/或α 2,6-唾液酸轉移酶產生rhCG。
如本發明之另一方面，提供生產如此述的rhCG及/或一種rhCG製劑(如本發明之一方面)之一種方法，其包括在一種人類細胞株中產生或表現rhCG之步驟，例如在一種Per.C6細胞株、一種Per.C6所衍生的細胞株或一種改質的Per.C6細胞株例如一種已使用α 2,3-唾液酸轉移酶加以改 質之細胞株中。
rhCG結構含有醣基部分。如技藝中眾所周知地可發生分支，以至於該醣基可具有1、2、3、4個以上的末端糖殘基或“觸角”。本發明的rhCG可具有在單觸角及/或二觸角及/或三觸角及/或四觸角結構上存在唾液酸糖苷化作用之醣基。該rhCG可包括單唾液酸糖苷化、二唾液酸糖苷化、三唾液酸糖苷化及四唾液酸糖苷化醣基結構，例如依如下的相對量：0.1至4%單唾液酸糖苷化；35至45%二唾液酸糖苷化；0.5至8%三唾液酸糖苷化及0至1%四唾液酸糖苷化(如藉由第8D例中所說明之帶電醣基的WAX分析所示)。本發明之重組hCG較佳包括單(1S)、二(2S)、三(3S)及四(4S)唾液酸糖苷化結構。唾液酸糖苷化結構的相對量較佳為下列之比例(1S：2S：4S：4S)：0.2-1%：35至40%：2.5至7%：0.5至1%(如藉由第8D例中所說明之帶電醣基的WAX分析所示)。
如本發明之另一方面，提供在一種人類細胞株中所產生(如表現)的rhCG。該rhCG可包括α 2,3-與α 2,6-唾液酸糖苷化作用。rhCG可在一種Per.C6細胞株、一種Per.C6所衍生的細胞株或一種改質的Per.C6細胞株中產生或表現。可使用α 2,3-唾液酸轉移酶將該細胞株改質。rhCG可包括藉由[該細胞株的]內源性唾液酸轉移酶活性所提供之α 2,6鍵結型唾液酸(α2,6唾液酸糖苷化作用)。任擇地或另外地，可使用α 2,6-唾液酸轉移酶將該細胞株改質。如本發明之rhCG(或rhCG製劑)可具有15莫耳/莫耳以上的唾液酸 含量[以唾液酸莫耳數相對於蛋白質莫耳數之比例表示]，例如自15莫耳/莫耳至25莫耳/莫耳，例如自17莫耳/莫耳至24莫耳/莫耳，例如自17.7莫耳/莫耳至23莫耳/莫耳，例如自18莫耳/莫耳至22莫耳/莫耳，例如自19莫耳/莫耳至21莫耳/莫耳，例如自19莫耳/莫耳至20莫耳/莫耳。該rhCG(或rhCG製劑)所具有的總唾液酸糖苷化作用中之10%以上可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用，例如總唾液酸糖苷化作用中之45%至80%可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用，例如總唾液酸糖苷化作用中之50%至70%可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用，例如總唾液酸糖苷化作用中之55至65%可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用。例如總唾液酸糖苷化作用中之65至85%可為α 2,3-唾液酸糖苷化作用。本發明之rhCG(或rhCG製劑)所具有的總唾液酸糖苷化作用中之50%以下可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用。例如，總唾液酸糖苷化作用中之20至55%可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用，例如總唾液酸糖苷化作用中之30至50%可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用，例如總唾液酸糖苷化作用中之35至45%可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用。例如總唾液酸糖苷化作用中之15至35%可為α 2,6-唾液酸糖苷化作用。本發明之rhCG(或rhCG製劑)所具有的總唾液酸糖苷化作用中之5%以下可為α 2,8-唾液酸糖苷化作用，例如總唾液酸糖苷化作用中之0至4%及如0.5至4%可為α 2,8-唾液酸糖苷化作用。本發明之rhCG(或rhCG製劑)可不具有α 2,8-唾液酸糖苷化作用。
