ES3023938T3 - Neutralizing antibodies to the alpha v beta 8 integrin complex for immunotherapy - Google Patents

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Abstract

Se proporciona un anticuerpo que se une específicamente al ανββ humano y bloquea la unión del péptido TGFp al ανβ8. El anticuerpo se une al bucle determinante de especificidad (SDL) del β8 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une además a uno, dos o los tres dominios de cabeza av humano, a la hélice α1 del β8 humano o a la hélice α1 del β8 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo es humanizado o quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo está unido a un marcador detectable. También se proporciona un método para potenciar la respuesta inmunitaria en un individuo humano, que comprende la administración de una cantidad suficiente del anticuerpo al individuo, potenciando así la respuesta inmunitaria. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-ανββ o sus moléculas de unión al antígeno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos neutralizantes del complejo integrina alfa v beta 8 para inmunoterapia
DECLARACIÓN DE DERECHOS A INVENCIONES REALIZADAS BAJO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO CON PATROCINIO FEDERAL
La presente invención se realizó con apoyo gubernamental en virtud de la subvención n.° U54 HL119893, otorgada por los National Institutes of Health. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.
Antecedentes de la invención
El factor de crecimiento transformante p (TGFp) se caracterizó originalmente como un oncogén capaz de inducir un fenotipo transformado en células no neoplásicas. Desde entonces se han caracterizado varios miembros de la familia TGFp, basándose en la presencia de dominios de aminoácidos similares.
Algunas isoformas de TGF-p se expresan de forma ubicua en los mamíferos (TGF-p 1-3), pero se mantienen en una forma inactiva mediante interacción no covalente con un propéptido, el dominio asociado a la latencia de TGF-p (LAP). Para que el TGFp señalice, debe liberarse de su complejo inactivo mediante un proceso llamado activación de TGFp. El complejo TGF latente incluye 3 componentes: el dímero TGFp activo (maduro), LAP (péptido asociado a la latencia) y LTBP (proteína de unión a TGFp latente). LAP es un dímero, enlazado mediante un puente disulfuro, que representa el extremo N-terminal de la proteína precursora TGFp. La proteína TGFp madura representa el extremo C terminal (aproximadamente 25 kD) del precursor. El enlace entre los TGFp y el LAP se escinde proteolíticamente dentro del Golgi, pero el propéptido TGF-p permanece unido a TGFp mediante interacciones no covalentes. El complejo de TGFp y LAP se denomina complejo latente pequeño (SLC). Es la asociación de LAP y TGFp la que confiere latencia. La unión de LAP-TGFp es reversible y los componentes purificados aislados pueden recombinarse para formar un SLC inactivo. Tanto el SLC como el complejo más grande se denominan en el presente documento TGFp latente, ya que ambos están inactivos.
En general, las integrinas son moléculas de adhesión y median la unión de las células a las proteínas de la matriz extracelular. La integrina avp8 se une al LAP de TGF-p y media la activación de TGF-p1 y 3 (Muet al.(2002)7.Cell Biol.159:493). La activación de TGF-p mediada por la integrina avp8 es necesaria para la activaciónin vivode TGF-p (es decir, liberación del polipéptido TGF-p maduro), por lo tanto, avp8 es un guardián de la función de TGF-p. La integrina avp8 se expresa en epitelios normales (por ejemplo, epitelios de las vías respiratorias), células mesenquimales y tejidos neuronales.
La integrina p8 (Itgb8) se ha asociado a linfocitos T positivos para forkhead box P3 (Foxp3) y remodelación epigenética específica de T reguladores. Véase, por ejemplo, Vandenbon,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USAvol. 113 n.° 17 p. E2393-E2402 (2016). FoxP3 es un factor de transcripción implicado en el desarrollo de linfocitos T reguladores (Treg). Los linfocitos Treg efectores humanos y de ratón expresan la integrina avp8 activadora de TGF-p funcional.Véase,Worthington,ImmunityVolumen 42, Artículo 5, p. 903-915 (mayo de 2015). La activación de TGF-p mediada por la integrina avp8 de los linfocitos T reg no es necesaria para la homeostasis de los linfocitos T y la expresión de la integrina avp8 por los linfocitos Treg suprime la inflamación activa.
Minagawaet al.(2014) Science Translational Medicine, AAAS 6:241 divulgan la focalización selectiva de la activación de TGF-p para tratar la enfermedad fibroinflamatoria de las vías respiratorias.
Definiciones
A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente una persona experta habitual en la materia. Véase,por ejemplo,Lackie, Dictionary of Cell and Molecular Biology, Elsevier (4a ed. 2007); Sambrooket al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Cualquier método, dispositivo y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica de la presente invención. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de determinados términos usados frecuentemente en el presente documento y no deben entenderse que limiten el alcance de la presente divulgación.
Las expresiones "anticuerpo anti-avp8", "anticuerpo específico de avp8", "anticuerpo avp8" y "anti-avp8" se usan como sinónimos en el presente documento para referirse a un anticuerpo que se une específicamente a avp8. De forma similar, un anticuerpo anti-p8 (y términos similares) se refieren a un anticuerpo que se une específicamente a p8. Los anticuerpos anti-avp8 y los anticuerpos anti-p8 descritos en el presente documento se unen a la proteína expresada en las células que expresan avp8.
Un trastorno asociado a avp8 es una afección caracterizada por la presencia de células que expresan avp8, ya sea células que expresan un nivel aumentado de avp8, o un número aumentado de células que expresan avp8 en relación con un control normal, no enfermo. Los trastornos asociados a TGFp (trastornos caracterizados por una actividad de TGFp superior a la normal) incluyen trastornos asociados a avp8, ya que avp8 está implicada en la activación de TGFp en determinadas circunstancias, como se describe en el presente documento.
"Ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma mono- o bicatenaria y complementos de las mismas. El término "polinucleótido" se refiere a una secuencia lineal de nucleótidos. El término "nucleótido" se refiere normalmente a una unidad individual de un polinucleótido, es decir, un monómero. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o versiones modificadas de los mismos. Los ejemplos de polinucleótidos contemplados en el presente documento incluyen ADN monocatenario y bicatenario, ARN monocatenario y bicatenario y moléculas híbridas que tienen mezclas de ADN y ARN monocatenario y bicatenario.
Las palabras "complementario" o "complementariedad" se refieren a la capacidad de un ácido nucleico de un polinucleótido para formar un par de bases con otro ácido nucleico de un segundo polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia A-G-T es complementaria de la secuencia T-C-A. La complementariedad puede ser parcial, en la cual solamente parte de los ácidos nucleicos se emparejan según el emparejamiento de bases, o bien completa, donde todos los ácidos nucleicos se emparejan según el emparejamiento de bases.
Las palabras "proteína", "péptido" y "polipéptido" se usan indistintamente para denotar un polímero de aminoácido o un conjunto de dos o más polímeros de aminoácidos que interactúan o se unen. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más restos de aminoácidos son un imitador químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales, aquellos que contienen restos modificados y polímeros de aminoácidos no naturales.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural o sintético, así como a análogos de aminoácidos e imitadores de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que la de un aminoácido de origen natural, por ejemplo, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Tales análogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los imitadores de aminoácidos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido de origen natural.
Los aminoácidos pueden mencionarse en el presente documento bien por sus símbolos habitualmente conocidos de tres letras o bien mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, asimismo, pueden citarse por sus códigos de una letra habitualmente aceptados.
"Variantes modificadas conservativamente " se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico concretas, las variantes modificadas conservativamente se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o si el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas o asociadas, por ejemplo, naturalmente contiguas. A causa de la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican la mayoría de las proteínas. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina se especifica mediante un codón, el codón puede alterarse a otro de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico se denominan "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácidos nucleicos en el presente documento que codifica un polipéptido también describe variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que, en ciertos contextos, cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse con el fin de conseguir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, las variaciones silenciosas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido están implícitas en una secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a secuencias de sonda reales.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, de péptido, de polipéptido o de proteína que altera, añade o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos de la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas conservativamente son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos. Los siguientes aminoácidos normalmente son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton,Proteins(1984)).
El término "idéntico" o la expresión "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos, o dos o más polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de nucleótidos, o aminoácidos, que son iguales (es decir, aproximadamente identidad del 60 %, preferentemente el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o identidad mayor en una región especificada, cuando se comparan y se alinean para obtener una correspondencia máxima en una ventana de comparación o región designada) tal como se determina usando algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con parámetros por defecto, o mediante alineación manual e inspección visual. Véase, por ejemplo, el sitio web del NCBI en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Por lo tanto, se dice que dichas secuencias son "sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere, o puede aplicarse, al complemento de una secuencia de prueba de nucleótidos. La definición también incluye secuencias que tienen deleciones y/o adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones. Como se describe a continuación, los algoritmos preferidos pueden tener en cuenta huecos y similares. Normalmente, existe identidad en una región que comprende un epítopo de anticuerpo, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o en una región que tiene 50-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o en toda la longitud de la secuencia de referencia.
El término "recombinante" cuando se usa en referencia, por ejemplo, a una célula, o un ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogo o la alteración de un ácido nucleico o proteína natural, o que la célula deriva de una célula modificada de esta forma. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma natural (no recombinante) de la célula o expresan genes naturales que de otra forma se expresarían de forma anómala, expresados en baja cantidad, o no expresados en absoluto.
El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a las partes de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestos para fabricar un ácido nucleico funcional nuevo, por ejemplo, un promotor procedente de una fuente y una región de codificación procedente de otra fuente. De forma similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).
El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, denota que el ácido nucleico o la proteína están prácticamente exentos de otros componentes celulares con los que está asociado en su estado natural. Preferentemente se encuentra en un estado homogéneo. Puede estar en solución seca o acuosa. La pureza y la homogeneidad se determinan normalmente usando técnicas de química analítica tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida o la cromatografía líquida de alto rendimiento. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está prácticamente purificada. En particular, un gen aislado se separa de los marcos de lectura abiertos que flanquean el gen y que codifican una proteína distinta del gen de interés. El término "purificado" denota que un ácido nucleico o proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. Particularmente, significa que el ácido nucleico o la proteína es al menos el 85 % puro, más preferentemente al menos el 95 % puro, y lo más preferentemente al menos el 99 % puro.
El término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región marco codificada por un gen de inmunoglobulina, o fragmentos del mismo, que se unen y reconocen específicamente un antígeno, por ejemplo, avp8 humana, un marcador de superficie celular particular o cualquier diana deseada. Normalmente, la "región variable" contiene la región de unión a antígeno del anticuerpo (o su equivalente funcional) y es la más crítica en cuanto a especificidad y afinidad de unión. Véase Paul,Fundamental Immunology(2003).
Una unidad estructural de una inmunoglobulina (anticuerpo) ilustrativa comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. Las expresiones cadena ligera variable (Vl) y cadena pesada variable (Vh) se refieren a dichas cadenas ligera y pesada, respectivamente.
Un "isotipo" es una clase de anticuerpos definida por la región constante de la cadena pesada. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser de cualquier isotipo o clase de isotipo. Los genes de inmunoglobulina incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de isotipos, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Los anticuerpos pueden existir como inmunoglobulinas intactas o como cualquiera de varios fragmentos bien caracterizados que incluyen actividad de unión al antígeno específico. Dichos fragmentos pueden producirse mediante digestión con diversas peptidasas. La pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que es en sí mismo una cadena ligera unida a Vh-Ch1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo de esta forma el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región bisagra (véaseFundamental Immunology(Paul ed., 3a ed. 1993). Aunque diversos fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la materia apreciará que dichos fragmentos pueden sintetizarsede novobien químicamente o usando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación de anticuerpos completos, o aquellos sintetizadosde novousando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv monocatenario) o aquellos identificados usando bibliotecas de presentación de fagos (véase, por ejemplo, McCaffertyet al., Nature348:552-554 (1990)).
Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, puede usarse cualquier técnica conocida en la materia (véanse, por ejemplo, Kohler y Milstein,Nature256:495-497 (1975); Kozboret al., Immunology Today4:72 (1983); Coleetal.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985). Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de e E.UU. N.° 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos contra polipéptidos. También, los ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, pueden usarse para expresar anticuerpos humanizados. Como alternativa, puede usarse tecnología de visualización de fagos para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados (véase, por ejemplo, McCaffertyet al.,citado anteriormente, Markset al., Biotechnology,10:779-783, (1992)).
Los métodos para humanizar o primatizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácido introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se denominan con frecuencia restos importados, que se toman normalmente de un dominio variable donante. La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo los métodos de Winter y colaboradores (véanse, por ejemplo, Joneset al., Nature321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature332:323-327 (1988); Verhoeyenet al., Science239:1534-1536 (1988) y Presta,Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992)), sustituyendo las CDR o las secuencias de CDR de roedores por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de EE.UU. N.° 4.816.567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los cuales algunos restos de la región determinante de la complementariedad ("CDR") y posiblemente algunos restos del marco ("FR") están sustituidos por restos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
Los anticuerpos o moléculas de unión a antígenos de la invención incluyen además una o más cadenas de inmunoglobulina que están químicamente conjugadas a, o expresadas como, proteínas de fusión con otras proteínas. También incluye anticuerpos biespecíficos. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de unión diferentes. Otros fragmentos de unión a antígeno o porciones de anticuerpos de la invención incluyen scFv bivalente (diacuerpo), anticuerpos scFv biespecíficos donde la molécula de anticuerpo reconoce dos epítopos diferentes, dominios de unión únicos (dAb) y minicuerpos.
Los diversos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden producirse mediante modificación enzimática o química de los anticuerpos intactos, o sintetizarsede novousando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv monocatenario), o identificarse usando bibliotecas de visualización de fagos (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990). Por ejemplo, los minicuerpos pueden generarse usando métodos descritos en la técnica, por ejemplo, Vaughan y Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen.
4:417-302001. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una diversidad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol.
79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). Los anticuerpos monocatenarios pueden identificarse usando bibliotecas de visualización de fagos o bibliotecas de visualización de ribosomas, bibliotecas barajadas de genes. Estas bibliotecas pueden construirse a partir de fuentes sintéticas, semisintéticas o nativas e inmunocompetentes.
Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una preparación clonal de anticuerpos con una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo determinado en un antígeno. Un "anticuerpo policlonal" se refiere a una preparación de anticuerpos que se generan contra un solo antígeno, pero con diferentes especificidades y afinidades de unión.
Como se usa en el presente documento, "región V" se refiere a un dominio de región variable de anticuerpo que comprende los segmentos del Marco 1, CDR1, Marco 2, CDR2, Marco 3, CDR3 y Marco 4. Estos segmentos se incluyen en el segmento V como consecuencia de la transposición de los genes de la región V de la cadena pesada y la cadena ligera durante la diferenciación de los linfocitos B.
Como se usa en el presente documento, "región determinante de complementariedad (CDR)" se refiere a las tres regiones hipervariables en cada cadena que interrumpen las cuatro regiones "marco" establecidas por las regiones variables de cadena ligera y pesada. Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan normalmente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N, y también se identifican normalmente por la cadena en la que está ubicada la CDR particular. Por lo tanto, una CDR3 de Vh está ubicada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 de Vl es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra.
Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para colocar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.
Las secuencias de aminoácidos de las CDR y las regiones marco pueden determinarse usando diversas definiciones bien conocidas en la técnica, por ejemplo, Rabat, Chothia, base de datos internacional ImMunoGeneTics (IMGT) y AbM (véanse, por ejemplo, Johnson y Wu,Nucleic Acids Res.1 de enero de 2000; 28(1): 214-218 y Johnsonet al.,Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia y Lesk, (1987)J. Mol. Biol.196, 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342, 877-883; Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikaniet al., J.Mol.Biol1997, 273(4)). Salvo que se indique lo contrario, las CDR se determinan de acuerdo con Rabat. Las definiciones de los sitios de combinación de antígenos también se describen en los siguientes: Ruiz et al.Nucleic Acids Res.,28, 219-221 (2000); y LefrancNucleic Acids Res.enero l;29(l):207-9 (2001); MacCallumet al., J. Mol. Biol.,262: 732745 (1996); y Martinet al, Proc. Natl Acad. Sci.EE.UU., 86, 9268-9272 (1989); Martin,et al, Methods Enzymol.,203: 121-153, (1991); Pedersenet al, Immunomethods,1, 126, (1992); y Reeset al,En Sternberg M. J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996).
Un"anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la cual (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, se reemplaza o se intercambia de tal manera que el sitio de unión a antígeno (región variable, CDR, o porción del mismo) está enlazada a una región constante de una clase diferente o alterada, función efectora y/o especie o una molécula completamente diferente que transmite nuevas propiedades al anticuerpo quimérico (por ejemplo, una enzima, una toxina, una hormona, un factor de crecimiento, un fármaco, etc.); o (b) la región variable, o una porción de la misma, se altera, se reemplaza por o se intercambia con una región variable que tiene una especificidad de antígeno diferente o alterada (por ejemplo, regiones CDR y de marco de diferentes especies).
Unanticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que conserva la reactividad de un anticuerpo no humano pero siendo menos inmunogénico en seres humanos. Esto puede lograrse, por ejemplo, conservando las regiones CDR no humanas y reemplazando las partes restantes del anticuerpo con sus homólogos humanos. Véase, por ejemplo, Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,81:6851-6855 (1984); Morrison y Oi,Adv. Immunol.,44:65-92 (1988); Verhoeyenet al., Science,239:15341536 (1988); Padlan,Molec. Immun.,28:489-498 (1991); Padlan,Molec. Immun.,31(3): 169-217 (1994).
El anticuerpo se une a un "epítopo" sobre el antígeno. El epítopo es el sitio de interacción de unión del anticuerpo específico en el antígeno y puede incluir unos pocos aminoácidos o porciones de unos pocos aminoácidos, por ejemplo, 5 o 6, o más, por ejemplo, 20 o más aminoácidos o porciones de esos aminoácidos. En algunos casos, el epítopo incluye componentes no proteicos, por ejemplo, de un carbohidrato, ácido nucleico o lípido. En algunos casos, el epítopo es una fracción tridimensional. Por lo tanto, por ejemplo, cuando la diana es una proteína, el epítopo puede comprender aminoácidos consecutivos o de aminoácidos de diferentes partes de la proteína que se acercan mediante el plegamiento de la proteína (por ejemplo, un epítopo discontinuo). Lo mismo ocurre con otros tipos de moléculas diana que forman estructuras tridimensionales.
La expresión "unirse específicamente" se refiere a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) que se une a un diana con al menos 2 veces más afinidad que los compuestos no diana, por ejemplo, al menos 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces o 100 veces mayor afinidad. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a p8 normalmente se unirá a p8 con al menos una afinidad 2 veces mayor que una diana que no sea p8 (por ejemplo, una subunidad de integrina diferente, por ejemplo, p6).
La expresión "se une" con respecto a un tipo de célula (por ejemplo, un anticuerpo que se une a células fibróticas, hepatocitos, condrocitos, etc.), generalmente indica que un agente se une a la mayoría de las células en una población pura de esas células. Por ejemplo, un anticuerpo que se une a un tipo de célula determinado normalmente se une al menos a 2/3 de las células de una población de las células indicadas (por ejemplo, el 75, el 80, el 85, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100 %). Cualquier persona experta reconocerá que surgirá cierta variabilidad dependiendo del método y/o umbral para determinar la unión.
Como se usa en el presente documento, un primer anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, "compite" por la unión a una diana con un segundo anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, cuando la unión del segundo anticuerpo con la diana disminuye de forma detectable en presencia del primer anticuerpo en comparación con la unión del segundo anticuerpo en ausencia del primer anticuerpo. La alternativa, donde la unión del primer anticuerpo a la diana también disminuye de forma detectable en presencia del segundo anticuerpo, puede, pero no necesariamente ser el caso. Es decir, un segundo anticuerpo puede inhibir la unión de un primer anticuerpo a la diana sin que ese primer anticuerpo inhiba la unión del segundo anticuerpo a la diana. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo a su epítopo o ligando cognado, ya sea al mismo, en mayor o menor grado, se dice que los anticuerpos "compiten de forma cruzada" entre sí por la unión de sus respectivos epítopos. La presente divulgación abarca tanto los anticuerpos competitivos como los de competencia cruzada. El término anticuerpo "competidor" puede aplicarse al primer o al segundo anticuerpo según lo determine un experto en la materia. En algunos casos, la presencia del anticuerpo competidor (por ejemplo, el primer anticuerpo) reduce la unión del segundo anticuerpo a la diana en al menos el 10 %,por ejemplo,el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o más, por ejemplo, de tal manera que la unión del segundo anticuerpo a la diana es indetectable en presencia del primer anticuerpo (competidor).
La expresión "expresado diferencialmente" o "regulado diferencialmente" se refiere generalmente a un biomarcador de proteína o ácido nucleico que está sobreexpresado (regulado positivamente) o subexpresado (regulado negativamente) en una muestra en comparación con al menos otra muestra. En el contexto de la presente divulgación, el término generalmente se refiere a la sobreexpresión de un biomarcador (por ejemplo, avp8) sobre una célula enferma en comparación con una célula normal.
Por ejemplo, el término "sobreexpresado" o la expresión "regulado positivamente" se refieren indistintamente a una proteína o un ácido nucleico, generalmente un biomarcador, que se transcribe o se traduce a un nivel detectablemente mayor que el de control. El término incluye la sobreexpresión debida a la transcripción, el procesamiento postranscripcional, la traducción, el procesamiento postraduccional, la localización celular (por ejemplo, orgánulo, citoplasma, núcleo, superficie celular) y la estabilidad del ARN y las proteínas. La sobreexpresión puede detectarse usando técnicas convencionales para detectar biomarcadores, ya sea ARNm (es decir, RT-PCR, hibridación) o proteína (es decir, citometría de flujo, formación de imágenes, ELISA, técnicas inmunohistoquímicas). La sobreexpresión puede ser el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o más en comparación con una célula normal.
Las expresiones "agonista", "activador", "inductor" y términos similares se refieren a moléculas que aumentan la actividad o la expresión en comparación con un control. Los agonistas son agentes que, por ejemplo, se unen a, estimulan, aumentar, activan, potencian la activación, sensibilizan o regulan positivamente la actividad de la diana. La expresión o la actividad pueden aumentarse el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 100 % o más que eso en un control. En determinados casos, la activación es 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más en comparación con un control.
Las expresiones "inhibidor", "represor", "antagonista" o "regulador negativo" se refieren indistintamente a una sustancia que produce un nivel de expresión o actividad detectablemente menor en comparación con un control. La expresión o actividad inhibida puede ser el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o menos que en un control. En determinados casos, la inhibición es 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más en comparación con un control.
Una muestra de "control" o valor de referencia se refiere a una muestra que sirve como una referencia, habitualmente una referencia conocida, para comparación con una muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de prueba puede tomarse a partir de una condición de prueba, por ejemplo, en presencia de un compuesto de prueba, y en comparación con muestras procedentes de condiciones conocidas, por ejemplo, en ausencia del compuesto de prueba (control negativo), o en presencia de un compuesto conocido (control positivo). Un control también puede representar un valor promedio recogido de varios ensayos o resultados. Un experto en la materia reconocerá que los controles pueden diseñarse para evaluar cualquier número de parámetros. Por ejemplo, puede diseñarse un control para comparar el beneficio terapéutico basándose en datos farmacológicos (por ejemplo, semivida) o medidas terapéuticas (por ejemplo, comparación de beneficios y/o efectos secundarios). Los controles pueden diseñarse para aplicacionesin vitro.Un experto en la materia entenderá qué controles son valiosos en una situación dada, y es capaz de analizar los datos basándose en comparaciones con valores de control. Los controles también son valiosos para determinar la significancia de los datos. Por ejemplo, si los valores de un parámetro dado son ampliamente variables en los controles, la variación en las muestras de prueba no se considerará significativa.
Un "marcador" o un "resto detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros físicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen 32P, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina, o haptenos y proteínas u otras entidades que pueden hacerse detectables, por ejemplo, mediante la incorporación de un radiomarcador en un péptido o anticuerpo específicamente reactivo con un péptido diana. Puede emplearse cualquier método conocido en la materia para conjugar un anticuerpo con el marcador, por ejemplo, usando los métodos descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.
Una molécula "marcada" (por ejemplo, ácido nucleico, proteína o anticuerpo) es una que está unida, bien covalentemente, a través de un enlazador o un enlace químico, o bien no covalentemente, a través de enlaces iónicos, de van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a un marcador de tal manera que la presencia de la molécula puede detectarse detectando la presencia del marcador unido a la molécula.
El término "diagnóstico" se refiere a la probabilidad relativa de que un trastorno tal como cáncer o una afección inflamatoria esté presente en el sujeto. De forma similar, el término "pronóstico" se refiere a una probabilidad relativa de que un determinado resultado futuro pueda producirse en el sujeto. Por ejemplo, el pronóstico puede referirse a la probabilidad de que un individuo desarrolle un trastorno asociado a TGFp o avp8, tener recidiva, o la probable gravedad de la enfermedad (por ejemplo, gravedad de los síntomas, tasa de deterioro funcional, supervivencia, etc.). No se pretende que los términos sean absolutos, como apreciará cualquier experto en el campo del diagnóstico médico.
"Biopsia" o "muestra biológica de un paciente" como se usa en el presente documento se refiere a una muestra obtenida de un paciente que tiene, o se sospecha que tiene, un trastorno asociado a TGFp o avp8. La muestra puede ser una biopsia de tejido, tal como biopsia con aguja, biopsia con aguja fina, biopsia quirúrgica, etc. La muestra también puede ser una muestra de sangre o una fracción de sangre, por ejemplo, fracción de glóbulos blancos, suero o plasma. La muestra puede comprender una muestra de tejido que alberga una lesión o una lesión sospechada, aunque la muestra biológica también puede derivar de otro sitio, por ejemplo, un sitio de metástasis sospechada, un ganglio linfático o de la sangre. En algunos casos, la muestra biológica también puede ser de una región adyacente a la lesión o lesión sospechada.
Puede obtenerse una "muestra biológica" de un paciente, por ejemplo, una biopsia, de un animal, tal como un modelo animal o de células cultivadas, por ejemplo, una línea celular o células extraídas de un paciente y cultivadas para observación. Las muestras biológicas incluyen tejidos y líquidos corporales, por ejemplo, sangre, fracciones de sangre, linfa, saliva, orina, heces, etc.
Los términos "terapia", "tratamiento", y "alivio" se refieren a cualquier reducción en la intensidad de los síntomas. En el caso del tratamiento de una afección inflamatoria, el tratamiento puede referirse a reducir, por ejemplo, los niveles sanguíneos de citocinas inflamatorias, los niveles sanguíneos de TGFp maduro activo, dolor, hinchazón, reclutamiento de células inmunitarias, etc. En el caso de tratar un cáncer, el tratamiento puede referirse a reducir, por ejemplo, el tamaño del tumor, el número de células cancerosas, la tasa de crecimiento, la actividad metastásica, la muerte celular de las células no cancerosas, etc. Como se usa en el presente documento, los términos "tratar" y "prevenir" no pretenden ser términos absolutos. El tratamiento y la prevención pueden referirse a cualquier retraso en la aparición, mejora de los síntomas, mejora en la supervivencia del paciente, aumento del tiempo o tasa de supervivencia, etc. El tratamiento y la prevención pueden ser completos (no quedan síntomas detectables) o parciales, de tal manera que los síntomas sean menos frecuentes o graves que en un paciente sin el tratamiento descrito en el presente documento. El efecto del tratamiento puede compararse con un individuo o grupo de individuos que no reciben el tratamiento, o con el mismo paciente antes del tratamiento o en un momento diferente durante el tratamiento. En algunos aspectos, la gravedad de la enfermedad se reduce en al menos el 10 %, en comparación, por ejemplo, con el individuo antes de la administración o con un individuo de control que no se somete al tratamiento. En algunos aspectos la intensidad de la infección o la enfermedad se reduce en al menos el 25 %, el 50 %, el 75 %, el 80 % o el 90 % o, en algunos casos, ya no es detectable usando técnicas de diagnóstico convencionales.
Las expresiones "cantidad eficaz", "dosis eficaz", "cantidad terapéuticamente eficaz", etc. se refieren a esa cantidad del agente terapéutico suficiente para mejorar un trastorno, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, para un determinado parámetro, una cantidad terapéuticamente eficaz mostrará un aumento o disminución del efecto terapéutico al menos el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 75 %, el 80 %, el 90 % o al menos el 100 %. La eficacia terapéutica también puede expresarse como "veces" de aumento o disminución. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede tener al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces o más de efecto en comparación con un control.
Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se usa como sinónimo de fisiológicamente aceptable y farmacológicamente aceptable. Una composición farmacéutica comprenderá generalmente agentes para tamponamiento y conservación en almacenamiento, y puede incluir tampones y vehículos para suministro adecuado, dependiendo de la vía de administración.
Los términos "dosis" y "dosificación" se usan indistintamente en el presente documento. Una dosis se refiere a la cantidad de principio activo que se administra a un individuo en cada administración. Para la presente divulgación, la dosis puede referirse a la concentración del anticuerpo o componentes asociados, por ejemplo, la cantidad de agente terapéutico o dosis de radiofármaco. La dosis variará dependiendo de varios factores, incluyendo frecuencia de administración; tamaño y tolerancia del individuo; gravedad de la afección; riesgo de efectos secundarios; la vía de administración; y la modalidad de obtención de imágenes de la fracción detectable (si está presente). Un experto en la materia reconocerá que la dosis puede modificarse dependiendo de los factores anteriores o en función del avance terapéutico. La expresión "forma farmacéutica" se refiere al formato particular del producto farmacéutico y depende de la vía de administración. Por ejemplo, una forma farmacéutica puede estar en un líquido, por ejemplo, una solución salina para inyección.
"Sujeto", "paciente", "individuo" y términos similares se usan indistintamente y se refieren a, excepto cuando se indique, mamíferos tales como seres humanos y primates no humanos, así como conejos, ratas, ratones, cabras, cerdos y otras especies de mamíferos. El término no indica necesariamente que el sujeto haya sido diagnosticado con una enfermedad en particular, pero normalmente se refiere a un individuo bajo supervisión médica. Un paciente puede ser un individuo que busca tratamiento, monitorización, ajuste o modificación de una pauta terapéutica existente, etc.
Una "afección inflamatoria" se refiere a cualquier inflamación en un individuo y puede ser transitoria (por ejemplo, en respuesta a la exposición a un patógeno o alérgeno) o crónica. La inflamación se caracteriza por citocinas inflamatorias tales como IFN-gamma, IL-6 y TNF-alfa que reclutan y activan macrófagos y otros leucocitos. En algunos casos, la inflamación puede desarrollarse hacia una afección crónica, dañina o autoinmunitaria (por ejemplo, EM, lupus, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn). La inflamación puede ser evidente localmente (por ejemplo, en un sitio localizado de infección o exposición) o sistémicamente (por ejemplo, aterosclerosis, hipertensión arterial). Las composiciones de anticuerpos y los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar afecciones inflamatorias.
"Cáncer", "tumor", "transformado" y términos similares incluyen células precancerosas, neoplásicas, transformadas y cancerosas, y puede referirse a un tumor sólido o a un cáncer no sólido (véase, por ejemplo, Edgeet al.AJCC Cancer Staging Manual (7a ed. 2009); Cibas y Ducatman Cytology: Diagnostic principles and clinical correlates (3a ed. 2009)). El cáncer incluye tanto neoplasias benignas como malignas (crecimiento anormal). "Transformación" se refiere a cambios fenotípicos espontáneos o inducidos, por ejemplo, inmortalización de células, cambios morfológicos, crecimiento celular aberrante, inhibición de contacto y anclaje reducidos y/o neoplasias malignas (véase, Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3a ed. 1994)). Aunque la transformación puede surgir de la infección con un virus transformante y la incorporación de nuevo ADN genómico, o la absorción de ADN exógeno, también puede surgir espontáneamente o después de la exposición a un carcinógeno.
El término "cáncer" puede referirse a carcinomas, sarcomas, adenocarcinomas, linfomas, leucemias, cánceres sólidos y linfoides,etc.Algunos ejemplos de diferentes tipos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico o NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de hígado (es decir, hepatocarcinoma), cáncer renal (es decir, carcinoma de células renales), cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer pleural, cáncer pancreático, cáncer uterino, cáncer cervicouterino, cáncer testicular, cáncer anal, cáncer pancreático, cáncer de las vías biliares, tumores carcinoides gastrointestinales, cáncer esofágico, cáncer de vesícula biliar, cáncer de apéndice, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago (gástrico), cáncer del sistema nervioso central, melanoma maligno, coriocarcinoma; cáncer de cabeza y cuello, cáncer hemático, sarcoma osteogénico, fibrosarcoma, neuroblastoma, glioma, melanoma, linfoma de linfocitos B, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Burkitt, Linfoma microcítico, Linfoma macrocítico, leucemia monocítica, leucemia mielógena, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CML), y mieloma múltiple. En algunas realizaciones, las composiciones de anticuerpos y los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar el cáncer.
El término "coadministrar" se refiere a la presencia simultánea de dos principios activos en la sangre de un individuo. Los principios activos que se coadministran pueden suministrarse de forma simultánea o secuencial.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a avp8 humana y bloquea la unión del péptido TGFp a avp8, en donde el anticuerpo comprende:
CDR1 SEQ ID NO:520, CDR2 SEQ ID NO:521 y CDR3 SEQ ID NO:522 de la cadena pesada; y CDR1 SEQ ID NO:541, CDR2 SEQ ID NO:542 y CDR3 SEQ ID NO:543 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:562, CDR2 SEQ ID NO: 563 y CDR3 SEQ ID NO: 564 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:569, CDR2 SEQ ID NO: 570 y CDR3 SEQ ID NO: 571 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:313, CDR2 SEQ ID NO: 314 y CDR3 SEQ ID NO: 315 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:334, CDR2 SEQ ID NO: 335 y CDR3 SEQ ID NO: 336 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:319, CDR2 SEQ ID NO: 320 y CDR3 SEQ ID NO: 321 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:340, CDR2 SEQ ID NO: 341 y CDR3 SEQ ID NO: 342 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:316, CDR2 SEQ ID NO: 317 y CDR3 SEQ ID NO: 318 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:337, CDR2 SEQ ID NO: 338 y CDR3 SEQ ID NO: 339 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:322, CDR2 SEQ ID NO: 323 y CDR3 SEQ ID NO: 324 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:343, CDR2 SEQ ID NO: 344 y CDR3 SEQ ID NO: 345 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:322, CDR2 SEQ ID NO: 323 y CDR3 SEQ ID NO: 324 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:346, CDR2 SEQ ID NO: 347 y CDR3 SEQ ID NO: 348 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:322, CDR2 SEQ ID NO: 323 y CDR3 SEQ ID NO: 324 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:349, CDR2 SEQ ID NO: 350 y CDR3 SEQ ID NO: 351 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:325, CDR2 SEQ ID NO: 326 y CDR3 SEQ ID NO: 327 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:352, CDR2 SEQ ID NO: 353 y CDR3 SEQ ID NO: 354 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:325, CDR2 SEQ ID NO: 326 y CDR3 SEQ ID NO: 327 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:355, CDR2 SEQ ID NO: 356 y CDR3 SEQ ID NO: 357 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:325, CDR2 SEQ ID NO: 326 y CDR3 SEQ ID NO: 327 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:358, CDR2 SEQ ID NO: 359 y CDR3 SEQ ID NO: 360 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:367, CDR2 SEQ ID NO: 368 y CDR3 SEQ ID NO: 369 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:373, CDR2 SEQ ID NO: 374 y CDR3 SEQ ID NO: 375 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:364, CDR2 SEQ ID NO: 365 y CDR3 SEQ ID NO: 366 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:373, CDR2 SEQ ID NO: 374 y CDR3 SEQ ID NO: 375 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:331, CDR2 SEQ ID NO: 332 y CDR3 SEQ ID NO: 333 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:382, CDR2 SEQ ID NO: 383 y CDR3 SEQ ID NO: 384 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:379, CDR2 SEQ ID NO: 380 y CDR3 SEQ ID NO: 381 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:361, CDR2 SEQ ID NO: 362 y CDR3 SEQ ID NO: 363 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:331, CDR2 SEQ ID NO: 332 y CDR3 SEQ ID NO: 333 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:361, CDR2 SEQ ID NO: 362 y CDR3 SEQ ID NO: 363 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:508, CDR2 SEQ ID NO: 509 y CDR3 SEQ ID NO: 510 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:529, CDR2 SEQ ID NO: 530 y CDR3 SEQ ID NO: 531 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:511, CDR2 SEQ ID NO: 512 y CDR3 SEQ ID NO: 513 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:532, CDR2 SEQ ID NO: 533 y CDR3 SEQ ID NO: 534 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:514, CDR2 SEQ ID NO: 515 y CDR3 SEQ ID NO: 516 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:535, CDR2 SEQ ID NO: 536 y CDR3 SEQ ID NO: 537 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:523, CDR2 SEQ ID NO: 524 y CDR3 SEQ ID NO: 525 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:544, CDR2 SEQ ID NO: 545 y CDR3 SEQ ID NO: 546 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:526, CDR2 SEQ ID NO: 527 y CDR3 SEQ ID NO: 528 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:547, CDR2 SEQ ID NO: 548 y CDR3 SEQ ID NO: 549 de la cadena ligera.
