ES2996944T3

ES2996944T3 - Method for producing cd3-positive cell

Info

Publication number: ES2996944T3
Application number: ES19847695T
Authority: ES
Inventors: Shin Kaneko; Yohei Kawai; Suguru Arima; Maiko Takiguchi; Kazuhide Nakayama; Yoshiaki Kassai; Akira Hayashi
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Kyoto University NUC
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Kyoto University NUC
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2025-02-13
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: TW202434719A; EP3835415A4; MX2021001528A; AU2019318021B2; CN112567025B; DK3835415T3; AU2019318021A1; CN119709615A; KR102847265B1; JP7678508B2; WO2020032179A1; KR20210044231A; EP4455166A2; BR112021002365A2; EP3835415B1; CA3107421A1; SG11202100829SA; PL3835415T3; US20210301260A1; IL280323A

Abstract

Para hacer posible el suministro constante de células T diferenciadas, la presente invención proporciona: un método para la producción o cultivo de expansión de una célula CD3-positiva en el que el CD3, que sirve como marcador de células T, se expresa en una membrana celular; y un kit de cultivo de expansión para una célula CD3-positiva. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir células CD3-positivas

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un método de producción o a un método de cultivo de expansión de células CD3-positivas (o células CD3-positivas CD197-positivas), que incluye una etapa de cultivo de células CD3-positivas en presencia de un agonista del complejo CD3/TCR, fibronectina o una variante de la misma, y un agonista CD30, y a un kit para el cultivo de expansión de células CD3-positivas. La presente invención también se refiere a un método para mantener células CD3-positivas como células CD3-positivas CD197-positivas, que incluye una etapa de estimulación de una señal CD30 en las células CD3-positivas, y a un kit para mantener células CD3-positivas como células CD3-positivas CD197-positivas.

(Antecedentes de la invención)

Se ha demostrado que la inmunoterapia tiene un fuerte efecto de prolongación de la vida incluso en cánceres para los cuales los tratamientos convencionales no son efectivos y se está convirtiendo en una terapia líder en el tratamiento del cáncer. La terapia CART, que incluye la transferencia de células T autólogas transfectadas con el gen del receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-CD19, muestra una alta tasa de remisión completa para las neoplasias malignas de células B, y la FDA aprobó dos terapias CART para la leucemia linfoblástica aguda de células B y el linfoma difuso de células B grandes en 2017. Además, se están realizando muchos ensayos clínicos para la terapia con células TCR-T en la que se introduce un gen del receptor de células T (TCR) que reconoce el antígeno de las células cancerosas. Si bien estas terapias con células T modificadas genéticamente que utilizan las propias células T de los pacientes muestran resultados clínicos extremadamente superiores, implican transporte, modificación genética, cultivo celular y similares de células T. Procesos tan complicados que requieren varias semanas o más dificultan la reducción de costes y el control de calidad. Además, dado que conducen a la pérdida de oportunidades de tratamiento para pacientes con cáncer de rápido crecimiento, existe una fuerte demanda del desarrollo de una terapia con células T alogénicas lista para usar. Hasta el momento se han descrito un método para el cultivo de expansión de células T recogidas de pacientes, un método para producir linfocitos Tc1 CD8-positivos o linfocitos Tc2 CD8-positivos poniendo en contacto una población de células T con un anticuerpo agonista anti-CD3 y un anticuerpo agonista anti-CD30 (documento de patente 1), un método para el cultivo de expansión de células T específicas de tumores obteniendo una población de células T de un paciente con cáncer y poniendo en contacto la población de células T con un anticuerpo agonista anti-CD3, un anticuerpo anti-CD28 y un inhibidor de VEGF (documento de patente 2). Sin embargo, las células T derivadas de donantes sanos o de pacientes tienen una capacidad proliferativa limitada y el número de células T modificadas genéticamente que pueden producirse a partir de células T que pueden recuperarse mediante una sola aféresis es limitado. Además, se ha informado que el cultivo de expansión de células T mediante estimulación con TCR provoca un aumento transitorio en la expresión de CCR7 (CD197), que es un marcador de superficie celular de células ingenuas y células T de memoria, seguido de desaparición varios días después (documento no patente 1). Además, se ha informado que ser una célula T de memoria ("persistencia de células T") es importante para la actividad antitumoralin vivo,y que se observó un alto efecto antitumoralin vivoal aumentar el número de células CART que se va a administrar, que es una célula T de memoria (documento no patente 2). Por lo tanto, la baja expresión de CD197 en la población de células obtenida mediante cultivo de expansión de células T no fue adecuada para el tratamiento del cáncer.

Por otra parte, dado que las células T diferenciadas a partir de células madre pluripotentes como las células iPS, las células ES y similares (células T diferenciadas) están hechas de células madre pluripotentes que teóricamente pueden proliferar infinitamente, las células T modificadas se pueden producir infinitamente en teoría. Sin embargo, un método para el cultivo de expansión de células iPS manteniendo la pluripotencia requiere un alto coste e implica dificultades técnicas. Por lo tanto, un método para obtener células T diferenciadas, particularmente células T CD197-positivas, mediante la proliferación de una gran cantidad de células iPS tiene una limitación. Como resultado, se ha demandado otro enfoque para obtener una gran cantidad de células T, particularmente células T CD197-positivas.

[Lista de documentos]

[Documentos de patente]

Documento de patente 1: WO 2003/038062

Documento de patente 2: US-A-2014/0255368

[Documentos de no patente]

Documento no de patente 1: Sallusto et al., Eur. J. Immunol. vol. 29, 2037-2045, 1999

Documento no de patente 2: Kaartinen et al., Cytotherapy vol. 19, 689-702, 2017

[Compendio de la invención]

[Problema técnico]

La presente invención tiene como objetivo suministrar de forma estable células T diferenciadas, particularmente células T CD197-positivas, y proporciona un método de producción, un método de cultivo de expansión y un kit para el cultivo de expansión de células CD3-positivas con un marcador de células T CD3 expresado en una membrana celular. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para mantener células T CD197-positivas y un kit para mantener células T CD197-positivas.

[Solución al problema]

Los presentes inventores han llevado a cabo estudios intensivos en un intento de lograr los objetivos y han descubierto que las células T CD8 positivas obtenidas a partir de células iPS transfectadas con el gen TCR (células T CD8 positivas derivadas de células iPS) se pueden proliferar de manera eficiente cultivando las células T en un medio que contiene un anticuerpo agonista anti-CD30 en un recipiente de cultivo en el que se inmovilizan el anticuerpo agonista anti-CD3 y RetroNectin (marca comercial registrada). Además, han confirmado que la eficiencia de proliferación de las células T y la actividad citotóxica específica del antígeno no se ven afectadas incluso cuando las células T CD8 positivas derivadas de células iPS se proliferan repetidamente mediante el método de cultivo. Además, han descubierto que, cuando las células T CD8 positivas derivadas de células iPS se cultivan utilizando un anticuerpo agonista anti-CD30, la tasa de expresión de CD197 se vuelve alta en comparación con el no uso del anticuerpo agonista anti-CD30 y las células T proliferadas están presentes como células T de memoria central. De manera similar a las células T CD8 positivas derivadas de células iPS, además, las células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana y las células T CD8 positivas derivadas de células iPS transfectadas con el gen anti-CD19-CAR (células anti-CD19-CART derivadas de células iPS) también podrían proliferar de manera eficiente añadiendo un anticuerpo agonista anti-CD30 al medio en un recipiente de cultivo en el que está inmovilizado el anticuerpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca comercial registrada). Además, han descubierto que cuando las células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana o las células anti-CD19-CART derivadas de células iPS se cultivan utilizando un anticuerpo agonista anti-CD30, la expresión de CD197 se mantiene durante un largo plazo y las células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana pueden sobrevivirin vivodurante un largo plazo en comparación con el no uso del anticuerpo agonista anti-CD30. Basándose en los hallazgos anteriores, han completado la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención proporciona lo siguiente.

[1] Un método para producir una célula CD3 positiva, que comprende la etapa (I) de cultivar la célula CD3 positiva en presencia de un agonista del complejo CD3/TCR, fibronectina o una variante de la misma, y un agonista CD30.

[2] El método de [1], que comprende además la etapa (II) de cultivar la célula CD3-positiva cultivada en la etapa (I) en ausencia de un agonista del complejo CD3/TCR y fibronectina o una variante de la misma, y en presencia de un agonista CD30.

[3] El método de [1] o [2], en donde la célula CD3 positiva se deriva de una célula madre pluripotente.

[4] El método de [3], en donde la célula madre pluripotente es una célula iPS.

[5] El método de cualquiera de [1] a [4], en donde la célula CD3-positiva es una célula CD3-positiva que expresa un receptor de antígeno quimérico.

[6] El método de cualquiera de [1] a [5], en donde la célula CD3-positiva es una célula CD3-positiva CD8-positiva.

[7] El método de [6], en donde la célula CD3-positiva CD8-positiva es una célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa.

[8] El método de uno cualquiera de [1] a [7], en donde la célula CD3 positiva es una célula<y>TCR positiva y/o 5TCR positiva.

[9] El método de uno cualquiera de los puntos [1] a [8], en donde el agonista del complejo CD3/TCR es un agonista de CD3 y/o un agonista de TCR.

[10] El método de [9], en donde el agonista CD3 es un anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo.

[11] El método de [10], en donde el anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo es un anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo producido a partir del clon UCHT1.

[12] El método de [9], en donde el agonista de TCR es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-TCR o un fragmento de unión del mismo, un complejo HLA/péptido o un multímero del mismo, y un complejo HLA/superantígeno o un multímero del mismo.

[13] El método de [10] o [11], en donde el anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo está inmovilizado en un recipiente de cultivo.

[14] El método de [13], en donde el anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo se inmoviliza poniendo en contacto 1 ng/ml - 50.000 ng/ml del anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo con el recipiente de cultivo.

[15] El método de uno cualquiera de los puntos [1] a [14], en donde la fibronectina o una variante de la misma es RetroNectin (marca comercial registrada).

[16] El método de [15], en donde RetroNectin (marca comercial registrada) se inmoviliza en el recipiente de cultivo.

[17] El método de [16], en donde RetroNectin (marca comercial registrada) se inmoviliza poniendo en contacto 1 - 150 pg/ml de RetroNectin (marca comercial registrada) con el recipiente de cultivo.

[18] El método de uno cualquiera de los puntos [1] a [17], en donde el agonista de CD30 es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo agonista anti-CD30 o un fragmento de unión del mismo y un ligando de CD30 o un fragmento de unión del mismo.

[19] El método de [18], en donde el anticuerpo agonista anti-CD30 o un fragmento de unión del mismo está contenido en el medio.

[20] El método de [19], en donde una concentración del anticuerpo agonista anti-CD30 o un fragmento de unión del mismo en el medio es de 1 ng/ml - 1.000 ng/ml.

[21] El método de uno cualquiera de [1] a [20], en donde el medio comprende al menos uno seleccionado de IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21.

[22] El método de [21], en donde el medio comprende IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21.

[23] El método de [21] o [22], en donde el medio comprende además TL1A y/o IL-12.

[24] El método de uno cualquiera de [1] a [23], en donde la célula CD3-positiva producida es además CD197-positiva.

[25] Un método para el cultivo de expansión de una célula CD3 positiva, que comprende una etapa de cultivar la célula CD3 positiva en presencia de un agonista del complejo CD3/TCR, fibronectina o una variante de la misma, y un agonista CD30.

[26] Un kit para el cultivo de expansión de una célula CD3 positiva, que comprende lo siguiente:

(1) un recipiente de cultivo en el que se inmovilizan un agonista del complejo CD3/TCR y fibronectina o una variante de la misma, y

(2) un medio que comprende un agonista CD30.

[Efectos ventajosos de la invención]

Las células T se pueden producir de manera eficiente o se pueden cultivar para expansión cultivando células CD3-positivas en presencia de un agonista del complejo CD3/TCR, fibronectina o una variante de la misma, y un agonista CD30. Además, dado que las células CD3 positivas producidas o la expansión cultivada por el cultivo mencionado anteriormente son células CD197 positivas, se espera una eficacia a largo plazo cuando las células se utilizan para la terapia de células T modificadas genéticamente. Además, las células CD3 positivas pueden mantenerse durante un largo plazo como células CD197 positivas estimulando la señal CD30 de las células.

[Breve descripción de los dibujos]

La Fig. 1 muestra concentraciones adecuadas para inmovilizar el anticuerpo agonista anti-CD3 y RetroNectin (marca comercial registrada) medidas mediante el método ELISA.

La Fig. 2 muestra el recuento de células T derivadas de iPSC (medidos por la cantidad de ATP) 12 días después de la estimulación con el anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada). La Fig. 3 muestra curvas de proliferación de células T derivadas de iPSC estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) o perlas anti-CD3/CD28. El eje vertical muestra el recuento de células y el eje horizontal muestra el número de días transcurridos desde el día en que se inició la estimulación mencionada anteriormente.

La Fig. 4 muestra curvas de proliferación de células T derivadas de iPSC para cada número de estimulaciones con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada).

La Fig. 5 muestra la actividad citotóxica específica de antígeno de las células T derivadas de iPSC proliferadas por estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada). La Fig. 6 muestra la proliferación promovida de células T derivadas de iPSC estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) mediante la adición de un anticuerpo agonista anti-CD30. El eje vertical muestra el recuento de células y el eje horizontal muestra el número de días transcurridos desde el día en que se inició la estimulación mencionada anteriormente.

La Fig. 7 muestra las curvas de proliferación de células T derivadas de iPSC que se sometieron a una prueba de proliferación en la que las células T derivadas de iPSC se estimularon (primera estimulación) con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada), o anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30, y luego se volvió a realizar la misma estimulación (segunda estimulación) después de completar la prueba. El eje vertical muestra el recuento de células y el eje horizontal muestra el número de días transcurridos desde el día en que se inició la segunda estimulación mencionada anteriormente.

La Fig. 8 muestra la expresión de CD197 y CD45RA en la superficie de la membrana celular de las células T derivadas de iPSC 7 días después de la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada), o anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30.

La Fig. 9 muestra la actividad citotóxica específica de antígeno de las células T derivadas de iPSC proliferadas por estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30.

La Fig. 10 muestra curvas de proliferación de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada), o anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30. El eje vertical muestra el recuento de células y el eje horizontal muestra el número de días transcurridos desde el día en que se inició la estimulación mencionada anteriormente.

La Fig. 11 muestra la expresión de CD197 en la superficie de la membrana celular de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana después de la estimulación con perlas anti-CD3/CD28 que contienen varias IL y anticuerpos anti-CD30.

La Fig. 12 muestra el número de células T humanas CD8 positivas que sobreviven en la sangre, el bazo y la médula ósea de ratones inmunodeficientes irradiados 4 semanas después del trasplante intravenoso de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana después de la estimulación con perlas anti-CD3/CD28 que contienen varias IL y anticuerpo anti-CD30.

La Fig. 13 muestra curvas de proliferación de células T derivadas de células iPS (iPS-T) y células anti-CD19-CART derivadas de células iPS (iPS-CART anti-CD19) estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30. El eje vertical muestra el recuento de células y el eje horizontal muestra el número de días transcurridos desde el día en que se inició la estimulación mencionada anteriormente.

La Fig. 14 muestra curvas de proliferación de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada), o anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30. El eje vertical muestra el recuento de células y el eje horizontal muestra el número de días transcurridos desde el día en que se inició la estimulación mencionada anteriormente.

La Fig. 15 muestra la expresión de CD197 en la superficie de la membrana celular de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada), o anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30.

La Fig. 16 muestra la actividad citotóxica, contra células Raji que expresan CD19, de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) mediante la adición de anticuerpo agonista anti-CD30.

La Fig. 17 muestra la actividad citotóxica, contra células Raji que expresan CD19, de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS (iCD19-CD30-CART) que contienen un dominio intracelular derivado de CD30.

La Fig. 18 muestra la proliferación celular de células<y>5T (células ¡<y>5T) diferenciadas de células iPS derivadas de células no T y estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) mediante la adición de anticuerpo agonista anti-CD30. El eje vertical muestra la razón de proliferación celular y el eje horizontal muestra el número de días transcurridos desde el día en que se inició la estimulación mencionada anteriormente.

La Fig. 19 muestra la proliferación celular de células anti-CD19-CARY5T (células ¡CAR<y>ST) estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) mediante la adición de anticuerpo agonista anti-CD30. El eje vertical muestra el recuento de células y el eje horizontal muestra el número de días transcurridos desde el día en que se inició la estimulación mencionada anteriormente.

La Fig. 20 muestra la actividad citotóxica específica de antígeno de células ¡CD19CAR/IL-15<y>5T proliferadas por estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada).

La Fig. 21 muestra el efecto del aumento de los días de supervivencia de ratones portadores de tumores que expresan CD19 humano mediante células ¡CD19CAR/IL-15<y>5T proliferadas mediante estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada).

La Fig. 22 muestra el efecto antitumoral de las células iCD19CAR/IL-15apT proliferadas por estimulación con el anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada).

La Fig. 23 muestra la concentración adecuada para inmovilizar el anticuerpo agonista anti-CD3 (UCHT1) y RetroNectin (marca comercial registrada), medida por el método ELISA.

La Fig. 24 muestra la tasa de proliferación de células T derivadas de iPSC 13 días después de la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado (UCHT1 )/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30.

(Descripción detallada de la invención)

En la presente memoria descriptiva, la "expresión génica" abarca tanto la síntesis de ARNm a partir de una secuencia de nucleótidos específica del gen (también denominada transcripción o expresión de ARNm) como la síntesis de proteína basada en la información del ARNm (también denominada traducción o expresión de proteína). A menos que se especifique lo contrario, la "expresión génica" o simplemente "expresión" significa expresión de proteína.

En la presente memoria descriptiva, "positivo" significa que una proteína o ARNm se expresa en una cantidad detectable mediante un método conocido en la técnica. La proteína se puede detectar mediante un ensayo inmunológico utilizando un anticuerpo, tal como el método ELISA, el método de inmunotinción, el método de transferencia Western y la citometría de flujo. Además, una proteína indicadora se expresa junto con la proteína, y la proteína objetivo puede detectarse detectando la proteína indicadora. Además, la presencia de una proteína se puede detectar detectando la función de la proteína (p. ej., cuando la proteína es un factor de transcripción, se detecta un gen cuya expresión está controlada por la proteína, y cuando la proteína es una enzima, se detecta un sustrato o un producto catalizado por la proteína, y similares). El ARNm se puede detectar, por ejemplo, mediante un método de amplificación de ácidos nucleicos y/o un método de detección de ácidos nucleicos tal como RT-PCR, microarray, biochip, RNAseq y similares.

En la presente memoria descriptiva, "negativo" significa que el nivel de expresión de la proteína o ARNm es menor que el límite inferior de detección por todos o cualquiera de los métodos conocidos mencionados anteriormente. El límite inferior de detección de la expresión de proteínas o ARNm puede variar según cada método.

En la presente memoria descriptiva, el "cultivo" se refiere a mantener, proliferar (hacer crecer) y/o diferenciar células en un entornoin vitro."Cultivar" significa mantener, proliferar (hacer crecer) y/o diferenciar células extratisulares oex vivo,por ejemplo, en una placa o matraz de cultivo celular.

En la presente memoria descriptiva, el "cultivo de expansión" significa cultivar con el propósito de proliferar una población de células deseada y aumentar el número de células. El aumento en el número de células se puede lograr incrementando el número de células por proliferación para superar la disminución en el número por muerte, y no requiere la proliferación de todas las células en la población de células. El aumento del número de células puede ser de 1,1 veces, 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 100 veces, 300 veces, 500 veces, 1.000 veces, 3.000 veces, 5.000 veces, 10.000 veces, 100.000 veces, o no menos de 1.000.000 de veces, en comparación con antes del inicio del cultivo de expansión.

En la presente memoria descriptiva, "estimulación" significa que una determinada sustancia se une a varios receptores y similares para activar una vía de señal en su secuencia descendente.

En la presente memoria descriptiva, "enriquecer" se refiere a aumentar la cantidad de un componente constituyente específico en una composición tal como una composición celular y similares, y "enriquecido" se refiere a una población de células en la que, cuando se utiliza para explicar una composición de células, por ejemplo, una población de células, la cantidad de un componente constituyente específico ha aumentado en comparación con la proporción de dicho componente constituyente en la población de células antes del enriquecimiento. Por ejemplo, una composición tal como una población de células y similares se puede enriquecer con respecto a un tipo de célula objetivo y, por lo tanto, la proporción del tipo de célula objetivo aumenta en comparación con la de la célula objetivo presente en la población de células antes del enriquecimiento. La población de células también puede enriquecerse con respecto a un tipo de célula objetivo mediante selección de células o un método de cribado conocido en la técnica. La población de células también puede enriquecerse mediante el proceso de selección o cribado específico descrito en la presente memoria descriptiva. En realizaciones específicas de la presente invención, al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de la población de células objetivo se enriquece mediante un método para enriquecer la población de células objetivo.

En la presente memoria descriptiva, la "población de células" significa dos o más células del mismo tipo o de tipos diferentes. La "población de células" también significa una masa de células del mismo tipo o de diferentes tipos.

La presente invención proporciona un método de producción o un método de cultivo de expansión de células CD3 positivas, que incluye una etapa de cultivo de células CD3 positivas en presencia de un agonista del complejo CD3/TCR, fibronectina o una variante de la misma, y un agonista CD30 (en lo sucesivo en la presente memoria, a veces denominado el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención).

El complejo CD3/TCR y CD30 pueden estimularse respectivamente con un agonista del complejo CD3/TCR y un agonista CD30.

En el método de producción o método de cultivo de expansión de la presente invención, la célula CD3-positiva a cultivar no está particularmente limitada siempre que exprese CD3 en la membrana celular. La célula CD3-positiva es preferiblemente una célula CD3-positiva CD8-positiva (célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-positiva o célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa), más preferiblemente, una célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa. Otra célula CD3-positiva preferida es, por ejemplo, una célula CD3-positiva CD4-positiva (célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-positiva o una célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-negativa).

La célula CD3-positiva que se va a cultivar mediante el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención puede ser CD30-positiva antes del cultivo, o diferenciarse para ser CD30-positiva durante el cultivo. Por lo tanto, cuando la célula CD3-positiva es CD30-positiva antes del cultivo, la célula CD3-positiva es preferiblemente una célula CD3-positiva CD8-positiva CD30-positiva (célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-positiva CD30-positiva o célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD30-positiva), más preferiblemente, una célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD30-positiva. Otra célula CD3-positiva preferida es, por ejemplo, una célula CD3-positiva CD4-positiva CD30-positiva (célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-positiva CD30-positiva o célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-negativa CD30-positiva).