如本發明之另一方面提供一種藥學組成物，其所 包含的rhCG係包括α 2,3-唾液酸糖苷化作用與α 2,6-唾液酸糖苷化作用(如上所說明)。該藥學組成物可進一步包含FSH及/或LH。
FSH可藉由技藝中已知的任一方式製得。如用於此之FSH係包括人類所衍生及重組的FSH。人類所衍生的FSH可藉由技藝中已知的任一方法自任一適當來源(如尿液)純化。FSH可為重組FSH，例如一種人類細胞株中所表現者。重組FSH之表現與純化方法係技藝中眾所周知。
LH可藉由技藝中已知的任一方式製得。如用於此之LH係包括人類所衍生及重組的LH。人類所衍生的LH可藉由技藝中已知的任一方法自任一適當來源(如尿液)純化。重組LH之表現與純化方法係技藝中所知。
該藥學組成物可用於治療不孕症，如用於例如協助生殖技術(ART)、誘發排卵或子宮內人工受精(IUI)。該藥學組成物可用於例如使用已知的hCG製劑之醫學適應症。本發明亦提供此述之rhCG及/或一種rhCG製劑(如本發明的一方面)在治療不孕症或在製造用於治療不孕症的一藥物之用途。本發明的藥學組成物可配製成供任一投藥途徑用之眾所周知的組成物，如口服、直腸、非經腸、透皮(如貼劑技術)、靜脈內、肌內、皮下、intrasusternal、陰道內、腹膜內、局部(散劑、軟膏劑或滴劑)或作為一種頰用或鼻用噴劑。一種典型的組成物包含一種藥學上可接受的載劑，諸如水溶液、無毒賦形劑，包括鹽類與防腐劑、緩衝劑等，如述於雷明頓製藥學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)乙書第15版(麥特出版公司(Matt Publishing Company)於1975年出版)第1405至1412頁與第1461至87頁及美國國家處方集(national formulary)XIV第14版(美國藥事協會(American Pharmaceutical Association)於1975年出版)等等。
適宜的含水與非水藥學載體、稀釋劑、溶劑或載劑之實例，係包括水、乙醇、多元醇(諸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纖維素與其適宜的混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射性有機酯類諸如油酸乙酯。
本發明的組成物亦可含有添加劑，諸如但不限於防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。可包括抗細菌與抗真菌劑以防止微生物生長，及包括例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。而且，包括等滲壓劑諸如糖、氯化鈉等可能適合需要。
在一些情況下，為達成長效，減緩自皮下或肌內注射之hCG(及若存在的其他有效成分)吸收作用係適合需要的。其可藉由使用水溶性不佳的晶質或非晶質物質之液體懸浮液而達成。hCG的吸收速率則依其溶解速率而定，其進而可依晶體大小與晶形而定。任擇地，藉由將hCG組合物溶解或懸浮於一種油載劑中，而達成延遲一種非經腸投藥的hCG組合物形式之吸收作用。
可藉由在生物可降解性聚合物諸如聚乳酸-聚甘醇酸中形成hCG(及若存在的其他藥劑)的微膠囊基質，而製造注射性儲存形式。依hCG相對於聚合物之比例及所用的 特定聚合物之性質而定，可控制hCG的釋出速率。生物可降解性聚合物之其他實例包括聚乙烯基吡咯啶酮、聚(原酸酯)、聚(酐)等。亦藉由將hCG截留在與身體組織可相容的脂質體或微乳液中，而製備儲存型可注射性配方。
例如可藉由過濾通過一種截留細菌式過濾器，或藉由納入無菌固態組成物形式的滅菌劑及其在使用前可溶解或分散於無菌的水或其他無菌的可注射性基質，而完成可注射性配方之滅菌。可注射性配方能以任一適宜的容器供應，如小瓶、預先充填式針筒、注射匣等。