En algunas realizaciones, el anticuerpo está enlazado a un marcador detectable.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además secuencias marco de la cadena pesada FR1, FR2, FR3 y FR4 como SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 560 y SEQ ID NO: 561, respectivamente, y las secuencias marco de la cadena ligera FR1, FR2, FR3 y FR4 como SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 567 y SEQ ID NO: 568, respectivamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además secuencias marco de la cadena pesada FR1, FR2, FR3 y FR4 como SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 552 y SEQ ID NO: 553, respectivamente, y las secuencias marco de la cadena ligera FR1, FR2, FR3 y FR4 como SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 556 y SEQ ID NO: 557, respectivamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo está humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado comprende SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:411; SEQ ID NO:419, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:443, SEQ ID NO:451, SEQ ID NO:459, SEQ ID NO:467; SEQ ID NO:475, SEQ ID NO:484 o SEQ ID NO:500.
ASPECTOS ADICIONALES
También se divulga un anticuerpo que se une específicamente a avp8 humana y bloquea la unión del péptido TGFp a avp8, en donde el anticuerpo se une a un epítopo en avp8 humana que comprende los aminoácidos D148, A149, D150, G151 e Y178 de av humana como ocurre en SEQ ID NO:393 y los aminoácidos H118, S170, D171, Y172, N173, L174, D175, H200 y R201 de p8 humana como ocurre en SEQ ID NO:394. También se divulga un anticuerpo que se une específicamente a avp8 humana y bloquea la unión del péptido TGFp a avp8, en donde el anticuerpo se une al bucle determinante de especificidad (SDL) de p8 humana. En algunos aspectos, el anticuerpo se une además a uno, dos, o los tres dominios de cabeza de av humana, la hélice a1 de p8 humana o la hélice a2 de p8 humana. En algunos aspectos, el anticuerpo es humanizado o quimérico. En algunos aspectos, el anticuerpo está enlazado a un marcador detectable.
También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un método para mejorar una respuesta inmunitaria a una infección vírica en un individuo humano. En algunas realizaciones, el método comprende administrar una cantidad suficiente de dicho anticuerpo al individuo, potenciando de esta manera la respuesta inmunitaria a la infección vírica.
En algunas realizaciones, la infección vírica es una infección de hepatitis. En algunas realizaciones, la infección vírica es una infección de hepatitis B.
También se divulga un método para mejorar una respuesta inmunitaria a una infección vírica en un individuo humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente del anticuerpo al individuo humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a avp8 humana y bloquea la unión del péptido TGFp a avp8 o bloquea la activación de avp8 mediante la unión de TGFp a avp8 humana, potenciando de esta manera la respuesta inmunitaria a la infección vírica.
También se proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un método para mejorar una respuesta inmunitaria a cáncer en un individuo humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente de dicho anticuerpo al individuo, potenciando de esta manera la respuesta inmunitaria al cáncer.
En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer metastásico. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer primario.
También se proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un método para mejorar una respuesta inmunitaria aH. pylorien un individuo humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente de dicho anticuerpo al individuo, potenciando de esta manera la respuesta inmunitaria aH. pylori.
En algunas realizaciones, el individuo humano tiene una úlcera peptídica, carcinoma gástrico o linfoma MALT.
También se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a avp8 humana y que comprende las CDR de la cadena pesada humana SEQ ID NO: 299, SEQ ID n O:301 y SEQ ID NO:303; y las Cd R de la cadena ligera SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:309 y SEQ ID NO:311. Como alternativa, puede usarse cualquier anticuerpo que tenga las CDR de la cadena pesada o una región variable de la cadena pesada como se establece en la FlG. 53 y las CDR de la cadena ligera o una región variable de la cadena ligera de una secuencia correspondiente como se establece en la FIG. 54.
En algunas realizaciones, el anticuerpo está enlazado a un marcador detectable.
También se proporciona un método para detectar la presencia, la ausencia o la cantidad de avp8 humana en una muestra, comprendiendo el método, poner en contacto con la muestra un anticuerpo que se une específicamente a avp8 humana y que comprende las CDR de la cadena pesada humana SEQ ID<n>O: 299, SEQ ID<n>O:301 y SEQ ID<n>O:303; y las C<d>R de la cadena ligera SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:309 y SEQ ID NO:311, y detectar o cuantificar la unión del anticuerpo a la muestra.
En algunas realizaciones, la muestra es una muestra fijada con formalina.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 ilustra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada para los clones usados en la construcción del anticuerpo compuesto C6D4. B13C415-8: todas las secuencias (SEQ ID NO:1), Marco 1 (SEQ ID NO:2), CDR1 (SEQ ID NO:3), Marco 2 (SEQ ID NO:4), CDR2 (SEQ ID NO:5), Marco 3 (SEQ ID NO:6), CRD3 (SEQ ID NO:7) y Marco 4 (SEQ ID NO:8); B13C4 15-10: todas las secuencias (SEQ ID NO:9), Marco 1 (SEQ ID NO: 10), CDR1 (SEQ ID NO: 11), Marco 2 (SEQ ID NO: 12), CDR2 (SEQ ID NO: 13), Marco 3 (SEQ ID NO:14), CRD3 (SEQ ID NO:15) y Marco 4 (SEQ ID NO:16); B13H3.2: todas las secuencias (SEQ ID NO: 17), Marco 1 (SEQ ID NO: 18), CDR1 (SEQ ID NO: 19), Marco 2 (SEQ ID NO:20), CDR2 (SEQ ID NO:21), Marco 3 (SEQ ID NO:22), CRD3 (SEQ ID NO:23) y Marco 4 (SEQ ID NO:24); B13C1231015: todas las secuencias (SEQ ID NO:25), Marco 1 (SEQ ID NO:26), CDR1 (SEQ ID NO:27), Marco 2 (SEQ ID NO:28), CDR2 (SEQ ID NO:29), Marco 3 (SEQ ID NO:30), CRD3 (SEQ ID NO:31) y Marco 4 (SEQ ID NO:32); B15BllVh: todas las secuencias (SEQ ID NO:33), Marco 1 (SEQ ID NO:34), CDR1 (SEQ ID NO:35), Marco 2 (SEQ ID NO:36), CDR2 (SEQ ID NO:37), Marco 3 (SEQ ID NO:38), CRD3 (SEQ ID NO:39) y Marco 4 (SEQ ID NO:40); B2B2 15-9: todas las secuencias (SEQ ID NO:41), Marco 1 (SEQ ID NO:42), CDR1 (SEQ ID NO:43), Marco 2 (SEQ ID NO:44), CDR2 (SEQ ID NO:45), Marco 3 (SEQ ID NO:46), CRD3 (SEQ ID NO:47) y Marco 4 (SEQ ID NO:48); R11D12715.3: todas las secuencias (SEQ ID NO:49), Marco 1 (SEQ ID NO:50), CDR1 (SEQ ID NO:51), Marco 2 (SEQ ID NO:52), CDR2 (SEQ ID NO:53), Marco 3 (SEQ ID NO:54), CRD3 (SEQ ID NO:55) y Marco 4 (SEQ ID NO:56); RSDLVH-1: todas las secuencias (SEQ ID NO:57 y SEQ ID NO:65), Marco 1 (SEQ ID NO:58 y SEQ ID NO:66), CDR1 (SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 67), Marco 2 (SEQ ID NO:60 y SEQ ID NO:68), CDR2 (SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 69), Marco 3 (SEQ ID NO:62 y SEQ ID NO:70), CRD3 (SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:71) y Marco 4 (SEQ ID NO:64 y SEQ ID NO:72); RSDLVH-3: todas las secuencias (SEQ ID NO:73), Marco 1 (SEQ ID NO:74), CDR1 (SEQ ID NO:75), Marco 2 (SEQ ID NO:76), CDR2 (SEQ ID NO:77), Marco 3 (SEQ ID NO:78), CRD3 (SEQ ID NO:79) y Marco 4 (SEQ ID NO:80); RSDLVH-16: todas las secuencias (SEQ ID NO:81), Marco 1 (SEQ ID NO:82), CDR1 (SEQ ID NO:83), Marco 2 (SEQ ID NO:84), CDR2 (SEQ ID NO:85), Marco 3 (SEQ ID NO:86), CRD3 (SEQ ID NO:87) y Marco 4 (SEQ ID NO:88); tanto 29 como 44: todas las secuencias (SEQ ID No :89), Marco 1 (SEQ iD NO:90), CDR1 (SEQ ID NO:91), Marco 2 (SEQ ID NO:92), CDR2 (SEQ ID NO:93), Marco 3 (SEQ ID NO:94), CRD3 (SEQ ID NO:95) y Marco 4 (SEQ ID NO:96); A1=B4=F9: todas las secuencias (SEQ ID NO:97), Marco 1 (SEQ ID NO:98), CDR1 (SEQ ID NO:99), Marco 2 (SEQ ID NO: 100), CDR2 (SEQ ID NO: 101), Marco 3 (SEQ ID NO: 102), CRD3 (SEQ ID NO:103) y Marco 4 (SEQ ID NO: 104); A5=C6: todas las secuencias (SEQ ID NO: 105), Marco 1 (SEQ ID NO: 106), CDR1 (SEQ ID NO: 107), Marco 2 (SEQ ID NO: 108), CDR2 (SEQ ID NO: 109), Marco 3 (SEQ ID NO: 110), CRD3 (SEQ ID NO:111) y Marco 4 (SEQ ID NO: 112); D4=E6: todas las secuencias (SEQ ID NO:113), Marco 1 (SEQ ID NO: 114), CDR1 (SEQ ID NO: 115), Marco 2 (SEQ ID NO: 116), CDR2 (SEQ ID NO: 117), Marco 3 (SEQ ID NO: 118), CRD3 (SEQ ID NO:119) y Marco 4 (SEQ ID NO: 120); y C6D4: todas las secuencias (SEQ ID NO: 121), Marco 1 (SEQ ID NO: 122), CDR1 (SEQ ID NO: 123), Marco 2 (SEQ ID NO: 124), CDR2 (SEQ ID NO: 125), Marco 3 (SEQ ID NO: 126), CRD3 (SEQ ID NO: 127) y Marco 4 (SEQ ID NO:128).
La FIG. 2 ilustra las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera para los clones usados en la construcción del anticuerpo compuesto C6D4. B2B235-20: todas las secuencias (SEQ ID NO: 129), Marco 1 (SEQ ID NO: 130), CDR1 (SEQ ID NO: 131), Marco 2 (SEQ ID NO: 132), CDR2 (SEQ ID NO: 133), Marco 3 (SEQ ID NO: 134), CRD3 (SEQ ID NO:135) y Marco 4 (SEQ ID NO: 136); B2B2 35-26: todas las secuencias (SEQ ID NO: 137), Marco 1 (SEQ ID NO: 138), CDR1 (SEQ ID NO: 139), Marco 2 (SEQ ID NO: 140), CDR2 (SEQ ID NO: 141), Marco 3 (SEQ ID NO: 142), CRD3 (SEQ ID NO:143) y Marco 4 (SEQ ID NO: 144); B15B11vk34-26: todas las secuencias (SEQ ID NO:145), Marco 1 (SEQ ID NO:146), CDR1 (SEQ ID NO: 147), Marco 2 (SEQ ID NO: 148), CDR2 (SEQ ID NO: 149), Marco 3 (SEQ ID NO: 150), CRD3 (SEQ ID NO:151) y Marco 4 (SEQ ID NO: 152); B15B11vk33-24: todas las secuencias (SEQ ID NO:153), Marco 1 (SEQ ID NO:154), CDR1 (SEQ ID NO: 155), Marco 2 (SEQ ID NO: 156), CDR2 (SEQ ID NO: 157), Marco 3 (SEQ ID NO: 158), CRD3 (SEQ ID NO:159) y Marco 4 (SEQ ID NO: 160); B15B11vk35-26: todas las secuencias (SEQ ID NO:161), Marco 1 (SEQ ID NO:162), CDR1 (SEQ ID NO: 163), Marco 2 (SEQ ID NO: 164), CDR2 (SEQ ID NO: 165), Marco 3 (SEQ ID NO: 166), CRD3 (SEQ ID NO:167) y Marco 4 (SEQ ID NO: 168); B13C12134-25: todas las secuencias (SEQ ID NO: 169), Marco 1 (SEQ ID NO: 170), CDR1 (SEQ ID NO: 171), Marco 2 (SEQ ID NO: 172), CDR2 (SEQ ID NO: 173), Marco 3 (SEQ ID NO: 174), CRD3 (SEQ ID NO:175) y Marco 4 (SEQ ID NO: 176); B13C12133-26: todas las secuencias (SEQ ID NO: 177), Marco 1 (SEQ ID NO: 178), CDR1 (SEQ ID NO: 179), Marco 2 (SEQ ID NO: 180), CDR2 (SEQ ID NO: 181), Marco 3 (SEQ ID NO: 182), CRD3 (SEQ ID NO:183) y Marco 4 (SEQ ID NO: 184); B13C435-20: todas las secuencias (SEQ ID NO: 185), Marco 1 (SEQ ID NO: 186), CDR1 (SEQ ID NO: 187), Marco 2 (SEQ ID NO: 188), CDR2 (SEQ ID NO: 189), Marco 3 (SEQ ID NO: 190), CRD3 (SEQ ID NO: 191) y Marco 4 (SEQ ID NO:192); B15B11vk35-20: todas las secuencias (SEQ ID NO:193), Marco 1 (SEQ ID NO: 194), CDR1 (SEQ ID NO: 195), Marco 2 (SEQ ID NO: 196), CDR2 (SEQ ID NO: 197), Marco 3 (SEQ ID NO: 198), CRD3 (SEQ ID NO: 199) y Marco 4 (SEQ ID NO:200); B13C12335-25: todas las secuencias (SEQ ID NO:201), Marco 1 (SEQ ID NO:202), CDR1 (SEQ ID NO:203), Marco 2 (SEQ ID NO:204), CDR2 (SEQ ID NO:205), Marco 3 (SEQ ID NO:206), CRD3 (SEQ ID NO:207) y Marco 4 (SEQ ID NO:208); B13C1233520: todas las secuencias (SEQ ID NO:209), Marco 1 (SEQ ID NO:210), CDR1 (SEQ ID NO:211), Marco 2 (SEQ ID NO:212), CDR2 (SEQ ID NO:213), Marco 3 (SEQ ID NO:214), CRD3 (SEQ ID NO:215) y Marco 4 (SEQ ID NO:216); RSDLVK-1: todas las secuencias (SEQ ID NO:217), Marco 1 (SEQ ID NO:218), CDR1 (SEQ ID NO:219), Marco 2 (SEQ ID NO:220), CDR2 (SEQ ID NO:221), Marco 3 (SEQ ID NO:222), CRD3 (SEQ ID NO:223) y Marco 4 (SEQ ID NO:224); RSDLVK-6: todas las secuencias (SEQ ID NO:225), Marco 1 (SEQ ID NO:226), CDR1 (SEQ ID NO:227), Marco 2 (SEQ ID NO:228), CDR2 (SEQ ID NO:229), Marco 3 (SEQ ID NO:230), CRD3 (SEQ ID NO:231) y Marco 4 (SEQ ID NO:232); RSDLVK-10: todas las secuencias (SEQ ID NO:233), Marco 1 (SEQ ID NO:234), CDR1 (SEQ ID NO:235), Marco 2 (SEQ ID NO:236), CDR2 (SEQ ID NO:237), Marco 3 (SEQ ID NO:238), CRD3 (SEQ ID NO:239) y Marco 4 (SEQ ID NO:240); RSDLVK-13: todas las secuencias (SEQ ID NO:241), Marco 1 (SEQ ID NO:242), CDR1 (SEQ ID NO:243), Marco 2 (SEQ ID NO:244), CDR2 (SEQ ID NO:245), Marco 3 (SEQ ID NO:246), CRD3 (SEQ ID NO:247) y Marco 4 (SEQ ID NO:248); 29: todas las secuencias (SEQ ID NO:249), Marco 1 (SEQ ID NO:250), CDR1 (SEQ ID NO:251), Marco 2 (SEQ ID NO:252), CDR2 (SEQ ID NO:253), Marco 3 (SEQ ID NO:254), CRD3 (SEQ ID NO:255) y Marco 4 (SEQ ID NO:256); 44: todas las secuencias (SEQ ID NO:257), Marco 1 (SEQ ID NO:258), CDR1 (SEQ ID NO:259), Marco 2 (SEQ ID NO:260), CDR2 (SEQ ID NO:261), Marco 3 (SEQ ID NO:262), CRD3 (SEQ ID NO:263) y Marco 4 (SEQ ID NO:264); A1=B4=F9: todas las secuencias (SEQ ID NO:265), Marco 1 (SEQ ID NO:266), CDR1 (SEQ ID NO:267), Marco 2 (SEQ ID NO:268), CDR2 (SEQ ID NO:269), Marco 3 (SEQ ID NO:270), CRD3 (SEQ ID NO:271) y Marco 4 (SEQ ID NO:272); A5=C6: todas las secuencias (SEQ ID NO:273), Marco 1 (SEQ ID NO:274), CDR1 (SEQ ID NO:275), Marco 2 (SEQ ID NO:276), CDR2 (SEQ ID NO:277), Marco 3 (SEQ ID NO:278), CRD3 (SEQ ID NO:279) y Marco 4 (SEQ ID NO:280); D4=E6: todas las secuencias (SEQ ID NO:281), Marco 1 (SEQ ID NO:282), CDR1 (SEQ ID NO:283), Marco 2 (SEQ ID NO:284), CDR2 (SEQ ID NO:285), Marco 3 (SEQ ID NO:286), CRD3 (SEQ ID NO:287) y Marco 4 (SEQ ID NO:288); y C6D4: todas las secuencias (SEQ ID NO:289), Marco 1 (SEQ ID NO:290), CDR1 (SEQ ID NO:291), Marco 2 (SEQ ID NO:292), CDR2 (SEQ ID NO:293), Marco 3 (SEQ ID NO:294), CRD3 (SEQ ID NO:295) y Marco 4 (SEQ ID NO:296).
La FIG. 3 es un gráfico de los porcentajes de inhibición de la unión del factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) para diferentes concentraciones del inhibidor alostérico B5 y el anticuerpo compuesto C6D4.
La FIG. 4 ilustra la conservación del epítopo entre mamíferos, indicando que los anticuerpos pueden ser útiles en múltiples modelos animales preclínicos y tienen una amplia utilidad, incluso en aplicaciones veterinarias. av humana (Se Q ID NO:591); av de chimpancé (s Eq ID NO:592); av de macaco de la India (SEQ ID NO:593); av de macaco cangrejero (SEQ ID NO:594); av de vaca (SEQ ID<n>O:595); av de cerdo (SEQ ID NO:596); av de caballo (SEQ ID NO:597); av de ratón (SEQ ID NO:598); av de rata (SEQ ID NO:599); av de armadillo (SEQ ID NO:600); av de ornitorrinco (SEQ ID n O:601); p8 humana (SEQ ID NO:602); p8 de chimpancé (SEQ ID NO:603); p8 de macaco de la India (SEQ ID NO:604); p8 de macaco cangrejero (SEQ ID<n>O:605); p8 de vaca (SEQ ID NO:606); p8 de cerdo (SEQ ID NO:607); p8 de caballo (SEQ ID NO:608); p8 de ratón (SEQ ID NO:609); p8 de rata (SEQ ID NO:610); p8 de armadillo (SEQ ID NO:611); y p8 de ornitorrinco (SEQ ID NO:612).
La FIG. 5 ilustra las secuencias de integrina alfaV (SEQ ID NO:394) y beta8 (SEQ ID NO:395). El epítopo de C6D4 está en negrita subrayado cursiva.
La FIG. 6 ilustra los resultados de crioEM, destacando las interacciones entre C6D4 y el bucle (SDL) de p8, las hélices a1 y a2 de p8 y la cabeza de av.
La FIG. 7 ilustra los restos de las hélices a1 y a2 de SDL y p8 y la cabeza av de la integrina avp8 que interactúan directamente con C6D4 tras unirse. La secuencia principal de la integrina av es
FNLDVDSPAEYSGPEGSYFGFAVDFFVPSASSRMFLLVGAPKANTTQPGIVEGGQVLKC
DWSSTRRCQPIEFDATGNRDYAKDDPLEFKSHQWFGASVRSKQDKILACAPLYHWRTE
MKQEREPVGTCFLQDGTKTVEYAPCRSQDIDADGQGFCQGGFSIDFTKADRVLLGGPGS
FYWQGQLISDQVAEIVSKYDPNVYSIKYNNQLATRTAQAIFDDSYLGYSVAVGDFNGD
GIDDFVSGVPRAARTLGMVYIYDGKNMSSLYNFTGEQMAAYFGFSVAATDINGDDYAD
VFIGAPLFMDRGSDGKLQEVGQVSVSLQRASGDFQTTKLNGFEVFARFGSAIAPLGDLD
QDGFNDIAIAAPYGGEDKKGIVYIFNGRSTGLNAVPSQILEGQWAARSMPPSFGYSMKG
ATDIDKNGYPDLIVGAFGVDRAILYRARP (SEQ ID N 0 623).
Secuencias CDR1 de Vh de C6D4 (SEQ ID NO:613); CDR2 de Vh de C6D4 (SEQ ID NO:614); CDR3 de Vh de C6D4 (SEQ ID NO:615); CDR1 de Vk de C6D4 (SEQ ID NO:616); CDR2 de Vk de C6D4 (SEQ ID NO:617); CDR3 de Vk de C6D4 (SEQ ID NO:618); p8, hélice a l (SEQ ID NO:619); p8, SDL (SEQ ID NO:620); p8, hélice a2 (SEQ ID NO:621); y aV, hoja de dominio propulsor de hélice p W3 (SEQ ID N<o>: 622).
La FIG. 8 ilustra la superposición del epítopo C6D4 con el bolsillo de unión del ligando de la integrina avp8, en relación con la asociación de la integrina con TGF-p latente.
La FIG. 9 es un gráfico del porcentaje de supervivencia de ratones inyectados con células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC). Se extirparon los tumores primarios y los animales fueron tratados con IgG2a murina C6D4 o con un control de isotipo SV5 en una dosis de 7 mg/kg una vez por semana. En este modelo, los ratones son sacrificados después de perder el 20 % del peso corporal debido a la recidiva del tumor primario o debido a metástasis.
La FIG 10 es una tabla de la eliminación del antígeno de superficie HepB (HBSag) de un modelo de ratón con infección crónica como resultado del tratamiento con C6D4.
Las FIG. 11A-B ilustran las secuencias de aminoácidos de los clones usados en la construcción del anticuerpo modificado por ingeniería genética 4F1F9, un anticuerpo usado para la detección de avp8 en tejidos humanos. FIG.
11A Secuencias - 4F1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:624), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:628), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:634), Marco 3 (SEQ ID NO:637), CDR3 (SEQ ID NO:651), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 6B9 : todas las secuencias (SEQ ID NO:656), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:635), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:652), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 6B9.1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:657), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:653), Marco 4 (SEQ ID NO:655), A1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:658), Marco 1 (SEQ ID NO:626), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:639), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), A2 : todas las secuencias (SEQ ID NO:659), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:640), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), A8 : todas las secuencias (SEQ ID NO:660), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:641), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), A11 : todas las secuencias (SEQ ID NO:661), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:630), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636),
Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), B1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:662), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:642), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), B3 : todas las secuencias (SEQ ID NO:663), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:643), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), C4=F10 : todas las secuencias (SEQ ID NO:664), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:644), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), C7=D1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:665), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:644), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), D3=F1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:666), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:645), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), D10=E5 : todas las secuencias (SEQ ID NO:667), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:646), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), G4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:668), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:647), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), C4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:669), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:650), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), D10 : todas las secuencias (SEQ ID NO:670), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:646), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1A11 : todas las secuencias (SEQ ID NO:671), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:650), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1E1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:672), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:631), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1G3 : todas las secuencias (SEQ ID NO:673), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:631), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:648), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1E10 : todas las secuencias (SEQ ID NO:674), Marco 1 (SEQ ID NO:627), CDR1 (SEQ ID NO:631), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1E9 : todas las secuencias (SEQ ID NO:675), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1H12 : todas las secuencias (SEQ ID NO:676), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:631), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:649), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), F9 : todas las secuencias (SEQ ID NO:677), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:631), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:654) y Marco 4 (SEQ ID NO:655). FIG. 11B Secuencias - 4F1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:678), Marco 1 (SEQ ID NO:692), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), 6B9 : todas las secuencias (SEQ ID NO:679), Marco 1 (SEQ ID NO:699), CDR1 (SEQ ID NO:700), Marco 2 (SEQ ID NO:701), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:702), Marco 4 (SEQ ID NO:698), 6B9.1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:680), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), A1 = A2 = C4 = C7 = DI = DIO = E5 = FI = F10 = G4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:681), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), A8 : todas las secuencias (SEQ ID NO:682), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), A11 : todas las secuencias (SEQ ID NO:683), Marco 1 (SEQ ID NO:704), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), B1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:684), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), B3 : todas las secuencias (SEQ ID NO:685), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), D10=E5 : todas las secuencias (SEQ ID NO:686), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), C4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:687), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:706), D10 : todas las secuencias (SEQ ID NO:688), Marco 1 (SEQ ID NO:699), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:706), 4F1E1 = 1F1G3 = 4F1B5 =4F1G11 = 4F1A9 = 4F1B9 = 4F1H9 = 4F1D10 = 4F1E9 = 4F1F10 = 4F1H11 = 4F1H12 : todas las secuencias (SEQ ID NO:689), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), 4FA11 : todas las secuencias (SEQ ID NO:690), Marco 1 (SEQ ID NO:705), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), F9 : todas las secuencias (SEQ ID NO:691), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697) y Marco 4 (SEQ ID NO:706).
La FIG. 12 demuestra cómo el epítopo C6D4 se superpone directamente con el bolsillo de unión del ligando de la integrina aVp8, previniendo la asociación de la integrina aVp8 a L-TGFp y por tanto la activación de L-TGFp. Promedios de clase representativos de complejos de integrina observados mediante microscopía electrónica de tinción negativa.
La FIG. 13 ilustra un modelo de cómo se genera el complejo a partir de la estructura cristalina de aVp3 (PDB ID: 3IJE), con el modelo p8 basado en p3 usando CHIMERA y MODELLER (Yanget al., J Struct Biol.sep. de 2012;179(3):269-78). El refinamiento del modelo al mapa de microscopía crioelectrónica se realiza en cuerpo rígido en COOT (Emsley P,et al., Acta Crystallographica Section D - Biological Crystallography.2010, 66:486-501), seguido de un refinamiento completo en PHENIX (Adamset al., Acta Cryst.2010; D66:213-221).
La FIG. 14 ilustra la interacción de CDR1 de Vk de C6D4 (SEQ ID NO:616) con la integrina aV (SEQ ID NO:622, posiciones 46-52 y 75-79): Modelo del complejo aVp8/C6D4 Fab. Los restos que interactúan se representan como palos. Las líneas discontinuas representan distancias entre átomos comprendidas entre 2,5 y 4,0 A que indican interacciones potenciales.
La FIG. 15 ilustra la interacción de C6D4 con la región SDL de la integrina p8: Modelo del complejo aVp8/C6D4 Fab. Los restos que interactúan se representan como palos. Las líneas discontinuas representan distancias entre átomos comprendidas entre 2,5 y 4,0 A que indican interacciones potenciales. CDR1 de Vh de C6D4 (SEQ ID NO:707), CDR3 de Vh de C6D4 (SEQ ID NO:615), p8, SDL (SEQ ID NO:620), CDR1 de Vk de C6D4 (SEQ ID NO:616), CDR2 de Vk de C6D4 (SEQ ID NO: 708) y CDR3 de Vk de C6D4 (SEQ ID NO: 618).
La FIG. 16 ilustra la interacción de CDR2 de Vk de C6D4 (SEQ ID NO:617) con la hélice a l de la integrina p8 (SEQ ID NO:619): Modelo del complejo aVp8/C6D4 Fab. Los restos que interactúan se representan como palos. Las líneas discontinuas representan distancias entre átomos comprendidas entre 2,5 y 4,0 A que indican interacciones potenciales.
La FIG. 17 ilustra la interacción de CDR1 de Vk de C6D4 (SEQ ID NO:613) con la hélice a2 de la integrina p8 (SEQ ID NO:621): Modelo del complejo aVp8/C6D4 Fab. Los restos que interactúan se representan como palos. Las líneas discontinuas representan distancias entre átomos comprendidas entre 2,5 y 4,0 A que indican interacciones potenciales.
La FIG. 18 ilustra que C6D4 bloquea el acceso de L-TGFp al bolsillo de unión del ligando de la integrina p8 y C6D4 unido a la integrina aVp8 choca directamente con la posición del bucle RGDLGRLKK de L-TGFp (SEQ iD NO:712). Se muestra la superficie del complejo aVp8/C6D4 Fab. La superficie es aVp8, mientras que la animación es C6D4. En los palitos se superponen los restos RGDLGRLKK (SEQ ID NO:712) del bucle de unión de la integrina de L-TGFp tal como se encuentra cuando se une a la integrina aVp6 (PDB 4UM9) ((4) Determinantes estructurales de la especificidad de la subunidad p de la integrina para el TGF-p latente. Dong X,et al. Nat. Struct. Mol. Biol.dic de 2014;21(12): 1091 6).
La FIG. 19 muestra que C6D4 es un potente inhibidor de la unión de avp8 secretada al péptido L-TGF-b3.
La FIG. 20 muestra que C6D4 es un potente inhibidor de la adhesión celular mediada por avp8 al péptido L-TGF-b3.
La FIG. 21 muestra la inmunodetección de la subunidad b8 de la integrina en secciones embebidas en parafina fijadas con formalina de pacientes infectados conH. Pylori(A, B) o que muestran histología normal (C, D). Las secciones se tiñeron con el clon F9 en formato IgG de conejo y se detectaron mediante amplificación de señal TSA (Perkin Elmer). El precipitado marrón indica una tinción positiva y los núcleos se contratiñen con hematoxilina. Las flechas indican ejemplos de criptas positivas con células epiteliales de criptas teñidas. Los resultados muestran que la subunidad b8 de la integrina aumenta su expresión en los estómagos de pacientes conH. Pylori.
La FIG. 22 muestra la cuantificación de la inmunodetección de la subunidad b8 de la integrina en secciones embebidas en parafina fijadas con formalina de pacientes infectados conH. Pylori,mostrando histología normal o inflamación crónica leve. Las secciones se tiñeron con el clon F9 en formato IgG de conejo y se detectaron mediante amplificación de señal TSA (Perkin Elmer). Se diseñó el siguiente sistema de puntuación para capturar la tinción criptoepitelial, 0=sin tinción, 1=solo contraste+, 2=dispersa, 3= difusa y la tinción estromal, 0= sin tinción, 1=solo contraste+, 2=dispersa, 3=difusa. Se muestra una puntuación combinada y se muestra la n. ANOVA con prueba de comparaciones múltiples de Sidak. **p<0,01, * p<0,05
La FIG. 23 muestra el ensayo de unión de las proteínas de fusión de fosfatasa alcalina (AP) avp3, avp6 y avp8 a CagL, el péptido MAP RGD derivado de la secuencia de TGFB3 DDHGRGDLGRLK (SEQ ID NO:713), Fibronectina, Vitronectina o un péptido MAP derivado de la secuencia de TGFB2 que corresponde a la secuencia que contiene RGD de TGFB1 y TGFB3. Todas las proteínas se recubren en placas ELISA a 5 ug/ml y la entrada de receptores AP se normaliza a la actividad de AP. Los resultados mostrados representan la señal por encima de los pocillos recubiertos con BSA. Los resultados muestran que avp8 (y avp6) se unen a CagL así como al péptido TGFb3, mientras que avp3 se une a FN y VN, poco a TGFB3 y nada a CagL. avp3 y avp8 no muestran unión y avp6 muestra una unión muy débil al péptido de control TGFb2. Se muestran S.E.M.
La FIG. 24 muestra el ensayo de unión de la proteína de fusión de fosfatasa alcalina (AP) avp8 a CagL en presencia de C6D4, un inhibidor alostérico, B5, o un anticuerpo no bloqueante para el mismo epítopo que B5, clon 68 que sirve como control negativo. CagL se recubre sobre placas ELISA a 5 ug/ml. Los resultados mostrados representan la señal por encima de los pocillos recubiertos con BSA. Los resultados muestran que la unión de avp8 a CagL está completamente inhibida por C6D4 y parcialmente inhibida por B5.
La FIG. 25 muestra el ensayo de adhesión de células Cho Lee que expresan de forma estable ITGAV e ITGB8 humanas a la proteína CagL recombinante en las concentraciones indicadas (donación de Eric. Sundberg, Universidad de Maryland, MD). La unión se compara con los pocillos recubiertos con un péptido presentador de antígenos múltiples que contiene el péptido RGD derivado de la secuencia TGFB3 DDHGRGDLGRLK (SEQ ID NO: 713), que corresponde a los aa 257-268 del TGF-b3 humano (NP_003230). Se permitió que 50 x 103 células se adhirieran a los pocillos durante 30 min a TA. Las células no unidas se lavaron con PBS. Los resultados se presentaron como células teñidas detectadas después de la tinción con violeta cristal (DO590). Los resultados mostrados representan una señal por encima de la unión nominal de las células Cho Lee transfectadas simuladamente a los pocillos recubiertos con péptidos CagL o TGFB3 (5 ug.ml). Los resultados muestran que avp8 media la adhesión celular a CagL así como al péptido TGFb3. Se muestran S.E.M. La significancia se determinó mediante ANOVA y la prueba de comparación múltiple de Sidak. ****=p<0,00001
La FIG. 26 muestra el ensayo de adhesión de células Cho Lee que expresan de forma estable ITGAV e ITGB8 humanas al péptido MAP r Gd de TGF-b3 (DDHGRGDLGRLK (s Eq ID NO:713)) (concentración de recubrimiento 5 ug/ml). Se preincubaron 50 x 103 células con CagL en las concentraciones indicadas de CagL frente al control de PBS durante 15 min a TA y a continuación se permitió que las células se adhirieran a los pocillos durante 30 min a TA. Las células no unidas se lavaron con PBS. Los resultados se presentaron como células teñidas detectadas después de la tinción con violeta cristal (DO590). Los resultados mostrados representan una señal por encima de la unión nominal de las células Cho Lee transfectadas simuladamente a los pocillos recubiertos con péptido TGFB3 (5 ug.ml). Los resultados muestran que avp8 media la adhesión celular a CagL dependiente de RGD. Se muestran S.E.M. N=3
La FIG. 27 muestra el ensayo de adhesión de células de ovario de hámster chino modificadas (Cho Lee) que expresan de forma estable ITGAV e ITGB8 humanas a la proteína CagL recombinante a una concentración de recubrimiento de 5 ug/ml, 50 x 103 células con los Mab en las concentraciones indicadas y se dejaron adherir a los pocillos durante 30 min a TA. B5 es un inhibidor alostérico descrito anteriormente de la unión de avp8 a TGF-B y L230 es un anticuerpo bloqueador anti-av descrito anteriormente. Las células no unidas se lavaron con PBS. Los resultados se presentan como células teñidas detectadas después de la tinción con violeta cristal (DO590). Los resultados mostrados representan el % de inhibición relativa a la unión de control definida por la unión en presencia de un anticuerpo de control de isotipo (anti-SV5) en la misma concentración. Se muestran S.E.M. La significancia se determinó mediante ANOVA y la prueba de comparación múltiple de Sidak. ****=p<0,00001, ***p <0,001, *<0,05. Los resultados muestran que C6D4 bloquea de manera más eficiente la mediación de la adhesión celular a CagL por avp8 que B5 o L230.
La FIG. 28 muestra un modelo de ratón para evaluar la metástasis pulmonar usando la línea de células tumorales LLC que no expresa las integrinas avp8 o avp8. La línea de células tumorales LLC es singénica con la cepa hospedadora C57B/6. La línea celular LLC.1 se ha pasado a través de ratones una vez y volvió a crecer a partir de metástasis pulmonar. Después de dos semanas, las células LLC.1 de tumor inyectado subcutáneamente (1x106) forman nódulos tumorales grandes (~1 cm). Los tumores se extirpan quirúrgicamente y cuando los animales pierden el 20 % de su peso corporal se les practica la eutanasia.
Las FIG. 29A y 29B muestran el efecto de C6D4 en la supervivencia de ratón usando el modelo de línea de células tumorales LLC expuesto en la FIG. 28. Las curvas de supervivencia (FIG. 29A) representan ratones sacrificados por razones de recidiva local o pérdida de peso. La FIG. 29B muestra la curva de supervivencia cuando se excluyen los animales eliminados por recidiva local. En la autopsia, todos los animales con pérdida de peso del 20 % tienen implantes metastásicos en los pulmones. En este caso, se han inyectado anticuerpos C6D4 durante hasta 90 días en animales supervivientes. Este experimento se realizó once veces, cada vez proporcionando resultados similares (datos no mostrados). Adicionalmente, el examenpost mortemno reveló ninguna respuesta inflamatoria anormal en los tejidos examinados.