La célula CD3-positiva obtenida mediante cultivo de producción o expansión mediante el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención no está particularmente limitada siempre que exprese CD3 en la membrana celular, y puede ser, por ejemplo, una célula similar a la célula CD3-positiva cultivada en el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención. La célula CD3-positiva después del cultivo de producción o expansión es preferiblemente CD197-positiva. La célula CD3-positiva después del cultivo de producción o expansión es además CD197-positiva, la célula es específicamente una célula CD3-positiva CD8-positiva CD197-positiva (célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-positiva CD197-positiva o célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD197-positiva), más preferiblemente, una célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD197-positiva. Alternativamente, la célula es una célula CD3-positiva CD4-positiva CD30-positiva CD197-positiva (célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-positiva CD30-positiva CD197-positiva o célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-negativa CD30-positiva CD197-positiva). Entre las células CD3-positivas, dado que la célula CD197-positiva se clasifica en célula T de memoria de célula madre o célula T de memoria central según la presencia o ausencia de expresión de CD45RA, y tiene una elevada capacidad de autoproliferación que puede suministrar células T efectoras, es adecuada para la inmunidad antitumoral.

La célula CD3-positiva tras el cultivo de producción o expansión es además preferiblemente CD197-positiva CD45RA-negativa. Cuando la célula CD3-positiva tras el cultivo de producción o expansión es además CD197-positiva CD45RA-negativa, la célula es específicamente una célula CD3-positiva CD8-positiva CD197-positiva CD45RA-negativa (célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-positiva CD197-positiva CD45RA-negativa o célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD197-positiva CD45RA-negativa), más preferiblemente, una célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa CD197-positiva CD45RA-negativa. Alternativamente, la célula es una célula CD3-positiva CD4-positiva CD30-positiva CD197-positiva CD45RA-negativa (célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-positiva CD30-positiva CD197-positiva CD45RA-negativa o célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-negativa CD30-positiva CD197-positiva CD45RA-negativa). Entre las células CD3 positivas, la célula CD197 positiva CD45RA negativa también se denomina particularmente célula T de memoria central.

CD3 es una molécula que se expresa durante el proceso de maduración de las células T, forma un complejo más grande (complejo CD3/TCR) con el receptor de células T (TCR) y también se conoce como marcador de células T. Es un complejo de 4 tipos de polipéptidos de cadenas<y>, 5, £ yZ-El TCR que forma un complejo con CD3 es una molécula que transmite una señal a las células T, y los ejemplos incluyen un dímero compuesto por dos cadenas a (TCRa), cadena p (TCRp), cadena<y>(TCR<y>) y cadena 5 (TCR5), un heterodímero (apTCR) compuesto por TCRa y TCRp, un heterodímero (y5TCR) compuesto por TCRy y TCR5, y un homodímero compuesto por las mismas cadenas de TCR. Al igual que el CD3, el CD8 se expresain vivodurante el proceso de maduración de las células T y se expresa junto con el CD4 en las primeras etapas de la maduración, pero solo se pierde la expresión del CD4 junto con la diferenciación en células T citotóxicas. El CD8 es una molécula que funciona como correceptor del complejo CD3/TCR y reconoce el péptido antígeno/MHC clase I, y es un homodímero que consiste en polipéptidos de cadena a o un heterodímero que consiste en dos tipos de polipéptidos de cadenas a y p. El CD4 se expresain vivojunto con el CD8 en las primeras etapas de la maduración de las células T, pero solo se pierde la expresión del CD8 junto con la diferenciación en células T auxiliares. Al igual que el CD8, el CD4 también funciona como un correceptor del complejo CD3/TCR, pero a diferencia del CD8, es una molécula que reconoce el péptido antigénico/MHC clase II. El CD30 es una molécula que se expresa en los linfocitos activados (células T y células B), tiene 6 motivos pseudo-repeticiones ricos en cisteína como dominios extracelulares y tiene, como dominio intracelular, una secuencia de unión al factor relacionado con el receptor de TNF (TRAP) que estimula la señal de NFkB. CD197 y CD45RA se utilizan como moléculas marcadoras para distinguir, en las células T, células T vírgenes o células T madre de memoria (CD197-positivas, CD45RA-positivas), células T de memoria central (CD197-positivas, CD45RA-negativas), células T de memoria efectoras (CD197-negativas, CD45RA-negativas) y células T efectoras (CD197-negativas, CD45RA-positivas).

En el método de producción o método de cultivo de expansión de la presente invención, las células CD3-positivas a cultivar pueden ser células recolectadas de un mamífero o células obtenidas mediante la diferenciación de células madre pluripotentes. Se prefieren las células obtenidas mediante la diferenciación de células madre pluripotentes.

Cuando las células CD3 positivas se recolectan de un mamífero, las células se pueden aislar y recolectar, por ejemplo, recolectando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del mamífero mediante aféresis y luego utilizando una columna de anticuerpos anti-CD3, un método de centrifugación en gradiente de densidad y similares. Los mamíferos para recolectar células CD3 positivas incluyen humanos y animales distintos de los humanos (p. ej., perro, gato, ratón, rata, hámster, conejillo de indias, conejo, cerdo, bovino, cabra, caballo, oveja, mono, etc.), siendo preferible el humano.

Cuando la célula CD3-positiva es una célula obtenida por diferenciación de células madre pluripotentes, las células madre pluripotentes incluyen células madre embrionarias (célula ES), células madre pluripotentes inducidas (célula iPS), células de carcinoma embrionario (célula EC) y células germinales embrionarias (célula EG). Se prefieren células ES o células iPS (las más preferidas son las células iPS humanas).

Cuando la célula madre pluripotente es una célula iPS, la célula iPS se puede producir introduciendo una sustancia de reprogramación nuclear en la célula somática. Las células somáticas que pueden utilizarse como material de partida para producir células iPS pueden ser cualquier célula distinta de las células germinales derivadas de mamíferos (p. ej., ratón o ser humano). Los ejemplos incluyen células epiteliales queratinizantes (p. ej., célula epidérmica queratinizada), células epiteliales mucosas (p. ej., célula epitelial en la capa superficial de la lengua), células epiteliales de glándulas exocrinas (p. ej., célula mamaria), células secretoras de hormonas (p. ej., célula de la médula suprarrenal), células metabólicas/de almacenamiento (p. ej., hepatocito), células epiteliales luminales que constituyen la interfaz (p. ej., célula alveolar tipo I), células epiteliales vasculares luminales (p. ej., célula endotelial vascular), células ciliadas con capacidad de transporte (p. ej., célula epitelial de las vías respiratorias), células de secreción de la matriz extracelular (p. ej., fibroblasto), células contráctiles (p. ej., célula de músculo liso), células sanguíneas y del sistema inmunológico (p. ej., linfocito T), células relacionadas con el sensor (p. ej., célula bastón), neuronas del sistema nervioso autónomo (p. ej., neurona colinérgica), células de soporte de neuronas periféricas y de órganos sensoriales (p. ej., célula satélite), células nerviosas y células gliales del sistema nervioso central (p. ej., célula astroglial), células pigmentarias células (p. ej., células epiteliales pigmentarias de la retina) y células progenitoras de las mismas (células progenitoras de tejido) y similares. El grado de diferenciación celular no está particularmente limitado, y tanto las células progenitoras indiferenciadas (incluidas las células madre somáticas) como las células maduras finalmente diferenciadas se pueden utilizar de manera similar como el origen de la célula somática en la presente invención. Como se utiliza en la presente memoria, los ejemplos de células progenitoras indiferenciadas incluyen células madre de tejido (células madre somáticas), tales como células madre del estroma derivadas de grasa, células madre neurales, células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales, células madre pulpares y similares.

La sustancia de reprogramación nuclear que se va a introducir en células somáticas para la producción de células iPS incluye combinaciones de varios genes de reprogramación notificados hasta el momento (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2007/069666, Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008), Cell, 126, 663-676 (2006) , Cell, 131, 861-872 (2007), Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009), Nature, 451, 141-146 (2008), Science, 318, 1917-1920 (2007), Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008), Cell Research (2008) 600-603, Nature 454: 646 650 (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528(2008), WO2008/118820, Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009), Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009), Science, 324: 797-801 (2009)). Además, una proteína codificada por el gen de reprogramación mencionado anteriormente también se puede introducir como sustancia de reprogramación nuclear en una célula somática (Cell Stem Cell, 4: 381-384(2009), Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2009.05.005 (2009)). En particular, es preferible una combinación de los tres factores Oct3/4, Sox2 y Klf4, considerando que las células iPS obtenidas se utilizan con fines terapéuticos.

Una colonia de células iPS se puede seleccionar mediante un método que utiliza la resistencia a fármacos y la actividad del informador como índices (Cell, 126, 663-676 (2006), Nature, 448, 313-317 (2007)) o un método que incluya la observación morfológica visual (Cell, 131, 861-872 (2007)). La confirmación de las células iPS se puede realizar utilizando la expresión de varios genes específicos de las células ES y la formación de teratomas como índices.

Actualmente, existen varios tipos de células iPS (iPSC), y células iPS establecidas por Yamanaka, et al. mediante la introducción de 4 factores de Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc en fibroblastos de ratón (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676), iPSC derivadas de una célula humana establecida mediante la introducción de 4 factores similares en fibroblastos humanos (Takahashi K, Yamanaka S., et al., Cell, (2007) 131: 861 -872.), Nanog-iPSc establecida mediante la selección con la expresión de Nanog como índice después de la introducción de los 4 factores mencionados anteriormente (Okita, K., Ichisaka, T., y Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), también se pueden utilizar iPSC producidas mediante un método libre dec -Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106), e iPSC establecidas mediante la introducción de 6 factores mediante un método libre de virus (Okita K et al., Nat. Methods 2011 May; 8(5) :409-12, Okita K et al., Stem Cells. 31(3) :458-66). Además, también se pueden utilizar iPSC establecidas por Thomson et al. mediante la introducción de 4 factores de OCT3/4, SOX2, NANOG y LIN28 (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), iPSC producidas por Daley et al. (Park IH, Daley Gq . et al., Nature (2007) 451: 141-146), células madre pluripotentes inducidas producidas por et al. (JP-A-2008-307007).

Además, puede usarse cualquiera de las iPSC conocidas en la técnica que se describen en artículos publicados (p. ej., Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, n.° 7, 795-797), o patentes (p. ej., JP-A-2008-307007, JP-A-2008-283972, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007/069666, WO2008/118220, WO2008/124133, WO2008/151058, WO2009/006930, WO2009/006997, WO2009/007852).

Como línea de células madre pluripotentes inducidas, se pueden utilizar varias líneas de iPSC establecidas por NIH, RIKEN, la Universidad de Kyoto y similares. Los ejemplos de la línea iPSC humana incluyen la cepa HiPS-RIKEN-1A, la cepa HiPS-RIKEN-2A, la cepa HiPS-RIKEN-12A, la cepa Nips-B2 de RIKEN, la cepa 253G1, la cepa 253G4, la cepa 1201C1, la cepa 1205D1, la cepa 1210B2, la cepa 1383D2, la cepa 1383D6, la cepa 201B7, la cepa 409B2, la cepa 454E2, la cepa 606A1, la cepa 610B1, la cepa 648A1, la cepa 1231A31, FfI-01 s04 y similares, siendo preferible la cepa 1231A3.

Cuando una célula CD3-positiva es una célula obtenida mediante la diferenciación de una célula madre pluripotente, el TCR expresado en la célula CD3-positiva incluye un dímero que consiste en dos de TCRa, TCRp, TCR<y>y TCR5, un heterodímero que consiste en TCRa y TCRp (apTCR), un heterodímero que consiste en TCRy y TCR5 (y5TCR), y un homodímero que consiste en la misma cadena TCR. Si bien estos TCR pueden ser dímeros endógenos o exógenos, es preferible un dímero que contenga TCRa exógeno y TCRp exógeno.

En la presente memoria descriptiva, el "TCR exógeno" se refiere a un heterodímero que consiste en un TCRa exógeno y un TCRp exógeno, un heterodímero que consiste en un TCRy exógeno y un TCR5 exógeno, y/o un homodímero que consiste en la misma cadena de TCR exógeno.

Cuando TCR es un dímero que contiene TCRa endógeno y TCRp endógeno, la célula madre pluripotente puede ser una célula madre pluripotente preparada a partir de una célula que contiene un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica TCRa endógeno y un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica TCRp endógeno. Los ejemplos de dichas células incluyen células T (células CD8-positivas CD4-negativas, células CD8-negativas CD4-positivas, células CD4-positivas CD8-positivas y similares). Cuando el TCR es un dímero que contiene TCRa exógeno y TCRp exógeno, entonces la célula madre pluripotente puede ser una célula que contiene un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica un TCRa exógeno y un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica un TCRp exógeno.

En la presente memoria descriptiva, el "ácido nucleico TCR exógeno" se refiere a un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica un TCRa exógeno, un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica un TCRp exógeno, un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica un TCRy exógeno y/o un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica un TCR5 exógeno.

El método para introducir un ácido nucleico TCR exógeno (p. ej., un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica un TCRa exógeno y un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica un TCRp exógeno) en una célula madre pluripotente no está particularmente limitado. Por ejemplo, se puede utilizar el siguiente método.

Cuando el ácido nucleico TCR exógeno está en forma de ADN, por ejemplo, vectores tales como virus, plásmidos, cromosomas artificiales y similares pueden introducirse en células madre pluripotentes mediante métodos tales como lipofección, liposoma, microinyección y similares. Los ejemplos del vector de virus incluyen el vector retroviral, el vector de lentivirus, el vector de adenovirus, el vector de virus adenoasociado, el vector del virus Sendai y similares. Los ejemplos del vector cromosómico artificial son el cromosoma artificial humano (HAC), el cromosoma artificial de levadura (YAC), el cromosoma artificial bacteriano (BAC, PAC) y similares. Como plásmido, se puede utilizar plásmido para células de mamíferos. El vector puede contener secuencias de control tales como promotor, potenciador, secuencia de unión a ribosoma, terminador, sitios de poliadenilación y similares para que se pueda expresar TCR exógeno. Cuando sea necesario, se pueden incluir secuencias de marcadores de selección tales como genes de resistencia a fármacos (p. ej., gen de resistencia a la kanamicina, gen de resistencia a la ampicilina, gen de resistencia a la puromicina y similares), gen de la timidina quinasa, gen de la toxina de la difteria y similares, secuencias de genes informadores tales como proteína fluorescente, p glucuronidasa (GUS), FLAG y similares, y similares. Los ejemplos del promotor incluyen el promotor SV40, el promotor LTR, el promotor CMV (citomegalovirus), el promotor RSV (virus del sarcoma de Rous), el LTR MoMuLV (virus de la leucemia del ratón de Moloney), el promotor HSV-TK (timidina quinasa del virus del herpes simple), el promotor EF-a, el promotor CAG y el promotor sensible a medicamentos. Los ejemplos del promotor sensible al fármaco incluyen el promotor TRE (promotor mínimo de CMV que tiene una secuencia sensible a Tet que tiene 7 secuencias tetO consecutivas) que expresa un gen en presencia del fármaco correspondiente. Cuando se utiliza el promotor TRE, es preferible utilizar un modo que induzca la expresión génica expresando simultáneamente una proteína de fusión de tetR inverso (rtetR) y VP16AD en la misma célula en presencia del fármaco correspondiente (p. ej., tetraciclina o doxiciclina). Se prefiere además un vector que tenga el promotor TRE y que tenga simultáneamente un modo que exprese el gen de fusión de rtetR y VP16AD en el mismo vector.

En la presente invención, también se puede utilizar un modo de expresión policistrónica para expresar simultáneamente TCRa exógeno y TCRp exógeno. Para la expresión policistrónica, las secuencias que codifican los genes pueden estar unidas por una región codificante IRES o del virus de la fiebre aftosa (FMDV) 2A.

En otra realización adicional, el vector mencionado anteriormente puede tener una secuencia de transposón antes y después de este casete de expresión (unidad de expresión génica que contiene un promotor, una secuencia génica y un terminador) para escindir según sea necesario la secuencia que codifica el TCR exógeno incorporado al cromosoma. La secuencia del transposón no está particularmente limitada y está ejemplificada por piggyBac. En otra realización, para eliminar el casete de expresión, la secuencia loxP o la secuencia FRT se pueden proporcionar antes y después del casete de expresión.

Cuando el ácido nucleico TCR exógeno está en forma de ARN, puede introducirse en células madre pluripotentes mediante un método tal como electroporación, lipofección, microinyección y similares.

En el método de producción o método de cultivo de expansión de la presente invención, las células CD3-positivas a cultivar también pueden ser células que expresan un receptor de antígeno quimérico.

En la presente invención, el "receptor de antígeno quimérico (CAR)" significa una proteína de fusión que contiene un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de transducción de señales intracelulares. El dominio de unión al antígeno del CAR incluye un anticuerpo de cadena corta (scFv) en el que la cadena ligera (VL) y la cadena pesada (VH) de la región variable del anticuerpo están unidas en tándem a través de un enlazador (p. ej., el enlazador GS). Las células CD3 positivas que expresan CAR reconocen el antígeno en la región scFV y luego transducen la señal de reconocimiento del mismo en las células T a través del dominio de transducción de señales intracelulares. La introducción de CAR en las células CD3 positivas permite impartir especificidad al antígeno de interés. Además, dado que CAR puede reconocer directamente moléculas de antígeno sin depender de HLA clase I o clase II, también se puede inducir una respuesta inmune alta contra células con expresión disminuida de genes HLA clase I o clase II.

Los ejemplos del antígeno al que se dirigen los TCR y CAR mencionados anteriormente incluyen, pero sin limitación, antígenos tumorales. El antígeno tumoral puede ser un antígeno específico del tumor (TSA) o un antígeno asociado al tumor (TAA). Ejemplos específicos de dicho antígeno tumoral incluyen uno o más tipos de antígenos seleccionados del grupo que consiste en antígenos diferenciados tales como MART-1/MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y similares, antígenos multilinaje específicos de tumores tales como WT1, Glypican-3, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15 y similares, antígenos fetales tales como CEA y similares, genes tumorales sobreexpresados o genes supresores de tumores mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu y similares, antígenos tumorales únicos causados por translocación cromosómica tales como B<c>R-ABL, E2A-PRL, H4-<r>E<t>, IGH-IGK, MYL-RAR y similares, y antígenos de virus tales como el antígeno del virus de Epstein Barr EBVA, los antígenos del virus del papiloma humano (HPV) E6 y E7 y similares. Como otros antígenos tumorales, pueden mencionarse CD19, CD20, EGP2, erB2,3,4, GD2, GD3, mesotelina, PSMA, 8H9, Lewis-Y, MUC1, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p-catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, a-fetoproteína, p-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3/CA 27.29/BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68/P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733/EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, proteína de unión TA-90/Mac-2/proteína asociada a ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP y TPS .

Los ejemplos del dominio transmembrana de CAR incluyen un dominio transmembrana derivado de una proteína seleccionada del grupo que consiste en cadena a, cadena p o cadena Z de TCR, CD28, cadena CD3s, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, 4-1BB (CD137) y CD154, y similares. Entre estos, es preferible un dominio transmembrana derivado de CD8. Además, por ejemplo, también se utiliza preferiblemente un dominio transmembrana derivado de una molécula, de la que se deriva el primer dominio de transducción de señales intracelulares unido a un dominio de unión a antígeno. Cuando, por ejemplo, la molécula de la que se deriva el primer dominio de transducción de señales intracelulares vinculado a un dominio de unión a antígeno es CD28, el dominio transmembrana también puede derivarse de CD28. Alternativamente, también se puede utilizar un dominio transmembrana diseñado artificialmente.

Los ejemplos del dominio de transducción de señales intracelulares de CAR incluyen, pero sin limitación, dominios intracelulares derivados de uno o más tipos de proteínas seleccionadas del grupo que consiste en cadena F<c>R<y>, cadena FcRp, cadena CD3<y>, cadena CD35, cadena CD3s, cadena CD3Z, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. Entre estos, es preferible un dominio intracelular derivado de la cadena CD3Z. Cuando se desencadena la fosforilación de tirosina del ITAM contenido en el dominio intracelular de la cadena CD3Z, se producen una serie de respuestas como un aumento de la concentración intracelular de Ca2+, secreción de citocinas y similares, y finalmente, se produce la división celular y las células CD3-positivas muestran actividad citotóxica como CTL. El dominio de transducción de señales intracelulares puede contener además un dominio intracelular de una molécula coestimulante. Los ejemplos de la molécula coestimulante incluyen, pero sin limitación, dominios intracelulares de uno o más tipos de proteínas seleccionadas del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1,<i>C<o>S, antígeno asociado a la función de los linfocitos-1 (LFA-1 ), CD2 , CD7, LIG<h>T, NKG2C, B7-H3 y CD83. Entre estos, son preferibles los dominios intracelulares derivados de CD28, 4-1BB (CD137), CD30. El CD28 puede unirse para promover la proliferación de células T aumentando la producción de IL-2. Además, 4-1BB puede promover la diferenciación en células de memoria al suprimir la apoptosis causada en la etapa final de la activación de las células T. El CD30 puede mejorar aún más la proliferación de células CD3 positivas con un anticuerpo CD3 y permite mantener las células como células CD197 positivas durante un largo plazo. Al seleccionar el tipo y número de moléculas coestimulantes, se puede controlar la intensidad y la duración de la actividad del CAR (p. ej., Mol Ther. 2009; 17:1453-1464). Cuando el dominio de transducción de señales intracelulares contiene uno o más tipos de dominios intracelulares, el orden de los mismos no está limitado.

Se puede incorporar un espaciador entre el dominio de unión al antígeno del CAR y el dominio transmembrana, o entre el dominio de transducción de señales intracelulares del CAR y el dominio transmembrana. Como espaciador, puede utilizarse generalmente un péptido que consiste en no más de 300 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 100 aminoácidos, y más preferiblemente de 20 a 50 aminoácidos. Ejemplos específicos de los mismos incluyen, pero sin limitación, una región de bisagra derivada de IgG1, un péptido que contiene una región CH2CH3 de inmunoglobulina y una parte de CD3, y similares.

Ejemplos específicos de CAR incluyen, pero sin limitación, un CAR de primera generación en el que el scFv y la cadena CD3Z están unidos a través de un espaciador, un CAR de segunda generación en el que un dominio transmembrana y un dominio intracelular derivado de CD28 se incorporan entre el scFv del CAR de primera generación y la cadena CD3Z para mejorar la capacidad de activación de las células T, y un CAR de tercera generación en el que un dominio intracelular de una molécula coestimulante (4-1BB u OX40) diferente de CD28 se incorpora entre el dominio intracelular de CD28 del CAR de segunda generación y la cadena CD3Z.

En el método de producción o método de cultivo de expansión de la presente invención, la célula CD3-positiva que se va a cultivar además pueden ser células que coexpresan CAR y una proteína de fusión de IL-15 e IL-15Ra (IL-15/IL-15Ra). El CAR expresado con IL-15/IL-15Ra puede ser similar al CAR mencionado anteriormente.

