ES3033342T3 - Methods and systems for the rapid detection of listeria using infectious agents - Google Patents

Methods and systems for the rapid detection of listeria using infectious agents

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Abstract

Se describen aquí métodos y sistemas para la detección rápida de microorganismos como Listeria spp. en una muestra. También se describe un bacteriófago modificado genéticamente que comprende un gen indicador en la región tardía del gen. La especificidad del bacteriófago, como el bacteriófago específico para Listeria, permite la detección de un microorganismo específico, como Listeria spp., y la señal indicadora puede amplificarse para optimizar la sensibilidad del ensayo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y sistemas para la detección rápida de listeria utilizando agentes infecciosos
Campo de la invención
Esta invención se refiere a composiciones, métodos, sistemas y kits para la detección de microorganismos utilizando agentes infecciosos.
Antecedentes
Existe un gran interés en mejorar la velocidad y la sensibilidad para la detección de bacterias, virus y otros microorganismos en muestras biológicas, alimentarias, de agua y clínicas. Los patógenos microbianos pueden causar una morbilidad sustancial entre los seres humanos y los animales domésticos, así como enormes pérdidas económicas. Además, la detección de microorganismos es una alta prioridad para la Administración de Alimentos y Medicamentos(Food and Drug Administraron,FDA) y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades(Centers for Disease Control,CDC), así como para el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos(United States Department of Agriculture,USDA), dados los brotes de enfermedades potencialmente mortales o fatales causadas por la ingestión de alimentos contaminados con ciertos microorganismos, por ejemplo,Listeria spp., Salmonella spp.oStaphylococcus spp.
En particular,Listeria spp.se sabe que causa una infección potencialmente grave, la listeriosis.Listeria spp.,comoL. monocytogenes,se transmiten normalmente por la ingestión de productos alimenticios contaminados.L. monocytogeneses una bacteria grampositiva que se asocia comúnmente con la contaminación de productos alimenticios, incluidos, entre otros, la leche, los mariscos, las aves y la carne. Las enfermedades transmitidas por los alimentos, como la listeriosis, se pueden prevenir detectando los alimentos contaminados antes de que estén disponibles para el consumidor.
Las pruebas microbiológicas tradicionales para la detección de bacterias se basan en cultivos de enriquecimiento selectivo y no selectivo, seguidos de siembra en placas en medios selectivos y ensayos posteriores para confirmar colonias sospechosas. Estos procedimientos pueden requerir hasta siete días. Por ejemplo, las pruebas tradicionales para la detección deListeria spp. en los productos alimenticios son complejas y requieren mucho tiempo, ya que requieren períodos de enriquecimiento de 24 a 48 horas seguidos de pruebas adicionales prolongadas, con un tiempo total de detección que oscila entre 5 y 7 días. Se han investigado y puesto en práctica una variedad de métodos rápidos para reducir el tiempo requerido. Sin embargo, estos métodos tienen inconvenientes. Por ejemplo, pruebas de reacción en cadena de polimerasa(Polymerase Chain Reaction,PCR) también incluyen una etapa de amplificación y, por lo tanto, pueden tener una sensibilidad y selectividad muy altas; se limitan económicamente a un tamaño de muestra pequeño. Con las suspensiones bacterianas diluidas, la mayoría de las submuestras pequeñas estarán libres de células y, por lo tanto, aún se requieren etapas de purificación y/o enriquecimiento prolongadas.
El tiempo requerido para el enriquecimiento biológico tradicional viene dictado por la velocidad de crecimiento de la población bacteriana diana de la muestra, por el efecto de la matriz de la muestra y por la sensibilidad requerida. Debido al tiempo requerido para el cultivo, estos métodos pueden llevar hasta tres días, según el organismo que vaya a identificarse y la fuente de la muestra. Por lo general, este tiempo de retraso no es adecuado, ya que es posible que los alimentos, el agua u otro producto contaminados ya hayan llegado al ganado o a los seres humanos. Además, el aumento de las bacterias resistentes a antibióticos y consideraciones de biodefensa hacen que la identificación rápida de patógenos bacterianos en el agua, en los alimentos y en las muestras clínicas sea una prioridad crítica en todo el mundo.
Por lo tanto, existe la necesidad de una detección e identificación más rápida, sencilla y sensible de microorganismos, tales como bacterias y otros microorganismos potencialmente patógenos.
Hagensy col.,BACTERIOPHAGE, (2011), vol. 1, No. 3, páginas 143 a 151, describe un bacteriófago marcador A511: :celB para la detección de células de Listeria viables.Loessner y col.,APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, EE. UU., (1997), vol. 63, No. 8, páginas 2961 -2965, describe un bacteriófago marcador de luciferasa A511: :LuxAB para la detección de Listeria monocytogenes en alimentos contaminados. Loessner ycol.,APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, EE. UU., (1996), vol. 62, No. 4, páginas 1133 a 1140, describe la construcción del bacteriófago recombinante A511: LuxAB para la detección de células de Listeria. Loessner ycol.,BACTERIOLOGY, (1995), vol. 177, No. 22, páginas 6601 - 6609, analiza la organización y la transcripción de la región génica tardía del fago A511 de Listeria. Akhtary col.,FOOD CONTROL (2016), vol. 75, páginas 108-115, describen el aislamiento, la caracterización y la evaluación de bacteriófagos virulentos contra Listeria monocytogenes.Farooq y col.,BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, (2018), vol. 118, páginas 204 a 216, describe el uso de bioensayos y biosensores basados en fagos.
Resumen
Realizaciones de la invención comprenden composiciones, métodos, sistemas y kits para la detección deListeria spp.La invención puede materializarse de diversas maneras.
En algunos aspectos, la invención comprende una composición combinada comprendiendo al menos un bacteriófago recombinante construido a partir del LMA4, comprendiendo un gen indicador y un promotor exógeno que controla la transcripción del gen indicador, insertado en una región génica tardía de un genoma de bacteriófago, en donde el gen indicador no es contiguo a un gen que codifica una proteína bacteriófaga estructural y no produce una proteína de fusión, y en donde la expresión del gen indicador da como resultado un producto proteico indicador. y en donde el bacteriófago recombinante infecta específicamente aListeria spp..
Se describen composiciones que incluyen un bacteriófago indicador recombinante tal como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir uno o más agentes infecciosos de tipo silvestre o modificados genéticamente (por ejemplo, bacteriófagos) y uno o más genes indicadores. En algunos aspectos, las composiciones, métodos, sistemas y kits pueden comprender un cóctel de al menos un bacteriófago recombinante para su uso en la detección de microorganismos tales comoListeria spp.
En algunos aspectos de los métodos para preparar bacteriófagos indicadores recombinantes, el bacteriófago de tipo silvestre es unaListeria spp.-bacteriófago específico y la bacteria patógena diana esListeria spp.En algunos aspectos, el aislamiento de un clon particular de bacteriófago recombinante comprende un ensayo de dilución limitante para aislar un clon que demuestre la expresión del gen indicador.
Otros aspectos de la invención incluyen métodos para detectarListeria spp.en una muestra, incluyendo las etapas de incubar la muestra con la composición de cóctel descrita anteriormente y detectar el producto proteico indicador producido por el bacteriófago recombinante, donde la detección positiva del producto proteico indicador indica queListeria spp.está presente en la muestra. La muestra puede ser una muestra de alimento o de agua. En algunas realizaciones, las muestras incluyen muestras ambientales (por ejemplo, esponjas e hisopos de superficies o equipos para la monitorización bacteriana en fábricas y otras instalaciones de procesamiento) o muestras comerciales. En algunas realizaciones, la muestra de alimento comprende carne, pescado, verduras, huevos, productos lácteos, productos alimenticios secos o fórmula infantil en polvo.
En algunas realizaciones de métodos para detectar bacterias, la muestra se incuba primero en condiciones que favorecen el crecimiento durante un período de enriquecimiento de 24 horas o menos, 23 horas o menos, 22 horas o menos, 21 horas o menos, 20 horas o menos, 19 horas o menos, 18 horas o menos, 17 horas o menos, 16 horas o menos, 15 horas o menos, 14 horas o menos, 13 horas o menos, 12 horas o menos, 11 horas o menos, 10 horas o menos, o 9 horas o menos, 8 horas o menos, 7 horas o menos, 6 horas o menos, 5 horas o menos, 4 horas o menos, 3 horas o menos o 2 horas o menos. En algunas realizaciones, la muestra no se enriquece antes de la detección. En algunas realizaciones, el tiempo total hasta obtener los resultados es de menos de 28 horas, menos de 27 horas, menos de 26 horas, 25 horas, 24 horas, 23 horas, 22 horas, 21 horas, 20 horas, 19 horas, 18 horas, 17 horas, 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas o 2 horas. En algunas realizaciones, la relación entre la señal y el fondo generada al detectar el indicador es de al menos 2,0 o al menos 2,5 o al menos 3,0. En algunas realizaciones, el método detecta tan solo 1, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 de la bacteria específica en una muestra de un tamaño estándar para la industria de la seguridad alimentaria.
Realizaciones adicionales incluyen sistemas y kits para detectarListeria spp.,en donde los sistemas o kits comprenden la composición de cóctel descrita anteriormente, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Algunas realizaciones incluyen además un sustrato para reaccionar con un indicador para detectar el producto proteico soluble expresado por el bacteriófago recombinante.
Breve descripción de las figuras
La presente invención puede entenderse mejor haciendo referencia a las siguientes figuras no limitativas.
Lafigura 1representa una construcción de fago indicador según una realización de la invención que ilustra la inserción de una construcción genética comprendiendo un gen de la luciferasa, un promotor del gen tardío del bacteriófago y un sitio de unión al ribosoma(Ribosomal Binding Site,RBS) insertado en la región tardía (clase III) de un bacteriófago. El promotor representado es adicional y está separado del promotor del gen tardío endógeno corriente arriba de los genes tardíos endógenos, tal como el gen de la proteína de la cápside principal(Major Capsid Protein,MCP).
Lafigura 2muestra el genoma del bacteriófago LMA4, un miovirus (relacionado con el fago LMTA-94 de Listeria) que se obtuvo de aguas residuales. Un gen hipotético homólogo a la supuesta proteína prohead proteasa p85 se encuentra corriente arriba de la cps, el gen de la cápside principal dentro de la región del gen tardío, que consiste en genes estructurales que codifican proteínas del virión. Después de la cps, hay un terminador transcripcional, seguido de un homólogo de la proteína de la vaina caudal (tsh) LMTA-94. Como estas proteínas del virión se expresan a un nivel muy alto, se puede esperar que cualquier gen insertado en esta región tenga niveles de expresión similares, siempre que se usen promotores génicos tardíos y/u otros elementos de control similares.
Lafigura 3muestra dos diseños de construcciones plasmídicas de recombinación homóloga que portan el gen de la luciferasa utilizado para construir los fagos recombinantes con aproximadamente varios cientos de pares de bases de secuencias de fagos coincidentes corriente arriba y corriente abajo del sitio de inserción para promover la recombinación homóloga. La luciferasa NANOLUC® se inserta en una cadena principal plasmídica del vector de lanzamiento gram positivo pCE104 con una región no traducida corriente arriba que contiene un promotor del gen tardío del fago dedicado y un sitio de entrada al ribosoma. pCE104.HR.A51. Se usó LNanoLuc.v2 para construir recombinantes para los Pecentumvirus A511, LMA4 y LMA8. Se usó pCE104.HR.lp- ES1.NanoLuc para construir Homburvirus LP-ES1. Cada construcción consistía en 500 pb de secuencia homóloga que consistía en un fragmento del gen de la proteína de la cápside principal (cps) seguido de un promotor génico tardío, que se añadió además del promotor génico tardío endógeno corriente arriba de la principal proteína de la cápside del genoma del fago, el gen de la luciferasa, y aproximadamente 258 pares de bases de secuencia coincidente corriente abajo para la recombinación homóloga del pCE104.HR. A511.NanoLuc.v2 y 500 puntos básicos de flujo descendente para PCE104.HR.LP-ESL.NanoLuc. Todos los recombinantes utilizaron un promotor del gen tardíodel virus P100en lugar del promotor del gen tardío T4.
Lafigura 4representa un ensayo en placa de filtro para detectar bacterias de interés utilizando un bacteriófago modificado según una realización de la invención, en donde las bacterias y los fagos recombinantes se incuban en placas de filtro y, tras la generación del bacteriófago progenie, la proteína indicadora se detecta directamente sin eliminar el medio de incubación.
Lasfiguras 5A y 5Bmuestran datos de ejemplos de ensayos de detección deListeriautilizando bacteriófagos recombinantes específicos para la detección deListeria. Listeriaen esponjas punzadas, utilizando 10 ml de medio agregado (5A) o 90 ml de medio agregado (5B).
Lafigura 6muestra datos de ejemplos de un ensayo de detección deListeriaque utiliza bacteriófagos recombinantes específicos paraListeriapara detectarListeriaen muestras de esponja con hisopo de superficie ambiental.
Descripción detallada de la invención
En la presente memoria se describen composiciones, métodos y sistemas que demuestran una sensibilidad sorprendente para la detección deListeria spp.,en muestras de prueba (por ejemplo, muestras biológicas, de alimentos, de agua y ambientales). La detección se puede lograr en un período de tiempo más corto de lo que se creía posible utilizando agentes infecciosos modificados genéticamente en ensayos realizados con tiempos de enriquecimiento mínimos durante los cuales los microorganismos podrían multiplicarse. También es sorprendente el éxito de utilizar una multiplicidad de infecciones(Multiplicity Of Infection,MOI) potencialmente alta, o altas concentraciones de unidades formadoras de placa(Plaque Forming Units,PFU), para la incubación con una muestra de prueba. Anteriormente, se pretendía que estas altas concentraciones de fagos (PFU/ml) eran perjudiciales en los ensayos de detección de bacterias, ya que se pretendía que causaban “ lisis desde el exterior” . Sin embargo, una alta concentración de fagos puede facilitar la búsqueda, la unión y la infección de un número reducido de células diana.
Las composiciones, métodos, sistemas y kits de la invención comprenden una composición de cóctel comprendiendo al menos un bacteriófago recombinante construido a partir del LMA4, comprendiendo un gen indicador y un promotor exógeno que controla la transcripción del gen indicador, insertado en una región génica tardía de un genoma de bacteriófago, en donde el gen indicador no es contiguo a un gen que codifica una proteína bacteriófaga estructural y no produce una proteína de fusión, y en donde la expresión del gen indicador da como resultado un producto proteico indicador, y en donde el bacteriófago recombinante infecta específicamenteListeria spppara su uso en la detección deListeria spp.La expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de una bacteria hospedadora da como resultado la producción de un producto proteico indicador soluble. El bacteriófago recombinante se construye a partir de bacteriófagos LMA4.