Las FIG. 30A-F muestran el efecto de CD64 sobre el crecimiento del tumor y la respuesta inmunitaria del tumor usando el modelo de línea de células tumorales LLC expuesto en la FIG. 28. En este caso, los tumores primarios LLC.1 resecados en ratones que recibieron dos inyecciones de control de isotipo (B5, que solo reacciona con b8 humano y no de ratón) o C6D4 (que reacciona de forma cruzada con ratón y ser humano), se registran los pesos de los tumores primarios, se miden las dimensiones, se disgregan enzimáticamente los tumores y se aíslan y se cuentan las células inmunitarias. Se realizó citometría de flujo en las células inmunitarias infiltradas en el tumor, y dichas células se separaron de las células tumorales mediante centrifugación en gradiente de Percoll. Se muestra aquí uno de los tres experimentos cada uno de los cuales proporciona resultados similares. En cada grupo n es igual o mayor que 10.
La FIG. 31 muestra un modelo de ratón para evaluar la enfermedad metastásica usando células tumorales B16-F10. La línea de células tumorales altamente metastásicas B16-F10 es singénica con la cepa hospedadora C57B/6. Esta línea no expresa las integrinas avpp o avp8. La B16-F10 se transfectó con itgbS murino y después de la selección y clasificación expresa avp8 de superficie en niveles altos. Cuando se inyecta por vía intravenosa a través de la vena de la cola, las metástasis pulmonares visibles aparecen a los 14 días.
Las FIG. 32A-H son muestras de adenocarcinoma de pulmón teñidas con anti-b8 (FIG. 32E-H) o anti-PD-L1 (E1L3N, Cell Signaling) FIG. 32A-D. En este punto, se observó que la expresión de beta 8 se correlacionaba inversamente con la expresión de PD-L1.
La FIG. 33A muestra la distribución de muestras de adenocarcinoma de pulmón de la FIG. 32 (n=29) con tinción para PD-L1 o beta 8. La FIG. 33B muestra que en todos los casos en que se tiñó al menos un 30 % para beta 8 o PD-L1 se agruparon y se correlacionaron las proporciones de tinción.
Las FIG. 34A-C muestran la inhibición de las metástasis pulmonares B16 en comparación con una muestra de isotipo. La FIG. 34A son fotografías de pulmones representativos en vistas anterior y posterior y se contaron las metástasis pulmonares visibles y se evaluó el área de superficie pulmonar total implicada con metástasis. La FIG. 34B muestra el efecto de C6D4 en el número total de metástasis pulmonares. La línea de células tumorales altamente metastásicas B16- F10 es singénica a la cepa hospedadora C57B/6 y no expresa las integrinas otvp5 ni otvp5. Las células tumorales B16-F 10 fueron transfectadas con itgbS murino. Después de la selección en G418 y dos rondas de clasificación, se inyectó por vía intravenosa a través de la vena de la cola un grupo de células avp8 de alta expresión. Después de tres inyecciones (i.p.) de control de isotipo (SV5) o C6D4, ambos a 7 mg/kg los días 0, 7 y 14, los ratones se sacrificaron en el día 18. La FIG. 34C muestra el efecto de C6D4 medido por el porcentaje de la superficie pulmonar total afectada por el melanoma metastásico.
Las FIG. 35A-H muestran que C6D4 efectúa la polarización de los macrófagos a un fenotipo proinflamatorio. El aumento de la expresión de MHCII por parte de los macrófagos y las células dendríticas asociados a tumores es importante en las respuestas inmunitarias del hospedador a los antígenos tumorales.
Las FIG. 36A-C muestran que C6D4 aumenta la expresión de MHCII por células dendríticas asociadas a tumores. Los aumentos de MHCII por parte de las células presentadoras de antígenos aumentarán la presentación de antígenos.
Las FIG. 37A-G son diagramas de dispersión que muestran la diferenciación mediada por integrinas de los linfocitos Treg de ratón. Los linfocitos T reguladores CD4+ asociados a tumores desempeñan un papel importante en la supresión de la respuesta inmunitaria del hospedador y ayudan a los tumores a escapar a la inmunovigilancia. La diferenciación de Treg requiere TGF-beta. Se cree que el TGF-beta proporcionado por mecanismos como la activación mediada por la integrina avp8 es importante para la diferenciación y la función de los T reg. En este caso, los presentes inventores inmovilizaron los ectodominios de diversas integrinas (2 mg/ml) en placas ELISA (correcubiertas con anti-CD3) y se cultivaron en placa células CD4+ esplénicas murinas vírgenes con hIL-2 y ácido retinoico. Después de 5 días las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con anti-CD4 y FoxP3. Como un control positivo y negativo, las células se sembraron en pocillos con solo anti-CD3 (sin integrina) en presencia (+) o ausencia (-) de rTGF-b. El porcentaje de células que expresan FoxP3 se muestra en cada uno de los diagramas de dispersión (Q2).
Las FIG. 38A-D muestran representaciones estructurales de un derivado de C6D4 (denominado "RGD3" o "CD64-RGD3") que presenta reactividad cruzada con avp8 y avp8, pero no con avpl, avp3 o avp5. La FIG. 38A muestra una vista detallada de C6D4-RGD3 (oro) en complejo con avp8 derivado de mapas crioEM. El verde es la subunidad av y el azul es la subunidad p8. Se muestra en rojo el péptido LTGF-B1 derivado de estructuras de TGFB1 latente en complejo con la integrina avp8. (avp8 (SEQ ID NO:709), allbp3 (SEQ ID NO:710 (GRGDSP) y SEQ ID NO:711 (AKQRGDV). La FIG. 38B muestra alineaciones de secuencias de hTGFpl-3 y la posición de los dominios RGD en TGFpl (SEQ ID NO:714) y TGFp3 (SEQ ID NO:715). TGFp2 (SEQ ID NO:716) no tiene una secuencia RGD. La FIG 38C muestra la secuencia de tres bucles CDR1 de Vk de D4 mutantes que contienen porciones de la secuencia RGD de hTGFB3 (en rojo) desarrollada en el presente documento (vk de C6D4 (SEQ ID NO:717); C6D4- RDG1 (SEQ ID NO:718); C6D4-RDG2 (SEQ ID NO:719); y C6D4-RDG3 (SEQ ID NO:720). La FIG. 38D muestra una imagen ampliada del bucle D4 (mostrado en oro) y el choque con la posición de la secuencia RGD unida de TGFpl en complejo con la integrina avp8.
La FIG. 39 muestra experimentos de tinción de la superficie celular de C8Vh expresado con cualquiera de los mutantes RGD1, RGD2 o RGD3 (como se establece en la FIG. 38) como IgG de conejo. La unión a células Cho humanas que expresan avp8 se expresó como un porcentaje de unión de C6D4.
La FIG. 40 muestra experimentos de tinción de la superficie celular de CSVh expresado con cualquiera de Vk de D4 o mutantes RGD1, RGD2 o RGD3 como IgG de conejo. Se muestra la unión a células Cho que expresan avp8 humana o células SW480 que expresan avp6. La unión relativa se define como la tinción comparada con la tinción de células Cho o SW480 no transfectadas.
La FIG. 41 muestra experimentos de unión de C6Vh expresado con cualquiera de Vk de D4 o mutantes RGD1, RGD2 o RGD3 como IgG de conejo, a diversas integrinas av. Todas las integrinas se recubrieron en placas ELISA a 2 mg/ml, e bloquearon con BSA y se permitió que los anticuerpos se unieran. Se detectó la unión de C6D4 y C6D4-RGD3 con anti-HRP de conejo. Los resultados se muestran en relación con los pocillos de control recubiertos con anti-av (clon 8B8) donde se detectaron integrinas av con otro anticuerpo av que reconoce un epítopo no superpuesto (L230-biotina), seguido de SA-HRP.
La FIG. 42 muestra el efecto de los cationes en la unión de C6D4 y C6D4-RGD3 a diversos receptores. La unión en un tampón que contiene EDTA define la dependencia de cationes porque el EDTA se une a Ca++ y Mg++. Los tampones de cationes de magnesio contienen Ca++ 1 mM y Mg + 1 mM. En este caso, los resultados son relativos a anti-av, clon 11D12V2. Todos los anticuerpos fueron recubiertos en placas ELISA a 5 pg/ml. Los receptores avp8 o avp6 (0,5 pg/ml) se unieron durante 1 hora y a continuación se detectaron con el clon anti-av biotinilado 8B8. La pequeña cantidad de unión de avp8 a C6D4-RGD3 en el tampón EDTA (en comparación con la ausencia de unión de avp8 a C6D4-RGD3 en el tampón EDTA) sugiere que la unión a avp8 depende más del bucle de unión RGD de Vk CDR1 que la unión a avp8.
Las FIGS. 43A y 43B muestran la inhibición de la adhesión de avp8 y la activación de TGF-beta. Las células Cho 3.2.8.1 transfectadas con bS se usaron en ensayos de adhesión a pocillos recubiertos con el péptido GRGDLGRLK ramificado (SEQ ID NO:721) (10 ug/ml). Se permitió que las células Cho-bS se unieran en ensayos de adhesión (FIG.
43 A) en presencia de C6D4, RGD3 o Mab de control en diferentes concentraciones. Se permitió que las células Chob8 se adhirieran a los pocilios con células reporteras TMLC TGF-p en presencia de C6D4, RGD3 o Mab de control en diferentes concentraciones (FIG. 43B). Los valores se muestran como una proporción del control Mab (SV5). Los resultados indican que C6D4-RGD3 y C6D4 bloquean la función avp8 de manera similar.
Las FIG. 44A-B muestran ensayos de adhesión y las FIG. 44C-D muestran la activación de TGF-beta. En este caso, las células Cho3.2.8.1 se transfectaron con GARP y LTGFB1. GARP (LRRC32) es una molécula de andamiaje de la superficie celular presente en la superficie de los linfocitos Treg y une LTGF-b a la superficie celular. Los paneles superiores (FIG. 44A y 44B) muestran ensayos de adhesión de células Cho que expresan GARP/LTGFB adheridas a avp8 inmovilizado (FIG. 44<a>) o avp8 (F<i>G. 44B) realizados en presencia de anti-p8 (C6D4), 3G9 (anti-p6) o el anticuerpo biespecífico RGD3 (anti-p6 y anti-p8). En los paneles inferiores (FIG. 44C y 44D), las células indicadoras de TGF-beta TMLC, se añadieron a cada pocillo para determinar la cantidad de activación de TGF-p en respuesta a avp8 (FIG. 44C) o avp8 (FIG. 44D) realizada en presencia de anti-p8 (C6D4), 3G9 (anti-p6) o el anticuerpo biespecífico<r>GD3 (anti-p6 y anti-p8). Los resultados se informan como actividad de luciferasa relativa en pocillos tratados con anticuerpo de control de isotipo (SV5). Debajo de cada gráfico se muestra la CE50 de cada anticuerpo inhibidor.
La FIG. 45 muestra el ensayo de unión de avp8 al péptido TGFp3. Mab 3G9 es un potente inhibidor de la activación de TGF-b mediada por avp8. C6D4-RGD3 muestra competición cruzada con la unión de 3G9 sugiriendo que tienen huellas de unión superpuestas o influyen alostéricamente en la unión de cada uno. Sin embargo, estos anticuerpos tienen diferentes modos de acción ya que la unión de 3G9 a avp8 no depende de cationes mientras que la unión de C6D4-RGD3 sí depende de cationes.
La FIG. 46 ilustra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera para los clones usados en la construcción del anticuerpo humanizado compuesto C6D4. Secuencias VH - C6D4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:722), Marco 1 (SEQ ID NO:732), CDR1 (SEQ ID NO:733), Marco 2 (SEQ ID NO:734), CDR2 (SEQ ID NO:735), Marco 3 (SEQ ID NO:736), CDR3 (SEQ ID NO:737), Marco 4 (SEQ ID NO:738); VI de HuC6D4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:723), Marco 1 (SEQ ID NO:739), CDR1 (SEQ ID NO:733), Marco 2 (SEQ ID NO:740), CDR2 (SEQ ID NO:735), Marco 3 (SEQ ID NO:741), CDR3 (SEQ ID NO:737), Marco 4 (SEQ ID NO:738); Mutclon A3 : todas las secuencias (SEQ ID NO:724), Marco 1 (SEQ ID NO:739), CDR1 (SEQ ID NO:733), Marco 2 (SEQ ID NO:740), CDR2 (SEQ ID NO:735), Marco 3 (SEQ ID NO:741), CDR3 (SEQ ID NO:737), Marco 4 (SEQ ID NO:738); Mutclon B7 : todas las secuencias (SEQ ID NO:725), Marco 1 (SEQ ID NO:742), CDR1 (SEQ ID NO:733), Marco 2 (SEQ ID NO:740), CDR2 (SEQ ID NO:735), Marco 3 (SEQ ID NO:743), CDR3 (SEQ ID NO:744), Marco 4 (SEQ ID NO:738); Mutclon E5 : todas las secuencias (SEQ ID NO:726), Marco 1 (SEQ ID NO:739), CDR1 (SEQ ID NO:733), Marco 2 (SEQ ID NO:740), CDR2 (SEQ ID NO:735), Marco 3 (SEQ ID NO:741), CDR3 (SEQ ID NO:744) y Marco 4 (SEQ ID NO:738). Secuencias VK - C6D4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:727), Marco 1 (SEQ ID NO:745), CDR1 (SEQ ID NO:746), Marco 2 (SEQ ID NO:747), CDR2 (SEQ ID NO:748), Marco 3 (SEQ ID NO:749), CDR3 (SEQ ID NO:750), Marco 4 (SEQ ID NO:751); VI de HuC6D4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:728), Marco 1 (SEQ ID NO:752), CDR1 (SEQ ID NO:746), Marco 2 (SEQ ID NO:747), CDR2 (SEQ ID NO:748), Marco 3 (SEQ ID NO:753), CDR3 (SEQ ID NO:750), Marco 4 (SEQ ID NO:754); Mutclon A3 : todas las secuencias (SEQ ID NO:729), Marco 1 (SEQ ID NO:755), CDR1 (SEQ ID NO:756), Marco 2 (SEQ ID NO:747), CDR2 (SEQ ID NO:748), Marco 3 (SEQ ID NO:753), CDR3 (SEQ ID NO:750), Marco 4 (SEQ ID NO:754); Mutclon B7 : todas las secuencias (SEQ ID NO:730), Marco 1 (SEQ ID NO:757), CDR1 (SEQ ID NO:746), Marco 2 (SEQ ID NO:747), CDR2 (SEQ ID NO:748), Marco 3 (SEQ ID NO:758), CDR3 (SEQ ID NO:750), Marco 4 (SEQ ID NO:754); Mutclon E5 : todas las secuencias (SEQ ID NO:731), Marco 1 (SEQ ID NO:752), CDR1 (SEQ ID NO:756), Marco 2 (SEQ ID NO:747), CDR2 (SEQ ID NO:748), Marco 3 (SEQ ID NO:753), CDR3 (SEQ ID NO: 750) y Marco 4 (SEQ ID NO: 754).
La FIG. 47 muestra el ensayo de unión de C6D4 humanizado o RDG3 a avp8 recombinante. C6D4 o RGD3 humanizado (los Marcos y CHI son humanos; la bisagra y CH2-3 son de ratón) se inmovilizaron en placas ELISA en las concentraciones indicadas. Como un control negativo, algunos pocillos se recubrieron con anti-SV5 en las mismas concentraciones. Los sitios de unión no específicos se bloquearon con BSA. Se añadió el ectodominio avp8 recombinante (0,5 ug/ml) a cada pocillo y, después de la unión y el lavado en tampón de unión (Ca y Mg 1 mM), el avp8 unido se detectó con anti-av biotinilado (8b8) y se detectó con SA-HRP. Los resultados se muestran como unión específica (menos el control SV5).
La FIG. 48 muestra la superposición del modelo de animación C6D4/avp8 con el mapa de alambre de C6D4/avp8 (FIG. 48A y 48C) en comparación con una superposición del mismo modelo de animación C6D4/avp8 con el mapa de alambre de C6D4-RGD3/avp8 (FIG. 48B y D). La comparación de los dos mapas muestra una orientación diferente del bucle CDR1 Vk de C6D4-RGD3 hacia el sitio de unión del ligando de la subunidad betaS.
Las FIG. 49A-C muestran mapas CryoEM de complejos C6D4 y C6D4-RGD avp8 que tienen un posicionamiento similar. En este caso, se compara el Fab-avp8 de C6D4 (FIG. 49A) con el mapa RGD3-avp8 (FiG. 49B), o en superposición (FIG. 49C), basándose en mapas de densidad derivados de crioEM. Se usó el Fab anti-av 11D12V2 para aumentar la masa molecular del complejo y ayudar en la orientación de las partículas.
La FIG. 50 ilustra las secuencias de aminoácidos de cadena pesada para los clones usados en la construcción de los anticuerpos humanizados compuestos C6D4 y C6D4-RGD3. Se proporcionan secuencias consenso para la versión humanizada de C6D4 y C6D4-RGD3. Secuencias VH - HuC6D4Vl: todas (SEQ ID NO:395), Marco 1 (SEQ ID NO:396), CDR1 (SEQ ID NO:397), Marco 2 (SEQ ID NO:398), CDR2 (SEQ ID NO:399), Marco 3 (SEQ ID NO:400), CDR3 (SEQ ID N©:401) y Marco 4 (SEQ ID NO:402); HuC6D4A3: todas (SEQ ID NO:403), Marco 1 (SEQ ID NO:404), CDR1 (SEQ ID NO:405), Marco 2 (SEQ ID NO:406), CDR2 (SEQ ID NO:407), Marco 3 (SEQ ID NO:408), CDR3 (SEQ ID NO:409) y Marco 4 (SEQ ID NO:410); HuC6D4B7: todas (SEQ ID NO:411), Marco 1 (SEQ ID NO:412), CDR1 (SEQ ID NO:413), Marco 2 (SEQ ID NO:414), CDR2 (SEQ ID NO:415), Marco 3 (SEQ ID NO:416), CDR3 (SEQ ID NO:417) y Marco 4 (SEQ ID NO:418); HuC6D4E5: todas (SEQ ID NO:419), Marco 1 (SEQ ID NO:420), CDR1 (SEQ ID NO:421), Marco 2 (SEQ ID NO:422), CDR2 (SEQ ID NO:423), Marco 3 (SEQ ID NO:424), CDR3 (SEQ ID NO:425) y Marco 4 (SEQ ID NO:426); C6D4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:722), Marco 1 (SEQ ID NO:732), CDR1 (SEQ ID NO:733), Marco 2 (SEQ ID NO:734), CDR2 (SEQ ID NO:735), Marco 3 (SEQ ID NO:736), CDR3 (SEQ ID NO:737) y Marco 4 (SEQ ID NO:738); HuC6D4: todas (SEQ ID NO:427), Marco 1 (SEQ ID NO:428), CDR1 (SEQ ID NO:429), Marco 2 (SEQ ID NO:430), CDR2 (SEQ ID NO:431), Marco 3 (SEQ ID NO:432), CDR3 (SEQ ID NO:433) y Marco 4 (SEQ ID NO:434); C6D4-RGD3: todas (SEQ ID NO:435), Marco 1 (SEQ ID NO:436), CDR1 (SEQ ID NO:437), Marco 2 (SEQ ID NO:438), CDR2 (SEQ ID NO:439), Marco 3 (SEQ ID NO:440), CDR3 (SEQ ID NO:441) y Marco 4 (SEQ ID NO:442); HuC6D4-RGD3: todas (SEQ ID NO:443), Marco 1 (SEQ ID NO:444), CDR1 (SEQ ID NO:445), Marco 2 (SEQ ID NO:446), CDR2 (SEQ ID NO:447), Marco 3 (SEQ ID NO:448), CDR3 (SEQ ID NO:449) y Marco 4 (SEQ ID NO:450); y Consenso VH: Marco 1 (SEQ ID NO:558), CDR1 (SEQ ID NO:563), Marco 2 (SEQ ID NO:559), CDR2 (SEQ ID NO:563), Marco 3 (SEQ ID NO:560), CDR3 (SEQ ID NO: 564) y Marco 4 (SEQ ID NO: 561).
La FIG. 51 ilustra las secuencias de aminoácidos de cadena ligera para los clones usados en la construcción de los anticuerpos humanizados compuestos C6D4 y C6D4-RGD3. Se proporcionan secuencias consenso para la versión humanizada de C6D4 y C6D4-RGD3. Secuencias VL - HuC6D4Vl: todas (SEQ ID NO:451), Marco 1 (SEQ ID NO:452), CDR1 (SEQ ID NO:453), Marco 2 (SEQ ID NO:454), CDR2 (SEQ ID NO:455), Marco 3 (SEQ ID NO:456), CDR3 (SEQ ID NO:457) y Marco 4 (SEQ ID NO:458); HuC6D4A3: todas (SEQ ID NO:459), Marco 1 (SEQ ID NO:460), CDR1 (SEQ ID NO:461), Marco 2 (SEQ ID NO:462), CDR2 (SEQ ID NO:463), Marco 3 (SEQ ID NO:464), CDR3 (SEQ ID NO:465) y Marco 4 (SEQ ID NO:466); HuC6D4B7: todas (SEQ ID NO:467), Marco 1 (SEQ ID NO:468), CDR1 (SEQ ID NO:469), Marco 2 (SEQ ID NO:470), CDR2 (SEQ ID NO:471), Marco 3 (SEQ ID NO:472), CDR3 (SEQ ID NO:473) y Marco 4 (SEQ ID NO:474); HuC6D4E5: todas (SEQ ID NO:475), Marco 1 (SEQ ID NO:476), CDR1 (SEQ ID NO:478), Marco 2 (SEQ ID NO:479), CDR2 (SEQ ID NO:480), Marco 3 (SEQ ID NO:481), CDR3 (SEQ ID NO:482) y Marco 4 (SEQ ID NO:483); C6D4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:727), Marco 1 (SEQ ID NO:745), CDR1 (SEQ ID NO:746), Marco 2 (SEQ ID NO:747), CDR2 (SEQ ID NO:748), Marco 3 (SEQ ID NO:749), CDR3 (SEQ ID NO:750) y Marco 4 (SEQ ID NO:751); HuC6D4: todas las secuencias (SEQ ID NO:484), Marco 1 (SEQ ID NO:485), CDR1 (SEQ ID NO:486), Marco 2 (SEQ ID NO:487), CDR2 (SEQ ID NO:488), Marco 3 (SEQ ID NO:489), CDR3 (SEQ ID NO:490) y Marco 4 (SEQ ID NO:491); C6D4-RGD3: todas (SEQ ID NO:492), Marco 1 (SEQ ID NO:493), CDR1 (SEQ ID NO:494), Marco 2 (SEQ ID NO:495), CDR2 (SEQ ID NO:496), Marco 3 (SEQ ID NO:497), CDR3 (SEQ ID NO:498) y Marco 4 (SEQ ID NO:499); HuC6D4-RGD3: todas (SEQ ID NO:500), Marco 1 (SEQ ID NO:501), CDR1 (SEQ ID NO:502), Marco 2 (SEQ ID NO:503), CDR2 (SEQ ID NO:504), Marco 3 (SEQ ID NO:505), CDR3 (SEQ ID NO:506) y Marco 4 (SEQ ID NO:507); y Consenso VL: Marco 1 (SEQ ID NO:565), CDR1 (SEQ ID NO:569), Marco 2 (SEQ ID NO:566), CDR2 (SEQ ID NO:570), Marco 3 (SEQ ID NO:567), CDR3 (SEQ ID NO:571) y Marco 4 (SEQ ID NO:568). Bucle RDG3 (SEQ ID NO:721).
La FIG. 52 ilustra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada para los clones usados en la construcción del anticuerpo compuesto F9. Secuencias: - 4F1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:624), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:628), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:634), Marco 3 (SEQ ID NO:637), CDR3 (SEQ ID NO:651), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 6B9 : todas las secuencias (SEQ ID NO:656), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:635), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:652), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 6B9.1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:657), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:653), Marco 4 (SEQ ID NO:655), A1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:658), Marco 1 (SEQ ID NO:626), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:639), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), A2 : todas las secuencias (SEQ ID NO:659), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:640), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), A8 : todas las secuencias (SEQ ID NO:660), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:641), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), A11 : todas las secuencias (SEQ ID NO:661), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:630), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), B1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:662), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:642), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), B3 : todas las secuencias (SEQ ID NO:663), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:643), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), C4=F10 : todas las secuencias (SEQ ID NO:664), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:644), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), C7=D1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:665), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:644), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), D3=F1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:666), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:645), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), D10=E5 : todas las secuencias (SEQ ID NO:667), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:646), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), E8 : todas las secuencias (SEQ ID NO:667), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:646), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), F2 : todas las secuencias (SEQ ID NO:667), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:646), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), G4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:668), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:647), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), C4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:669), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:650), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), D10 : todas las secuencias (SEQ ID NO:670), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:633), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:646), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1A11 : todas las secuencias (SEQ ID NO:671), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:650), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1E1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:672), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:631), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1G3 : todas las secuencias (SEQ ID NO:673), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:631), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:648), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1E10 : todas las secuencias (SEQ ID NO:674), Marco 1 (SEQ ID NO:627), CDR1 (SEQ ID NO:631), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1E9 : todas las secuencias (SEQ ID NO:675), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:629), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), 4F1H12 : todas las secuencias (SEQ ID NO:676), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:631), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:649), CDR3 (SEQ ID NO:654), Marco 4 (SEQ ID NO:655), F9 : todas las secuencias (SEQ ID NO:677), Marco 1 (SEQ ID NO:625), CDR1 (SEQ ID NO:631), Marco 2 (SEQ ID NO:632), CDR2 (SEQ ID NO:636), Marco 3 (SEQ ID NO:638), CDR3 (SEQ ID NO:654) y Marco 4 (SEQ ID NO:655).
La FIG. 53 ilustra las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera para los clones usados en la construcción del anticuerpo compuesto F9. Secuencias VL - 4F1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:678), Marco 1 (SEQ ID NO:692), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), 6B9 : todas las secuencias (SEQ ID NO:679), Marco 1 (SEQ ID NO:699), CDR1 (SEQ ID NO:700), Marco 2 (SEQ ID NO:701), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:702), Marco 4 (SEQ ID NO:698), 6B9.1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:680), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), A1: todas las secuencias (SEQ ID NO:681), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), A2: todas las secuencias (SEQ ID NO:681), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), A8 : todas las secuencias (SEQ ID NO:682), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), A11 : todas las secuencias (SEQ ID NO:683), Marco 1 (SEQ ID NO:704), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), B1 : todas las secuencias (SEQ ID NO:684), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), B3 : todas las secuencias (SEQ ID NO:685), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), C4=F10: todas las secuencias (SEQ ID NO:681), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), C7=D1: todas las secuencias (SEQ ID NO:681), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), D3=F1: todas las secuencias (SEQ ID NO:681), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), D10=E5 : todas las secuencias (SEQ ID NO:686), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), E8: todas las secuencias (SEQ ID NO:686), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:755), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), F2: todas las secuencias (SEQ ID NO:681), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), G4: todas las secuencias (SEQ ID NO:681), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), C4 : todas las secuencias (SEQ ID NO:687), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:706), D10 : todas las secuencias (SEQ ID NO:688), Marco 1 (SEQ ID NO:699), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:706), 4F1E1 = 1F1G3 = 4F1B5 = 4F1G11 = 4F1A9 = 4F1B9 = 4F1H9 = 4F1D10 = 4F1E9 = 4F1F10 = 4F1H11 = 4F1H12 : todas las secuencias (SEQ ID NO:689), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), 4FA11 : todas las secuencias (SEQ ID NO:690), Marco 1 (SEQ ID NO:705), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697), Marco 4 (SEQ ID NO:698), F9 : todas las secuencias (SEQ ID NO:691), Marco 1 (SEQ ID NO:703), CDR1 (SEQ ID NO:693), Marco 2 (SEQ ID NO:694), CDR2 (SEQ ID NO:695), Marco 3 (SEQ ID NO:696), CDR3 (SEQ ID NO:697) y Marco 4 (SEQ ID NO:706).
Las FIG. 54A-54D son gráficos que muestran el porcentaje de células con tinción positiva para diversos marcadores de superficie celular. A los ratones se les inyectaron células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) y SV5 (control de isotipo) o C6D4 a una dosis de 7 mg/kg una vez por semana.
Descripción detallada
I. Introducción
Los inventores han descubierto determinados anticuerpos que se unen a la integrina humana avp8 y provocan una reducción al menos parcial en la función de unión del ligando. Basándose en ese descubrimiento, han desarrollado modelos estructurales detallados para ayudar en el descubrimiento de anticuerpos que se unan a la integrina avp8 en epítopos particulares que bloquean de manera óptima el sitio de unión del ligando de la integrina avp8. Algunos de los anticuerpos identificados se unen tanto al dominio de cabeza de la subunidad de la integrina av como al dominio de cabeza de la subunidad de la integrina p8 para cubrir eficazmente el sitio de unión del ligando de la integrina avp8 sin unirse al sitio de unión del ligando en sí (es decir, actuando como un ligando mimético).
Además, los inventores han descubierto que bloquear la unión del ligando a la integrina avp8 es eficaz para inhibir el cáncer (incluyendo pero no limitado a cáncer metastásico) y también es eficaz en el tratamiento de infecciones víricas. Sin desear limitar el alcance de la invención descrita, se cree que la integrina avp8 desempeña un papel en el bloqueo de la función y/o el desarrollo de los linfocitos T reguladores (Tregs) y, por lo tanto, que los anticuerpos descritos en el presente documento estimulan la inmunidad a las células tumorales y los virus. En consecuencia, los anticuerpos y los métodos de su uso, entre otros aspectos, se proporcionan en el presente documento.
Los inventores también han introducido una secuencia "RGDL" (SEQ ID NO:756) en un CDR del anticuerpo anti-avp8 y han demostrado que dicha introducción hace que el anticuerpo sea capaz de unirse a avp8 mientras mantiene sustancialmente la misma actividad de unión para avp8.
II. Anticuerpos
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos que se unen a integrina otvpS humana (y en algunos aspectos otros mamíferos, por ejemplo, tales como de ratón, de cobaya, de cerdo y de conejo). En algunos aspectos, los anticuerpos están aislados, son quiméricos (que comprenden al menos alguna secuencia de aminoácidos heteróloga), están marcados o unidos covalentemente a otra molécula tal como un agente citotóxico o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a la integrina humana avp5 y bloquean la unión de un ligando a la integrina humana avp5. Los ligandos ilustrativos pueden incluir, por ejemplo, TGFp y LAP. En algunos aspectos, los anticuerpos se unen de manera dependiente de cationes o tienen una unión mejorada en presencia de cationes.
En algunos aspectos, el epítopo unido por los anticuerpos descritos en el presente documento sobre la integrina humana av(35 comprende aminoácidos en (1) el bucle determinante de especificidad (SDL) de la proteína integrina (35<(por ejemplo,>TVSPYISIHPF.RIHNQCSDYNLDCMPPH<(SEQ ID NO:620)), (2) en las hélices a1 (por ejemplo,>SASMIINNIEKENSVGNDLSRKMAFFS<(SEQ ID NO:619)) o a2 (por ejemplo,>NITEFEKAVHR<(SEQ ID NO:621)) de la proteína integrina (38, (3) la cabeza de la proteína av (por ejemplo,>DADGQ<(SEQ ID NO:757);>
SF\ W<Q (SEQ id NO:758);>FDDSY<(SEQ ID NO:759)) u otras porciones de>KQDKILACAPLYHYVRTEMKQEREPVGTCFLQDGTKTVEYAPCRSQDIDADGQGFCQGG
FSIDFTKADRVLLGGPGSFYWQGQLISDQVAEIVSKYDPNVYSIKYNNQLATRTAQAIFD
(SEQ ID NO:760) o (4) una combinación de los mismos (por ejemplo, 1 y 2, 2 y 3, 1 y 3 o 1, 2 y 3) tal como aparecen en la proteína integrina humana nativa avp8, incluyendo por ejemplo todas las porciones enumeradas de la integrina humana av(38. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a uno o más o todos los aminoácidos en el SDL
seleccionados de: D175 (por ejemplo, en ^LD C M (SEQ ID NO:761)), L174 (por ejemplo, en (SEQ ID
<NO:762)) o S170, D171 o Y172 (por ejemplo, en>SDYNL<(SEQ ID NO:763)), o combinaciones de los mismos, en>donde la numeración se basa en la proteína integrina (38 humana (SEQ ID NO:394). Véase, por ejemplo, la FIG. 7. En
<algunos aspectos, el anticuerpo se une al aminoácido H118 (por ejemplo, en>SMHNN)<(SEQ ID NO:764) en la hélice>a l de la proteína integrina p8), en donde la numeración se basa en la proteína integrina p8 humana (SEQ ID NO:394).
En algunos aspectos, el anticuerpo se une al aminoácido H200 o R201 (por ejemplo, en A V H R Q j en |a hélice a2 de la proteína integrina p8, o combinaciones de los mismos, en donde la numeración se basa en la proteína integrina p8 humana (SEQ ID NO:394). En algunos aspectos, el anticuerpo se une a uno o más o todos los aminoácidos (subrayados) en la cabeza de la proteína av seleccionada de: D148, A149, D150, G151 o Y178 (por ejemplo, en SFYWQ (SEQ ID NO:758)) o combinaciones de los mismos, en donde la numeración se basa en la proteína integrina av humana (SEQ ID NO:393). En algunos aspectos, el anticuerpo se une a cada uno de los aminoácidos indicados anteriormente (subrayados) descritos en este párrafo. Como puede verse a partir de las FIG. 12-18, la interacción con los dominios descritos anteriormente de la integrina avp8 es beneficiosa.
Como se ha indicado anteriormente, en algunos aspectos, los anticuerpos se unen específicamente a la integrina humana avp8 y bloquean la unión de un ligando a la integrina humana avp8. La capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de la integrina avp8 a un ligando puede determinarse mediante la inhibición de la unión de una forma soluble de avp8 o una forma de longitud completa de avp8 expresada en la superficie de las células a TGF-beta latente inmovilizado o una porción del mismo que contiene la secuencia RGDL. Véase, por ejemplo, Ozawa, A,et al. J Biol Chem.291(22):11551-65 (2016).
En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden una o más CDR (o todas las CDR de cadena pesada de un clon, o todas las CDR de cadena ligera de un clon) como sigue:
Cadenas
pesadasNombre del clon CDR1 Vh (SEQ ID: ) CDR2 Vh (SEQ ID: CDR3 Vh (SEQ ID:
Cadenas ligeras Nombre del clon CDR1 Vk CDR2 Vk CDR3 Vk
En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden una o más CDR (o todas las CDR de cadena pesada de un clon, o todas las CDR de cadena ligera de un clon) como sigue:
Cadenas
pesadasNombre del clon CDR1 Vh (SEQ ID: CDR2 Vh (SEQ ID:) CDR3 Vh (SEQ ID
Cadenas
ligerasNombre del clon CDR1 Vk (SEQ ID: CDR2 Vk (SEQ ID: CDR3 Vk (SEQ ID:
En algunos aspectos, un anticuerpo descrito en el presente documento comprende las CDR de cadena pesada y ligera como se emparejan en la siguiente tabla:
Combinaciones (H+L Nombre del clon CDR1 (SEQ ID:) CDR2 (SEQ ID:) CDR3 (SEQ ID:)
(continuación)
Combinaciones (H+L Nombre del clon CDR1 (SEQ ID:) CDR2 (SEQ ID:) CDR3 (SEQ ID:)
En algunos aspectos, un anticuerpo descrito en el presente documento comprende las CDR de cadena pesada y ligera como se emparejan en la siguiente tabla:
Combinaciones
(H+L)Nombre del clon CDR1 (SEQ ID: ) CDR2 (SEQ ID: ) CDR3 (SEQ ID
(continuación)
Nombre del clon CDR1 (SEQ ID: ) CDR2 (SEQ ID: ) CDR3 (SEQ ID
(continuación)
Nombre del clon CDR1 (SEQ ID: ) CDR2 (SEQ ID: ) CDR3 (SEQ ID
En algunos aspectos, un anticuerpo como se describe en el presente documento comprende una, dos, tres o las cuatro secuencias marco que se proporcionan aquí:
Marcos Fr 1 (SEQ ID NO:) Fr2 (SEQ ID NO:)
Marcos Fr3 (SEQ ID NO:) Fr4 (SEQ ID NO:)
En algunos aspectos, un anticuerpo como se describe en el presente documento comprende una, dos, tres o las cuatro secuencias marco que se proporcionan aquí:
Marcos Fr 1 (SEQ ID NO:) Fr2 (SEQ ID NO:)
Marcos Fr3 (SEQ ID NO:)
En algunos aspectos, un anticuerpo como se describe en el presente documento comprende una, dos, tres o las cuatro secuencias marco que se proporcionan aquí:
Marcos Fr 1 (SEQ ID NO:) Fr2 (SEQ ID NO:)
Marcos Fr3 (SEQ ID NO:)
En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden las secuencias de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 como se proporciona en el presente documento, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo,
SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:7;
SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15;
SEQ ID SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:23;
SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:31
SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37 y SEQ ID NO:39
SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45 y SEQ ID NO:47
SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53 y SEQ ID NO:55
SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61 y SEQ ID NO:63
SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69 y SEQ ID NO:71
SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77 y SEQ ID NO:79
SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85 y SEQ ID NO:87
SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93 y SEQ ID NO:95
SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 111;
SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 119;
SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 127;
SEQ ID NO:291, SEQ ID NO:293 y SEQ ID NO:295;
SEQ ID NO:313, SEQ ID NO:314 y SEQ ID NO:315;
SEQ ID NO:316, SEQ ID NO:317 y SEQ ID NO:318;
SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:320 y SEQ ID NO:321;
SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 y SEQ ID NO:324;
SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326 y SEQ ID NO:327;
SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:329 y SEQ ID NO:330;
SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:332 y SEQ ID NO:333;
SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:368 y SEQ ID NO:369;
SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:365 y SEQ ID NO:366;
SEQ ID NO:370, SEQ ID NO:371 y SEQ ID NO:372;
SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:380 y SEQ ID NO:381;
SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:399 y SEQ ID NO:401;
SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:407 y SEQ ID NO:409;
SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:415 y SEQ ID NO:417;
SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:423 y SEQ ID NO:425; o
SEQ ID NO:429, SEQ ID NO:431 y SEQ ID NO:433.