可注射性配方能以具有含hCG(選擇性地含FSH、LH等)的藥學組成物之一產物形式供應。若有一種以上的有效成分(亦即hCG及如FSH或LH)，其等可適合分開或一起投藥。若分開投藥，該投藥作用可循序進行。該產物能以任一適當的包裝供應。例如，一產物可包括數個含有hCG、FSH或FSH與hCG二者的組合物之預先充填式針筒，該等針筒係包裝於一種泡殼包裝或其他構件以維持無菌性。一產物可選擇性地包括該hCG與FSH配方之使用說明書。
依據該領域之例行操作，調整該藥學組成物的不同組分之pH值與確切濃度。見GOODMAN與GILMAN之“治療學之藥理基礎(THEPHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES)”乙書第7版。在一個較佳的實施例中，本發明的組成物係以供非經腸投藥的組成物形式供應。用於製備非經腸配方的通用方法係技藝中所知，及述 於前述雷明頓：藥劑學之科學與應用(REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY)乙書第780至820頁。該非經腸組成物可以液態配方供應，或以在投藥之前方與無菌的可注射性基質混合之一固體形式供應。在一個特佳的實施例中，該非經腸組成物係以劑型單位形式供應，以求投藥之便利及劑量之均一性。
圖式簡單說明
現在將參照下列實例與所附圖式更詳細地說明本發明，其中：第1圖係顯示phCG α/β表現載體之一質體圖；第2圖係顯示α 2,3-唾液酸轉移酶(ST3GAL4)表現載體；第3圖係顯示α 2,6-唾液酸轉移酶(ST6GAL1)表現載體；第4圖顯示藉由以考馬斯藍(Coomassie Blue)染色之IEF，檢測如本發明之人類細胞株所衍生的重組hCG製劑中之rhCG異構體(第3、4道)，及與先前技術的製劑相比較(第1、2道)；第5圖係顯示經α 2,3-唾液酸轉移酶工程化的Per.C6hCG試樣之代謝廓清速率(MCR)；及第6圖係顯示經α 2,3唾液酸轉移酶工程化的Per.C6rhCG試樣之長期MCR。
第1、2與3圖：phCGα/β、pST3及pST6表現載體 之質體圖。CMV=細胞巨大病毒啟動子，BGHp(A)=牛生長荷爾蒙聚腺苷酸化序列，fl ori=fl複製起點，SV40=猿猴病毒40啟動子，Neo=新黴素抗性標記，Hyg=潮黴素抗性標記，SV40 p(A)=猿猴病毒40聚腺苷酸化序列，hCG α=人類絨毛膜性腺激素α多肽，hCG β=人類絨毛膜性腺激素β多肽，ST3GAL4=α2,3-唾液酸轉移酶，ST6GAL1=α2,6-唾液酸轉移酶，CoIEl=CoIEl複製起點，Amp=安比西林(ampicillin)抗性標記。
第4圖：藉由以考馬斯藍(CoomassieBlue)染色之IEF，檢測如本發明的組成物(第3道為10微克及第4道為15微克)及先前技術之CHO所衍生的組成物艾澤(Ovitrelle)(第1道為10微克的艾澤(Ovitrelle)及第2道為15微克的艾澤(Ovitrelle))中之rhCG異構體。帶狀係代表含有不同數目的唾液酸分子之hCG異構體。第4圖顯示經α 2,3-唾液酸轉移酶工程化之人類細胞株所衍生的重組hCG(如本發明之組成物)具有比艾澤(Ovitrelle)更具酸性之廓型。
第5圖：經α 2,3-唾液酸轉移酶工程化的Per.C6rhCG試樣之代謝廓清率。基於其等的IEF廓型，就其等的唾液酸含量挑選試樣。在零時在雌性大鼠(每個殖株3隻動物)的尾靜脈注入快速輸液的rhCG(1至10微克/大鼠)。在後續時間收集血液試樣，及藉由ELISA分析hCG含量。
第6圖：經α 2,3-唾液酸轉移酶工程化的Per.C6rhCG試樣之長期代謝廓清率。在零時在雌性大鼠(每個殖株3隻動物)的尾靜脈注入快速輸液的rhCG(1至10微克/ 大鼠)。在後續時間收集血液試樣，及藉由ELISA分析hCG含量。
較佳實施例之詳細說明 序列之選擇 人類hCG
依據Fiddes與Goodman(1979年乙文)，使用該基因之hCG α多肽的編碼區。該序列係以AH007338寄存，及在構建之時並無該蛋白質序列的其他變異體。該序列在此稱作序列辨識編號1。