En la presente invención, "IL-15/IL-15Ra" significa una proteína de fusión que contiene IL-15 e IL-15Ra. En el sistema de transducción de señales IL-15, el IL-15Ra expresado en las células presentadoras de antígeno generalmente se une a IL-15 y el IL-15 se presenta al receptor de IL-15 que consiste en una cadena y común (Yc) con IL-15Rp en las células CD8 positivas y CD4 negativas (transpresentación), por lo que se mantiene la actividad citotóxica de las células CD8 positivas y CD4 negativas. Por lo tanto, cuando la célula CD3-positiva que expresa IL-15/IL-15Ra es CD8-positiva y CD4-negativa, la célula puede transmitir la señal de IL-15 a su propia célula a través del receptor de IL-15. Alternativamente, la célula CD3 positiva que expresa IL-15/IL-15Ra puede transmitir la señal de IL-15 a otras células CD8 positivas y CD4 negativas a través del receptor de IL-15. Como se ha descrito anteriormente, dado que IL-15/IL-15Ra puede mantener la actividad citotóxica de las células CD8 positivas y CD4 negativas, se espera que muestre un efecto citotóxico continuo en las células a las que se dirige el CAR.

IL-15/IL-15Ra puede ser una proteína de tipo transmembrana o una proteína secretora. Se sabe que, en IL-15Ra, el dominio de unión de IL-15 de 1-65 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína madura es la región responsable de la unión a IL-15 (Wei X. et al., J. Immunol., 167: 277-282, 2001). Por lo tanto, la proteína de tipo transmembrana puede ser una proteína que retiene el dominio de unión de IL-15 y retiene el dominio transmembrana de IL-15Ra. Por otro lado, la proteína secretora puede ser una proteína que mantiene el dominio de unión de IL-15 y carece del dominio transmembrana de IL-15Ra.

Se puede incorporar un espaciador entre IL-15 e IL-15Ra de IL-15/IL-15Ra. Como espaciador, generalmente se puede utilizar un péptido que consiste en no más de 300 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 100 aminoácidos, y más preferiblemente de 20 a 50 aminoácidos. Ejemplos específicos de los mismos incluyen, pero sin limitación, enlazador GS y similares.

IL-15/IL-15Ra no está particularmente limitado siempre que sea un péptido en el que IL-15 e IL-15Ra estén unidos a través de un espaciador, y ejemplos específicos del mismo incluyen un péptido que consiste en SEQ ID NO: 8. Si bien IL-15/IL-15R no está particularmente limitado siempre que pueda unirse al receptor de IL-15 y transmitir la señal de IL-15 a la célula, por ejemplo, se puede mencionar un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de no menos de aproximadamente 90%, preferiblemente no menos de aproximadamente 95%, más preferiblemente no menos de aproximadamente 97%, particularmente preferiblemente no menos de aproximadamente 98%, lo más preferiblemente no menos de aproximadamente 99%, con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 8. Como se utiliza en la presente memoria, la "homología" significa la proporción (%) del mismo aminoácido y residuo de aminoácido similar con respecto a todos los residuos de aminoácidos superpuestos en la alineación óptima donde dos secuencias de aminoácidos se alinean utilizando un algoritmo matemático conocido en el campo técnico relevante (preferiblemente, el algoritmo es tal que se puede introducir un espacio en una o ambas secuencias para la alineación óptima). Por "aminoácido similar" se entiende aminoácidos que tienen propiedades fisicoquímicas similares y, por ejemplo, se pueden mencionar aminoácidos clasificados en el mismo grupo tales como aminoácidos aromáticos (Phe, Trp, Tyr), aminoácidos alifáticos (Ala, Leu, Ile, Val), aminoácidos polares (Gln, Asn), aminoácidos básicos (Lys, Arg, His), aminoácidos ácidos (Glu, Asp), aminoácidos que tienen un grupo hidroxilo (Ser, Thr), aminoácidos que tienen una cadena lateral pequeña (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) y similares. Se predice que la sustitución con aminoácidos tan similares no cambia el fenotipo de la proteína (es decir, sustitución de aminoácidos conservadora). Ejemplos específicos de la sustitución conservadora de aminoácidos son bien conocidos en el campo técnico y se describen en diversos documentos (p. ej., Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990)). La homología de la secuencia de aminoácidos en la presente memoria descriptiva se puede calcular utilizando el algoritmo de cálculo de homología NCBI BLAST (Herramienta de búsqueda de alineamiento local básico del Centro Nacional de Información Biotecnológica), y bajo las siguientes condiciones (expectativa = 10; aceptar espacio; matriz = BLOSUM62; filtrado = desconectado).

Cuando el receptor de antígeno quimérico y/o IL-15/IL-15Ra se expresan en la célula CD3-positiva cultivada en el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención, un método para introducir el ácido nucleico CAR y/o el ácido nucleico IL-15/IL-15Ra en las células (p. ej., células madre pluripotentes) no está particularmente limitado y, por ejemplo, se puede utilizar el mismo método que el método de introducción del ácido nucleico TCR.

Cuando las células CD3-positivas que se van a cultivar en el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención son células obtenidas mediante la diferenciación de células madre pluripotentes, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células CD3-positivas mediante un método conocido en sí mismo. Se describen métodos específicos para diferenciar células madre pluripotentes en células CD3-positivas, por ejemplo, en los documentos WO 2016/076415 y WO 2017/221975. Un método específico para diferenciar células madre pluripotentes en células CD3-positivas puede incluir, por ejemplo, (1) un proceso para diferenciar células madre pluripotentes en células progenitoras hematopoyéticas, y (2) un proceso para diferenciar las células progenitoras hematopoyéticas en células CD3-positivas.

(1) Proceso para diferenciar células madre pluripotentes inducidas en células progenitoras hematopoyéticas

En la etapa (1), la célula progenitora hematopoyética (HPC) significa una célula CD34-positiva, preferiblemente una célula CD34-positiva y CD43-positiva (DP). En la etapa (1), la célula progenitora hematopoyética y la célula madre hematopoyética no se distinguen y muestran la misma célula a menos que se indique particularmente.

El método de diferenciación de células madre pluripotentes en células progenitoras hematopoyéticas no está particularmente limitado siempre que pueda provocar la diferenciación en células progenitoras hematopoyéticas. Los ejemplos de los mismos incluyen un método que incluye el cultivo de células madre pluripotentes en un medio para la inducción de células progenitoras hematopoyéticas, como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2013/075222, WO 2016/076415 y Liu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015); 344 358 y similares.

En la etapa (1), el medio utilizado para la inducción en células progenitoras hematopoyéticas no está particularmente limitado. Un medio utilizado para cultivar células animales se puede preparar en un medio basal. Los ejemplos del medio basal incluyen, pero sin limitación, medio de Dulbecco (p. ej., IMDM), medio de Eagle (p. ej.,<d>M<e>M, EMEM, BME, MEM, aMEM), medio de Ham (p. ej., medio F10, medio F12), medio RPMI (p. ej., medio RPMI-1640, medio RPMI-1630), medio MCDB (p. ej., medio MCDB104, 107, 131, 151, 153), medio de Fischer, medio 199, medio de cultivo para células ES de primates (medio de cultivo para células ES/iPS de primates, Reprocell), medio para células ES de ratón (medio de cultivo TX-WES, Thromb-X), medio sin suero (mTeSR, Stemcell Technologies), ReproFF, StemSpan (marca comercial registrada) SFEM, StemSpan (marca comercial registrada) H3000, StemlineII, ESF-B medio, medio ESF-C, medio CSTI-7, medio Neurobasal (Life Technologies, Inc.), medio StemPro-34, StemFit (marca comercial registrada) (p. ej., StemFit AK03N, StemFit AK02N) y similares. Además, estos medios se pueden mezclar según sea necesario y utilizar y, por ejemplo, se pueden mencionar el medio DMEM/F12 y similares. El medio basal utilizado puede contener suero o no contenerlo. El medio basal puede suplementarse adecuadamente con 10 - 20% de suero (suero bovino fetal (FBS), suero humano, suero de caballo) o un reemplazo de suero (KSR y similares), insulina, varias vitaminas, L-glutamina, varios aminoácidos tales como aminoácidos no esenciales y similares, 2-mercaptoetanol, varias citocinas (interleucinas (IL-2, IL-7, IL-15, etc.), SCF (factor de células madre), activina y similares), varias hormonas, varios factores de crecimiento (factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), TGF-p, etc.), varias matrices extracelulares, varias moléculas de adhesión celular, antibióticos tales como penicilina/estreptomicina, puromicina y similares, indicador de pH tal como rojo fenol y similares, y similares. Si es necesario, el medio basal también puede contener vitamina C (p. ej., ácido ascórbico), albúmina, insulina, transferrina, compuesto de selenio (p. ej., selenito de sodio), ácido graso, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, tioglicerol (p. ej., a-monotioglicerol (MTG)), lípidos, L-alanil-L-glutamina (p. ej., Glutamax (marca comercial registrada)), factores de crecimiento, compuestos de bajo peso molecular, antibióticos, antioxidantes, ácido pirúvico, tampones, sales inorgánicas y similares.

En la etapa (1), "Vitamina C" significa ácido L-ascórbico y derivados del mismo, y "derivado del ácido L-ascórbico" significa derivados que se convierten en vitamina C mediante reacción enzimática en el cuerpo vivo. Los ejemplos de los derivados del ácido L-ascórbico utilizados en la etapa (1) incluyen fosfato de vitamina C, glucósido de ácido ascórbico, etil ascorbilo, éster de vitamina C, tetrahexildecanoato de ascorbilo, estearato de ascorbilo y 2-fosfato 6-palmitato de ascorbilo. Se prefiere el fosfato de vitamina C. Los ejemplos de fosfato de vitamina C (p. ej., ácido ascórbico 2-fosfato) incluyen sales de fosfato de ácido L-ascórbico como fosfato de ácido L-ascórbico Na y fosfato de ácido L-ascórbico Mg.

Cuando se utiliza vitamina C, la vitamina C se añade (suministra) preferiblemente cada cuatro días, cada tres días, cada dos días o todos los días. Es preferible añadir vitamina C cada día. En una realización, la vitamina C se añade preferiblemente al medio en una cantidad correspondiente a 5 ng/ml a 500 ng/ml (p. ej., una cantidad correspondiente a 5 ng/ml, 10 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml o 500 ng/ml). En otra realización, se añade vitamina C al medio de cultivo en una cantidad correspondiente a 5 pg/ml - 500 pg/ml (p. ej., una cantidad correspondiente a 5 pg/ml, 10 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 300 pg/ml, 400 pg/ml, 500 pg/ml).

El medio a utilizar en la etapa (1) puede complementarse además con al menos un tipo de citocina seleccionada del grupo que consiste en BMP4 (proteína morfogenética ósea 4), VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), SCF (factor de células madre), TPO (trombopoyetina), FLT-3L (ligando Flt3) y bFGF (factor de crecimiento básico de fibroblastos). Se prefiere más un cultivo suplementado con BMP4, VEGF y bFGF, y más preferiblemente un cultivo suplementado con BMP4, VEGF, SCF y bFGF.

Cuando se usa citocina, su concentración en el medio puede ser, por ejemplo, 5 ng/ml - 500 ng/ml para BMP4, 5 ng/ml - 500 ng/ml para VEGF, 5 ng/ml - 500 ng/ml para SCF, 3 ng/ml - 300 ng/ml para TPO, 1 ng/ml - 100 ng/ml para FLT-3L y 5 ng/ml - 500 ng/ml para bFGF.

El medio puede complementarse con un inhibidor de TGFp. El inhibidor de TGFp es un inhibidor de moléculas pequeñas que interfiere con la transducción de señales de la familia TGFP e incluye, por ejemplo, SB431542, SB202190 (ambos R.K. Lindemann et al., Mol. Cancer 2:20 (2003)), SB505124 (GlaxoSmithKline), NPC30345, SD093, SD908, SD208 (Scios), LY2109761, LY364947, LY580276 (Lilly Research Laboratories) y similares. Por ejemplo, cuando el inhibidor de TGFp es SB431542, su concentración en el medio es preferiblemente 0,5 pM - 100 pM.

Las células madre pluripotentes inducidas pueden cultivarse mediante cultivo adherente o cultivo en suspensión. En los casos de cultivo adherente, el cultivo puede llevarse a cabo en un recipiente de cultivo revestido con un componente de matriz extracelular y/o puede co-cultivarse con células alimentadoras. Si bien la célula alimentadora no está particularmente limitada, se pueden mencionar, por ejemplo, fibroblastos (fibroblasto de embrión de ratón (MEF), fibroblasto de ratón (STO) y similares). Las células alimentadoras se inactivan preferiblemente mediante un método conocido en sí mismo, por ejemplo, irradiación con radiación (rayos gamma y similares), tratamiento con un agente anticancerígeno (mitomicina C y similares) y similares. Como componente de la matriz extracelular, se pueden mencionar proteínas fibrosas tales como Matrigel (Niwa A, et al., PLoS One.6(7): e22261, 2011), gelatina, colágeno, elastina y similares, glucosaminoglicano y proteoglicano como ácido hialurónico, sulfato de condroitina y similares, proteínas de adhesión celular como fibronectina, vitronectina, laminina y similares, y similares.

Cultivo en suspensión significa cultivar células en un estado de no adhesión a un recipiente de cultivo y no está particularmente limitado. Para mejorar la adhesividad a las células, se puede utilizar un recipiente de cultivo libre de un tratamiento artificial (p. ej., tratamiento de revestimiento con matriz extracelular y similares), o un recipiente de cultivo sometido a un tratamiento para suprimir artificialmente la adhesión (p. ej., tratamiento de revestimiento con ácido polihidroxietil metacrílico (poli-HEMA) o poliol tensioactivo no iónico (Pluronic F-127, etc.)). En el cultivo en suspensión, se forma y cultiva preferiblemente el embrioide (EB).

Las células progenitoras hematopoyéticas también se pueden preparar a partir de una estructura similar a un saco (también denominada saco ES o saco iPS) obtenida mediante el cultivo de células madre pluripotentes. Como se utiliza en la presente memoria, la "estructura tipo saco" es una estructura sacular tridimensional (con espacios en su interior) derivada de células madre pluripotentes, que está formada por una población de células endoteliales y similares y contiene células progenitoras hematopoyéticas en su interior.

Las condiciones de temperatura en la etapa (1) no están particularmente limitadas. La temperatura es, por ejemplo, de aproximadamente 37°C a aproximadamente 42°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C a aproximadamente 39°C. El período de cultivo puede ser determinado apropiadamente por los expertos en la técnica mediante el monitoreo del número de células progenitoras hematopoyéticas y/o similares. El número de días de cultivo no está limitado siempre que se puedan obtener células progenitoras hematopoyéticas. Los ejemplos del período de cultivo incluyen al menos 6 días, no menos de 7 días, no menos de 8 días, no menos de 9 días, no menos de 10 días, no menos de 11 días, no menos de 12 días, no menos de 13 días y no menos de 14 días. El período de cultivo es preferiblemente de 14 días. Aunque un período de cultivo más largo generalmente no representa un problema en la producción de células progenitoras hematopoyéticas, preferiblemente no es más de 35 días, más preferiblemente no más de 21 días. El cultivo puede llevarse a cabo en condiciones de bajo oxígeno, y la condición de bajo oxígeno en la presente memoria descriptiva significa, por ejemplo, una concentración de oxígeno de 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% o inferior a estas.

(2) Etapa de diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas en células CD3 positivas

Un método para diferenciar células progenitoras hematopoyéticas en células CD3-positivas no está particularmente limitado siempre que pueda diferenciar células progenitoras hematopoyéticas en células CD3positivas. Los ejemplos de los mismos incluyen un método para cultivar células progenitoras hematopoyéticas en las mismas condiciones de cultivo que las de un método para inducir células T a partir de células progenitoras hematopoyéticas, como se describe en los documentos WO 2016/076415, WO 2017/221975 y similares.

En la etapa (2), un medio para inducir la diferenciación en células T CD3-positivas no está particularmente limitado, y un medio utilizado para cultivar células animales se puede preparar en un medio basal. Los ejemplos del medio basal incluyen aquellos similares al medio basal utilizado en la etapa (1 ) mencionado anteriormente. El medio puede contener suero o no contenerlo. Si es necesario, el medio basal también puede contener vitamina C (p. ej., ácido ascórbico), albúmina, insulina, transferrina, compuesto de selenio (p. ej., selenito de sodio), ácido graso, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, tioglicerol (p. ej., a-monotioglicerol (MTG)), lípidos, aminoácidos, L-alanil-L-glutamina (p. ej., Glutamax (marca comercial registrada)), factores de crecimiento, aminoácidos no esenciales, compuestos de bajo peso molecular, antibióticos, antioxidantes, ácido pirúvico, tampones, sales inorgánicas y similares.

Cuando se utiliza vitamina C en la etapa (2), la vitamina C puede ser la misma que la descrita en la etapa (2 1) y se puede añadir de manera similar. En una realización, la concentración de vitamina C en el medio o medio de cultivo es preferiblemente de 5 pg/ml - 200 pg/ml. En otra realización, se añade vitamina C al medio de cultivo en una cantidad correspondiente a 5 pg/ml - 500 pg/ml (p. ej., una cantidad correspondiente a 5 pg/ml, 10 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 300 pg/ml, 400 pg/ml, 500 pg/ml).

En la etapa (2), son preferibles el inhibidor de p38 y/o SDF-1 (factor 1 derivado de células estromales). En la presente memoria descriptiva, el "inhibidor de p38" significa una sustancia que inhibe las funciones de la proteína p38 (p38 MAP quinasa). Los ejemplos de los mismos incluyen, pero sin limitación, inhibidor químico de p38, mutante dominante negativo de p38 o ácido nucleico que lo codifica y similares.

Los ejemplos del inhibidor químico de p38 que se utilizará en la etapa (2) incluyen, pero sin limitación, SB203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfonilfenil)-5-(4-piridil)-1 H-imidazol), y un derivado del mismo, SB202190 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxifenil)-5-(4-piridil)-1 H-imidazol) y un derivado del mismo, SB239063 (trans-4-[4-(4-fluorofenil)-5-(2-metoxi-4-pirimidinil)-1H-imidazol-1-il]ciclohexanol) y un derivado del mismo, SB220025 y un derivado del mismo, PD169316, RPR200765A, AMG-548, BIRB-796, SClO-469, SCIO-323, VX-702 y FR167653. Estos compuestos están disponibles comercialmente y, por ejemplo, SB203580, SB202190, SB239063, SB220025 y PD169316 están disponibles en Calbiochem, y SClO-469 y SCIO-323 están disponibles en Scios y similares. El inhibidor químico de p38 es preferiblemente SB203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfonilfenil)-5-(4-piridil)-1 H-imidazol), o un derivado del mismo.

Los ejemplos del mutante dominante negativo de p38 en la etapa (2) incluyen p38T 180A obtenido por mutación puntual de la treonina en la posición 180 ubicada en la región de unión al ADN de p38 a alanina, p38Y182F obtenido por mutación puntual de la tirosina en la posición 182 de p38 en humanos y ratones a fenilalanina y similares. El inhibidor de p38 está contenido en un medio en una concentración, por ejemplo, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 50 pM. Cuando se utiliza SB203580 como inhibidor de P38, puede estar contenido en un medio a 1 pM - 50 pM, 5 pM - 30 pM, 10 pM - 20 pM.

El SDF-1 en la etapa (2) puede ser no solo SDF-1 a o una forma madura del mismo, sino también una isoforma tal como SDF-1p, SDF-1<y>, SDF-15, SDF-1<s>, SDF-1^ y similares o una forma madura de los mismos, o una mezcla de estos a cualquier razón o similares. Preferiblemente se utiliza SDF-1 a. A veces se hace referencia al SDF-1 como CXCL-12 o PBSF.

En la etapa (2), uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SDF-1 pueden sustituirse, eliminarse, añadirse y/o insertarse siempre que tenga la actividad de la quimiocina (SDF-1 con dicha sustitución, eliminación, adición y/o inserción de aminoácido también se denominará "SDF-1 mutante"). De manera similar, la cadena de azúcar puede sustituirse, eliminarse y/o añadirse en SDF-1 o SDF-1 mutante. Los ejemplos del mutante del SDF-1 mencionado anteriormente incluyen aquellos que mantienen al menos 4 residuos de cisteína (Cys30, Cys32, Cys55 y Cys71 en el SDF-1 a humano) y que tienen no menos del 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de una sustancia natural, aunque la mutación de aminoácidos no se limita a esto. El SDF-1 puede obtenerse de un mamífero, por ejemplo, un ser humano o un mamífero no humano tal como un mono, una oveja, un bovino, un caballo, un cerdo, un perro, un gato, un conejo, una rata, un ratón y similares. Por ejemplo, la proteína registrada con número de acceso en GenBank: NP_954637 se puede utilizar como SDF-1 a humana, y la proteína registrada con número de acceso en GenBank: NP_000600 se puede utilizar como SDF-1 p.

El SDF-1 puede estar disponible comercialmente, purificado de la naturaleza o producido mediante síntesis de péptidos o técnicas de ingeniería genética. El SDF-1 está contenido en un medio dentro del intervalo de, por ejemplo, aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. Además, también se puede utilizar una alternativa SDF-1 que tenga una actividad similar a la de SDF-1 en lugar de SDF-1. Los ejemplos de dicha alternativa de SDF-1 incluyen el agonista CXCR4, y se puede añadir al medio un compuesto de bajo peso molecular que tenga una actividad agonista CXCR4 y similares en lugar de SDF-1.

El medio de cultivo utilizado en la etapa (2) puede complementarse además con al menos un tipo, preferiblemente todos, de citocinas seleccionadas del grupo que consiste en SCF, TPO (trombopoyetina), FLT-3L e IL-7. Su concentración es, por ejemplo, de 10 ng/ml a 100 ng/ml para el SCF, de 10 ng/ml a 200 ng/ml para la TPO, de 1 ng/ml a 100 ng/ml para la IL-7 y de 1 ng/ml a 100 ng/ml para la FLT-3L.

En la etapa (2), las células progenitoras hematopoyéticas pueden cultivarse mediante cultivo adherente o cultivo en suspensión. En casos de cultivo adherente, se puede utilizar un recipiente de cultivo revestido y/o las células progenitoras hematopoyéticas se pueden co-cultivar con células alimentadoras y/o similares. Los ejemplos de células alimentadoras para el co-cultivo incluyen una línea de células del estroma de la médula ósea, células OP9 (disponibles en Riken BioResource Center). La célula OP9 es preferiblemente una célula OP9-DL4 o una célula OP9-DL1, que expresa constantemente DLL4 o DLL1 (p. ej., Holmes R I y Zuniga-Pflucker J C. Cold Spring Harb Protoc. 2009(2)). En la etapa (2), en los casos en que se utilizan células OP9 como células alimentadoras, se puede añadir DLL1, o un DLL4 o DLL1 preparado por separado, o una proteína de fusión de DLL4 o DLL1, y Fc o similar, al medio para realizar el co-cultivo. Cuando se utilizan células alimentadoras, es preferible reemplazarlas de manera adecuada durante el cultivo. La sustitución de las células alimentadoras se puede llevar a cabo transfiriendo las células objeto que se están cultivando a células alimentadoras que se siembran preliminarmente. La sustitución podrá realizarse cada cinco días, cada cuatro días, cada tres días o cada dos días. Cuando las células progenitoras hematopoyéticas se obtienen mediante cultivo en suspensión de embriones, es preferible realizar un cultivo de adhesión después de la disociación en células individuales. Si bien las células pueden co-cultivarse con células alimentadoras, el cultivo se realiza preferiblemente sin utilizar células alimentadoras.