En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden las secuencias de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 descritas anteriormente pero contienen 1,2 o 3 sustituciones conservativas de aminoácidos en una, dos o más secuencias CDR en comparación con aquellas enumeradas anteriormente.
En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden las secuencias de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 como se proporciona en el presente documento, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo,
SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO 133 y SEQ ID NO 135
SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO 143
SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO 149 y SEQ ID NO 151
SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO 157 y SEQ ID NO 159
SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO 165 y SEQ ID NO 167
SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO 173 y SEQ ID NO
SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO 183
SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO 189 y SEQ ID NO 191
SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO 197 y SEQ ID NO 199
SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:205 y SEQ ID NO:207
SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:213 y SEQ ID NO:215
SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:221 y SEQ ID NO:223
SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:229 y SEQ ID NO:231
SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:245 y SEQ ID NO:247
SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:253 y SEQ ID NO:255
SEQ ID NO:259, SEQ ID NO:261 y SEQ ID NO:263
SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:269 y SEQ ID NO:271
SEQ ID NO:275, SEQ ID NO:277 y SEQ ID NO:279
SEQ ID NO:283, SEQ ID NO:285 y SEQ ID NO:287
SEQ ID NO:291, SEQ ID NO:293 y SEQ ID NO:295
SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:309 y SEQ ID NO:311
SEQ ID NO:334, SEQ ID NO:335 y SEQ ID NO:336
SEQ ID NO:337, SEQ ID NO:338 y SEQ ID NO:339;
SEQ ID NO:340, SEQ ID NO:341 y SEQ ID NO:342;
SEQ ID NO:343, SEQ ID NO:344 y SEQ ID NO:345;
SEQ ID NO:346, SEQ ID NO:347 y SEQ ID NO:348;
SEQ ID NO:349, SEQ ID NO:350 y SEQ ID NO:351;
SEQ ID NO:352, SEQ ID NO:353 y SEQ ID NO:354;
SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:356 y SEQ ID NO:357;
SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:359 y SEQ ID NO:360;
SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:362 y SEQ ID NO:363;
SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375;
SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:377 y SEQ ID NO:378;
SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:383 y SEQ ID NO:384;
SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:455 y SEQ ID NO:457;
SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:463 y SEQ ID NO:465;
SEQ ID NO:469, SEQ ID NO:471 y SEQ ID NO:473;
SEQ ID NO:478, SEQ ID NO:480 y SEQ ID NO:482; o
SEQ ID NO:486, SEQ ID NO:488 y SEQ ID NO:490.
En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden las secuencias de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 descritas anteriormente pero contienen 1,2 o 3 sustituciones conservativas de aminoácidos en una, dos o más secuencias CDR en comparación con aquellas enumeradas anteriormente. En algunos aspectos, la secuencia CDR1 de la cadena ligera tiene una longitud de 12-18 aminoácidos, por ejemplo, 14-17, por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 aminoácidos de longitud.
En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden las secuencias de cadena pesada y igera CDR1, CDR2 y CDR3 como se proporciona en el presente documento, incluyendo, por ejemplo,
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:313, SEQ ID NO:314 y SEQ ID NO:315; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:334, SEQ ID NO:335 y SEQ ID NO:336; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:320 y SEQ ID NO:321; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:340, SEQ ID NO:341 y SEQ ID NO:342; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 317 y SEQ ID NO: 318; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:337, SEQ ID NO:338 y SEQ ID NO:339; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 y SEQ ID NO:324; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:343, SEQ ID NO:344 y SEQ ID NO:345; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 y SEQ ID NO:324; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:346, SEQ ID NO:347 y SEQ ID NO:348; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323 y SEQ ID NO:324; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:349, SEQ ID NO:350 y SEQ ID NO:351; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326 y SEQ ID NO:327; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:352, SEQ ID NO:353 y SEQ ID NO:354; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326 y SEQ ID NO:327; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:356 y SEQ ID NO:357; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:326 y SEQ ID NO:327; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:359 y SEQ ID NO:360; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:368 y SEQ ID NO:369; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:365 y SEQ ID NO:366; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:368 y SEQ ID NO:369; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:377 y SEQ ID NO:378; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:370, SEQ ID NO:371 y SEQ ID NO:372; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:374 y SEQ ID NO:375; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:332 y SEQ ID NO:333; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:383 y SEQ ID NO:384; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:380 y SEQ ID NO:381; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:362 y SEQ ID NO:363; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:332 y SEQ ID NO:333; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:362 y SEQ ID NO:363; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:508, SEQ ID NO:509 y SEQ ID NO:510; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:529, SEQ ID NO:530 y SEQ ID NO:531; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:511, SEQ ID NO:512 y SEQ ID NO:513; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:533 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:514, SEQ ID NO:515 y SEQ ID NO:516; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:535, SEQ ID NO:536 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:518 y SEQ ID NO:519; y as CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:538, SEQ ID NO:539 y SEQ ID NO:540; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:520, SEQ ID NO:521 y SEQ ID NO:522; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:541, SEQ ID NO:542 y SEQ ID NO:543; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:544, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:526, SEQ ID NO:527 y SEQ ID NO:528; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:547, SEQ ID NO:548 y SEQ ID NO:549.
En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden las secuencias de cadena pesada y ligera CDR1, CDR2 y CDR3 descritas anteriormente pero contienen 1, 2 o 3 sustituciones conservativas de aminoácidos en una, dos o más secuencias CDR en comparación con aquellas enumeradas anteriormente.
Cualquier anticuerpo descrito en el presente documento puede comprender una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia RGD, por ejemplo, como se proporciona en la siguiente tabla:
En algunos aspectos, cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento puede comprender como CDR1 una de las CDR seleccionadas de SEQ ID NO:572, SEQ ID NO:573, SEQ ID NO:574, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:576, SEQ ID NO:577, SEQ ID NO:578, SEQ ID NO:579, SEQ ID NO:580, SEQ ID NO:581, SEQ ID NO:582, SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:584, SEQ ID NO:585, SEQ ID NO:586, SEQ ID NO:587, SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:589 y SEQ ID NO:590.
En algunos aspectos, el anticuerpo puede comprender secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera como se proporciona a continuación, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo,
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO: 525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:572, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO: 525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:573, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO: 525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:574, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO: 525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO: 525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:576, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO: 525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:577, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:578, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:579, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:580, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:581, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:582, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:584, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:585, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:586, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:587, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:589, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:590, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:546; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:572, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:573, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:574, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:576, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:577, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:578, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:579, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:580, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:581, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:582, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:584, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:585, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:586, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:587, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:589, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:590, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:534; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:572, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de a cadena ligera SEQ ID NO:573, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:574, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:576, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:577, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:578, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:579, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:580, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:581, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:582, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:584, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:585, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:586, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:587, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:589, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537; o
las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:523, SEQ ID NO:524 y SEQ ID NO:525; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:590, SEQ ID NO:545 y SEQ ID NO:537.
En algunos aspectos, los anticuerpos comprenden las secuencias de cadena pesada y igera CDR1, CDR2 y CDR3 descritas anteriormente pero contienen 1, 2 o 3 sustituciones conservativas de aminoácidos en una, dos o más secuencias CDR en comparación con aquellas enumeradas anteriormente.
En algunos aspectos, cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento puede comprender una de las regiones variables de cadena pesada seleccionadas de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 121 o SEQ ID NO:297 o SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO:419, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:435 o SEQ ID NO:443.
En algunos aspectos, cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento puede comprender una de las regiones variables de cadena ligera seleccionadas de SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:225, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:257, SEQ ID NO:265, SEQ ID NO:273, SEQ ID NO:281, SEQ ID NO:289, SEQ ID NO:305 o SEQ ID NO:451, SEQ ID NO:459, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:475, SEQ ID NO:484, SEQ ID NO:492 o SEQ ID NO:500.
En algunos aspectos, los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden comprender una o más o todas las regiones variables de cadena ligera (CDR o regiones marco) seleccionadas de SEQ ID NO:565, SEQ ID NO:566, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO:568, SEQ ID NO:569, SEQ ID NO:570 o SEQ ID NO:571.
En algunos aspectos, cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden comprender una o más o todas las regiones variables de cadena ligera (CDR o regiones marco) seleccionadas de SEQ ID NO:558, SEQ ID NO:559, SEQ ID NO:560, SEQ ID NO:561, SEQ ID NO:562, SEQ ID NO:563 o SEQ ID NO:564.
Las regiones variables de cadena pesada pueden emparejarse con regiones de cadena ligera según se desee, incluyendo o no limitado a regiones variables que comprenden las CDR emparejadas como se establece anteriormente.
Además, como se ha indicado anteriormente, los inventores han descubierto que una secuencia RGDL (SEQ ID NO:756) puede insertarse en una secuencia CDR1 de cadena ligera en un anticuerpo de unión a avp8 para obtener un anticuerpo que tiene seis CDR en total y que se une tanto a avp8 como a avp6. Los anticuerpos bloquean al menos parcialmente la función de unión del ligando. Véase, por ejemplo, las FIG. 38A-D. Por lo tanto, en algunos aspectos, se proporcionan anticuerpos que se unen a avp8 y avp6 y comprenden una secuencia RGDL (SEQ ID NO:756) en la secuencia CDR1 de la cadena ligera. Por ejemplo, en algunos aspectos la CDR1 de cadena ligera tiene entre 20 22 aminoácidos (por ejemplo, 21 aminoácidos) y opcionalmente comprende KSSQSLLGRGDLGRLKK (SEQ ID NO:765) o una secuencia que contiene 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos conservativas.
Adicionalmente, los inventores han descubierto que una secuencia RGDL (SEQ ID NO:756) puede insertarse en una secuencia CDR1 de cadena ligera en un anticuerpo de unión a avp8 para obtener un anticuerpo que tiene seis CDR y que se une a avp8, avp6 y avp3 (es decir, es tri-específico). Véase, el Ejemplo 12.
En algunos aspectos, cualquier anticuerpo descrito en el presente documento puede comprender una secuencia CDR1 de cadena ligera seleccionada de, pero no limitada a, SEQ ID NO:572, SEQ ID NO:573, SEQ ID NO:574, SEQ ID NO:575, SEQ ID NO:576, SEQ ID NO:577, SEQ ID NO:578, SEQ ID NO:579, SEQ ID NO:580, SEQ ID NO:581, SEQ ID NO:582, SEQ ID NO:583, SEQ ID NO:584, SEQ ID NO:585, SEQ ID NO:586, SEQ ID NO:587, SEQ ID NO:588, SEQ ID NO:589 y SEQ ID NO:590. En algunos aspectos, cualquiera de las secuencias CDR1 de cadena ligera expuestas en este párrafo puede combinarse con cualquier CDR2 de cadena ligera, CDR3 de cadena ligera, CDR1 de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada y CDR3 de cadena pesada, expuestas en el presente documento.
En algunos aspectos, los anticuerpos que comprenden las secuencias CDR1 de cadena ligera descritas en el párrafo anterior pueden contener 1,2 o 3 sustituciones de aminoácidos conservativas en la secuencia CDR1 en comparación con las enumeradas anteriormente (es decir, SEQ ID NO:572-590).
En algunos aspectos, los anticuerpos pueden comprender las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se proporciona en el presente documento, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:439 y SEQ ID NO:441; o SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:447 y SEQ ID NO:449.
En algunos aspectos, los anticuerpos pueden comprender las secuencias de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 descritas anteriormente pero contienen 1, 2 o 3 sustituciones conservativas de aminoácidos en una, dos o más secuencias CDR en comparación con aquellas enumeradas anteriormente.
En algunos aspectos, los anticuerpos pueden comprender las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se proporciona en el presente documento, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:496 y SEQ ID NO:498; o SEQ ID NO:502, SEQ ID NO:504 y SEQ ID NO:506.
En algunos aspectos, los anticuerpos pueden comprender las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera descritas anteriormente pero contienen 1, 2 o 3 sustituciones conservativas de aminoácidos en una, dos o más secuencias CDR en comparación con aquellas enumeradas anteriormente.
Las regiones variables de cadena pesada pueden emparejarse con regiones de cadena ligera según se desee, incluyendo o no limitado a regiones variables que comprenden las CDR emparejadas como se establece anteriormente.
Para la preparación y el uso de anticuerpos adecuados como se describe en el presente documento, por ejemplo, anticuerpos recombinantes, monoclonales o policlonales, pueden usarse muchas técnicas conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein,Nature256:495-497 (1975); Kozboret al., Immunology Today4: 72 (1983); Coleetal.,pág. 77-96 enMonoclonal Antibodies and Cáncer Therapy,Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan,Current Protocols in Immunology(1991); Harlow y Lane,Antibodies, A Laboratory Manual(1988); y Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(2a ed. 1986)). Los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de interés pueden clonarse a partir de una célula, por ejemplo, los genes que codifican un anticuerpo monoclonal pueden clonarse a partir de un hibridoma y usarse para producir un anticuerpo monoclonal recombinante. Las bibliotecas de genes que codifican las cadenas ligera y pesada de anticuerpos monoclonales también pueden producirse a partir de hibridomas o células plasmáticas. Las combinaciones aleatorias de productos génicos de cadena pesada y ligera generan una gran combinación de anticuerpos con diferentes especificidades antigénicas (véase, por ejemplo, Kuby,Immunology(3a ed. 1997)). Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios o anticuerpos recombinantes (Patente de EE.UU. 4.946.778, Patente de EE.UU. N.° 4.816.567) pueden adaptarse para producir anticuerpos contra polipéptidos. También, los ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, pueden usarse para expresar anticuerpos humanizados o humanos (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, Markset al., Bio/Technology10:779-783 (1992); Lonberget al., Nature368:856-859 (1994); Morrison,Nature368:812-13 (1994); Fishwildet al., Nature Biotechnology14:845-51 (1996); Neuberger,Nature Biotechnology14:826 (1996); y Lonberg & Huszar,Intern. Rev. Immunol.13:65-93 (1995)). Como alternativa, puede usarse tecnología de visualización de fagos para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados (véanse, por ejemplo, McCaffertyet al., Nature348:552-554 (1990); Markset al., Biotechnology10:779-783 (1992)). Los anticuerpos también pueden convertirse en biespecíficos, es decir, capaces de reconocer dos antígenos diferentes (véanse, por ejemplo, el documento WO 93/08829, Trauneckeret al., EMBO J.10:3655-3659 (1991); y Sureshet al.,Methods in Enzymology121:210 (1986)). Los anticuerpos también pueden ser heteroconjugados, por ejemplo, dos anticuerpos unidos covalentemente o inmunotoxinas (véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 4.676.980, el documento WO 91/00360; el documento WO 92/200373; y el documento EP 03089).
Los anticuerpos pueden producirse usando cualquier número de sistemas de expresión, incluyendo sistemas de expresión procariotas y eucariotas. En algunos aspectos, el sistema de expresión es una expresión de células de mamíferos, tales como un hibridoma o un sistema de expresión de células CHO. Muchos de estos sistemas están ampliamente disponibles a través de proveedores comerciales. En aspectos en que un anticuerpo comprende tanto una región Vh como una Vl, las regiones Vh y Vl pueden expresarse usando un único vector, por ejemplo, en una unidad de expresión dicistrónica, o bajo el control de diferentes promotores. En otros aspectos, la región Vh y Vl pueden expresarse usando vectores separados. Una región Vh o Vl como se describe en el presente documento puede comprender opcionalmente una metionina en el extremo N.
Un anticuerpo como se describe en el presente documento también puede producirse en diversos formatos, incluyendo como un Fab, un Fab', un F(ab')2, un scFv o un dAB. Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse mediante una diversidad de métodos, incluyendo, digestión de un anticuerpo intacto con una enzima, tales como pepsina (para generar fragmentos (Fab')<2>) o papaína (para generar fragmentos Fab); o síntesisde novo.Los fragmentos de anticuerpos también pueden sintetizarse usando la metodología del ADN recombinante. En algunos aspectos, un anticuerpo anti-p8 comprende fragmentos F(ab')<2>que se unen específicamente a p8. Un anticuerpo de la invención también puede incluir una región constante humana. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology (Paul ed., 4a ed.
1999); Bird,et al., Science242:423 (1988); y Huston,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879 (1988).
Los métodos para humanizar o primatizar anticuerpos no humanos también son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácido introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se denominan con frecuencia restos importados, que se toman normalmente de un dominio variable donante. La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo los métodos de Winter y colaboradores (véanse, por ejemplo, Joneset al., Nature321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature332:323-327 (1988); Verhoeyenet al., Science239:1534-1536 (1988) y Presta,Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992)), sustituyendo las CDR o las secuencias de CDR de roedores por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de EE.UU. N.° 4.816.567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los cuales algunos restos de la CDR y posiblemente algunos restos de la FR están sustituidos por restos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede conjugarse con otra molécula, por ejemplo, polietilenglicol (PEGilación) o seroalbúmina, para proporcionar una semivida prolongadain vivo.Se proporcionan ejemplos de PEGilación de fragmentos de anticuerpos enet al. Platelets15:409, 2004 (para abciximab); Pedleyet al., Br. J. Cancer70:1126, 1994 (para un anticuerpo anti-CEA); Chapmanet al., Nature Biotech.17:780, 1999; y Humphreys,et al., Protein Eng. Des.20: 227,2007). El anticuerpo o fragmento de anticuerpo también puede marcarse o conjugarse con un agente terapéutico como se describe a continuación.
La especificidad de la unión del anticuerpo puede definirse en términos de las constantes de disociación comparativas (Kd) del anticuerpo para la diana (por ejemplo, p8) en comparación con la constante de disociación con respecto al anticuerpo y otros materiales en el entorno o moléculas no relacionadas en general. Normalmente, la Kd del anticuerpo con respecto al material no relacionado será al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces o mayor que la Kd con respecto a la diana.
La afinidad deseada por un anticuerpo, por ejemplo, alta (pM a bajo nM), media (bajo nM a 100 nM) o baja (aproximadamente 100 nM o más), puede diferir dependiendo de si se usa como una opción diagnóstica o terapéutica. Por ejemplo, un anticuerpo con afinidad media puede tener más éxito en la localización del tejido deseado en comparación con uno con alta afinidad. Por lo tanto, los anticuerpos que tienen diferentes afinidades pueden usarse para opciones diagnósticas y terapéuticas.
Una fracción de direccionamiento normalmente se unirá con un Kd de menos de aproximadamente 1000 nM, por ejemplo, menos de 250, 100, 50, 20 o menos nM. En algunos aspectos, la Kd del agente de afinidad es menor que 15, 10, 5 o 1 nM. En algunos aspectos, la Kd es de 1-100 nM, 0,1-50 nM, 0,1-10 nM o 1-20 nM. El valor de la constante de disociación (Kd) puede determinarse mediante métodos bien conocidos y puede calcularse incluso para mezclas complejas mediante métodos como los divulgados, por ejemplo, en Caceciet al.,Byte (1984) 9:340-362.
La afinidad de un anticuerpo o de cualquier agente de direccionamiento, para una diana puede determinarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se revisó en Ernstet al.Determination of Equilibrium Dissociation Constants, Therapeutic Monoclonal Antibodies (Wiley & Sons ed. 2009).
Pueden usarse ELISA cuantitativo y métodos de afinidad basados en matrices similares. ELISA (inmunoensayo enzimático) es un método basado en anticuerpos. En algunos casos, un anticuerpo específico para la diana de interés se fija a un sustrato y se pone en contacto con una muestra sospechosa de contener la diana. A continuación se lava la superficie para eliminar las sustancias no unidas. La unión a la diana puede detectarse de diversas maneras, por ejemplo, usando una segunda etapa con un anticuerpo marcado, marcaje directo de la diana o marcaje del anticuerpo primario con una etiqueta que sea detectable tras la unión del antígeno. En algunos casos, el antígeno se fija al sustrato (por ejemplo, usando un sustrato con alta afinidad por las proteínas o una interacción estreptavidina-biotina) y se detecta usando un anticuerpo marcado (u otra fracción de direccionamiento). Se han desarrollado varias permutaciones de los métodos ELISA originales y se conocen en la técnica (véase Lequin (2005)Clin. Chem.
51:241518 para una revisión).
La Kd, Kon y Koff también pueden determinarse usando resonancia plasmónica de superficie (SPR), por ejemplo, medido mediante un sistema Biacore T100 o mediante ensayos de exclusión cinética (por ejemplo, KinExA®). Las técnicas de SPR se revisan, por ejemplo, en Hahnfeldet al.Determination of Kinetic Data Using SPR Biosensors, Molecular Diagnosis of Infectious Diseases (2004). En un experimento típico de SPR, un interactuante (diana o agente de direccionamiento) se inmoviliza en un portaobjetos de vidrio activo a SPR, recubierto de oro en una célula de flujo y se introduce una muestra que contiene el otro interactuante para que fluya a través de la superficie. Cuando se proyecta una luz de una frecuencia determinada sobre la superficie, los cambios en la reflectividad óptica del oro indican la unión y la cinética de la unión. Los ensayos de exclusión cinética son el método preferido para determinar la afinidad salvo que se indique lo contrario. Esta técnica se describe en, por ejemplo, Darlinget al., Assay and Drug Development TechnologiesVol. 2, número 6647-657 (2004).
La afinidad de unión también puede determinarse anclando un interactuante biotinilado a un chip sensor de estreptavidina (SA). El otro interactuante a continuación se pone en contacto con el chip y se detecta, por ejemplo, como se describe en Abdessamadet al. (2002) Nuc. Acids Res.30:e45.
También se proporcionan polinucleótidos que codifican los anticuerpos descritos en el presente documento, o fragmentos de unión de los mismos que comprenden al menos CDR de cadena pesada o cadena ligera o ambas, por ejemplo, polinucleótidos, casetes de expresión (por ejemplo, un promotor unido a una secuencia codificante) o vectores de expresión que codifican regiones variables de cadena pesada o ligera o segmentos que comprenden las regiones determinantes de complementariedad como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, la secuencia de polinucleótidos está optimizada para la expresión, por ejemplo, optimizada para la expresión en mamíferos u optimizada para la expresión en un tipo de célula particular.
III. Tratamientos
Los anticuerpos anti-avp8 descritos en el presente documento (incluyendo fragmentos de unión a avp5 de los mismos, anticuerpos marcados, inmunoconjugados, composiciones farmacéuticas, etc.), así como los anticuerpos que se unen tanto a avp8 como a avp5 como se describe en el presente documento o fragmentos de unión de los mismos pueden usarse para detectar, tratar, mejorar o prevenir enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y asma, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad autoinmunitaria inflamatoria cerebral, esclerosis múltiple, una enfermedad desmielinizante (por ejemplo, mielitis transversa, enfermedad de Devic, síndrome de Guillain-Barré), neuroinflamación, enfermedad renal o glioma, artritis, trastornos fibróticos, tales como fibrosis de las vías respiratorias, fibrosis pulmonar idiopática, neumonía intersticial no específica, fibrosis pulmonar postinfecciosa, daño alveolar difuso, fibrosis pulmonar asociada a enfermedad vascular del colágeno, fibrosis pulmonar inducida por fármacos, silicosis, fibrosis pulmonar relacionada con el amianto, bronquiolitis respiratoria, bronquiolitis respiratoria, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis intersticial descamativa, neumonía organizada criptogénica, neumonía por hipersensibilidad crónica, fibrosis pulmonar o hepática relacionada con fármacos, fibrosis renal y fibrosis hepática (por ejemplo, inducida por el consumo de alcohol y drogas, esteatohepatitis, infección vírica (por ejemplo, hepatitis B o C), coleostasis, etc. y cáncer, incluyendo pero no limitado a adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma de mama y crecimiento y metástasis del cáncer. En consecuencia, los anticuerpos y las composiciones farmacéuticas descritos en el presente documento pueden administrarse a un ser humano que padece o se sospecha que padece una de las enfermedades enumeradas anteriormente en una dosis adecuada para mejorar o tratar una de las enfermedades o al menos un síntoma de las mismas.
Sin desear limitar el alcance de la invención, en algunos aspectos se cree que los anticuerpos descritos en el presente documento funcionan en parte desencadenando un aumento en la expresión de MHCII en las células presentadoras de antígenos. Véase, por ejemplo, Fig. 36A-F.
Por otro lado, los anticuerpos anti-avp8 descritos en el presente documento (incluyendo fragmentos de unión a avp8 de los mismos, anticuerpos marcados, inmunoconjugados, composiciones farmacéuticas, etc.) pueden usarse para tratar, mejorar o prevenir infecciones víricas (por ejemplo, estimulando una respuesta inmunitaria). Otros anticuerpos que se unen específicamente a avp8 y que bloquean la unión de uno o más ligandos avp8, por ejemplo, tal como se describe en WO2011/103490 o W020l5/026004 también puede usarse para tratar, mejorar o prevenir infecciones víricas. Las infecciones víricas ilustrativas incluyen pero no se limitan a infecciones por hepatitis A, B (VHB) y C (VHC), virus del herpes simple (por ejemplo, HSVI, HSVII), VIH y gripe, todas de las cuales están potenciadas por la supresión inmunitaria mediada por Treg (Keynan, Y,et al., Clin Infect Dis.1 de abril de 2008;46(7): 1046-52.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los presentes anticuerpos anti-avp8 o moléculas de unión a antígeno, así como anticuerpos que se unen tanto a avp8 como a avp6 como se describe en el presente documento o fragmentos de unión de los mismos, cualquiera de los cuales puede formularse junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener además otros agentes terapéuticos que sean adecuados para tratar o prevenir un trastorno determinado. Los vehículos farmacéuticos pueden mejorar o estabilizar la composición o facilitar la preparación de la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles.
Una composición farmacéutica como se describe en el presente documento puede administrarse mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. La vía y/o el modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. Se prefiere que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, o administrada proximalmente al sitio de la diana. El vehículo farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, intranasal, inhalatoria, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y de otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Los anticuerpos, solos o junto con otros componentes adecuados, pueden convertirse en formulaciones de aerosol (es decir, pueden "nebulizarse") para administrarse mediante inhalación. Las formulaciones de aerosol pueden colocarse en propulsores aceptables a presión, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.
En algunos aspectos, la composición es estéril y fluida. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de recubrimientos tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro sódico en la composición. Puede lograrse la absorción de larga duración de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse de acuerdo con métodos bien conocidos y practicados rutinariamente en la técnica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan, en parte, por la composición particular que se administre, así como por el método particular usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia diversidad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los métodos aplicables para formular los anticuerpos y determinar la dosificación y el control estricto adecuados pueden encontrarse, por ejemplo, enRemington: The Science and Practice of Pharmacy,21a Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippincott Williams & Wilkins (2005); y enMartindale: The Complete Drug Reference,Sweetman, 2005, Londres: Pharmaceutical Press. y en Martindale,Martindale: The Extra Pharmacopoeia,31a Edición., 1996, Amer Pharmaceutical Assn y Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferentemente en condiciones GMP. Normalmente, se emplea una dosis terapéuticamente eficaz o dosis eficaz del anticuerpo anti-avp8 en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los anticuerpos avp8 se formulan en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). En la determinación de una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz, puede administrarse una dosis baja y a continuación aumentarla gradualmente hasta lograr la respuesta deseada con efectos secundarios no deseados mínimos o nulos. Por ejemplo, puede administrarse una sola inyección en embolada, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario.
Los niveles de dosificaciones reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse de tal forma que se obtiene una cantidad del principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado depende de una diversidad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas o el éster, la sal o la amida de las mismas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto en particular que se esté empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general y antecedentes médicos previos del paciente que están siendo tratado y factores similares.
En algunos aspectos, las composiciones farmacológicas comprenden una mezcla del anticuerpo anti-avp8 o la molécula de unión a antígeno (por ejemplo, que bloquea la unión del ligando o bloquea la activación por unión del ligando) y un segundo agente farmacológico. Sin desear limitar la invención, se observa que los inventores han descubierto que la linfopoyetina estromal tímica (TSLP) es un inductor del aclaramiento vírico en un modelo de ratón de VHB agudo y crónico y, por lo tanto, es útil combinar TSLP con un anticuerpo como se describe en el presente documento para tratamientos antivíricos. Por otro lado, los inventores han descubierto que los agonistas de OX40 son eficaces para estimular una respuesta inmunitaria al VHB en combinación con un anticuerpo como se describe en el presente documento.
Como alternativa a la mezcla del anticuerpo anti-avp8 y el segundo agente farmacológico en una composición farmacológica, el anticuerpo anti-avp8 y el segundo agente farmacológico pueden administrarse por separado al ser humano que lo necesite dentro de un marco de tiempo (por ejemplo, en 3, 2 o 1 día o días o en 24, 13, 6 o 3 horas entre sí).
IV Composiciones diagnósticas y aplicaciones
La integrina avp8 se expresa en fibroblastos, células estrelladas, condrocitos, macrófagos activados y subconjuntos de linfocitos T y B. La integrina avp8 aumenta su expresión en fibroblastos en pacientes con EPOC y fibrosis pulmonar, y puede usarse como marcador sustituto de una mayor masa de células fibroblásticas. Por lo tanto los anticuerpos descritos en el presente documento pueden tener una amplia aplicación en estrategias de bioformación de imágenes para detectar procesos fibroinflamatorios. Los anticuerpos terapéuticos y diagnósticos descritos actualmente pueden aplicarse a: enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, artritis, un trastorno fibroinflamatorio hepático, lesión hepática inducida por alcohol, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), hepatitis vírica y cirrosis biliar primaria (CBP), rechazo del injerto después del trasplante de hígado, hepatitis autoinmunitaria, un trastorno autoinmunitario, lupus eritematoso, esclerodermia, dermatomiositis, penfigoide ampolloso, pénfigo vulgar, un trastorno fibrótico pulmonar, una enfermedad autoinmunitaria inflamatoria del cerebro, esclerosis múltiple, una enfermedad desmielinizante, neuroinflamación, nefropatía, glomerulonefritis, carcinoma hepatocelular (HCC), adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, glioma, melanoma, carcinoma de próstata, ovárico, uterino y de mama. Los inventores han descubierto que la expresión de p8 y PD-L1 se correlacionan inversamente. Por lo tanto, los anticuerpos anti-avp8 descritos en el presente documento pueden usarse como un marcador para la expresión de PD-L1 y, opcionalmente, para seleccionar individuos con más probabilidades de beneficiarse del tratamiento anti-avp8.
Los anticuerpos anti-avp8 descritos en el presente documento (incluyendo fragmentos de unión a avp8 de los mismos, variantes maduradas por afinidad o scFv) pueden usarse para el diagnóstico, ya seain vivooin vitro(por ejemplo, usando una muestra biológica obtenida de un individuo). Además de los anticuerpos descritos anteriormente, los anticuerpos que tienen los siguientes CDR pueden usarse para el diagnóstico y el pronóstico: las CDR de cadena pesada SEQ ID NO:299, SEQ ID NO:301 y SEQ ID NO:303; y las CDR de la cadena ligera SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:309 y SEQ ID NO:311. En algunos aspectos, los anticuerpos tienen una región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO:297 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:305. Como alternativa, puede usarse cualquier anticuerpo que tenga las CDR de la cadena pesada o una región variable de la cadena pesada como se establece en la FIG. 53 y las CDR de la cadena ligera o una región variable de la cadena ligera de una secuencia correspondiente como se establece en la FIG. 54. Los anticuerpos son particularmente útiles para detectar avp8 en muestras que han sido fijadas, por ejemplo, en muestras fijadas con formalina, incluyendo, por ejemplo, muestras biológicas (por ejemplo, de tejido o de células) fijadas con formalina embebidas en parafina (FFPE).
Cuando se usa para detección o diagnóstico, el anticuerpo generalmente está conjugado o asociado de otro modo con un marcador detectable. La asociación puede ser directa, por ejemplo, un enlace covalente, o indirecta, por ejemplo, usando un agente de unión secundario, quelante o enlazador.
Un anticuerpo marcado puede proporcionarse a un individuo para determinar la aplicabilidad de una terapia prevista. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo marcado para detectar la densidad de integrina p8 dentro de un área enferma. En el caso de las terapias destinadas a atacar la actividad de TGFp o avp8 (para reducir la actividad de TGFp o avp8), la densidad de p8 suele ser alta en relación con el tejido no enfermo. Un anticuerpo marcado también puede indicar que el área enferma es accesible para la terapia. Por lo tanto, los pacientes pueden seleccionarse para la terapia basándose en los resultados de la formación de imágenes. La caracterización anatómica, tal como la determinación de los límites precisos de un cáncer, puede lograrse usando técnicas de formación de imágenes convencionales (por ejemplo, exploraciones por TC, exploración MRI/PET, etc.). Dichos métodosin vivométodos pueden llevarse a cabo usando cualquiera de los anticuerpos actualmente divulgados.
Cualquiera de los anticuerpos descritos actualmente también puede usarse para métodos de diagnóstico o monitorizaciónin vitro,por ejemplo, usando células o tejido de una muestra del paciente. En algunos aspectos, se usa F9 marcado (o un fragmento de unión p8 o una variante madurada por afinidad), ya que puede unir tanto células fijadas como no fijadas.
En algunos aspectos, el anticuerpo de diagnóstico es un fragmento variable monocatenario (scFv). Los anticuerpos intactos (por ejemplo, IgG) pueden usarse para radioinmunoterapia o administración dirigida de agentes terapéuticos porque exhiben una alta captación y retención. En algunos casos, la persistencia en la circulación de mAb intactos puede resultar en un nivel de fondo alto (Olafsenet al.(2012)Tumour Biol.33:669-77; Caietal. (2007) JNucIMed.
48:304-10). Los ScFv, normalmente con una masa molecular de ~ 25 kD, se excretan rápidamente por los riñones, pero son monovalentes y pueden tener menor afinidad. Los problemas de monovalencia pueden superarse con modificación por ingeniería genética avanzada de anticuerpos (como se muestra en el presente documento), donde las afinidades pueden mejorarse al intervalo de bajo nM a pM. Estos anticuerpos tienen semividas lo suficientemente cortas como para ser útiles como agentes de formación de imágenes y tienen características de unión adecuadas para la focalización tisular (Cortez-Retamozoet al.(2004)Cáncer Res.64:2853-7). Como se muestra en el presente documento, los presentes inventores han creado un anticuerpo scFV de muy alta afinidad derivado de 4F1, 6B9, denominado F9, que pueden convertirse en plataformas scFV humanizadas. Estos anticuerpos mejorados no bloquean la función y, por lo tanto, pueden usarse en combinación con un agente terapéutico que se dirige a p8.