Las composiciones, métodos, sistemas y kits de la invención comprenden el cóctel mencionado en las reivindicaciones para su uso en la detección de los microorganismosListeria spp.
En algunos aspectos, la invención comprende un método para detectar un microorganismo de interés. El método utiliza un agente infeccioso para la detección del microorganismo de interésListeria spp.El agente infeccioso es una composición de cóctel, comprendiendo la composición de cóctel al menos un bacteriófago recombinante construido a partir del LMA4, comprendiendo un gen indicador y un promotor exógeno que controla la transcripción del gen indicador, insertado en una región génica tardía de un genoma de bacteriófago, en donde el gen indicador no es contiguo a un gen que codifica una proteína bacteriófaga estructural y no produce una proteína de fusión, y en donde la expresión del gen indicador da como resultado un producto proteico indicador.. El microorganismo de interés esListeria spp.y el agente infeccioso es el bacteriófago que infecta específicamente a unaListeria spp.El método comprende la detección de una bacteria de interés en una muestra incubando la muestra con la composición de cóctel que infecta la bacteria de interés. El método comprende detectar el producto proteico indicador, en donde la detección positiva del producto proteico indicador indica queListeria spp.está presente en la muestra. En algunas realizaciones, la proteína indicadora es soluble.
En ciertas realizaciones, la invención puede comprender un sistema. El sistema se define como en las reivindicaciones adjuntas.
Por lo tanto, algunas realizaciones de la presente invención resuelven una necesidad mediante el uso de métodos basados en bacteriófagos para amplificar una señal detectable que indica la presencia de la bacteriasListeria ssp..En ciertas realizaciones, se detectan tan solo 10 bacterias. Debido a los numerosos sitios de unión de un agente infeccioso en la superficie deListeria spp.,la capacidad de progenie durante la infección y la posibilidad de que una fracción indicadora codificada exprese a un nivel elevado, el agente infeccioso o la fracción indicadora pueden detectarse más fácilmente que laListeria spp.en sí misma. De este modo, las realizaciones de la presente invención pueden lograr una enorme amplificación de la señal incluso a partir de una sola célula infectada.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario en la presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto exija lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. De forma general, las nomenclaturas utilizadas en relación con el cultivo de células y tejidos, la biología molecular, la inmunología, la microbiología, la genética y la química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en la presente memoria son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Métodos y técnicas conocidos se llevan a cabo de forma general según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo según las especificaciones del fabricante, tal como se logra habitualmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Las nomenclaturas utilizadas en relación con los procedimientos y técnicas de laboratorio descritos en la presente memoria son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica.
Se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:
Como se utilizan en la presente memoria, los términos “ un” , “ una” y “ el/la” pueden referirse a uno o más a menos que se indique específicamente lo contrario.
El uso del término “ o” se utiliza para significar “y/o” a menos que se indique explícitamente que se refieren solo a alternativas o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripción respalde una definición que se refiera solo a alternativas e “y/o” . Como se utiliza en la presente memoria, “ otro” puede significar al menos un segundo o más.
En esta solicitud, el término “ aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el método empleado para determinar el valor o la variación que existe entre muestras.
El término “ soporte sólido” o “ soporte” significa una estructura que proporciona un sustrato y/o una superficie sobre la que pueden unirse las biomoléculas. Por ejemplo, un soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo (es decir, tal como una placa de microtitulación o una placa multipocillo), o el soporte sólido puede ser un lugar en un filtro, una matriz o un soporte móvil, tal como una perla o una membrana (por ejemplo, una placa de filtro, partícylkas de látex, partículas paramagnéticas o una tira de flujo lateral).
El término “ agente de unión” se refiere a una molécula que puede unirse específica y selectivamente a una segunda molécula de interés (es decir, diferente). La interacción puede ser no covalente, por ejemplo, como resultado de enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der Waals o interacciones electrostáticas o hidrófobas, o puede ser covalente. El término “ agente aglutinante soluble” se refiere a un agente aglutinante que no está asociado (es decir, unido covalentemente o no covalentemente) a un soporte sólido.
Como se utiliza en la presente memoria, un “ analito” se refiere a una molécula, compuesto o célula que se está midiendo. El analito de interés puede, en ciertas realizaciones, interactuar con un agente aglutinante. Como se describe en la presente memoria, el término “ analito” puede referirse a una proteína o péptido de interés. Un analito puede ser un agonista, un antagonista o un modulador. O bien, un analito puede no tener un efecto biológico. Los analitos pueden incluir moléculas pequeñas, azúcares, oligosacáridos, lípidos, péptidos, peptidomiméticos, compuestos orgánicos y similares.
El término “ fracción detectable” o “ biomolécula detectable” o “ indicador” o “ fracción indicadora” se refiere a una molécula que puede medirse en un ensayo cuantitativo. Por ejemplo, una fracción indicadora puede comprender una enzima que puede utilizarse para convertir un sustrato en un producto que pueda medirse. Una fracción indicadora puede ser una enzima que cataliza una reacción que genera emisiones bioluminiscentes (por ejemplo, luciferasa). O bien, una fracción indicadora puede ser un radioisótopo que pueda cuantificarse. O bien, una fracción indicadora puede ser un fluoróforo. O pueden utilizarse otras moléculas detectables.
Como se utiliza en la presente memoria, “ bacteriófago” o “ fago” incluye uno o más de una pluralidad de virus bacterianos. En esta descripción, los términos “ bacteriófago” y “ fago” incluyen virus tales como micobacteriófagos (tales como para el bacilo de la tuberculosis y de la paratuberculosis), micófagos (tales como para hongos), fagos de micoplasma y cualquier otro término que se refiera a un virus que puede invadir bacterias, hongos, micoplasmas, protozoos, levaduras y otros organismos vivos microscópicos vivos y que los utiliza para autorreplicarse. Aquí, “ microscópico” significa que la dimensión más grande es un milímetro o menos. Los bacteriófagos son virus que han evolucionado en la naturaleza para utilizar las bacterias como medio para replicarse. Un fago hace esto uniéndose a una bacteria e inyectando su ADN (o ARN) en esa bacteria, e induciéndola a replicar el fago cientos o incluso miles de veces. Esto se denomina amplificación de fagos.
Como se utiliza en la presente memoria, “ región génica tardía” se refiere a una región de un genoma viral que se transcribe al final del ciclo de vida viral. La región génica tardía normalmente incluye los genes expresados más abundantemente (por ejemplo, proteínas estructurales ensambladas en la partícula del bacteriófago). Los genes tardíos son sinónimos de genes de clase III e incluyen genes con funciones de estructura y ensamblaje. Por ejemplo, los genes tardíos (sinónimos de clase III) se transcriben en el fago T7, por ejemplo, desde 8 minutos después de la infección hasta la lisis, la clase I (por ejemplo, la ARN polimerasa) es temprana, de 4 a 8 minutos, y la clase II, de 6 a 15 minutos, por lo que hay una superposición en los tiempos de II y III. Un promotor tardío es aquel que está localizado de forma natural y es activo en dicha región génica tardía.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “ cultivo para enriquecimiento” se refiere al cultivo tradicional, como la incubación en medios favorables para la propagación de microorganismos, y no debe confundirse con otros posibles usos de la palabra “ enriquecimiento” , como el enriquecimiento mediante la eliminación del componente líquido de una muestra para concentrar el microorganismo contenido en ella, u otras formas de enriquecimiento que no incluyen la facilitación tradicional de la propagación de microorganismos. El cultivo para el enriquecimiento durante períodos de tiempo puede emplearse en algunas realizaciones de los métodos descritos en la presente memoria.
Como se utiliza en la presente memoria, “ recombinante” se refiere a las modificaciones genéticas (es decir, de ácidos nucleicos) que se realizan normalmente en un laboratorio para reunir material genético que de otro modo no se encontraría. Este término se utiliza indistintamente con el término “ modificado” en la presente memoria.
Como se utiliza en la presente memoria, “ RLU” se refiere a unidades de luz relativas medidas con un luminómetro (por ejemplo, el GLOMAX® 96) o un instrumento similar que detecta la luz. Por ejemplo, la detección de la reacción entre la luciferasa y el sustrato apropiado (por ejemplo, NANOLUC® con NANO-GLO®) se comunica a menudo en RLU detectadas.
Como se utiliza en la presente memoria, “tiempo hasta obtener resultados” se refiere a la cantidad total de tiempo desde el inicio de la incubación de la muestra hasta el resultado generado. El tiempo para obtener los resultados no incluye ningún tiempo de prueba confirmatoria. La recopilación de datos se puede realizar en cualquier momento después de que se haya generado un resultado.
Muestras
Cada una de las realizaciones de los métodos y sistemas de la invención puede permitir la detección y cuantificación rápida deListeria spp.en una muestra según las reivindicaciones adjuntas.
Muestras pueden ser líquidas, sólidas o semisólidas. Las muestras pueden ser hisopos de superficies sólidas. Las muestras pueden incluir materiales ambientales, tal como muestras de agua, o los filtros de muestras de aire, o muestras de aerosoles de colectores ciclónicos. Las muestras pueden ser de verduras, carne, pescado, aves, mantequilla de maní, alimentos procesados, fórmula infantil en polvo, leche en polvo, tés, almidones, huevos, leche, queso u otros productos lácteos.
En algunas realizaciones, las muestras pueden utilizarse directamente en los métodos de detección de la presente invención, sin preparación, concentración o dilución. Por ejemplo, las muestras líquidas, que incluyen, aunque no de forma limitativa, leche y zumos, pueden analizarse directamente. Las muestras pueden diluirse o suspenderse en una solución, que puede incluir, entre otras, una solución tamponada o un medio de cultivo bacteriano. Una muestra que sea sólida o semisólida puede suspenderse en un líquido picando, mezclando o macerando el sólido en el líquido. Una muestra debe mantenerse dentro de un intervalo de pH que promueva la adhesión de los bacteriófagos a la célula bacteriana huésped. Una muestra también debe contener las concentraciones apropiadas de cationes divalentes y monovalentes, incluyendo aunque no de forma limitativa Na+, Mg2+ y Ca2+. Preferiblemente, una muestra se mantiene a una temperatura que mantenga la viabilidad de cualquier célula patógena contenida dentro de la muestra.
En algunas realizaciones del ensayo de detección, la muestra se mantiene a una temperatura que mantiene la viabilidad de cualquier célula patógena presente en la muestra. Por ejemplo, durante las etapas en las que los bacteriófagos se unen a las células bacterianas, es preferible mantener la muestra a una temperatura que facilite la unión de los bacteriófagos. Durante las etapas en las que los bacteriófagos se replican dentro de una célula bacteriana infectada o lisan dicha célula infectada, es preferible mantener la muestra a una temperatura que promueva la replicación de los bacteriófagos y la lisis del huésped. Dichas temperaturas son de al menos aproximadamente 25 grados Celsius (C), más preferiblemente no más de aproximadamente 35 grados C, lo más preferiblemente de aproximadamente 30 grados C.
Los ensayos pueden incluir varias muestras de control apropiadas. Por ejemplo, se pueden analizar muestras de control que no contienen bacteriófagos o muestras de control que contienen bacteriófagos sin bacterias como controles para determinar los niveles de señal de fondo.
Bacteriófago indicador
Como se describe con más detalle en la presente memoria, las composiciones, métodos, sistemas y kits de la invención comprenden una composición de cóctel comprendiendo al menos un bacteriófago recombinante construido a partir del LMA4, comprendiendo un gen indicador y un promotor exógeno que controla la transcripción del gen indicador, insertado en una región génica tardía de un genoma de bacteriófago, en donde el gen indicador no es contiguo a un gen que codifica una proteína bacteriófaga estructural y no produce una proteína de fusión, y en donde la expresión del gen indicador da como resultado una producto proteico indicador, y en donde el bacteriófago recombinante infecta específicamenteListeria spp...
Un bacteriófago indicador recombinante puede incluir un gen marcador o indicador. En realizaciones de la invención, el gen indicador no codifica una proteína de fusión. La expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago después de la infección de una bacteria huésped da como resultado un producto de proteína indicadora soluble. En realizaciones, el gen indicador se insertar en una región génica tardía del bacteriófago. Los genes tardíos generalmente se expresan a niveles más altos que otros genes de fagos, ya que codifican proteínas estructurales. La región génica tardía puede ser una región génica de clase III y puede incluir un gen para una proteína principal de la cápside.
Algunas realizaciones que no forman parte de la invención reivindicada incluyen el diseño (y opcionalmente la preparación) de una secuencia para la recombinación homóloga corriente abajo del gen principal de la proteína de la cápside. Otras realizaciones que no forman parte de la invención reivindicada incluyen el diseño (y opcionalmente la preparación) de una secuencia para la recombinación homóloga corriente arriba del gen principal de la proteína de la cápside. En algunas realizaciones, la secuencia comprende un gen marcador con codones optimizados precedido por una región no traducida. La región no traducida puede incluir un promotor del gen tardío del fago y un sitio de entrada al ribosoma.
En algunos ejemplos, un bacteriófago indicador se deriva de un fago específico deListeria.En algunas realizaciones, el bacteriófago natural seleccionado o el cóctel de bacteriófagos silvestres es capaz de infectar al menos unaListeria sppdiana. Las especies deListeriason omnipresentes en el medio ambiente y con frecuencia se encuentran en el agua, las aguas residuales y el suelo. En algunas realizaciones, el bacteriófago natural seleccionado o el cóctel de bacteriófagos silvestres es capaz de infectar una o más, dos o más, o tres o másListeria sppdiana. En ciertas realizaciones, la especie diana deListeriase selecciona entreL. monocytogenes, L. ivanoviiyL. grayi.