依據Fiddes與Goodman(1980年乙文)，使用該基因之hCG β多肽的編碼區。該序列係以NP_000728寄存，及係與CGβ3、CGβ5及CGβ7的蛋白質序列相符。該序列在此稱作序列辨識編號2。
唾液酸轉移酶
α 2,3-唾液酸轉移酶-依據Kitagawa與Paulson(1994年乙文)，使用該基因之β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶4(α2,3-唾液酸轉移酶，ST3GAL4)的編碼區。該序列係以L23767寄存，及在此稱作序列辨識編號3。
α 2,6-唾液酸轉移酶-依據Grundmann等人(於1990年乙文)，使用該基因之β-半乳糖醯胺α-2,6-唾液酸轉移酶1(α2,6-唾液酸轉移酶，ST6GAL1)的編碼區。該序列係以NM_003032寄存，及在此稱作序列辨識編號4。
實例 第1例 hCG表現載體之構建
分別使用引子組合物CGa-fw與CGa-rev及CGb-fw與CGb-rec，藉由PCR擴增hCG α多肽(AH007338，序列辨識編號1)與hCG β多肽(NP_000728，序列辨識編號2)之編碼序列。
所產生之擴增後的hCG β DNA係以限制酶AscI與HpaI進行酶切，及插入至CMV所驅動之帶有一個新黴素篩選標記的哺乳類動物表現載體上之AscI與HpaI位址。類似地，以BamHI與NheI酶切hCG α DNA，及插入至已含有hCG β多肽DNA的表現載體上之BamHI與NheI位址。
使用載體DNA，將大腸桿菌(E.coli)的DH5 α菌株轉形。挑選菌落進行擴增反應，及自所包括的載體同時含有hCG α與β之數量中，挑選20個以進行定序。所有經挑選用於定序的菌落，皆含有如序列辨識編號1與序列辨識編號2之正確序列。選擇質體phCGA+B進行轉染作用(第1圖)。
第2例 ST3表現載體之構建
使用引子組合物2,3STfw與2,3STrev，藉由PCR擴增β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶4(ST3，L23767，序列辨識編號3)之編碼序列。
所產生之擴增後的ST3DNA係以限制酶BamHI與AflII進行酶切，及插入至CMV所驅動之帶有一個潮黴素抗性標記的哺乳類動物表現載體上之BamHI與AflII位址。該載體係如前述擴增及定序。殖株pST3#1(第2圖)含有如序列辨識編號3之正確序列及被挑選進行轉染作用。
第3例 ST6表現載體之構建
使用引子組合物2,6STfw與2,6STrev，藉由PCR擴增β-半乳糖醯胺α-2,6-唾液酸轉移酶1(ST6，NM_003032，序列辨識編號4)之編碼序列。
所產生之擴增後的ST6DNA係以限制酶BamHI與AflII進行酶切，及插入至CMV所驅動之帶有一個潮黴素抗性標記的哺乳類動物表現載體上之BamHI與AflII位址。 該載體係如前述擴增及定序。殖株pST6#11(第3圖)含有如序列辨識編號4之正確序列及被挑選用於轉染作用。
第4例 phCG A+B於PER.C6細胞中之穩定表現作用。殖株之轉染分離作用與篩選。
藉由表現來自單一質體之hCG的二個多肽鏈，而產生製造hCG之Per.C6殖株(見第1例)。
為獲得穩定的殖株，使用一種脂質體式轉染劑與phCGA+B構建體。在增補10%FCS與含有G418的Per.C6選擇培養基中，挑選穩定的殖株。在轉染作用之三週後，生長出具G418抗性的殖株。總共挑選389個殖株進行分離作用。在選擇培養基中培養分離殖株，直至緻密度為70至80%。使用一種hCG選擇性ELISA分析上清液的hCG蛋白質含量，及使用一種cAMP累積分析分析在選殖細胞株中之對於hCG受體的藥理活性。表現功能性蛋白的殖株(118)進行培養增殖至24孔、6孔及T80燒瓶。
測定來自47個殖株之物質的生產力與品質之研究，係在T80燒瓶中開始，以產生足夠的物質。細胞係在如前述的增補型培養基中培養7天，及收集上清液。使用hCG選擇性ELISA測定生產力。測定該物質的等電廓型(使用第6例所述之方法)。使用來自IEF的資訊，以挑選用於代謝廓清速率分析之殖株。挑選具有充分的生產力與品質之殖株進行唾液酸轉移酶工程技術。