En el caso de cultivo de adhesión y cuando un recipiente de cultivo está revestido, los ejemplos del agente de revestimiento incluyen Matrigel (Niwa A, et al. PLos One, 6(7):e22261, 2011)), colágeno, gelatina, laminina, proteoglicano de ácido heparán sulfúrico, RetroNectin, proteína de fusión de DLL4 o DLL1, o DLL4 o DLL1, y región Fc de anticuerpo (en lo sucesivo en la presente memoria a veces denominada Fc) y similares (p. ej., quimera DLL4/Fc), entactina y/o combinación de estos, y es preferible una combinación de RetroNectin y proteína de fusión de DLL4 y Fc, etc.

En la etapa (2), las condiciones de temperatura de cultivo no están limitadas. La temperatura es, por ejemplo, de aproximadamente 37°C a aproximadamente 42°C, preferiblemente de aproximadamente 37 a aproximadamente 39°C. El período de cultivo puede ser determinado apropiadamente por los expertos en la técnica mediante el monitoreo del número de células CD3 positivas y similares. El número de días de cultivo no está limitado siempre que se puedan obtener células CD3 positivas. Los ejemplos del período de cultivo incluyen al menos no menos de 10 días, no menos de 12 días, no menos de 14 días, no menos de 16 días, no menos de 18 días, no menos de 20 días, no menos de 22 días y no menos de 23 días. El período de cultivo es preferiblemente de 21 días. Además, no es preferible más de 90 días, y no es más preferible más de 42 días.

Las células obtenidas mediante las etapas anteriores incluyen células CD3-positivas. Un método específico para diferenciar células madre pluripotentes en células CD3 positivas puede incluir además la siguiente etapa (3).

(3) Etapa de obtención de células CD3 positivas CD8 positivas CD4 negativas (o células CD3 positivas CD8 positivas CD4 negativas CD30 positivas) o etapa de enriquecimiento de células CD3 positivas

Los ejemplos del método para obtener células CD3-positivas CD8-positivas CD4-negativas (o células CD3-positivas CD8-positivas CD4-negativas CD30-positivas) incluyen los métodos descritos en los documentos WO 2016/076415, WO 2017/221975 y similares. Las células CD3 positivas también pueden enriquecerse utilizando un método similar.

En la etapa (3), un medio utilizado para obtener células CD3 positivas, CD8 positivas, CD4 negativas (o células CD3 positivas, CD8 positivas, CD4 negativas, CD30 positivas) o enriquecer células CD3 positivas no está particularmente limitado, y un medio utilizado para cultivar células animales se puede preparar en un medio basal. Los ejemplos del medio basal incluyen aquellos similares al medio basal utilizado en la etapa (1) mencionado anteriormente. El medio puede contener suero o no contenerlo. Si es necesario, el medio basal también puede contener vitamina C (p. ej., ácido ascórbico), albúmina, insulina, transferrina, compuesto de selenio (p. ej., selenito de sodio), ácido graso, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, tioglicerol (p. ej., amonotioglicerol (MTG)), lípidos, aminoácidos L-alanil-L-glutamina (p. ej., Glutamax (marca comercial registrada)), factores de crecimiento, aminoácidos no esenciales, compuestos de bajo peso molecular, antibióticos, antioxidantes, ácido pirúvico, tampones, sales inorgánicas y similares.

Cuando se utiliza vitamina C en la etapa (3), la vitamina C puede ser similar a las descritas en la etapa (1) y se puede añadir de manera similar. En una realización, la concentración de vitamina C en el medio o medio de cultivo es preferiblemente de 5 gg/ml - 200 gg/ml. En otra realización, se añade vitamina C al medio de cultivo en una cantidad correspondiente a 5 pg/ml - 500 pg/ml (p. ej., una cantidad correspondiente a 5 pg/ml, 10 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 300 pg/ml, 400 pg/ml, 500 pg/ml).

Cuando se utiliza hormona en la etapa (3), los ejemplos de la hormona incluyen corticosteroides. El corticosteroide es glucocorticoide o un derivado del mismo, y se citan como ejemplos acetato de cortisona, hidrocortisona, acetato de fludrocortisona, predonisolona, triamcinolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona y dipropionato de beclometasona. Se prefiere la dexametasona. Cuando el corticosteroide es dexametasona, su concentración en el medio es de 1 nM - 100 nM.

En la etapa (3), el medio contiene un agonista del complejo CD3/TCR. El agonista del complejo CD3/TCR no está particularmente limitado siempre que sea una molécula capaz de transducir una señal de un complejo CD3/TCR a una célula CD3 positiva uniéndose específicamente a al menos una parte del complejo CD3/TCR. Los ejemplos del agonista del complejo CD3/TCR incluyen el agonista CD3 y/o el agonista TCR. Como agonista CD3, se puede mencionar un anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo, y como agonista TCR, se puede mencionar al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo agonista anti-TCR o un fragmento de unión del mismo, un complejo MHC/péptido antígeno o un multímero del mismo, y un complejo MHC/superantígeno o un multímero del mismo. Cuando se utiliza un anticuerpo agonista anti-CD3, el anticuerpo agonista anti-CD3 incluye tanto un anticuerpo policlonal como un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, preferiblemente IgG. Como anticuerpo agonista anti-CD3, se puede mencionar un anticuerpo (OKT3) producido a partir del clon OKT3, un anticuerpo (UCHT1) producido a partir del clon UCHT1 y similares, y es preferiblemente UCHT1. Cuando el anticuerpo agonista anti-CD3 es OKT3, OKT3 incluye RYTMH (SEQ ID NO: 9), YINPSRGYTNYNQKFKD (SEQ ID NO: 10) y YYDDHYCLDY (SEQ ID NO: 11) como regiones determinantes de complementariedad 1-3 en la región variable de la cadena pesada, y SASSSVSYMN (SEQ ID NO: 12), DTSKLAS (SEQ ID NO: 13) y QQWSSNPFT (SEQ ID NO: 14) como regiones determinantes de complementariedad 1-3 en la región variable de la cadena ligera. Además, OKT3 incluye preferiblemente una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 21 y una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 22. Cuando el anticuerpo agonista anti-CD3 es UCHT1, UCHT1 incluye GYSFTGYTMN (SEQ ID NO: 15), LINPYKGVST (SEQ ID NO: 16) y SGYYGDSDWYFDV (SEQ ID NO: 17) como regiones determinantes de complementariedad 1-3 en la región variable de la cadena pesada, y RASQDIRNYLN (SEQ ID NO: 18), YTSRLHS (SEQ ID NO: 19) y QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 20) como regiones determinantes de complementariedad 1-3 en la región variable de la cadena ligera. Además, UCHT1 incluye preferiblemente una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 23 y una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 24. La concentración de anticuerpo agonista anti-CD3 en el medio es, por ejemplo, 10 ng/ml - 1.000 ng/ml, preferiblemente 50 ng/ml - 800 ng/ml, más preferiblemente 250 ng/ml - 600 ng/ml.

Cuando se utiliza citocina en la etapa (3), se pueden mencionar IL-2 e IL-7 y similares como la citocina. Cuando la citocina es IL-2, su concentración en el medio es de 10 U/ml - 1.000 U/ml, y cuando es IL-7, su concentración en el medio es de 1 ng/ml - 1.000 ng/ml.

En la etapa (3), las condiciones de temperatura de cultivo no están particularmente limitadas. La temperatura es, por ejemplo, de aproximadamente 37°C a aproximadamente 42°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C a aproximadamente 39°C. El período de cultivo puede ser determinado apropiadamente por los expertos en la técnica mediante el monitoreo del número de células CD3 positivas y similares. El número de días de cultivo no está limitado, siempre que se puedan obtener células CD3 positivas. El período de cultivo es, por ejemplo, al menos 1 día o más, 2 días o más, 3 días o más, 4 días o más, 5 días o más y, preferiblemente, 6 días. Preferiblemente es de 28 días o menos, más preferiblemente de 14 días o menos.

Como se ha descrito anteriormente, mediante la diferenciación de células madre pluripotentes, se pueden obtener células CD3-positivas que se cultivarán mediante el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención.

El método de producción o método de cultivo de expansión de la presente invención incluye una etapa de cultivo de células CD3-positivas en presencia de un agonista del complejo CD3/TCR, fibronectina o una variante de la misma, y un agonista CD30 (en lo sucesivo en la presente memoria denominada etapa (I) de la presente invención).

En la etapa (I) de la presente invención, el agonista del complejo CD3/TCR puede ser el mismo que el agonista del complejo CD3/TCR utilizado en la etapa (3).

En la etapa (I) de la presente invención (o la etapa (3)), cuando el agonista del complejo CD3/TCR a utilizar es un anticuerpo agonista anti-CD3 o un anticuerpo anti-TCR, los anticuerpos policlonales de los mismos se pueden producir, por ejemplo, mediante el siguiente método. Por ejemplo, en el caso del anticuerpo policlonal para CD3, se inmunizan mamíferos tales como conejos, ratones, ratas, cabras, cobayas, hámsteres y similares (de 1 a varias dosis de refuerzo cada aproximadamente 1 a 4 semanas desde la inmunización inicial) con una mezcla de un péptido parcial (p. ej., cadena<y>, 5, £, Zn) que contiene CD3 o un epítopo del mismo y adyuvante de Freund completo o incompleto (FCA o FIA) como antígeno de inmunización, y en el caso del anticuerpo policlonal para TCR, los mamíferos se inmunizan con una mezcla de un péptido parcial (p. ej., cadena a, p,<y>5) que contiene TCR o un epítopo del mismo y adyuvante de Freund completo o incompleto (FCA o FIA) como antígeno de inmunización. Aproximadamente de 3 a 10 días después de cada inmunización adicional, se mide el título de anticuerpos del suero parcialmente recolectado utilizando una reacción antígeno-anticuerpo conocida convencionalmente, y se confirma su aumento. Además, aproximadamente de 3 a 10 días después de la inmunización final, se recolecta sangre completa y se purifica el antisuero. El anticuerpo policlonal también se puede purificar como una sola clase de inmunoglobulina mediante una técnica de separación convencional, como la precipitación con sal (p. ej., fraccionamiento con sulfato de amonio), centrifugación, diálisis y cromatografía en columna.

Cuando el anticuerpo agonista anti-CD3 o el anticuerpo anti-TCR utilizado en la etapa (I) de la presente invención (o la etapa (3)) es un anticuerpo monoclonal, el anticuerpo monoclonal puede obtenerse generalmente a partir de hibridomas (células de fusión) producidos por fusión celular. Es decir, al igual que en el anticuerpo policlonal mencionado anteriormente, se puede producir aislando células productoras de anticuerpos de un mamífero inmunosensibilizado a un péptido parcial que contiene CD3 o TCR o un epítopo del mismo, fusionándolos con células de mieloma para formar un hibridoma, clonando el hibridoma y seleccionando, como antígeno marcador, un clon que produzca un anticuerpo que muestre afinidad específica por CD3 o TCR. Además, también se puede utilizar una célula productora de anticuerpos obtenida mediante la reacción de CD3 con esplenocitos o linfocitos aislados previamente en un medio de cultivo. En este caso, también se pueden preparar células productoras de anticuerpos de origen humano.

El hibridoma que secreta anticuerpo monoclonal se puede preparar según el método de Kohler y Milstein (Nature, Vol. 256, págs. 495-497, 1975) o un método modificado del mismo. Es decir, el anticuerpo monoclonal se prepara cultivando un hibridoma obtenido mediante la fusión de células productoras de anticuerpos contenidas en esplenocitos, timocitos, células de ganglios linfáticos, linfocitos periféricos, células de mieloma o tonsilas, preferiblemente esplenocitos, obtenidos de animales inmunosensibilizados como se ha descrito anteriormente, con preferiblemente células de mieloma de mamíferos alogénicos tales como ratón, rata, conejillo de indias, hámster, conejo o humano, más preferiblemente ratón, rata o humano. El cultivo se puede realizarin vitrooin vivoen mamíferos tales como ratón, rata, conejillo de indias, hámster, conejo, preferiblemente ratón o rata, más preferiblemente por vía intraperitoneal en ratones, y el anticuerpo se puede obtener del sobrenadante del cultivo o ascitis del mamífero.

Los ejemplos de células de mieloma utilizadas para la fusión celular incluyen mieloma derivado de ratón (p. ej., P3-NSI-1 -Ag4-1, P3-X63-Ag8-U1, P3-X63-Ag8-653, SP2/0-Ag14, BW5147 y similares), mieloma derivado de rata (p. ej., 210RCY3-Ag1.2.3 y similares), mieloma derivado de humano (p. ej., U-266AR1, GML500-6TG-A1 -2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 y CEM-T15 y similares) y similares.

Un clon de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal se puede detectar cultivando el hibridoma en, por ejemplo, una microplaca de titulación, y midiendo la reactividad del sobrenadante de cultivo en el pocillo, que mostró proliferación, con CD3 mediante radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático, inmunoensayo de fluorescencia y similares.

El aislamiento y la purificación del anticuerpo monoclonal se pueden realizar sometiendo el sobrenadante del cultivo que contiene el anticuerpo o la ascitis producida por el método descrito anteriormente a cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en columna de afinidad tal como una columna de antiinmunoglobulina o una columna de proteína G.

El anticuerpo monoclonal utilizado en la etapa (I) de la presente invención (o la etapa (3)) de la presente invención puede obtenerse por cualquier método sin limitarse al método de producción. Si bien un anticuerpo monoclonal generalmente tiene una cadena de azúcar que tiene una estructura diferente según el tipo de mamífero a inmunosensibilizar, el anticuerpo monoclonal en la presente invención no está limitado por la diferencia estructural de la cadena de azúcar e incluye anticuerpos monoclonales derivados de cualquier mamífero.

El anticuerpo agonista anti-CD3 o anticuerpo anti-TCR incluye el anticuerpo policlonal, anticuerpo natural tal como anticuerpo monoclonal (mAb), anticuerpo quimérico (anticuerpo humanizado) que se puede producir utilizando tecnología de recombinación genética, anticuerpo monocatenario y fragmentos de unión de estos anticuerpos. El fragmento de unión de un anticuerpo significa una región de una parte del anticuerpo que tiene actividad de unión específica, e incluye específicamente Fab, Fab', F(ab')2, scAb, scFv, scFv-Fc y similares.

Además, los expertos en la técnica pueden producir un anticuerpo de fusión de un anticuerpo agonista anti-CD3 o un anticuerpo anti-TCR o un fragmento de unión del mismo con otro péptido o proteína, o un anticuerpo modificado al que está unido un agente modificador. Otros péptidos y proteínas utilizados para la fusión no están particularmente limitados siempre que no reduzcan la actividad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden mencionar albúmina sérica humana, varios péptidos etiqueta, péptidos con motivos de hélice artificiales, proteínas de unión a maltosa, glutatión S transferasa, varias toxinas, otros péptidos o proteínas que pueden promover la multimerización y similares. El agente modificador utilizado para la modificación no está particularmente limitado siempre que no reduzca la actividad de unión del anticuerpo, y los ejemplos del mismo incluyen polietilenglicol, cadena de azúcar, fosfolípido, liposoma, compuesto de bajo peso molecular y similares.

Como anticuerpo agonista anti-CD3, también se puede utilizar un reactivo que se puede comprar. El anticuerpo agonista anti-CD3 que se puede comprar no está particularmente limitado y, por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo (OKT3) producido a partir de un clon OKT3 (anti-CD3 humano de grado funcional purificado (Clon: OKT3) (eBioscience)), un anticuerpo (UCHT1) producido a partir del clon UCHT1 (anticuerpo CD3 (Clon: UCHT1) (GeneTex)), y similares, y se puede utilizar preferiblemente UCHT1.

Cuando el agonista del complejo CD3/TCR utilizado en la etapa (I) de la presente invención (o la etapa (3)) es un complejo MHC/péptido antigénico, el complejo MHC/péptido antigénico no está particularmente limitado siempre que sea una molécula específicamente reconocida por el complejo CD3/TCR de células CD3-positivas y la molécula pueda transmitir una señal a las células CD3-positivas.

El MHC que constituye el complejo MHC/péptido antígeno puede ser MHC de clase I o MHC de clase II, preferiblemente MHC de clase I.

En la etapa (I) de la presente invención (o la etapa (3)), la clase I del MHC no está particularmente limitada siempre que sea una molécula que forme un complejo con un péptido antigénico, sea reconocida por el complejo CD3/TCR y CD8, y transmita una señal a las células CD3-positivas. El MHC de clase I es, por ejemplo, un dímero compuesto por una cadena a (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F o HLA-G para humanos, H-2K, H-2D o H-2L para ratones) y p2 microglobulina, preferiblemente, un dímero compuesto por HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F o HLA-G, y p2 microglobulina, más preferiblemente, un dímero compuesto por HLA-A, HLA-B o HLA-C, y p2 microglobulina. En el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención, los ejemplos específicos de la clase I de MHC incluyen, pero sin limitación, HLA-A*02:01, HLA-A*24:02, HLA-A*01:01 y similares. El péptido antigénico no está particularmente limitado siempre que sea un péptido presentado por MHC de clase I. Como péptido antigénico presentado por MHC de clase I, se pueden mencionar, por ejemplo, HER-2/neu, MART-1, NY-ESO-1, Gp-100, MUC-1, p53, antígeno prostático específico (PSA), hTERT, WT1, survivina, CEA, MAGE-3, péptido derivado de proteína derivada de un grupo de virus fuertemente relacionados con el desarrollo de tumores malignos, y similares, y es preferible el péptido derivado de WT1. Como péptido derivado de WT1 específico, se pueden mencionar RMFPNAPYL (s Eq ID NO: 1), SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 2), CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3) (péptido modificado del mismo CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4)) y similares.

En la etapa (I) de la presente invención (o la etapa (3)), la clase II del MHC no está particularmente limitada siempre que sea una molécula que forme un complejo con un péptido antigénico, sea reconocida por el complejo CD3/TCR y CD4, y transmita una señal a las células CD3-positivas La clase II del MHC es, por ejemplo, HLA-DR, h LA-DQ o HLA-DP para humanos, y H-2A o H-2B para ratones, cada uno de los cuales es un dímero compuesto por una cadena a y una cadena p (p. ej., HLA-DR se compone de HLA-DRA como cadena a y HLA-DRB1 como cadena p), preferiblemente, h LA-DR, HLA-DQ o HLA-DP. El péptido antigénico no está particularmente limitado siempre que sea un péptido presentado por MHC clase II. Como péptido antigénico presentado por MHC de clase II, se pueden mencionar, por ejemplo, WT1, PSA, MAGE-3, CEA, survivina, tirosinasa, péptido derivado de proteína derivada de un grupo de virus fuertemente relacionados con el desarrollo de tumores malignos y similares, siendo preferible el péptido derivado de WT1.

El MHC y/o el péptido antigénico (en lo sucesivo en la presente memoria denominado MHC y similares) pueden ser una proteína sintetizada químicamente o una proteína sintetizada bioquímicamente en un sistema de traducción libre de células. Alternativamente, la proteína puede ser una proteína recombinante producida a partir de un transformante que incorpora un ácido nucleico que tiene una secuencia de bases que codifica MHC y similares.

Cuando MHC y similares se producen según un método conocido de síntesis de péptidos, por ejemplo, se puede utilizar cualquiera de un método de síntesis en fase sólida y un método de síntesis en fase líquida. La proteína deseada se puede producir condensando un derivado de aminoácido que tiene un grupo protector unido a un grupo carboxi y un grupo funcional de una cadena lateral, y un derivado de aminoácido que tiene un grupo amino protegido y un grupo funcional protegido de una cadena lateral, y eliminando los grupos protectores.

La condensación y eliminación de grupos protectores se realizan según un método conocido en sí mismo, por ejemplo, los métodos descritos en (1) - (5) a continuación.

(1) M. Bodanszky y M.A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, Nueva York (1966)

(2) Schroeder y Luebke: The Peptide, Academic Press, Nueva York (1965)

(3) Nobuo Izumiya, et al.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide synthesis), publicado por Maruzen Co. (1975)

(4) Haruaki Yajima y Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)

(5) Haruaki Yajima, ed.: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), Vol. 14, Peptide Synthesis, publicado por Hirokawa Shoten.

El MHC y similares así obtenidos pueden purificarse o aislarse mediante un método de purificación conocido. Aquí, como ejemplos del método de purificación, se pueden mencionar la extracción con disolventes, la destilación, la cromatografía en columna, la cromatografía líquida, la recristalización, combinaciones de las mismas y similares.

Cuando el MHC y similares así obtenidos están en una forma libre, la forma libre se puede convertir en una forma de sal adecuada mediante un método conocido o un análogo del mismo, y por otro lado, cuando el MHC y similares se obtienen en forma de sal, se pueden convertir en la forma libre o en la forma de una sal diferente mediante un método conocido o un análogo del mismo.

Además, el MHC y similares también se pueden producir cultivando un transformante que comprende un ácido nucleico que lo codifica, y separando y purificando el MHC y similares del cultivo obtenido. El ácido nucleico que codifica MHC y similares puede ser ADN o ARN, o una quimera de ADN/ARN, y preferiblemente ADN. Además, el ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. En el caso de cadenas dobles, se puede utilizar ADN bicatenario, ARN bicatenario o híbrido ADN:ARN. En el caso de una sola hebra, puede ser una hebra de sentido (es decir, una hebra codificante) o una hebra antisentido (es decir, una hebra no codificante).