En algunas realizaciones de la invención, la composición de cóctel comprende al menos un bacteriófago recombinante construido a partir de LMA4. En algunas realizaciones, otros bacteriófagos de tipo silvestre seleccionados provienen del orden de los fagos de losCaudovirales. Caudoviralesson un orden de bacteriófagos con cola con genomas de ADN bicatenario (dsDNA). Cada virión del orden de losCaudoviralestiene una cabeza icosaédrica que contiene el genoma viral y una cola flexible. El ordenCaudoviralescomprende cinco familias de bacteriófagos:Myoviridae(colas largas contráctiles),Siphoviridae(colas largas no contráctiles),Podoviridae(colas cortas no contráctiles),AckermannviridaeyHerelleviridae.El término miovirus puede utilizarse para describir cualquier bacteriófago con una cabeza icosaédrica y una cola larga y contráctil, que abarca los bacteriófagos de las familiasMyoviridaeyHerelleviridae.En algunas realizaciones, otros bacteriófagos de tipo silvestre seleccionados son miembros de la familiaMyoviridae,tales como el fago deListeriaB054, el fago deListeriaLiPZ5, el fago deListeriaPSU-VKH-LP041 y el fago deListeriaWIL-2. En otras realizaciones, el bacteriófago de tipo silvestre seleccionado adicionalmente es un miembro de la familiaHerelleviridae.El géneroPecentumvirus,de la familiaHerelleviridae,incluye bacteriófagos tales como el fago deListeriaLMSP-25, el fago deListeriaLMTA-148, el fago deListeriaLMTA-34, el fago deListeriaLP-048, el fago deListeriaLP-064, el fago deListeriaLP-083-2, el fago deListeriaLP-125, el virus deListeriaP100, el fago deListeriaList-36, el fago deListeriaWIL-1, el fago deListeriaVB_LMOM_Ag20 y el virus de laListeriaA511. Es probable que el LMA4 y el LMA8 también pertenezcan al géneropecentumvirus,de la familiaHerelleviridae.En otras realizaciones, otro bacteriófago de tipo silvestre seleccionado es el LMA8. En ciertas realizaciones, otro bacteriófago de tipo silvestre seleccionado es el LP-ES3A, que se deriva del A511 pero que se ha adaptado para ser capaz de infectar el serotipo 3 A deListeria monocytogenes.En otras realizaciones más, el bacteriófago de tipo silvestre seleccionado adicionalmente es un miembro de la familiaAckermannviridae.En otras realizaciones más, el bacteriófago de tipo silvestre seleccionado adicional es un miembro de la familiaSiphoviridae,que incluye los fagos de Listeria A006, A118, A500, B025, LP-026, LP-030-2, LP-030-3, LP-037, LP-101, LP-110, LP-114, P35, P40, P70, PSA, VB_LmoS_188 y Vb _Lmos_293. En otras realizaciones, otro bacteriófago de tipo silvestre seleccionado es el LP-ES1. LP-ES1 también es probable que pertenezca al géneroHomburgvirus,de la familiaSiphoviridae.
En algunas realizaciones, el bacteriófago indicador se deriva de un fago específico deListeria;la composición de cóctel comprende al menos un bacteriófago recombinante construido a partir de LMA4. Se puede construir un bacteriófago indicador a partir de un Pecentumvirus, Tequatravirus, Vil, Kuttervirus, Homburgvirus, LMTA-94, LMA4, LMA8, P70, LP-ES1, LP-ES3A u otro bacteriófago que tenga un genoma con al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de homología con el fago de Listeria LMTA-94, P70, T7, similar a T7, T4, similar a T4,Listeria spp.-bacteriófagos específicos, Vil o similares a Vil (Kuttervirus, según GenBank/NCBI). En otras realizaciones, otros bacteriófagos de tipo silvestre seleccionados son LP-ES1, LP-ES3A o LMA8. En realizaciones, el fago indicador se deriva de un bacteriófago que es altamente específico de un microorganismo patógeno particular. Las modificaciones genéticas pueden evitar las deleciones de los genes de tipo silvestre y, por lo tanto, el fago modificado puede permanecer más similar al bacteriófago de tipo silvestre que muchos fagos comercializados. Los bacteriófagos obtenidos del medio ambiente pueden ser más específicos para las bacterias que se encuentran en el medio ambiente y, como tales, genéticamente distintos de los fagos disponibles comercialmente.
En otro aspecto de la invención, una composición de cóctel comprende al menos un tipo de bacteriófago recombinante construido a partir de LMA4. En algunas realizaciones, la composición del cóctel comprende otros tipos de bacteriófagos recombinantes construidos a partir de LMA8, A511, P70, LP-ES1 y LP-ES3A. En otras realizaciones, la composición del cóctel comprende otros tipos de bacteriófagos recombinantes construidos a partir de LMA8, LP-ES1 y LP-ES3A.
Además, los genes de los fagos que se cree son no esenciales pueden tener una función no reconocida. Por ejemplo, un gen aparentemente no esencial puede tener una función importante en la elevación del tamaño de ruptura, como funciones sutiles de corte, ajuste o recorte durante el ensamblado. Por lo tanto, eliminar genes para insertar un indicador puede ser perjudicial. La mayoría de los fagos pueden empaquetar un ADN que es un poco más grande que su genoma natural. Con esta consideración, un gen indicador más pequeño puede ser una opción más apropiada para modificar un bacteriófago, especialmente uno con un genoma más pequeño. Las proteínas OpLuc y nAn OLUC® tienen solo aproximadamente 20 kDa (aproximadamente 500-600 pb para codificar), mientras que FLuc tiene aproximadamente 62 kDa (aproximadamente 1700 pb para codificar). Además, el gen marcador no debe ser expresada de forma endógena por la bacteria (es decir, no forma parte del genoma bacteriano), debe generar una alta relación señal/fondo y debe ser fácilmente detectable de forma oportuna. En algunas realizaciones, el gen indicador es una luciferasa. En otras realizaciones, el gen indicador es una subunidad activa de una luciferasa. NANOLUC® de Promega es una luciferasa modificada deOplophorus gracilirostris(camarón de aguas profundas). En algunas realizaciones, NANOLUC® combinado con NANO-GLO® de Promega, un sustrato de imidazopirazinona (furimazina), puede proporcionar una señal robusta con bajo nivel de fondo.
En algunas realizaciones de fagos indicadores, el gen indicador puede insertarse en una región no traducida para evitar la alteración de los genes funcionales, dejando intactos los genes de los fagos de tipo salvaje, lo que puede dar lugar a una mayor idoneidad para infectar cepas de bacterias que no sean de laboratorio. Además, incluir codones de terminación en los tres marcos de lectura puede ayudar a aumentar la expresión al reducir la lectura completa, también conocida como expresión “ leaky” o defectuosa. Esta estrategia también puede eliminar la posibilidad de que se produzca una proteína de fusión a niveles bajos, lo que se manifestaría como una señal de fondo (por ejemplo, luciferasa) que no se puede separar del fago.
Un gen indicador puede expresar una variedad de biomoléculas. El gen indicador es un gen que expresa un producto detectable o una enzima que produce un producto detectable. Por ejemplo, en una realización, el gen indicador codifica una enzima luciferasa. Pueden utilizarse varios tipos de luciferasa. En realizaciones alternativas, y como se describe con más detalle en la presente memoria, la luciferasa es una de las siguientes: luciferasa deOplophorus,luciferasa de luciérnaga, luciferasa Lucia, luciferasa Renilla o una luciferasa diseñada. En algunas realizaciones, el gen de la luciferasa se obtiene deOplophorus.En algunas realizaciones, el gen indicador es un gen de luciferasa modificado genéticamente, tal como Na No LUC®.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente invención comprende un bacteriófago modificado genéticamente comprendiendo un gen indicador no bacteriófago en la región génica tardía (clase III). En algunas realizaciones, el gen indicador no nativo está bajo el control de un promotor tardío. El uso de un promotor génico tardío asegura que el gen marcador (por ejemplo, la luciferasa) no solo se exprese a niveles altos, como las proteínas de la cápside viral, sino que tampoco se desactive como los genes bacterianos endógenos o incluso los genes virales tempranos.
En algunas realizaciones, el promotor tardío es un promotor de Pecentumvirus, Tequatravirus, Homburgvirus o Kuttervirus, u otro promotor de fago similar al que se encuentra en el fago de tipo silvestre seleccionado, es decir, sin modificación genética. La región génica tardía puede ser una región génica de clase III, y el bacteriófago puede derivar del fago deListeriaLMTA-94, P70, A511, LP-ES1, LP-ES3A, LMA4, LMA8, Pecentumvirus, Tequatravirus, Homburgvirus, Kuttervirus, T7, T4, tipo T4, Vil,Listeria spp.-bacteriófago específico u otro bacteriófago de tipo silvestre que tenga un genoma con al menos 70, 75, 80, 85, 90 o 95 % de homología con el bacteriófago específico LMTA-94, LMA4, LMA8, Pecentumvirus, Tequatravirus, Homburgvirus, Kuttervirus, T7, T4, Vil oListeria.El promotor del gen tardíodel Pecentumviruses distinto del promotor T4 o del tequatravirus, ya que consiste no solo en la región -10, sino también en una región -35. Esta región -35 difiere de la región -35 estándar que se encuentra en la mayoría de los promotores bacterianos.
Las modificaciones genéticas de agentes infecciosos pueden incluir inserciones, deleciones o sustituciones de un pequeño fragmento de ácido nucleico, una parte sustancial de un gen o un gen entero. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos insertados o sustituidos comprenden secuencias no nativas. Puede insertarse un gen indicador no nativo en el genoma de un bacteriófago de modo que esté bajo el control de un promotor de bacteriófago. Por lo tanto, en realizaciones, el gen indicador no nativo no forma parte de una proteína de fusión. Es decir, en algunas realizaciones, una modificación genética puede configurarse de forma que el producto proteínico indicador no comprenda polipéptidos del bacteriófago de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el producto proteínico indicador es soluble. En realizaciones, la invención comprende un método para detectar una bacteria de interés comprendiendo la etapa de incubar una muestra de ensayo con tal bacteriófago recombinante.
En realizaciones, la expresión del gen indicador en el bacteriófago de la progenie después de la infección de la bacteria hospedadora da lugar a un producto proteínico soluble y libre. En realizaciones, el gen indicador no nativo no es contiguo a un gen que codifica una proteína fágica estructural y, por lo tanto, no produce una proteína de fusión. A diferencia de los sistemas que emplean una fusión de una fracción de detección con la proteína de la cápside (es decir, una proteína de fusión), algunas realizaciones de la presente invención expresan un indicador o marcador soluble (por ejemplo, luciferasa soluble). En algunas realizaciones, el indicador o marcador está idealmente libre de la estructura del bacteriófago. Es decir, el indicador o marcador no está unido a la estructura del fago. Como tal, el gen del indicador o marcador no se fusiona con otros genes del genoma del fago recombinante. Esto puede aumentar considerablemente la sensibilidad del ensayo (hasta de una sola bacteria) y simplificar el ensayo, ya que permite que el ensayo se complete en dos horas o menos en algunas realizaciones, en vez de en varias horas debido a las etapas de purificación adicionales requeridas con las construcciones que producen proteínas de fusión detectables. Además, las proteínas de fusión pueden ser menos activas que las proteínas solubles debido, por ejemplo, a restricciones de plegamiento de las proteínas que pueden alterar la conformación del sitio activo de la enzima o el acceso al sustrato. Si la concentración es de 1000 células bacterianas/ml de muestra, por ejemplo, menos de cuatro horas de infección pueden ser suficientes para la detección de la bacteria diana.
Además, las proteínas de fusión, por definición, limitan el número de fracciones unidas a las subunidades de una proteína en el bacteriófago. Por ejemplo, el uso de un sistema disponible en el mercado diseñado para servir como plataforma para una proteína de fusión daría lugar a aproximadamente 415 copias de la fracción de fusión, que corresponden a las aproximadamente 415 copias de la proteína de la cápside del gen 10B en cada partícula del bacteriófago T7. Sin esta restricción, puede esperarse que las bacterias infectadas expresen muchas más copias de la fracción de detección (por ejemplo, luciferasa) de las que caben en el bacteriófago. Además, las proteínas de fusión grandes, como la fusión cápside-luciferasa, pueden inhibir el ensamblado de la partícula de bacteriófago, produciendo por lo tanto una menor progenie de bacteriófagos. Por lo tanto, puede ser preferible un producto del gen indicador soluble que no sea una fusión.
En algunas realizaciones, el fago indicador codifica un marcador, tal como una enzima detectable. El producto del gen indicador puede generar luz y/o puede detectarse mediante un cambio de color. Se comercializan diversas enzimas adecuadas, tales como fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rábano (HRP) o luciferasa (Luc). En algunas realizaciones, estas enzimas pueden servir como fracción indicadora. En algunas realizaciones, la luciferasa de luciérnaga es la fracción indicadora. En algunas realizaciones, la luciferasa deOplophoruses la fracción indicadora. En algunas realizaciones, la luciferasa de luciérnaga es la fracción indicadora. Otras luciferasas modificadas por ingeniería genética u otras enzimas que generan señales detectables también pueden ser fracciones indicadoras adecuadas.
En algunas realizaciones, el uso de una fracción de detección soluble elimina la necesidad de eliminar el fago parental contaminante del lisado de las células de muestra infectadas. Con un sistema de proteínas de fusión, cualquier bacteriófago utilizado para infectar las células de la muestra tendría la fracción de detección unida y sería indistinguible del bacteriófago hijo que también contiene la fracción de detección. Como la detección de bacterias de muestra se basa en la detección de una fracción de detección recién creada (sintetizadade novo),el uso de construcciones de fusión requiere etapas adicionales para separar las fracciones antiguas (parentales) de las fracciones recién creadas (bacteriófagos hijos). Esto puede conseguirse lavando las células infectadas varias veces, antes de completar el ciclo de vida del bacteriófago, inactivando el exceso de fagos parentales después de la infección por medios físicos o químicos, y/o modificando químicamente el bacteriófago parental con una fracción de unión (tal como biotina), que a continuación puede unirse y separarse (tal como mediante perlas de sefarosa recubiertas de estreptavidina). Sin embargo, incluso con todos estos intentos de eliminación, el fago parental puede permanecer cuando se utiliza una concentración elevada del fago parental para asegurar la infección de un número reducido de células de la muestra, creando una señal de fondo que puede dificultar la detección de la señal del fago de la progenie celular infectada.