第5a例 在過度表現α 2,3-唾液酸轉移酶的細胞中之唾液酸糖苷化水平增加。在表現hCG的PER.C6細胞中之pST3的穩 定表現作用；殖株之轉染分離作用與篩選。
製造高度唾液酸糖苷化hCG的Per.C6殖株，係藉由在業已表現hCG的二種多肽鏈之Per.C6細胞(見第4例)中表現來自個別質體的α 2,3唾液酸轉移酶(見第2例)而產生。就其等包括生產力、良好的生長廓型、製造功能性蛋白及所製造的hCG包括一些唾液酸糖苷化作用在內之特徵，而挑選如第4例所說明之自PER.C6®細胞所產生的殖株。
如先前於第4例中所述，產生穩定的殖株。將來自α 2,3-唾液酸轉移酶程序的殖株分離、增殖及分析。用於α 2,3-研究之最終殖株數目為5。讓α 2,3-唾液酸轉移酶殖株適應於無血清培養基與懸浮條件。
如前述，使用一種hCG選擇性ELISA、在一種hCG受體細胞株中的功能性反應、IEF，而分析殖株(第6例)。其等亦進行代謝廓清速率(第9例)與USP hCG生物分析(第10例)之評估。將結果與一種商品化重組hCG(雪蘭諾(Serono)公司之艾澤(Ovitrelle))及親代hCG Per.C6細胞株比較。代表性試樣係示於實例與圖式中。
總之，hCG連同α 2,3-唾液酸轉移酶在Per.C6細胞中之表現作用，造成唾液酸糖苷化hCG之水平係高於僅表現hCG的細胞。
第5b例 在表現hCG的PER.C6細胞中之pST3的穩定表現作用-一種不同的方法
如上所產生的α β異型二聚體(第4例)具有低的 唾液酸糖苷化水平，而造成非常鹼性的IEF廓型。如上述(第5a例)，hCG連同α 2,3-唾液酸轉移酶在Per.C6細胞中之表現作用，造成唾液酸糖苷化hCG之水平係高於僅表現hCG的細胞。
進行雙重轉染作用，而將hCG α與β次單元基因連同α 2,3唾液酸轉移酶酵素基因轉染進入懸浮細胞培養形式的Per.C6細胞中。在無血清條件下，藉由共同轉染hCG載體(第1例之α/β二者)與編碼α 2,3-唾液酸轉移酶的載體(第2例)，而產生細胞株。就其等包括生產力、良好的生長廓型、製造功能性蛋白及所製造的hCG包括一些唾液酸糖苷化作用在內之特徵，而挑選自PER.C6®細胞所產生的殖株。將殖株分離、增殖及分析。
如前述，使用一種hCG選擇性ELISA、在一種hCG受體細胞株中的功能性反應、IEF，而分析殖株(第6例)。其等亦進行代謝廓清速率(第9例)與USP hCG生物分析(第10例)之評估。將結果與一種商品化重組hCG(雪蘭諾(Serono)公司之艾澤(Ovitrelle))及親代hCG Per.C6細胞株比較。代表性試樣係示於實例與圖式中(見第6、9、10例、第4與5圖)。藉由殖株所產生的重組hCG(亦即如本發明之重組hCG)具有顯著增進的唾液酸糖苷化作用(亦即平均而言較多的hCG異構體具有數目較多的唾液酸)，相較於在無α 2,3-唾液酸轉移酶情況下所表現的hCG及艾澤(Ovitrelle)而言(見第6與例、第4圖)。
第6例 藉由等電聚焦法分析Per.C6所產生的hCG異構體之 等電點pI
電泳係界定為藉由一電場將帶電分子輸送通過一溶劑。生物分子通過一電場之移動性將依場強度、分子上的淨電荷、分子的尺寸與形狀、該分子所遷移通過之基質的離子強度與性質而定。
等電聚焦法(IEF)係以蛋白質的pI為基礎而用於分離蛋白質之一種電泳技術。pI係一蛋白不具有淨電荷及不會在電場中遷移之pH值。hCG異構體的唾液酸含量微妙地改變各異構體的pI點，可使用該技術而將其用於顯現來自各殖株的Per.C6 hCG異構體。
使用等電聚焦法，分析細胞培養上清液中之Per.C6所產生的hCG異構體之等電點。如第4、5a及5b例所述，產生來自Per.C6 hCG殖株之細胞培養基。
在pH 3.0至7.0的兩性電解質溶液中，在pH 3.0至7.0之梯度，在原始狀態下在含有5%聚丙烯醯胺的諾維科斯(Novex®)IEF凝膠上，分離Per.C6 hCG試樣。使用技藝中眾所周知之方法，使用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色而顯現蛋白質。
