ES3030259T3 - Analytical method for glycoconjugates using a capillary-based immunoassay system - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos analíticos para identificar y cuantificar composiciones complejas de glicoconjugados, en particular para el análisis de un glicoconjugado en una muestra que comprende al menos 4 glicoconjugados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento analítico para glicoconjugados usando un sistema de inmunoensayo basado en capilares

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para analizar un glicoconjugado en una muestra de ensayo que comprende una mezcla de al menos 4 glicoconjugados, en particular a procedimientos para analizar un glicoconjugado en una muestra de ensayo que comprende al menos 4 glicoconjugados, en particular en un caso en que el glicoconjugado da lugar a la generación de señales amplias que pueden comprender picos no completamente resueltos.

Antecedentes

Existe una mayor presión de las autoridades reguladoras sobre los fabricantes de productos biofarmacéuticos para que acrediten programas satisfactorios para comprender, medir y controlar la glicosilación en fármacos basados en glicoconjugado. No obstante, el análisis de composiciones complejas de glicoconjugados, tales como vacunas de glicoconjugado, es decir, la identificación y cuantificación de glicoconjugados individuales dentro de dicha composición, es una tarea complicada. Dicho análisis normalmente implica procedimientos laboriosos, tales como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o una inmunotransferencia Western por puntos manual. Un procedimiento de este tipo implica normalmente una gran cantidad de trabajo manual.

Además, el ELISA que se usa frecuentemente no proporciona información sobre diferentes variantes de glicosilación de cada glicoconjugado.

Una alternativa reciente es un procedimiento de inmunoensayo basado en capilares, es decir, una inmunotransferencia Western capilar, que puede automatizarse completamente con excepción de la etapa de preparación de la muestra [véase, por ejemplo, Rustandi et al., Applications of an Automated and Quantitative CE-based Size and Charge Western Blot for Therapeutic Proteins and Vaccines. 2016. En: Tran N., Taverna M. (eds) Capillary Electrophoresis of Proteins and Peptides: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, vol. 1466, páginas 197-217]. Un procedimiento de este tipo puede reducir significativamente la cantidad de trabajo manual, así como el tiempo de análisis general.

En dichos procedimientos, los diferentes componentes de una muestra se separan dentro de un capilar y se detectan por medio de un anticuerpo específico.

Hamm et al. [Analytical Biochemistry 2015, 478: 33-39] describen la identificación de glicoconjugados individuales dentro de una composición de vacuna de glicoconjugado usando un procedimiento de inmunoensayo basado en capilares. Sin embargo, no informan de la cuantificación de los glicoconjugados dentro de dicha composición, sino que se limitan a sugerir la posibilidad de realizar una cuantificación. Por lo tanto, el documento tampoco describe la medición de muestras de calibración para la generación de una curva de calibración. Para lograr una cuantificación precisa de todos los glicoconjugados dentro de una composición de vacuna de glicoconjugado, es obligatorio poder integrar con precisión toda la señal correspondiente a cada glicoconjugado individual. Por lo tanto, este documento solo divulga un ensayo de identidad para glicoconjugados. Por consiguiente, tampoco divulga un programa informático que permita la cuantificación de glicoconjugados que den lugar a la generación de señales amplias que comprenden picos no completamente resueltos. Además, no se divulga ningún análisis de bioconjugados.

Minsker et al. [Vaccine 2020, 38: 7155-7174] describen la identificación y cuantificación relativa de glicoproteínas usando inmunotransferencia Western capilar. En este procedimiento, se detecta el componente proteínico de la glicoproteína y la señal resultante se utiliza para determinar la abundancia relativa de las glicoproteínas. En consecuencia, este procedimiento no incluye la medición de muestras de calibración para la generación de una curva de calibración ni la cuantificación absoluta de glicoproteínas de interés. Además, no se proporcionan detalles sobre el análisis de datos. En su lugar, se indica que "todas las configuraciones no especificadas se aplicaron como recomendaciones predeterminadas del proveedor".

Markely et al. [Biotechnology progress 2015, 32(1): 235-241] describen un procedimiento de inmunoensayo de enfoque isoeléctrico para la cuantificación relativa de diferentes formas sialiladas de una glicoproteína con el fin de supervisar los cambios relativos en la sialilación durante el cultivo celular. Por consiguiente, el documento no describe la generación de una curva de calibración ni la cuantificación absoluta de un glicoconjugado. El análisis de datos en este documento se realizó utilizando el programa informático Compass de acuerdo con las directrices del fabricante.

Sin embargo, en general, la cuantificación de analitos que dan lugar a la generación de señales amplias, en particular señales amplias que comprenden picos no completamente resueltos, sigue siendo un desafío [véase, por ejemplo, la figura 5D en Castle et al., J. Biol. Chem. 2019:294-8 (2642-2650].

Mientras que algunos glicoconjugados pueden dar lugar a la generación de señales estrechas que son cuantificables por los procedimientos de inmunoensayo basados en capilares actualmente disponibles, otros no lo hacen. Por ejemplo, un glicoconjugado que comprende una proteína transportadora EPA con cuatro sitios de glicosilación, puede existir en una forma mono, di-, tri- o tetraglicosilada. Dicho glicoconjugado puede producirse por conjugación enzimática del componente polisacárido con una proteína transportadora, por ejemplo usando la oligosacariltransferasa PglB [véanse, por ejemplo, el documento WO 2015/124769; el documento W<o>2020/191082; Poolman y Wacker, J. Infect. Dis. (2016) v.213(1), páginas 6-13 y referencias en el mismo]. En tal caso, es decir, la conjugación enzimática de un componente polisacárido con una proteína transportadora en una célula, el glicoconjugado también se denomina bioconjugado.

Las señales generadas por dichos bioconjugados tras el análisis por medio de un procedimiento de inmunoensayo basado en capilares son normalmente amplias y comprenden varios picos correspondientes a diferentes estados de glicosilación, por ejemplo, una mezcla de formas mono-, di-, tri- o tetraglicosiladas del bioconjugado que normalmente no están completamente resueltas, es decir, no están separadas en el estado basal.

En tal caso, el sistema de inmunoensayo basado en capilares actualmente disponible, es decir, el sistema WES™ en combinación con el programa informático "Compass for SW, versión 3.1.7" [disponible comercialmente en Bio-techne; https://www.proteinsimple.com/wes.html, consultado el 07 de septiembre de 2020], no proporciona datos cuantitativos fiables sobre la muestra de ensayo.

Por lo tanto, los procedimientos de inmunoensayo basados en capilares conocidos no son adecuados para la identificación y la cuantificación absoluta de todos los glicoconjugados, en particular los glicoconjugados que dan como resultado señales amplias, como es normalmente el caso de los bioconjugados. Estas señales amplias pueden abarcar un intervalo de peso molecular de entre 100 y 500 kDa, normalmente de entre 200 y 400 kDa. Ejemplos de los mismos son bioconjugados que comprenden una proteína transportadora con un número definido de sitios de glicosilación, por ejemplo 1-10, tal como 4, y en los que los glicanos se conjugan con un número limitado de sitios de glicosilación específicos, por ejemplo 1-10, tal como 1, 2, 3 o 4. En particular, este es el caso de los bioconjugados y mezclas de los mismos que comprenden:

• Una proteína transportadora EPA con cuatro sitios de glicosilación y

• Un componente polisacárido correspondiente a diferentes antígenos O deEscherichia coli.

Tal como se ha descrito anteriormente, un bioconjugado de este tipo en el que los glicanos están acoplados a un número limitado de sitios de glicosilación específicos, tal como 4, puede producirse mediante conjugación enzimática del componente polisacárido con una proteína transportadora usando la oligosacariltransferasa PglB [por ejemplo, documento WO 2015/124769; documento WO 2020/191082; Poolman y Wacker, J. Infect. DIS. (2016) v.213(1), páginas 6-13 y referencias en el mismo].

Además, la identificación y cuantificación absoluta de glicoconjugados estrechamente relacionados, es decir, glicoconjugados que solo difieren en el componente PS correspondiente a diferentes serotipos de un antígeno, es un desafío único para cada glicoconjugado, en particular bioconjugados. Dicho análisis mediante un procedimiento de inmunoensayo basado en capilares aún no se ha descrito para los glicoconjugados descritos anteriormente.

También se mencionan los documentos siguientes:

• Minsker et al (2020) Vaccine, 38(45): 7166-7174 que se refiere a la caracterización de glicoproteínas rVSV [Delta] G-ZEBOV-GP utilizando inmunotransferencia Western capilar automatizada;

• Hamm et al (2015) Analytical Biochemistry, 478: 33-39 que se refiere al procedimiento de inmunotransferencia Western por puntos capilar automatizada para la identidad de una vacuna de conjugado neumocócico 15-valente;

• Markely et al (2015) Biotechnology Progress, 32(1): 235-241 que se refiere a un inmunoensayo de enfoque isoeléctrico capilar de alto rendimiento para el análisis mediante huella dactilar de la sialilación de proteínas;

• Driedger et al (2000) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(4): 1135-1139 que se refiere a un procedimiento de fluorescencia inducida por láser por electroforesis capilar para el análisis de glicoalcaloides de patata;

• Wang et al (2016) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 139: 263-268 que se refiere a la evaluación del sistema WES automatizado como herramienta analítica y de caracterización para promover el desarrollo de fármacos de anticuerpos monoclonales; y

• Andrew et al (2019) Journal of Biological Chemistry, 294(8): 2642-5291 que se refiere a la aplicación de un análisis Western de alto rendimiento basado en capilares a la escisión modulada de la proteína celular previa. Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es atenuar estas limitaciones de la técnica anterior

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para analizar un glicoconjugado en una muestra de ensayo que comprende una mezcla de al menos 4 glicoconjugados,

en el que el análisis incluye:

• la identificación de dicho glicoconjugado y

• la cuantificación absoluta de dicho glicoconjugado sobre la base de una curva de calibración; comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes:

(a) proporcionar la muestra de ensayo y un conjunto de muestras de calibración, opcionalmente una muestra de escalera y opcionalmente una muestra de control;

(b) medir, mediante un sistema de inmunoensayo basado en capilares, en capilares individuales: dicha muestra de ensayo, dichas muestras de calibración, opcionalmente dicha muestra de escalera y opcionalmente dicha muestra de control, generando así un conjunto de datos para cada capilar; y

(c) analizar dicho conjunto de datos mediante un programa informático que ofrezca al menos las siguientes funciones:

o la recepción de límites para la integración; y

o el cálculo de una señal de fondo para cada capilar; y

o la sustracción de una señal de fondo de una señal generada en cada capilar.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Análisis de un electroferograma resultante de la medición de un glicoconjugado que comprende una proteína transportadora EPA y un componente PS correspondiente a un antígeno O (serotipo O6) deE. coli,tal como se describe en el ejemplo 1, utilizando la función"Dropped Lines(Líneas Caídas)" del programa informático "Compass for SW, versión 3.1.7" que se incluye en el sistema WES™. Este tipo de cálculo de área también se conoce como procedimiento de caída perpendicular(perpendicular drop).El análisis por medio del programa informático Compass no logra integrar toda el área de señal (solo el área marcada se integró mediante el programa informático Compass). El eje Y representa la intensidad de señal quimioluminiscente y el eje X representa el peso molecular (MW) expresado en kDa.