Por el contrario, con la fracción de detección soluble expresada en algunas realizaciones de la presente invención, la purificación del fago parental a partir del lisado final es innecesaria, ya que el fago parental no tiene ninguna fracción de detección unida. Por lo tanto, cualquier fracción de detección presente después de la infección debe haberse creadode novo,indicando la presencia de una bacteria o bacterias infectadas. Para aprovechar este beneficio, la producción y preparación del fago parental puede incluir la purificación del fago a partir de cualquier fracción de detección libre producido durante la producción del bacteriófago parental en cultivo bacteriano. Pueden emplearse técnicas estándar de purificación de bacteriófagos para purificar algunas realizaciones de fagos según la presente invención, tales como centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, centrifugación en gradiente de densidad isopícnica con cloruro de cesio, HPLC, cromatografía de exclusión por tamaño y diálisis o tecnologías derivadas (tales como los concentradores de la marca Amicon - Millipore, Inc.). Puede emplearse ultracentrifugación isopícnica con cloruro de cesio como parte de la preparación del fago recombinante de la invención, para separar las partículas del fago parental de la proteína luciferasa contaminante producida tras la propagación del fago en el huésped bacteriano. De este modo, el bacteriófago recombinante parental de la invención está sustancialmente exenta de cualquier luciferasa generada durante la producción en la bacteria. La eliminación de la luciferasa residual presente en la reserva de fagos puede reducir sustancialmente la señal de fondo observada cuando los bacteriófagos recombinantes se incuban con una muestra de ensayo.
En algunas realizaciones de bacteriófagos modificados, el promotor tardío (promotor de clase III, por ejemplo, de Pecentumvirus, Homburgvirus, T7, T4, Vil o LMA4/8) tiene alta afinidad por la ARN polimerasa del mismo bacteriófago que transcribe genes para proteínas estructurales ensambladas en la partícula del bacteriófago. Estas proteínas son las proteínas más abundantes producidas por el fago, ya que cada partícula de bacteriófago comprende docenas o cientos de copias de estas moléculas. El uso de un promotor tardío viral puede garantizar un nivel de expresión óptimamente alto de la fracción de detección de luciferasa. El uso de un promotor viral tardío derivado, específico o activo en el bacteriófago natural original del que se deriva el fago indicador (p. ej., un fago específico deListeria,un promotor tardío T4, T7 o ViI con un sistema basado en T4, T7 o ViI) puede garantizar además la expresión óptima de la fracción de detección. El uso de un promotor bacteriano estándar (no de virus/no de bacteriófago) puede en algunas realizaciones ser perjudicial para la expresión, ya que estos promotores a menudo se regulan por disminución durante la infección por bacteriófagos (para que el bacteriófago priorice los recursos bacterianos para la producción de proteínas de fagos). Por lo tanto, en algunas realizaciones, el fago se modifica por ingeniería genética preferiblemente para codificar y expresar a un nivel alto una fracción indicadora soluble (libre), utilizando un lugar en el genoma que no limite la expresión al número de subunidades de un componente estructural del fago.
Composiciones de la invención pueden comprender uno o más agentes infecciosos de tipo silvestre o modificados genéticamente (por ejemplo, bacteriófagos) y uno o más genes indicadores. En algunas realizaciones, las composiciones pueden incluir cócteles de diferentes fagos indicadores que pueden codificar y expresar las mismas o distintas proteínas indicadoras. En algunas realizaciones, el cóctel de bacteriófagos comprende al menos dos tipos diferentes de bacteriófagos recombinantes.
Métodos de preparación de bacteriófagos indicadores
Algunas realizaciones de los métodos para fabricar bacteriófagos indicadores comienzan con la selección de un bacteriófago de tipo silvestre para su modificación genética. Algunos bacteriófagos son muy específicos para una bacteria diana. Esto presenta una oportunidad para una detección altamente específica.
Por lo tanto, los métodos de la presente invención utilizan la alta especificidad de los agentes de unión, asociados con los agentes infecciosos que reconocen y se unen a un microorganismo de interés particular como un medio para amplificar una señal y, por lo tanto, detectar niveles bajos de un microorganismo (por ejemplo, un solo microorganismo) presente en una muestra. Por ejemplo, los agentes infecciosos (bacteriófagos) reconocen específicamente los receptores de superficie de microorganismos particulares y, por lo tanto, infectan específicamente esos microorganismos. Como tales, estos agentes infecciosos son agentes de unión apropiados para atacar un microorganismo de interés.
Realizaciones de la invención utilizan la especificidad de unión y la capacidad de expresión genética de alto nivel del bacteriófago recombinante para una orientación rápida y sensible para infectar y facilitar la detección de una bacteria de interés. En algunas realizaciones, un bacteriófago LMA4 específico paraListeriase modifica genéticamente para incluir un gen marcador. En algunas realizaciones, la región génica tardía de un bacteriófago se modifica genéticamente para incluir un gen marcador. En algunas realizaciones, un gen marcador se coloca corriente abajo del gen principal de la cápside. En otras realizaciones, un gen marcador se coloca corriente arriba del gen principal de la cápside. En algunos ejemplos, la construcción genética insertada comprende además su propio promotor exógeno dedicado para impulsar la expresión del gen indicador. El promotor exógeno se suma a cualquier promotor endógeno en el genoma del fago. Como los bacteriófagos producen transcripciones de ARNm policistrónico, solo se requiere un único promotor corriente arriba del primer gen/cistrón de la transcripción. Construcciones recombinantes convencionales solo utilizan el promotor bacteriófago endógeno para impulsar los genes insertados. Por el contrario, la adición de un promotor adicional corriente arriba del gen marcador y del sitio de unión al ribosoma puede aumentar la expresión génica al actuar como un sitio de inicio secundario para la transcripción. Los genomas complicados y compactos de los virus suelen tener genes superpuestos en diferentes marcos, a veces en dos direcciones diferentes.
Algunas realizaciones de los métodos, que no forman parte de la invención reivindicada, para preparar un bacteriófago indicador recombinante incluyen la selección de un bacteriófago de tipo silvestre que infecte específicamente una bacteria patógena diana, tal comoListeria spp.;preparar un plásmido/vector de recombinación homólogo comprendiendo un gen indicador; transformar el plásmido/vector de recombinación homólogo en bacterias patógenas diana; infectar las bacterias patógenas diana transformadas con el bacteriófago de tipo silvestre seleccionado, permitiendo de este modo que se produzca una recombinación homóloga entre el plásmido/vector y el genoma del bacteriófago; y aislar un clon particular de bacteriófago recombinante.
Se conocen varios métodos para diseñar y preparar un plásmido de recombinación homólogo. Se conocen varios métodos para transformar bacterias con un plásmido, que incluyen el choque térmico, la conjugación bacteriana mediada por F pilus, la electroporación y otros métodos. También se conocen varios métodos para aislar un clon particular después de la recombinación homóloga. Algunas realizaciones del método descritas en la presente memoria utilizan estrategias particulares.
Por lo tanto, algunas realizaciones de métodos, que no forman parte de la invención reivindicada, para preparar bacteriófagos indicadores incluyen las etapas de seleccionar un bacteriófago de tipo silvestre que infecte específicamente una bacteria patógena diana; determinar la secuencia natural en la región tardía del genoma del bacteriófago seleccionado; anotar el genoma e identificar el gen principal de la proteína de la cápside del bacteriófago seleccionado; diseñar una secuencia para la recombinación homóloga adyacente al gen de la proteína de la cápside principal, en donde la secuencia comprende un gen marcador con codones optimizados; incorporar la secuencia diseñada para la recombinación homóloga en un plásmido/vector; transformar el plásmido/vector en bacterias patógenas diana; seleccionar las bacterias transformadas; infectar las bacterias transformadas con el bacteriófago natural seleccionado, permitiendo de este modo que se produzca una recombinación homóloga entre el plásmido y el genoma del bacteriófago; determinar el título del lisato de bacteriófagos recombinantes resultante; y realizar un ensayo de dilución limitante para enriquecer y aislar el bacteriófago recombinante. Algunas realizaciones comprenden repetir adicionalmente las etapas de dilución limitante y titulación, después del primer ensayo de dilución limitante, según sea necesario hasta que el bacteriófago recombinante represente una fracción detectable de la mezcla. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las etapas limitantes de dilución y titulación pueden repetirse hasta que al menos 1/30 del bacteriófago de la mezcla sea recombinante antes de aislar un clon particular del bacteriófago recombinante. En algunas realizaciones, se espera que una proporción de 1:30 de recombinante: natural produzca un promedio de 3,2 unidades de transducción(Transducing Units,TU) por 96 placas (por ejemplo, en una placa de 96 pocillos). La proporción inicial entre fagos recombinantes y fagos de tipo silvestre puede determinarse realizando ensayos de dilución limitantes basados en el TCID50 (dosis infecciosa en cultivo de tejidos del 50 %), tal como se describió anteriormente en la Solicitud de EE. UU. N° 15/409,258. Según la distribución de Poisson, una proporción de 1:30 genera un 96 % de probabilidades de observar al menos una TU en algún lugar de los 96 pozos.
La figura 1representa una representación esquemática de la estructura genómica de un bacteriófago indicador recombinante de la invención. Para la realización representada en lafigura 1,la fracción de detección está codificada por un gen100de luciferasa insertado en la región110del gen tardío (claseNI),que se expresa al final del ciclo de vida viral. Los genes tardíos generalmente se expresan a niveles más altos que otros genes de fagos, ya que codifican proteínas estructurales. Por lo tanto, en la realización del fago recombinante representada en lafigura 1, el gen indicador (es decir, la luciferasa) se inserta en la región génica tardía, justo después del gen de la proteína de la cápside principal (cps)120, y es una construcción comprendiendo el gen de la luciferasa100.En algunas realizaciones, la construcción representada en lafigura 1puede incluir codones de terminación en los 3 marcos de lectura para garantizar que la luciferasa no se incorpore al producto génico de la cps mediante la creación de una proteína de fusión. También como se representa en lafigura 1,la construcción puede comprender un promotor tardío130adicional dedicado para impulsar la transcripción y la expresión del gen de la luciferasa. La construcción también comprende un sitio de unión al ribosoma (RBS)140.Esta construcción asegura que la luciferasa soluble se produzca de manera que la expresión no se limite al número de proteínas de la cápside inherentes al sistema de presentación en fagos.
Como se indica en la presente memoria, en ciertas realizaciones, puede preferirse utilizar agentes infecciosos que se hayan aislado del entorno para la producción de los agentes infecciosos de la invención. De esta manera, se pueden generar agentes infecciosos que son específicos para los microorganismos de origen natural.
Por ejemplo, lafigura 2muestra el genoma del bacteriófago LMA4, un bacteriófago de tipo silvestre que infecta específicamente aListeria spp.Como se explica en los ejemplos, la proteína de la cápside principal (cps) 240 y varios otros genes estructurales se encuentran en la región génica tardía 210, que consiste en genes estructurales que codifican las proteínas del virión. Los genes que codifican el ARNt220representan una secuencia genómica adyacente a, pero fuera de, la región génica tardía. Un gen hipotético homólogo a la supuesta proteasa prohead del fago LMTA-94230deListeriase encuentra corriente arriba de la cps240,que consiste en genes estructurales que codifican las proteínas del virión. Otros genes tardíos descritos son homólogos de la supuesta proteína de la cápside principal (cps)240del fago deListeria,seguida de un terminador transcripcional 250 y un homólogo de la proteína de la vaina caudal (tsh)260del fago deListeriaLMTA-94. Como estas proteínas del virión se expresan a un nivel muy alto, se puede esperar que cualquier gen insertado en esta región tenga niveles de expresión similares, siempre que se usen promotores génicos tardíos y/u otros elementos de control similares.
Existen numerosos métodos y productos comerciales conocidos para preparar plásmidos. Por ejemplo, PCR, mutagénesis dirigida al sitio, digestión por restricción, la ligación, la clonación y otras técnicas pueden utilizarse en combinación para preparar plásmidos. Los plásmidos sintéticos también se pueden pedir comercialmente (por ejemplo, GeneWiz). También se pueden emplear cósmidos, o se puede utilizar el sistema CRISPR/CAS9 para editar selectivamente el genoma de un bacteriófago. Algunas realizaciones de los métodos para preparar un bacteriófago indicador recombinante incluyen el diseño de un plásmido que pueda recombinarse fácilmente con el genoma del bacteriófago de tipo silvestre para generar genomas recombinantes. Al diseñar un plásmido, algunas realizaciones incluyen la adición de un gen marcador con codones optimizados, tal como un gen de la luciferasa. Algunas realizaciones incluyen además la adición de elementos en la región no traducida corriente arriba. Por ejemplo, al diseñar un plásmido para recombinarse con el genoma del bacteriófago específico deListeria,se puede añadir una región no traducida corriente arriba entre la secuencia que codifica el extremo C de la proteína gp23/de la cápside mayor y el codón de inicio del gen marcador NANOLUC®. La región no traducida puede incluir un promotor, tal como un promotor T4, Tequatravirus, Homburgvirus, T7, similar a T7, Pecentumvirus, bacteriófago específico deListeria,Vil o Kuttervirus. La región no traducida también puede incluir un sitio de entrada/unión ribosómico(Ribosomal Entry/ Binding Site,RBS), también conocido como “ secuencia de Shine-Dalgarno” con sistemas bacterianos. Uno o ambos de estos elementos, u otros elementos no traducidos, se pueden incrustar dentro de una región no traducida situada corriente arriba corta formada por secuencias aleatorias comprendiendo aproximadamente el mismo contenido de GC que el resto del genoma del fago. La región aleatoria no debe incluir una secuencia ATG, ya que actuará como un codón de inicio.
Las composiciones de cóctel de la invención comprenden al menos un bacteriófago recombinante construido a partir de LMA4. Las composiciones pueden comprender además diversos agentes infecciosos y/o genes indicadores. Por ejemplo, lafigura 3muestra una construcción plasmídica de recombinación homóloga utilizada para hacer que el fago indicador sea específico paraListeria spp.Las construcciones se elaboraron y se utilizaron en recombinación conListeria spp.fago LMA4,Listeria spp.fago LMA8,Listeria spp.fago LP-ES3A,Listeria spp.fago LP-ES1 u otros fagos específicos deListeriapara generar el bacteriófago recombinante de la invención. La construcción de lafigura 3muestra un esquema general del plásmido de recombinación utilizado para la inserción por recombinación homóloga de la luciferasa NANOLUC® en ambasListeria spp.Los fagos LMA4 y LMA8 del virusPecentum,cada uno con 500 pares de bases de secuencias homólogas ascendentes y descendentes: el plásmido de recombinación homólogo pCE104.HR.Listeriaphage.NANOLUC.v2.
