ES2991488T3

ES2991488T3 - Método de procesamiento de semen, aparato y composiciones de medio relacionadas

Info

Publication number: ES2991488T3
Application number: ES18742360T
Authority: ES
Inventors: Thomas B Gilligan; Clara Gonzalez-Marin; Ramakrishnan Vishwanath
Original assignee: Inguran LLC
Current assignee: Inguran LLC
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2024-12-03
Anticipated expiration: 2038-01-19
Also published as: CN110177461A; US11279913B2; CN110177461B; EP4445731A3; BR112019014499A2; EP4445731A2; RU2019125565A; CA3049264A1; CA3049264C; RU2019125565A3; US20180208894A1; EP3570853B1; CN114732007A; CA3210334A1; US20220186182A1; NZ755215A; EP3570853A1; US20250346857A1; WO2018136772A1; EP3570853A4

Abstract

Las realizaciones de la presente invención se refieren en general a procesos, sistemas y composiciones útiles para manipular una proporción de espermatozoides viables portadores de cromosomas X con respecto a espermatozoides viables portadores de cromosomas Y en al menos una población de espermatozoides y útiles para preservar la población de espermatozoides manipulada resultante. En algunas realizaciones, se puede incorporar un crioprotector en varios medios utilizados para manipular la muestra de esperma, como en un medio de tinción, un fluido envolvente y un medio de recolección. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de procesamiento de semen, aparato y composiciones de medio relacionadas

Campo técnico

Generalmente, la presente divulgación se refiere al procesamiento de semen, y más particularmente se refiere a procesos, sistemas y composiciones útiles en la manipulación de una relación entre espermatozoides viables portadores del cromosoma X y espermatozoides viables portadores del cromosoma Y en al menos una población de espermatozoides y útiles para conservar la población de espermatozoides manipulada resultante.

Antecedentes

El contenido cromosómico de los gametos haploides masculinos determina el sexo de la descendencia de los mamíferos. Más específicamente, la fecundación de un ovocito con un espermatozoide portador del cromosoma Y da descendencia masculina y la fecundación con un espermatozoide portador del cromosoma X da descendencia femenina. Aunque se han investigado varias tecnologías para predeterminar el sexo de la descendencia de los mamíferos, sólo la selección por citometría de flujo goza de una amplia aceptación comercial.

Los citómetros de flujo modificados para la selección de espermatozoides detectan diferencias relativas en el contenido de ADN de los espermatozoides portadores del cromosoma X y espermatozoides portadores del cromosoma Y. Para medir el contenido de ADN de los espermatozoides, una población de espermatozoides se tiñe generalmente de forma estequiométrica con un colorante fluorescente selectivo de ADN que se une al ADN nuclear. Dicho colorante fluorescente selectivo de ADN, Hoechst 33342, denominado algunas veces Hoechst bisbenzimide 33342, se puede usar en cantidades suficientes para diferenciar pequeñas variaciones en el ADN nuclear sin presentar la toxicidad de otros colorantes.

Estas diferencias relativas entre espermatozoides portadores del cromosoma X y espermatozoides portadores del cromosoma Y son normalmente pequeñas variaciones. En bovinos, por ejemplo, los toros de raza frisona tienen aproximadamente una diferencia del 3,8 % en contenido de ADN, mientras que los toros de Jersey tienen aproximadamente una diferencia del 4,1 %. Debido a la naturaleza inexacta de la tinción estequiométrica del ADN, estas pequeñas diferencias son difíciles de determinar. Las muestras de semen, incluso muestras dentro de una única raza, pueden variar mucho en concentración, pH, movilidades y morfologías. Por lo tanto, las condiciones de tinción que funcionaron bien en una circunstancia pueden teñir por defecto o teñir por exceso otras muestras de semen, incluso muestras de semen recogidas de la misma raza, o incluso del mismo animal. La forma de los espermatozoides crea dificultades adicionales en la diferenciación de células portadoras del cromosoma X de del cromosoma X. En particular, las cabezas de espermatozoides, que contienen el ADN nuclear, tienen forma aproximadamente de pala en la mayoría de las especies. Esta geometría presenta un efecto de confusión adicional que produce diferentes niveles de emisiones fluorescentes a diferentes ángulos y estas diferencias superan a las diferencias detectables en espermatozoides portadores de los cromosomas X e Y. La mayoría de los citómetros de flujo que seleccionan espermatozoides incluyen un detector lateral para determinar la orientación de los espermatozoides y una boquilla de orientación para proporcionar espermatozoides con una orientación más uniforme.