Figura 2: Integración de electroferogramas resultantes del análisis de un glicoconjugado que comprende una proteína transportadora EPA y un componente PS correspondiente a un antígeno O (serotipo O4) deE. coli,tal como se describe en el ejemplo 1, utilizando el programa informático que se describe en el presente documento. El eje Y representa la intensidad de señal quimioluminiscente y el eje X representa el peso molecular (MW) expresado en kDa. Las mediciones se realizaron utilizando el sistema WES™. El intervalo de integración se indica mediante dos rectángulos verticales a 100 y 480 kDa. La anchura del rectángulo representa la ventana de peso molecular para calcular la señal de fondo para un capilar específico. La señal de fondo se resta automáticamente de la señal resultante del analito dentro del capilar correspondiente. El usuario puede ajustar el intervalo de integración y la anchura de la ventana de peso molecular para calcular la señal de fondo específica del capilar.

1. A) Superposición de electroferogramas resultantes del análisis de cuatro muestras de calibración (se muestra una réplica). Esto se utiliza para generar la curva de calibración.

2. B) Superposición de 4 réplicas del análisis del glicoconjugado anterior en una composición de vacuna de glicoconjugado multivalente que comprende 10 glicoconjugados. Esto confirma la reproducibilidad técnica de la determinación de la identidad y la cuantificación absoluta del analito.

Figura 3: Análisis de electroferogramas resultantes de tres mediciones (triplicados) de un bioconjugado de O-EPA de O25B usando el sistema WES™. El eje Y representa la intensidad de señal quimioluminiscente y el eje X representa el peso molecular (MW) expresado en kDa.

A-C: Integración de mediciones por triplicado de O25B-EPA usando la función"Dropped Lines(Líneas Caídas)" del programa informático "Compass for SW, versión 3.1.8" que se incluye en el sistema WES™, también denominado procedimiento de caída perpendicular. El análisis utilizando el programa informático Compass da lugar a diferentes intervalos de integración (área marcada) para cada medición. En cada caso, el programa informático Compass no puede integrar toda el área de la señal.

D-F: Integración de las mismas mediciones por triplicado de O-EPA de O25B que en A-C, pero la integración se realizó utilizando el programa informático que se describe en el presente documento. El intervalo de integración se indica mediante dos rectángulos verticales a 100 y 570 kDa. La anchura del rectángulo representa la ventana de peso molecular para calcular la señal de fondo para un capilar específico. La señal de fondo se resta automáticamente de la señal resultante del analito dentro del capilar correspondiente. La integración de toda el área de la señal se realiza de una forma reproducible.

Descripción detallada de la invención

A menos que se indique lo contrario, en la presente memoria descriptiva se aplicarán las siguientes definiciones:

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "un", "una", "el", "la" y términos similares que se utilizan en el contexto de la presente invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse de forma que abarquen tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "que incluye", "que contiene" y "que comprende" se usan en el presente documento en su sentido abierto y no limitante. Se entiende que las diversas formas de realización, preferencias e intervalos pueden combinarse a voluntad.

Glicoconjugado:El término "glicoconjugado" se conoce en el sector y describe particularmente entidades químicas unidas covalentemente a uno o más polisacáridos (PS). Dicho glicoconjugado puede obtenerse por conjugación biológica en una célula viva ("bioconjugado" o "conjugado biológico") o puede obtenerse por conjugación química de un polisacárido (glicoconjugado "químico" o "sintético"). Las entidades químicas adecuadas incluyen proteínas/péptidos y lípidos, siendo los glicoconjugados correspondientes glicoproteínas y glicolípidos. Particularmente adecuados, dentro del alcance de la invención, son los glicoconjugados seleccionados del grupo de glicoproteínas. Tal como se ha descrito anteriormente, la identificación y cuantificación absoluta de glicoconjugados que son bioconjugados (es decir, un subgrupo de glicoproteínas) es particularmente complicada utilizando los procedimientos de la técnica anterior. Sin embargo, los bioconjugados son glicoconjugados particularmente adecuados en el contexto de la presente invención.

En más detalle, el término glicoproteína incluye "glicoproteínas tradicionales" y "vacunas de glicoconjugado".

En las glicoproteínas tradicionales, el énfasis reside en la parte proteínica, tal como, por ejemplo, para anticuerpos o eritropoyetina en los que el principio "activo" reside más en la parte proteínica, y los glicanos desempeñan un papel, por ejemplo, en la semivida o en la definición de otras propiedades. Dichas glicoproteínas tradicionales encuentran un uso generalizado en aplicaciones farmacéuticas, tales como en oncología o enfermedades inflamatorias.

En las vacunas de glicoconjugado, el énfasis reside en la parte de glicano, que se desea que proporcione una respuesta inmunitaria porque los glicanos son los antígenos relevantes, y la parte proteínica simplemente sirve como vehículo para llevar a una respuesta inmunitaria de memoria de linfocitos T deseada. Por consiguiente, las vacunas de glicoconjugado difieren de las "glicoproteínas tradicionales" descritas anteriormente.

En formas de realización preferidas, los glicoconjugados son vacunas de glicoconjugado que forman parte de una composición de vacuna de glicoconjugado. Las vacunas de glicoconjugado comprenden una proteína transportadora que está unida a uno o más componentes PS, correspondiendo dichos componentes PS a un antígeno, en particular un antígeno O bacteriano. Los bioconjugados, a diferencia de los glicoconjugados químicos, han surgido recientemente como vacunas de glicoconjugado particularmente adecuadas. Particularmente adecuadas dentro del alcance de la invención son las glicoproteínas seleccionadas del grupo de vacunas de glicoconjugado, más particularmente bioconjugados.

Bioconjugado: El término se ha explicado anteriormente. Específicamente, un bioconjugado es un glicoconjugado preparado en una célula huésped, en el que la maquinaria de la célula huésped produce el glicano y la proteína transportadora y une el glicano a la proteína transportadora, por ejemplo, a través de enlaces N de asparagina o arginina. Una célula huésped particularmente preferida para producir bioconjugados esE. coli, quecomprende preferentemente ácido nucleico que codifica: (i) la proteína transportadora, (ii) una oligosacariltransferasa tal como PglB deC. jejunique es capaz de unir covalentemente polisacáridos de antígeno O a un residuo de asparagina (Asn) en una secuencia consenso de glicosilación (ASN-X-Ser (Thr), en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro) en una proteína transportadora mediante glicosilación ligada a N, y (iii) una agrupación de genesrfbque codifica las enzimas responsables de generar el polisacárido de antígeno O de un serotipo deseado. Al crear células huésped con un locusrfbdiferente, se pueden preparar diferentes bioconjugados, por ejemplo, que comprenden polisacáridos de antígeno O de diferentes serotipos deE. colioShiglla.El cultivo de dichas células huésped producirá los bioconjugados que comprenden la proteína transportadora a la que el polisacárido de antígeno O codificado por el locusrfbestá unido covalentemente, dentro del periplasma de la célula huésped. Una descripción más detallada de la producción de bioconjugados en dichas células huésped puede encontrarse, por ejemplo, en los documentos WO 2009/104074, WO 2015/124769, WO 2017/035181 o WO 2020/191082. Se han descrito variantes optimizadas de la oligosacariltransferasa PglB para la producción de bioconjugados de antígenos O deE. coliespecíficos en el documento WO 2020/191088. La presente invención trata de procedimientos novedosos y mejorados de identificación y cuantificación absoluta de los bioconjugados producidos a partir de dichas células huésped. La célula huésped para la producción de bioconjugados es normalmente una célula bacteriana, preferentemente una célula bacteriana gramnegativa, y en formas de realización preferidas la célula huésped esE. coli.

Los bioconjugados particularmente útiles incluyen proteínas transportadoras a las que se unen uno o más polisacáridos. Dichos bioconjugados se utilizan, por ejemplo, como componentes activos de determinadas vacunas, que tienen como objetivo inducir respuestas inmunitarias funcionales contra los polisacáridos de los bioconjugados. En formas de realización de la invención, dicho bioconjugado comprende una proteína transportadora y uno o más polisacáridos unidos covalentemente a dicha proteína transportadora, preferentemente de 1 a 4 polisacáridos unidos covalentemente a dicha proteína transportadora.

En formas de realización de la invención, el bioconjugado es un producto de conjugación que contiene un polisacárido de antígeno O deE. coliunido covalentemente a una proteína transportadora. En formas de realización de la invención, el bioconjugado es un producto de conjugación que contiene un polisacárido de antígeno O deShigellaunido covalentemente a una proteína transportadora.

El término antígeno O se conoce en el sector y se usa en su contexto normal, no debe confundirse con ligado en O. En formas de realización típicas, el polisacárido de antígeno O está ligado en N a la proteína transportadora. El término polisacárido de antígeno O generalmente se refiere a un polímero de glicano repetitivo contenido dentro de un LPS de una bacteria, tal comoE. coli.El antígeno O deE. colies un polímero de oligosacáridos de repetición inmunogénicos (normalmente 1 -40 unidades de repetición, por ejemplo 5-30 unidades de repetición) y se utiliza normalmente para el serotipado y la producción de vacunas de glicoconjugado.

Proteína transportadora:El término se ha explicado anteriormente. En formas de realización particulares de la invención, la proteína transportadora es una exotoxina A dePseudomonas aeruginosa(EPA; los términos exotoxina A y exoproteína A deP. aeruginosa,o EPA, se usan indistintamente) detoxificada. En tales formas de realización, la EPA comprende preferentemente de 1 a 10, preferentemente de 2 a 4, sitios de glicosilación.