Pecentumvirus.NANOLUC.v2 y el plásmido de recombinación utilizado para la recombinación homóloga insertan la luciferasa NANOLUC® enListeria spp.Fago del virus deHomburgLP-ES1, pCE104.HR.LP-ESL.NanoLuc
En ciertas realizaciones, un plásmido se denomina pCE104.HR.Pecentumvirus.NanoLuc.v2. La fracción de detección/indicadora está codificada por el gen marcador NANOLUC®300.El inserto, representado por la serie de rectángulos, está en el vector de lanzamiento Gram positivo, pCE104 310. La región de recombinación homóloga corriente arriba consiste en 500 pb del fragmento C-terminal320de la proteína principal de la cápside. Una secuencia de consenso del promotor tardío delPecentumvirusy un sitio de entrada/unión ribosómica de Shine-Dalgarno dentro de la región330no traducida 5'. El gen marcador NANOLUC®300con codones optimizados sigue inmediatamente después. El terminador transcripcional endógeno viene a continuación, junto con la región no traducida(UnTranslated Region,UTR) y el hipotético fragmento N-terminal de la proteína que consiste en la recombinación homóloga posterior340que se encuentran al final de la región de recombinación homóloga.
El fragmento de proteína de la cápside principal es parte de un gen estructural que codifica una proteína del virión. Como estas proteínas del virión se expresan a un nivel muy alto, se puede esperar que cualquier gen insertado en esta región tenga niveles de expresión similares, siempre que se usen promotores génicos tardíos y/u otros elementos de control similares.
En algunas realizaciones, el fago indicador según la invención comprende el bacteriófago LMA4 específico deListeriamodificado genéticamente para comprender un gen marcador tal como un gen de la luciferasa. Por ejemplo, un fago indicador puede serListeria spp.-bacteriófago específico en donde el genoma comprende la secuencia del gen NANOLUC®. Un genoma bacteriófago NanoLuc recombinanteespecífico de Listeriapuede comprender además un promotor de consenso del bacteriófagoPecentumvirus,T4, T7,específico de Listeria,Vil, LMA4 o LMA8 u otro promotor tardío. En realizaciones, el promotor es un promotor exógeno. La inserción de un promotor exógeno para impulsar la expresión de un gen indicador es ventajosa porque la expresión no está limitada por la expresión de otras proteínas del fago (por ejemplo, la proteína principal de la cápside).
Por lo tanto, en el caso del fago recombinante generado como resultado de la recombinación, el gen indicador (es decir, NANOLUC®) se inserta en la región génica tardía, justo corriente abajo del gen que codifica la proteína principal de la cápside y, por lo tanto, crea genomas de bacteriófagos recombinantes comprendiendo el gen NANOLUC®. La construcción puede comprender además el promotor de consenso del fago deListeriaLMTA-94, T4, T7, el bacteriófagoespecífico de Listeria, Vil u otro promotor tardío u otro promotor adecuado para impulsar la transcripción y expresión del gen de la luciferasa. La construcción también puede comprender una región no traducida compuesta sintetizada a partir de varias UTR. Esta construcción asegura que la luciferasa soluble se produzca de manera que la expresión no se limite al número de proteínas de la cápside inherentes al sistema de presentación en fagos.
El fago recombinante generado por recombinación homóloga de un plásmido diseñado para la recombinación con el genoma del fago de tipo silvestre se puede aislar a partir de una mezcla comprendiendo un porcentaje muy pequeño (por ejemplo, el 0,005 %) del total de los genomas del fago. Tras el aislamiento, se puede llevar a cabo una producción a gran escala para obtener reservas de fagos indicadores recombinantes de alta titulación apropiadas para su uso en ensayo de detección deListeria spp.Además, la centrifugación en gradiente de densidad isopícnica con cloruro de cesio se puede utilizar para separar las partículas de fagos de la proteína luciferasa contaminante para reducir el fondo.
Métodos de uso de agentes infecciosos para detectarListeria spp.
Como se señala en la presente memoria, en ciertas realizaciones, la invención puede comprender métodos de uso de partículas infecciosas para detectar microorganismos. Los métodos de la invención pueden realizarse de diversas formas.
La invención comprende un método para detectarListeria spp.en una muestra comprendiendo: incubar la muestra con una composición de cóctel comprendiendo al menos un bacteriófago recombinante específico deListeriaconstruido a partir del LMA4; y detectar un producto proteico indicador producido por el bacteriófago recombinante, en donde la detección positiva del producto proteico indicador indica queListeria spp.está presente en la muestra.
En algunos ejemplos, al menos un tipo de bacteriófago recombinante se construye a partir del LMA4. En algunas realizaciones, se pueden construir bacteriófagos recombinantes adicionales a partir de LMA8, A511, P70, LP-ES1 y LP-ES3A. En otras realizaciones, al menos un tipo adicional de bacteriófago recombinante se construye a partir de LMA8, LP-ES1 y LP-ES3A.
En ciertas realizaciones, el ensayo puede realizarse para utilizar un concepto general que puede modificarse para adaptarse a diferentes tipos o tamaños de muestras y formatos de ensayo.
Las realizaciones que emplean el bacteriófago recombinante de la invención (es decir, el bacteriófago indicador) pueden permitir la detección rápida de cepas bacterianas específicas deListeriaspp., con tiempos totales de ensayo inferiores a 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12, 12,5, 13.0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 21,0, 21,522,0, 22,5, 23,0, 23,5, 24.0, 24,5 25,0, 25,5, o 26,0 horas, según el tipo de muestra, el tamaño de la muestra y el formato del ensayo. Por ejemplo, la cantidad de tiempo requerido puede ser algo más corta o más larga dependiendo de la cepa de bacteriófago y la cepa de bacterias a detectar en el ensayo, el tipo y tamaño de la muestra a analizar, las condiciones requeridas para la viabilidad de la diana, la complejidad del entorno físico/químico y la concentración de contaminantes bacterianos “ endógenos” no diana.
El bacteriófago (p. ej., el fago T7, T4, P70, P100, A511, LP-ES3A, LP-ES1, LMA4 o LMA8) puede modificarse por ingeniería genética para expresar una luciferasa soluble durante la replicación del fago. La expresión de la luciferasa es impulsada por un promotor de la cápside viral (por ejemplo, el bacteriófago Pecentumvirus o el promotor tardío T4), lo que produce una alta expresión. Los fagos parentales se preparan de manera que estén libres de luciferasa, por lo que la luciferasa detectada en el ensayo debe provenir de la replicación del fago progenie durante la infección de las células bacterianas. Por lo tanto, generalmente no hay necesidad de separar el fago parental del fago progenie.
Lafigura 4representa un ensayo con placa de filtro para detectarListeriautilizando un bacteriófago modificado según una realización de la invención. En resumen, las muestras416que incluyen una bacteria de interés418pueden añadirse a los pocillos402de una placa de filtro multipocillo404y centrifugarse406para concentrar las muestras mediante la eliminación del líquido de la muestra. Los fagos420modificados genéticamente se añaden a los pocillos y se incuban con medios adicionales añadidos durante el tiempo suficiente para la adsorción408, seguida de la infección de las bacterias diana y el avance del ciclo de vida del fago410(por ejemplo, ~ 240 minutos). Finalmente, se añade el sustrato de luciferasa y reacciona con cualquier luciferasa presente424.La emisión resultante se mide en un luminómetro414que detecta la actividad de la luciferasa426.
En algunas realizaciones, no es necesario enriquecer las bacterias de la muestra antes de la prueba. En algunas realizaciones, la muestra puede enriquecerse antes de analizarla mediante incubación en condiciones que fomenten el crecimiento. En tales realizaciones, el período de enriquecimiento puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas o más, dependiendo del tipo y tamaño de la muestra.
Por lo tanto, el bacteriófago indicador comprende una fracción indicadora detectable, y la infección de una sola célula patógena (por ejemplo, una bacteria) puede detectarse mediante una señal amplificada generada a través de la fracción indicadora. Por lo tanto, el método comprende detectar una fracción indicadora producida durante la replicación del fago, en donde la detección del indicador indica que la bacteria de interés está presente en la muestra.
En una realización, la invención comprende un método para detectarListeria spp.en una muestra comprendiendo las etapas de: incubar la muestra con una composición de cóctel comprendiendo al menos un bacteriófago recombinante construido a partir del LMA4 que infecta laListeria ssp.,en donde el bacteriófago recombinante comprende un gen indicador y un promotor exógeno que controla la transcripción del gen indicador, insertado en una región génica tardía del bacteriófago, en donde el gen indicador no es contiguo a un gen que codifica una proteína bacteriófaga estructural y no producen una proteína de fusión, de modo que la expresión de el gen indicador durante la replicación de los bacteriófagos después de la infección de la bacteria huésped da como resultado la producción de un producto proteico indicador soluble; y detectar el producto proteico indicador, en donde la detección positiva del producto proteico indicador indica que laListeria spp.está presente en la muestra. En algunas realizaciones, la cantidad de fracción indicadora detectada corresponde a la cantidad de la bacteria de interés presente en la muestra.
Como se describe con más detalle en la presente memoria, los métodos y sistemas de la invención pueden utilizar un intervalo de concentraciones de bacteriófagos indicadores parentales para infectar las bacterias presentes en la muestra. En algunas realizaciones, el bacteriófago indicador se añaden a la muestra a una concentración suficiente para encontrar, unirse e infectar rápidamente las bacterias diana que están presentes en cantidades muy bajas en la muestra, tal como una sola célula. En algunas realizaciones, la concentración de fagos puede ser suficiente para encontrar, unir e infectar la bacteria diana en menos de una hora. En otras realizaciones, estos eventos pueden producirse en menos de dos horas, o menos de tres horas, o menos de cuatro horas, después de la adición del fago indicador a la muestra. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la concentración de bacteriófagos para la etapa de incubación es mayor de 1 * 105 PFU/ml, mayor de 1 * 106 PFU/ml, o mayor de 1 * 107 PFU/ml.
En ciertas realizaciones, el agente infeccioso recombinante puede purificarse para que esté libre de cualquier proteína indicadora residual que pueda generarse tras la producción de la reserva de agentes infecciosos. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el bacteriófago recombinante puede purificarse utilizando centrifugación en gradiente de densidad isopícnico con cloruro de cesio antes de la incubación con la muestra. Cuando el agente infeccioso es un bacteriófago, esta purificación puede tener el beneficio adicional de eliminar los bacteriófagos que no tienen ADN (es decir, fagos vacíos o “ fantasmas” ).
En algunas realizaciones de los métodos de la invención, el microorganismo puede detectarse sin ningún aislamiento o purificación de los microorganismos de una muestra. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una muestra que contiene uno o más microorganismos de interés puede aplicarse directamente a un recipiente de ensayo, tal como una columna de centrífuga, un pocillo de microtitulación o un filtro, y el ensayo se lleva a cabo en ese recipiente de ensayo. En la presente memoria se describen diversas realizaciones de dichos ensayos.
Las alícuotas de una muestra de ensayo se pueden distribuir directamente en los pocillos de una placa de múltiples pocillos, se puede añadir un fago indicador y, después de un período de tiempo suficiente para la infección, se puede añadir un tampón de lisis, así como un sustrato para la fracción indicadora (por ejemplo, un sustrato de luciferasa para un indicador de luciferasa) y se pueden analizar para detectar la señal indicadora. Algunas realizaciones del método pueden realizarse sobre placas de filtro. Algunas realizaciones del método pueden realizarse con o sin concentración de la muestra antes la infección con fago indicador.
Por ejemplo, en muchos casos, se utilizan placas multipocillo para realizar los ensayos. La elección de las placas (o cualquier otro recipiente en donde pueda hacerse la detección) puede afectar a la etapa de detección. Por ejemplo, algunas placas pueden incluir un fondo de color o blanco, lo que puede afectar a la detección de emisiones de luz. De forma general, las placas blancas tienen una mayor sensibilidad, pero también producen una señal de fondo más alta. Otros colores de las placas pueden generar una señal de fondo más baja, pero también tienen una sensibilidad ligeramente inferior. Además, una de las razones de la señal de fondo es la fuga de luz de un pocillo a otro pocillo adyacente. Hay algunas placas que tienen pocillos blancos, pero el resto de la placa es negra. Esto permite una señal alta dentro del pocillo, pero evita la fuga de luz de pocillo a pocillo y, por lo tanto, puede disminuir la señal de fondo. Por lo tanto, la elección de la placa u otro recipiente de ensayo puede influir en la sensibilidad y en la señal de fondo del ensayo.
Los métodos de la invención pueden comprender varias otras etapas para aumentar la sensibilidad. Por ejemplo, como se describe con más detalle en la presente memoria, el método puede comprender una etapa para lavar la bacteria capturada e infectada, después de añadir el bacteriófago pero antes de incubar, para eliminar el exceso de bacteriófago y/o luciferasa parentales u otra proteína marcadora que contamina la preparación de bacteriófagos.
En algunas realizaciones, la detección del microorganismo de interés puede completarse sin la necesidad de cultivar la muestra como una forma de aumentar la población de microorganismos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el tiempo total requerido para la detección es inferior a 28,0 horas, 27,0 horas, 26,0 horas, 25,0 horas, 24,0 horas, 23,0 horas, 22,0 horas, 21,0 horas, 21,0 horas, 20,0 horas, 19,0 horas, 18,0 horas, 17,0 horas, 16,0 horas, 15,0 horas, 14,0 horas, 13,0 horas, 12,0 horas, 11,0 horas, 10,0 horas, 9,0 horas, 8,0 horas, 7,0 horas, 6,0 horas, 5,0 horas, 4,0 horas, 3,0 horas, 2,5 horas, 2,0 horas, 1,5 horas o menos de 1,0 hora. Minimizar el tiempo necesario para obtener los resultados es fundamental en ensayos alimentarios y ambientales para detectar patógenos.
A diferencia de los ensayos conocidos en la técnica, el método de la invención puede detectar microorganismos individuales. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el método puede detectar tan solo 10 células del microorganismo presente en una muestra. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el bacteriófago recombinante es altamente específico paraListeria spp.En una realización, el bacteriófago recombinante puede distinguirListeria spp.en presencia de otros tipos de bacterias. En ciertas realizaciones, el bacteriófago recombinante puede utilizarse para detectar una sola bacteria del tipo específico en la muestra. En ciertas realizaciones, el bacteriófago recombinante detecta tan solo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 de las bacterias específicas de la muestra.