Un agente de diagnóstico que comprende un anticuerpo descrito en el presente documento puede incluir cualquier agente de diagnóstico conocido en la técnica, como se proporciona, por ejemplo, en las siguientes referencias: Armstronget al., Diagnostic Imaging,5a Ed., Blackwell Publishing (2004); Torchilin, V. P., Ed.,Targeted Delivery of Imaging Agents,CRC Press (1995); Vallabhajosula, S.,Molecular Imaging: Radiopharmaceuticals for PET and SPECT,Springer (2009). Las expresiones "agente detectable", "resto detectable", "marcador", "agente de formación de imágenes", y expresiones similares se usan en el presente documento como sinónimos. Un agente de diagnóstico puede detectarse de diversas maneras, incluyendo como un agente que proporciona y/o mejora una señal detectable. Las señales detectables incluyen, pero no se limitan a, señales emisoras de rayos gamma, radioactivas, ecogénicas, ópticas, fluorescentes, de absorción, magnéticas o tomográficas. Las técnicas para formación de imágenes del agente diagnóstico pueden incluir, pero no se limitan a, tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), formación de imágenes mediante resonancia magnética (IRM), formación de imágenes ópticas, tomografía de emisión de positrones (TEP), tomografía computarizada (TC), radiografía, formación de imágenes de rayos gamma, y similares. La PET es particularmente sensible y cuantitativa y, por lo tanto, valiosa para caracterizar los procesos fibróticosin vivo(Olafsenet al.(2012)Tumour Biol.33:66977; Caiet al.(2007)J NuclMed.48:304-10). Esto es útil más allá de un diagnóstico complementario y sería útil en general para diagnosticar, estadificar y seguir clínicamente a los pacientes fibróticos durante cualquier régimen de tratamiento.
Puede incorporarse un radioisótopo a los agentes de diagnóstico descritos en el presente documento y puede incluir radionúclidos que emiten rayos gamma, positrones, partículas beta y alfa y rayos X. Los radionúclidos adecuados incluyen pero no se limitan a 225Ac,72As, 211At, 11B, 128Ba, 212Bi, 75Br, 77Br, 14C, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3|_| 166|_|o 123<1>124<1>125| 130| 131<1>111|n 177Lu 13N 15O 32P 33P 212Pb 1°3Pd 186Re 188Re 47Sc 153Sm 89Sr 99mTc 88Y e 90Y. En determinados aspectos, los agentes radiactivos pueden incluir 111In-DTPA, 99mTc(CO)3-DTPA, 99mTc(CO)3-ENPy2, 62/64/67Cu-TETA, 99mTc(CO)3-IDA y 99mTc(CO)3triaminas (cíclicas o lineales). En otros aspectos, los agentes pueden incluir DOTA y sus diversos análogos con 111In, 177Lu, 153Sm, 88/90Y, 62/64/67Cu o 67/68Ga. En algunos aspectos, una nanopartícula puede marcarse mediante la incorporación de lípidos unidos a quelatos, tales como DTPA-lípido, como se proporciona en las siguientes referencias: Phillipset al., Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology,1(1): 69-83 (2008); Torchilin, V.P. & Weissig, V., Eds.Liposomes 2aEd.Oxford Univ. Press (2003); Elbayoumi, T.A. & Torchilin, V.P.,Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging33:1196-1205 (2006); Mougin-Degraef, M.et al., Int 'IJ. Pharmaceutics344:110-117 (2007).
En algunos aspectos, un agente de diagnóstico puede incluir quelantes que se unen, por ejemplo, a iones metálicos que se usarán en una diversidad de técnicas de diagnóstico de formación de imágenes. Los quelantes ilustrativos incluyen pero no se limitan a ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido [4-(1,4,8,11-tetraazaciclotetradec-1-il) metil] benzoico (CPTA), Ácido ciclohexanodiaminotetraacético (CDTA), ácido etilenbis(oxietilennitrilo)tetraacético (EGTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), ácido cítrico, ácido hidroxietilendiaminotriacético (HEDTA), ácido iminodiacético (IDA), ácido trietilentetraaminohexaacético (TTHA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetra(metilenfosfónico) (DOTP), ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacético (TETA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), N1,N1-bis(piridin-2-ilmetil)etano-1,2-diamina (ENPy2) y derivados de los mismos.
En algunos aspectos, el agente de diagnóstico puede estar asociado a un ligando de unión secundario o a una enzima (una etiqueta enzimática) que generará un producto coloreado tras entrar en contacto con un sustrato cromogénico. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen ureasa, fosfatasa alcalina, hidrógeno peroxidasa (de rábano picante) y glucosa oxidasa. Los ligandos de unión secundarios incluyen, por ejemplo, compuestos de biotina y avidina o estreptavidina como se conoce en la técnica.
En algunos aspectos, los agentes de diagnóstico pueden incluir agentes ópticos tales como agentes fluorescentes, agentes fosforescentes, agentes quimioluminiscentes y similares. Numerosos agentes (por ejemplo, tintes, sondas, marcadores o indicadores) se conocen en la técnica y pueden usarse en la presente invención. (Véanse, por ejemplo, Invitrogen, The Handbook—A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Décima edición (2005)). Los agentes fluorescentes pueden incluir una diversidad de pequeñas moléculas orgánicas y/o inorgánicas o una diversidad de proteínas fluorescentes y derivados de las mismas. Por ejemplo, los agentes fluorescentes pueden incluir pero no se limitan a cianinas, ftalocianinas, porfirinas, indocianinas, rodaminas, fenoxazinas, fenilxantenos, fenotiazinas, fenoselanazinas, fluoresceínas, benzoporfirinas, escuaraínas, dipirrolo pirimidonas, tetracenos, quinolinas, piracinas, corrinas, croconios, acridonas, fenantridinas, rodaminas, acridinas, antraquinonas, análogos de calcogenopirilio, clorinas, naftalocianinas, tintes de metina, colorantes de indolenio, compuestos azo, azúlenos, azaazulenos, colorantes de trifenilmetano, indoles, benzoindoles, indocarbocianinas, benzoindocarbocianinas y derivados de BODIPY™.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.
Ejemplo 1. Construcción del anticuerpo compuesto C6D4
Los ratones de inactivación ITGB-8 se inmunizaron con proteína integrina humana alfa V beta 8 recombinante (avp8). Se generaron aproximadamente 5000 hibridomas y se analizaron para determinar su capacidad de unirse a avp8 en un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA). Los resultados se confirmaron mediante tinción celular y el bloqueo de la función se determinó con el uso de un bioensayo del factor de crecimiento transformante beta (TGF-p). Se analizaron anticuerpos bloqueantes contra una forma recombinante de avp8 modificada por ingeniería genética para carecer del bucle determinante de especificidad (SDL) del dominio de la cabeza p8. A continuación se seleccionaron los anticuerpos que no se unen a esta avp8 modificada por ingeniería genética.
A continuación se aislaron los genes variables (V) de ocho hibridomas, se secuenciaron y se descubrió que comprendían siete genes Vh y once Vk que eran únicos pero relacionados. La FIG. 1 y la FIG. 2 proporcionan información de secuencia para los productos de estos genes Vh y Vk. La información de secuencia usa el esquema de numeración de Kabat. Cada gen V se amplificó en condiciones mutagénicas y se construyó una biblioteca de fragmentos variables monocatenarios (scFV) mezclando el ADNc amplificado y usando superposición de corte y empalme. La biblioteca sirvió como plantilla de amplificación usando cebadores diseñados para complementar los vectores dobles Vh y Vl que expresan IgG de conejo. Se identificaron once genes Vh distintos y dieciséis genes Vk distintos después de secuenciar >100 clones aleatorios y se transfectaron en 165 combinaciones diferentes en células 293. Los ocho pares que produjeron los mejores aglutinantes se determinaron mediante tinción celular y análisis FACS, y midiendo la afinidad de unión por las células CHO que expresan avp8. Los ocho pares comprendían cada uno un dominio Vh seleccionado de r Sd LVH-1, RSDLVH-3 y Rs DlVH-16; y un dominio Vk seleccionado de RSDLVK-1, RSDLVK-6, RSDLVK-10 y RSDLVK-13; cuyas secuencias se muestran en la FIG. 1 y FIG. 2.
A continuación estos ocho pares Vh/Vk de IgG de conejo se usaron para crear una nueva biblioteca de visualización de levadura scFV mutagénica que se insertó en un vector de biblioteca de expresión de levadura. Se identificaron dos proteínas de unión de alta afinidad de esta etapa de selección y maduración de afinidad y se designaron clon 29 y clon 44. A continuación se crearon bibliotecas mutagénicas de mutación aleatoria a partir de los genes de los clones 29 y 44, y a partir de estas bibliotecas se seleccionaron y determinaron los clones de unión de mayor afinidad C6 y D4 (FIG.
1 y FIG. 2). Se identificaron mutaciones en las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de C6 Vh y D4 Vk, y las dos cadenas se combinaron para crear el anticuerpo compuesto C6D4 (FIG. 1 y FIG. 2).
Ejemplo 2. Caracterización de la afinidad de unión de C6D4
Se usó un ensayo de exclusión cinética (KINEXA ®) para medir la afinidad de unión de C6D4. La afinidad como una IgG2a murina se midió como 832 pM. Como IgG recombinante, se descubrió que C6D4 provocaba un bloqueo sustancialmente completo de la activación de TGF-p mediada por avp8. Este resultado implica un bloqueo mejor que con B5, un inhibidor alostérico de la activación de TGF-p mediada por avp8. (Minagawa, et al,Sci Trans Med.18 de junio de 2014;6(241):241 ra79)
También se demostró que C6D4 bloquea la adhesión de las células al TGF-p latente inmovilizado. Se sintetizó un péptido con la secuencia DDHGRG<d>L<g>RLK (SEQ ID NO:713), que corresponde al aa 257268 del TGF-p3 humano (NP 003230) en un núcleo de 8 lisinas (péptido presentador de antígenos múltiples, BioSyn) y se usó a 1 ug/ml para recubrir una placa ELISA de 96 pocillos. Una forma secretada truncada de avp8 que se fusionó en el marco a la fosfatasa alcalina (Gline SE,et al. J Biol Chem.24 de diciembre de 2004; 279(52):54567-72) se añadió con Mab en las concentraciones indicadas. Los resultados (FIG. 19) muestran la superioridad de C6D4 sobre B5 y la mejora de C6D4 en comparación con el Clon 1302. La tabla muestra los valores de CI50 en pg/ml.
Además, se sintetizó un péptido con la secuencia DDHGRGDLGRLK (SEQ ID NO:713), que corresponde al aa 257 268 del TGF-p3 humano (NP 003230) en un núcleo de 8 lisinas (péptido presentador de antígenos múltiples, BioSyn) y se usó a 0,51 ug/ml para recubrir una placa ELISA de 96 pocillos. Se permitió que las células CHO lec transfectadas de forma estable con avp8 se unieran a los pocillos recubiertos de péptidos durante 30 minutos a TA. Las células no unidas se lavaron con PBS. Se añadió el Mab C6D4 en las concentraciones indicadas. Los resultados se presentaron como células teñidas detectadas después de la tinción con violeta cristal (DO590). Los resultados (FIG. 20) muestran que C6D4 bloquea casi por completo la adhesión celular al péptido.
Ejemplo 3. Caracterización de la estructura de unión de C6D4
La comprensión actual de la estructura de la integrina se enfrenta al obstáculo de tener que conciliar dos visiones polarmente opuestas de la conformación de la integrina. Un grupo propone que las integrinas están siempre dobladas. La otra cree que las integrinas deben sufrir un cambio conformacional significativo, de una conformación doblada a una conformación extendida, tras la activación, abriendo las "cabezas" de las integrinas para que sean completamente funcionales. Este modelo de extensión de la integrina propone uno de los mayores reordenamientos estructurales terciarios y cuaternarios en biología.
La prueba de tales extremos conformacionales se ha visto obstaculizada por compromisos y deficiencias asociadas a técnicas usadas rutinariamente en biología estructural. La cristalografía tradicional produce estructuras cristalinas con resolución atómica, pero depende de las conformaciones y las condiciones en que se pueden formar los cristales. En el caso de las integrinas, solo se han observado conformaciones compactas cerradas mediante cristalografía. Como alternativa, la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de integrinas en condiciones de activación ha demostrado grandes cambios de tamaño consistentes con la extensión de la integrina. Estos cambios en la conformación se han visualizado directamente mediante estudios de microscopía electrónica (EM) con tinción negativa pero a baja resolución. Por lo tanto, los detalles atómicos de la unión del ligando de la integrina y el mecanismo de activación de la integrina siguen sin resolverse.
La microscopía crioelectrónica de partículas individuales (crioEM) puede usarse para determinar la estructura de macromoléculas biológicas sin cristales, ofreciendo de esta manera una alternativa que sortea los obstáculos de la cristalización de las integrinas en la forma extendida. Los recientes desarrollos de hardware y software demuestran que la crioEM de partículas individuales tiene el poder de proporcionar una comprensión estructural a nivel atómico de moléculas que tradicionalmente son difíciles de estudiar. Debido a que la crioEM de partículas individuales no requiere la formación de cristales y permite el examen en las conformaciones funcionales nativas no afectadas por las fuerzas de empaquetamiento de cristales o tampones de cristalización con alto contenido de sal, este método es especialmente adecuado para comprender estructuras de proteínas o complejos integrina-ligando o integrina-Fab que son difíciles de cristalizar. En este caso, los presentes inventores han usado crioEM de partículas individuales para abordar algunos de los mayores misterios de la biología estructural, los mecanismos estructurales de la activación de la integrina y, a la inversa, el mecanismo de acción de los inhibidores de la integrina.
Las estructuras cristalinas publicadas previamente del péptido latente TGF-p arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) de avp6 muestran el posicionamiento del TGF-p RGD en el bolsillo de unión de avp6, así como el posicionamiento de R del RGD de TGF-p próximo a la cabeza av. La microscopía crioelectrónica de la nueva estructura del anticuerpo compuesto C6D4 ha producido ahora una estructura con una resolución de ~4-5 angstroms del Fab C6D4 que se une a avp8. Para generar las estructuras de avp8 en complejo con C6D4, los complejos Fab avp8 y C6D4 recombinantes purificados se aislaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño y a continuación se congelaron por inmersión en rejillas en nitrógeno líquido. Se seleccionaron imágenes de -61.000 partículas individuales capturadas por microscopía electrónica para producir un mapa de densidad electrónica 3D que se usó para construir un modelo de avp8 en complejo con Fab C6D4 usando entradas existentes del Banco de Datos de Proteínas (PDB) para la integrina avp3, aIIbp3 y Fab con CDR similares.
Las FIG. 13A y 13B presentan resultados de crioEM que muestran la unión del Fab C6D4 a la integrina avp8 en el dominio de cabeza. Las FIG. 13A y 13B ilustran esta unión entre C6D4 y avp8 con más detalle. De la huella del anticuerpo C6D4 de la FIG. 6, puede observarse que C6D4 se une principalmente al bucle SDL de p8, estableciendo contactos adicionales con otras estructuras secundarias en las hélices p8 a l y a2 y en la cabeza de av. En conjunto, estos componentes de la configuración de unión dan como resultado la oclusión casi completa del bolsillo de unión del ligando. Los restos de las hélices p8 a l y a2 y la cabeza av que interactúan directamente con C6D4 se detallan con más detalle en la FIG. 7.
La estructura dilucidada muestra que el dominio CDR1 del D4 Vl se une cerca del sitio de contacto del R de RGD en la estructura cristalina avp6-RGD publicada previamente. Debido a que la subunidad av es compartida tanto por avp8 como por avp8, este descubrimiento sugiere que el bucle CDR1 de D4 Vl está ubicado de manera óptima para inhibir estéricamente la unión del R de RGD del TGF-p latente a avp8. En el otro lado del SDL hay un bolsillo de unión hidrófobo que tiene una L que sigue inmediatamente al RGD, formando un péptido RGDL. Se ha demostrado que este bolsillo hidrófobo es esencial como sitio de unión secundario para la unión del péptido RGD TGF-p latente a avp8. Véase, por ejemplo, Shi M,et al., Nature474(7351):343-9 (2011). También se ha demostrado que L o RGDL es esencial para la unión del péptido RGD TGF-p latente a avp8. (Véase, por ejemplo, Ozawa, A,et al. J Biol Chem.
291(22): 11551-65 (2016). Ahora se ha demostrado que el bucle CDR3 de C6 Vh se une de tal manera que cubre sustancialmente el bolsillo de unión hidrófobo ubicado en el dominio de la cabeza de la subunidad p8. Adicionalmente, se descubrió que C6D4 interactuaba ampliamente con el SDL de p8. La FIG. 8 ilustra la superposición del epítopo C6D4 con el bolsillo de unión del ligando de la integrina avp8, mostrando cómo puede prevenir la asociación de la integrina con TGF-p latente y, por tanto, la activación de TGF-p latente. De forma importante, se cree que todos los restos de contacto con C6D4 se conservan en avp8 en todas las especies de mamíferos. Esto es a diferencia del inhibidor alostérico B5, que solo reacciona significativamente contra avp8 humana.
Ejemplo 4. Modelado de los efectos de C6D4 en la supervivencia del cáncer de pulmón
Los modelos singénicos para el estudio del cáncer de pulmón son muy limitados. El modelo de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) es el único modelo de cáncer de pulmón singénico reproducible que se usa ampliamente en la actualidad. LLC es una línea celular establecida a partir del pulmón de un ratón C57BL portador de un carcinoma pulmonar de Lewis primario. Esta línea es altamente tumorigénica y se usa para modelar la metástasis pulmonar que resulta después de la resección del tumor primario. De este modo el modelo imita fielmente el escenario clínico. Es un modelo útil para evaluar la eficacia de los agentes quimioterapéuticosin vivo.Una ventaja del modelo LLC es que las células tumorales son inmunológicamente compatibles, a diferencia de las cepas inmunodeficientes usadas en la mayoría de los otros modelos de xenoinjerto. El modelo LLC se usó como modelo preclínico para evaluar la vinorelbina antes de su uso en ensayos clínicos. La línea celular LLC se inyecta por vía subcutánea en el tejido subcutáneo de ratones C57B6 y, en dos semanas, los tumores primarios alcanzan tamaños reproducibles de 10 mm. Después de la resección del tumor primario, la metástasis pulmonar aparece en 2-4 semanas. Los criterios de valoración principales de este modelo son la pérdida de peso y el número de metástasis pulmonares.
La FIG. 9 presenta resultados que indican que C6D4 aumenta la supervivencia en el modelo LLC. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de IgG2a murina C6D4 o de control de isotipo SV5 (7 mg/kg) en el momento de la extirpación del tumor primario (día 0) y a continuación una vez por semana hasta que la pérdida de peso excedió el 20 %. Los resultados positivos indican la primera demostración de un anticuerpo anti-p8 que inhibe la metástasis del cáncer de pulmón. El hecho de que C6D4 inhiba la metástasis del cáncer de pulmón en este modelo indica su potencial como tratamiento para prevenir la metástasis del cáncer de pulmón. Debido a que el mecanismo de este anticuerpo en el cáncer probablemente implica inhibir la función o el desarrollo de células Treg inmunosupresoras, C6D4 puede tener amplias aplicaciones en cualquier número de cánceres donde los linfocitos Treg desempeñan un papel inmunosupresor.
La FIG. 28 proporciona un esquema del modelo LLC usado en el presente documento para evaluar la metástasis pulmonar. La línea de células tumorales LLC es singénica con la cepa hospedadora C57B/6. Esta línea celular no expresa las integrinas avp8 o avp8. La línea celular LLC.1 se ha pasado a través de ratones una vez y volvió a crecer a partir de metástasis pulmonar. Después de dos semanas, las células LLC.1 de tumor inyectado subcutáneamente (1x106) forman nódulos tumorales grandes (~1 cm). Los tumores se extirpan quirúrgicamente y cuando los animales pierden el 20 % de su peso corporal se les practica la eutanasia.
El experimento de metástasis pulmonar del modelo LLC descrito en el párrafo anterior se repitió once (11) veces y se encontró que los resultados en cada uno de los once experimentos eran similares (datos no mostrados). Las FIG. 29A y 29B presentan datos del undécimo experimento que indica que C6D4 aumenta la supervivencia en el modelo LLC. En cada caso, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de IgG2a murina C6D4 o de control de isotipo SV5 (7 mg/kg) en el momento de la extirpación del tumor primario (día 0) y a continuación una vez por semana hasta que la pérdida de peso excedió el 20 %. Los resultados indican que el anticuerpo anti-p8 (C6D4) inhibe la metástasis del cáncer de pulmón. Las curvas de supervivencia en la FIG. 29A representan ratones sacrificados por razones de recidiva local o pérdida de peso. En la FIG. 29B, se excluyen los animales eliminados por recidiva local. En la autopsia, todos los animales con pérdida de peso del 20 % tienen implantes metastásicos en los pulmones. Los anticuerpos C6D4 se inyectaron durante hasta 90 días en los animales supervivientes. De forma interesante, el examenpost mortemno reveló ninguna respuesta inflamatoria anormal en los tejidos examinados. El hecho de que C6D4 inhiba la metástasis del cáncer de pulmón en este modelo indica su potencial como tratamiento para prevenir la metástasis del cáncer de pulmón. Debido a que el mecanismo de este anticuerpo en el cáncer probablemente implica inhibir la función o el desarrollo de células Treg inmunosupresoras, C6D4 puede tener amplias aplicaciones en cualquier número de cánceres donde los linfocitos Treg desempeñan un papel inmunosupresor.
También se evaluó el efecto de C6D4 con respecto al crecimiento del tumor y la respuesta inmunitaria del tumor. A partir de los tumores primarios LLC.1 resecados en ratones que recibieron dos inyecciones de control de isotipo (B5, que solo reacciona de forma cruzada con b8 humano y no de ratón) o C6D4 (que reacciona de forma cruzada con ratón y ser humano), se registraron los pesos de los tumores primarios y se midieron las dimensiones. Los tumores se desagregaron enzimáticamente y las células inmunitarias se aislaron y se contaron. Se realizó citometría de flujo y las células inmunitarias infiltrantes del tumor se separaron de las células tumorales mediante centrifugación en gradiente de Percoll. Las FIG. 30A-F son uno de los tres experimentos con resultados similares (los datos restantes no se muestran). En cada experimento, n era mayor que, o igual a, 10 en cada grupo de prueba.
Ejemplo 5. Efectos de C6D4 en la enfermedad metastásica usando un modelo de enfermedad de melanoma
En este trabajo se probó un modelo para el estudio de la metástasis que usó la línea de células tumorales B16-F10. La línea de células tumorales altamente metastásicas B16-F10 es singénica con la cepa hospedadora C57B/6. Esta línea no expresa las integrinas avpp o avp8. La línea celular B16-F10 se transfectó con ITGb8 murino y después de la selección en G418 y dos rondas de clasificación, se identificó un grupo de células con alta expresión de avp8. Cuando se inyecta por vía intravenosa a través de la vena de la cola, las metástasis pulmonares visibles aparecieron al cabo de 14 días. Un esquema del modelo de melanoma de enfermedad metastásica descrito en este párrafo se proporciona en la FIG. 31. Después de tres inyecciones (i.p.) de control de isotipo (SV5) o C6D4, ambas a 7 mg/kg, en los días 0, 7 y 14, los ratones se sacrificaron en el día 18. La FIG. 34A muestra fotografías de pulmones representativos en vistas anterior y posterior; se contaron las metástasis pulmonares visibles y se evaluó la superficie pulmonar total afectada por metástasis. La FIG. 34B muestra el número total de metástasis y la FIG. 34C muestra el porcentaje de la superficie pulmonar total implicada en el melanoma metastásico.
Ejemplo 6. Modelado de los efectos de C6D4 sobre la infección por hepatitis B y el pronóstico de la enfermedad
Debido a que el virus de la hepatitis B (VHB) no infecta a los ratones, la investigación se ha centrado tradicionalmente en el uso de modelos de ratones transgénicos y de inactivación para estudiar la inmunidad al VHB. En este modelo, los antígenos víricos en el hígado están expuestos a un sistema inmunitario que no es inmunológicamente tolerante y que no ha estado expuesto previamente al VHB. La meta es imitar los eventos inmunológicos que normalmente se producirían durante la infección primaria por VHB. Además, este modelo permite manipular el sistema inmunológico que está expuesto al virus, para poder identificar y diseccionar las células, citocinas y quimiocinas que contribuyen a la hepatitis crónica o a la resolución de la enfermedad.
Para generar el modelo, el sistema inmunológico residente (tolerado) de los ratones transgénicos VHB se destruye mediante el retrocruzamiento con cepas inmunodeficientes (Mombaertset al.(1992)Nature360:225 and Mombaertset al.(1992)Cell68:869). Esta estrategia de crianza genera animales que expresan altos niveles de antígeno vírico (HBV-Env) o virus (HBV-replicación) en el hígado, en ausencia de un sistema inmunitario tolerante (Baronet al.(2002)Immunity16:583). En estos ratones, los esplenocitos singénicos ingenuos al VHB (el equivalente a un bazo completo) se transfieren desde ratones de tipo silvestre para reconstituir el sistema inmunológico, imitar el punto de infección primaria y probar la importancia de los mediadores celulares y solubles en la patogénesis del VHB. El seguimiento cuidadoso de las respuestas inmunitarias y los resultados patológicos ha revelado la utilidad de este modelo para imitar o modificar la infección aguda y crónica por VHB (Publicoveret al.(2011)J. Clin. Investigation2011:1154 y Publicoveret al. (2QYS)J. Clin. Investigation123:3728). De esta manera, el modelo de ratón proporciona un sistema experimental para examinar la reversibilidad de la preparación inmunitaria alterada que facilita la persistencia del VHB y para probar terapias inmunomoduladoras.
Los resultados mostrados en la FIG. 10 indican que C6D4 induce la eliminación del virus VHB en el modelo de ratón con infección crónica sin provocar hepatitis. En la figura, el antígeno de superficie HepB (HBSag) es un sustituto del VHB intacto. La eliminación de HBSag es un marcador de la eliminación del VHB. ALT es la enzima hepática que se monitoriza para medir la inflamación y el daño hepático. El intervalo normal de ALT en ratones es de 15-40. Los datos muestran que el anticuerpo C6D4 promovió la eliminación de HBsAg en tres de los cuatro ratones modelo con VHB crónico.
Ejemplo 7. Construcción y caracterización del anticuerpo compuesto 4F1F9
Se creó una biblioteca scFV de visualización de levadura usando genes V de los clones de hibridoma 6B9 y 4F1, se seleccionó un nuevo clon 6B9.1 de esta biblioteca, a continuación se creó otra biblioteca scFV de visualización de levadura usando el gen V de 6B9.1 y mutagénesis aleatoria, se caracterizaron dieciséis variantes maduradas por afinidad de esta segunda biblioteca en términos de afinidad de unión y dos clones C4 y D10 se transformaron en formato IgG de conejo, ambos reaccionan débilmente con p8 humana en tejido fijado con formalina embebido en parafina. A continuación se creó una tercera biblioteca scFV mutagénica a partir de las regiones variables de estos dos anticuerpos y se insertó en un vector de visualización de fagos y se mostró como scFv en la superficie del fago (FIG. 11A-B). La biblioteca de fagos inducidos se comparó con avp8 humana inmovilizada embebida en parafina. Se llevaron a cabo múltiples rondas de selección y se caracterizaron quince clones de fagos en detalle antes de seleccionar el clon final F9 (FIG. 11 A-B) y transformarlo en formato IgG para su caracterizaciónin vitro.
Se descubrió que el clon F9 en formato IgG funciona de manera eficiente en tejidos fijados con formalina embebidos en parafina. El clon puede ser adecuado para su uso como diagnóstico complementario, por ejemplo, para determinar tumores que expresan avp8 o infiltrados por las células inmunitarias que expresan avp8 (es decir, células dendríticas, linfocitos Treg), como un reactivo de bioformación de imágenes para medir la captación tumoral específica de p8 y para fundamentar decisiones de tratamiento con C6D4. El anticuerpo F9 también puede usarse para detectar avp8 en muestras de lisado de tejido o líquido mediante ELISA.
Ejemplo 8. Métodos para inh ib ir y/o tratar la patogenicidad deH. Pylori
La bacteriaHelicobacterpylori (H. pylori)Infecta el estómago de aproximadamente la mitad de la población mundial y está asociada a la enfermedad de úlcera péptica, carcinoma gástrico y linfoma gástrico (MALToma). La patogenicidad deHelicobacter pyloriestá vinculada a un sistema de secreción de tipo IV y a la isla de patogenicidad genética asociada a la citotoxicidad cagPAI. Las proteínas cagPAI se transcriben a partir de un tramo de 40 kb del ADN deH. pylorique codifica ~31 genes de los cuales uno, cagL, contiene un motivo de unión a la integrina RGDL. Se cree que este motivo RGDL actúa como un receptor para las integrinas de tal manera que el pilus deH. pyloripuede interactuar con las células epiteliales gástricas y a continuación penetrar la membrana celular y la toxina oncogénica cagA puede inyectarse en la célula (véanse Kwok, et al.,Nature,2007449, 862-866 y Barden, et al,Journal of Molecular Biology,2015, 427 (6) Parte B, 1304-1315). Los presentes inventores han usado el clon anti-p8 F9 para teñir biopsias de estómago humano y han descubierto que la integrina avp8 se expresa por las células epiteliales de las criptas gástricas y esta expresión aumenta en pacientes con gastritis crónica activa debido a la infección porH. pylori(véanse la FIG.
21 y 22). El ectodominio de las integrinas avp6 y avp8, pero no otras integrinas que se unen a RGD (avp1, avp3, avp5 y a5p1) ha demostrado que se unen preferentemente a CagL a través de un mecanismo dependiente de RGDL (véase Barden, et al.,Gastroenterology,2010, 138(3). Anteriormente, se pensaba que la integrina a5p1 era el principal receptor de CagL en las células epiteliales gástricas (véase Kwok, et al.,Nature,2007, 449 (7164):862-6. Los presentes inventores han descubierto que las integrinas avp6 y avp8 se unen con una eficiencia similar a CagL mientras que la integrina avp3 no se une a CagL (véase la FIG. 23). La unión mediada por avp8 a CagL puede bloquearse eficientemente por C6D4 (véase la FIG. 24). La integrina avp8 también media la fuerte adhesión celular a CagL (véase la Fig. 25) y CagL puede competir por la adhesión celular mediada por avp8 al péptido RGD de TGF-p3, lo que indica que avp8 se une al sitio RGD de CagL (véase la FIG. 26). C6D4 puede bloquear eficazmente la adhesión celular a CagL (véase la FIG. 27).
El bloqueo de la unión mediada por avp8 de CagL con C6D4 o sus derivados (es decir, IgA, monomérica o dimérica) puede usarse como método para inhibir la patogenicidad deH. Pylori.(es decir, enfermedad ulcerosa péptica, carcinoma gástrico o MALToma) al bloquear la entrada de la toxina oncogénica CagA. Además, C6D4 podría brindar protección contra la propiaH. Pylorio contra sus efectos oncogénicos y tóxicos indirectos al inhibir la función de Treg y aumentar la inmunidad más efectiva contraH. Pylori,carcinoma gástrico y MALToma. Estos efectos pueden predecirse a partir de los descubrimientos en modelos murinos donde se ha demostrado que el escape inmunológico deH. Pyloriestá mediado por la desviación de Treg inducida por células dendríticas y la supresión de Th17 (véase Kao, et al.,Gastroenterology,2010 138(3): 1046-54). Debido a que se ha demostrado que la activación de TGF-p mediada por la integrina avp8 es necesaria para el desarrollo y la función de los Treg (véase Worthington, et al.,Immunity,2015, Volumen 42, Artículo 5, p. 903-915), inhibir la activación de TGF-p mediada por avp8 usando C6D4 o sus derivados protegerá contra los efectos oncogénicos de la infección porH. Pylorial mejorar la inmunidad a la propiaH. pylorimientras aumenta simultáneamente la inmunidad antitumoral. Otro posible mecanismo por el cual el bloqueo de la activación de TGF-p mediada por avp8 con C6D4 o sus derivados podría bloquear la función de los Treg es inhibiendo la migración de Treg a la mucosa gástrica infectada porH. Pylori.La quimiocina CCL20 es una potente quimiocina para los linfocitos Treg y las células dendríticas, que se requieren para la diferenciación de Treg y la activación de TGF-p mediada por avp8 proporciona una importante contribución a la producción y función de CCL20 (véase Cook, et al,Gut(2014), 63(10): 1550-9; Brand, et al,J Biol Chem,2015, 290(23): 14717-28, Hashimoto, et al,J Immunol195(3): 118290.). Por lo tanto, tratar a pacientes con C6D4 u otro anticuerpo anti-avp8 solo, en combinación con anticuerpos contra otras integrinas de unión a CagL (a5p 1, Act-1 o avp6, 3G9) o en combinación con la terapia convencional contraH. Pylori(es decir, sales de bismuto, inhibidores de la bomba de protones, macrólidos, amoxicilina, metronidazol) tratarían no sólo el mecanismo patogénico deH. Pylorisino que mejorarían la inmunidad para eliminar más eficientementeH. Pylori,mientras que al mismo tiempo protege y/o trata las complicaciones neoplásicas malignas de la infección crónica porH. pylori.
Ejemplo 9. Construcción del anticuerpo humanizado compuesto C6D4
La FIG. 46, la FIG. 50 y la FIG. 51, muestran la alineación de secuencias de diversos clones humanizados C6D4. Las FIG. 50 y 51 también proporcionan secuencias consenso de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera para los clones humanizados relacionados con C6D4. La humanización del anticuerpo C6D4 se centró en la región del marco del dominio V de la cadena pesada y ligera. El proceso de humanización se realizó para incluir tres criterios:
(1) La versión humanizada del anticuerpo (HuC6D4) debería tener una afinidad y especificidad similares o mejoradas para avp8 que la versión murina C6D4;
(2) El aminoácido final en la región del marco del anticuerpo HuC6D4 debe ser lo más cercano posible a la región del marco del anticuerpo traducida de la versión de la línea germinal humana que se seleccionó como la familia de genes diana (VH1/VK3);
(3) Los niveles de producción de la versión humanizada final (HuC6D4) en IgG u otro formato deberían ser escalables para su aplicación en la industria.
Los presentes inventores diseñaron una posible versión humanizada principal del C6D4 murino basada en la línea germinal elegida del anticuerpo humano (VH1/VK3), y el algoritmo de humanización desarrollado en UCSF, y otra información publicada para el desarrollo de fármacos de anticuerpos humanos, con principal consideración en la estructura general de IgG, interfaz VH/VL, empaquetamiento de plegamiento de IgG, accesibilidad de la superficie, zona de impacto de vernier, puntos críticos de humanización y otros factores de riesgo.
Estas versiones principales diseñadas se sintetizaron y expresaron como scFV mediante visualización de levadura. La Kd medida mostró una disminución aproximada de 2 veces con respecto al scFv C6D4 murino original.
A continuación, se creó una biblioteca de visualización de scFv de levadura basada en mutaciones aleatorias usando la versión principal humanizada como punto de partida y se realizó una clasificación FACS para seleccionar los mejores aglutinantes para avp de la biblioteca de levadura mostrada. Tres candidatos mutantes (C6D4-RGD1, C6D4-RGD2 y C6D4-RGD3) se eligieron para realizar más pruebas en formato IgG (véanse, por ejemplo, la FIG. 38C y la FIG. 39).
Ejemplo 10. Caracterización de la afinidad de unión de C6D4 humanizado y CD64-RGD3
En la FIG. 39 se muestran experimentos de tinción de la superficie celular de C6Vh expresado con mutantes RGD1, RGD2 o RGD3 (como se describe en el Ejemplo 8) como IgG de conejo. La unión a células Cho humanas que expresan avp8 se expresó como un porcentaje de unión de C6D4. Los resultados muestran que el mutante RGD3 tiene una unión relativa sustancialmente mayor a avp8 en comparación con C6D4 de tipo silvestre, mutante RGD1 o mutante RDG2.
La FIG. 40 muestra experimentos de tinción de la superficie celular de C6Vh expresado con D4 Vk o mutantes RGD1, RGD2 o RGD3 (como se describe en el Ejemplo 8) como IgG de conejo. Se muestra la unión a células Cho que expresan avp8 humana o células SW480 que expresan avp6. La unión relativa se define como la tinción comparada con la tinción de células Cho o SW480 no transfectadas. Los resultados muestran que el mutante C6D4-RGD3 tiene una unión relativa sustancialmente mayor a avp8 en comparación con C6D4 de tipo silvestre, mutante RGD1 o mutante RDG2.
Se muestra en la FIG. 41 un experimento de unión de C6Vh expresado con D4 Vk o mutantes RGD1, RGD2 o RGD3 (como se describe en el Ejemplo 8) como IgG de conejo para diversas integrinas av-. Las integrinas avpl, avp3, avp5, avp8 y avp8 se adquirieron en R&D systems. Todas las integrinas se recubrieron en placas ELISA a 2 mg/ml, e bloquearon con BSA y se permitió que los anticuerpos se unieran. Se detectó la unión de C6D4 y RGD3 con anti-HRP de conejo. Los resultados mostrados son en relación con los pocillos de control recubiertos con anti-av (clon 8B8) donde se detectaron integrinas av con otro anticuerpo av que reconoce un epítopo no superpuesto (L230-biotina), seguido de SA-HRP. Los resultados muestran que el mutante RGD3 tiene una unión sustancialmente mayor a avp8, mientras que C6D4 tiene una mayor unión relativa a avp8.