En una forma de realización particular, la EPA comprende cuatro sitios de glicosilación. En una forma de realización particular, la EPA comprende cuatro sitios de glicosilación que tienen la SEQ ID NO 1, preferentemente que tienen la SEQ ID NO 2. Véanse, por ejemplo, el documento WO 2015/124769, el documento WO 2017/035181 o el documento WO 2020/191082 para una descripción de ejemplos de bioconjugación de diversos polisacáridos de antígeno O deE. colicon la proteína transportadora EPA, y una secuencia de aminoácidos representativa de la proteína transportadora EPA. Véase, por ejemplo, el documento WO 2009/104074 para una descripción de ejemplos de bioconjugación de polisacáridos de antígeno O deShigellacon proteína transportadora EPA.

Para EPA, se han descrito varias variantes de proteína detoxificada en la literatura, que podrían usarse como proteínas transportadoras. Por ejemplo, la detoxificación puede lograrse mutando y eliminando los residuos catalíticamente esenciales L552V y AE553.

En una forma de realización preferida no limitante, la proteína transportadora de un bioconjugado según la invención comprende la SEQ ID NO: 3.

Un glicoconjugado, en particular un bioconjugado, que comprende una proteína transportadora EPA con cuatro sitios de glicosilación puede existir en una forma mono-, di-, tri- o tetraglicosilada.

Polisacárido:El término "polisacárido" es conocido en el sector y describe particularmente hidratos de carbono poliméricos compuestos por unidades de monosacáridos unidas entre sí por enlaces glucosídicos, ya sean lineales o ramificados. Dichos polisacáridos se caracterizan por sus unidades de repetición, cada unidad de repetición descrita con su respectiva composición de monosacáridos. Dichas unidades de repetición incluyen uno o más monosacáridos que también pueden estar químicamente modificados (por ejemplo, aminados, amidados, sulfonados, acetilados, fosforilados, etc). Los monosacáridos que se encuentran normalmente en dichas unidades de repetición son monosacáridos cíclicos o lineales que contienen de tres a siete átomos de carbono. En el caso específico de vacunas de glicoconjugado, el polisacárido conjugado se origina a partir de una especie patógena (por ejemplo,Escherichia coli), estando dicha unidad de repetición definida por la genética del patógeno específico. Por lo tanto, la unidad de repetición puede ser un marcador/identificador específico del patógeno.

El término "componente polisacárido", por consiguiente, designa una o más cadenas de glicanos de un glicoconjugado. Los glicanos pueden ser monómeros o polímeros de residuos de azúcar, pero normalmente contienen al menos tres azúcares y pueden ser lineales o ramificados. Un glicano puede incluir residuos de azúcar naturales (por ejemplo, glucosa, N-acetilglucosamina, ácido N-acetilneuramínico, galactosa, manosa, fucosa, arabinosa, ribosa, xilosa, etc.) y/o azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, 2'-desoxirribosa, fosfomanosa, 6'-sulfo N-acetilglucosamina, etc). El término "glicano" incluye homo- y heteropolímeros de residuos de azúcar. El término "glicano" también abarca un componente de glicano de un glicoconjugado (por ejemplo, de una glicoproteína, glicopéptido, glicolípido). El término también abarca glicanos libres, incluidos glicanos que se han escindido o liberado de otro modo a partir de un glicoconjugado.

El término "polisacárido O-acetilado", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a polisacáridos en los que uno o más monosacáridos de la unidad de repetición están modificados químicamente mediante acetilación. Dichos monosacáridos tienen uno o más de sus grupos hidroxilo presentes acetilados. Para las unidades de repetición derivadas de patógenos utilizadas en vacunas de glicoconjugado, la O-acetilación de determinados monosacáridos puede ser esencial para inducir una respuesta inmunitaria para dicho patógeno. En la tabla 1 se muestran ejemplos no limitantes de componentes polisacáridos derivados de patógenos.

El término "serotipo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a glicoconjugados que tienen diferentes cadenas de polisacárido que se derivan de diferentes serotipos bacterianos. Ejemplos de glicanos de un número de serotipos deE. co lise identifican a continuación en la tabla 1.

En formas de realización particulares, el componente PS del glicoconjugado corresponde a diferentes serotipos del "antígeno O" deEscherichia coli (E. coli).

El "antígeno O" es parte del lipopolisacárido (LPS) bacteriano. Los LPS consisten en un lípido y un componente PS, en los que el componente PS se divide adicionalmente en una estructura central y el "antígeno O". Además, cada antígeno O está compuesto por n unidades de repetición, siendo n 1-100, tal como 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, 3-50, 3-40, por ejemplo, al menos 5, tal como 5-40, 5-30, por ejemplo 7-30, por ejemplo de 7 a 25, por ejemplo de 10 a 20, por ejemplo 5-20, unidades de repetición. Cada unidad de repetición comprende monosacáridos no modificados y/o modificados.

El término "monosacáridos modificados" en formas de realización no limitantes incluye N-acetilación, O-acetilación, amidación y/o aminación de monosacáridos. Dichos monosacáridos modificados pueden comprender una o más modificaciones, particularmente una, dos o tres de las modificaciones anteriores, en el mismo monosacárido.

En formas de realización particulares, los monosacáridos modificados son monosacáridos O-acetilados y/o N-acetilados, específicamente monosacáridos que comprenden una O-acetilación o N-acetilación.

En formas de realización de la invención, las unidades de repetición adecuadas comprenden monosacáridos seleccionados del grupo que consiste en manosa, ramosa, glucosa, fucosa, galactosa, manosa modificada, ramosa modificada, glucosa modificada, fucosa modificada y galactosa modificada.

Las estructuras no limitantes e ilustrativas de polisacáridos de antígeno O deE. colise muestran a continuación en la tabla 1. Se muestra una única unidad de repetición para cada polisacárido de antígeno O deE. coli.En esta tabla, cada n es independientemente un número entero de 1 a 100, tal como 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, 3-50, 3-40, 5-30, por ejemplo, al menos 5, tal como 5-40, por ejemplo 7-30, por ejemplo de 7 a 25, por ejemplo de 10 a 20, por ejemplo 5-20, pero en algunos casos puede ser 1-2.

Tabla 1:Estructuras de polisacáridos de antígeno O deE. coli

Los diversos serotipos deE. colidifieren en la composición de azúcar del antígeno O. Sin embargo, dentro de la misma clasificación de serotipo, el antígeno O puede variar en el número de unidades de repetición y el grado de acetilación.

MuestraEl término muestra se conoce en el sector. Incluye cualquier material que, opcionalmente después de una dilución, pueda suministrarse a un sistema analítico. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "muestra de ensayo" se refiere a la muestra que se va a analizar. La muestra de ensayo comprende al menos un glicoconjugado, preferentemente bioconjugado, junto con otros componentes, normalmente una mezcla de al menos cuatro glicoconjugados, preferentemente bioconjugados, y uno o más de otros componentes. Tales muestras incluyen particularmente (i) lotes de producción de glicoconjugados (incluidos lotes en proceso y lotes de producción liberados/almacenados); (ii) composiciones que comprenden múltiples glicoconjugados, tales como composiciones farmacéuticas que comprenden una vacuna multivalente.

Las muestras de ensayo adecuadas comprenden, además del glicoconjugado o los glicoconjugados, (i) una matriz acuosa; (ii) opcionalmente polisacáridos no unidos a proteína transportadora (en el presente documento: "PS libres"); (iii) opcionalmente proteínas no relacionadas; (iv) opcionalmente proteína transportadora exenta de polisacáridos. La matriz acuosa (i) puede contener uno o más de tampones (por ejemplo, tampón de fosfato), sales inorgánicas (por ejemplo, NaCl), alcoholes de azúcar (por ejemplo, D-sorbitol), tensioactivos no iónicos (por ejemplo, polisorbato 80). Las proteínas no relacionadas (iii) pueden incluir hasta el 10% de impurezas relacionadas con el proceso (por ejemplo, proteínas de células huésped). En una forma de realización, la muestra de ensayo comprende al menos 4 y hasta 20 glicoconjugados, por ejemplo, al menos 4 y hasta 12 glicoconjugados, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 glicoconjugados. En determinadas formas de realización, la muestra de ensayo comprende 4, 9 o 10 glicoconjugados.

El término "muestra de calibración" se refiere a una muestra que comprende una concentración conocida del glicoconjugado que se va a analizar. Por lo tanto, un conjunto de muestras de calibración se refiere a una pluralidad de muestras de calibración con concentraciones graduadas del glicoconjugado. El intervalo de concentración del conjunto de muestras de calibración también abarca la concentración esperada del glicoconjugado dentro de la muestra de ensayo. Dicho conjunto de muestras de calibración es adecuado para establecer una curva de calibración para la cuantificación absoluta del glicoconjugado dentro de la muestra de ensayo.

La expresión "muestra de control" se refiere a una muestra que comprende una concentración conocida del glicoconjugado que se va a analizar para verificar la idoneidad del sistema de inmunoensayo basado en capilares para realizar el análisis previsto. Estas muestras de control también se conocen como controles de idoneidad del sistema (SSC). Dichas muestras de control pueden comprender componentes adicionales, tales como un tampón adecuado (por ejemplo, el mismo tampón que la muestra de ensayo), pero comprenden solo un glicoconjugado y, por lo tanto, difieren normalmente de la muestra de ensayo. Normalmente, la concentración del glicoconjugado en la muestra de control es mayor que en la muestra de ensayo.

El término "muestra de escalera", o simplemente "escalera", se refiere a una muestra que comprende un patrón de tamaño. Dichos patrones de tamaño son conocidos y normalmente incluyen una mezcla de proteínas o proteínas modificadas de un peso molecular conocido. Una muestra de escalera adecuada comprende una mezcla de proteínas biotiniladas con pesos moleculares que abarcan el intervalo de 66 kDa a 440 kDa.

Inmunoensayo basado en capilares:El término inmunoensayo se refiere generalmente a un procedimiento de análisis en el que se utiliza un anticuerpo para la identificación y/o cuantificación de componentes específicos dentro de una muestra. En caso de que el ensayo se realice en un capilar, el procedimiento se denomina inmunoensayo basado en capilares. Puede consultarse información detallada, por ejemplo, en Moser et al., Electrophoresis 2008, 29(16): 3279-3295. Alternativamente, la detección por un anticuerpo puede reemplazarse por un aptámero. Dentro del alcance de la invención, un inmunoensayo basado en capilares se refiere a una inmunotransferencia Western basada en capilares automatizada. Los sistemas para realizar tales inmunotransferencias Western basadas en capilares son conocidos en el sector y están disponibles comercialmente. Un ejemplo particular es el sistema Wes™ de Bio-Techne, véase https://www.proteinsimple.com/wes.html, consultado el 7 de septiembre de 2020. Este sistema se ha utilizado para el análisis de varios glicoconjugados [por ejemplo, Rustandi et al., Applications of an Automated and Quantitative CE-Based Size and Charge Western Blot for Therapeutic Proteins and Vaccines. En: Tran N., Taverna M. (eds) Capillary Electrophoresis of Proteins and Peptides. Methods in Molecular Biology, vol. 1466]. Sin embargo, los procedimientos actualmente disponibles no son adecuados para lograr el objetivo de la presente invención, que es la identificación y la cuantificación absoluta de glicoconjugados, particularmente bioconjugados, incluidos aquellos que dan lugar a la generación de señales amplias que comprenden picos no completamente resueltos. Tal como se ha explicado anteriormente, un ejemplo de dicho glicoconjugado es un glicoconjugado que comprende una proteína transportadora EPA con cuatro sitios de glicosilación y un componente PS correspondiente a un antígeno O deE. colital como se indica en la reivindicación 5 (ii).