Por lo tanto, algunos aspectos de la presente invención proporcionan métodos para la detección de microorganismos en una muestra de ensayo mediante una fracción indicadora. En algunos ejemplos, la fracción indicadora puede estar asociada con un agente infeccioso, un bacteriófago indicador. La fracción indicadora puede reaccionar con un sustrato para emitir una señal detectable o puede emitir una señal intrínseca (por ejemplo, proteína fluorescente). En algunas realizaciones, la sensibilidad de detección puede revelar la presencia de tan solo 50, 40, 30, 20, 10, 5 o 2 células del microorganismo de interés en una muestra de prueba. En algunas realizaciones, incluso una sola célula del microorganismo de interés puede producir una señal detectable. En algunas realizaciones de la invención, la composición de cóctel comprende al menos un bacteriófago recombinante construido a partir de LMA4. En algunas realizaciones, otros bacteriófagos son un bacteriófago del Pecentumvirus, del Tequatravirus, del Homburgvirus o del Kuttervirus. En algunas realizaciones, el bacteriófago recombinante adicional se deriva de un bacteriófago específico para ftera. En ciertas realizaciones, un bacteriófago recombinante específico paraListeriaes altamente específico paraListeria spp.
En algunas realizaciones, la fracción indicadora codificada por el agente infeccioso puede detectarse durante o después de la replicación del agente infeccioso. En la técnica se conocen muchos tipos diferentes de biomoléculas detectables adecuadas para su uso como fracciones indicadoras, y muchas están disponibles comercialmente. En algunas realizaciones, el fago indicador comprende una enzima, que sirve como fracción indicadora. En algunas realizaciones, el genoma del fago indicador se modifica para codificar una proteína soluble. En algunas realizaciones, el fago indicador codifica una enzima detectable. El indicador puede emitir luz y/o puede detectarse mediante un cambio de color en un sustrato adicionado. Se comercializan diversas enzimas adecuadas, tales como fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rábano (HRP) o luciferasa (Luc). En algunas realizaciones, estas enzimas pueden servir como fracción indicadora. En algunas realizaciones, la luciferasa de luciérnaga es la fracción indicadora. En algunas realizaciones, la luciferasa deOplophoruses la fracción indicadora. En algunas realizaciones, la luciferasa de luciérnaga es la fracción indicadora. Otras luciferasas modificadas por ingeniería genética u otras enzimas que generan señales detectables también pueden ser fracciones indicadoras adecuadas.
Por lo tanto, en realizaciones, el bacteriófago recombinante de los métodos, sistemas o kits se prepara a partir del bacteriófago LMA4específico de Listeriade tipo silvestre. En algunas realizaciones, el gen indicador codifica una proteína que emite una señal intrínseca, tal como una proteína fluorescente (por ejemplo, una proteína fluorescente verde u otras). El indicador puede emitir luz y/o puede detectarse mediante un cambio de color. En algunas realizaciones, el gen indicador codifica una enzima (por ejemplo, la luciferasa) que interactúa con un sustrato para generar una señal. En algunas realizaciones, el gen indicador es un gen de luciferasa. En algunas realizaciones, el gen de la luciferasa es uno de la luciferasaOplophorus,la luciferasa de Luciérnaga, la luciferasa de Renilla, la luciferasa de Gaussia externa, la luciferasa de Lucía o una luciferasa diseñada como NANOLUC®, Rluc8.6-535 u Orange Nano-lantern.
La detección del indicador puede incluir la detección de emisiones de luz. En algunas realizaciones, puede utilizarse un luminómetro para detectar la reacción del indicador (por ejemplo, la luciferasa) con un sustrato. La detección de RLU se puede lograr con un luminómetro, o también pueden utilizarse otras máquinas o dispositivos. Por ejemplo, un espectrofotómetro, una cámara CCD o una cámara CMOS pueden detectar cambios de color y otras emisiones de luz. RLU absolutas son importantes para la detección, pero la relación señal/fondo también debe ser alta (por ejemplo, > 2,0, > 2,5 o > 3,0) para que se detecten de forma fiable las células individuales o un número reducido de células.
En algunas realizaciones, el fago indicador se modifica genéticamente para que contenga el gen de una enzima, tal como una luciferasa, que solo se produce tras la infección de bacterias que el fago reconoce e infecta específicamente. En algunas realizaciones, la fracción indicadora se expresa al final del ciclo de vida viral. En algunas realizaciones, como se describe en la presente memoria, el indicador es una proteína soluble (por ejemplo, luciferasa soluble) y no se fusiona con una proteína estructural del fago que limita su número de copias.
Por lo tanto, en algunas realizaciones en las que se utilizan fagos indicadores, la invención comprende un método para detectar un microorganismo de interés comprendiendo las etapas de capturar al menos una muestra de bacteria; incubar la al menos una bacteria con una pluralidad de fagos indicadores; dejar tiempo para que la infección y la replicación generen el fago de la progenie y expresen la fracción indicadora soluble; y detectar el fago de progenie, o preferiblemente el indicador, en donde la detección del indicador demuestra que la bacteria está presente en la muestra.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, la bacteria de la muestra de ensayo puede capturarse por unión a la superficie de una placa o filtrando la muestra a través de un filtro bacteriológico (por ejemplo, un filtro de centrífuga o un filtro de placa con un tamaño de poro de 0,45 pm). En un ejemplo, el agente infeccioso (por ejemplo, el fago indicador) se añade en un volumen mínimo a la muestra capturada directamente sobre el filtro. En una realización, el microorganismo capturado en la superficie del filtro o la placa se lava posteriormente una o más veces para eliminar el exceso de agente infeccioso no unido. En una realización, se puede agregar un medio (por ejemplo, caldo Luria-Bertani (LB), agua de peptona tamponada(Buffered Peptone Water,BPW), caldo de soja triptófano o caldo de soja triptona(Tryptic Soy Broth or Tryptone Soy Broth,TSB), caldo de enriquecimiento de listeria tamponado(Buffered Listeria Enrichment Broth,BLEB), infusión de cerebro y corazón(Brain Heart Infusion,BHI), caldo de la Universidad de Vermont(University of Vermont,UVM) o caldo Fraser) para un mayor tiempo de incubación, para permitir la replicación de células bacterianas y fagos y la expresión de alto nivel del gen que codifica la fracción indicadora.. Sin embargo, un aspecto sorprendente de algunos ejemplos de ensayos de ensayo es que la etapa de incubación con el fago indicador solo necesita ser lo suficientemente larga para un único ciclo de vida del fago. Anteriormente se pensaba que el poder de amplificación del uso de bacteriófagos requería más tiempo, de modo que el fago se replicaría durante varios ciclos.
Un único ciclo de replicación del fago indicador puede ser suficiente para facilitar la detección rápida y sensible según algunas realizaciones de la presente invención.
En algunas realizaciones, se pueden aplicar alícuotas de una muestra de prueba que comprende bacterias a una columna de centrifugación y, después de la infección con un bacteriófago recombinante y un lavado opcional para eliminar cualquier exceso de bacteriófago, la cantidad de indicador soluble detectado será proporcional a la cantidad de bacteriófagos que producen las bacterias infectadas.
El indicador soluble (por ejemplo, luciferasa) liberado en el líquido circundante tras la lisis de la bacteria puede medirse y cuantificarse a continuación. En un ejemplo, la solución se hace pasar a través del filtro y el filtrado se recoge para su análisis en un nuevo receptáculo (por ejemplo, en un luminómetro) tras la adición de un sustrato para la enzima indicadora (por ejemplo, un sustrato de luciferasa). De forma alternativa, la señal indicadora puede medirse directamente en el filtro.
En diversas realizaciones, el fago indicador parental purificado no comprende el indicador detectable en sí mismo, porque el fago parental se puede purificar antes de utilizarlo para la incubación con una muestra de ensayo. La expresión de genes tardíos (clase III) se produce al final del ciclo de vida viral. En algunas realizaciones de la presente invención, el fago parental puede purificarse para excluir cualquier proteína indicadora existente (por ejemplo, la luciferasa). En algunas realizaciones, la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago después de la infección de la bacteria huésped da como resultado un producto de proteína indicadora soluble. Por lo tanto, en muchos casos, no es necesario separar el fago parental del de la progenie antes de la etapa de detección. En una realización, el microorganismo es una bacteria y el fago indicador es un bacteriófago. En una realización, la fracción indicadora es la luciferasa soluble, que se libera tras la lisis del microorganismo huésped.
Por lo tanto, en una realización alternativa, el sustrato indicador (por ejemplo, el sustrato de luciferasa) puede incubarse con la parte de la muestra que permanece en un filtro o unida a la superficie de una placa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el soporte sólido es una placa de filtro de 96 pocillos (o una placa normal de 96 pocillos), y la reacción del sustrato puede detectarse poniendo la placa directamente en el luminómetro.
Por ejemplo, en una realización, la invención puede comprender un método para detectarListeria spp.comprendiendo las etapas de: infectar las células capturadas en una placa filtrante de 96 pocillos con una pluralidad de fagos indicadores parentales capaces de expresar la luciferasa tras la infección; eliminar por lavado el exceso de fagos; añadir caldo BHI y dejar tiempo para que el fago se replique y lise laListeria sppespecífica diana (p. ej., 60 a 240 minutos); y detectar la luciferasa indicadora añadiendo sustrato de luciferasa y midiendo la actividad de la luciferasa directamente en la placa de 96 pocillos, en donde la detección de la actividad de la luciferasa indica que laListeria spp.está presente en la muestra.
En otra realización, la invención puede comprender un método para detectarListeria spp.comprendiendo las etapas de: infectar las células en solución o suspensión líquida en una placa de 96 pocillos con una pluralidad de fagos indicadores parentales capaces de expresar la luciferasa tras la infección; dar tiempo a que el fago se replique y lise laListeria sppdiana específica. (p. ej., 60 a 240 minutos); y detectar la luciferasa indicadora añadiendo sustrato de luciferasa y midiendo la actividad de la luciferasa directamente en la placa de 96 pocillos, en donde la detección de la actividad de la luciferasa indica que laListeria spp.está presente en la muestra. En tal realización, no es necesaria ninguna etapa de captura. En algunas realizaciones, la solución o suspensión líquida puede ser una muestra de prueba consumible, tal como un lavado de verduras. En algunas realizaciones, la solución o suspensión líquida puede ser un lavado de vegetales fortificado con caldo Luria-Bertani (LB) concentrado, agua de peptona tamponada (BPW) o caldo de soja triptona o caldo de soja triptona (TSB), caldo de enriquecimiento de Listeria tamponado (BLEB), infusión de cerebro y corazón (BHI), caldo de la Universidad de Vermont (UVM) o caldo Fraser. En algunas realizaciones, la solución o suspensión líquida puede ser una bacteria diluida en caldo BHI.
En algunas realizaciones, la lisis de la bacteria puede ocurrir antes, durante o después de la etapa de detección. Los experimentos sugieren que las células infectadas no lisadas pueden detectarse tras la adición del sustrato de luciferasa en algunas realizaciones. Presumiblemente, la luciferasa puede salir de las células y/o el sustrato de la luciferasa puede entrar en las células sin una lisis celular completa. Por lo tanto, en los casos en los que se utiliza el sistema de filtro giratorio, en los que solo se analiza en el luminómetro la luciferasa liberada en el lisado (y no la luciferasa que aún se encuentra dentro de las bacterias intactas), se requiere la lisis para la detección. Sin embargo, en los casos en los que se utilizan placas de filtro o placas de 96 pocillos con la muestra en solución o suspensión, en los que la placa original llena de células intactas y lisadas se ensaya directamente en el luminómetro, la lisis no es necesaria para la detección.
En algunas realizaciones, la reacción de la fracción indicadora (por ejemplo, la luciferasa) con el sustrato puede continuar durante 60 minutos o más, y la detección en varios puntos temporales puede ser deseable para optimizar la sensibilidad. Por ejemplo, en las realizaciones en las que se utilizan placas de filtro de 96 pocillos como soporte sólido y luciferasa como indicador, las lecturas del luminómetro pueden tomarse inicialmente y a intervalos de 10 o 15 minutos hasta que se complete la reacción.
Sorprendentemente, las altas concentraciones de fagos utilizadas para infectar las muestras de prueba han logrado detectar con éxito un número muy bajo de un microorganismo diana en un período de tiempo muy corto. La incubación del fago con una muestra de ensayo en algunas realizaciones solo necesita ser lo suficientemente larga para un único ciclo de vida del fago. En algunas realizaciones, la concentración de bacteriófagos para esta etapa de incubación es superior a 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1,0 x 107, 1,1 x 107, 1,2 x 107, 1,3 x 107, 1,4 x 107, 1,5 x 107, 1,6 x 107, 1,7 x 107, 1,8 x 107, 1,9 x 107, 2,0 x 107, 3,0 x 107, 4,0 x 107, 5,0 x 107, 6,0 x 107, 7,0 x 107, 8,0 x 107, 9,0 x 107 o 1,0 x 108 PFU/ml.
El éxito con concentraciones tan altas de fagos es sorprendente porque la gran cantidad de fagos se asociaba anteriormente con la “ lisis desde el exterior” , que destruía las células diana y, por lo tanto, impedía la generación de señales útiles a partir de ensayos anteriores con fagos. Es posible que la limpieza de las reservas de fagos preparadas descritas en la presente memoria ayude a aliviar este problema (por ejemplo, la limpieza mediante ultracentrifugación con gradiente de densidad isopícnico de cloruro de cesio), porque además de eliminar cualquier luciferasa contaminante asociada con el fago, esta limpieza también puede eliminar las partículas fantasma (partículas que han perdido ADN). Las partículas fantasma pueden lisar las células bacterianas mediante “ lisis externa” , matando las células prematuramente e impidiendo de este modo la generación de una señal indicadora. La microscopía electrónica demuestra que un lisado de fagos crudo (es decir, antes de la limpieza con cloruro de cesio) puede tener más del 50 % de fantasmas. Estas partículas fantasma pueden contribuir a la muerte prematura del microorganismo a través de la acción de muchas partículas de fagos que perforan la membrana celular. Por lo tanto, las partículas fantasma pueden haber contribuido a problemas anteriores en los que se informó que las altas concentraciones de PFU eran perjudiciales. Además, una preparación de fagos muy limpia permite realizar el ensayo sin etapas de lavado, lo que hace posible realizar el ensayo sin una etapa de concentración inicial. Algunas realizaciones incluyen una etapa de concentración inicial y, en algunas realizaciones, esta etapa de concentración permite un tiempo de incubación de enriquecimiento más corto.
Algunas realizaciones de los métodos de prueba pueden incluir además ensayos confirmatorios. En la técnica se conocen diversos ensayos para confirmar un resultado inicial, normalmente en un momento posterior. Por ejemplo, las muestras se pueden cultivar (por ejemplo, mediante cultivo cromogénico selectivo) y se puede utilizar PCR para confirmar la presencia del ADN microbiano, o se pueden utilizar otros ensayos de confirmación para confirmar el resultado inicial.