Los ejemplos de ADN que codifica MHC y similares incluyen ADN genómico, ADNc derivado de células de animales de sangre caliente (p. ej., humanos, bovinos, monos, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, conejillos de indias, ratas, ratones, conejos, hámsteres, aves y similares), ADN sintético y similares. El ADNc que codifica MHC y similares se puede amplificar directamente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviado como "método PCR") utilizando, como plantilla, una fracción total de ARN o ARNm preparada a partir de cualquier célula de los animales [p. ej., hepatocito, esplenocito, célula nerviosa, célula glial, célula p pancreática, mielocito, célula mesangial, célula de Langerhans, célula epidérmica, célula epitelial, célula caliciforme, célula endotelial, célula de músculo liso, fibroblasto, fibrocito, miocito, adipocito, inmunocito (p. ej., macrófago, célula T, célula B, célula asesina natural, mastocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocito), megacariocito, célula sinovial, condrocito, célula ósea, osteoblasto, osteoclasto, célula de la glándula mamaria, hepatocito, célula intersticial o una célula progenitora, célula madre o célula cancerosa correspondiente de la misma, etc.] o cualquier tejido en el que están presentes estas células [p. ej., cerebro o cualquier porción del cerebro (p. ej., bulbo olfatorio, núcleo amigdaloide, ganglios basales, hipocampo, tálamo, hipotálamo, corteza cerebral, bulbo raquídeo, cerebelo), médula espinal, hipófisis, estómago, páncreas, riñón, hígado, gónada, tiroides, vesícula biliar, médula ósea, glándula suprarrenal, piel, pulmón, tracto gastrointestinal (p. ej., intestino grueso e intestino delgado), vaso sanguíneo, corazón, timo, bazo, glándula submandibular, sangre periférica, próstata, testículo, ovario, placenta, útero, hueso, articulación, tejido adiposo (p. ej., tejido adiposo marrón, tejido adiposo blanco), músculo esquelético, etc.], y mediante reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como "método PCR") y PCR con transcriptasa inversa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como "método RT-PCR"). Alternativamente, el ADNc que codifica MHC y similares también se puede clonar mediante el método de hibridación de colonias o placas o el método de PCR y similares a partir de una biblioteca de ADNc preparada insertando el ARN total mencionado anteriormente o un fragmento de ARNm en un vector adecuado. El vector utilizado para la biblioteca puede ser un bacteriófago, un plásmido, un cósmido, un fagémido y similares.

Un ADN que codifica MHC y similares se puede clonar amplificando un cebador de ADN sintetizado que tiene una parte de una secuencia de bases que codifica el MHC y similares mediante el método de PCR, o hibridando un ADN incorporado en un vector de expresión adecuado con un fragmento de ADN marcado o ADN sintético que codifica una parte o la totalidad de una región de MHC y similares. La hibridación se puede realizar mediante un método conocido en sí mismo o un método análogo al mismo, por ejemplo, mediante el método descrito en Molecular Cloning, 2.a ed. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) y similares. Cuando se utiliza una biblioteca disponible comercialmente, la hibridación se puede realizar según el manual de instrucciones adjunto. La hibridación se puede realizar preferiblemente en condiciones rigurosas.

Como ejemplos de condiciones altamente estrictas, se pueden mencionar las condiciones de una reacción de hibridación en 6xSSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) a 45°C seguida de un lavado en 0,2xSSC/0,1% SDS a 65°C una vez o más y similares. Los expertos en la técnica pueden obtener fácilmente la rigurosidad deseada modificando la concentración de sal de la disolución de hibridación, la temperatura de la reacción de hibridación, la concentración de la sonda, la longitud de la sonda, el número de desajustes, el tiempo de la reacción de hibridación, la concentración de sal de la disolución de lavado, la temperatura de lavado y similares, según corresponda. Cuando se utiliza una biblioteca disponible comercialmente, la hibridación se puede realizar según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto a la biblioteca.

Un vector de expresión que comprende ADN que codifica MHC y similares se puede producir, por ejemplo, cortando un fragmento de ADN deseado del ADN que codifica MHC y similares, y uniendo el fragmento de ADN aguas abajo de un promotor en un vector de expresión apropiado.

Como vector de expresión, se utilizan plásmidos derivados de Escherichia coli (p. ej., pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); plásmidos de expresión de células animales (p. ej., pA1 -11 , pXT1 , pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo); vectores de virus animales tales como retrovirus, virus vaccinia, adenovirus, lentivirus y similares; y similares.

El promotor puede ser cualquier promotor, siempre que sea apropiado para el huésped utilizado para expresar el gen.

Por ejemplo, cuando el huésped es una célula animal, se utilizan el promotor SRa, el promotor SV40, el promotor LTR, el promotor CMV (citomegalovirus), el promotor RSV (virus del sarcoma de Rous), el promotor LTR MoMuLV (virus de la leucemia murina de Moloney), el promotor HSV-TK (timidina quinasa del virus del herpes simple) y similares. De estos, se prefieren el promotor CMV, el promotor SRa y similares.

Cuando el huésped es una bacteria del género Escherichia, se prefieren el promotor trp, el promotor lac, el promotor recA, el promotor AP<l>, el promotor lpp, el promotor T7 y similares.

Los vectores de expresión utilizados en la presente memoria incluyen, además de los anteriores, vectores de expresión que opcionalmente comprenden un potenciador, una señal de empalme, una señal de adición de poliA, un marcador de selección, un origen de replicación SV40 (en lo sucesivo en la presente memoria también abreviado como SV40 ori) y similares. Como ejemplos de marcadores de selección, se pueden mencionar el gen de la dihidrofolato reductasa (en lo sucesivo en la presente memoria también abreviado como dhfr) [resistencia al metotrexato (MTX)], el gen de resistencia a la ampicilina (en lo sucesivo en la presente memoria también abreviado como ampr), el gen de resistencia a la neomicina (en lo sucesivo en la presente memoria también abreviado como neor, resistencia a G418) y similares. En particular, cuando se utiliza una célula de hámster chino defectuosa en el gen dhfr y el gen dhfr se utiliza como marcador de selección, también se puede seleccionar un gen objetivo utilizando un medio sin timidina.

Cuando sea necesario, se puede añadir una secuencia de bases que codifique una secuencia de señal adecuada para un huésped (codón de señal) (o sustituirla con un codón de señal nativo) al lado 5'-terminal de un ADN que codifique MHC y similares. Por ejemplo, cuando el huésped es del género Escherichia, se utilizan la secuencia señal PhoA, la secuencia señal OmpA y similares; cuando el huésped es una célula animal, se utilizan la secuencia señal de insulina, la secuencia señal de interferón a, la secuencia señal de molécula de anticuerpo y similares.

El MHC y similares se pueden producir transformando un huésped con un vector de expresión que contiene el ADN mencionado anteriormente que codifica el MHC y similares, y cultivando el transformante obtenido.

Como huésped se utilizan, por ejemplo, el género Escherichia, células animales y similares.

Como género Escherichia, se utilizan, por ejemplo, K12 DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 60,160(1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, vol. 9, 309(1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, vol. 120, 517(1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, vol. 41,459(1969)], C600 [Genetics, vol. 39, 440(1954)] y similares.

Como célula animal, se pueden utilizar, por ejemplo, células COS-7 de mono, células Vero de mono, células de ovario de hámster chino (en lo sucesivo en la presente memoria abreviadas como células CHO), células CHO defectuosas en el gen dhfr (en lo sucesivo en la presente memoria abreviadas como células CHO(dhfr-)), células L de ratón, células AtT-20 de ratón, células de mieloma de ratón, células GH3 de rata, células FL humanas y similares.

La transformación se puede llevar a cabo según el tipo de huésped según un método conocido.

El género Escherichia se puede transformar, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 69, 2110(1972), Genee, vol. 17, 107(1982) y similares.

Las células animales se pueden transformar según, por ejemplo, el método descrito en Saibo Kogaku, número adicional 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol, 263-267 (1995), publicado por Shujunsha, o Virology, 52, 456 (1973).

Como ejemplo del medio utilizado para cultivar un transformante cuyo huésped es una bacteria del género Escherichia, es preferible un medio M9 suplementado con glucosa y un aminoácido cas [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1972]. Según sea necesario, para aumentar la eficiencia del promotor, se puede añadir al medio un agente químico como el ácido 3p-indolilacrílico.

El cultivo de un transformante cuyo huésped es una bacteria del género Escherichia se lleva a cabo normalmente a aproximadamente 15°C a aproximadamente 43°C durante aproximadamente 3 a aproximadamente 24 horas. Si fuera necesario, el cultivo podrá airearse o agitarse.

Como medio utilizado al cultivar un transformante cuyo huésped es una célula animal, se utiliza, por ejemplo, medio esencial mínimo (MEM) que contiene aproximadamente 5 - aproximadamente 20% de suero bovino fetal [Science, vol. 122, 501(1952)], medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) [Virology, vol. 8, 396(1959)], medio RPMI1640 [The Journal of the American Medical Association, vol. 199, 519(1967)], medio 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, vol. 73, 1(1950)] o similares. El pH del medio es preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. El cultivo se lleva a cabo normalmente a aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C durante aproximadamente 15 a aproximadamente 60 horas. Cuando sea necesario, el cultivo podrá airearse o agitarse.

Como se ha descrito anteriormente, MHC y similares se pueden producir en una célula del transformante o fuera de la célula.

El MHC y similares se pueden separar y purificar del cultivo obtenido cultivando el transformante según un método conocido en sí mismo.

Por ejemplo, cuando se extrae MHC o similar de una bacteria cultivada o citoplasma de célula, se utiliza un método según sea apropiado en donde las bacterias o células se recogen del cultivo por un medio conocido, se suspenden en una disolución tampón apropiada y se desintegran por medio de sonicación, lisozima y/o congelación-descongelación y similares, después de lo cual se obtiene un extracto crudo de proteína soluble por centrifugación o filtración. La disolución tampón puede comprender un agente desnaturalizante de proteínas como urea o clorhidrato de guanidina y un tensioactivo como Triton X-100™. Además, cuando el MHC o similar se secreta fuera de la bacteria (célula), se utiliza un método para separar un sobrenadante de cultivo mediante centrifugación, filtración o similar de un cultivo, y similares.

El aislamiento y la purificación de MHC y similares contenidos en la fracción soluble y el sobrenadante de cultivo así obtenidos se pueden realizar según un método conocido en sí mismo. Los métodos útiles incluyen métodos basados en solubilidad, tales como precipitación con disolvente y salazón; métodos basados principalmente en diferencias de peso molecular, tales como diálisis, ultrafiltración, filtración en gel y electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS; métodos basados en diferencias de carga, tales como cromatografía de intercambio iónico; métodos basados en afinidad específica, tales como cromatografía de afinidad; métodos basados en diferencias de hidrofobicidad, tales como cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa; y métodos basados en diferencias de punto isoeléctrico, tales como isoelectroenfoque. Estos métodos pueden combinarse según sea apropiado.

El complejo MHC/péptido antígeno obtenido como se ha descrito anteriormente puede ser un multímero Al multimerizar el complejo MHC/péptido antígeno, se puede esperar un mayor efecto agonista sobre el TCR. Se conoce el método para multimerizar el complejo péptido antígeno/MHC de la presente invención. Por ejemplo, el complejo péptido antígeno/MHC modificado con biotina se puede tetramerizar a través de un tetrámero de avidina o estreptavidina. Alternativamente, también se puede multimerizar ligando el complejo MHC/péptido antígeno al dextrano.

Cuando el agonista del complejo CD3/TCR utilizado en la etapa (I) de la presente invención (o la etapa (3)) es un complejo MHC/superantígeno, el complejo MHC/superantígeno es un complejo de MHC de clase II y superantígeno. Como superantígeno se pueden mencionar la enterotoxina estafilocócica, la exotoxina pirogénica estreptocócica, la toxina del síndrome de choque tóxico y similares. El MHC y el superantígeno se pueden producir mediante un método igual al método descrito para el MHC y similares. El complejo MHC/superantígeno puede ser un multímero como el complejo MHC/péptido antígeno. El método para multimerizar el complejo MHC/superantígeno de la presente invención es el mismo que el método para multimerizar el complejo MHC/péptido antígeno.

El agonista del complejo CD3/TCR utilizado en la etapa (I) de la presente invención puede estar presente en cualquier forma siempre que pueda entrar en contacto con el complejo CD3/TCR en la superficie celular CD3-positiva durante el cultivo. Por ejemplo, puede estar contenido en el medio durante el cultivo, o puede estar inmovilizado en un recipiente de cultivo, y preferiblemente está inmovilizado en un recipiente de cultivo.

Cuando el agonista del complejo CD3/TCR está contenido en el medio, el medio no está particularmente limitado siempre que las células CD3-positivas puedan cultivarse en el mismo. Por ejemplo, se incluyen el medio esencial mínimo de Glasgow (GMEM), el medio IMDM, el medio 199, el medio esencial mínimo de Eagle (EMEM), el medio aMEM, el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el medio F12 de Ham, el medio RPMI 1640, el medio de Fischer, el medio Neurobasal (Life Technologies) y medios mixtos de estos y similares. El medio puede contener suero o no contenerlo. Cuando se contiene un suero, la concentración del suero (p. ej., suero bovino fetal (FBS), suero humano y similares) es tal que el límite inferior generalmente no es inferior al 1%, preferiblemente no inferior al 5%, y el límite superior generalmente no es superior al 20%, preferiblemente no superior al 15%. Cuando sea necesario, el medio puede contener uno o más sustitutos de suero tales como Knockout Serum Replacement (KSR) (reemplazo de suero de FBS en células ES en cultivo), suplemento N2 (Invitrogen), suplemento B27 (Invitrogen), albúmina, insulina, transferrina, compuestos de selenio (p. ej., selenito de sodio), vitamina C (p. ej., ácido ascórbico), apotransferrina, ácido graso, precursor de colágeno, oligoelemento, 2-mercaptoetanol, 3'-tiolglicerol y similares, y una o más sustancias tales como lípidos, aminoácidos, L-glutamina, L-alanil-L-glutamina (p. ej., Glutamax (marca comercial registrada)), aminoácidos no esenciales, vitaminas, factores de crecimiento, compuestos de bajo peso molecular, antibióticos (p. ej., penicilina, estreptomicina), antioxidantes, ácido pirúvico, agente tampón, sales inorgánicas, ácido selénico, progesterona, putrescina y similares. Cuando el agonista del complejo CD3/TCR está contenido en el medio, la concentración del agonista del complejo CD3/TCR puede ser tal que el límite inferior no sea inferior a 0,3 ng/ml, preferiblemente no inferior a 3 ng/ml, y el límite superior no sea superior a 10.000 ng/ml, preferiblemente no superior a 1.000 ng/ml. En particular, cuando el agonista del complejo CD3/TCR es un anticuerpo agonista anti-CD3, la concentración del anticuerpo agonista anti-CD3 en el medio es, por ejemplo, 10 ng/ml - 1.000 ng/ml. El cultivo se puede realizar, por ejemplo, en una incubadora de CO2 en una atmósfera con una concentración de CO2 de aproximadamente 1 - aproximadamente 10%, preferiblemente de aproximadamente 2 - aproximadamente 5% a aproximadamente 30 - aproximadamente 40°C, preferiblemente aproximadamente 37°C. El período de cultivo en un medio que contiene un agonista del complejo CD3/TCR puede ser determinado apropiadamente por los expertos en la técnica monitoreando el número de células CD3 positivas y similares. El número de días de cultivo no está limitado siempre que se puedan obtener células CD3 positivas. El período de cultivo es, por ejemplo, al menos 6 horas o más, 12 horas o más, 16 horas o más, 24 horas o más, 48 horas o más, 72 horas o más, preferiblemente 16 - 72 horas. Además, es preferible 14 días o más, y es más preferible 7 días o más.

El medio utilizado en la etapa (I) de la presente invención puede contener además citocina. La citocina contenida en el medio no está particularmente limitada y se puede mencionar al menos una seleccionada de IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21. Es preferible que contenga todas las IL-7, IL-15, IL-18 y IL-21. La concentración de citocina es tal que el límite inferior no es inferior a 0,1 ng/ml, preferiblemente no inferior a 10 ng/ml, y el límite superior no es superior a 1.000 ng/ml, preferiblemente no superior a 300 ng/ml. Cuando se utilizan estas citocinas, la concentración en el medio es de 1 a 100 ng/ml para IL-7, 1 a 100 ng/ml para IL-15, 5 a 500 ng/ml para IL-18 y 2 a 200 ng/ml para IL-21.

El medio utilizado en la etapa (I) de la presente invención puede contener además TL1A y/o IL-12. En este caso, la concentración de TL1A en el medio es de 5 a 500 ng/ml y la concentración de IL-12 en el medio es de 5 a 500 ng/ml.

El medio utilizado en la etapa (I) de la presente invención puede contener una citocina de la familia TNF como citocina. Los ejemplos de citocinas de la familia TNF incluyen TNF-a, TNF-p, linfotoxina a, ligando Fas, TRAIL, TWEAK, TL1A, ligando RANK, ligando OX40, APRIL, AIt Rl , BAFF, 4-1 Bb L y ligando Cd40 y similares, siendo preferible TL1A. Cuando se utiliza TL1A, su concentración en el medio puede ser de 5 ng/ml a 500 ng/ml.

Como inhibidor de la apoptosis utilizado en la etapa (I) de la presente invención, se puede mencionar un inhibidor de proteasa, por ejemplo, un inhibidor de caspasa. Como inhibidor de caspasa, es preferible el inhibidor de Pan Caspasa FMK Z-VAD (N-benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp(O-Me) fluorometilcetona), y su concentración en el medio puede ser de 1 a 1.000 pM.

Cuando el agonista del complejo CD3/TCR se inmoviliza en un recipiente de cultivo, el recipiente de cultivo no está particularmente limitado siempre que se puedan cultivar células CD3 positivas en el mismo, y se pueda utilizar un recipiente, un portaobjetos, una perla o una combinación de estos. Los ejemplos del recipiente de cultivo incluyen matraz, matraz de cultivo de tejido, placa, placa de Petri, placa de cultivo de tejido, multiplaca, microplaca, placa de micropocillos, multiplaca, placa de múltiples pocillos, microportaobjetos, portaobjetos de cámara, tubo, bandeja, bolsa de cultivo, frasco rotatorio, microperlas y similares.

El agonista del complejo CD3/TCR se puede inmovilizar en un recipiente de cultivo mediante un medio conocido. Por ejemplo, un agonista del complejo CD3/TCR se puede inmovilizar en un recipiente de cultivo disolviendo el agonista del complejo CD3/TCR en un disolvente (p. ej., PBS y similares), añadiéndolo al recipiente de cultivo y dejándolo reposar a 4°C durante la noche. La concentración de la disolución de agonista del complejo CD3/TCR para inmovilizar el agonista del complejo CD3/TCR en el recipiente de cultivo puede ser determinada apropiadamente por los expertos en la técnica según el tipo de agonista del complejo CD3/TCR. En una realización de la presente invención, por ejemplo, cuando el agonista del complejo CD3/TCR es un anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo, una disolución de 0,3 - 10.000 ng/ml del anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo se puede poner en contacto generalmente con el recipiente de cultivo, y es más preferible de 3 - 5.000 ng/ml, es aún más preferible de 3 - 3.000 ng/ml y es particularmente preferible de 3 - 600 ng/ml. En otra realización de la presente invención, la concentración de un anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo en una disolución es, por ejemplo, 10 ng/ml - 10.000 ng/ml, preferiblemente 50 ng/ml - 5.000 ng/ml, más preferiblemente 200 ng/ml - 4.000 ng/ml. En otra realización más de la presente invención, la concentración de un anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo en una disolución es, por ejemplo, 1 - 50.000 ng/ml, preferiblemente 3 - 30.000 ng/ml, más preferiblemente 30 - 30.000 ng/ml, aún más preferiblemente 300 - 30.000 ng/ml. Cuando el anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo es un anticuerpo (OKT3) o un fragmento de unión del mismo producido a partir de un clon OKT3, su concentración en una disolución es, por ejemplo, 1 ng/ml - 50.000 ng/ml, preferiblemente 10 ng/ml - 10.000 ng/ml, más preferiblemente 50 ng/ml - 5.000 ng/ml, aún más preferiblemente 200 ng/ml - 4.000 ng/ml. Cuando el anticuerpo agonista anti-CD3 o su fragmento de unión es un anticuerpo (UCHT1) o un fragmento de unión producido a partir de un clon de UCHT1, su concentración en una solución es, por ejemplo, de 1 ng/ml - 50000 ng/ml, preferiblemente 3 ng/ml - 30000 ng/ml, más preferiblemente 30 ng/ml - 30000 ng/ml, más preferiblemente 300 ng/ml - 30000 ng/ml.

En la etapa (I) de la presente invención, la fibronectina no está particularmente limitada siempre que sea una molécula capaz de unirse a células CD3-positivas. La variante de fibronectina no está particularmente limitada siempre que sea una molécula capaz de unirse a VLA-5 y VLA-4 en la superficie de las células CD3 positivas, y ejemplos de las mismas incluyen RetroNectin (marca comercial registrada).

La fibronectina o una variante de la misma que se utilizará en la etapa (I) de la presente invención puede estar presente en cualquier forma siempre que pueda entrar en contacto con células CD3-positivas durante el cultivo, como el agonista del complejo CD3/TCR. Por ejemplo, puede estar contenido en el medio durante el cultivo, o puede estar inmovilizado en un recipiente de cultivo, y preferiblemente está inmovilizado en un recipiente de cultivo.

Cuando la fibronectina o una variante de la misma está contenida en un medio, el medio puede ser el mismo que contiene un agonista del complejo CD3/TCR. La presencia o ausencia de suero, aditivo y similares puede ser la misma que la del medio que contiene un agonista del complejo CD3/TCR. Cuando la fibronectina o una variante de la misma está contenida en un medio, el límite inferior de la concentración de fibronectina o una variante de la misma no puede ser inferior a 10 ng/ml, preferiblemente no inferior a 100 ng/ml, y el límite superior puede ser no superior a 10.000 pg/ml, preferiblemente no superior a 1.000 pg/ml.

Cuando la fibronectina o una variante de la misma se inmoviliza en un recipiente de cultivo, el recipiente de cultivo puede ser el mismo que aquel en el que se inmoviliza el agonista del complejo CD3/TCR. Además, la inmovilización de fibronectina o una variante de la misma en el recipiente de cultivo puede ser la misma que la inmovilización del agonista del complejo CD3/TCR. La inmovilización de fibronectina o una variante de la misma en un recipiente de cultivo puede ser la misma que la del agonista del complejo CD3/TCR. La concentración de la disolución de fibronectina o una variante de la misma al inmovilizar fibronectina o una variante de la misma en un recipiente de cultivo puede ser determinada apropiadamente por los expertos en la técnica según la fibronectina o una variante de la misma. Por ejemplo, cuando la fibronectina o una variante de la misma es RetroNectin (marca comercial registrada), preferiblemente se pone en contacto una disolución de 0,1 - 10.000 pg/ml de RetroNectin (marca comercial registrada) con el recipiente de cultivo. En este caso, la concentración de la disolución de RetroNectin es más preferiblemente de 0,1 a 1.000 pg/ml, más preferiblemente de 1 a 300 pg/ml, particularmente preferiblemente de 1 a 150 pg/ml.

En la etapa (I) de la presente invención, el agonista de CD30 no está particularmente limitado siempre que sea una molécula capaz de transducir una señal de un CD30 a una célula uniéndose específicamente a CD30. Los ejemplos del agonista CD30 incluyen al menos uno seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo agonista anti-CD30 o un fragmento unido a este y ligando CD30 o un fragmento unido a este.

El tipo, método de producción y similares del anticuerpo agonista anti-CD30 y un fragmento de unión del mismo utilizados en la etapa (I) de la presente invención pueden ser los mismos que los del anticuerpo agonista anti-CD3 y el anticuerpo anti-TCR.

El ligando CD30 o un fragmento de unión del mismo utilizado en la etapa (I) de la presente invención es, por ejemplo, CD153. El ligando CD30 o un fragmento de unión del mismo se puede producir mediante un método similar al método de producción de MHC y/o péptido antigénico.