Identificación y/o cuantificación absoluta de un glicoconjugado:Tal como se ha explicado anteriormente, el análisis incluye la identificación y cuantificación absoluta de un glicoconjugado, en particular un bioconjugado. En principio, tanto la identificación como la cuantificación de un glicoconjugado pueden referirse al glicoconjugado en su conjunto o a los componentes individuales de dicho glicoconjugado, es decir, la proteína transportadora y/o el componente PS. El aspecto decisivo es la elección del anticuerpo primario que se aplica para detectar el glicoconjugado (por ejemplo, el anticuerpo primario puede reconocer el componente PS o la proteína transportadora). La región constante (Fc) del anticuerpo primario puede entonces reconocerse por un anticuerpo secundario que es capaz de generar una señal detectable que puede usarse para la cuantificación absoluta del glicoconjugado sobre la base de una curva de calibración.

En el contexto de la presente invención, en particular, la identificación y cuantificación absoluta del componente PS es relevante. Por lo tanto, se usa un anticuerpo primario que se une específicamente al componente PS del glicoconjugado. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, la identificación y cuantificación absoluta del glicoconjugado se refiere a la identificación y cuantificación absoluta del componente PS del glicoconjugado.

Por lo tanto, la concentración del glicoconjugado, tal como se menciona en la etapa (a1) a continuación, se refiere a la concentración del componente PS. Por ejemplo, una concentración de glicoconjugado de 0,100 pg ml-1 se refiere a una concentración de 0,100 pg ml-1 del componente PS, independientemente de la cantidad de proteína transportadora dentro de la muestra (tal como se ha mencionado anteriormente, uno o más polisacáridos están unidos covalentemente a la proteína transportadora). Sin embargo, también es posible la identificación y cuantificación absoluta del glicoconjugado con respecto a la proteína transportadora. En este caso, se puede utilizar un anticuerpo primario que se une específicamente a dicha proteína transportadora.

A lo largo de la presente memoria descriptiva se utilizan una serie de abreviaturas, que incluyen:

E. coli Escherichia coli

EPA exotoxina A deP. aeruginosa detoxificada

FC región constante de un anticuerpo

PRH peroxidasa de rábano picante

LPS lipopolisacárido

PS polisacárido

SSC control de adecuabilidad del sistema

Las abreviaturas anteriores son comunes en el sector.

La invención se refiere a un procedimiento para analizar un glicoconjugado en una muestra de ensayo que comprende una mezcla de al menos 4 glicoconjugados, en el que el análisis incluye tanto la identificación de dicho glicoconjugado como la cuantificación de dicho glicoconjugado. El procedimiento de la invención comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar la muestra de ensayo y un conjunto de muestras de calibración para establecer una curva de calibración, opcionalmente una muestra de escalera y opcionalmente una muestra de control;

(b) medir, mediante un sistema de inmunoensayo basado en capilares, en capilares individuales: dicha muestra de ensayo, dichas muestras de calibración, opcionalmente dicha muestra de escalera y opcionalmente dicha muestra de control, generando así un conjunto de datos para cada capilar; y

(c) analizar dicho conjunto de datos mediante un programa informático que ofrezca al menos las siguientes funciones:

o la recepción de límites para la integración; y

o el cálculo de una señal de fondo para cada capilar; y

o la sustracción de una señal de fondo de una señal generada en cada capilar.

Con más precisión, el término "identificación" se refiere a la identificación de un glicoconjugado sobre la base del componente PS de dicho glicoconjugado y el término "cuantificación" se refiere a la cuantificación absoluta de dicho glicoconjugado sobre la base de una curva de calibración.

La expresión "la recepción de límites", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a "la recepción de límites de intervalo de peso molecular", es decir, la recepción de límites para un intervalo de peso molecular en el que se integra una señal. Tal como se ha indicado anteriormente, dichos límites para la integración pueden abarcar, por ejemplo, un intervalo de peso molecular de entre 100 y 500 kDa (por ejemplo, los límites para la integración son 100 kDa y 500 kDa), normalmente de entre 200 y 400 kDa. Este procedimiento se explicará con más detalle a continuación, haciendo referencia en primer lugar a muestras adecuadas, seguidas de las etapas del procedimiento individuales:

Muestra de ensayo:Una muestra de ensayo de la presente invención comprende una mezcla de al menos 4 glicoconjugados. Se puede utilizar un amplio abanico de muestras en el contexto de la presente invención. Los glicoconjugados cuantificables también incluyen glicoconjugados que dan lugar a la generación de señales amplias que comprenden picos no completamente resueltos y, por lo tanto, no son cuantificables mediante los procedimientos de inmunoensayo basados en capilares actualmente disponibles. Tales señales amplias pueden abarcar, por ejemplo, un intervalo de peso molecular de entre 50-600 kDa, preferentemente de entre 100 y 500 kDa, normalmente de entre 200 y 400 kDa. Ejemplos de tales señales amplias se muestran en las figuras 1 - 3. Por ejemplo, la señal mostrada en la figura 1 abarca un intervalo de peso molecular de aproximadamente 370 kDa, es decir, la señal comienza en aproximadamente 80 kDa y termina en aproximadamente 450 kDa. En este caso, el programa informático Compass incluido en el sistema WES™ no puede integrar de forma fiable toda el área de señal. Dichos procedimientos de análisis también pueden aplicarse a una mezcla de glicoconjugados estrechamente relacionados, es decir, glicoconjugados, particularmente bioconjugados, que solo difieren en el componente polisacárido.

En una forma de realización, el glicoconjugado comprende una proteína transportadora y uno o más polisacáridos unidos covalentemente a dicha proteína transportadora, siendo preferentemente dicha proteína transportadora una exotoxina A dePseudomonas aeruginosa(EPA) detoxificada con cuatro sitios de glicosilación.

En una forma de realización, el glicoconjugado comprende una proteína transportadora y uno o más polisacáridos unidos covalentemente a dicha proteína transportadora, siendo dicho polisacárido un antígeno O deE. coli,preferentemente seleccionado del grupo que consiste en antígeno O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B u O75.

En una forma de realización, el glicoconjugado comprende una proteína transportadora y uno o más polisacáridos unidos covalentemente a dicha proteína transportadora, produciéndose dicho glicoconjugado por medio de la conjugación enzimática del componente PS con la proteína transportadora mediante el uso de una oligosacariltransferasa (tal como PglB) enE. coli.Por lo tanto, los glicoconjugados se denominan "bioconjugados" y difieren en esta forma de realización de los glicoconjugados en los que la proteína transportadora y el componente PS están acoplados químicamente.

En determinadas formas de realización, dicho o dichos polisacáridos comprenden 1-100, preferentemente 3-30, de forma más preferida 5-20, unidades de repetición. Dichas unidades de repetición comprenden monosacáridos no modificados y/o monosacáridos modificados. En particular, los monosacáridos modificados son monosacáridos O-acetilados y/o N-acetilados, por ejemplo monosacáridos que comprenden una O-acetilación o N-acetilación.

La muestra de ensayo puede comprender, y normalmente lo hace, componentes adicionales. En una forma de realización, la muestra de ensayo comprende además una matriz acuosa, que opcionalmente incluye uno o más de tampones, sales inorgánicas, alcoholes de azúcar y/o tensioactivos no iónicos. Opcionalmente, la muestra comprende además polisacáridos no unidos a proteína transportadora ("PS libres"). Opcionalmente, la muestra comprende además proteínas no relacionadas, por ejemplo proteínas de células huésped. Opcionalmente, la muestra comprende además una proteína transportadora exenta de polisacáridos.

En determinadas formas de realización, la muestra de ensayo comprende una pluralidad de glicoconjugados diferentes, preferentemente 4-20, por ejemplo 4-10 glicoconjugados. En una forma de realización específica, la muestra comprende 4, 9 o 10 glicoconjugados, difiriendo dicho glicoconjugado en los componentes polisacáridos deEscherichia colienumerados anteriormente.

En una forma de realización preferida, la muestra de ensayo es una composición de vacuna multivalente adaptada para su uso directo en un sujeto que lo necesite.

Dado lo anterior, el procedimiento de la invención también permite la identificación y/o cuantificación de variantes mono-, di-, tri- o tetraglicosiladas de dicho glicoconjugado y mezclas de los mismos mediante el procedimiento de inmunoensayo basado en capilares descrito en el presente documento. Por lo tanto, la invención también prevé un procedimiento, en el que dicho análisis incluye la identificación de variantes mono-, di-, tri- y/o tetraglicosiladas de dicho glicoconjugado y mezclas de las mismas y/o la cuantificación de variantes mono-, di-, tri- y/o tetraglicosiladas de dicho glicoconjugado y mezclas de las mismas.

Tal como se ha descrito anteriormente, el término "identificación" se refiere con más precisión a la identificación de un glicoconjugado sobre la base del componente PS de dicho glicoconjugado y el término "cuantificación" se refiere con más precisión a la cuantificación absoluta de variantes mono-, di-, tri- y/o tetraglicosiladas de dicho glicoconjugado sobre la base de una curva de calibración.

Etapa a:La provisión de muestras a un dispositivo analítico se conoce de por sí. La concentración de un glicoconjugado en una muestra de ensayo puede variar en un amplio intervalo, y si es necesario se adapta en la etapa (a1), que se describe a continuación. En una forma de realización preferida, la etapa (a) comprende además una o más de las siguientes etapas (a1), (a2) y/o (a3), preferentemente en el orden que se indica:

En una forma de realización, esta incluye (a1) ajustar la concentración del glicoconjugado a una concentración esperada de 0,01 - 0,50 pg ml-1. Tal como se ha descrito anteriormente, la concentración del glicoconjugado se refiere a la concentración del componente PS del glicoconjugado. Será evidente para los expertos que esta etapa es opcional, por ejemplo, si ya se espera que la concentración del glicoconjugado se encuentre en este intervalo, esta etapa no es necesaria.