En ciertas realizaciones, los métodos de la presente invención combinan el uso de un agente de unión (por ejemplo, un anticuerpo) para purificar y/o concentrar un microorganismo de interés, tal comoListeria spp.de la muestra, además de la detección con un agente infeccioso. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la presente invención comprende un método para detectar un microorganismo de interés en una muestra comprendiendo las etapas de: capturar el microorganismo de la muestra sobre un soporte anterior utilizando un anticuerpo de captura específico para el microorganismo de interés, tal comoListeria spp.;incubar la muestra con un bacteriófago recombinante que infectaListeria spp.en donde el bacteriófago recombinante comprende un gen indicador insertado en una región génica tardía del bacteriófago, de manera que la expresión del gen indicador durante la replicación del bacteriófago tras la infección de la bacteria huésped da como resultado un producto proteico indicador soluble; y detectar el producto proteico indicador, en donde la detección positiva del producto proteico indicador indica queListeria spp.está presente en la muestra.
En algunas realizaciones, fagos sintéticos se diseñan para optimizar los rasgos deseables para su uso en ensayos de detección de patógenos. En algunas realizaciones, la bioinformática y los análisis previos de las modificaciones genéticas se emplean para optimizar los rasgos deseables. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los genes que codifican las proteínas de la cola de los fagos pueden optimizarse para reconocer y unirse a especies particulares de bacterias. En otras realizaciones, los genes que codifican las proteínas de la cola de los fagos pueden optimizarse para reconocer y unirse a un género completo de bacterias, o a un grupo particular de especies dentro de un género. De esta manera, el fago puede optimizarse para detectar grupos de patógenos más amplios o más estrechos. En algunas realizaciones, el fago sintético puede diseñarse para mejorar la expresión del gen marcador. Además y/o como alternativa, en algunos casos, el fago sintético puede diseñarse para aumentar el tamaño del arranque(burst)del fago para mejorar la detección.
En algunas realizaciones, la estabilidad del fago puede optimizarse para mejorar la vida útil. Por ejemplo, la solubilidad enzibiótica puede aumentarse para aumentar la estabilidad posterior de los fagos. Además y/o como alternativa, se puede optimizar la termoestabilidad de los fagos. Fagos termoestables preservan mejor la actividad funcional durante el almacenamiento, lo que aumenta la vida útil. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la termoestabilidad y/o la tolerancia al pH pueden optimizarse.
En algunas realizaciones, el fago modificado genéticamente o el fago derivado sintéticamente comprenden un indicador detectable. En algunas realizaciones, el indicador es una luciferasa. En algunas realizaciones, el genoma del fago comprende un gen indicador (por ejemplo, un gen de luciferasa u otro gen que codifica un indicador detectable).
Sistemas y kits de la invención
En algunas realizaciones, la invención comprende sistemas (por ejemplo, sistemas automatizados o kits) comprendiendo componentes para realizar los métodos definidos en las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones, los fagos indicadores están comprendidos en los sistemas o kits según la invención. Los métodos descritos en la presente memoria también pueden utilizar dichos sistemas o kits de fagos indicadores. Algunas realizaciones descritas en la presente memoria son especialmente adecuadas para la automatización y/o kits, dada la cantidad mínima de reactivos y materiales requerida para llevar a cabo los métodos. En ciertas realizaciones, cada uno de los componentes de un kit puede comprender una unidad autónoma que se puede entregar desde un primer sitio a un segundo sitio.
En algunas realizaciones, la invención comprende sistemas o kits para la detección rápida de unaListeria spp.de interés en una muestra. En ciertas realizaciones, los sistemas o kits pueden comprender un componente para incubar la muestra con el cóctel. La composición comprende al menos un bacteriófago recombinante construido a partir del LMA4, el bacteriófago recombinante comprende un gen indicador y un promotor exógeno que controla la transcripción del gen indicador, insertado en una región génica tardía del genoma de un bacteriófago, en donde el gen indicador no es contiguo a un gen que codifica una proteína bacteriófaga estructural y no produce una proteína de fusión., y en donde la expresión del gen indicador da como resultado un producto proteico indicador, y en donde el bacteriófago recombinante infecta específicamenteListeria spp.Algunos sistemas comprenden además un componente para capturar el microorganismo de interés sobre un soporte sólido.
En otras realizaciones, la invención comprende un método, sistema o kit para la detección rápida de un microorganismo de interés en una muestra, comprendiendo una composición de cóctel comprendiendo al menos un bacteriófago recombinante construido a partir del LMA4, el bacteriófago recombinante comprendiendo un gen indicador y un promotor exógeno que controla la transcripción del gen indicador, insertado en una región génica tardía de un genoma de bacteriófago, en donde el gen indicador no es contiguo a un gen que codifica un proteína bacteriófaga y no produce una fusión proteína, y en donde la expresión del gen indicador da como resultado un producto proteico indicador, y en donde el bacteriófago recombinante infecta específicamente aListeria spp. Enuna realización, el bacteriófago recombinante puede distinguirListeria spp.en presencia de otros tipos de bacterias. En ciertas realizaciones, un sistema o kit detecta tan solo 1, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 bacterias específicas en la muestra.
En ciertas realizaciones, los sistemas y/o kits pueden comprender además un componente para lavar la muestra de microorganismos capturada. Adicional o alternativamente, los sistemas y/o kits pueden comprender además un componente para determinar la cantidad de la fracción indicadora, en donde la cantidad del fracción indicador detectado corresponde a la cantidad de microorganismo en la muestra. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el sistema o kit puede comprender un luminómetro u otro dispositivo para medir la actividad de la enzima luciferasa.
En algunos sistemas y/o kits, puede utilizarse el mismo componente para varias etapas. En algunos sistemas y/o kits, las etapas son automatizadas o controladas por el usuario mediante una entrada de ordenador y/o en donde un robot de manipulación de líquidos realiza al menos una etapa.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la invención puede comprender un sistema o kit para la detección rápida deListeria spp.según las reivindicaciones adjuntas.
El agente infeccioso puede comprender el bacteriófago NANOLUC®específico de Listeriaque porta el gen indicador NANOLUC®. Los sistemas o kits pueden comprender una variedad de componentes para la detección de agentes infecciosos de la progenie. Por ejemplo, el agente infeccioso de la progenie (bacteriófago) comprende un fracción indicadora. En una realización, la fracción indicadora en el agente infeccioso de la progenie (bacteriófago) puede ser una fracción detectable que se expresa durante la replicación, tal como una proteína luciferasa soluble.
Sistemas informáticos y medios legibles por ordenador que no forman parte de la invención
El sistema, tal como se describe en la presente técnica o cualquiera de sus componentes, se puede incorporar en forma de un sistema informático. Ejemplos típicos de un sistema informático incluyen un ordenador de uso general, un microprocesador programado, un microcontrolador, un elemento de circuito integrado periférico y otros dispositivos o disposiciones de dispositivos que son capaces de ejecutar las etapas que constituyen el método de la presente técnica.
Un sistema informático puede comprender un ordenador, un dispositivo de entrada, una unidad de visualización y/o Internet. El ordenador puede comprender además un microprocesador. El microprocesador puede estar conectado a un bus de comunicación. El ordenador también puede incluir una memoria. La memoria puede incluir una memoria de acceso aleatorio (RAM) y una memoria de solo lectura (ROM). El sistema informático puede comprender además un dispositivo de almacenamiento. El dispositivo de almacenamiento puede ser una unidad de disco duro o una unidad de almacenamiento extraíble, tal como una unidad de disquete, una unidad de disco óptico, etc. El dispositivo de almacenamiento también puede ser otro medio similar para cargar programas informáticos u otras instrucciones en el sistema informático. El sistema informático también puede incluir una unidad de comunicación. La unidad de comunicación permite que el ordenador se conecte a otras bases de datos y a Internet a través de una interfaz de E/S. La unidad de comunicación permite la transferencia a, así como la recepción de datos de, otras bases de datos. La unidad de comunicación puede incluir un módem, una tarjeta Ethernet o cualquier dispositivo similar que permita al sistema informático conectarse a bases de datos y redes tales como LAN, MAN,<w>A<n>e Internet. Por lo tanto, el sistema informático puede facilitar las entradas de un usuario a través de un dispositivo de entrada, accesible al sistema a través de la interfaz de E/S.
Un dispositivo informático incluirá de forma típica un sistema operativo que proporciona instrucciones de programa ejecutables para la administración y el funcionamiento general de ese dispositivo informático, y normalmente incluirá un medio de almacenamiento legible por ordenador (por ejemplo, un disco duro, una memoria de acceso aleatorio, una memoria de solo lectura, etc.) que almacena instrucciones que, cuando son ejecutadas por un procesador del servidor, permiten al dispositivo informático realizar las funciones previstas. Se conocen implementaciones adecuadas para el sistema operativo y la funcionalidad general del dispositivo informático o se comercializan, y son fácilmente implementadas por personas con experiencia ordinaria en la técnica, especialmente a la luz de la descripción en la presente memoria.
El sistema informático ejecuta un conjunto de instrucciones que se almacenan en uno o más elementos de almacenamiento, para procesar los datos de entrada. Los elementos de almacenamiento también pueden contener datos u otra información, según se desee. El elemento de almacenamiento puede tener la forma de una fuente de información o un elemento de memoria física presente en la máquina de procesamiento.
El entorno puede incluir una variedad de almacenes de datos y otros medios de memoria y almacenamiento, como se ha explicado anteriormente. Pueden residir en una variedad de localizaciones, como en un medio de almacenamiento local (o residente en) uno o más de los equipos o de forma remota desde cualquiera o todos los equipos de la red. En un conjunto particular de realizaciones, la información puede residir en una red de área de almacenamiento(“ Storage Area Network,SAN” ) familiar para los expertos en la técnica. Del mismo modo, cualquier archivo necesario para realizar las funciones atribuidas a los ordenadores, servidores u otros dispositivos de red puede almacenarse de forma local y/o remota, según corresponda. Cuando un sistema incluye dispositivos informáticos, cada uno de estos dispositivos puede incluir elementos de hardware que pueden acoplarse eléctricamente a través de un bus, los elementos incluyen, por ejemplo, al menos una unidad central de procesamiento (CPU), al menos un dispositivo de entrada (por ejemplo, un ratón, un teclado, un controlador, una pantalla táctil o un teclado) y al menos un dispositivo de salida (por ejemplo, un dispositivo de visualización, una impresora o un altavoz). Dicho sistema también puede incluir uno o más dispositivos de almacenamiento, tales como unidades de disco, dispositivos de almacenamiento óptico y dispositivos de almacenamiento de estado sólido, tales como memoria de acceso aleatorio (“ RAM” ) o memoria de solo lectura (“ ROM” ), así como dispositivos multimedia extraíbles, tarjetas de memoria, tarjetas flash, etc.
Dichos dispositivos también pueden incluir un lector de medios de almacenamiento legible por ordenador, un dispositivo de comunicaciones (por ejemplo, un módem, una tarjeta de red (inalámbrica o cableada), un dispositivo de comunicación por infrarrojos, etc.) y una memoria de trabajo como se ha descrito anteriormente. El lector de medios de almacenamiento legibles por ordenador puede conectarse con, o configurarse para recibir, un medio de almacenamiento legible por ordenador, que representa dispositivos de almacenamiento remotos, locales, fijos y/o extraíbles, así como medios de almacenamiento para contener, almacenar, transmitir y recuperar de forma temporal y/o más permanente información legible por ordenador. El sistema y los diversos dispositivos también incluirán normalmente una serie de aplicaciones de software, módulos, servicios u otros elementos localizados en al menos un dispositivo de memoria de trabajo, incluidos un sistema operativo y programas de aplicación, tales como una aplicación cliente o un navegador web. Debe apreciarse que las realizaciones alternativas pueden tener numerosas variaciones con respecto a las descritas anteriormente. Por ejemplo, también puede utilizarse hardware personalizado y/o pueden incorporarse elementos particulares en hardware, software (incluido software portátil, como applets) o ambos. Además, puede emplearse la conexión a otros dispositivos informáticos, tales como dispositivos de entrada/salida de red.
Los medios de almacenamiento no transitorios y los medios legibles por ordenador para contener código, o partes de código, pueden incluir cualquier medio apropiado conocido o utilizado en la técnica, incluidos medios de almacenamiento y medios de comunicación, tales como, entre otros, medios volátiles y no volátiles, extraíbles y no extraíbles ejecutados en cualquier método o tecnología para el almacenamiento y/o la transmisión de información, como instrucciones legibles por ordenador, estructuras de datos, módulos de programa u otros datos, incluidos RAM, ROM, EEPROM, memoria flash u otra tecnología de memoria, CD-ROM, disco versátil digital (DVD) u otro dispositivo de almacenamiento óptico, casetes magnéticos, cinta magnética, almacenamiento en disco magnético u otros dispositivos de almacenamiento magnético, o cualquier otro medio que pueda utilizarse para almacenar la información deseada y al que pueda accederse mediante un dispositivo del sistema. Basándose en la descripción y en los principios proporcionados en la presente memoria, un experto en la técnica apreciará otras formas y/o métodos para ejecutar las diversas realizaciones.
Un medio legible por ordenador puede comprender, aunque no de forma limitativa, un dispositivo de almacenamiento electrónico, óptico, magnético u otro capaz de proporcionar a un procesador instrucciones legibles por ordenador. Otros ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa, disquete, CD-ROM, DVD, disco magnético, chip de memoria, ROM, RAM, SRAM, DRAM, memoria direccionable por contenido (“ CAM” ), DDR, memoria flash como flash NAND o NOR, un ASIC, procesador configurado, almacenamiento óptico, cinta magnética u otro medio de almacenamiento magnético, o cualquier otro medio desde el que un procesador de ordenador pueda leer instrucciones. En una realización el dispositivo informático puede comprender un único tipo de medio legible por ordenador, tal como una memoria de acceso aleatorio (RAM). En otras realizaciones, el dispositivo informático puede comprender dos o más tipos de medios legibles por ordenador, tales como una memoria de acceso aleatorio (RAM), una unidad de disco y una memoria caché. El dispositivo informático puede estar en comunicación con uno o más medios externos legibles por ordenador, tales como una unidad de disco duro externa o una unidad de DVD o Blu-Ray externa.