El agonista de CD30 utilizado en la etapa (I) de la presente invención puede estar presente en cualquier forma siempre que pueda estar presente en contacto con CD30 durante el cultivo. Por ejemplo, puede estar contenido en el medio durante el cultivo, o puede estar inmovilizado en un recipiente de cultivo, y preferiblemente está inmovilizado en un recipiente de cultivo.

Cuando un agonista CD30 está contenido en un medio, el medio puede ser el mismo que el que contiene un agonista del complejo CD3/TCR. La presencia o ausencia de suero, aditivo y similares puede ser la misma que la del medio que contiene un agonista del complejo CD3/TCR. Cuando un agonista CD30 está contenido en un medio, la concentración del agonista CD30 en el medio puede ser determinada apropiadamente por los expertos en la técnica según el tipo de agonista CD30. Por ejemplo, cuando el agonista CD30 es un anticuerpo agonista anti-CD30 o un fragmento de unión del mismo, la concentración del anticuerpo agonista anti-CD30 o un fragmento de unión del mismo en el medio es generalmente de 1 ng/ml a 10.000 ng/ml, preferiblemente de 1 ng/ml a 1.000 ng/ml, más preferiblemente de 3 ng/ml a 300 ng/ml, aún más preferiblemente de 30 ng/ml a 300 ng/ml.

Cuando el agonista CD30 se inmoviliza en un recipiente de cultivo, el recipiente de cultivo puede ser el mismo que aquel en el que se inmoviliza el agonista del complejo CD3/TCR. Además, un método para inmovilizar el agonista CD30 en el recipiente de cultivo puede ser el mismo que el de inmovilizar el agonista del complejo CD3/TCR. El límite inferior de la concentración de una disolución de agonista CD30 cuando el agonista CD30 está inmovilizado en un recipiente de cultivo no puede ser inferior a 0,1 ng/ml, preferiblemente no inferior a 1 ng/ml, y el límite superior puede ser no superior a 10.000 ng/ml, preferiblemente no superior a 1.000 ng/ml.

El método de producción o método de cultivo de expansión de la presente invención puede incluir además una etapa de cultivo de las células CD3-positivas, que se cultivaron en la etapa (I) de la presente invención, en ausencia de un agonista del complejo CD3/TCR, y fibronectina o una variante de la misma, y en presencia de un agonista CD30 (en lo sucesivo en la presente memoria denominada etapa (II) de la presente invención).

Como medio en la etapa (II) de la presente invención, se puede utilizar el medio utilizado en la etapa (I) mencionado anteriormente. El medio puede contener suero o no contenerlo. Cuando se contiene un suero, la concentración del suero (p. ej., suero bovino fetal (FBS), suero humano y similares) es tal que el límite inferior generalmente no es inferior al 1%, preferiblemente no inferior al 5%, y el límite superior generalmente no es superior al 20%, preferiblemente no superior al 15%. Cuando sea necesario, el medio puede contener uno o más sustitutos de suero tales como Knockout Serum Replacement (KSR) (reemplazo de suero de FBS en células ES en cultivo), suplemento N2 (Invitrogen), suplemento B27 (Invitrogen), albúmina, insulina, transferrina, compuestos de selenio (p. ej., selenito de sodio), vitamina C (p. ej., ácido ascórbico), apotransferrina, ácido graso, precursor de colágeno, oligoelemento, 2-mercaptoetanol, 3'-tiolglicerol y similares, y una o más sustancias tales como lípidos, aminoácidos, L-glutamina, Glutamax (Invitrogen), aminoácido no esencial, vitamina, factor de crecimiento, compuesto de bajo peso molecular, antibiótico, antioxidante, ácido pirúvico, agente amortiguador, sales inorgánicas, ácido selénico, progesterona, putrescina y similares. El cultivo se puede realizar, por ejemplo, en una incubadora de CO2 en una atmósfera con una concentración de CO2 de aproximadamente 1 - aproximadamente 10%, preferiblemente de aproximadamente 2 - aproximadamente 5% a aproximadamente 30 - aproximadamente 40°C, preferiblemente aproximadamente 37°C. El período de cultivo puede ser determinado apropiadamente por los expertos en la técnica mediante monitoreando el número de células CD3 positivas y similares. El número de días de cultivo no está limitado siempre que se puedan obtener células CD3 positivas. El período de cultivo es, por ejemplo, no menos de 3 días, no menos de 5 días, no menos de 7 días, no menos de 10 días, no menos de 14 días, no menos de 21 días, preferiblemente no menos de 5 días y no más de 15 días. Preferiblemente no más de 30 días, más preferiblemente no más de 21 días.

Cuando se utiliza vitamina C, la vitamina C se añade (suministra) preferiblemente cada cuatro días, cada tres días, cada dos días o todos los días. Es preferible añadir la vitamina C cada día. En una realización, la vitamina C se añade preferiblemente al medio en una cantidad correspondiente a 5 ng/ml a 500 ng/ml (p. ej., una cantidad correspondiente a 5 ng/ml, 10 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml o 500 ng/ml). En otra realización, se añade vitamina C al medio de cultivo en una cantidad correspondiente a 5 pg/ml - 500 pg/ml (p. ej., una cantidad correspondiente a 5 pg/ml, 10 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 300 pg/ml, 400 pg/ml, 500 pg/ml).

El medio utilizado en la etapa (II) de la presente invención puede contener además citocina. La citocina no está particularmente limitada y se puede mencionar al menos una seleccionada de IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21. Es preferible que contenga todas las IL-7, IL-15, IL-18 y IL-21. La concentración de citocina es tal que el límite inferior no es inferior a 0,1 ng/ml, preferiblemente no inferior a 10 ng/ml, y el límite superior no es superior a 1.000 ng/ml, preferiblemente no superior a 300 ng/ml. Cuando se utilizan estas citocinas, la concentración en el medio es de 1 a 100 ng/ml para IL-7, 1 a 100 ng/ml para IL-15, 5 a 500 ng/ml para IL-18 y 2 a 200 ng/ml para IL-21.

El medio utilizado en la etapa (II) de la presente invención puede contener además TL1A y/o IL-12. En este caso, la concentración de TL1A en el medio puede ser de 5 ng/ml a 500 ng/ml, y la concentración de IL-12 en el medio puede ser de 5 ng/ml a 500 ng/ml.

El medio utilizado en la etapa (II) de la presente invención puede contener además un inhibidor de la apoptosis. Como inhibidor de la apoptosis se puede mencionar un inhibidor de proteasa, por ejemplo, el inhibidor de caspasa. Como inhibidor de caspasa, es preferible el inhibidor de Pan Caspasa FMK Z-VAD (N-benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp(O-Me) fluorometilcetona) (en lo sucesivo en la presente memoria denominado a veces "Z-VAD-FMK"), y su concentración en el medio puede ser de 1 pM - 1.000 pM, preferiblemente de 1 pM - 500 pM, más preferiblemente de 1 pM - 200 pM, particularmente preferiblemente de 1 pM - 50 pM.

En una realización de la presente invención, la etapa (I) y la etapa (II) mencionados anteriormente pueden repetirse en este orden.

La presente invención también proporciona células CD3-positivas obtenidas mediante el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención (en lo sucesivo en la presente memoria denominadas células CD3-positivas de la presente invención). La célula CD3-positiva de la presente invención es la misma que la célula CD3-positiva obtenida mediante el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención.

La presente invención también proporciona un kit para cultivo de expansión de células CD3 positivas que contiene lo siguiente (en lo sucesivo en la presente memoria denominado el kit de la presente invención):

(1) un recipiente de cultivo que tiene un agonista del complejo CD3/TCR y fibronectina o una variante de la misma inmovilizada en el mismo, y

(2) un medio que contiene un agonista CD30.

El agonista del complejo CD3/TCR, la fibronectina o una variante de la misma, el agonista CD30, el recipiente de cultivo y el medio contenidos en el kit de la presente invención pueden ser los mismos que los descritos para el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención.

La presente invención también proporciona un método para mantener células CD3-positivas como células CD3-positivas CD197-positivas, incluyendo una etapa de estimulación de una señal CD30 en las células CD3-positivas (en lo sucesivo en la presente memoria denominado el método de mantenimiento de la presente invención).

Generalmente, cuando las células T vírgenes derivadas de sangre periférica se estimulan con un antígeno presentado por una célula dendrítica, las células T vírgenes se activan mediante señales intracelulares, repiten la proliferación y la maduración, y se diferencian secuencialmente en células T de memoria de células madre, células T de memoria central, células T de memoria efectoras y células T efectoras. Las células T efectoras producen citocinas en el caso de las células CD3 positivas, CD4 positivas y CD8 negativas (células T colaboradoras), y matan a las células objetivo a través del antígeno en el caso de las células CD3 positivas, CD4 negativas y CD8 positivas (células T citotóxicas), pero no pueden sobrevivir durante mucho tiempo. Sin embargo, al estimular la señal CD30 en las células T, las células T pueden mantenerse como células T ingenuas autoproliferativas o células T de memoria de células madre (CD197 positivas, CD45RA positivas) o células T de memoria central (CD197 positivas, CD45RA negativas) que pueden diferenciarse en células T efectoras.

Las células CD3 positivas cultivadas mediante el método de mantenimiento de la presente invención pueden ser las mismas que las células CD3 positivas cultivadas mediante el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención. Preferiblemente, la célula CD3-positiva es una célula CD3-positiva CD197-positiva.

El método de mantenimiento de la presente invención incluye una etapa de estimulación de la señal CD30 en las células CD3-positivas. El método de estimulación de la señal CD30 en las células CD3 positivas no está particularmente limitado siempre que la señal pueda transmitirse aguas abajo a través de un dominio intracelular de CD30. Los ejemplos del método incluyen un método que incluye una etapa de cultivo de células CD3 positivas en presencia de un agonista CD30 (en lo sucesivo en la presente memoria denominado el método de mantenimiento (1) de la presente invención). Las células CD3-positivas pueden mantenerse como células CD3-positivas CD197-positivas mediante el método de mantenimiento (1) de la presente invención.

En una realización del método de mantenimiento (1) de la presente invención, las células CD3-positivas se pueden mantener como células CD3-positivas CD197-positivas CD45RA-negativas.

El agonista CD30 y las condiciones de cultivo utilizadas en el método de mantenimiento (1) de la presente invención pueden ser las mismas que las utilizadas en el método de producción o en el método de cultivo de expansión de la presente invención.

La presente invención también proporciona un kit que contiene un agonista CD30 para mantener células CD3-positivas como células CD3-positivas CD197-positivas (en lo sucesivo en la presente memoria denominado el kit de mantenimiento de la presente invención).

El agonista CD30 contenido en el kit de mantenimiento de la presente invención puede ser el mismo que el agonista CD30 utilizado en el método de mantenimiento (1) de la presente invención.

En el método de mantenimiento de la presente invención, otro método para estimular una señal CD30 en la célula CD3-positiva es, por ejemplo, un método que incluye una etapa de cultivo de células CD3-positivas que expresan un receptor de antígeno quimérico que contiene el dominio intracelular de CD30, en presencia de un antígeno que estimula el receptor de antígeno quimérico (en lo sucesivo en la presente memoria denominado el método de mantenimiento (2) de la presente invención). La señal se puede transmitir a través de un dominio intracelular de CD30 estimulando un receptor de antígeno quimérico que contiene el dominio intracelular de CD30, y las células CD3-positivas que expresan un receptor de antígeno quimérico que contiene el dominio intracelular de CD30 se pueden mantener como células CD3-positivas y CD197-positivas.

En una realización del método de mantenimiento (2) de la presente invención, las células CD3-positivas que expresan un receptor de antígeno quimérico que contiene el dominio intracelular de CD30 se pueden mantener como células CD3-positivas CD197-positivas CD45RA-negativas.

Las condiciones de cultivo utilizadas en el método de mantenimiento (2) de la presente invención pueden ser las mismas que las utilizadas en el método de producción o en el método de cultivo de expansión de la presente invención.

El antígeno que estimula el receptor de antígeno quimérico utilizado en el método de mantenimiento (2) de la presente invención no está particularmente limitado siempre que se pueda transmitir una señal al receptor de antígeno quimérico a través de un dominio intracelular de CD30 contenido en el receptor de antígeno quimérico. El antígeno que estimula el receptor de antígeno quimérico puede ser el mismo que el antígeno al que se dirige el receptor de antígeno quimérico de las células CD3 positivas que expresan el receptor de antígeno quimérico cultivadas mediante el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención.

La presente invención también proporciona un receptor de antígeno quimérico que contiene un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de transducción de señales intracelulares, en donde el dominio de transducción de señales intracelulares contiene un dominio intracelular de CD30 o un mutante del mismo (en lo sucesivo en la presente memoria denominado el receptor de antígeno quimérico de la presente invención).

El dominio de unión a antígeno contenido en el receptor de antígeno quimérico de la presente invención puede ser el mismo que el dominio de unión a antígeno contenido en el receptor de antígeno quimérico expresado en las células CD3-positivas cultivadas en el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención.

El dominio transmembrana contenido en el receptor de antígeno quimérico de la presente invención puede ser el mismo que el dominio transmembrana contenido en un receptor de antígeno quimérico expresado en las células CD3 positivas cultivadas en el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención.

El dominio de transducción de señales intracelulares contenido en el receptor de antígeno quimérico de la presente invención contiene un dominio intracelular de CD30 o un mutante del mismo. El dominio intracelular de CD30 no está particularmente limitado siempre que el dominio de unión a antígeno contenido en el receptor de antígeno quimérico de la presente invención reconozca un antígeno y conserve la función de transmitir la señal de reconocimiento del mismo a las células. Por ejemplo, se puede mencionar un péptido que contenga la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 6.

Si bien el mutante del dominio intracelular de CD30 no está particularmente limitado siempre que pueda conservar la función mencionada anteriormente, por ejemplo, se puede mencionar un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de no menos de aproximadamente 90%, preferiblemente no menos de aproximadamente 95%, más preferiblemente no menos de aproximadamente 97%, particularmente preferiblemente no menos de aproximadamente 98%, lo más preferiblemente no menos de aproximadamente 99%, con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 6. Como se utiliza en la presente memoria, la "homología" puede ser la misma que la de la secuencia de aminoácidos de "IL-15/IL-15Ra".

Además, el mutante del dominio intracelular de CD30 también incluye, por ejemplo, una proteína que contiene (1 ) una secuencia de aminoácidos en donde uno o más (preferiblemente, 1 - aproximadamente 100, preferiblemente 1 - aproximadamente 50, más preferiblemente 1 - aproximadamente 10, particularmente preferiblemente 1 - varios (2, 3, 4 o 5)) aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 están eliminados, (2) una secuencia de aminoácidos en donde uno o más (preferiblemente, 1 -aproximadamente 100, preferiblemente 1 - aproximadamente 50, más preferiblemente 1 - aproximadamente 10, particularmente preferiblemente 1 - varios (2, 3, 4 o 5)) aminoácidos se añaden a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, (3) una secuencia de aminoácidos en donde uno o más (preferiblemente, 1 - aproximadamente 50, preferiblemente 1 - aproximadamente 10, más preferiblemente 1 -varios (2, 3, 4 o 5)) aminoácidos se insertan en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, (4) una secuencia de aminoácidos en donde uno o más (preferiblemente, 1 - aproximadamente 50, preferiblemente 1 - aproximadamente 10, más preferiblemente 1 - varios (2, 3, 4 o 5)) aminoácidos se sustituyen por otros aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6 o (5) una secuencia de aminoácidos que es una combinación de las mismas y similares. Cuando la secuencia de aminoácidos se inserta, elimina o sustituye como se mencionó anteriormente, la posición de inserción, eliminación o sustitución no está particularmente limitada siempre que se mantenga la función del dominio intracelular de CD30.

El dominio de transducción de señales intracelulares contenido en el receptor de antígeno quimérico de la presente invención puede contener un dominio intracelular de CD30 o un mutante del mismo, y además un dominio intracelular derivado de otra proteína. El dominio intracelular que se incluirá además puede ser el mismo que el dominio intracelular contenido en un dominio de transducción de señales intracelulares contenido en el receptor de antígeno quimérico expresado en células CD3 positivas cultivadas en el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención. El dominio intracelular que se incluirá además no está particularmente limitado, y es preferible un dominio intracelular derivado de la cadena CD28 o CD3Z.

El receptor de antígeno quimérico de la presente invención puede tener un espaciador incorporado entre un dominio de unión de antígeno y un dominio transmembrana, o entre un dominio de transducción de señales intracelulares y un dominio transmembrana. El espaciador puede ser el mismo que el espaciador contenido en el receptor de antígeno quimérico expresado en células CD3 positivas cultivadas en el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención.

Ejemplos específicos del receptor de antígeno quimérico de la presente invención incluyen un receptor de antígeno quimérico que contiene scFv que reconoce CD19 como un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana de CD8 como un dominio transmembrana, un dominio intracelular derivado de CD28 como un dominio de transducción de señal intracelular, un dominio intracelular derivado de CD30 y un dominio intracelular derivado de la cadena CD3Z. El orden de los dominios intracelulares mencionados anteriormente contenidos en el dominio de transducción de señales intracelulares no está particularmente limitado y, por ejemplo, se adopta el orden del dominio intracelular derivado de CD28, el dominio intracelular derivado de CD30 y el dominio intracelular derivado de la cadena CD3Z. Más específicamente, el receptor de antígeno quimérico en la presente invención está compuesto, por ejemplo, de la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 7.

El receptor de antígeno quimérico de la presente invención puede ser una proteína sintetizada químicamente o una proteína sintetizada bioquímicamente en un sistema de traducción libre de células, o puede ser una proteína recombinante producida a partir de un transformante que incorpora un ácido nucleico que tiene una secuencia de bases que codifica el receptor de antígeno quimérico de la presente invención. El receptor de antígeno quimérico de la presente invención se puede producir, aislar y purificar de manera similar según el método de producción de MHC y/o péptido antigénico utilizado en el método de producción o método de cultivo de expansión de la presente invención.

La presente invención también proporciona un ácido nucleico que contiene un polinucleótido que codifica el receptor de antígeno quimérico de la presente invención (en lo sucesivo en la presente memoria denominado el ácido nucleico de la presente invención).

El ácido nucleico de la presente invención puede ser un ADN o un ARN, o una quimera de ADN/ARN. Se prefiere un ADN. Además, el ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. En el caso de cadenas dobles, se puede utilizar ADN bicatenario, ARN bicatenario o híbrido ADN:ARN. En el caso de una sola hebra, puede ser una hebra de sentido (es decir, una hebra codificante) o una hebra antisentido (es decir, una hebra no codificante).

El ácido nucleico de la presente invención se puede obtener mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como "método PCR"). En primer lugar, un ADN genómico o ADNc que codifica cada dominio de un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de transducción de señales intracelulares contenido en el receptor de antígeno quimérico de la presente invención. El ADNc también se puede amplificar directamente mediante el método de PCR y PCR con transcriptasa inversa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviado como "método RT-PCR") utilizando, como plantilla, una fracción total de ARN o ARNm preparada a partir de células. Utilizando el ADN genómico o ADNc obtenido como plantilla, se puede amplificar un ácido nucleico que codifica cada dominio de un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de transducción de señales intracelulares mediante el método de PCR utilizando un cebador de ADN sintético que consiste en una parte de la secuencia de bases que codifica cada dominio y una secuencia de bases que codifica un espaciador. El ácido nucleico de la presente invención se puede obtener repitiendo el método de PCR utilizando los respectivos dominios obtenidos como plantillas y los cebadores de ADN sintéticos.

La presente invención también proporciona un vector de transferencia de genes de receptor de antígeno quimérico que contiene el ácido nucleico de la presente invención (en lo sucesivo en la presente memoria denominado el vector transgén de la presente invención).

El vector transgénico de la presente invención se puede producir, por ejemplo, uniendo el ácido nucleico de la presente invención al extremo descendente de un promotor en un vector de transferencia genética apropiado. El vector de transferencia genética, el promotor y otros elementos pueden ser los mismos que el vector, el promotor y otros elementos utilizados cuando se introduce TCR exógeno en células madre pluripotentes en el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención.

La presente invención también proporciona una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico que contiene el vector transgénico de la presente invención (en lo sucesivo en la presente memoria denominada la célula que expresa un receptor de antígeno quimérico de la presente invención).

La célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención se puede producir introduciendo el vector transgénico de la presente invención en células y cultivando las células. Como célula en la que se introduce el vector transgénico de la presente invención, se puede mencionar una célula CD3-positiva o una célula progenitora de la misma (célula madre hematopoyética, célula progenitora linfoide común, linfoblasto y similares), o una célula madre pluripotente. Como célula madre pluripotente se pueden mencionar células ES, células iPS, células EC y células EG, siendo preferidas las células ES o las células iPS.

El vector transgénico de la presente invención puede introducirse en células mediante métodos tales como lipofección, liposoma, microinyección y similares.

La célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención es preferiblemente una célula CD3-positiva. La célula CD3-positiva es preferiblemente una célula CD3-positiva CD8-positiva (célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-positiva o célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa), más preferiblemente una célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa. Otra célula CD3-positiva preferible mencionada anteriormente es, por ejemplo, una célula CD3-positiva CD4-positiva (célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-positiva o célula CD3-positiva CD4-positiva CD8-negativa).

Cuando la célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención es una célula producida introduciendo el vector transgénico de la presente invención en células madre pluripotentes, la célula madre pluripotente puede diferenciarse en una célula CD3-positiva según un método conocido en sí mismo. Un método específico para diferenciar una célula madre pluripotente en una célula CD3 positiva puede ser el mismo que el método para diferenciar la célula CD3 positiva que se va a cultivar en una célula madre pluripotente en el método de producción o el método de cultivo de expansión de la presente invención.

La célula que expresa el receptor de antígeno quimérico así obtenida de la presente invención recibe la especificidad para el antígeno de interés mediante el receptor de antígeno quimérico, y puede mostrar actividad citotóxica contra tumores que expresan el antígeno de interés. El receptor de antígeno quimérico puede reconocer directamente una molécula de antígeno sin depender de HLA de clase I o clase II. Por lo tanto, la célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención puede provocar una alta respuesta inmune incluso para tumores con expresión reducida del gen HLA de clase I o de clase II.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona un medicamento que contiene la célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención como ingrediente activo (en lo sucesivo en la presente memoria, a veces denominado el medicamento de la presente invención). Un medicamento que contiene la célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención se puede utilizar para la profilaxis o el tratamiento de tumores que expresan un antígeno reconocido por el receptor de antígeno quimérico de la presente invención, y se puede administrar, por ejemplo, a mamíferos (p. ej., ratón, rata, hámster, conejo, gato, perro, bovino, oveja, mono, humano), preferiblemente humano. Por lo tanto, en una realización de la presente invención, se proporciona el medicamento de la presente invención para su uso en la profilaxis o el tratamiento de tumores que expresan un antígeno reconocido por el receptor de antígeno quimérico de la presente invención. Además, se proporciona un método para prevenir o tratar tumores que expresan un antígeno reconocido por el receptor de antígeno quimérico de la presente invención, que incluye la administración de la célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención preferiblemente en forma de un medicamento que contiene la célula.