第4圖係顯示藉由以考馬斯藍(CoomassieBlue)染色之IEF，檢測如本發明的組成物(第3道為10微克及第4道為15微克)及先前技術之CHO所衍生的組成物艾澤(Ovitrelle)(第1道為10微克的艾澤(Ovitrelle)及第2道為15微克的艾澤(Ovitrelle))中之rhCG異構體。帶狀係代表含有不同數目的唾液酸分子之hCG異構體。使用該方法，辨識 出所產生的hCG異構體具有數目較多的唾液酸分子之殖株。第4圖顯示經α 2,3-唾液酸轉移酶工程化之人類細胞株所衍生的重組hCG(如本發明的組成物)具有比艾澤(Ovitrelle)更具酸性之廓型。
第7例 Per.C6 hCG的唾液酸鍵結之分析
使用一種凝集素式醣基分異方法，分析醣複合物。藉由該方法，可進行與硝化纖維素結合的醣蛋白與醣複合物之特徵分析。凝集素選擇性地辨識一特定部分，例如α 2,3鍵結型唾液酸。所用的凝集素係與類固醇半抗原長葉毛地黃配質複合，其促成結合型凝集素之免疫檢測。
使用標準SDS-PAGE技術，將來自一親代殖株(無附加的唾液酸轉移酶)與來自經α 2,3-唾液酸轉移酶工程化的一殖株之純化後的Per.C6 hCG分離。使用一種商品化重組hCG(雪蘭諾(Serono)公司之艾澤(Ovitrelle))作為一標準品。
依據製造商之說明書，使用DIG醣基分異作用套組(羅奇(Roche)公司型錄編號11 210 238 001)分析唾液酸。與西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)之陽性反應係指末端鍵結型(2-6)唾液酸。與朝鮮槐(Maackia amurensis)凝集素II(MAA)之陽性反應係指末端鍵結型(α 2-3)唾液酸。
總而言之，親代殖株含有低水平的α 2,3-與α 2,6-唾液酸。經α 2,3-唾液酸轉移酶工程化之殖株含有高水平的α 2,3-唾液酸鍵結與低水平的α 2,6-唾液酸鍵結。標準 對照組艾澤(Ovitrelle)僅含有α 2,3-唾液酸鍵結。其係與所知之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中所產生的重組蛋白(Kagawa等人於1988年乙文、Takeuchi等人於1988年乙文、Svensson等人於1990年乙文)相符。
總之，以α 2,3-唾液酸轉移酶工程化Per.C6hCG細胞，成功地增加與試樣中的重組hCG複合之唾液酸分子的數目。
第8A與8B例 總唾液酸之量化作用
唾液酸係視為單醣之一種蛋白結合型醣，及與其他單醣如半乳糖、甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖及海藻糖組合出現。使用以Stanton等人的方法(於期刊“J.Biochem.Biophys.Methods.”第30期(1995年)第37至48頁乙文)為基礎之一種方法，測量在如本發明的純化rhCG上之總唾液酸。
第8A例
測量經α 2,3-唾液酸轉移酶改質之Per.C6重組hCG的唾液酸總含量(如第5a例、第5b例)，及發現大於15莫耳/莫耳[以唾液酸莫耳數相對於蛋白質莫耳數之比例表示]，例如大於18莫耳/莫耳，例如19.1莫耳/莫耳。其可與唾液酸總含量為17.6莫耳/莫耳的艾澤(Ovitrelle)相比。
第8B例
測量經α 2,3-唾液酸轉移酶080019-19改質之Per.C6重組hCG(藉由上述第5b例的方法製備)的唾液酸總含量，及發現為20莫耳/莫耳[以唾液酸莫耳數相對於蛋白質莫耳數之比例表示]。同樣地，其係優於唾液酸總含量為17.6 莫耳/莫耳之艾澤(Ovitrelle)。測試該實例(080019-19)，以量化α 2,3與α 2,6唾液酸的相對量(第8C例)。
第8C例-α 2,3與α 2,6唾液酸的相對量之量化作用