En una forma de realización, esta incluye (a2) añadir a la muestra uno o más reactivos auxiliares seleccionados de un tampón de muestra, un agente reductor de puente disulfuro, tal como ditiotreitol, y uno o más marcadores, tales como marcadores de proteína fluorescente con un peso molecular conocido. Dichos marcadores pueden usarse como referencia de peso molecular dentro de cada capilar y se utilizan para tener en cuenta las diferencias en la migración electroforética entre capilares individuales.

En una forma de realización, esta incluye (a3) aplicar un programa de calor y, por lo tanto, desnaturalizar la muestra. Un ejemplo de un programa de calor adecuado es calentar la muestra respectiva a 95°C durante 5 min.

Etapa b:La medición de una muestra mediante un procedimiento de inmunoensayo basado en capilares se conoce de por sí. En una forma de realización preferida, la etapa (b) comprende además una o más de las siguientes etapas (b1) a (b7), preferentemente en el orden que se indica:

En una forma de realización, esta incluye (b1) cargar una matriz de análisis en los capilares de dicho sistema de inmunoensayo; preferentemente la matriz de análisis es una matriz de exclusión por tamaño; preferentemente dicha matriz de exclusión por tamaño comprende al menos dos componentes de matriz con diferentes tamaños de poro (matriz de apilamiento y separación).

En una forma de realización preferida, los glicoconjugados se separan en función de su tamaño / peso molecular. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, la identificación y cuantificación absoluta de un glicoconjugado mediante un sistema de inmunoensayo se refiere a la identificación y cuantificación absoluta de un glicoconjugado mediante un sistema de inmunoensayo basado en tamaño/peso molecular. El análisis de glicoconjugados basado en su tamaño / peso molecular difiere del análisis de glicoconjugados basado en su punto isoeléctrico (por ejemplo, inmunoensayo de enfoque isoeléctrico).

En una forma de realización, esta incluye (b2) cargar la muestra de ensayo, muestras de calibración, muestra de escalera opcional y muestra de control opcional en los capilares de dicho sistema de inmunoensayo.

En una forma de realización, esta incluye (b3) separar los componentes de dichas muestras, preferentemente según el peso molecular de cada componente. Esta separación se realiza en la matriz de análisis en los capilares de dicho sistema de inmunoensayo.

En una forma de realización, esta incluye (b4) inmovilizar los componentes de dicha muestra, por ejemplo mediante reticulación fotoquímica.

En una forma de realización, esta incluye (b5) aplicar un anticuerpo primario específico de glicano que se une a dicho glicoconjugado. Los anticuerpos específicos de glicano se unen a la parte PS del glicoconjugado y son específicos para una estructura de PS dada. Se conocen como tales y pueden obtenerse de fuentes comerciales o prepararse mediante técnicas convencionales conocidas. Pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales.

En una forma de realización, esta incluye (b6) aplicar un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario y que genera una señal detectable. El anticuerpo secundario puede, por ejemplo, unirse a la región constante (Fc) del anticuerpo primario. Una diversidad de posibilidades para generar dicha señal detectable (etapa b6) son bien conocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, dicha señal puede generarse aplicando en la etapa (b6) un anticuerpo secundario que está unido covalentemente a una enzima, que es capaz de catalizar una reacción quimioluminiscente, una reacción quimifluorescente o una reacción química que da lugar a un producto coloreado o fluorescente. Ejemplos de tales enzimas son peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina.

Sin embargo, es evidente para los expertos en la técnica que una señal detectable también puede generarse por otros medios. Por ejemplo, dicho anticuerpo secundario (etapa b6) puede unirse a un colorante fluorescente, tal como un Alexa Fluor, Alexa Fluor Plus, IRDye, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Cy3, Cy5, aloficocianina (APC), tetrametilrodamina, DyLight, Texas Red, Texas Red-X, ficoeritrina (R-PE), Qdot, 3-carboxi-6,8-difluor-7-hidroxicumarina o tinte naranja pacífico. Otra posibilidad es aplicar un anticuerpo primario en la etapa (b5) que está unido a biotina. En este caso, se puede generar una señal detectable aplicando en la etapa (b6) una proteína estreptavidina que está unida a HRP en lugar de aplicar un anticuerpo secundario. Tal como se ha descrito anteriormente, en la etapa (b7) se aplica un sustrato para HRP.

Otra posibilidad en la etapa (b6) es la de aplicar un anticuerpo secundario que está unido a una nanopartícula de oro.

En una forma de realización, esta incluye (b7), en caso de que el anticuerpo secundario esté unido a una enzima, aplicar un sustrato para dicha enzima. En una forma de realización preferida, dicho anticuerpo secundario está unido a la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP). La señal detectable se genera aplicando un sustrato en la etapa (b7). En una forma de realización preferida, el sustrato es una mezcla de luminol/peróxido.

Etapa c:El análisis de datos por un programa de ordenador es conocido. Sin embargo, tal como se ha explicado anteriormente y se muestra en las figuras 1, 3 y las tablas 3 a 5, el presente procedimiento estándar de análisis de datos es insuficiente y no permite una cuantificación fiable.

Siguiendo el protocolo anterior, se resuelve esta deficiencia. En una forma de realización preferida, la etapa c) comprende además una o más de las siguientes etapas, preferentemente en el orden que se indica:

(c1) recibir el conjunto de datos para cada capilar generado en la etapa b);

(c2) identificar el fondo para cada capilar;

(c3) restar la señal de fondo individual de la señal medida del capilar correspondiente;

(c4) obtener un área bajo la curva para cada capilar integrando la señal con corrección de fondo en un intervalo de integración específico de serotipo y ajustable manualmente;

(c5) establecer una curva de calibración aplicando regresión no lineal a las señales generadas por muestras de calibración con concentraciones conocidas y representar así el área bajo la curva calculada para cada señal frente a la concentración de la muestra de calibración correspondiente;

(c6) calcular la concentración del glicoconjugado dentro de la muestra de ensayo comparando el área bajo la curva medida con la curva de calibración;

(c7) evaluar la validez de la concentración calculada mediante comparación automatizada con criterios de aceptación predefinidos.

Enla etapa (c1),el conjunto de datos generado en la etapa (b) es recibido por un ordenador.

Enla etapa (c2),el fondo para cada capilar se identifica aplicando una regresión lineal desde la señal que se midió para cada capilar antes del inicio del intervalo de integración hasta la señal que se midió después del final del intervalo de integración.

Normalmente, los expertos esperarían que identificar una señal de fondo promedio sobre múltiples capilares o una señal de fondo de referencia a partir de un capilar de referencia y restar dicha referencia o señal de fondo promedio de cada capilar sería suficiente. Sin embargo, sorprendentemente se ha descubierto que la precisión de los resultados mejoró cuando se identificó una señal de fondo individual para cada capilar. Sin desear vincularse a ninguna teoría, esto puede deberse a una interferencia de la señal detectable generada en un capilar con la señal generada en los capilares vecinos.

Esta etapa se explica con más detalle de la siguiente manera:

En unaprimera etapa,se establecen los límites para la integración de señales, definiendo así un intervalo de integración.

En unasegunda etapa,se calcula el promedio de al menos 3 puntos de datos, preferentemente todos los puntos de datos, que se midieron dentro de una primera ventana de peso molecular ajustable antes del inicio del intervalo de integración (punto de datos promedio P1), y, al menos 3 puntos de datos, preferentemente todos los puntos de datos, que se midieron dentro de una segunda ventana de peso molecular ajustable (intervalo para calcular la señal de fondo) después del final del intervalo de integración (punto de datos promedio P2).

Ventana de peso molecular:

El inicio y la anchura de la primera y segunda ventana se pueden seleccionar individualmente. Como ejemplo, la primera ventana puede abarcar el intervalo de X1 = "valor del eje X más bajo que forma parte del intervalo de integración" a X2 = X1 - "anchura de la primera ventana de peso molecular ajustable [kDa]''. La segunda ventana puede abarcar el intervalo de X3 = "valor del eje X más alto que forma parte del intervalo de integración" a X4 = X3 "anchura de la segunda ventana de peso molecular ajustable [kDa]".

Una anchura adecuada de la ventana de peso molecular ajustable es de 10 kDa. Sin embargo, la anchura de la ventana de peso molecular también puede ajustarse de forma que se desvíe de un valor predefinido de 10 kDa, por ejemplo, a 8 kDa o 13 kDa, siempre que cada una, la primera ventana y la segunda ventana, comprendan al menos 3 puntos de datos.

Puntos de datos:

En una forma de realización, los puntos de datos promedio respectivos P1 y P2 consisten en el promedio de las intensidades de señal (eje Y) de al menos 3 puntos de datos dentro de la primera o segunda ventana de peso molecular respectiva y el promedio del peso molecular en estos puntos de datos (eje X).

En otra forma de realización, los puntos de datos promedio respectivos P1 y P2 consisten en el promedio de las intensidades de señal (eje Y) de al menos 3 puntos de datos dentro de la primera o segunda ventana de peso molecular respectiva y el peso molecular al inicio o al final del intervalo de integración, respectivamente.

En unatercera etapa,se realiza una regresión lineal entre los puntos de datos promedio P1 y P2 calculados anteriormente.

Enla etapa (c3),la señal de fondo en cada peso molecular específico, que se puede obtener a partir de la línea de regresión lineal calculada anteriormente, se resta de la señal total correspondiente en cada peso molecular individual específico, es decir, la diferencia entre la señal detectada dentro de un capilar en cada peso molecular y la señal de fondo en el peso molecular correspondiente.

Enla etapa (c4),la señal con corrección de fondo se integra entre los límites de integración establecidos en (c2), primera etapa. Dicha integración produce un área bajo la curva para cada analito. El programa informático Compass incluido en el sistema WES™ no proporciona una opción para recibir límites para la integración y para integrar de forma fiable un área de señal completa dentro de estos límites. Sorprendentemente, se ha descubierto que en el caso de los glicoconjugados tal como se describen en el presente documento, en particular los bioconjugados, el programa informático Compass incluido en el sistema WES™ no proporciona una integración fiable de toda el área de señal (véanse las figuras 1, 3 y las tablas 3-5).