También se demostró que C6D4 y C6D4-RGD3 se unen ávidamente a avp8. C6D4 o C6D4-RGD3 humanizado (los Marcos y CHI son humanos; la bisagra y CH2-3 son de ratón) se inmovilizaron en placas ELISA en las concentraciones indicadas. Como un control negativo, algunos pocillos se recubrieron con anti-SV5 en las mismas concentraciones. Los sitios de unión no específicos se bloquearon con BSA. Se añadió el ectodominio avp8 recombinante (0,5 ug/ml) a cada pocillo y, después de la unión y el lavado en tampón de unión (Ca++ y Mg++ 1 mM), el avp8 unido se detectó con anti-av biotinilado (8b8) y se detectó con SA-HRP. Los resultados de este experimento se muestran como unión específica (menos el control SV5) (FIG. 47). Los resultados muestran que C6D4 y C6D4-RGD3 superan a los anticuerpos murinos C6D4 y C6D4-RGD3 al unirse ávidamente a avp8.
Ejemplo 11. Caracterización de la estructura de unión humanizada de C6D4-RGD3
Como se establece en el Ejemplo 3, pueden usarse modelados y mapas de CrioEM para proporcionar información estructural con respecto a la unión de anticuerpos. La FIG. 48 presenta un mapa de la unión de RGD3 al bolsillo del ligando de avp8. El mapa deriva de C6D4 en complejo con avp8 y se compara con C6D4-RGD3 en complejo con avp8. El mapa de densidad comparado con la cabeza de avp8 en complejo con LTGFpl muestra la similitud de la posición de los restos RGD de LTGFB1 con los restos RGD de C6D4-RGD3. El cable magenta representa el mapa de densidad RGD3+avp8, El negro representa el mapa de densidad C6D4+avp8; El oro representa C6D4 Fab; El verde representa la subunidad av; El azul representa la subunidad p8.
La FIG. 49 es un mapa crioEM que muestra que el bucle CDR Vk1 de C6D4-RGD3 ocupa el bolsillo de unión del ligando de avp8. En este caso, los modelos de Fab-avp8 de C6D4 (FIG. 49A) se comparan con el mapa RGD3-avp8 (FIG. 49B), o en superposición (FIG. 49C), basándose en mapas de densidad derivados de crioEM. Se usó el Fab anti-av 11D12V2 para aumentar la masa molecular del complejo y ayudar en la orientación de las partículas. Los resultados muestran que los complejos C6D4 y C6D4-RGD3 poseen un posicionamiento muy similar.
Ejemplo 12. Caracterización de mutantes D4-RGD3 con diferentes longitudes de bucle de RGD y secuencia flanqueante de Pro-TGF-beta 3
Hay una hélice alfa anfipática que sigue la secuencia R-G-D de Latente-TGF-betal y Latente-TGF-beta3. De las 3 versiones modificadas por ingeniería genética (RGD1, RGD2, RGD3) de D4 solo RGD3 contenía la hélice anfipática. Por lo tanto, los presentes inventores modificaron por ingeniería genética diversos bucles que contenían porciones de RGD y secuencias flanqueantes de Pro-TGF-beta 3 para determinar si la longitud del bucle alteraba la afinidad, la especificidad o la producción de cada clon. Debido a que el Vh no se alteró, los presentes inventores clonaron todas las nuevas construcciones en la región CDRL1 del vector de expresión de IgG murino C6D4 y transfectaron los diversos nuevos mutantes D4-RGD3 en células 293. Después de 10 días, la expresión de proteínas se comparó usando un ELISA de IgG murina (que se muestra como niveles de expresión relativos en la Tabla que se proporciona a continuación). Las integrinas avpl, avp3, avp5, avp8 o avp8 (R&D systems) se recubrieron sobre placas ELISA Immulon 4HBX (Thermo Scientific) durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de un bloqueo con una solución de seroalbúmina bovina al 5 % (Sigma-Aldrich) durante toda la noche a 4 °C. Se aplicaron sobrenadantes con diversos anticuerpos mutantes RGD3 a diluciones 1/10 en los pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos unidos a las integrinas se detectaron con un anticuerpo anti-IgG-HRP de ratón (GE Healthcare) y se revelaron con el sustrato TMB (Pierce). La unión se cuantificó por intensidad como 0-4 (representando 0 ninguna unión aparente; representando 4 unión robusta) y los resultados se normalizaron a la expresión. Como puede verse en los datos proporcionados en la tabla a continuación, los diferentes intercambios de Cd Rl<1>en Vk D4 muestran especificidades de unión distintas. Como resultado, los presentes inventores identificaron varios mutantes con especificidades de unión bi-específicas (por ejemplo, RGD3-2 y RGD3-3) o triespecíficas (por ejemplo, RGD3-7 y RGD3-8).
Ejemplo 13. C6D4 induce sesgo Th1 y aumenta las células productoras de CD8 IFN-y
Se inyectaron diecisiete ratones C57B/7 con 106 células tumorales de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) a 8 ratones por vía intraperitoneal con anti-SV5 (control de isotipo) o a 9 ratones con C6D4 (ambos grupos a 7 mg/kg). Las inyecciones de Mab se repitieron el día 7 y los tumores se recogieron el día 11. Las células linfoides infiltrantes de tumores se aislaron de los tumores mediante digestión enzimática y centrifugación en gradiente de Percoll y se tiñeron para CD45, TCRb, CD4, CD8 y ensayo de captura de superficie para IFNg. Las células CD45+ vivas se seleccionaron y las células negativas para B220, Ly6g, CD11c, CD11b, positivas para TCRb se segregaron en subconjuntos positivos para CD4, CD8, IFN-g. Los resultados de este experimento se muestran en la FIG. 54A-54D. Se muestran porcentajes. * p<0,05, **p<0,01.
Listado informal de secuencias
SEQ ÍD NO:l<B13C4 15-8 EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSMH>WVKQAPGKGLKWMG WIKTETGEPTYADDFKG RFAFSLETSATTAYLQINNLKNEDTAKYFCAI YYYGRDS WGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:2 M arco 1 deVH<EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ TD NO:3 CDR1 de VH<TFTDYSMH>
SEQ ID NO:4 M arco 2 deVH<WVKQAPGKGLKWMG>
SEQ ID NO:5 CDR2 de VH<w i k t e t g e p t y a d d f k g>
SEQ TD NO:6 M arco 3 deVH<RFAFSLETSATTAYLQINNLKNEDTAKYFCAI>
SEQ ID NO:7 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQ ID NO:8 M arco 4 deVH<w g q g t t l t v s s>
SEQ ID NO:9<B13C4 15-10 QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSMH WVKQAPGKGLKWMG WIKTETGEPTYADDFKG>RFAFSL£TSATTAYLQINNT,KNFnTAKYFCAT YYYGRDS WGQGTTLTVSS
SEQ TD NO: 10 M arco 1 deVH<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ ID NO: 11 CDR1 de VH<TFTDYSMH>
SEQ ID NO: 12 M arco 2 deV H<¡ WVKQAPGKGLKWMG>
SEQ ID NO: 13 CDR2 de VH<WIKTETGEPTYADDFKG>
SEQ ID NO: 14 M arco 3 deVH<» RFAFSLETSATTAYLQINNLKNEDTAKYFCAI>
SEQ TD NO: 15 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQ ID NO: 16 M arco 4 deVH<WGQGTTLTVSS>
SEQ ID NO: 17
B13H3.2 QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSMH WVKQAPGKGLKWMG WIKTETDEPTYADDFKE
RFAFSLETSASTANLQ11NLKNEDTATYFCAI YYYGRDS WGQGTTLTVSSSEQ
SEQ ID NO: 18 M arco 1 de VH<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ ID NO: 19 CDR1 de VH<TFTDYSMH>
SEQ TD NO:20 M arco 2 de VH<WVKQAPGKGLKWMG>
SEQ ID NO:21 CDR2 de VH<WIKTETDEPTYADDFKE>
SEQ ID NO:22 M arco 3 de VH<RFAFSLETSASTANLQ11NLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO:23 CÍ)R3de VH<YYYGRDS>
SEQ TD NO:24 M arco 4 de VH<WGQGTTLTVSSSEQ>
SEQ ID NO:25
B13C1231015 QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSIH WVKQAPGKGLKWMG WIKTETGEPTYADDFNG
rfafsletsast aylqinnt.knkdtatyfcat yyygrds WGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:26 M arco 1 de VH<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ ID NO:27 CDR1 de VH<tftdysih>
SEQ TD NO:28 M arco 2 de VH<w v k q a p g k g l k w m g>
SEQ ID NO:29 CDR2 de VH<WIKTETGEPTYADDFKG>
SEQ ID NO:30 M arco 3 de VH<RFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO:31 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQ ID NO:32 M arco 4 de VH<WGQGTTLTVSS>
SEQ TD NO:33
B15BllVh QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSMH WVKQAPGKGLKWVA RINTETGEFTFADDFRG RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI YYYGRDS WGQGTTLTVSSSEQ ID NO:34M arco1 deV H<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ ID NO:35 CDR1 de VH<tftdysmh>
SEQ ID NO:36M arco 2deV H<■wv kq apg kg lkw va>
SEQ ID NO:37 CDR2 de VH<RINTETGEPTFADDFRG>
SEQ TD NO:38M arco3 deV H<RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO:39 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQ ID NO:40M arco 4deV H<WGQGTTLTVSS>
SEQ ID NO:41
B2B2 15-9 QIQLLQSGPELKKPGETVKISCLASGY TFTDYSMH WVKQAPGKGLKWVA RINTETGEPTFADDFGG RFAVSLETSASTAYLQlNWLKNEDTATYFCAr YYYGRDS WGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:42M arco1 deV H<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCLASGY>
SEQ TD NO:43 CDR1 de VH<tftdysmh>
SEQ ID NO:44M arco2 deVTH<.wv kq ap gk g lk w va>
SEQ ID NO:45 CDR2 de VH<ri n tetge ptfa bdfg g>
SEQ ID NO:46M arco3 deV H<RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO:47 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQIDNO:48M arco 4deV H<wgqg ttltvs s>
SEQ ID NO:49
R11D12715.3 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGF TFSSFGMS WVRQTPDKRLELVA T1NSNGGSTYYPDNMKG RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAS ACYRYGAFFDY WGQGTTLTVSSSEQ ID NO:50M arco 1deV H<EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGF>
SEQ ID NO:51 CDR1 de VH<TFSSFGMS>
SEQ ID NO:52M arco2 deV H<■ w v r q t p d k r l s l v a>
SEQ ID NO:53 CDR2 de VH<TINSNGGSTYYPDNMKG>
SEQ ID NO:54M arco3 deV H<RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAS>
SEQ ID NO:55 CDR3 de<ACYRYGAFFDY>
SEQ ID NO:56M arco 4deV H<WGQGTTLTVSS>
SEQ ID NO:57
RSDLVH-l EVQLLESGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSIH WVKQÁPGKGLKWMG WIKTETGEPTYADDFKG rfafsletsastaylqinnlknedtatyfcai yyygrds wgqgttvtvss
SEQ ID NO:58M arco 1deV H<EVQLLESGPELKKPGETVKXsckas gy>
SEQ ID NO:59 CDR1 de VH<TFTDYSIH>
SEQ ID NO:60M arco2 deV H<WVKQAPGKGLKWMG>
SEQ ID NO:61 CDR2 de<wi k tetge ptya ddfk g>
SEQ ID NO:62M arco3 deV H<RFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO:63 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQ ID NO:64M arco 4deV H<WGQGTTVTVSS>
SEQ ID NO:65
RSDLVU-l EVQLLESGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSIH WVKQAPGKGLKWMG WIKTETGEPTYADDFKG RFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI YYYGRDS WGQGTTVTVSS
SEQ TD N O:66 M arco 1 de V H<EVQLLESGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ ID NO:67 CD Rl de VH<TFTDYSIH>
SEQ ID N O:68 M arco 2 de V H<WVKQAPGKGLKWMG>
SEQ ID NO:69 CDR2 de VH<WIKTETGEPTYADDFKG>
SEQ TD N O:70 M arco 3 de V H<RFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO:71 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQ ID NO:72 M arco 4 de V H<w g q g t t v t v s s>
SEQ TD NO:73
RSDLVH 3 QVQLMQSGPELKKPGETVKISCIÍASGY TFTDYSIH WVKQAPGKGLKWMG WIKTETGEPTYADDFNG RFAFSLETSASTAYLQINNLKHEDTATYFCAI YYYGRCS WGQGTTLTVSSSEQ ID N O:74 M arco 1 de V H<QVQLMQSGPELKKPGETVKISCIÍASGY>
SEQ TD N O:75 CDRl de VH<t f t d y s i h>
SEQ TD N O:76 M arco 2 de V H<w v k q a p g k g l k w m g>
SEQ TD N O:77 CDR2 de<V H w i k t e t g e p t y a d d f n g>
SEQ TD N O:78 M arco 3 de V H<RFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO:79 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQ TD N O:80 M arco 4 de V H<WGQGTTLTVSS>
SEQ TD N O :8I
RSDLVII-16 QIQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSMH WVKQAPGKGLKWVA P.INTETGEPTFADDFP.G RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCA1 YYYGRDS WGQGTTLTVSS
SEQ TD NO:82 M arco T de V H<QIQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ ID NO:83 CDRl de VH<TFTDYSMH>
SEQ ID N 084 M arco 2 de V H<WVKQAPGKGLKWVA>
SEQ ID NO:85 CD Rl de VH<RINTETGEPTFADDFRG>
SEQ TD NO:86 M arco 3 de V H<RFAVSLETSASTAYLQIMNLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO:87 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQ TD NO:88 M arco 4 de V H<WGQGTTLTVSS>
SEQ ID NO:89
25 and 44 QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSMH WVKQAPGKGLKWVA RINTETGEPTFADDFRG RFAVSLEYSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI YYYGRDS WGQGTTLTVSSSEQ TD N O:90 M arco 1 de V H<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ TD NO:9T CDRl de VH<TFTDYSMH>
SEQ TD N O:92 M arco 2 de V H<WVKQAPGKGL KWVA>
SEQ TD N O:93 CDR2 de VH<RINTETGEPTFADDFRG>
SEQ TD N O:94 M arco 3 de V H<' RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO:95 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQ ID N O:96 M arco 4 de V H<WGQGTTLTVSS>
SEQ TD NO:97
Al—B4—F'9 QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSMH WVKQAPGKGLKWVA RINTETGEPTFADDFRG RFAVSLETSASTAYLQINNLKNFDTATYFCAI YYYGRDT WGQGTTLSVSSSEQ TD NO:98 M arco 1 de V H<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ ID NO:99 CD Rl de<V H t f t d y s m h>
SEQ TD NO: 100 M arco 2 de V H<WVKQAPGKGLKWVA>
SEQ ID NO: 101 CDR2 de VH<RINTETGEPTFADDFRG>
SEQ ID NO: 102M arco 3 de V H<RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ TD NO: 103 C D R 3 d e V H<YYYGRDT>
SEQ TD NO: 104 M arco 4 de VH<WGQGTTLSVSS>
SEQ ID NO: 105
A5=ce QIQLLQSGPELKKPGETVKI5CKASGY TFTDYSMH WVKQAPGKGLKWVA RINTETGEPTFADDFRG RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI FYYGRDS WGQGTALTVSSSEQ ID NO: 106 M arco 1 de V H<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ TD NO: 107 C D R ld eV H<TFTDYSMH>
SEQ TD NO: 108 M arco2de V H<WVKQAPGKGLKWVA>
SEQ ID NO:109 CDR2 de<V H r i n t e t g e p t f a d d f r g>
SEQ ID NO: 110 M arco 3 de V H<RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
S E Q lD N O :lll CDR3 de VH<fyygrds>
SEQ ID NO: 112 M arco4de V H<WGQGTALTVSS>
SEQ ID NO: 113
D4-E6 QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSMH WVKQAPGKGLKWVA RINTETGEPTFADDFRG RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI<yyygr ds wgqg ttl tv ss>
SEQ ID NO: 114 M arco 1 de V H<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ ID NO: 115 CDRl de VH<TFTDYSMH>
SEQ ID NO: 116 M arco2de V H<WVKQAPGKGLKWVA>
SEQ TD NO: 117 CDR2deVH<RINTETGEPTFADDFRG>
SEQ TD NO: 118 M arco 3 de V H<RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO: 119 CDR3 de VH<yyygr ds>
SEQ ID NO: 120 M arco4de V H<WGQGTTLTVSS>
SEQ ID NO: 121
C6D4 QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY TFTDYSMH WVKQAPGKGLKWVA RINTETGEPTFADDFRG RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI FYYGRDS WGQGTTLTVSSSEQ ID NO: 122 M arco 1 de V H<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGY>
SEQ ID NO: 123 CDRl de VH<TFTDYSMH>
SEQ TD NO: 124 M arco2de V H<WVKQAPGKGLKWVA>
SEQ ID NO: 125 CDR2 de VH<RINTETGEPTFADDFRG>
SEQ ID NO: 126 M arco 3 de V H<RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ TD NO: 127 CDR3 de VH<f yy gr d s>
SEQ TD NO: 128 M arco4de V H<WGQGTTLTVSS>
SEQ ID N O:129
B2B2 35-20 DIVMSQSPSSMYASLGERVTITC KASQDINSYLS WFQQKPGKSPKTLIY RANRLVD GVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYC LQYDEFPPLT FGAGTKLELKASEQ ID NO: 130 M arco 1 de V L<DIVMSQSPSSMYASLGERVTITC>
SEQ ID NO: 131 CDRl de VL<KASQDINSYLS>
SEQ ID N O:132 M arco2de V L<wf qq k pg ks p kt l iy>
SEQ ID NO: 133 CDR2 de VL<RANRLVD>
SEQ ID NO: 134 M arco 3 de V L<GVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYC>
SEQ ID NO: 135 CDR3 de VL<LQYDEFPPLT>
SEQ TD NO: 136 M arco4de V L<FGAGTKLELKA>
SEQ ID NO: 137
B232 35-26 QIVLTQSPSSMYASLGERVTITC KASQDINSYLS WFQQKPGKSPKTLIY RANRLVD GVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYC LQYDEFPPLT FGAGTKLELKA
SEQ TD NO: 138 M arco 1 de V L<QIVLTQSPSSMYASLGERVTITC>
SEQ ID NO: 139 C D R ld eV L<KASQDINSYLS>
SEQ ID NO: 140 M arco 2 de V L<WFQQKPGKSPKTLIY>
SEQ ID NO: 141 CDR2 de V L<ranrlvd>
SEQ TD NO: 142 M arco 3 de V L<GVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYC>
SEQ ID NO:143 CDR3 de VL<lqycefpplt>
SEQ ID NO: 144 M arco 4 de V L<FGAGTKLELKA>
SEQ ID NO: 145
Bl5Bllvk34-26 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC SASSSVSYMH WYQQKPGTSPKLWIY DTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC QQWSSNPLT FGSGTKLEIKASEQ ID NO: 146 M arco 1 de V L<QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC>
SEQ ID NO: 147 CDR1 de VL<sas ssvsy mh>
SEQ TD NO:148 M arco 2 de V L<WYQQKPGTSPKLWIY>
SEQ TD NO: 149 CDR2 de V LDTSNLAS
SEQ TD NO:150 M arco 3 de V L<GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC>
SEQ TD NO:151 CDR3 de MQQWSSNPLT
SEQ TD NO: 152 M arco 4 de V L<FGSGTKLEIKA>
SEQ TD NO: 153
B15Bllvk33-24 EIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC SASSSVSYMH WYQQKPGSSPKLWIY DTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC QQWSSNPLT FGDGTRLEIKASEQ ID NO: 154 M arco 1 de V L<ElVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC>
SEQ ID NO: 155 CDR1 de VL<sas ssvsymh>
SEQ TD NO: 156 M arco 2 de V L<WYQQKPGSSPKLWIY>
SEQ TD NO: 157 CDR2 de VL<dtsnlas>
SEQ ID NO: 158 M arco 3 de V L<GVPARFSGSGSGTSYSLTI SSMEAEDAATYYC>
SEQ ID NO:159 CDR3 de VL<qqw ssnpl t>
SEQ TD NO: 160 M arco 4 de V L<f g d g t r l e i k a>
SEQ TD NO:161
B15Bllvk35-26 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC SASSSVSYMH WYQQKSGTSPKLWIY DTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLT1SSMEAEDAATYYC QQWSSNPPi' FGAGTKLELKA
SEQ TD NO: 162 M arco 1 de V L<QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTC>
SEQ TD NO: 163 CDR1 de VLSASSSVSYMH
SEQ ID NO: 164 M arco 2 de V LWYQQKSGTSPKLWIY
SEQ ID NO: 165 CDR2 de VIDTSNLAS
SEQ TD NO: 166 M arco 3 de V LGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC
SEQ TD NO: 167 CDR3 de VL<qq w ssnpp t>
SEQ ID NO:168 M arco 4 de V L<FGAGTKLELKA>
SEQ TD NO: 169
B13CI2134-25 D1KMTQSPAIMSASPGEKVTMTC SASSSVSYMH WYQQKSGTSPKRW1Y DTSKLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEñEDAATYYC QQWSSNPFT FGSGTKLEIKA
SEQ TD NO: 170 M arco 1 de V L<DIKMTQSPAIMSASPGEKVTMTC>
SEQ TD NO:171 CDR1 de VL<sas ssvsy mh>
SEQ ID NO:172 M arco 2 de V L<WYQQKSGTSPKRWIY>
SEQ ID NO:173 CDR2 de VLDTSKLAS
SEQ TD NO:174 M arco 3 de V L<GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC>
SEQ TD NO: 175 C D R 3 de V L<QQWSSNPFT>
SEQ ID NO: 176 Marco 4 de VL<FGSGTKLEIKA>
SEQ ID NO:177
B13C12133-26 QMVLIHSPAIMSASPGEKVTMTC SASS3VSYMH WYQQKPGSSPKPWIY GTSNLAS GVPARFSGSG5GTSYSLTISRMEAEDAATYYC QQWSSFFPT FGDGTR1EIKA
SEQ ID NO:178 M arco 1 de V L<QMVLTHSPAIMSASPGEKVTMTC>
SEQ ID NO: 179 CDRl de VL<SASSSVSYMH>
SEQ TD NO: 180 M arco 2 de V L<WYQQKPGSSPKPWIY>
SEQ ID NO:181 CDR2de_VL<GTSNLAS>
SEQ ID NO:182 M arco 3 de V L<GVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC>
SEQ ID NO: 183 CDR3 de VL<QQWSSNPPT>
SEQ ID NO: 184 M arco 4 de V L<FGDGTRLEIKA>
SEQ ID NO:185
U13C4 35-20 DIVMSQSP5SLAVSAGEKVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQSFRLL1Y WASTRES GVPDRFTGSG3GTDFTLTI33VGAEDLAVYYC KQSYNLIT FGAGTKLELKA
SEQ ID NO: 186 M arco 1 de V L<DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC>
SEQ ID NO: 187 CDRl de VL<KSSQSLLNSRTRKNYLA>
SEQ ID NO:188 M arco 2 de V L<WYQQKPGQSPRLLIY>
SEQ ID NO: 189 CDR2 de VL<WASTRES>
SEQ ID NO: 190 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC>
SEQ ID NO: 191 CDR3 de VL<kqsyn llt>
SEQ ID NO:192 M arco 4 de V L<FGAGTKLELKA>
SEQ TD NO: 193
B15Bllvk35 20 DIVMSQSPSSLAVSAGENVTVSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQSPKLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFC KQSYNLLT FGAGTKLELKASEQ ID NO: 194 M arco 1 de V L<DIVMSQSPSSLAVSAGENVTVSC>
SEQ ID NO: 195 CDRl de VL<DIVMSQSPSSLAVSAGENVTVSC>
SEQ TD NO: 196 M arco 2 de V L<WYQQKPGQSPKLLIY>
SEQ ID NO: 197 CDR2 de_VL<WASTRES>
SEQ ID NO: 198 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFC>
SEQ ID NO: 199 CDR3 de VL<KQSYNLLT>
SEQ ID N 0 :200 M arco 4 de V L<FGAGTKLELKA>
SEQ ID NO:201
B13C.2335-25 DIKMTQSPSSLAVSPGEKVTHSC KSSQSLLHSRTRKNYLA WYQQKPGQSPKLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLLT FGAGTKLELKASEQ ID NO:202 M arco 1 de V L<DIKMTQSPSSLAVSPGEKVTMSC>
SEQ ID NO:203 CDRl de VL<KSSQSLLHSRTRKNYLA>
SEQ ID NO:204 M arco 2 de V L<WYQQKPGQSPKLLIY>
SEQ ID NO:205 CDR2 de VL<WASTRES>
SEQ ID NO:206 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC>
SEQ ID NO:207 CDR3 de VL<KQSYNLLT>
SEQ TD NO:208 M arco 4 de V L<FGAGTKLELKA>
SEQ ID NO:209
B13C1233520 DIVMSQSPSSLAVSPGEKVTMSC KSSQSLLHSRTRKNYLA WYQQKPGQSPKLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLLT FGAGTKLELKA
SEQ TD NO:210 M arco 1 de V L<DIVMSQSPSSLAVSPGEKVTMSC>
SEQ TD NO:211 CDR1 de VL<kss qsll hs rtr km yla>
SEQ ID JNO:212 M arco 2 de V L<WYQQKPGQSPKLLIY>
SEQ ID NO:213 CDR2de_VL<wastres>
SEQ TD NO:214 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTI SSVQAEDLAVYYC>
SEQ TD NO:215 CDR3 de^<kqsynllt>
SEQ TD NO:216 M arco 4 de V L<FGAGTKLELKA>
SEQ TD NO:217
RSDLVK-1 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLLT FGAGTKLELKRSEQ ID NO:218 M arco 1 de V L<DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC>
SEQ ID NO:219 CDR1 de VL<KSSQSLLNSRTRKNYLA>
SEQ TD NO:220 M arco 2 de V L<WYQQKPGQSPRLLIY>
SEQ TD NO:221 C D R 2deV L<WASTRES>
SEQ TD NO:222 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC>
SEQ ID NO:223 CDR3 de VL<kqsynllt>
SEQ TD NO:224 M arco 4 de V L<fgag tklel kr>
SEQ TD NO:225
RSDLVK-6 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLLT FGAGTRLEIKRSEQ TD NO:226 M arco 1 de V L<DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC>
SEQ TD NO:227 CDR1 de VL<KSSQSLLNSRTRKNYLA>
SEQ TD NO:228 M arco 2 de V L<wyq qkp gqsp rlli y>
SEQ TD NO:229 C D R 2deV L<wastres>
SEQ TD NO:230 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC>
SEQ ID NO:231 CDR3 de VL<kqsynllt>
SEQ TD NO:232 M arco 4 de V L<FGAGTRLEIKR>
SEQ ID NO:233
RSDLVK-10 DIVMTQSPSSLAVSAGENVTVSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQSPKLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTGFTLTISSVQAEDLAVYFC KQSYNLLT FGAGTRLEIKRSEQ ID NO:234 M arco 1 de V L<DIVMTQSPSSLAVSAGENVTVSC>
SEQ TD NO:235 CDR1 deVL<kss qsll ns rtr kn yla>
SEQ TD NO:236 M arco 2 de V L<wy qqkp gqsp klli y>
SEQ TD NO:237 C D R 2JeV XWASTRES
SEQ TD NO:238 M arco 3 de V L<gvp drftg sgsgt gf tlt is sv qae dl avy fc>
SEQ TD NO:239 CDR3 de VL<kqsynllt>
SEQ TD NO:240 M arco 4 de V L<FGAGTRLEIKR>
SEQ TD NO:241
RSDLVK-13 DIVMSQSPSSLAVSPGEKVTMSC KSSQSLLHSRTRKMYLA WYQQKPGQSPKLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLLT FGAGTKLELKRSEQ TD NO:242 M arco 1 de V L<DIVMSQSPSSLAVSPGEKVTMSC>
SEQ ID NO:243 CDR1 de V L<KSSQSLLHSRTRKNYLA>
SEQ TD NO:244 M arco 2 de V L<WYQQKPGQSPKLLIY>
SEQ ID NO:245 CDR2 de VL<wastres>
SEQ TD NO:246 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC>
SEQ TD NO:247 C D R 3 de V L<kqsynllt>
SEQ TD NO:248 Marco 4 de VL<fgagtklelkr>
SEQ ID NO:249
2 9DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLLT FGAGTKLELKASEQ ID NO:250M arco1 deV L<DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC>
SEQ TD NO:251 CDRl de VL<KSSQSLLNSRTRKNYLA>
SEQ ID NO:252M arco2 deV L<wy q qkp gq sp rl liy>
SEQ ID NO:253 CDR2 de VL<WASTRES>
SEQ TD NO:254M arco3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC>
SEQ TD NO:255 CDR3 de VL<KQSYNLLT>
SEQ TD NO:256M arco4 de V L<FGAGTKLELKA>
SEQ TD NO:257
44 DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQDEDLAVYYC KQSYNLLT FGAGTKLELKASEQ ID NO:258M arco1 de V L<DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC>
SEQ ID NO:259 CDRl de VL<KSSQSLLNSRTRKNYLA>
SEQ TD NO:260M arco2 de V L<wy q qkp gq sp rl liy>
SEQ ID NO:261 C D R 2deV L<WASTRES>
SEQ ID NO:262M arco3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQDEDLAVYYC>
SEQ ID NO:263 CDR3 de VL<KQSYNLLT>
SEQ TD NO:264M arco4 de V L<FGAGTKLELKA>
SEQ TD NO:265
A1=B4=E9 DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLLT FGAGTKLELKASEQ TD NO:266 M arco 1 de V L<DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC>
SEQ ID NO:267 CDRl de VL<KSSQSLLNSRTRKNYLA>
SEQ TD NO:268 M arco 2 de V L<WYQQKPGQSPRLLIY>
SEQ ID N0 :269 CDR2 d tV L<wastr es>
SEQ TD NO:270 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC>
SEQ ID NO:271 C D R 3deV L<KQSYNLLT>
SEQ ID NO:272 M arco 4 de V L<fgag tklel ka>
SEQ TD NO:273
A5-C6 DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQSPRLLIY WASTRES GVPBRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLLT FGAGTKLELKASEQ TD NO:274 M arco 1 de V L<DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC>
SEQ ID NO:275 C D R ld eV L<KSSQSLLNSRTRKNYLA>
SEQ ID NO:276 M arco 2 de V L<wy q qkp gq sp rl liy>
SEQ TD NO:277 C D R 2JaV L<WASTRES>
SEQ TD NO:278 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC>
SEQ ID NO:279 CDR3 de VL<KQSYNLLT>
SEQ ID NO:280 M arco 4 de V L<fga gtklelka>
SEQ ID NO:281
D4=E6 DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQXPRLLIY WAS'i'RES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQDEDLAVYYC KQSYNLLS FGAGTKLELKA
SEQ ID NO:282 M arco 1 de V L<DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSC>
SEQ ID NO:283 CDRl<de V L kssqsllnsrtrknyla>
SEQ ID NO:284 M arco 2 de V L<WYQQKPGQXPRLLIY>
SEQ ID NO:285<C D R 2 de V L WASTRES>
SEQ ID NO:286 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQDEDLAVYYC>
SEQ ID NO:287 CDR3<de V L KQSYNLLS>
SEQ ID NO:288 M arco 4 de V L<FGAGTKLELKA>
SEQ ID NO:289
C6D4 DIVMTQSPSSIAVSAGEKVTMSC KSSQSLLKSRTRKKYLA, WYQQKPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQ3YÍJLLS FGAGTKIELKR
SEQ ID NO:290 M arco 1 de V L<DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC>
SEQ ID NO:291<C D R l de V L kssqsllnsrtrknyla>
SEQ ID NO:292 M arco 2 de V L<WYQQKPGQSPRLLIY>
SEQ ID NO:293<CD R2 de V L wastres>
SEQ ID NO:294 M arco 3 de V L<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC>
SEQ ID NO:295 CDR3<de V L KQSYNLLS>
SEQ TD NO:296 M arco 4 de V L<fgagtklelkr>
SEQ ID NO:297
F9 VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIQ WVKQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKS33SAYMQLS3LTSGDSAVYE‘CAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:298 M arco 1 de V H<QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY>
SEQ ID NO:299 CDRl<de VHAFTDYLIQ>
SEQ ID N 0 :300 M arco 2 de V H<wvkqrpgqglewig>
SEQ ID N0 :301 CDR2<de V H vineetggtnynakfrg>
SEQ ID NO:302 M arco 3 de V H<KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR>
SEQ ID NO:303 CDR3<de VTi e a g n y i y a m d y>
SEQ TD NO:304 M arco 4 de V H<WGQGTSVTVSS>
SEQ ID NO:305
F9 VL DIVMTQSPAFLSASVGETVTITC RASVNIYSYLV WYQQKQGRSPQLLVII NAKTLAE GVPSRFSGSGSGTQFSLKIKSLQPEBFGSYYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIKKSEQ ID NO:306 M arco 1 de V L<DIVMTQSPAFLSASVGETVTITC>
SEQ TD NO:307 CDRl<de V L rasvmiysylv>
SEQ ID NO:308 M arco 2 de V L<wyqqkqgkspqllvh>
SEQ ID NO:309 CDR2<de VL HAKTLAE>
SEQ ID NO:310 M arco 3 de V L<GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC>
SEQ ID N O :31I C D R 3d e\ X<QHHHGTPYT>
SEQ ID NO:312 M arco 4 de V L<FGGGTKLEIKR>
SEQ ID NO:313 B2B2 CDRl de VH<TFTDYSMH>
SEQ ID NO:314 B2B2 CDR2 de<V H rintetgeptfaddfgg>
SEQ ID NO:315 B2B2 CDR3 de VH<yyygrds>
SEQ ID NO:316 B13C4 CDRl de VH<TFTDYSMH>
SEQ ID NO:317 B13C4 CDR2 de VH<wiktetgeptyaddfkg>
SEQ ID N O :3l8 B13C4 CDR3 de VH<YYYGRDS>
SEQ ID N O :319b i 3h3CDR1 deVH tftdysmh
SEQ ID N O :320B13H3CDR2 de VH<w iktetdeftyaedfke>SEQ ID NO:321B13H3CDR3 de VH yyygrds
SEQ ID N O :322B15B11CDR1 de VH tftdysmh.