El tumor que se puede prevenir o tratar mediante la célula de expresión del receptor de antígeno quimérico de la presente invención no está particularmente limitado siempre que exprese un antígeno reconocido por el receptor de antígeno quimérico de la presente invención. El tumor se describe, por ejemplo, en "Daniel Baumhoer et al., Am J. Clin Pathol, 2008, 129, 899-906" y similares. Un tumor incluye un tumor benigno, un tumor maligno (también denominado "cáncer") y un tumor que puede diagnosticarse o determinarse como benigno o maligno. Ejemplos específicos de tumor incluyen, pero sin limitación, cáncer de hígado (p. ej., hepatoma), cáncer de ovario (p. ej., adenocarcinoma de células claras de ovario), cáncer infantil, cáncer de pulmón (p. ej., carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de testículo (p. ej., tumor de células germinales no seminomas), tumor de tejidos blandos (p. ej., liposarcoma, histiocitoma fibroso maligno), cáncer de útero (p. ej., tumor intraepitelial de cuello uterino, carcinoma de células escamosas de cuello uterino), melanoma, tumor de glándula suprarrenal (p. ej., adenoma de glándula suprarrenal), tumor neurótico (p. ej., schwannoma), cáncer gástrico (p. ej., adenocarcinoma de estómago), cáncer renal (p. ej., tumor de Grawitz), cáncer de mama (p. ej., carcinoma lobulillar invasivo, cáncer mucoso), cáncer de tiroides (p. ej., cáncer medular), cáncer de laringe (p. ej., carcinoma de células escamosas), cáncer de vejiga urinaria (p. ej., carcinoma de células transicionales invasivo) y similares.

La célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención se puede cultivar y/o estimular utilizando un medio apropiado y/o una molécula estimulante antes de la administración a un sujeto de prueba. Los ejemplos de la molécula estimulante incluyen, pero sin limitación, citocinas, proteínas adecuadas, otros componentes y similares. Los ejemplos de citocinas incluyen IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IFN-y y similares, pudiéndose utilizar preferiblemente IL-2. Si bien la concentración de IL-2 en el medio no está particularmente limitada, por ejemplo, es preferiblemente 0,01 U/ml - 1x105 U/ml, más preferiblemente 1 U/ml - 1x104 U/ml. Los ejemplos de la proteína adecuada incluyen un antígeno reconocido por un receptor de antígeno quimérico, un ligando CD3, un ligando CD28, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD30 y un anticuerpo anti-IL-4. Además de estos, también se puede añadir un factor estimulante de linfocitos tales como lectina y similares. Además, se puede añadir suero o plasma al medio. Si bien la cantidad de adición a estos medios no está particularmente limitada, se puede mencionar entre 0% en volumen y 20% en volumen. Además, la cantidad de suero o plasma a utilizar se puede modificar según la etapa del cultivo. Por ejemplo, la concentración sérica o plasmática se puede reducir gradualmente. El origen del suero o plasma puede ser autólogo o alogénico, siendo preferible el autólogo desde el punto de vista de la seguridad.

El medicamento de la presente invención se utiliza preferiblemente mediante administración parenteral al sujeto de prueba. Los ejemplos del método para la administración parenteral incluyen la administración intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal y subcutánea y similares. Aunque la dosis se selecciona apropiadamente según la condición, el peso corporal, la edad y similares del sujeto de prueba, el medicamento generalmente se administra de tal manera que el número de células sea generalmente 1 x 106 - 1 x 1010 células, preferiblemente 1x107 - 1x109 células, más preferiblemente 5x107 - 5x108 células, por dosis a un sujeto de prueba con un peso corporal de 60 kg. Las células T pueden administrarse una vez o en varias porciones. El medicamento de la presente invención puede formularse en una forma conocida adecuada para administración parenteral, por ejemplo, inyección o agente inyectable. El medicamento de la presente invención puede contener disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato (PBS), medio y similares para mantener las de forma células estable. El medio no está particularmente limitado y los ejemplos del mismo incluyen, pero sin limitación, medios como RPMI, AIM-V, X-VIVO10 y similares. El medicamento puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable (p. ej., albúmina sérica humana), conservante y similares con fines de estabilización.

Además, dado que la célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención puede matar células que expresan un antígeno reconocido por el receptor de antígeno quimérico de la presente invención, se puede utilizar como un agente de eliminación para células que expresan el antígeno. Este agente letal se puede producir y utilizar de la misma manera que el medicamento.

La presente invención también incluye realizaciones del uso de la célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención en la producción de agentes profilácticos o terapéuticos para un tumor que expresa un antígeno reconocido por el receptor de antígeno quimérico de la presente invención, según el medicamento que contiene la célula que expresa el receptor de antígeno quimérico de la presente invención. Los agentes profilácticos o terapéuticos para tumores pueden producirse mediante un método conocido en sí mismo. Por ejemplo, se pueden producir en una forma conocida adecuada para administración parenteral, tal como inyección, agente inyectable o similar, como en el método de preparación mencionado anteriormente del medicamento de la presente invención.

Si bien la presente invención se explica con más detalle haciendo referencia a los siguientes Ejemplos, estos son meras ejemplificaciones y no limitan la presente invención.

[Ejemplos]

[Ejemplo 1]

1. Preparación de células iPS

Como célula iPS se utilizó la cepa Ff-I01s04 proporcionada por el Centro de Investigación y Aplicación de Células iPS (CiRA) de la Universidad de Kioto. El cultivo de células iPS se realizó según el protocolo distribuido por CiRA, "Cultivo de células iPS humanas en condiciones sin alimentador".

2. Introducción del gen del receptor de células T (TCR) en células iPS

Como gen TCR, se utilizó el gen TCR específico de WT1 restringido por HLA-A*24:02 derivado de TAK1 (WT1-TCR) proporcionado por el Profesor Masataka Yasukawa, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ehime. La transferencia de genes a células iPS se realizó mediante la incorporación al vector lentivirus CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1 suministrado por el Instituto de Investigación Física y Química e infectando las células iPS.

3. Diferenciación de células iPS con el gen WT1-TCR introducido en ellas en células T CD8 positivas (CTL)

La diferenciación de células iPS con el gen WT1 -TCR introducido en ellas en células T CD8-positivas (CTL) se realizó según un método conocido (WO 2017/221975). Las células presentes eran CD3 positivas y CD8 positivas. A continuación, las células se utilizaron como células T derivadas de células iPS.

4. Reactivo, anticuerpo

RetroNectin (marca comercial registrada) se adquirió de Takara Bio Inc. Como anticuerpo agonista anti-CD3, se utilizó anticuerpo anti-CD3 humano funcional purificado de grado (Clon: OKT3) adquirido de eBioscience o anticuerpo CD3 (Clon: UCHT1) adquirido de GeneTex. A menos que se indique lo contrario, se utilizó OKT3. Como anticuerpo agonista anti-CD30, se utilizó el anticuerpo agonista CD30 adquirido en R&D Systems.

5. Inmovilización de anticuerpo agonista anti-CD3 y RetroNectin (marca comercial registrada) en placa de cultivo

El anticuerpo agonista anti-CD3 y RetroNectin (marca comercial registrada) disueltos en PBS a las concentraciones necesarias se añadieron a una placa de 96 pocillos a 50 pl/pocillo, y la placa se dejó reposar a 4°C durante la noche. Las células se lavaron con PBS y se sometieron a la prueba.

6. ELISA para detección de anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado y RetroNectin inmovilizada (marca comercial registrada)

Para la detección del anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado, se utilizó el anticuerpo de detección anti-ratón IgG2a de cabra conjugado con HRP contenido en el conjunto de cuantificación ELISA de IgG2a de ratón adquirido en Bethyl Laboratories. Para la detección de RetroNectin inmovilizada (marca comercial registrada), se utilizó el anticuerpo anti-RetroNectin marcado con peroxidasa contenido en el kit RetroNectin EIA adquirido a Takara Bio Inc. Cada anticuerpo de detección se añadió a una placa inmovilizada y la placa se dejó reposar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS que contenía 0,05% de Tween-20, se añadió la disolución de sustrato 1-Step™ Ultra TMB-ELISA (ThermoFisher). Después de reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente, se añadió ácido sulfúrico 1 M para interrumpir la reacción y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placas.

7. Prueba de proliferación

Las células T derivadas de células iPS preparadas a 100.000 células/200 pl en un medio preparado añadiendo citocinas y similares de la Tabla 1 a medio a-MEM que contenía 15% de FBS se sembraron en una placa con un anticuerpo agonista anti-CD3 (3, 30, 300, 3.000 ng/ml) y RetroNectin (marca comercial registrada) (0, 1,85, 2,25, 16,7, 50, 150 pg/ml) inmovilizada sobre ellas, y se cultivaron durante 3 días en atmósfera de 5% de CO2/37°C.

El día 3 de cultivo, se recogieron las células de la placa y se midió el número de células utilizando TC20 (Bio-Rad). Las células se suspendieron en una cantidad apropiada de un medio obtenido mediante la adición de citocinas y similares en la Tabla 2 a un medio a-MEM que contenía 15% de FBS, se añadió a una placa de 96 pocilios no inmovilizada y se cultivó a 5% de CO2/37°C. Posteriormente, se recogieron las células de la placa cualquiera de los días 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 y 16 una vez cada vez y de 4 a 7 veces en total, y se midió el número de células. Las células se suspendieron en una cantidad apropiada, se añadieron a una placa no inmovilizada y se cultivaron a 5% de CO2/37°C.

[Tabla 1]

[Tabla 2]

8. Prueba de ATP

Las células en el día 12 de cultivo en la prueba de proliferación y el ATP en el sobrenadante de cultivo se midieron según el protocolo estándar y utilizando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo(R) adquirido en Promega KK.

9. Medición de la actividad citotóxica específica del antígeno WT1

Las células LCL HLA-A*24:02 positivas se adquirieron en el centro RIKEN BioResource. Las células se cultivaron en un medio RPMI1640 que contenía 10% de FBS. La síntesis del péptido antigénico WT1 (CMTWNQMNL: SEQ ID NO: 3) se subcontrató a Scrum Inc. La prueba de citotoxicidad se evaluó según el protocolo estándar y utilizando el inmunoensayo DELFIA adquirido a Perkin Elmer Inc.

10. Prueba de proliferación con adición de anticuerpo agonista anti-CD30

Se añadió un anticuerpo agonista anti-CD30 diluido a una concentración final de 0, 30, 100, 300 ng/ml al medio de cultivo durante la suspensión de las células. El resto fue igual que en el método de la "7. Prueba de proliferación".

En la prueba de proliferación de células T derivadas de células iPS mediante estimulaciones múltiples con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30, se añadió un anticuerpo agonista anti-CD30 diluido a una concentración final de 100 ng/ml al medio de cultivo durante la suspensión de las células. El resto fue igual que en el método de la "7. Prueba de proliferación".

11. Detección de CD197 y CD45RA en la superficie de la membrana celular

Las células del día 7 de cultivo se recogieron, se tiñeron con el anticuerpo de la Tabla 3 y se detectaron utilizando citometría de flujo LSRFortessa™ X-20 (BD Bioscience).

[Tabla 3]

[Ejemplo 1 Experimental]

1. Medición de la concentración de anticuerpo agonista anti-CD3 y concentración de RetroNectin (marca comercial registrada) adecuada para inmovilizar en placa de cultivo

Se midió la concentración de un anticuerpo agonista anti-CD3 y RetroNectin (marca comercial registrada) adecuado para inmovilizar en una placa de cultivo mediante el método ELISA (Fig. 1). Se confirmó la inmovilización dependiente de la concentración de un anticuerpo agonista anti-CD3 entre 3 ng/ml y 3.000 ng/ml. Se confirmó la inmovilización dependiente de la concentración de RetroNectin (marca comercial registrada) entre 16,7 pg/ml y 150 pg/ml.

2. Verificación del intervalo de concentración del anticuerpo agonista anti-CD3 y RetroNectin (marca comercial registrada) necesario para el anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado y RetroNectin (marca comercial registrada) inmovilizado adecuado para la proliferación de células T derivadas de células iPS

Las células T derivadas de células iPS se estimularon durante 3 días en una placa con un anticuerpo agonista anti-CD3 (0, 3, 30, 300, 3.000 ng/ml) y RetroNectin (marca comercial registrada) (0, 1,85, 5,56, 16,7, 50, 150 pg/ml) inmovilizado sobre ellas, y se cultivaron en una placa no inmovilizada durante 9 días, y se midió la cantidad de ATP (Fig. 2).

3. Prueba de proliferación de células T derivadas de células iPS estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada)

Las células T derivadas de células iPS preparadas a 100.000 células/200 pl se estimularon durante 3 días en una placa de 96 pocillos con un anticuerpo agonista anti-CD3 (3.000 ng/ml) y RetroNectin (marca comercial registrada) (150 pg/ml) inmovilizado sobre ellas, o con perlas anti-CD3/CD28 (Dynabeads) en las que la razón entre la cantidad de células T derivadas de células iPS y la cantidad de partículas de perlas es 1:1, y la cantidad de células cultivadas sin estimulación se midió a lo largo del tiempo (Fig. 3). Las células T derivadas de células iPS proliferaron más mediante la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) que con perlas anti-CD3/CD28.

4. Prueba de proliferación de células T derivadas de células iPS estimuladas varias veces con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca registrada).

Se confirmó la reacción de proliferación celular de las células T derivadas de células iPS a múltiples veces de estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada). Se realizó una prueba de proliferación estimulando células T derivadas de células iPS durante 3 días en una placa inmovilizada y cultivando las células durante 11 a 15 días en una placa no inmovilizada. Una vez finalizada la prueba, se ajustó el número de células y se sometió a la siguiente prueba. Las células T derivadas de células iPS respondieron a la cuarta estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y proliferaron (Fig. 4).

5. Verificación de la actividad citotóxica específica del antígeno WT1 de las células T derivadas de células iPS transferidas al gen WT1-TCR proliferadas mediante estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada)

Se evaluó la actividad citotóxica específica del antígeno WT1 de las células T derivadas de células iPS transferidas al gen WT1-TCR y proliferadas mediante estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) La actividad citotóxica específica del antígeno WT1 se evaluó con base en la diferencia entre la citotoxicidad contra LCL añadido con el péptido del antígeno WT1 y la citotoxicidad contra LCL libre de la adición. Las células T derivadas de células iPS transferidas al gen WT1-TCR apenas tuvieron actividad citotóxica no específica y mostraron únicamente actividad citotóxica específica del antígeno WT1 (Fig. 5).

6. Prueba de proliferación de células T derivadas de células iPS mediante estimulación con anticuerpo agonista anti-CD30

Se verificó si la adición de un anticuerpo agonista anti-CD30 (0, 30, 100, 300 ng/ml) durante la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) influye en la proliferación de células T derivadas de células iPS. Como placa inmovilizada de 96 pocillos, se utilizó una en la que se inmovilizaron un anticuerpo agonista anti-CD3 (3.000 ng/ml) y RetroNectin (marca comercial registrada) (150 ug/ml). Las células T derivadas de células iPS proliferaron más mediante la adición de un anticuerpo agonista anti-CD30. Las células proliferaron de manera dependiente de la concentración de anticuerpos agonistas anti-CD30 (Fig. 6).

7. Prueba de proliferación de células T derivadas de células iPS mediante estimulación múltiple con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30

Se verificó si las células T derivadas de células iPS muestran una reacción de proliferación luego de múltiples estímulos con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30. Las células se sembraron en una placa que contenía anticuerpo anti-CD3 (3.000 ng/ml) y RetroNectin (marca comercial registrada) (150 pg/ml) inmovilizado sobre ella y se cultivaron a 5% de CÜ2/37°C durante 3 días.

El día 3 de cultivo, se recogieron las células de la placa y se midió el número de células utilizando TC20 (Bio-Rad). Las células se suspendieron en una cantidad apropiada de un medio obtenido mediante la adición de citocinas y similares en la Tabla 2 a un medio a-MEM que contenía 15% de FBS, se añadió a una placa no inmovilizada y se cultivó a 5% de CÜ2/37°C. Posteriormente, se recogieron las células de la placa una vez cada uno de los días 6, 7, 9, 10, 14 y 16, y se midió el número de células. Las células se suspendieron en una cantidad apropiada, se añadieron a una placa no inmovilizada y se cultivaron a 5% de CÜ2/37°C. Como medio de cultivo se utilizó uno adicionado con un anticuerpo agonista anti-CD30 diluido a la concentración final de 100 ng/ml, y uno libre de anticuerpo agonista anti-CD30. La estimulación antes mencionada del día 0 al día 16 de cultivo se repitió dos veces. Incluso en la segunda estimulación, las células T derivadas de células iPS proliferaron mediante la estimulación con el anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y el anticuerpo agonista anti-CD30 en comparación con la estimulación con el anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) solo (Fig. 7).

8. Detección de CD197 y CD45RA en la superficie de la membrana de células T derivadas de células iPS después de la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30

Después de la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca registrada), o estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30, se midió mediante citómetro de flujo la expresión de CD197 y CD45RA en la superficie de la membrana de las células T derivadas de células iPS en el día 7. En la población de células estimulada con el anticuerpo agonista anti-CD3/RetroNectin (marca comercial registrada) y el anticuerpo agonista anti-CD30, las células T derivadas de células iPS de memoria central CD197-positivas y CD45RA-negativas fueron mayoría (Fig. 8).

9. Verificación de la actividad citotóxica específica del antígeno WT1 de células T derivadas de células iPS transferidas al gen WT1-TCR proliferadas mediante estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin y anticuerpo agonista anti-CD30

Las células T derivadas de células iPS transferidas al gen WT1-TCR proliferaron mediante la estimulación con el anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y el anticuerpo agonista anti-CD30 y se aplicaron a células LCL HLA-A*24:02 positivas en presencia o ausencia del péptido antígeno WT1, y se evaluó la actividad citotóxica específica del antígeno WT1. Las células T derivadas de células iPS transferidas al gen WT1-TCR apenas tuvieron actividad citotóxica no específica y mostraron únicamente actividad citotóxica específica del antígeno WT1 (Fig. 9).

[Ejemplo 2]

1. Preparación de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana

La sangre periférica humana era una célula mononuclear de sangre periférica derivada de un donante sano adquirida en Precision Bioservices. Utilizando el kit de aislamiento de células T CD8+, se aislaron células T humanas CD8 positivas (Milteny).

2. Prueba de proliferación de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana

Mediante un método similar al del [Ejemplo 1] 7. Prueba de proliferación, se realizó la prueba.

3. Cultivo de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana utilizadas para la prueba de injerto en ratones

A células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana suspendidas a una concentración final de 100.000 células/ml en 3 tipos de medios obtenidos añadiendo los aditivos que se muestran en la Tabla 4 a un medio a-MEM que contenía 15% de FBS se añadió Dynabeads T-Activator CD3/CD28 (gibco) ajustado a una cantidad de 3 veces el número de células, y las células se cultivaron a 5% de CÜ2/37°C durante 3 días. Las células se recogieron de la placa el día 3 de cultivo y se suspendieron en una cantidad apropiada de un medio obtenido mediante la adición de citocinas y similares que se muestran en la Tabla 5 al medio a-MEM que contenía 15% de FBS y se cultivaron a 5% de CÜ2/37°C. Posteriormente, se recogieron las células de la placa el día 10 de cultivo y se midió el número de células. Las células se suspendieron en una cantidad adecuada y se administraron a los ratones. Los días 6, 10, 13 y 17 de cultivo, las células se recogieron de la placa, se suspendieron en una cantidad adecuada y se sometieron a un experimento de expresión de CD197.

[Tabla 4]

[Tabla 5]

4. Administración de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana a ratones y recuperación de células injertadas.

Se utilizó un ratón NSG macho de 8 semanas de edad (Japón Charles River), que fue irradiado con 2 Gy de rayos gamma antes de la administración de células el mismo día. Se administraron por vía intravenosa a ratones 5.000.000 de células ajustadas en cultivo de células T CD8-positivas derivadas de sangre periférica humana utilizadas para la prueba de injerto en ratones en el [Ejemplo 2] 3, y los ratones se criaron durante 4 semanas. Posteriormente, los ratones fueron sacrificados y se recogieron de ellos células de médula ósea, esplenocitos y leucocitos en la sangre.

5. Detección de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana injertadas en tejido de ratón

Las células recolectadas se tiñeron con el anticuerpo de la Tabla 3 y se detectaron utilizando citometría de flujo LSRFortessa™ X-20 (BD Bioscience).

[Ejemplo 2 Experimental]

1. Prueba de proliferación de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana mediante estimulación con anticuerpo agonista anti-CD30

Se confirmó si la adición de un anticuerpo agonista anti-CD30 durante la estimulación con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) influye en la proliferación de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana. La adición del anticuerpo agonista anti-CD30 promovió la proliferación de células T CD8 positivas en la sangre periférica humana (Fig. 10).

2. Detección de CD197 en la superficie de la membrana de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana después de la estimulación con microesferas anti-CD3/CD28 y anticuerpo agonista anti-CD30

La expresión de CD197 en la superficie de la membrana celular de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana estimuladas con perlas anti-CD3/CD28 en medio que contenía IL-2 o medio que contenía IL-7/IL-15, medio que contenía IL-7/IL-15/anticuerpo anti-CD30 en los días 6, 10, 13, 17 de cultivo se midió mediante un citómetro de flujo. El día 6, se confirmó la expresión de CD197 en todos los grupos. Sin embargo, la expresión de CD197 casi desapareció el día 13 en el grupo de medio que contenía IL-2 y el día 17 en el grupo de medio que contenía IL-7/IL-15, mientras que la expresión de CD197 se mantuvo incluso el día 17 en el grupo de medio que contenía IL-7/IL-15/anticuerpo anti-CD30 (Fig. 11).

3. Evaluación del injerto de células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana después de la estimulación con microesferas anti-CD3/CD28 y anticuerpo agonista anti-CD30

Se administraron por vía intravenosa células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana estimuladas con perlas anti-CD3/CD28 en medio que contenía IL-2 o medio que contenía IL-7/IL-15, medio que contenía IL-7/IL-15/anticuerpo anti-CD30 el día 10 de cultivo a ratones inmunodeficientes y se confirmó el injerto en sangre y tejidos inmunes. El día 28 después de la administración, se recogieron sangre, bazo y médula ósea de los ratones y se detectaron las células T humanas CD8 positivas contenidas en ellos mediante citometría de flujo. Casi no se detectaron células T humanas CD8 positivas en el grupo de medio que contenía IL-2 en ninguno de los órganos, mientras que se detectaron células T humanas CD8 positivas en el grupo de medio que contenía IL-7/IL-15 y en el grupo de medio que contenía IL-7/IL-15/anticuerpo anti-CD30. En el grupo de medio que contenía anticuerpos IL-7/IL-15/anti-CD30, se detectó una mayor cantidad de células T humanas CD8 positivas. Por lo tanto, se demostró que las células T CD8 positivas derivadas de sangre periférica humana cultivadas en un medio que contiene anticuerpo IL-7/IL-15/anti-CD30 no solo pueden mantener la expresión de CD197 durante mucho tiempo durante el cultivo, sino que también pueden sobrevivir durante mucho tiempoin vivo(Fig. 12).