Enla etapa (c5),se establece una curva de calibración aplicando una regresión no lineal a las señales generadas por las muestras de calibración en la etapa b). La curva de calibración comprende el área bajo la curva calculada para cada señal en función de la concentración de la muestra de calibración correspondiente. Preferentemente, se aplica un modelo de regresión bilogarítmico con efectos cuadráticos para establecer la curva de calibración, en particular según la fórmula:

ln(área) = A ln(concentración)A2 B ln(concentración) C.

El programa informático Compass incluido en el sistema WES™ no proporciona una opción para establecer una curva de calibración basada en dicho modelo, sino que utiliza un modelo de regresión lineal o un modelo de curva logística de cuatro parámetros (4PL). Sin embargo, sorprendentemente se ha descubierto que establecer la curva de calibración basándose en un modelo de regresión bilogarítmico con efectos cuadráticos mejora la precisión de los resultados.

Enla etapa (c6),la concentración del glicoconjugado dentro de la muestra de ensayo se calcula comparando el área bajo la curva que se midió para la muestra de ensayo con la curva de calibración.

Enla etapa (c7),la validez de la concentración calculada se evalúa mediante comparación automatizada con criterios de aceptación predefinidos. Ejemplos de criterios de aceptación predefinidos son:

• Coeficiente de determinación (R12) para la curva de calibración, por ejemplo R2 > 0,85, tal como R2 > 0,90

• Coeficiente de variación para muestras de calibración, por ejemplo CV < 30%, tal como CV < 25%

• Coeficiente de variación para el glicoconjugado dentro de la muestra de ensayo, por ejemplo CV < 25%, tal como CV < 20%

• Coeficiente de variación para la muestra de control dentro de la muestra de ensayo, por ejemplo CV < 25%, tal como CV < 20%

• Diferencia relativa de concentración calculada para la muestra de control con la concentración conocida de la muestra de control, por ejemplo

([concentración calculada] - [concentración conocida]) / [concentración conocida] < 35 %

Por lo tanto, la deficiencia mencionada se resuelve mediante la combinación de dos características en el análisis de datos:

La primera característica es el cálculo de una señal de fondo para cada capilar y la sustracción de dicha señal de fondo de la señal que se genera por el glicoconjugado dentro de ese capilar. La señal de fondo varía entre los capilares y, por lo tanto, reduce la reproducibilidad de la cuantificación a menos que se tenga en cuenta en cada capilar.

La segunda característica es la posibilidad de recibir límites para la integración de señales. Estos límites se establecen normalmente por el usuario. La concentración calculada de este modo se compara automáticamente con criterios de aceptación predefinidos. Esto permite evaluar si la muestra de ensayo cumple con criterios de aceptación predefinidos.

Los siguientes ejemplos de la invención ilustran aún más la naturaleza de la invención. Debe entenderse que los siguientes ejemplos no limitan la invención y el alcance de la invención debe determinarse por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: Análisis de bioconjugados O-EPA según el procedimiento de la invención

I. Preparación del material de referencia

Una muestra de glicoproteína en grandes cantidades se obtuvo directamente de un lote de fabricación y se repartió en partes alícuotas y se almacenó adecuadamente (por ejemplo, -80 °C). Las diferentes etapas de caracterización se realizaron en partes alícuotas descongeladas de dicha muestra de glicoproteína.

La muestra de ensayo utilizada fue una vacuna de glicoconjugado que comprende 10 glicoconjugados diferentes (cada uno de los cuales es un bioconjugado, la composición que comprende los diez bioconjugados diferentes se describe, por ejemplo, en el documento W o 2020/191082), cada uno de los cuales comprende una proteína transportadora EPA con cuatro sitios de glicosilación que está unida covalentemente a un componente PS correspondiente a uno de los antígenos O deE. colide los serotipos O1 A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, 018A, O25B u O75. Debido a la presencia de 4 sitios de glicosilación, cada uno de los glicoconjugados estaba presente como una variante mono-, di-, tri- o tetraglicosilada del mismo serotipo, o una mezcla de las mismas. El siguiente ejemplo se refiere a la identificación y cuantificación absoluta de un glicoconjugado O-EPA que comprende un componente PS correspondiente al serotipo 04 deE. colipresente en la mezcla mencionada anteriormente de 10 bioconjugados de O-EPA diferentes, pero se puede aplicar igualmente a los otros serotipos (la figura 1 se refiere al serotipo 06 deE. coli,la figura 2 se refiere al serotipo 04 deE. oli,la figura 3 se refiere al serotipo 025B deE. coli;las tablas 2, 4 y 5 muestran los resultados de las composiciones de vacuna de glicoconjugado que comprenden nueve o diez glicoconjugados correspondientes a diferentes serotipos deE. coli).

1)Determinación de la identidad correcta del material de referencia.Se siguió un protocolo de inmunotransferencia Western estándar usando un anticuerpo específico que se seleccionó y analizó para determinar la especificidad de la cadena de polisacárido del glicoconjugado de interés. Opcionalmente, la identidad correcta de la proteína transportadora se determina utilizando un anticuerpo específico para la proteína transportadora.

2)Determinación del contenido total de polisacárido dentro del material de referencia.Se realizó una hidrólisis ácida total en monosacáridos con análisis posterior mediante cromatografía iónica y detección amperométrica pulsada (IC-PAD), de acuerdo con las siguientes instrucciones.

Se hidrolizó una parte alícuota del material de referencia durante 2 h a 120 °C utilizando ácido trifluoracético (TFA) a una concentración final de 1,8 M. Las condiciones óptimas de hidrólisis (temperatura, concentración de TFA y tiempo) pueden variar dependiendo de la concentración inicial de los polisacáridos.

Las condiciones óptimas deben demostrar que liberan cuantitativamente todos los monosacáridos de la cadena de polisacáridos sin degradación adicional de la molécula de monosacárido que es objetivo de la cuantificación absoluta.

Después de la hidrólisis, la muestra se enfrió hasta la temperatura ambiente y después se secó usando un SpeedVac a 30 °C durante la noche. La muestra seca se resuspendió completamente en H<2>O (grado MilliQ) y se transfirió a un vial de HPLC. Se preparó un conjunto de patrones de calibración utilizando un monosacárido disponible comercialmente (en este caso N-acetilglucosamina; GIcNAc). Si el monosacárido que es objetivo para cuantificación experimenta modificación durante la etapa de hidrólisis mencionada anteriormente (por ejemplo, la N-acetilglucosamina se convierte en glucosamina), debe usarse el monosacárido apropiado (por ejemplo, glucosamina) 0, alternativamente, el procedimiento de hidrólisis mencionado anteriormente también debe realizarse en el conjunto de patrones de calibración.

A continuación, se preparó un sistema de cromatografía iónica (por ejemplo, Dionex ICS-5000) equipado con un detector amperométrico pulsado (PAD) y un electrodo de oro desechable en politetrafluoroetileno (PTFE). Se usó una columna analítica Dionex CarboPac PA1 (4x 250 mm) en combinación con una columna de protección Dionex CarboPac PA1 (4x 50 mm). El sistema se equilibró con eluyente A (NaOH 16 mM para elución de muestra) y eluyente B (NaOH 500 mM para limpieza de columnas). La muestra y el conjunto de patrones de calibración se inyectaron secuencialmente utilizando el siguiente procedimiento instrumental/perfil de gradiente:

• 0 a 24 min, 100% de eluyente A, caudal 1 ml/min (elución)

• 25 a 32 min, 100% de eluyente B, caudal de 1 ml/min (lavado)

• 33 a 60 min, 100 % de eluyente A, caudal 1 ml/min (reequilibrado)

Dependiendo del monosacárido objetivo, puede ser necesario optimizar estos gradientes.

Se utilizó el área bajo la curva del conjunto de calibración medido para obtener una curva de calibración y después se cuantificó la muestra desconocida. Opcionalmente, la cantidad de monosacárido objetivo también se puede utilizar para calcular de nuevo la cantidad absoluta de unidades de repetición/polisacáridos en pg/ml en la muestra de glicoconjugado.

II. Análisis del sistema de inmunoensayo basado en capilares

La muestra de ensayo que se va a analizar (identificación y cuantificación absoluta) se obtuvo directamente de un lote de fabricación de una vacuna de glicoconjugado. Se preparó un material de referencia tal como se ha descrito anteriormente que refleja la misma especie de glicoconjugado, es decir, el mismo componente PS (en este caso, polisacárido de antígeno O4 deE. coli)y la misma proteína transportadora (en este caso, EPA detoxificada que tiene la SEQ ID NO: 3). Tal como se ha mencionado anteriormente, la muestra de ensayo comprendió adicionalmente nueve bioconjugados de O-EPA adicionales correspondientes a los serotipos de E. coli O1 A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B y O75.

La medición se realizó en el sistema WES™ (Bio-Techne) equipado con el programa informático "Compass for SW, versión 3.1.7".

1. Ajuste de las concentraciones de la muestra de ensayo, las muestras de calibración y la muestra de control

Las concentraciones del bioconjugado O-EPA de O4 presentes dentro de la muestra de ensayo, las muestras de calibración y la muestra de control se diluyeron a las concentraciones objetivo respectivas utilizando tampón de muestra 0,1x (SB) proporcionado por Bio-Techne (N° de catálogo 042-195). Para la muestra de ensayo, la concentración esperada se calculó a partir de las concentraciones que se midieron para la fabricación de lotes de los glicoconjugados individuales antes de combinar los glicoconjugados individuales en una composición de vacuna de glicoconjugado multivalente.

Para el bioconjugado que comprende una proteína transportadora EPA con cuatro sitios de glicosilación (SEQ ID NO: 3) unidos covalentemente a un componente PS correspondiente a un antígeno O deE. colidel serotipo O4, se realizaron las siguientes diluciones:

(i) La curva de calibración se generó a partir de 4 muestras de calibración con diferentes concentraciones de PS (0,200, 0,155, 0,110 y 0,065 pg/ml). Cada muestra de calibración se preparó por triplicado;

(ii) la muestra de ensayo, es decir, el lote de vacuna de glicoconjugado, se diluyó hasta una concentración de PS (polisacárido O4 deE. coli)de 0,150 pg/ml. La muestra de ensayo se preparó por cuadruplicado;

(iii) la muestra de control (SSC) se diluyó hasta una concentración de PS de 0,100 pg/ml. La muestra de control se preparó por triplicado.

Las diluciones óptimas para muestras de calibración y muestra de ensayo deben evaluarse para cada glicoconjugado individualmente. Se descubrió que las diluciones anteriores eran óptimas para la identificación y cuantificación absoluta del bioconjugado O-EPA de O4.