SEQ ID N O :323B15B11CDR2 de VH rintetgeptfaddfrgSEQ ID N O:324B15B 11CDR3 de VH yyygrds
SEQ ID N O :325B13C12 CDR1 de VH<tftd y sih>
SEQ ID N O :326Bi 3 c i2 CDR2 de VH wiktetgeptyaddfngSEQ TD N O:327B13C12 CDR3 de VH<yyygrds>
SEQ ID N O :328a i CDR1 de VH tftdysmh
SEQ ID N O:329a ! CDR2 de VH rintetgeptfaddfrgSEQ ID N O :330a i CDR3 de VH yyygrdt
SEQ ID NO:331C6 CDR1 de VH tftdysmh
SEQ ID N O:332ce C D R 2d eV H<rintetgeptfaddfrg>SEQ ID N O :333C6 CDR3 de VH fyygrds
SEQ ID N O:334b2b2 CDR1 d eV k kasqdinsyls
SEQ ID N O :335B2B2CDR2 de V k<ranrlvd>
SEQ ID N O :336B2B2CDR3 de V k lqydefpplt
SEQ ID N O:337B13C4 CDR1 de V k kssqsllnsrtrknylaSEQ ID N O :338B13C4 CDR2 de V k castres
SEQ ID N O :339B13C4 CDR3 de V k kqsynllt
SEQ ID NO:340B13H3 CDR1 de V k kssq sllnsrirkn ylaSEQ ID NO:341B13H3 CDR2 de V k castres
SEQ ID NO:342B13H3 CDR3 de V k<kqsynllt>
SEQ ID N O :343B 15B H . i CDR1 de Vk sasssvsym i-iSEQ ID N O:344B15 B H . i CDR2 de V k<dtsnlas>
SEQ ID N O :345b i s b i i . i CDR3 de Vk qqwssnplt
SEQ ID N O:346B 15B H .2 CDR1 de Vk<sasssvsymh>
SEQ ID N O:347b i 5b i i .2 CDR2 de Vk dtsnlas
SEQ ID NO:348B15 B H .2 CDR3 de Vk qqwssnppt
SEQ ID N O :349B 15B H .3 CDR1 d eV k kssqsllnsrtrknylaSEQ ID N O :350B15 B H .3 CDR2 de V k wastres
SEQ ID NO:351B15 B 11.3CDR3 de V k kqsynllt
SEQ ID NO:352B13C12. i CDR1 de Vk SASSSVSYMH
SEQ ID N O :353B13C12. i CDR2 de Vk dtsklas
SEQIDNO:354<B13C12.>ICDR3<de>Vk<qqwssmpft>
SEQIDNO:355 B13C12.2CDR1deVk<sasssvsymh>
SEQIDNO:356 B13C12.2CDR2deVk<gtsnlas>
SEQIDNO:357 B13C12.2CDR3de VkQQWSSNPPT
SEQIDN O :358 B13C12.3CDR1 de VkKSSQSLLHSRTRKNYLA
SEQIDNO:359 B13C12.3CDR2deVk<wastres>
SEQIDNO:360 B13C12.3CDR3de VkKQSYNLLT
SEQIDNO:361 D4CDR1deVkKSSQSLLNSRTRKNYLA
SEQIDNO:362 D4CDR2deVk<wastres>
SEQIDNO:363<d>4CDR3deVk<kqsynlls>
SEQIDJNO:364<rsdlvh>-i CDR1 de VH<tftd y sih>
SEQIDINO:365<rsdlvh>-i CDR2 de VH<wiktetgeptyaddfkg>
SEQIDN O :366<rsdlvh>- iCDR3 de VH<yyygrds>
SEQIDNO:367<rsdlvh>-3CDR1 de VH<tftd y sih>
SEQIDNO:368<rsdlvh>- 3CDR2 de VH<wiktetgeptyaddfng>
SEQIDNO:369<rsdlvh>- 3CDR3 de VH<yyygrds>
SEQIDN O :370<rsdlvh>-is CDR1 de VH<tftdysmh>
SEQIDNO:371<rsdlvh>-16CDR2 de VH<rintetgeptfaddfrg>
SEQIDNO:372<rsdlvh>- 16CDR3 de VH<yyygrds>
SEQIDN O :373<rsdlvk>-10CDR1deVk<kssqsllnsrtrknyla>
SEQIDN O :374<rsdlvk>-10 CDR2deVk<wastres>
SEQIDN O :375<rsdlvh>-i o CDR3deVk<kqsynllt>
SEQIDNO:376<rsdlvk>- 13CDR1 de Vk<kssqsllhsrtrknyla>
SEQIDNO:377<rsdlvk>- 13CDR2 de Vk<wastres>
SEQIDN O :378<rsdlvk>- 13CDR3 de Vk<kqsynllt>
SEQIDNO:379<d>4<h>CDR1 de VH<tftdysmh>
SEQIDIVO:380<d>4<h>CDR2 de VH<rintetgeptfaddfrg>
SEQIDNO:381 D4nCDR3deVH<yyygrds>
SEQIDNO:382 C6kCDR1 de VkKSSQSLLNSRTRKNYLA
SEQIDN O :383 c6kCDR2 de Vk<wastres>
SEQIDN O :384 C6kCDR3deVk<kqsynllt>
SEQIDNO:385 FR1 de cadena pesada (<q>/<e>) IQL (L/<m>) (Q/E) SGPELKKPGETVKISCKASGY SEQIDNO:386 FR2 de cadena pesada wvkqapgkglkw (V/m¡ a
SEQIDNO:387 FR3 de cadena pesada RFA(V/F) SLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI SEQIDN O :388 FR4 de cadena pesada WYQQKPGQSP (K/R| LLIY
SEQ ID N O :389FRlde cadena ligera (D/E) IVM ¡T/S) QSPSSLAV(/PS) AGE (K/N) VT (M/V) SC SEQ ID JNO:390FR2de cadena ligera WYQQKPGQSP (K/R) LLIY
SEQ ID NO:391 FR3 de cadena ligera GVPDRFTGSGSGT'DFTLT'ISSVQAEDLAVY (Y/F) C
SEQ ID NO:392 FR4 de cadena ligera FGAGT (R/K) LE(L/I ) K
SEQ ID NO:393 av humana
1 FNLDVDSPAEYSGPEGSYFGFAVDFFVPSASSRMFLLVGAPKANTTQPGI 50 51 VEGGQVLKCDWSSTRRCQPIEFDATGNRDYAKDDPLEFKSHQWFGASVRS 100 101 KQDKILACAPLYHWRTEMKQEREPVGTCFLQDGTKTVEYAPCRSQDIDAD 150 151 GQGFCQGGFSIDFTKADRVELGGPGSFYWQGQLISDQVAEIVSKYDPNVY 200 201 SIKYNNQLATRTAQAIFDDSYLGYSVAVGDFNGDGIDDFVSGVPRAARTL 250 251 GMVYIYDGKNMSSLYNFTGEQMAAYFGFSVAATDINGDDYADVFIGAPLF 300 301 MDRGSDGKLQEVGQVSVSLQRASGDFQTTKLNGFEVFARFGSAIAPLGDL 350 351 DQDGFNDIAIAAPYGGEDKKGIVYIFNGRSTGLNAVPSQILEGQWAARSM 400 401 PPSFGYSMKGATDIDKNGYPDLIVGAFGVDRAILYRARPVITVNAGLEVY 450 451 PSILNQDNKTCSLPGTALKVSCFNVRFCLKADGKGVLPRKLNFQVELLLD 500 501 KLKQKGAIRRALFLYSRSPSHSKNMTISRGGLMQCEELIAYLRDESEFRD 550 551 KLTPITIFMEYRLDYRTAADTTGLQPILNQFTPANISRQAHILLDCGEDN 600 601 VCKPKLEVSVDSDQKKIYIGDDNPLTLIVKAQNQGEGAYEAELIVSIPLQ 650 651 ADFIGWRNNEALARL3CAFKTENQTRQWCDLGNPMKAGTQLLAGLRFS 7 00 701 VHQQSEMDTSVKFDLQIQSSNLFDKVSPWSHKVDLAVLAAVEIRGVSSP 750 751 DHVFLPIPNWEHKENPETEEDVGPWQHIYELRNNGPSSFSKAMLHLQWP 800 801 YKYNNNTLLYILHYDIDGPMNCTSDMEINPLRIKISSLQTTEKNDTVAGQ 85 0 851 GERDHLITKRDLALSEGDIHTLGCGVAQCLKIVCQVGRLDRGKSAILYVK 900 901 SLLWTETFMNKENQNHSYSLKSSASFNVIEFPYKNLPIEDITNSTLVTTN 950 951 VTWGIQPAPMPVPVWVIILAVLAGLLLLAVLVFVMYRMGFFKRVRPPQEE 1000 1001 QEREQLQPHENGEGNSET 1018
SEQ ID NO:394 (38 humana
1 EDNRCASSNAASCARCLALGPECGWCVQEDFISGGSRSERCDIVSNLISK 50 51 GCSVDSIEYPSVHVIIPTENEINTQVTPGEVSIQLRPGAEANFMLKVHPL 100 101 KKYPVDLYYLVDVSASMHNNIEKLNSVGNDLSRKMAFFSRDFRLGFGSYV 150 151 DKTVSPYISIHPERIHNQCSDYNLDCMPPHGYIHVLSLTENITEFEKAVH 200 201 RQKISGNIDTPEGGFDAMLQAAVCESHIGWRKEAKRLLLVMTDQTSHLAL 250 251 DSKLAGIWPNDGNCHLKNNVYVKSTTMEHPSLGQLSEKLIDNNINVIFA 300 301 VQGKQFHWYKDLLPLLPGTIAGEIESKAANLNNLWEAYQKLISEVKVQV 350 351 ENQVQGIYFNITAICPDGSRKPGMEGCRNVTSNDEVLFNVTVTMKKCDVT 400
401 GGKNYAIIKPIGFNETAKIHIHRNCSCQCEDNRGPKGKCVDETFLDSKCF 450
451 QCDENKCHFDEDQFSSESCKSHKDQPVCSGRGVCVCGKCSCHKIKLGKVY 500
501 GKYCEKDDFSCPYHHGNLCAGHGECEAGRCQCFSGWEGDRCQCPSAAAQH 550
551 CVNSKGQVCSGRGTCVCGRCECTDPRSIGRFCEHCPTCYTACKENWNCMQ 600
601 CLHPHNLSQAILDQCKTSCALMEQQHYVDQTSECFSSPSYLRIFFIIFIV 650
651 TFLIGLLKVLIIRQVILQWNSNKIKSSSDYRVSASKKDKLILQSVCTRAV 700
701 TYRREKPEEIKMDISKLNAHETFRCNF 727
SEQ ID N O :395
HUC6D4V1 QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT DYSMH WVRQAPGQGLEWVA RINTETGEPT FADDFRG RFrVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI FYYGRDS WGQGTTLTVSS
SEQ ID N O :396 M arco 1 de V H<QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT>
SEQ 1D N O :397 CDR1 de VH<DYSMH>
SEQ ID N O :398 M a rco 2 de V H<WVRQAPGQGLEWVA>
SEQ ID N O :399 CDR2 de VH<RINTETGEPTFADDFRG>
SEQ ID N 0 :40 0 M arco 3 de V H<RFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI>
S EQ 1D N O :401 CDR3 de VH<fyygrds>
SEQ ID N O:402 M arco 4 de V H<WGQGTTLTVSS>
SEQ ID N O :403
HuC6D4A3 QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT DYSMH WVRQAPGQGLEWVA RINTETGEPTFADDFRG RFTVTLDTSTSVÁYLEIRSLRSDDTAVYFCAT FYYGRDS WGQGTTLTVSSSEQ ID N O:404 M arco 1 de V H<QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT>
SEQ ID N O :405 CD Rl de VH<DYSMH>
SEQ ID N O :406 M arco 2 de V H<WVRQAPGQGLEWVA>
SEQ ID N O :407 C D R 2deV H<rintetgsptfaddfrg>
SEQ ID N O :408 M a rco 3 de V H<RFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI>
SEQ ID N O :409 CDR3 de VH<fyygrds>
SEQ ID N O :410 M arco 4 de V H<WGQGTTLTVSS>
SEQ ID NO:411
HuC6D4B7 QIQLVQSGAKVKKPGASVKISCKASGYTFT DYSMH WVRQAPGQGLEWVA RINTETGEPTFADDFRG RFSVTLDTSTSTAYLEITSLRSDDTAVYFCAI FYYGRDT WGQGTALTVSSSEQ ID N O :412 M arco 1 de V H<QIQLVQ S GAKVKKPGAS VKI SCKAS'GYTFT>
SEQ ID N O :4I3 C D R l de \ U<DYSMH>
SEQ ID N O :414 M arco 2 de V H<WVRQAPGQGLEWVA>
SEQ ID N O :415 CDR2 de VH<RINTETGEPTFADDFRG>
SEQ ID N O :416 M arco 3 de V H<RFS VTL DTS TSTAYLEI TSLR'S DDTAVY FCA1>
SEQ ID N O :417 CDR3 de VH<FYYGRDT>
SEQ ID N O :4I8 M arco 4 de V H<WGQGTALTVSS>
SEQ ID N O :4I9
HuC6D4E5 QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT DYSMH WVRQAPGQGLEWVA RINTETGEPTFADDFRG RFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI FYYGRDT WGQGTTLTVSSSEQ ID N O :420 M a rco 1 de V H<QIQL VQ S GAE VKKPGAS VKI SCKASGYTFT>
SEQ ID N O :42I CD Rl de VH<d y s m h>
SEQ TD N O :422M arco 2 de V H<WVRQAPGQGL EWVA>
SEQ TD N O :423 CDR2 de VH<r in t e t g e pt f a d d fr g>
SEQ ID N O:424M a rco 3 de V H<RFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI>
SEQ ID N O :425 CDR3 de VHFYYGRDT
SEQ TD N O :426M arco 4 de V H<WGQGTTLTVSS>
SEQ ID N O :427
HuC6D4 QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT DYSMH WVRQAPGQGLEWVA RINTETGEPTFADDFRG RFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI FYYGRDT WGQGTTLTVSSSEQ ID N O :428 M a rco 1 de V H<QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT>
SEQ TD N O:429 CDR1 de VHDYSMH
SEQ ID N O :430 M arco 2 de V H<WVRQAPGQGLEWVA>
SEQ TD NO:431 CDR2 de VHRINTETGEPTFADDFRG
SEQ TD N O:432 M arco 3 de V H<RFTVTLDTSTSTAYLElRSLRSDDTAVYFCAI>
SEQ TD N O :433 CDR3 de VHFYYGRDT
SEQ ID N O :434 M arco 4 de V H<w g q g tt lt v ss>
SEQ TD N O :435
C6D4 RGD3 QIQLLQSGPELKKPGETVKI3CKASGYTFT DYSMH WVKQAPGKGL KWVA RINTETGEPTFADDFRG RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI FYYGRDS WGQGTTLTVSSSEQ TD N O :436 M arco 1 de V H<QIQLLQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFT>
SEQ ID N O :437 CDR1 de VH<DYSMH>
SEQ TD N O :438 M arco 2 de V H<WVKQAPGKGL KWVA>
SEQ ID N O :439 CDR2 de VH<RINTETGEPTFADDFRG>
SEQ TD N O :440 M arco 3 de V H<RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAI>
SEQ ID NO:441 CDR3 de VH<FYYGRDS>
SEQ TD N O :442 M arco 4 de V H<WGQGTTLTVSS>
SEQ TD N O :443
HuC6D4-RGD3 QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT DYSMH WVRQAPGQGLEWVA RINTETGEPTFADDFRG RFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI FYYGRDT WGQGTTLTVSSSEQ TD N O:444M arco 1 de V H<QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT>
SEQ ID N O :445 CDR1 de VHDYSMH
SEQ TD N O:446M arco 2 de V H<WVRQAPGQGLEWVA>
SEQ TD N O:447 CDR2 de VHRINTETGEPTFADDFRG
SEQ TD N O:448M arco 3 de V H<RFTVTLDT S T STAYL EI RS L RS DDTAVYFCAI>
SEQ TD N O:449 CDR3 de VHFYYGRDT
SEQ TD N O :450M arco 4 de V H<w g q g tt lt v ss>
SEQ TD NO:451
HUC6D4V1 EIVMTQSPATLSVSPGERVTMSC KS S Q SLLNS RTRKN YLA WYQQKPGQAPRLLIY WASTRES GVPARFS GSGSGTEFTLTIS SVQ SED FAVYYC KQ5YNLLS FGQGTVLEIKR
SEQ TD N O :452M arco 1 de V k<E IVMTQ S PATL SVS PGERVTMSC>
SEQ TD N O :453 CDR1de VkKSSQSLLNSRTRKNYLA
SEQ TD N O :454M arco 2 de V k<WYQQKPGQAPRLLIY>
SEQ TD N O :455 CDR2 de VkWASTRES
SEQ TD N O :456M arco 3 de V k<GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC>
SEQ ID N O :457 CDR3 de VkKQSYNLLS
SEQ TD N O :458M arco 4 de V k<FGQGTVLEIKR>
SEQ TD N O :459
HuC6D4A3<e i v m t q sp at l s v s p ge iv t m s c k ss q s l l n s r s r k n y l a w y q q k p g q a pr l l i y>WASTRES GVPARFSGSG3GTEFTLTI3SVQSEDFAVYYC KQSYNLIS FGQGTVLEIKR
SEQ TD N O :460 M arco 1 de V k<EIVMTQSPATLSVSPGEIVTMSC>
SEQ TD NO:461 C D R ld e V k<KSSQSLLNSRSRKNYLA>
SEQ TD N O :462 M a rco 2 de V k<WYQQKPGQAPRLLIY>
SEQ ID N O :463 CDR2 de Vk<WASTRES>
SEQ TD N O :464 M arco 3 de V k<GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC>
SEQ TD N O :465 CDR3 de Vk<KQSYNLIS>
SEQ TD N O :466 M a rco 4 de V k<FGQGTVLEIKR>
SEQ TD N O :467
HuC6Q4E7 EIVMTQTPVTLSVSPGERVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQAPRLLIY WASTRES DVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC KQSSNL.S FGQGTVLEIKR
SEQ TD N O :468 M a rco 1 de V k<EIVMTQTPVTLSVSPGERVTMSC>
SEQ ID N O :469 CDRl de Vk<k s s q s l ln s r t r k n y l a>
SEQ TD N O :470 M arco 2 de V k<WYQQKPGQAPRLLIY>
SEQ TD N O :471 C D R 2d eV k<WASTRES>
SEQ TD N O:472 M arco 3 de V k<DVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC>
SEQ TD N O :473 C D R 3d eV k<KQSSNLIS>
SEQ TD N O :474 M a rco 4 de V k<FGQGTVLEIKR>
SEQ ID N O:475
HUC6D4E5 EIVMTQSPATLSVSPGERVTMSC KSSQSLLNSRSRKNYLA WYQQKPGQAPRLLIY WASTRES GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC KQSYNLLS FGQGTVLEIKRSEQ TD N O :476 M a rco I de V k<EIVMTQSPATLSVSPGERVTMSC>
SEQ TD N O :478 CD Rl de Vk<KSSQSLLNSRSRKNYLA>
SEQ TD N O :479 M arco 2 de V k<WYQQKPGQAPRLLIY>
SEQ ID N O :480 CDR2 de Vk<WASTRES>
SEQ ID NO:481 M arco 3 de V k<GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC>
SEQ TD N O :482 C D R 3d eV k<kqsyn lls>
SEQ TD N O :483 M a rco 4 de V k<f g q gt vl e i kr>
SEQ TD N O:484
HuCÉD4 EIVMTQSPATLSVSPGERVTMSC KSSQSLLNSRSRKNYLA WYQQKPGQAPRLLIY WASTRES GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC KQSYNLLS FGQGTVLEIKRSEQ TD N O :485 M arco 1 de V k<EIVMTQSPA.TLSVS PGERVTMSC>
SEQ ID N O :486 CDRl de Vk<k s s q s l ln s r s r k n y l a>
SEQ TD N O :487 M arco 2 de V k<WYQQKPGQAPRLLIY>
SEQ ID N O :488 C D R 2d e\ k<WASTRES>
SEQ TD N O :489 M arco 3 de V k<GVPARESGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC>
SEQ TD N O :490 CDR3 de Vk<KQSYNLLS>
SEQ ID N O:491 M a rco 4 de V k<FGQGTVLEIKR>
SEQ TD N O:492
C6E4-RGE3 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC KSSQSLLGRGDLGRLKKNALAWYQQKPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRETGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLLS FGAGTKLELKRSEQ TD N O :493 M arco 1 de V k<E1VMTQSPS SLAVSAGEKVTMSC>
SEQ TD N O :494 C D R l de Vk<KSSQSLLGRGDLGRLKKNALA>
SEQ TD N O :495 M arco 2 de V k<WYQQKPGQSPRLLIY>
SEQ ID N O :496 C D R 2d eV k<WASTRES>
SEQ TD N O :497 M a rco 3 de V k<GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC>SEQ ID N O :498 CDR3 de Vk<KQSYNLLS>
SEQ ID N0 :499 M a rco 4 de V k<FGAGTKLELKR>
SEQ TD N 0 :500
HUC6D4-RGD3<e i v m t q s p a tl s v s p ge rv t m s c k s s qs l l g r g d l g r l k k n a l a w y q q k p g q a p rl li y>GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC KQSYNLLS FGQGTVLEIKRSEQ TD N O:501 M arco 1 de V k<EIVMTQSPATLSVSPGERVTMSC>
SEQ ID N O :502 CDR1 de Vk<KSSQSLLGRGDLGRLKKNALA>
SEQ ID N O :503 M arco 2 de V k<w y q q k p g q a p rl l i y>
SEQ TD N O :504 C D R 2d eV k<WASTRES>
SEQ TD N O :505 M arco 3 de V k<GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC>SEQ TD N O :506 CDR3 deV k<KQSYNLLS>
SEQ TD N O :507 M arco 4 de V k<FGQGTVLEIKR>
SEQ TD N O:508HuC6D4viCDR1 de VH<dysmh>
SEQ TD N O :509HuC6D4viCDR2deVH<rintetgeptfaddfrg>
SEQ TD N O:510<HuC6D4VI>CDR3 de VH<FYYGRDS>
SEQ TD NO:51T<HuC6D4A3>CDRl de VH<CYSMH>
SEQ TD N O:512<iiuC6D4A3>CDR2 de VH<r in t e t g e pt f a d df r g>
SEQ TD N O :513<nuc6c4A3>CDR3 de VH<fyygr ds>
SEQ TD N O:514<HuC6C437>CDRl de VH<d y s m h>
SEQ TD N O :515<HuC6D437>CDR2 de VH<r in t e t g e pt f a d df r g>
SEQ TD N O :516<HUC6B437CDR3>de VH<fyygr dt>
SEQ ID N O:517<HuC6D4E5>CDRl de VH<CYSMH>
SEQ TD N O:518<HuC6D4E5>CDR2 de VH<r in t e t g e pt f a d df r g>
SEQ TD N O:519Huc6D4E5CDR3 de VH<fyygrdt>
SEQ TD N O:520<HuC6D4>CDRl de VH<dysmh>
SEQ TD NO:521<h u c Sd 4>CDR2deVH<r i n t e tg e p t f a d df r g>
SEQ TD N O:522<HuC6D4>CDR3deVH<fyygr dt>
SEQ TD N O:523<CÉD4 r g d 3>CDRl de VH<DYSMH>
SEQ TD N O:524<C6D4-RGD3>CDR2 de VH<RINTETGEPTFADDFRG>
SEQ ID N O :525<C6D4-RGD3>CDR3 de VH<FYYGRDS>
SEQ TD N O :526<h u c>6<d>4-<r g d>3 CDRldeVH<dy sm h>
SEQ TD N O :527<h u c Sd 4-r g d3>CDR2 de VH<ri n te t g e pt f a d df r g>
SEQ TD N O:528<HUC6D4-RGD3>CDR3 de VH<fyygr dt>
SEQ TD N O:529HuC6D4vlCDRl deVk<kssqsllnsrtrknyla>
SEQ ID N O :530<huc>6<d>4<v i>CDR2 de Vk<wastres>
SEQ TD NO:531HUCSD4V1CDR3 de VkKQSYNLLS
SEQ ID NO:532<HuC6D4A3>CDR1 de Vk<KSSQSLLNSRSRKNYLA>
SEQ ID NO:533<HuC6D4A3>CDR2 de vk<WASTRES>
SEQ ID NO:534<h u c 6d 4a 3>CDR3 de Vk<kq synl is>
SEQ ID NO:535Huc6D4B7CDR1deVk<k ss q s l l n s r t r x n y l a>
SEQ ID NO:536HuC6D4B7CDR2deVk<wa s tr es>
SEQ ID NO:537HuC6D4B7CDR3deVk<kq ssnlis>
SEQ ID NO:538<HuC6D4E5>CDR1 de Vk<k ss q s l l n s r s r k n y l a>
SEQ ID NO:539 Hucec475 CDR2 de Vk<wa s tr es>
SEQ ID NO:540<h u c 6d 4e5>CDR3 de Vk<kq synl ls>
SEQ ID NO:541<HuC6D4>CDR1 de Vk<k s s q s l l n s r s r k n y l a>
SEQ ID NO:542<iiuc6i'4>CDR2 de Vk<wa s tr es>
SEQ ID NO:543<h u c s d4>CDR3 de Vk<kq sy nll s>
SEQ ID NO:544<C6Q4 RGD3>CDR1 de vk<KSSQSLLGRGDLGRLKKNALA>
SEQ ID NO:545<C6D4-RGD3>CDR2 de Vk<WASTRES>
SEQ ID NO:546<C6D4-RGD3>CDR3 de Vk<KQSYNLLS>
SEQ ID NO:547<HuC6D4-RGD3>CDR1 de Vk<KSSQSLLGRGDLGRLKKNALA>
SEQ ID NO:548<h u c 6d 4-r g d3>CDR2deVk<w ast re s>
SEQ ID NO:549<HUC6D4-RGD3>CDR3 de Vk<KQSYNLLS>
SEQ ID NO:550 FR1 de cadena pesada<QIQLVQSG (P/A) (E/K) (L/V) KKPG ÍE/A) (T/S)VKISCKASGYTFT>SEQ ID NO:551 FR2 de cadena pesada<WV (K/R) QAPG (K/Q) GL (K/E) WVA>
SEQ ID NO:552 FR3 de cadena pesada<R F( a /t / S ) v (s /t i l ( e /d ) t s (a /t ; s t a y l ÍQ/e ) i (n/r /t )>(H/S)L(K/R)(14/S)(E/D)DTA(T/V)YFCAI
SEQ ID NO:553 FR4 de cadena pesada<wgqgt (t /a ; ltv ss>
SEQ ID NO:554 FRlde cadena ligera (<d>/<e>)<ivmtq>;<s>/<t>)<p>(<s>/<a>/<v>; (<s>/<t>¡<l í a>/<s i v s>(<a>/<p>)<ge>;<k>/<r>/<i>)<vtmsc>SEQ ID NO:555 FR2de cadena ligeraWYQQKPGQ (S/A) PRLLIY
SEQ ID NO:556 FR3de cadena ligera (G/D)<v p>(<d>/A) RF : r/S) GSGSGT (D/E) FTLTISSVQ (A/S) ED (L/F) AVYYCSEQ ID NO:557 FR4de cadena ligera fg (a/q ) gt (k/v )<l e í l>/<i>) kr
SEQ ID NO:558FRldecadenapesada QlQLx 1QSG<x>2<x>3<x>34KKPG<x>4<x>5VKISCKASGYTFTSEQ ID NO:559FR2decadenapesada W Vx6QAPGx7GLx8W x9x 10
SEQ ID NO:560FR3decadenapesada
RFx 17x 18x 19Lx20TSx21 x22TAx23Lx24Ix25x26Lx27x28x29DTAx30 YFCAI
SEQ ID NO:561FR4decadenapesada WGQGTx33LVTVSS
SEQ ID NOí562CDRldecadenapesada DYSMH
SEQ ID NO:563CDR2decadenapesada x l ] Ix 12TETxl 3EPTxl4A D D Fxl5x 16
SEQ lD N O :564CDR3decadenapesada x31YYGRDx32
donde x l = V o L, x2 = A o P, x3 = E o K, x4 = A o E, x5 = S o T, xó = R o K, x7 = Q o K x8 = E o K, x9 = V o M, x 10 = A o G , x l l = R o W , x l 2 = N o K , x l 3 = G o D , x l 4 = F o Y, x l 5 = R , N, K o G, x 16 = G o E , x l 7 = T , A , o S , x l 8 = V o F , x l 9 = T o S, x20 = D o E
SEQ IDN O:565<fri>decadenaligera x40IVMx41Qx42Px43x44Lx45VSx46GEx47VTMSC SEQ IDNO:566FR2decadenaligera W YQQKPGQx49PRLLlY
SEQ IDN O:567FR3decadenaligera x50VPx51RFx52GSGSGTx53FTLTISSVQx54EDx55AVYYC
SEQ IDNO:568FR4decadenaligera FGx56GTx57LEx58KR
SEQ ID NO:569<cdri>de cadena ligera KSSQSLLNSRx48RKNYLA
SEQ ID NO:570CDR2de cadena ligera W AS TRES
SEQ ID NO:571CDR3de cadena ligera KQSYNLLS
donde x40 = E o D, x41 — T o S, x42 = S O T, x43 = A, S O V, x44 = T, S, x45 — S O A, x46 =Po A, x47 =R,K o I,x48=So T, x49 = A o S,x50=Go D,x51= A o D, x52 = S o T, x53 = E o D, x54 = S, D o A, x55 = F o L, x56 = Q o A, x57 = V o K, x58 = I o L.