使用已知的技術即具正相(NP)之HPLC，測量在純化rhCG上之α 2,3與α 2,6唾液酸的相對百分比量[實例(080019-19)及藉由第5例的方法製備之其他二個實例]。
進行下列分析，以量化O-鍵結型醣基中之α 2,3與2,6唾液酸。使用一種歐瑞拉(Orela)醣基釋出套組，將O-鍵結型醣基自hCG試樣解離，及在NP-HPLC上分離。以不同的唾液酸酶分解所萃取、匯集的醣基試樣(如上萃取)，以測定鍵結。使用α 2-3,6,8唾液酸酶與α 2-3唾液酸酶，進行醣基之酵素性降解作用。經酵素性分解的醣基然後在NP管柱上再分離，及使用所製備的標準品，在NP-HPLC上辨識O-醣基。計算相對百分比及示於下表中(SA=唾液酸)。
就α 2,3唾液酸糖苷化作用而言，發現相對百分比係位於55%至65%之範圍(如59%)；及就α 2,6唾液酸糖苷化作用而言，係位於35至45%之範圍(如41%)。
第8D例 單、二、三與四觸角型唾液酸糖苷化結構的相對量之量化作用
使用已知技術，測量在萃取自純化rhCG的醣基上之單、二、三與四唾液酸糖苷化結構的相對百分比量(在 第8C例中所用的三種試樣)。
將rhCG的各試樣固定化(凝膠塊)、清洗、還原、烷化及以糖苷酶(PNGase)F分解過夜。然後萃取與處理N-醣基。如Royle等人所詳述，以螢光團2AB標記用於NP-HPLC與WAX-HPLC分析之N-醣基。
如所說明Royle等人，以一種胎球蛋白N-醣基標準品作為參考基準，進行藉由電荷分離N-醣基之弱陰離子交換(WAX)HPLC(第8C例)。醣基係依據其等所含有的唾液酸數目洗提。所有試樣包括單(1S)、二(2S)、三(3S)及四(4S)唾液酸糖苷化結構。發現唾液酸糖苷化結構的相對量係如下列之比例(1S：2S：4S：4S)：0.1至4%：35至45%：0.5至8%：0至1%。
一個較佳的實例080019-19包括單(1S)、二(2S)、三(3S)及四(4S)唾液酸糖苷化結構。唾液酸糖苷化結構的相對量係如下列之比例(1S：2S：4S：4S)：0.1至4%：35至45%：0.5至8%：0至1%。
第9例 rhCG的代謝廓清率之測定
為測定經α 2,3-唾液酸轉移酶工程化的Per.C6hCG試樣(如第5a、5b例)之代謝廓清速率(MCR)，在零時在有知覺的雌性大鼠(每個殖株3隻動物)之尾靜脈注入快速輸液的rhCG(1至10微克/大鼠，基於試樣的ELISA量化作用，DRG EIA 1288)。在注射試驗試樣1、2、4、8、12、24及32小時之後，自尾端抽取血液試樣(400微升)。藉由離心作用收集血清，及藉由ELISA(DRG EIA 1288)分析hCG 含量。經α 2,3-唾液酸轉移酶工程化的Per.C6 hCG試樣之MCR所顯示的半衰期，係與標準品相近(第5圖)。第6圖係顯示經α 2,3-唾液酸轉移酶工程化的其他hCG試樣所具有的半衰期可優於標準品(第6圖)。
第10例-依據USP之hCG生物分析
進行一種hCG生物分析，以分析hCG特異性活性。使用艾澤(Ovitrelle)作為一標準品，依據USP測量該活性(美國藥典正文(USP Monographs)：絨毛膜性腺激素，USPC法定2009年8月1日至2009年11月30日)。艾澤(Ovitrelle)所具有的生物活性為26,000國際單位/毫克(於期刊“Curr Med Res Opin.”2005年12月第21(12)期第1969至76頁乙文)。可接受的限值為21,000國際單位hCG/毫克以上。以α 2,3-唾液酸轉移酶工程化之人類細胞株所衍生的hCG重組型hCG(所具有的唾液酸含量為19.1莫耳/莫耳-見第8例)之一試樣的生物活性為27,477國際單位hCG/毫克。
第11例 生產與純化作用綜述
發展出一程序，以在懸浮培養於無血清培養基之PER.C6細胞中生產重組hCG。該程序係說明如下，及適用於數種產生hCG的PER.C6細胞株。
使用Lowry等人(於1976年乙文)所述方法之修改，自一種α 2,3-殖株製備重組hCG。