2. Preparación de los marcadores fluorescentes y una escalera biotinilada

Los marcadores fluorescentes y una escalera biotinilada se obtuvieron de Bio-Techne (N° de catálogo PS-FL03-8. Se incluyeron dos marcadores fluorescentes en cada capilar y se usaron para considerar las diferencias en la migración electroforética entre capilares individuales. Los marcadores fluorescentes migraron a 57 kDa y 280 kDa. La escalera biotinilada comprendía una pluralidad de proteínas de un peso molecular conocido y se analizó en un capilar separado. La escalera se usó como referencia de tamaño para los glicoconjugados que se van a analizar. El peso molecular de las proteínas dentro de la escalera biotinilada abarcó el intervalo de 66 kDa a 440 kDa. Los marcadores fluorescentes y la escalera biotinilada se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante:

(i) los marcadores fluorescentes se resuspendieron en tampón de muestra 10X (N° de catálogo 042-195), complementado con DTT 400 mM para crear una mezcla maestra fluorescente 5X;

(ii) la escalera biotinilada se resuspendió en agua desionizada.

3. Preparación de la muestra de ensayo, las muestras de calibración y las muestras de control para su carga en una placa de ensayo para el sistema de inmunoensayo basado en capilares

(i) 4,8 pl de cada una de las muestras de ensayo diluidas, muestras de calibración y muestra de control se mezclaron cada una con 1,2 pl de la mezcla maestra fluorescente 5X;

(Ii) las muestras se incubaron a 95 °C durante 5 minutos.

(iii) las mezclas se enfriaron mediante una incubación en hielo durante 5 minutos;

(iv) las mezclas se agitaron en vórtice brevemente, se giraron hacia abajo y se cargaron 5 pl en compartimentos separados de una placa de ensayo. Un compartimiento de esta placa de ensayo ya estaba llenado previamente conSeparation Matrix 3(matriz de separación 3),Stacking Matrix 2(matriz de apilamiento 2),Split Running Buffer 3(tampón de migración de división 3) yMatriz Removal Buffer(tampón de eliminación de matriz) (Bio-Techne, N° de catálogo SM-W006). Este compartimiento ya estaba sellado por el vendedor.

4. Preparación de los anticuerpos y sustratos para carga en la placa de ensayo

(i) un anticuerpo monoclonal de rata primario específico para el componente PS del glicoconjugado O4-EPA (antígeno O deE. coli,serotipo O4) se diluyó enAntibody Diluent(diluyente de anticuerpo) 2 (Bio-Techne, N° de catálogo 042-203) para alcanzar la concentración final de 0,05 mg/ml;

(ii) el anticuerpo anti-HRP secundario de rata (BioLegend, N° de catálogo 405405) se diluyó con una relación 1:100 en el diluyente de anticuerpo 2;

(iii) el sustrato para el capilar N° 1 se preparó mezclando 15 pl de reactivo Luminol-S y 15 pl de reactivo de peróxido suministrado en el módulo de detección (Bio-Techne, N° de catálogo DM-003);

(iv) el sustrato para capilares N° 2-25 se preparó mezclando 220 pl de reactivo Luminol/potenciador y 220 pl de reactivo peróxido suministrado en el kit de sustrato ECL para inmunotransferencia Western Clarity™ (BioRad, N° de catálogo 170-5060);

(v) los anticuerpos (10 pl por pocillo) y los sustratos (15 pl por pocillo) se cargaron en compartimentos separados de la placa de ensayo preparada en la etapa 3 (iv);

(vi) el tampón de lavado (Bio-Techne, N° de catálogo 042-202) se añadió a compartimentos separados de la placa de ensayo (500 gl por compartimiento) de acuerdo con las instrucciones del fabricante;

(vii) la placa de ensayo se cubrió con una tapa y se centrifugó a 1100 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para asegurarse de que el líquido se encontraba en el fondo en todos los pocillos.

5. Carga de la placa de ensayo en el sistema WES™ e inicio de la medición

En esta etapa, la placa de ensayo obtenida después de la etapa 4 (vii) se cargó en el equipo WES™ (Bio-Techne) para iniciar el análisis:

(i) se encendieron el sistema de inmunotransferencia Western capilar y su ordenador relacionado. Una vez que la señal luminosa del instrumento dejó de pulsar, el sistema estaba listo para su uso y se inició el programa informático Compass que se proporciona con el sistema WES™;

(ii) La ventana"new run(nueva ejecución)" se abrió en el programa informático Compass y se seleccionaron los siguientes parámetros:"Size(Tamaño)" comoAssay Type(Tipo de Ensayo), "66-440 kDa" comoSize Range(Intervalo de Tamaño) y "25" comoCartridge(Cartucho);

(iii) el cartucho capilar (Bio-Techne, N° de catálogo SM-W006) se insertó en el soporte apropiado y la luz interior cambió de naranja a azul, lo que indica que el cartucho se insertó correctamente;

(iv) después de retirar la tapa de la placa de ensayo, el sello de evaporación se despegó cuidadosamente de la placa sosteniéndolo firmemente en el banco; si hay burbujas presentes en los pocillos de la matriz de separación, dichas burbujas pueden eliminarse usando una aguja limpia (no fue necesario en este caso); (v) la placa de ensayo precargada se dispuso en el soporte de placa, la puerta del instrumento se cerró y la ejecución del ensayo se inició desde el programa informático Compass.

6. Análisis de los datos

(i) en el programa informático Compass, se verificó la posición correcta de los marcadores fluorescentes (57 y 280 kDa): Si las señales correspondientes a los marcadores fluorescentes están mal asignadas por el programa informático, la posición de la señal puede corregirse a 57 y 280 kDa, respectivamente, seleccionando"Not a standard(No es un patrón)" o"Force Standard(Patrón de Fuerza)" (no era necesario en este caso);

(ii) los conjuntos de datos se exportaron del programa informático Compass seleccionando:File(Archivo) ^Export Spectra(Exportar espectros) ^Text Format(Formato de Texto) (se creó automáticamente una nueva carpeta que contenía los espectros en la misma carpeta en la que se ha guardado la ejecución);

(iii) el conjunto de datos (Sample Graps Raw.txt) se importó en el programa informático del procedimiento de la invención para analizar los datos;

(iv) se introdujo el ID de la muestra, el serotipo, el instrumento utilizado y la fecha del análisis;

(v) se introdujeron el intervalo de integración (100 - 480 kDa) y el intervalo de evaluación basal relativo (ventana de peso molecular: 10 kDa; 90 - 100 kDa y 480 - 490 kDa);

(vi) se estableció una curva de calibración aplicando a las señales generadas por las muestras de calibración un modelo de regresión bilogarítmico con efectos cuadráticos de acuerdo con la fórmula: ln(área) = A ln(concentración)A2 B ln(concentración) C. La curva de calibración comprendió el área bajo la curva calculada para cada señal en función de la concentración de la muestra de calibración correspondiente. La concentración del glicoconjugado dentro de la muestra de ensayo se calculó comparando el área bajo la curva que se midió para la muestra de ensayo con la curva de calibración. Esta comparación se realizó mediante inversión de la función de regresión mencionada anteriormente subyacente a la curva de calibración. Dicha inversión de la función de regresión mencionada anteriormente produce 2 resultados. Se selecciona el resultado más probable, es decir, el resultado que está más cerca del contenido esperado del glicoconjugado dentro de la muestra de ensayo.

Etapa (v): El programa informático calculó una señal de fondo específica de los capilares y se restó de la señal total que se midió dentro de este capilar.

En analogía con lo anterior, las concentraciones de los otros nueve bioconjugados presentes dentro de la vacuna de glicoconjugado (comprendiendo cada bioconjugado EPA detoxificada que tiene la SEQ ID NO: 3 unida covalentemente a uno de los polisacáridos de antígeno O deE. co lide los serotipos O1A, O2, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B u O75) se determinaron utilizando los anticuerpos correspondientes.

Los resultados de este ejemplo específico fueron los siguientes (teniendo en cuenta la dilución en la etapa II, 3):

Tabla 2:Resultados del análisis de una composición de vacuna de glicoconjugado que comprende diez bioconjugados O-EPA diferentes (polisacáridos O deE. coli)utilizando el procedimiento de la invención

Ejemplo 2: Análisis comparativo del bioconjugado de O25BO-EPA según la técnica anterior y procedimiento de la invención

Dos lotes de una composición de vacuna de glicoconjugado que comprende 9 bioconjugados diferentes (comprendiendo cada bioconjugado EPA detoxificada que tiene la SEQ ID NO: 3 unida covalentemente a uno de los polisacáridos de antígeno O de E. coli de los serotipos O1 A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B y O75) se analizaron con respecto a la concentración de bioconjugado O-EPA de O25B de acuerdo con la técnica anterior (Wes™ con el programa informático Compass) y el procedimiento de la invención.

Se estableció una curva de calibración basada en 4 muestras de calibración de glicoconjugado de O25B (0,080, 0,063, 0,045, 0,028 gg/ml; concentración basada en el componente PS) de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente (análisis paralelo en diferentes capilares del sistema WES™; dilución que se encontró óptima para el bioconjugado O-EPA de O25B). Cada una de las muestras de calibración anteriores se midió en triplicados preparados independientemente (réplicas denominadas a-c en la tabla 3). El área de señal completa para cada muestra se analizó utilizando tanto el programa informático Compass disponible comercialmente (técnica anterior) como el programa informático descrito en el presente documento (procedimiento de la invención). Las AUC resultantes de acuerdo con ambos procedimientos y el coeficiente de variación (CV) basado en las mediciones por triplicado se muestran en la tabla 3 a continuación. Los electroferogramas correspondientes a triplicados de la muestra de calibración O-EPA de O25B de 0,063 pg/ml se muestran en la figura 3 (A-C: Integración por medio del programa informático Compass; D-F: Integración por medio del programa informático que se describe en el presente documento).

Se puede observar tanto en la figura 3 como en la tabla 3 que

(i) el AUC de acuerdo con el procedimiento de la técnica anterior es inferior al AUC de acuerdo con el procedimiento de la invención debido a la integración incompleta de toda el área de señal; y

(ii) menor precisión del análisis de acuerdo con la técnica anterior (CV más alto); mayor desviación de las mediciones individuales, incluido un fallo ocasional para integrar la señal (menor reproducibilidad).

Tabla 3:Muestras de calibración de bioconjugado O-EPA de O25B analizadas de acuerdo con la técnica anterior y el procedimiento de la invención

La curva patrón se estableció en función de los resultados mostrados en la tabla 3, ya sea de acuerdo con

a) el modelo lineal proporcionado en el programa informático Compass (proporcionado alternativamente en el programa informático Compass es un "modelo logístico de cuatro parámetros", pero que no era adecuado para el conjunto de datos); o

b) un modelo de regresión bilogarítmico con efectos cuadráticos de acuerdo con la fórmula: ln(área) = A ln(concentración)A2 B ln(concentración) C (procedimiento de la invención).