SEQ IDNO:572 (C6D4) K S SQ S LLN SRSRKNYL A
SEQ IDNO:573 (RGD1) KS SQ S LLGRGDLGN AL A
SEQ IDNO:574 (RGD2) KS SQ S LLN SGRGD LGN AL A
SEQ IDNO:575 (RGD3) KS SQSLLGRGDLGRLKKN ALA
SEQ IDNO:576 (RGD3-1) KS SQ S LLGRGDLGRLKKQKDHN AL A
SEQ IDNO:577 (RGD3-2) KS SQ S LLGRGDLGRLKKQKDN AL A
SEQ IDNO:578 (RGD3-3) KSSQSLLGRGDLGRLKKQKNALA
SEQ IDNO:579 (RGD3-4) KSSQSLLGRGDLGRLKKQNALA
SEQ IDNO:580 (RGD3-6) K S SQ S LLGRGDLGRLKN AL A
SEQ IDNO:581 (RGD3-7) KSSQSLLGRGDLGRLNALA
SEQ IDNO:582 (RGD3-8) KS SQ S LLGRGDLGRN ALA
SEQ IDNO:583 (RGD3-9) KS SQ S LLGRGDLGRLKKQKDHH
SEQ IDNO:584 (RGD3-10) KS SQ S LLGRGDLGRLKKQKDH
SEQ IDNO:585 (RGD3-11) KS SQ S LLGRGDLGRLKKQKD
SEQ IDNO:586 (RGD3-12) KS SQ S LLGRGDLGRLKKQK
SEQ IDNO:587 (RGD3-13) KS SQ S LLGRGDLGRLKKQ
SEQ IDNO:588 (RGD3-14) KS SQ S LLGRGDLGRLKK
SEQ IDNO:589 (RGD3-15) KS SQ SLLGRGDLGRLK
SEQ IDNO:590 (RGD3-16) K S SQ S LLGRGDLGRL
SEQ ID av humanaFLODGTKTVEYAPCRSODl/MDGOGFCOGGFSIDFTKADRVNO:591LLGGPGSFFWQGQ
SEQ ID av de chimpancéFLODGTKTVEYAPCRSODl/MDGOGFCOGGFSIDFTKADRVNO:592LLGGPGS FIW QGQ
SEQ ID av de macacoFLQDGTKTVEYAPCRSQDIDADGQGFCQGGFSIDFTKADRVNO:593 de la IndiaLLGGPGSFFWQGQ
SEQ ID av de macacoFLODGTKTVEYAPCRSOD1IM/9GOGFCOGGFSIDFTKADRVNO:594 cangrejeroLLGGPGSFnVQGQ
SEQIDav de vacaFLQDGTKTVEYAPCRSKNUMDGQGFCQGGFSIDFTKADRVNO: 595LLGGPGSFFWQGQ
SEQIDav de cerdoFLQDGTKTVEYAPCRSKNUM/X7QGFCQGGFSIDFTKADRVNO: 596LLGGPGSFFWQGQ
SEQIDav de caballoFLQDGAKTVEYAPCRSKNUMDGQGFCQGGFSIDFTKADRVNO:597LLGGPGSFFWQGQ
SEQIDav de ratónFLQDGTKTVEYAPCRSKN I/J.4/JGOGFCOGGFSI DFTKADRVNO: 598LLGGPGSFFWQGQ
SEQIDav de rataFLQDGTKTYEY APCRSKNLPA TXrQGF COGGF SIDFTKADRVNO:599LLGGPGSFiY/QGQ
SEQIDav de armadilloFLQDGTKTVEYAPCRSKNL/M-¿>(70GFC0GGFSI DFTKADRVNO:600LLGGPGSFiV/QGQ
SEQIDav de ornitorrincoFLQDGTKTVEYAPCRSRSIiMDGQGFCQGGFSIDFTKADRVLNO:601LGGPGSFFWQGQ
SEQID(38 humanaS A S MffNNIEKLN S V GNDLSRKMAFF SR DF RLGFGSYVDKTVNO:602SPYISIHPERIFfNOCADFNLDCMPPHGYIHVLSLTENITEFEKAVHROKISSEQIDP8 de chimpancéS A S MffNNIEKLN S V GNDLSRKMAFF SRDF RLGFGSYVDKTVNO: 603SPYISIHPERIFfNOCAWW/.DCMPPHGYIHVLSLTENITEFERA V/7/?QKIS
SEQIDp8 de macacoS A S MffNNIEKLN S V GNDLSRKMAFF SRDF RLGFGSYVDKTVNO:604 de la IndiaSPYIS1HPKRIHNOCSI)Y N U KVIP P HG YIH V ES L 1E N I' 1 E P E K A VffiíQKIS
SEQIDp8 de macacoS A S M/íNNIEKLN S V GNDLSRKMAFF SRDF RLGFGSYVDKTVNO:605 cangrejeroSPYISIHPER1HN OCA/) FAXDCMPPHGYIHV LSLTENITEFEKA Vgj?OKIS
SEQIDp8 de vacaS A S MffNNIEKLN S V GNDLSRKMAFF SRDF RLGFGSYVDKTVNO:606SP YISIHPERIHNOCSD YNLDCMP PHGYDTVLSLTENITEFEKA V/fflOKIS
SEQIDp8 de cerdoS A S IVLffNNIEKLNTV GNDLSRKMAFF SRDFRLGF GSY V DKTVNO:607SPYISIHPERIHNOCAPFjVLDCMPPHGYIHVLSLTENITEFEKA VEfflOKIS
SEQIDP8 de caballoS A S M/7NNIEKLNS VGNDLSRKMAFF SRDF RLGFGSYVDKTVNO:608SPYISMPERIEINQGSW AXPCMPPHGYIHVLSLTENITEFEKA VfflfQKIS
SEQIDP8 de ratónSASM/7NNIEKLNSVGNDLSKKMALYSRDFRLGFGSYVDKTNO: 609VSPYISIHPERIHNQCA'DFAXDCMPPHGYIHVLSLTENITEFEK AVJflgQKIS
SEQIDP8 de rataSASMÍ7NNIEKLNSVGNDLSKKMALFSHDFRLGFGSYVDKTNO:610VSPYISIHPERIHNOGVDFAXDCMPPHGYIHVLSLTENITEFEK AV/ZROKIS
SEQIDP8 de armadilloSASMffNNIEKLNSVGNDLSRKMAFFSLDFRLGFGSYVDKTVNO:611SPY1SIHPER1HNQCADF7VXDCMPPHGY1HVLSLTENITEFAK AVi/ffOKIS
SEQIDp8 de ornitorrincoS A S MZ7NNIEKLN S V GNDLS Q KM ADFTRD FRLGF GS YVDKTNO:612VSPYISIHPGRTRNQ C AQ FDXDC MPPHGYIHVLPLTENVTEFE
KAVNKQKIS
SEQ TD N O :623:secuencia de cabeza de integrina av FNLDVDSPAEYSGPEGSYFGFAVDFFVPSASSRMFLLVGAPKANTTQPGIVEGGQVLKC DWSSTRRCQPIEFDATGNRDYAKDDPLEFKSHQWFGASVRSKQDKILACAPLYHWRTE MKQEREPVGTCFLQDGTKTVEYAPCRSQDIDADGQGFCQGGFSIDFTKADRVLLGGPGS FYWQGQLISDQVAE1VSKYDPNVYS1KYNNQLATRTAQAIFDDSYLGYSVAVGDFNGD GiDDFVSGVPRAARTLGMVYlYDGKNMSSLYNFTGEQMAAYFGFSVAATDINGDDYAD VFT G APLFMDRG SDGKLQEV GQ VS V SLQR A S GDF QTTKLN GFE VF ARF G S ATAPLGDLD QDGFNDIAIAAPYGGEDKKGIVYIFNGRSTGLNAVPSQILEGQWAARSMPPSFGYSMKG ATD TDKNGYPD LTV GAFGVDRAIL YR ARP
SEQ ID N O :624
4F1 VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTNYLIE WVKQRPGQGLEWIG VINPGTGGTNYNKKFKV KATLTADKSSSTAYMQLGGLTFDDSAVYFCAR EGHARTYYYAMDY WGQGTSVTVSS SEQ ID NO:625 M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY
SEQ ID NO:628 CDR1 de VHAFTNYLIE
SEQ ID NO:632 M arco2 deV HWVKQRPGQGLEWIG
SEQ ID NO:634 CDR2 de VH VINPGTGGTNYNKKFKV
SEQ ID NO:637 M arco3 deV H KATLTADKSSSTAYMQLGGLTFDDSAVYFCAR SEQ ID NO:651 CDR3 de VH EGNARTYYYAMDY
SEQ ID NO:655 M arco 4deV H WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :656
6B9VII QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVKQRPGQGLEWIG VIHPETGGTNYHAKFKG KATLTADKSS5SAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID N O :629CDR1 de VH AFTDYLIE
SEQ ID N O :632M arco2 deV HWVKQRPGQGLEWIG
SEQ ID N O :635CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFKG
SEQ TD N O :638M arco 3 de V H KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ ID N O :652CDR3 de VH EAGNYIYAMDY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :657
6B9.1 VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVKQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSAYMQ<L>SSLTSGDSAVYFCAR AGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID NO:629CDR1 de VH A FTDYLIE
SEQ ID NO:632M arco 2 de V H WVKQRPGQGLEWIG
SEQ TD NO:636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID NO:638M arco 3 de V H KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ ID NO:653CDR3 de VH AGNYIYAMDY
SEQ TD NO:655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ TD NO:658
Al VH QVQLQQSGAELVRPGASVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSVYMQLSSLTSGD5AVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ TD NO:626M arco I d e V H QVQLQQSGAELVRPGASVKVSCKASGYSEQ ID NO:629CDR1 de VH A FTDYLIE
SEQ TD NO:633M arco 2 de V H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ TDN 0 :636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ TD NO:639M arco 3 d e V H KATLTADKSSSSVYMQLSSLTSGDSAVYECARSEQ TD NO:654CDR3 de VH EAGNYIYAMDY
SEQ TD NO:655M arco 4 d e V H WGQGTSVTVSS
SEQ TD NO:659
A2 VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKS53TAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ TD NO:625 M arco 1 deV H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ TD NO:629CDR1 de VH AFTDYLIE
SEQ TD NO:633 M arco 2 deV H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ TD NO:636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ TD NO:640 M arco 3 deV H KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ TD NO:654CDR3 de VH EAGNYIYAMDY
SEQ TD NO:655 M arco 4 deV H WGQGTSVTVSS
SEQ TD NO:660
ASVH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSAYMQLSGLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSSEQ ID NO:625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ TDN 0 :629CDR1 de VH A FTDYLIE
SEQ TD NO:633M arco 2 de V H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ TD NO:636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ TD NO:641M arco 3 de V H KATLTADKSSSSAYMQLSGLTSGDSAVYFCARSEQ TD NO:654CDR3 de VH EAGNYIYAMDY
SEQ TD NO:655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ TD NO:661
Ail Vil QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDNL1E WVRQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGBSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSSEQ TD NO:625M arco I de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ TD NO:630CDR1 de VH AFTDNLIE
SEQ TD NO:633M arco 2 de V H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ TD NO:636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID NO:638M arco 3 de V H KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYECARSEQ ID N O :654 CDR3 de VHEAGNYIYAMDY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :662
B1VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVKQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSAYMQ'LSSLSSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID N O :629CDR1 de VH AFTDYLIE
SEQ ID N O :632M arco 2 de V H WVKQRPGQGLEWIG
SEQ ID N O :636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID N O :642M arco 3 de V H KATLTADKSSSSAYMQLSSLSSGDSAVYFCARSEQ ID N O :654CDR3 de VH EAGNYIYAMDY
SEQ ID NO:fi55M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :663
B3 VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRFGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSAYHQLSGLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSSEQ ID N O :625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID N O :629CDR1 de VH AFTDYLIE
SEQ ID N O :633M arco 2 de V H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ ID N O :636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID N O :643M arco 3 de V H KATLT ADKSSSSAYMQLSGLTSGDSAVYFCARSEQ ID N O :654CDR3 de VH EAGNYIYAMDY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :664
C4=F10VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG RATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYICAR EAGNY1YAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID N O :629CDR1 de VH AFTDYLIE
SEQ ID N O :633M arco 2 de V H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ ID N O :636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID N O :644M arco 3 de V H RATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ ID N O :654CDR3 de VH EAGNYIYAMDY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :665
C7=DIVH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KATLTAEKSSGSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSSEQ ID N O :625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID N O :629CDR1 de VH AFTDYLIE
SEQ ID N O :633M arco 2 de V H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ ID N O :636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID N O :644M arco 3 de V H RATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ ID N O :654CDR3 de VH EAGNYIYAMDY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :666
D3=F_VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRPGQGLEWIGVINPETGGTNYNAKFRG FÍATLTADKSSSSAYMQLSSLTSDDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :625M arco 1 de V H QVQLQ Q SG A ELVRPGTSVKVSCKA SGYSEQ ID N O :629CDR1 de VH A FTD YLIE
SEQ ID N O :633M arco 2 de V H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ ID N O:636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID N O :645M arco 3 de V H K A TLTA D K SSSSA YM Q LSSLTSD D SA V YFCA RSEQ ID N O:654CDR3 de VH EA GN YIYAM DY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H W G Q G TSVTVSS
SEQ TD N O:667
DlO=E5 VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRPGQGLEWIGVINPETGGTNYNAKFRG KVTLTADKTSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSSEQ ID N O :625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID N O:629 C D R 1deV HAFTDYLIE
SEQ ID N O :633M arco 2 de V H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ ID N O:636 C D R 2deV HVINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID N O:646M arco 3 de V H KVTLTADKTSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ ID N O:654 C D R 3 de V HEAGNYIYAMDY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :668
G4VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRPGQGLEWIGVINPETGGTNYNAKFRG KVTLTADKSSSSAYMQLNSLTSGDSAVYECAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSSEQ ID N O :625 M arco 1 de V HQ V Q LQ Q SG A ELVRPGTSVKVSCKA SGYSEQ ID N O:629 CD RldeV HAFTDYLIE
SEQ ID N O :633M arco 2 de V H W VRQRPGQGLEW IG
SEQ ID N O :636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID N O :647M arco 3 de V H K V TLTA D K SSSSA YM Q LN SLTSG D SA VYFC A RSEQ ID N O:654CDR3 de VH EA GN YIYAM D Y
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H W G Q G TSVTVSS
SEQ ID N O:669
C4VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRPGQGLEWIGVINPETGGTNYNAKFRG RATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSSEQ ID N O:625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID N O :629CDR1 de VH A FTD YLIE
SEQ ID N O :633M arco 2 de V H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ ID N O:636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID N O:650M arco 3 de V H RATLT ADKS S S S A YM QLS SLT SGD S A V YF CARSEQ ID N O:654CDR3 de VH EA GN YIYAM DY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H W G Q G TSVTVSS
SEQ ID N O:670
DIO VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVRQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KVTLTADKTSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSSEQ ID N O:625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID N O :629 C D R 1 de V HAFTDYLIE
SEQ ID N O :633M arco 2 de V H WVRQRPGQGLEWIG
SEQ TD N O:636 C D R 2 de V HVINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID N O :646M arco 3 de V H KVTLTADKTSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ ID NO:654 C D R 3 de V HEAGNYIYAMDY
SEQ ID N O:655M arco 4 de Y7H WGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:671
4FIATIVH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYIIE WVKQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG RATLTADKSSSSAYMQLSSITSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSID N O:625M arco 1 de V H QVQLQQ SGAELVRPGTSVKVSCKASGYID N O:629 C D R 1de VH A FTDYLIE
ID NO:632M arco 2 de V H W VKQRPGQGLEW IG
TD NO:636 C D R 2de VH VINPETGGTNYNAKFRG
ID NO:650M arco 3 de V H RATLTA D KSSSSA YM Q LSSLTSG D SA VYFCA RID NO:654 C D R 3de VH EAGNYIYAM DY
ID NO:655M arco 4 de V H W G QGTSVTVSS
ID NO:672
VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIQ WVKQRPGQGLEWIG
VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
ID N O:625M arco 1 de V H QVQLQQ SGAELVRPGTSVKVSCKASGYID NO:631CDR1 de VH AFTDYLIQ
ID N O:632M arco 2 de V H W VKQRPGQGLEW IG
ID N O:636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
ID N O:638M arco 3 de V H KA TLTA D K SSSSA YM Q LSSLTSG D SA VYFCA RID NO:654CDR3 de VH EAGNYIYAM DY
TD N O:655M arco 4 de V H W G QGTSVTVSS
TD N O:673
VH QVQLQQSGAELVRPGTSVRVSCKASGY AFTDYLIQ WVKQRPGQGLEWIG
VINPETGGTNYNAKFRG KATLTANKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O:625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ TD NO:631 C D R 1 deVH AFTDYLIQ
SEQ TD NO:632M arco 2 de V H WVKQRPGQGLEWIG
SEQ ID NO:636 C D R 2 deVH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID NO:648M arco 3 de V H KA TLTA N KSSSSA YM Q LSSLTSG D SA VYFCA RSEQ ID NO:654 C D R 3de VH EAGNYIYAM DY
SEQ ID N O:655M arco 4 de V H W GQGTSVTVSS
SEQ ID NO:674
4F1E-0VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVPCKASGY AFTDYLIQ WVKQRPGQGLEWIG
VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ TD NO:627M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVPCKASGYSEQ ID NO:631 C D R 1 de V HAFTDYLIQ
SEQ ID NO:632M arco 2 de V H WVKQRPGQGLEWIG
SEQ ID NO:636 C D R 2 de V HVINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID NO:638M arco 3 de V H KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ ID NO:654 C D R 3 de V HEAGNYIYAMDY
SEQ ID N O:655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:675
4F1I9 VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIE WVKQRPGQGLEWIG VINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSSEQ ID N O :625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID N O :629 C D R 1deV HAFTDYLIE
SEQ ID NO:632M arco 2 de V H WVKQRPGQGLEWIG
SEQ ID NO:636 C D R 2 de V HVTNPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID NO:638M arco 3 de V H KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ ID NO:654 C D R 3 de V HEAGNYIYAM DY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:676
4F1H12VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIQ WVKQRPGQGLEWIG VINPECGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSAYLQLSSLTSGDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSSSEQ ID N O :625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID N O :631CDR1 de VH AFTDYLIQ
SEQ ID N O:632M arco 2 de V H WVKQRPGQGLEWIG
SEQ ID NO:636CDR2 de VH VINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID NO:649M arco 3 de V H KATLTADKSSSSAYLQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ ID NO:654CDR3 de VH EAGNYIYAM DY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :677
F9VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGY AFTDYLIQ WVKQRPGQGLEWIGVINPETGGTNYNAKFRG KATLTADKSSSSAYMQLS3LT3GDSAVYFCAR EAGNYIYAMDY WGQGTSVTVSS
SEQ ID N O :625M arco 1 de V H QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYSEQ ID NO:631 C D R 1 de V H A F T D Y L IQ
SEQ ID NO:632M arco 2 de V H WVKQRPGQGLEWIG
SEQ ID NO:636 C D R 2 de V HVINPETGGTNYNAKFRG
SEQ ID NO:638M arco 3 de V H KATLTADKSSSSAYMQLSSLTSGDSAVYFCARSEQ ID NO:654 C D R 3 de V HEAGNYIYAM DY
SEQ ID N O :655M arco 4 de V H WGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:678
4F1VL DIQMTQSPASLSASVGETVTITC RASVNIYSYLV WYQQKQGKSPQLLVH NAKTLAE GVPSRFSG3GSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC QHHHGTPYT EGGGTKLEIKA
SEQ ID N O:692M arco 1 de V L DIQMTQSPASLSASVGETVT1TC
SEQ ID N O :693CDR1 de VL RASVNIYSYLV
SEQ ID NO:694M arco 2 de V L WYQQKQGKSPQLLVH
SEQ ID N O :695CDR2 de VL NAKTLAE
SEQ ID NO:696M arco 3 de V L GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQ ID N O :697CDR3 de VL OHHHGTPYT
SEQ ID NO:698M arco 4 de V L F GGGTKLEIK A
SEQ ID NO:679
6B9VL DIEMTQTPASLSASVGETVTITC PASEN1YSYLV WYQQKQGKSPQVLVY NAKTLAE GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC QHHNGTPYT FGGGTKLEIKñ
SEQ ID N O :699 M a rco 1 de V LDIEMTQTPASLSASVGETVTITC
SEQ ID N 0 :700 C D R l d e V LRASENIYSYLV
SEQ ID NO:701M arco 2 de V L WYQQKQGKSPQVLVY
SEQ ID N O :695 C D R 2 deVL NAKTLAE
SEQ ID N O :696M arco 3 de V L GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQ ID NO:702 CDR3 de VL OHHNGTPYT
SEQ ID NO:698 M arco 4 de VL FGGGTKLEIKA
SEQIDNO:680
6E9.LVL DIVMTQSPASLSASVGETVTITC RASVHIYSYLV WYQQKQGKSPQLLVH NAKTLAE GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIKASEQ ID NO:703M arco 1 de V L DIVMTQSPASLSASVGETVTITC
SEQ ID N O:693 C D R 1 de V LRASVNIYSYLV
SEQ ID NO:694M arco 2 de V L WYQQKQGKSPQLLVH
SEQ ID N O:695 C D R 2 de V LNAKTLAE
SEQ TD N O:696M arco 3 de V L GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQ ID N O:697 C D R 3 de V LQHHHGTPYT
SEQ ID NO:698M arco 4 de V L FGGGTKLEIKA
SEQ ID NO:681
Al =A2 =C4 =C7= Di = LIO=ES= t i =FIO=G4VL DIVMTQSPASLSASVGETVTITC
RASVNIYSYLV WYQQKQGKSPQLLVH NAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC
QHHHGTPYT FGGGTKLEIKASEQ TD N O:703M arco 1 de V L DIVM TQSPASLSASVGETVTITC
SEQ ID N O:693CDR1 de VL RA SV N IYSYLV
SEQ ID NO:694M arco 2 de V L W YQQKQGKSPQLLVH
SEQ ID N O:695CDR2 de VL NAKTLAE
SEQ ID N O:696M arco 3 de V L GVPSRFSGSGSGTQFSLKIN SLQPEDFGSYYCSEQ ID NO:697CDR3 de VL OHHHGTPYT
SEQ ID N O:698M arco 4 de V L FGGGTKLEIKA
SEQ ID NO:682
A8 VL DIVMTQSPASLSASVGETVTITC RASVNIYSYLV WYQQKQGKSPQLLVH GVPSRFSG3GSGTQFSLKINSVQPEDFGSYYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIKA
SEQ ID NO:703M arco 1 de V L DIVM TQSPASLSASVGETVTITC
SEQ ID N O:693CDR1 de VL RA SV N IYSYLV
SEQ ID NO:694M arco 2 de V L W YQQKQGKSPQLLVH
SEQ ID N O:695CDR2 de VL NAKTLAE
SEQ ID NO:696M arco 3 de V L GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQ ID N O:697CDR3 de VL OHHHGTPYT
SEQ ID NO:698M arco 4 de V L FGGGTKLEIKA
SEQ ID N O:683
Al1 VL HIVMTQSPASLSASVGETVTITC RASVNIYSYLV WYQQKQGKSPQLLVH NAKTLAE GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIKASEQ ID NO:704M arco 1 de V L HIVMTQSPASLSASVGETVTITC
SEQ ID N O:693 C D R 1 de V LRASVNIYSYLV
SEQ ID NO:694M arco 2 de V L WYQQKQGKSPQLLVH
SEQ TD N O:695 C D R 2 de V LNAKTLAE
SEQ ID N O:696M arco 3 de V L GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQ ID N O:697 C D R 3 de V LQHHHGTPYT
SEQ TD NO:698M arco 4 de V L FGGGTKLEIKA
SEQ ID NO:684
B1VL BIVMTQSPASISASVGETVTITC RASVNIYSYBV WYQQKQGKSPQILVH NAKTLAE GVP5RFSG3GSGTQFSLKINSLQPEDVG5YYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIIÍA
SEQTDNO:703M arco 1 deV L DIVMTQSPASLSASVGETVTITC
SEQTDNO:693 CDR1 de VL RASVNIYSYLV
SEQIDNO:694M arco2deV L W YQQKQGKSPQLLVH
SEQTDNO:695 CDR2 de VL NAKTLAE
SEQTDNO:696M arco 3 deV LGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQTDNO:697 CDR3 de VL OFIHHGTPYT
SEQTDNO:698M arco 4 deV LFGGGTKLEIKA
SEQIDNO:685
B3VL DIVMTQSPASLSASVGETVTITC RASVNIYSYLV WYQQKQGKSPQLLVH NAKTLAE GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIKA SEQIDNO:703M arco 1 de V L DIVMTQSPASLSASVGETVTITC
SEQIDNO:693 CDR1 de VLRASVNIYSYLV
SEQTDNO:694M arco 2 de V L WYQQKQGKSPQLLVH
SEQTDNO:695 CDR2 de VLNAKTLAE
SEQTDNO:696M arco 3 de V L GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQTDNO:697 CDR3 de VL OHHHGTPYT
SEQTDNO:698M arco 4 de V L FGGGTKLEIKA
SEQTDNO:686
D10=E5 VL B1VMTQSPASLSASVGETVTITC RASVNIYSYLV WYQQKQGKSPQLLVH NAKTLAE GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIKA SEQTDNO:703M arco 1 de V L DIVMTQSPASLSASVGETVTITC
SEQTDNO:693 CDR1 de VLRASVNIYSYLV
SEQTDNO:694M arco 2 de V L WYQQKQGKSPQLLVH
SEQTDNO:695 CDR2 de VLNAKTLAE
SEQTDNO:696M arco 3 de V L GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQTDNO:697 CDR3 de VL OHHHGTPYT
SEQTDNO:698M arco 4 de V L FGGGTKLEIKA
SEQTDNO:687
C4VL DIVMTQSPASLSASVGETVTITC RASVNIYSYLV WYQQKQGKSPQLLVH NAKTLAE GVFSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIKR SEQTDNO:703M arco 1 deV L DIVMTQSPASLSASVGETVTITC
SEQTDNO:693 CDR1 de VL RASVNIYSYLV
SEQTDNO:694M arco2deV L WYQQKQGKSPQLLVH
SEQTDNO:695 CDR2 de VL NAKTLAE
SEQTDNO:696M arco 3 de V L GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQTDNO:697 CDR3 de VLOHHHGTPYT
SEQTDNO:706M arco 4 de V L FGGGTKLEIKR
SEQTDNO:688
DIOVL DIEMTQTPASLSASVGETVTITC RASVNIYSYDV WYQQKQGKSPQLLVH NAKTLAE GVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIKR SEQTDNO:699M arco 1 de V L DIEMTQTPASLSASVGETVTTTC
SEQTDNO:693 CDR1 deVL RASVNIYSYLV
SEQTDNO:694M arco 2 de V L WYQQKQGKSPQLLVH
SEQTDNO:695 CDR2 de VLNAKTLAE
SEQ ID NO:696 M arco 3 de Y LGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQ ID NO:697 CDR3 de VLOHHHGTPYT
SEQ ID NO:706 M arco 4 de V LFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO:689
4F1E1= 1F1G3=4F1B5= 4FlGll =4F1A9 =4F1B9 =4F1H9 =4F1D10 =4F1F9 =4F1F10= 4b11111= 4F1H12VL DIVMTQSPASLSASVGETVFITC RASVNIYSYLV WYQQKQGKSPQLLVH NñKTLAE GVPSRFSGSGSGTOFSLKINSLOPEDFGSYYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIKA SEQ ID NO:703 M arco 1 de V LDIVMTQSPASLSASVGETVTITC
SEQ ID NO:693 CDR1 de VLRASVNIYSYLV
SEQ ID NO:694 M arco 2 de V LWYQQKQGKSPQLLVH
SEQ ID NO:695 CDR2 de VLNAKTLAE
SEQ ID NO:696 M arco3 deV LGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQ ID NO:697 CDR3 de VLOFIHHGTPYT
SEQ ID NO:698 M arco 4deV LFGGGTKLE1KA
SEQ ID NO:690
4FA1LVL DIWTQ£PASLSASVGETVTITC RASVNIYSYLV WYQQKQGKSPQLLVH NAKTLAE GVPSRFSGSGSGTQFSLKIMSLQPEDFGSYYC QHHHGTPYT FGGGTKLEIKA SEQ ID NO:705 M arco 1 de V LDIVVTQSPASLSASVGETVTITC
SEQ ID NO:693 CDR1 de VLRASVNIYSYLV
SEQ ID NO:694 M arco 2 de V LWYQQKQGKSPQLLVH
SEQ ID NO:695 CDR2 de VLNAKTLAE
SEQ TD NO:696 M arco 3 de V LGVPSRFSGSGSGTQFSLKTNSLQPEDFGSYYCSEQ ID NO:697 CDR3 de VLQHHHGTPYT
SEQ ID NO:698 M arco 4 de V LFGGGTKLEIKA
SEQ ID NO:709aVpó: GRGDLGRLKK
SEQ ID NO:710allbp3: GRGDSP
SEQ ID NO:711allbp3: AKQRGDV
SEQ ID NO:712: RGDLGRLKK - bucle de L-TGFp
SEQ ID NO:713: DDHGRGDLGRLK (secuencia de TGFB3)
SEQ ID NO: 714 TGBF1 MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGE VPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIY MFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWL SFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDTNGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLL MATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWTHEPKGYHANFCL GPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCYPQALEPLPrVYYVGRKPKVEQLSNMrVRSC KCS
SEQ ID NO: 715 TGEB2
MF1Y C V LS AFLILHL VTVALSLS T C STLDMDQFMRKRIEAIRGQIL SKLKLTS P PEDYPEP EE VPPEV ISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDV SAMEKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEGEWL SFDVTDAVHEWLPSYRLESQQTNRRKKRALDAAYCFRVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEP KGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLS NMIVKSCKCS
SEQ ID NO: 716 TGFB3 MKMHLQRALVVLALLNFATVSLSLSTCTTLDFGFIIKKKRVEATRGQILSKLRLTSPPEPTVTHVPY QVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVF RFNVSSVEKNRTNLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYTGGKNLPTRGTAE WLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEIS1HCPCHTFQPNGDILEN1HEVME1KFKGVDNEDDHGRGD LGRLKKQKQHHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKRALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQD LGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVEGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTTLYY VGRTPKVEQLSNMYVKSCKCS
SEQ ID NO: 717 C 6D 4vk
DIVMTQSPSSIAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLMTYQQKPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQ AEDLAVYYCKQSYNLLSFGAGTKLELKñADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTD QDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEA.THKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:718 C6D4-RDG1 KSSQSLLGRGDLGNALA
SEQ ID NO:719 C6D4-RDG2 KSSQSLLNSGRGDLGNALA
SEQ ID NO:720 C6D4-RDG3 KSSQSLLGRGDLGRLKKNALA
SEQ ID N 0 721 - GRGDLGRLK
SEQ ID NO:722
C6E4 Vil QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFT DYSMI1 WVKQAPGKGLKWVA RINTETGEPTFADDFRG RE’AVSLETSASTAYLQINNLKNSDFATYFCAI FYYGRDS tíGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:732M arco 1 de V H QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTSEQ ID NO:733 CDR1 de VH DYSMH
SEQ ID NO:734M arco 2 de V H WVKQAPGKGLKWVA
SEQ ID NO:735 CDR2 de VH RINTETGEPTFADDFRG
SEQ ID NO:736M arco 3 de V H RFAVSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAISEQ ID NO:737 C D R 3 de VH F Y Y G R D S
SEQ ID NO:738 M arco 4 de VH WGQGTTLTVSS
SEQIDN O :723
HüC6D4 VI VH QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT DYSMH WVRQAPGQGLEWVA RINTETGEPTFADDFRG RFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI FYYGRDS WGQGTTLTVSSSEQTDN O :739 M arco 1 de V H QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT SEQIDN O :733C D R ld e V H DYSM H
SEQIDN O:740 M a rco 2 de V H WVRQAPGQGLEWVA
SEQTDN O :735CDR2 de VH RINTETGEPTFADDFRG
SEQTDNO:741 M arco 3 de V H RFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI SEQIDN O :737CDR3 de VH FYYG RD S
SEQIDN O :738 M arco 4 de V H WGQGTTLTVSS
SEQTDN O:724
MutcloneA3 VH QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT DYSMH WVRQAPGQGLEWVA RINTETGEPTFADDFRG RFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI FYYGRDS WGQGTTLTVSSSEQIDN O :739 M arco 1 de V H QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT SEQTDN O :733CDR1 de VH DYSM H
SEQTDNO:740 M arco 2 de V H WVRQAPGQGLEWVA
SEQIDN O :735CDR2 de VH RIN TETGEPTFADDFRG
SEQIDNO:741 M arco 3 de V H RFTVTLDTSTST AYLEIRSLRSDDTAVYFCAI SEQIDN O :737CDR3 de VH FY YG RD S
SEQTDN O:738 M arco 4 de V H WGQGTTLTVSS
SEQTDN O :725
Mutclone B7 VH QIQLVQSGAKVKKPGASVKISCKASGYTFT DYSMH WVRQAPGQGLEWVA RINTETGEPTFADDFRG RFSVTLDTSTSTAYLEITSLRSDDTAVYFCAI FYYGRDT WGQGTTLTVSSSEQIDN O:742 M arco 1 de V H QIQLVQSGAKVKKPGASVKISCKASGYTFT SEQTDN O :733CDR1 de VH DYSMH
SEQTDN O:740 M a rco 2 de V H WVRQAPGQGLEWVA
SEQIDN O :735CDR2 de VHRINTETGEPTFADDFRG
SEQTDN O:743 M arco 3 de V H RFSVTLDTSTSTAYLEITSLRSDDTAVYFCAI SEQIDNO:744CDR3 de VH FY YG RD T
SEQIDN O:738 M a rco 4 de V H WGQGTTLTVSS
SEQIDN O :726
Mutclone E5 VH QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT DYSMH WVRQAPGQGLEWVA RINTETGEPTFADDFRG RFTVTLDTSTSTAYLEIRSLRSDDTAVYFCAI FYYGRDT WGQGTTLTVSSSEQTDN O :739 M arco 1 de V H QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFT SEQIDN O :733C D R ld e V H DYSM H
SEQIDN O:740 M arco 2 de V H WVRQAPGQGLEWVA
SEQTDN O :735CDR2 de VH RINTETGEPTFADDFRG
SEQTDN O :74I M arco 3 de V H RFTVTLDTSTST AYLEIRSLRSDDTAVYFCAI SEQIDN O:744CDR3 de VH FYYG RD T
SEQIDN O :738 M arco 4 de V H WGQGTTLTVSS
SEQIDN O :727
C6D4VK DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLLS FGAGTKLELKR
SEQ ID N O :745M arco 1 de V K DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCSEQ ID N O:746CDR1 de VK KSSQSLLNSRTRKNYLA
SEQ ID N O:747M arco 2 de V K WYQQKPGQ SPRLLIY
SEQ ID N O:748CDR2 de VK WASTRES
SEQ ID N O:749M arco 3 de V K GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCSEQ ID N O :750CDR3 de VK KQSYNLLS
SEQ ID NO:751M arco 4 de V K FG AGTKLELKR
SEQ TD N O :728
HuC6D4Vi VK EIVMTQSPATLSVSPGERVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQAPRLLIY WASTRES GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVOSEDFAVYYC KOSYNLLS FGQGTVLEIKRSEQ ID N O:752M arco 1 de V K EIVMTQSPATLSVSPGERVTMSC
SEQ ID N O:746C D R ld eV K KSSQSLLNSRTRKNYLA
SEQ TD N O:747M arco 2 de V K WYQQKPGQSPRLLIY
SEQ ID N O:748CDR2 de VK WASTRES
SEQ ID N O :753M arco 3 de V K GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCSEQ ID N O :750CDR3 de VK KQSYNLLS
SEQ ID N O :754M arco 4 de V K FGQGTVLEIKR
SEQ ID N O :729
MuLcloneA3 VK EIVMTQSPATLSVSPGEIVTMSC KSSQSLLNSRSRKNYLA WYQQKPGQAPRLLIY WASi'RES GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC KQSYNLLS FGQGTVLEIKR
SEQ ID N O :755M arco 1 de V K EIVMTQSPATLSVSPGEIVTMSC
SEQ ID N O :756C D R ld eV K KSSQSLLNSRSRKNYLA
SEQ ID N O:747M arco 2 de V K W YQQKPGQSPRLLIY
SEQ ID N O:748CDR2 de VK WASTRES
SEQ ID N O :753M arco 3 de V K GVPARFSGSGSGTEFTLTTSSVQSEDFAVYYCSEQ TD N O:750CDR3 de VK KQSYNLLS
SEQ ID N O :754M arco 4 de V K FGQGTVLEIKR
SEQ ID N O:730
MutcloneB7 VK EIVMTQTPVTLSVSPGERVTMSC KSSQSLLNSRTRKNYLA WYQQKPGQAPRLLIY WASTRESBVPARFSG5GSGTEFTLTISSVQ5EDFAVYYC KQSSNLLS FGQGTVLEIKR
SEQ ID N O:757M arco 1 de V K EIVMTQTPVTLSVSPGERVTMSC
SEQ ID N O:746C D R ld eV K KSSQSLLNSRTRKNYLA
SEQ ID N O:747M arco 2 de V K WYQQKPGQSPRLLIY
SEQ ID N O:748CDR2 de VK WASTRES
SEQ ID N O :758M arco 3 de V K DVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCSEQ ID N O:750CDR3 de VK KQSYNLLS
SEQ ID N O :754M arco 4 de V K FGQGTVLEIKR
SEQ ID NO:731
Mutclone E5 VK EIVMTQSPATLSVSPGERVTMSC KSSQSLLNSRSRKNYLA WYQQKPGQAPRLLIY WASTRESGVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC KQSYNLLS FGQGTVLEIKRSEQ ID N O :752M arco 1 de V K EIVMTQSPATLSVSPGERVTMSC
SEQ ID N O :756C D R ldeV K KSSQSLLNSRSRKNYLA
SEQ ID N O:747M arco 2 de V K W YQQKPGQSPRLLIY
SEQ TD N O:748CDR2 de VK WASTRES
SEQ ID N O :753M arco 3 de V K GVPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCSEQ ID NO:750 CDR3 de VK KQSYNLLS
SEQ ID NO:754 Marco 4 de VK FGQGTVLE1KR
SEQ ID N O:755 - E8 -M arco 3 deV L -GVPSRFSGSGSGTRFSLKINSLQPEDFGSYYCSEQ ID N O:756 - RGDL
SEQ ID NO:757a v DADGQ
SEQ ID NO:758a v SFYWQ
SEQ ID NO:759a v FDDSY
SEQ ID NO:760KQDKILACAPLYHWRTEMKQEREPVGTCFLQDGTKTVEYAPCRSQDIDADGQGFCQGG F SIDFTK ADRVLLGGPG SF YW QGQLISDQ VAEIV SK YDPN VY SIK YNN QL ATRT AQ AIFD
SEQ ID N O:765 - KSSQSLLGRGDLGRLKK
SEQ ID N O:766 -C6H - VH C D R 1 - TFTDYSMH
SEQ ID NO:767 -C6H - VH CDR2 - RINTETGEPTFADDFRG
SEQ ID N O:768 -C6H - VH CDR3 - FYYGRDS
SEQ ID N O:877FR2 de cadena pesada<w v (k /R) q a p g (k /q )g l (k /e )w (v /m |(a /g )>
SEQ ID N O:878FR3 de cadena pesada
RF(A/T/S)(V/F)(S/T)L(E/D)TS(A/T)(S/T)TA(YSEQ ID N O:879FR4 de cadena pesada
SEQ ID NO:880FR1de cadena ligera
(D/E)IVM(T/S)Q(S/T)?(S/A/Vj(S/T)L(A/S)VS(A/P)GE(K/R/I)VTMSC
SEQ ID NO:881FR2 de cadena ligera<wyqqkpgo ;s/a ; p r l l i y>
SEQ ID N O:882FR3 de cadena ligera
(G/D)VP(D/ñ)RF(T/S)GSGSGT(D/E)FTLTISSVQ(A/S/CiED(L/F)AVYYC
SEQ ID NO:883FR4<d e c a d e n a l ig e r a F G (a /q ) gt (k/v ) le (í /l i ) kr>

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une específicamente a avp8 humana y bloquea la unión del péptido TGFp a avp8, en donde el anticuerpo comprende:
CDR1 SEQ ID NO:520, CDR2 SEQ ID NO:521 y CDR3 SEQ ID NO:522 de la cadena pesada; y CDR1 SEQ ID NO:541, CDR2 SEQ ID NO:542 y CDR3 SEQ ID NO:543 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:562, CDR2 SEQ ID NO: 563 y CDR3 SEQ ID NO: 564 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:569, CDR2 SEQ ID NO: 570 y CDR3 SEQ ID NO: 571 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:313, CDR2 SEQ ID NO: 314 y CDR3 SEQ ID NO: 315 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:334, CDR2 SEQ ID NO: 335 y CDR3 SEQ ID NO: 336 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:319, CDR2 SEQ ID NO: 320 y CDR3 SEQ ID NO: 321 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:340, CDR2 SEQ ID NO: 341 y CDR3 SEQ ID NO: 342 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:316, CDR2 SEQ ID NO: 317 y CDR3 SEQ ID NO: 318 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:337, CDR2 SEQ ID NO: 338 y CDR3 SEQ ID NO: 339 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:322, CDR2 SEQ ID NO: 323 y CDR3 SEQ ID NO: 324 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:343, CDR2 SEQ ID NO: 344 y CDR3 SEQ ID NO: 345 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:322, CDR2 SEQ ID NO: 323 y CDR3 SEQ ID NO: 324 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:346, CDR2 SEQ ID NO: 347 y CDR3 SEQ ID NO: 348 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:322, CDR2 SEQ ID NO: 323 y CDR3 SEQ ID NO: 324 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:349, CDR2 SEQ ID NO: 350 y CDR3 SEQ ID NO: 351 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:325, CDR2 SEQ ID NO: 326 y CDR3 SEQ ID NO: 327 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:352, CDR2 SEQ ID NO: 353 y CDR3 SEQ ID NO: 354 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:325, CDR2 SEQ ID NO: 326 y CDR3 SEQ ID NO: 327 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:355, CDR2 SEQ ID NO: 356 y CDR3 SEQ ID NO: 357 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:325, CDR2 SEQ ID NO: 326 y CDR3 SEQ ID NO: 327 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:358, CDR2 SEQ ID NO: 359 y CDR3 SEQ ID NO: 360 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:367, CDR2 SEQ ID NO: 368 y CDR3 SEQ ID NO: 369 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:373, CDR2 SEQ ID NO: 374 y CDR3 SEQ ID NO: 375 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:364, CDR2 SEQ ID NO: 365 y CDR3 SEQ ID NO: 366 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:373, CDR2 SEQ ID NO: 374 y CDR3 SEQ ID NO: 375 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:331, CDR2 SEQ ID NO: 332 y CDR3 SEQ ID NO: 333 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:382, CDR2 SEQ ID NO: 383 y CDR3 SEQ ID NO: 384 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:379, CDR2 SEQ ID NO: 380 y CDR3 SEQ ID NO: 381 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:361, CDR2 SEQ ID NO: 362 y CDR3 SEQ ID NO: 363 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:331, CDR2 SEQ ID NO: 332 y CDR3 SEQ ID NO: 333 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:361, CDR2 SEQ ID NO: 362 y CDR3 SEQ ID NO: 363 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:508, CDR2 SEQ ID NO: 509 y CDR3 SEQ ID NO: 510 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:529, CDR2 SEQ ID NO: 530 y CDR3 SEQ ID NO: 531 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:511, CDR2 SEQ ID NO: 512 y CDR3 SEQ ID NO: 513 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:532, CDR2 SEQ ID NO: 533 y CDR3 SEQ ID NO: 534 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:514, CDR2 SEQ ID NO: 515 y CDR3 SEQ ID NO: 516 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:535, CDR2 SEQ ID NO: 536 y CDR3 SEQ ID NO: 537 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:523, CDR2 SEQ ID NO: 524 y CDR3 SEQ ID NO: 525 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:544, CDR2 SEQ ID NO: 545 y CDR3 SEQ ID NO: 546 de la cadena ligera; o
CDR1 SEQ ID NO:526, CDR2 SEQ ID NO: 527 y CDR3 SEQ ID NO: 528 de a cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO:547, CDR2 SEQ ID NO: 548 y CDR3 SEQ ID NO: 549 de la cadena ligera.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende además secuencias marco de la cadena pesada FR1, FR2, FR3 y FR4 como SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 560 y SEQ ID NO: 561, respectivamente, y las secuencias marco de la cadena ligera FR1, FR2, FR3 y FR4 como SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 567 y SEQ ID NO: 568, respectivamente.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende además secuencias marco de la cadena pesada FR1, FR2, FR3 y FR4 como SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 552 y SEQ ID NO: 553, respectivamente, y las secuencias marco de la cadena ligera FR1, FR2, FR3 y FR4 como SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 556 y SEQ ID NO: 557, respectivamente.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 427.
5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 484.
6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 427 y la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 484.
7. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está humanizado.
8. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está enlazado a un marcador detectable.
9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un método para potenciar una respuesta inmunitaria a una infección vírica en un individuo humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente de dicho anticuerpo al individuo, potenciando de esta manera la respuesta inmunitaria a la infección vírica.
11. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 10, en donde la infección vírica es una infección por hepatitis.
12. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 11, en donde la infección vírica es una infección por hepatitis B.
13. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un método para potenciar una respuesta inmunitaria a un cáncer en un individuo humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente de dicho anticuerpo al individuo, potenciando de esta manera la respuesta inmunitaria al cáncer.
14. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 13, en donde el cáncer es cáncer de pulmón.
15. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 13, en donde el cáncer es un cáncer metastásico.
16. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 13, en donde el cáncer es un cáncer primario.
17. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un método para potenciar una respuesta inmunitaria aH. pylorien un individuo humano, comprendiendo el método administrar una cantidad suficiente de dicho anticuerpo al individuo, potenciando de esta manera la respuesta inmunitaria aH. pylori.
18. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 17, en donde el individuo humano tiene una úlcera péptica, carcinoma gástrico o linfoma MALT.
19. Un anticuerpo que se une específicamente a avp8 humana y que comprende CDR1 SEQ ID NO: 299, CDR2 SEQ ID NO: 301, y CDR3 SEQ ID NO: 303 de la cadena pesada y CDR1 SEQ ID NO: 307, CDR2 (SEQ ID NO: 309) y CDR3 (SEQ ID NO: 311) de la cadena ligera humanas.
20. El anticuerpo de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo está enlazado a un marcador detectable.
21. Un método para detectar la presencia, la ausencia o la cantidad de avp8 humana en una muestra, comprendiendo el método,
poner en contacto el anticuerpo de la reivindicación 19 o 20 con la muestra, y
detectar o cuantificar la unión del anticuerpo a la muestra.
22. El método de la reivindicación 21, en donde la muestra es una muestra fijada con formalina.
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