為生產PER.C6-hCG，讓細胞株適應於一種無血清培養基，亦即Excell 525(JRH生物科學(JRH Biosciences)公司)。首先在T80培養瓶中培養細胞，以形成緻密度為70% 至90%之一單層。在繼代培養時，將細胞再懸浮於無血清培養基Excell 525+4mM L-麩醯胺酸中，直至細胞密度為0.3x106個細胞/毫升。將25毫升的細胞懸浮液置入一個250毫升的振盪燒瓶中，及於37℃與5%二氧化碳下，以100rpm振盪。在細胞密度大於1x106個細胞/毫升之後，將細胞繼代培養至細胞密度為0.2或0.3x106個細胞/毫升，及於37℃與5%二氧化碳下，以100rpm在振盪燒瓶中進一步培養。
為生產hCG，將細胞轉移至一種無血清的生產培養基，亦即VPRO(JRH生物科學(JRH Biosciences)公司)，其支持PER.C6細胞之生長至非常高的細胞密度(在批式培養中通常超過107個細胞/毫升)。首先在Excell 525中培養細胞至超過1x106個細胞/毫升，然後以1000rpm離心5分鐘，接著懸浮於VPRO培養基+6mM L-麩醯胺酸中，直至密度為1x106個細胞/毫升。然後於37℃與5%二氧化碳下，以100rpm在振盪燒瓶中培養細胞7至10天。在該期間，細胞生長至密度高超過107個細胞/毫升。在細胞活力開始下降之後，採收培養基。細胞於1000rpm離心5分鐘，及使用上清液以量化與純化hCG。使用ELISA(DRG EIA 1288)測定hCG濃度。
之後，使用Lowry等人(於1976年乙文)所述方法之修改，進行hCG的純化作用。其係藉由在DEAE纖維素上的層析法、在葡聚糖凝膠(Sephadex)G100上的凝膠過濾作用、在羥磷石灰上的吸附層析法及製備級聚丙烯醯胺電泳達成。
在所有的層析程序期間，藉由RIA(DRG EIA 1288)與IEF(第6例)證實免疫反應性重組hCG之存在。
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序列辨識編號1
人類絨毛膜性腺激素α多肽
登錄序號AH007338
hCG α的核苷酸序列
hCG α的蛋白質序列
序列辨識編號2
人類絨毛膜促性腺激素β多肽
登錄序號NP_000728
hCG β的核苷酸序列
核苷酸序列
hCG β的蛋白質序列
序列辨識編號3
β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶4
登錄序號L23767
ST3GAL4的核苷酸序列
ST3GAL4的蛋白質序列
序列辨識編號4
β-半乳糖醯胺α-2,6-唾液酸轉移酶1
登錄序號NM_003032
ST6GAL1的核苷酸序列
0p-
ST6GAL1的蛋白質序列

Claims (11)

  1. 一種藥學組成物，其包含在人類細胞株中產生或表現的重組hCG(rhCG)。
  2. 如請求項1之藥學組成物，其中該rhCG包括α2,3-與α2,6-唾液酸糖苷化作用。
  3. 如請求項1或2之藥學組成物，其中該rhCG包括單(1S)、二(2S)、三(3S)及四(4S)唾液酸糖苷化結構。
  4. 如請求項3之藥學組成物，其中該等唾液酸糖苷化結構之相對量係呈下列之比例(1S：2S：4S：4S)：0.2至1：35至40：2.5至7：0.5至1。
  5. 如請求項1之藥學組成物，其在Per.C6細胞株、Per.C6所衍生的細胞株或經改質的Per.C6細胞株中產生或表現。
  6. 如請求項1之藥學組成物，其中該細胞株係經使用α2,3-唾液酸轉移酶而被改質。
  7. 如請求項1之藥學組成物，其包括藉由內源性唾液酸轉移酶活性所提供之α2,6鍵結型唾液酸(α2,6唾液酸糖苷化作用)。
  8. 如請求項1之藥學組成物，其進一步包含FSH及/或LH。
  9. 如請求項8之藥學組成物，其用於治療不孕症。
  10. 一種在人類細胞株中產生或表現之rhCG於製備用於治療不孕症之藥物的用途。
  11. 一種產生包含rhCG的藥學組成物的方法，該方法包含在人類細胞株中產生或表現rhCG之步驟。
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