A continuación, dos lotes de la composición de vacuna de glicoconjugado mencionada anteriormente que comprenden 9 bioconjugados diferentes (comprendiendo cada bioconjugado EPA detoxificada que tiene la SEQ ID NO: 3 unida covalentemente a uno de los polisacáridos de antígeno O deE. colide los serotipos O1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B y O75) se midieron en cuadruplicados con el sistema Wes™ tal como se ha descrito anteriormente (réplicas denotadas como a-d en la tabla 4). Las muestras de ensayo se diluyeron hasta una concentración objetivo de O-EPA de O25B de 0,063 pg/ml basada en el componente PS de O25B deE. coli.La integración de señal completa se realizó utilizando el programa informático Compass (técnica anterior) o utilizando el programa informático descrito en el presente documento.

A continuación, se realizó una cuantificación absoluta del bioconjugado de O-EPA de O25B presente dentro de la composición de vacuna de glicoconjugado 9-valente descrita anteriormente

A) la curva de calibración descrita anteriormente obtenida usando el programa informático Compass (técnica anterior); o

b) la curva de calibración descrita anteriormente obtenida utilizando el programa informático descrito en el presente documento (procedimiento de la invención).

En analogía con lo anterior, se midió una muestra de control de bioconjugado O-EPA de O25B (control de la idoneidad del sistema; SSC) en paralelo (capilares separados) y se analizó de acuerdo con el procedimiento de la técnica anterior o el procedimiento de la invención.

Los resultados (teniendo en cuenta la dilución) se muestran en la tabla 4.

Tabla 4:Bioconjugado de O-EPA de O25B presente dentro de una composición de vacuna de glicoconjugado 9-valente fserotipos deE. coliO1A, O2, O4, O6A, O15, O16, O18A, O25B y O75) analizados de acuerdo con la técnica anterior y el procedimiento de la invención

Puede observarse en la tabla 4 que el procedimiento de la técnica anterior (programa informático Compass) no proporcionó una cuantificación absoluta fiable del bioconjugado O-EPA de O25B tanto para lotes de la composición de vacuna de glicoconjugado como para la muestra de control, mientras que el procedimiento de la invención proporcionó datos precisos tanto sobre lotes de la muestra de ensayo como sobre la muestra de control.

En analogía con lo anterior, también se analizaron los otros bioconjugados de O-EPA presentes dentro del lote 1 de la composición de vacuna de glicoconjugado 9-valente descrita anteriormente de acuerdo con la técnica anterior (programa informático Compass) y el procedimiento de la invención. Los resultados (media de triplicados independientes) se muestran en la tabla 5 a continuación.

Tabla 5:Resultados comparativos del análisis de una composición de vacuna de glicoconjugado que comprende nueve bioconjugados de O-EPA diferentes fpolisacáridos O deE. coli)utilizando el procedimiento de la invención o de acuerdo con la técnica anterior

Mientras que el análisis de acuerdo con la técnica anterior puede proporcionar datos precisos sobre algunos de los bioconjugados O-EPA presentes en la composición de glicoconjugado 9-valente, el procedimiento de la técnica anterior no proporciona una cuantificación absoluta fiable sobre los otros bioconjugados (por ejemplo, bioconjugados O-EPA de O6A, O18A y O25B) . En algunos casos (bioconjugados O-EPA de O18A y O25B), el programa informático Compass, de hecho, no proporciona datos significativos.

Sin embargo, el procedimiento de la invención proporcionó una cuantificación absoluta fiable en todos los bioconjugados, incluidos los bioconjugados O-EPA particularmente complicados de O18A y O25B. La identificación de los bioconjugados se logró con éxito mediante la generación de una señal detectable tras la unión de un anticuerpo específico de PS a cada uno de los bioconjugados.

DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1(secuencia consenso de glicosilación) Asn-X-Ser(thr), en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro

SEQ ID NO: 2(secuencia consenso de glicosilación optimizada) Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en la que X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro

SEQ ID NO: 3(proteína transportadora EPA que incluye 4 secuencias consenso de glicosilación ligadas a N) GSGGGDQNATGSGGGKLAEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEG GNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHE LNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLflRDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSWMAQAQPRREKRW SEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKDNNNSTPTVISHRLH FPEGGSLAALTAHQACHLPLEAFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALA SPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGñASADWSLTCPVAKDQNRTKGEC AGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAA QSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRWSLPGFYRTG LTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRVTILGWPLAERTWIPSAIPTDPRNVGGDLDP SSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLKLGSGGGDQNAT

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para analizar un glicoconjugado en una muestra de ensayo que comprende una mezcla de al menos 4 glicoconjugados,

en el que el análisis incluye:

• la identificación de dicho glicoconjugado y

• la cuantificación absoluta de dicho glicoconjugado sobre la base de una curva de calibración;

comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes:

(a) proporcionar la muestra de ensayo y un conjunto de muestras de calibración, opcionalmente una muestra de escalera y opcionalmente una muestra de control;

(b) medir, mediante un sistema de inmunoensayo basado en capilares, en capilares individuales: dicha muestra de ensayo, dichas muestras de calibración, opcionalmente dicha muestra de escalera y opcionalmente dicha muestra de control, generando así un conjunto de datos para cada capilar; y

(c) analizar dicho conjunto de datos mediante un programa informático que ofrezca al menos las siguientes funciones:

• la recepción de límites para la integración; y

• el cálculo de una señal de fondo para cada capilar; y

• la sustracción de una señal de fondo de una señal generada en cada capilar.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la medición de dicho glicoconjugado da lugar a una señal amplia, en particular una señal amplia que comprende picos no completamente resueltos.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que dichos glicoconjugados son componentes de una vacuna de glicoconjugado.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que dicho glicoconjugado es un bioconjugado, en particular un bioconjugado que se produce mediante conjugación enzimática de un componente polisacárido con una proteína transportadora, preferentemente usando un sistema de oligosacariltransferasa PglB enE. coli.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que dicho glicoconjugado comprende una proteína transportadora y uno o más polisacáridos unidos covalentemente a dicha proteína transportadora en el que (i) dicha proteína transportadora es una exotoxina A dePseudomonas aeruginosa(EPA) detoxificada y

(ii) dicho polisacárido es un antígeno O deEscherichia coliseleccionado del grupo que consiste en O1A, O2, O4, O6A, O8, O15, O16, O18A, O25B u O75.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que dicho o dichos polisacáridos comprenden 1 - 100, preferentemente 3 - 30, de forma más preferida 5 - 20, unidades de repetición, comprendiendo dichas unidades de repetición monosacáridos no modificados y/o monosacáridos modificados, en el que los monosacáridos modificados están en particular O-acetilados y/o N-acetilados.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en el que dicha muestra de ensayo comprende además:

• una matriz acuosa, que incluye, dicha matriz, opcionalmente uno o más de tampones, sales inorgánicas, alcoholes de azúcar y/o tensioactivos no iónicos;

• opcionalmente polisacáridos no unidos a proteína transportadora ("PS libres");

• opcionalmente proteínas no relacionadas.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en el que dicha muestra de ensayo comprende una pluralidad de diferentes glicoconjugados, preferentemente 4 - 20 glicoconjugados, preferentemente 4 - 10 glicoconjugados, tal como 4, 9 o 10 glicoconjugados, en el que, dichos glicoconjugados, difieren en los componentes polisacáridos enumerados en la reivindicación 5 (ii).

9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, en el que dicho análisis incluye

• la identificación de variantes mono-, di-, tri- y/o tetraglicosiladas de dicho glicoconjugado y/o

• la cuantificación absoluta de variantes mono-, di-, tri- y/o tetraglicosiladas de dicho glicoconjugado sobre la base de una curva de calibración.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, en el que dicha etapa a) comprende además una o más de las etapas siguientes, preferentemente en el orden que se indica:

(a1) ajustar la concentración del glicoconjugado a una concentración esperada de 0,01 - 0,50 gg ml-1;

(a2) añadir a la muestra uno o más reactivos auxiliares seleccionados de un tampón de muestra, un agente reductor de puente disulfuro y uno o más marcadores;

(a3) desnaturalizar la muestra, preferentemente mediante la aplicación de calor.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, en el que dicha etapa b) comprende además una o más de las etapas siguientes, preferentemente en el orden que se indica:

(b1) cargar una matriz de análisis, que comprende preferentemente una matriz de exclusión por tamaño, en los capilares de dicho sistema de inmunoensayo;

(b2) cargar la muestra de ensayo, muestras de calibración, muestra de escalera opcional y muestra de control opcional en capilares individuales de dicho sistema de inmunoensayo;

(b3) separar los componentes de dichas muestras;

(b4) inmovilizar los componentes de dicha muestra;

(b5) aplicar un anticuerpo primario específico de glicano que se une a dicho glicoconjugado;

(b6) aplicar un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario y que genera una señal detectable;

(b7) en caso de que el anticuerpo secundario esté unido a una enzima, aplicar un sustrato para dicha enzima.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que en la etapa (b6) se genera la señal detectable dado que dicho anticuerpo secundario está unido covalentemente a una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante, capaz de catalizar una reacción quimioluminiscente, una reacción quimiofluorescente o una reacción química que da como resultado un producto coloreado o fluorescente.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12, en el que la etapa c) comprende además una o más de las etapas siguientes, preferentemente en el orden que se indica:

(c1) recibir el conjunto de datos para cada capilar generado en la etapa b);

(c2) identificar el fondo para cada capilar;

(c3) sustraer la señal de fondo individual de la señal medida del capilar correspondiente;

(c4) obtener un área bajo la curva para cada capilar integrando la señal con corrección de fondo a lo largo de un intervalo de integración ajustable y específico de polisacárido;

(c5) establecer una curva de calibración aplicando regresión no lineal, preferentemente aplicando un modelo de regresión bilogarítmico con efectos cuadráticos, a las señales generadas por muestras de calibración con concentraciones conocidas y, así, representar el área bajo la curva calculada para cada señal frente a la concentración de la muestra de calibración correspondiente;

(c6) calcular la concentración del glicoconjugado dentro de la muestra de ensayo comparando el área bajo la curva medida con la curva de calibración; y

(c7) evaluar la validez de la concentración calculada mediante comparación automatizada con criterios de aceptación predefinidos.