Como se ha descrito anteriormente, la realización comprende un procesador que está configurado para ejecutar instrucciones de programa ejecutables por ordenador y/o para acceder a la información almacenada en la memoria. Las instrucciones pueden comprender instrucciones específicas del procesador generadas por un compilador y/o un intérprete a partir de código escrito en cualquier lenguaje de programación de ordenador adecuado, incluyendo, por ejemplo, C, C++, C#, Visual Basic, Java, Python, Perl, JavaScript y ActionScript (Adobe Systems, Mountain View, California). En una realización, el dispositivo informático comprende un único procesador. En otras realizaciones, el dispositivo comprende dos o más procesadores. Tales procesadores pueden comprender un microprocesador, un procesador de señales digitales (<d>S<p>, por sus siglas en inglés), un circuito integrado de aplicación específica (ASIC, por sus siglas en inglés), matrices de puertas programables en campo (FPGA, por sus siglas en inglés) y máquinas de estado. tales procesadores pueden comprender además dispositivos electrónicos programables tales como PLC, controladores de interrupción programables (PIC, por sus siglas en inglés), dispositivos lógicos programables (PLD, por sus siglas en inglés), memorias de solo lectura programables (PROM, por sus siglas en inglés), memorias de solo lectura programables electrónicamente (EPROM o EEPROM) u otros dispositivos similares.
El dispositivo informático comprende una interfaz de red. En algunas realizaciones, la interfaz de red está configurada para comunicarse a través de enlaces de comunicación cableados o inalámbricos. Por ejemplo, la interfaz de red puede permitir la comunicación a través de redes a través de Ethernet, IEEE 802.11 (Wi-Fi), 802.16 (Wi-Max), Bluetooth, infrarrojos, etc. Como otro ejemplo, la interfaz de red puede permitir la comunicación a través de redes tales como CDMA, GSM, UMTS u otras redes de comunicación celular. En algunas realizaciones, la interfaz de red puede permitir conexiones punto a punto con otro dispositivo, por ejemplo, a través del bus serie universal (USB), FireWire 1394, conexiones en serie o en paralelo, o interfaces similares. Algunas realizaciones de dispositivos informáticos adecuados pueden comprender dos o más interfaces de red para la comunicación a través de una o más redes. En algunas realizaciones, el dispositivo informático puede incluir un almacén de datos además de, o en vez de, una interfaz de red.
Algunas realizaciones de dispositivos informáticos adecuados pueden comprender, o estar en comunicación con, varios dispositivos externos o internos, tales como un ratón, un CD-ROM, un DVD, un teclado, una pantalla, altavoces de audio, uno o más micrófonos o cualquier otro dispositivo de entrada o salida. Por ejemplo, el dispositivo informático puede estar en comunicación con varios dispositivos de interfaz de usuario y una pantalla. La pantalla puede utilizar cualquier tecnología adecuada que incluye, aunque no de forma limitativa, lCd , l Ed , CRT y similares.
El conjunto de instrucciones para su ejecución por el sistema informático puede incluir varios comandos que ordenan a la máquina de procesamiento que realice tareas específicas, tales como las etapas que constituyen el método de la presente técnica. El conjunto de instrucciones puede ser en forma de un programa de software. Además, el software puede ser en forma de una colección de programas separados, un módulo de programa con un programa más grande o una parte de un módulo de programa, como en la presente técnica. El software también puede incluir programación modular en forma de programación orientada a objetos. El procesamiento de los datos de entrada por parte de la máquina de procesamiento puede ser en respuesta a las órdenes del usuario, los resultados del procesamiento anterior o una solicitud realizada por otra máquina de procesamiento.
Ejemplos
Resultados que se muestran en los siguientes ejemplos demuestran la detección de un número bajo de células, tan solo 1 bacteriaListeria,en un tiempo reducido para obtener los resultados.
Ejemplo 1. Creación y aislamiento de fagos indicadores a partir de bacteriófagos específicos deListeria
El fago indicador LMA4.NANOLUC, LMA8.NANOLUC y otros bacteriófagos deListeria específicos para Listeriase crearon mediante recombinación homóloga utilizando procedimientos como los descritos anteriormente. Véanse las figuras 1-3, que representan y describen fagos deListeriarecombinantes derivados de LMA4 y LMA8.
Las secuencias genómicas de estos fagos se obtuvieron mediante la secuenciación del genoma completo utilizando el sistema Illumina MiSeq con ensamblaje de secuenciasde novo.Basándose en genomas previamente conocidos y anotados de fagos relacionados, las regiones génicas tardías y los genes de la proteína principal de la cápside se localizaron en los nuevos genomas de los fagos. Los plásmidos se diseñaron y sintetizaron para insertar NANOLUC® junto con el promotor génico tardío apropiado y el sitio de unión ribosómico, flanqueados por aproximadamente 200-500 pares de bases de secuencia de fagos coincidente para promover la recombinación homóloga.
Las bacterias diana se transformaron con los plásmidos de recombinación homóloga mediante una selección antibiótica adecuada y se infectaron con sus respectivos fagos de tipo silvestre para permitir la recombinación homóloga con el plásmido. Tras la recombinación homóloga para generar los genomas de los bacteriófagos recombinantes, se utilizaron una serie de etapas de titulación y enriquecimiento para aislar bacteriófagos recombinantes específicos que expresan NANOLUC® como se describió anteriormente.
Por último, se llevó a cabo una producción a gran escala para obtener reservas con alta titulación apropiadas para su uso en ensayos de detección deListeria spp.La centrifugación en gradiente de densidad isopícnica con cloruro de cesio se puede utilizar para separar las partículas de fagos de la proteína luciferasa contaminante para reducir el fondo. En otras realizaciones, la centrifugación en gradiente de densidad isopícnica de sacarosa se puede utilizar para separar las partículas de fago de la proteína luciferasa contaminante para reducir el fondo.
Ejemplo 2. Muestra de esponja inoculada - ensayo con esponja para detectarListeria
Muestreadores de esponja de poliuretano EZ Reach se prehumedecieron con caldo Dey/Engley y se punzaron con < 1 CFU (Colony Forming Unit, CFU - Unidad de Formación de Colonia) deListeria monocytogenes,que se diluyó a partir de un cultivo nocturno o con 100 CFU de bacterias de desafío(Cronobacter sakazakii).
El mango de la esponja se rompió y la esponja se colocó en el medio en una bolsa. Se añadió medio de caldo de enriquecimiento de listeria tamponado (BLEB) (Remel) (10 o 90 ml) para cubrir la mayor cantidad posible de esponja. A continuación, la esponja se masajeó suavemente para liberar las bacterias en el medio y se enriqueció a 35 °C durante 16-18 horas o 24 horas. Tras el enriquecimiento, las esponjas se masajearon o exprimieron suavemente para eliminar el líquido y, a continuación, se separaron del medio contenido en la bolsa. A continuación, la bolsa se masajeó suavemente para mezclar el contenido. Se transfirieron alícuotas de 150 pL a una placa de 96 pocillos. La esponja se colocó a continuación en el medio para un mayor enriquecimiento a 35 °C, si fuera necesario.
Las muestras de esponja se analizaron con un cóctel de fagos deListeriadespués de una infección de 1 hora y 4 horas. En resumen, se añadió reactivo de fago (10 pL) a las muestras y las muestras se incubaron a 30 °C durante 1 hora o 4 horas. Finalmente, se añadieron 65 pL del reactivo Luciferase Master Mix a cada pocillo y se mezclaron suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Las muestras se leyeron (es decir, se detectó la luminiscencia) en un instrumento luminómetro (GloMax96) 3 minutos después de la adición del sustrato. Las esponjas/hisopos se volvieron a colocar en la bolsa/tubo y el enriquecimiento continuó a 35 °C durante un total de 24 horas. Opcionalmente, se pueden tomar alícuotas y enriquecerlas aún más y volver a analizarlas.
Los resultados se muestran en lasfiguras 5A y 5B. Una relación señal/fondo (S/B) superior a 3 se consideró positiva. Se determinó que el nivel de fondo era de 100 RLU basándose en las caracterizaciones previas de los fagos. Estos experimentos indican que el ensayo con fagos de Listeria puede detectar un pico de 1 CFU del ATCC 19115 deA. monocytogenestras 16-18 horas de enriquecimiento y 1 hora de infección. Lafigura 5A(10 ml de medio) muestra que las muestras de esponja 1 y 4 fueron negativas para la detección de Listeria (es decir, S/B < 3,0). Las muestras de esponja 2, 3, 5 y el control de 10 CFU fueron todas positivas en todos los tiempos de enriquecimiento e infección.La figura 5B(90 ml de medio) muestra que la esponja 1 fue negativa para la detección deListeria,mientras que todas las demás muestras tuvieron una detección positiva. Estos datos indican que las esponjas con 10 ml de medio agregado generaron una mejor señal con una relación S/B más alta que las muestras con 90 ml de medio agregado.
Por lo tanto, el experimento demuestra que es posible detectar pico de 1 CFU en un cultivo nocturno con todas las condiciones probadas (es decir, enriquecimiento de 16 a 18 horas, 1 hora de infección, 16 a 18 horas de enriquecimiento, 4 horas de infección, 24 horas de enriquecimiento, 1 hora de infección y 24 horas de enriquecimiento, 4 horas de infección).
Ejemplo 3. Muestra de superficie ambiental - ensayo con esponja paraListeria
Superficies de acero inoxidable se inocularon con el número indicado de células en el medio. Las células se dejaron secar en la superficie y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 18-24 horas antes de frotarse con una esponja de poliuretano EZ Reach. Las muestras se humedecieron previamente con medio Letheen (World BioProducts). Se usóListeria monocytogenes19115 como diana yStaphylococcus aureus12600 como cepa de desafío.
El mango de la esponja se rompió y la esponja se volvió a colocar en el medio de la bolsa. Se añadió medio de caldo de enriquecimiento de listeria tamponado (BLEB) (Remel) (20 ml) para cubrir la mayor cantidad posible de esponja en el medio. La esponja se masajeó suavemente para liberar las bacterias en el medio y se enriqueció a 35 °C durante 20 horas. Después del enriquecimiento, las esponjas se masajearon suavemente, se exprimieron para eliminar el líquido y a continuación se separaron del medio en la bolsa. La bolsa se masajeó suavemente para mezclar el contenido. Se transfirieron alícuotas de 150 pL a una placa de 96 pocillos. La esponja se reemplazó en el medio y se incubó a 35 °C si era necesario un enriquecimiento adicional.
Las muestras de esponja se analizaron con un cóctel de fagos de Listeria después de una infección de 1 hora y 4 horas. En resumen, se añadió reactivo de fago (10 pL) a las muestras y se incubó a 30 °C durante 4 horas. Finalmente, se añadieron 65 pL del reactivo Luciferase Master Mix a cada pocillo y se mezclaron suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Las muestras se leyeron (es decir, se detectó la luminiscencia) en un instrumento GloMax96 3 minutos después de la adición del sustrato.
Se añadió reactivo de fago (10<j>L) a las muestras y se incubó a 30 °C durante 4 horas. Finalmente, se añadieron 65<j>L del reactivo Luciferase Master Mix a cada pocilio y se mezclaron suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Las muestras se leyeron (es decir, se detectó la luminiscencia) en un instrumento GloMax963 minutos (180 segundos) después de la adición del sustrato.
Lafigura 6muestra la RLU generada a partir de pasas de hisopos en superficies de acero inoxidable. Las muestras que generaron una RLU >300 se consideraron positivas. Estos datos muestran que el ensayo con fagos de Listeria puede detectar una inoculación superficial de 100 CFU deL. monocytogenescon un enriquecimiento de 20 horas y 4 horas de infección en presencia de una bacteria que no esListeriapresente a un nivel de CFU 10 veces mayor que el de la bacteriaListeriadiana. La muestra 2 y el control negativo fueron negativos para la detección deL. monocytogenes.Todas las demás muestras, incluido el control positivo, fueron positivas. En comparación con los experimentos con esponjas punzadas, los hisopos frotados sobre acero inoxidable requirieron un período de enriquecimiento más prolongado y un nivel de CFU más alto para una detección positiva. Esto se puede atribuir a varias variables, incluido el aumento del daño a las células inoculadas en la superficie en comparación con las de un cultivo nocturno. Las células inoculadas en la superficie normalmente tienen una pérdida significativa de viabilidad. Además, la recuperación de las células de una superficie con esponjas puede ser muy variable.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Una composición de cóctel comprendiendo al menos un bacteriófago recombinante construido a partir de LMA4, comprendiendo:
    (i) un gen indicador, y
    (ii) un promotor exógeno que controla la transcripción del gen indicador, insertado en una región génica tardía del genoma del bacteriófago;
    en donde, el gen indicador no es contiguo a un gen que codifica una proteína bacteriófaga estructural y no produce una proteína de fusión,
    y en donde la expresión del gen indicador da como resultado un producto proteico indicador,
    y en donde el bacteriófago recombinante infecta específicamenteListeria spp.
  2. 2. Un método para detectarListeria spp.en una muestra comprendiendo:
    incubar la muestra con la composición de cóctel según la reivindicación 1; y
    detectar el producto proteico indicador producido por el bacteriófago recombinante, en donde la detección positiva del producto proteico indicador indica queListeria spp.está presente en la muestra.
  3. 3. El método de la reivindicación 2, en donde la muestra es una muestra alimentaria, ambiental, acuática o comercial.
  4. 4. El método de las reivindicaciones 2 a 3, en donde el método detecta tan solo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o una sola bacteria en una muestra de un tamaño estándar para la industria de la seguridad alimentaria.
  5. 5. El método de la reivindicación 3, en donde la muestra de alimento comprende carne, pescado, verduras, huevos, productos lácteos, productos alimenticios secos o fórmula infantil en polvo.
  6. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la muestra se incuba primero en condiciones que favorecen el crecimiento durante un período de enriquecimiento de menos de 24 horas, 23 horas, 22 horas, 21 horas, 20 horas, 19 horas, 18 horas, 17 horas, 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, o 2 horas.
  7. 7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el tiempo total hasta obtener resultados es inferior a 28 horas, 27 horas, 26 horas, 25 horas, 24 horas, 23 horas, 22 horas, 21 horas, 20 horas, 19 horas, 18 horas, 17 horas, 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas o 2 horas.
  8. 8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde la relación entre la señal y el fondo generado al detectar el indicador es de al menos 2,0 o al menos 2,5 o al menos 3,0.
  9. 9. Un kit para detectarListeria spp.,comprendiendo la composición de cóctel según la reivindicación 1.
  10. 10. El kit de la reivindicación 9, comprendiendo además un sustrato para reaccionar con un indicador para detectar el producto proteico soluble expresado por el bacteriófago recombinante.
  11. 11. Un sistema para detectarListeria spp.,comprendiendo la composición de cóctel según la reivindicación 1.
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