[Ejemplo 3]

1. Prueba de proliferación de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS

Las células anti-CD19-CART derivadas de células iPS preparadas a 100.000 células/200 gl, en un medio preparado mediante la adición de citocinas y similares de la Tabla 1 a un medio a-MEM que contenía 15% de FBS, se sembraron en una placa que contenía anticuerpo anti-CD3 y RetroNectin inmovilizado sobre la misma y se cultivaron a 5% CÜ2/37°C durante 3 días. Las células se recogieron de la placa el día 3 de cultivo y el número de células se midió utilizando TC20 (Bio-Rad). Las células se suspendieron en una cantidad adecuada de un medio obtenido añadiendo la citocina y similares indicados en la Tabla 2 a un medio a-MEM que contenía un 15% de FBS, se añadieron a una placa no inmovilizada y se cultivaron a 5% de CÜ2/37°C. Posteriormente, las células se recogieron de la placa de 4 a 7 veces en cualquiera de los días 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16 de cultivo y se midió el número de células. Las células se suspendieron en una cantidad apropiada, se añadieron a una placa no inmovilizada y se cultivaron a 5% de CÜ2/37°C.

2. Gen anti-CD19-CAR

Como gen anti-CD19-CAR, se sintetizó artificialmente un oligo ADN que codifica un polipéptido (SEQ ID NO: 5) diseñado para alinearse en el orden que se muestra en la Tabla 6 desde el extremo N.

[Tabla 6]

3. Producción de un vector retroviral portador del gen anti-CD19-CAR

El oligo ADN artificial sintetizado en el [Ejemplo 3] 2. se incorporó al sitio de multiclonación del vector del retrovirus pMEI-5. La producción del vector del virus se subcontrató a Unitech.

4. Producción de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS

Las células T derivadas de células iPS producidas en el [Ejemplo 1] 3. se infectaron con el vector retroviral que era portador de un gen anti-CD19-CAR y se produjeron en el [Ejemplo 3] 3., por lo que se produjeron células anti-CD19-CART derivadas de células iPS.

[Ejemplo 3 Experimental]

1. Prueba de proliferación de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS estimuladas con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada)

Las células T derivadas de células iPS producidas en el [Ejemplo 1] 3. y las células anti-CD19-CART derivadas de células iPS producidas en el [Ejemplo 3] 4. se estimularon durante 3 días con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada), y se midió el número de células cultivadas sin estimulación a lo largo del tiempo. Las células anti-CD19-CART derivadas de células iPS proliferaron al mismo nivel que las células T derivadas de células iPS mediante la estimulación con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) (Fig. 13).

2. Prueba de proliferación de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS mediante estimulación con anticuerpo agonista anti-CD30.

Se confirmó si la adición de un anticuerpo agonista anti-CD30 durante la estimulación con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) influye en la proliferación de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS. La adición del anticuerpo agonista anti-CD30 promovió la proliferación de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS (Fig. 14).

3. Detección de CD197 en la superficie de la membrana de células iPS derivadas de células anti-CD19-CART tras estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30.

La expresión de CD197 en la superficie de la membrana celular de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS en los días 3 y 7 después de la estimulación con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada), o después de la estimulación con anticuerpo anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada)/anticuerpo agonista anti-CD30 se midió mediante citómetro de flujo. El día 3, se confirmó la expresión de CD197 en ambos grupos. Sin embargo, la expresión de CD197 casi desapareció el día 7 en el grupo de estimulación con anticuerpo anti-CD3/RetroNectin (marca comercial registrada), pero se confirmó que la expresión de CD197 se mantuvo en el grupo de estimulación con anticuerpo anti-CD3/RetroNectin (marca comercial registrada) anticuerpo agonista anti-CD30 (Fig. 15).

4. Verificación de la actividad citotóxica de Raji de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS después de la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30

La actividad citotóxica de las células anti-CD19-CART derivadas de células iPS obtenidas por proliferación en el [Ejemplo experimental 3] 1. contra células cancerosas CD19-positivas se evaluó mediante la actividad citotóxica contra células Raji CD19-positivas. Las células anti-CD19-CART derivadas de células iPS mostraron actividad citotóxica contra las células Raji que expresan CD19 (Fig. 16).

[Ejemplo 4]

1. Gen anti-CD19-CAR que contiene el dominio intracelular derivado de CD30

Como gen anti-CD19-CAR, se sintetizó artificialmente un oligo ADN que codifica un polipéptido (SEQ ID NO: 7) diseñado para alinearse en el orden mostrado en la Tabla 7 desde el extremo N.

[Tabla 7]

2. Producción de un vector retroviral que porta el gen anti-CD19-CAR que contiene el dominio intracelular derivado de CD30

El oligo ADN artificial sintetizado en el [Ejemplo 4] 1. se incorporó al sitio de multiclonación del vector retroviral pMY. Utilizando células FLYRD18 para la producción de vectores retrovirales, se produjo un vector de virus.

3. Producción de células anti-CD19-CART derivadas de células iPS (iCD19-CD30-CART) que contienen el dominio intracelular derivado de CD30

Las células T derivadas de células iPS producidas en el [Ejemplo 1]3. se infectaron con el vector retroviral portador de un gen anti-CD19-CAR y se produjeron en el [Ejemplo 4] 2., por lo que se produjeron células anti-CD19-CART derivadas de células iPS (iCD19-CD30-CART) que contienen un dominio intracelular derivado de CD30.

[Ejemplo 4 Experimental]

La actividad citotóxica de iCD19-CD30-CART obtenida en el [Ejemplo 4] 3. contra células cancerosas CD19-positivas se evaluó mediante la actividad citotóxica contra células Raji CD19-positivas. El iCD19-CD30-CART mostró actividad citotóxica contra las células Raji que expresaban CD19 (Fig. 17).

[Ejemplo 5]

1. Preparación de células iPS

De forma similar al [Ejemplo 1], como célula iPS se utilizó la cepa Ff-I01s04 proporcionada por el Centro de Investigación y Aplicación de Células iPS (CiRA) de la Universidad de Kyoto. El cultivo de células iPS se realizó según el protocolo distribuido por CiRA, "Cultivo de células iPS humanas en condiciones sin alimentador".

2. Diferenciación de células iPS en células T Y5TCR-positivas (células y5T)

La diferenciación de células iPS en células T YSTCR-positivas (células<y>^T) se realizó según un método conocido (documento WO 2017/221975) como en el [Ejemplo 1]. Como anticuerpo anti-CD3 utilizado en la etapa de diferenciación, se utilizó UCHT1 3.000 ng/ml (fabricado por GeneTex). Las células CD3 positivas obtenidas fueron células yST (en lo sucesivo en la presente memoria denominadas "células yST derivadas de células iPS (células ¡<yó>T)").

3. Cultivo de expansión de células<y>5T derivadas de células iPS

Las células ¡<yó>T obtenidas en el [Ejemplo 5] 2. se suspendieron a 2.000.000 de células/ml en un medio obtenido añadiendo la citocina que se muestra en la Tabla 8 a un medio a-MEM que contenía 15% de FBS, y la suspensión se sembró en una placa que contenía anticuerpo anti-CD3 (UCHT1) y RetroNectin (marca comercial registrada) inmovilizado sobre la misma y se cultivó a 5% de CO2/37°C durante 3 días. Las células se recogieron de la placa el día 3 de cultivo y se midió el número de células utilizando NucleoCounter NC-200 (ChemoMetec). Las células se suspendieron en una cantidad adecuada de un medio obtenido añadiendo las citocinas y similares indicadas en la Tabla 9 a un medio a-MEM que contenía un 15% de FBS, se añadieron a una placa G-Rex de 6 pocillos no inmovilizada (WILSON<w>O<l>F) y se cultivaron a 5% de CO2/37°C. Posteriormente, las células se recogieron de la placa de 4 a 6 veces en cualquiera de los días 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 17 de cultivo y se midió el número de células. Las células se inmovilizaron en la placa de cultivo con anticuerpo anti-CD3 y RetroNectin (marca comercial registrada) mediante el siguiente método. Se añadieron a la placa un anticuerpo anti-CD3 (UCHT1, concentración final 3.000 ng/ml) y RetroNectin (concentración final 150 pg/ml) disueltos en PBS en las concentraciones necesarias y la placa se dejó reposar durante la noche a 4°C. La placa se lavó con PBS y se sometió a la prueba.

[Tabla 8]

Nombre del producto I Fabricante I Concentración I con anti-CD30 I sin anti-CD30

[Tabla 9]

[Ejemplo 5 Experimental]

1. Prueba de proliferación de células yST derivadas de células iPS mediante estimulación con anticuerpo agonista anti-CD30

Se verificó si la adición de un anticuerpo agonista anti-CD30 (300 ng/ml) al método de estimulación utilizando anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) en el [Ejemplo 5] 3. influye en la proliferación de células<y>5T derivadas de células iPS. Las células T derivadas de células iPS proliferaron mediante la adición de un anticuerpo agonista anti-CD30 (Fig. 18).

[Ejemplo 6]

1. Gen IL-15Ra/IL-15

Como gen IL-15Ra/IL-15, se sintetizó artificialmente un ADN oligo que codifica un polipéptido (SEQ ID NO: 8) diseñado para alinearse en el orden mostrado en la Tabla 10 desde el extremo N.

[Tabla 10]

2. Producción de un vector retroviral portador del gen IL-15Ra/IL-15

El oligo ADN artificial sintetizado en el [Ejemplo 6] 1. se incorporó al sitio de multiclonación del vector retroviral pMY. Utilizando células FLYRD18 para la producción de vectores retrovirales, se produjo un vector de virus.

3. Producción de células anti-CD19-CAR/IL-15Y5T derivadas de células iPS

Las células<y>ST derivadas de células iPS (células<íy>5T) producidas en el [Ejemplo 5] 2. se infectaron con el vector retroviral portador del gen anti-CD19-CAR y producido en el [Ejemplo 3] 3. y el vector retroviral portador del gen IL-15Ra/IL-15 y producido en el [Ejemplo 6] 1., por lo que se produjeron células anti-CD19-CAR/IL-15<y>5T derivadas de células iPS (células<í>CD19C<a>R/IL-15<y>5T).

4. Cultivo de expansión de células anti-CD19-CAR/IL-15Y5T derivadas de células iPS

Mediante un método similar al del [Ejemplo 5]3., se realizó un cultivo de expansión de células iCD19CAR/IL-15y5T excepto que no se añadió IL-2.

[Ejemplo 6 Experimental]

1. Prueba de proliferación de células anti-CD19-CAR/IL-15y5T derivadas de células iPS mediante estimulación con anticuerpo agonista anti-CD30

Se verificó si la adición de un anticuerpo agonista anti-CD30 (0, 30, 100, 300 ng/ml) durante la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) en el [Ejemplo 6] 4. influye en la proliferación de células ÍCD19CAR/IL-15<y>5T. Las células proliferaron más mediante la adición de un anticuerpo agonista anti-CD30 (Fig. 19).

2. Estudio de la actividad citotóxica de células iPS derivadas de células anti-CD19-CAR/IL-15Y5T después de la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30

Se evaluó la actividad citotóxica de las células ÍCD19CAR/IL-15<y>5T obtenidas en el [Ejemplo 6] 4. Utilizando células Raji CD19 positivas y células CCRF-CEN CD19 negativas como células objetivo, se mezclaron células T ÍCD19CA<r>/IL-15<y>5 en una proporción de 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 veces en relación con la célula objetivo. La actividad citotóxica de las células ÍCD19CAR/IL-15y5T se evaluó en función de la muerte de la célula objetivo 2 horas después. Se demostró que la expansión de células iCD19CAR/IL-15y5T cultivadas en un medio que contiene un anticuerpo agonista anti-CD30 tiene actividad citotóxica contra las células Raji CD19-positivas, pero no tiene actividad citotóxica contra las células CCRF-CEN CD19-negativas (Fig. 20).

3. Efecto de aumento del número de días de supervivencia de las células anti-CD19-CAR/IL-15Y5T derivadas de células iPS después de la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada) y anticuerpo agonista anti-CD30.

Se trasplantaron 5x105 células Nalm6 (ATCC) a ratones NOD/Shi-scid, IL-2R<y>KO (NOG) (Instituto Central para Animales Experimentales, hembras, 7-8 semanas de edad) por la vena de la cola para preparar ratones de xenoinjerto Nalm6. El día 4 después del trasplante, se administró una suspensión de células iCD19CAR/IL-15<y>5T (5<x>106 (células)) obtenidas en el [Ejemplo 6] 4. en 0,1 ml de tampón HBSS o una cantidad igual de tampón HBSS por la vena de la cola, y se confirmó el número de días de supervivencia. Todos los ratones trasplantados con células cancerosas Nalm6 CD19-positivas a través de la vena de la cola murieron dentro de las 3 semanas en el grupo de administración de control, mientras que todos los ratones sobrevivieron durante al menos 6 semanas en el grupo de administración de células T ÍCD19CAR/IL-15<y>5 cultivadas en un medio que contenía un anticuerpo agonista anti-CD30 (Fig. 21).

[Ejemplo 7]

1. Producción de células iPS derivadas de células anti-CD19-CAR/IL-15apT

Las células anti-CD19-CART derivadas de células iPS producidas por el método del [Ejemplo 3] 4. se infectaron con el vector retroviral portador del gen IL15Ra/IL-15 producido en el [Ejemplo 6] 2. para producir células anti-CD19-CAR/IL-15apT derivadas de células iPS (células iCD19CAR/IL-15apT).

2. Cultivo de expansión de células iCD19CAR/IL-15apT mediante el uso de anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada)

Las células iCD19CAR/IL-15apT obtenidas en el [Ejemplo 7] 1. se cultivaron mediante un método similar al del [Ejemplo 6] 4. hasta el día 7. No se añadió un anticuerpo anti-CD30 humano.

[Ejemplo 7 Experimental]

1. Efecto antitumoralin vivode células iCD19CAR/IL-15apT después de la estimulación con anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado/RetroNectin (marca comercial registrada)

Se transplantaron 5x105 células Nalm6 que expresan luciferasa (ATCC) a ratones NOD/Shi-scid, IL-2RyKO (NOG) (Instituto Central para Animales de Experimentación, hembras, de 7-8 semanas de edad) por la vena de la cola para preparar ratones xenoinjertados Nalm6 que expresan luciferasa. El día 4 después del trasplante, se administró por la vena de la cola una suspensión de células ¡CD19CAR/IL-15apT (5x106 células) obtenida en el [Ejemplo 7] 2. en 0,1 ml de tampón HBSS o una cantidad igual de tampón HBSS. Se administró luciferina por la vena de la cola cada semana después de la administración, y se midió la actividad de la luciferasa expresada por las células Nalm6 utilizando IVIS. En el grupo al que se administró el control, se confirmó la luminiscencia derivada de las células Nalm6 en todo el cuerpo 2 semanas después de la administración, y todos los ratones murieron 3 semanas después de la administración, mientras que no se detectó luminiscencia hasta 6 semanas después de la administración en el grupo al que se administró células iCD19CAR/IL-15apT (Fig. 22).

[Ejemplo 8]

1. Producción de células yST derivadas de células iPS

De la misma manera que en el [Ejemplo 5] 1. y 2., se produjeron células y5T derivadas de células iPS (células ¡yst).

[Ejemplo 8 Experimental]

1. Medición de la concentración de anticuerpo agonista anti-CD3 (UCHT1) apto para inmovilización en placa de cultivo y concentración de RetroNectin (marca comercial registrada)

Un anticuerpo agonista anti-CD3 (UCHT1) y RetroNectin (marca comercial registrada) se mezclaron e inmovilizaron en una placa de cultivo de la misma manera que en el [Ejemplo 1] 5. Después, se midió la cantidad del mismo inmovilizado en una placa de cultivo utilizando el método ELISA (Fig. 23). Se confirmó la inmovilización dependiente de la concentración de un anticuerpo agonista anti-CD3 libre de mezcla con RetroNectin (marca comercial registrada) entre 3 ng/ml y 3.000 ng/ml (0,003 pg/ml a 30 pg/ml). Sin embargo, la cantidad de anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado disminuyó a medida que aumentó la concentración de RetroNectin (marca comercial registrada) a mezclar. Se confirmó la inmovilización dependiente de la concentración de RetroNectin (marca comercial registrada) entre 16,7 pg/ml y 150 pg/ml.

2. Verificación del intervalo de concentración de anticuerpo agonista anti-CD3 y RetroNectin (marca comercial registrada) necesario para que el anticuerpo agonista anti-CD3 inmovilizado y RetroNectin (marca comercial registrada) inmovilizado sean adecuados para la proliferación de células ¡<yó>T derivadas de células iPS.

Las células ¡yóT ajustadas a 100.000 células/200 pl en un medio obtenido añadiendo citocinas y similares de la Tabla 1, y un anticuerpo agonista anti-CD30 diluido a una concentración final de 0, 3, 30, 300 ng/ml a medio IMDM que contenía 15% de FBS se sembraron en una placa con un anticuerpo agonista anti-CD3 (0, 300, 3.000, 30.000 ng/ml (0, 0,3, 3, 30 pg/ml)) y RetroNectin (marca comercial registrada) (0, 2, 15, 150 pg/ml) inmovilizado sobre las mismas, y se cultivaron durante 3 días en atmósfera de 5% de CÜ2/37°C.

El día 3 de cultivo, las células se recogieron de la placa, se suspendieron en una cantidad apropiada de un medio obtenido mediante la adición de citocinas y similares en la Tabla 2 a medio IMDM que contenía 15% de FBS, se sembraron en una placa de 96 pocillos no inmovilizada y se cultivaron a 5% de CÜ2/37°C. Posteriormente, las células se recogieron de la placa en cualquiera de los días 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 12 una vez cada vez y de 4 a 7 veces en total, se suspendieron en una cantidad apropiada de un medio, se sembraron en una placa no inmovilizada y se cultivaron a 5% de CÜ2/37°C. El día 13 de cultivo se contaron las células utilizando un hemocitómetro y se midió la tasa de proliferación en función de la comparación con el número del día 0 de cultivo (Fig. 24). Se observó una inducción equivalente de la proliferación de células ¡yóT en las placas en las que se inmovilizó una mezcla de anticuerpo agonista anti-CD3 y RetroNectin (marca comercial registrada) a 0,3 pg/ml y 2 pg/ml, 3 pg/ml y 15 pg/ml, 30 pg/ml y 150 pg/ml, respectivamente. Además, se confirmó la concentración de adición de anticuerpos agonistas anti-CD30 que dependía de la proliferación celular.

[Aplicabilidad industrial]

Las células T pueden expandirse eficientemente en cultivos repetidos cultivando células CD3-positivas en presencia de un agonista del complejo CD3/TCR, fibronectina o una variante de la misma, y un agonista CD30. Cuando las células CD3 positivas que se van a cultivar son células CD3 positivas CD8 positivas o células CD3 positivas CD8 positivas CD30 positivas, las células cultivadas producidas o en expansión cambian fácilmente a células T efectoras y exhiben actividad citotóxica. Por lo tanto, se puede aplicar a la terapia con células T.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una célula CD3 positiva, que comprende la etapa (I) de cultivar la célula CD3 positiva en presencia de un agonista del complejo CD3/TCR, fibronectina o una variante de la misma, y un agonista CD30.

2. El método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa (II) de cultivar la célula CD3-positiva cultivada en la etapa (I) en ausencia de un agonista del complejo CD3/TCR y fibronectina o una variante de la misma, y en presencia de un agonista CD30.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde la célula CD3 positiva se deriva de una célula madre pluripotente.

4. El método según la reivindicación 3, en donde la célula madre pluripotente es una célula iPS.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula CD3-positiva es una célula CD3-positiva que expresa un receptor de antígeno quimérico.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula CD3-positiva es una célula CD3-positiva CD8-positiva.

7. El método según la reivindicación 6, en donde la célula CD3-positiva CD8-positiva es una célula CD3-positiva CD8-positiva CD4-negativa

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la célula CD3 positiva es una célula YTCR positiva y/o 5TCR positiva.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el agonista del complejo CD3/TCR es un agonista de CD3 y/o un agonista de TCR

10. El método según la reivindicación 9, en donde el agonista CD3 es un anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo.

11. El método según la reivindicación 10, en donde el anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo es un anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo producido a partir del clon UCHT1.

12. El método según la reivindicación 9, en donde el agonista de TCR es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-TCR o un fragmento de unión del mismo, un complejo HLA/péptido o un multímero del mismo, y un complejo HLA/superantígeno o un multímero del mismo.

13. El método según la reivindicación 10 u 11, en donde el anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo está inmovilizado en un recipiente de cultivo

14. El método de según la reivindicación 13, en donde el anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo se inmoviliza poniendo en contacto 1 ng/ml - 50.000 ng/ml del anticuerpo agonista anti-CD3 o un fragmento de unión del mismo con el recipiente de cultivo.

15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la fibronectina o una variante de la misma es RetroNectin (marca comercial registrada).

16. El método según la reivindicación 15, en donde RetroNectin (marca comercial registrada) se inmoviliza en el recipiente de cultivo.

17. El método según la reivindicación 16, en donde RetroNectin (marca comercial registrada) se inmoviliza poniendo en contacto 1 - 150 ug/ml de RetroNectin (marca comercial registrada) con el recipiente de cultivo.

18. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el agonista de CD30 es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo agonista anti-CD30 o un fragmento de unión del mismo y un ligando de CD30 o un fragmento de unión del mismo.

19. El método según la reivindicación 18, en donde el anticuerpo agonista anti-CD30 o un fragmento de unión del mismo está contenido en el medio.

20. El método según la reivindicación 19, en donde una concentración del anticuerpo agonista anti-CD30 o un fragmento de unión del mismo en el medio es de 1 ng/ml - 1.000 ng/ml.

21. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el medio comprende al menos uno seleccionado de IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21.

22. El método según la reivindicación 21, en donde el medio comprende IL-7, IL-15, IL-18 e IL-21.

23. El método según la reivindicación 21 o 22, en donde el medio comprende además TL1A y/o IL-12.

24. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde la célula CD3-positiva producida es además CD197-positiva.

25. Un método para el cultivo de expansión de una célula CD3 positiva, que comprende una etapa de cultivar la célula CD3 positiva en presencia de un agonista del complejo CD3/TCR, fibronectina o una variante de la misma, y un agonista CD30.

26. Un kit para el cultivo de expansión de una célula CD3 positiva, que comprende lo siguiente:

(2) un medio que comprende un agonista CD30.