A pesar de estas dificultades, Hoechst 33342 se puede usar en concentraciones no tóxicas. Desafortunadamente, el proceso de tinción es perjudicial para las células no regenerativas y de tiempo crítico. En particular, la tinción uniforme con Hoechst 33342 requiere incubación a elevadas temperaturas y elevados pH y tanto elevar la temperatura del semen como elevar el pH del semen contribuyen a un daño del semen. Una vez teñido, la presión experimentada por el semen en un citómetro de flujo puede suponer un daño adicional al semen, y las fuerzas de cizallamiento asociadas pueden suponer más daño.

La vida útil limitada del semen necesita frecuentemente congelación para la conservación y el transporte. Se retiran los líquidos intracelulares, que incluyen agua, de la célula durante este proceso para reducir el volumen de líquidos intracelulares a congelar. De otro modo, los líquidos intracelulares cristalizarían y se expandirían a partir de su volumen líquido. Esta expansión provoca estrés intracelular y daño mecánico al semen y reduce la fertilidad del semen. Varios crioprotectores pueden ser adecuados para este fin, siendo el más común el glicerol. Incluso el glicerol, sin embargo, presenta varios inconvenientes. Por ejemplo, el glicerol plantea al menos un grado de toxicidad al semen, cuyo efecto puede llegar a ser más pronunciado con cantidades mayores de glicerol. Además, el glicerol puede ser hiperosmótico para el semen, que puede dar como resultado un grado de choque al semen al que se ha añadido el glicerol. Dichas propiedades hiperosmóticas pueden provocar que un semen que entra en contacto con el glicerol se encoja o expanda rápidamente como resultado de una diferencia en la concentración de soluto a través de la membrana celular del espermatozoide. Dicho rápido encogimiento y expansión pueden provocar daño al semen. Esta toxicidad y daño pueden tener un efecto agravante, particularmente para el semen seleccionado que ha sufrido a través de las etapas perjudiciales de tinción y selección.

Sin embargo, en la mayoría de los entornos comerciales, el beneficio de la congelación de semen seleccionado supera generalmente el impacto negativo del daño causado y se han desarrollado ciertos procedimientos para minimizar los efectos adversos del glicerol sobre el semen. Como un ejemplo, el glicerol se puede combinar con semen a temperaturas reducidas para mitigar los efectos tóxicos del glicerol sobre el semen. Para este fin, se pueden preparar diluyentes u otros medios que incorporan glicerol en un proceso de múltiples etapas que implica dos o más fracciones de diluyente. En particular, los diluyentes del semen pueden comprender una fracción "A" sin glicerol y una fracción "B" con glicerol. Las fracciones "A" y "B" permiten introducir un diluyente de semen en dos o más etapas, por ejemplo, una primera etapa en la que la fracción A se añade al semen, tal como semen de sexo seleccionado, que puede estar a temperatura ambiente, seguido por una segunda etapa en la que el semen y la fracción A se enfrían hasta una temperatura más baja, y la fracción B que contiene glicerol se añade a dicha temperatura más baja. Además, para reducir los efectos hiperosmóticos del glicerol sobre los espermatozoides, la fracción B se puede añadir en múltiples etapas, posiblemente para reducir el choque a los espermatozoides sometiendo los espermatozoides a cantidades reducidas de glicerol en cada etapa de glicerol añadido. Como se describe en la solicitud internacional WO/200137655, por ejemplo, el semen diluido puede ser reconcentrado por centrifugación y suspensión en un diluyente de congelación, algunas veces llamado un diluyente "AB" que tiene la mitad del contenido de glicerol de la fracción "B".

Sumario de la invención

Una amplia realización de la invención descrita en el presente documento se refiere a un método de procesamiento de semen en el que un crioprotector se introduce en fases más tempranas de las previamente contempladas. La muestra de semen que tiene espermatozoides viables portadores del cromosoma X con respecto a espermatozoides viables portadores del cromosoma Y se tiñe con un medio de tinción y entra en contacto con un líquido envolvente en una trayectoria de flujo. El líquido envolvente puede incluir un crioprotector. El método puede continuar mediante la manipulación de la relación entre espermatozoides viables portadores del cromosoma X y espermatozoides viables portadores del cromosoma Y en la muestra de semen para formar al menos una población de espermatozoides manipulada. Ciertas realizaciones pueden incluir además la etapa de recoger la población de espermatozoides manipulada en un medio de recogida, algunas veces denominado un líquido de captura o un líquido de recogida. Ciertas realizaciones pueden incluir además la etapa de crioconservar/congelar la muestra de semen manipulada. El crioprotector puede ser un polialcohol, amida de bajo peso molecular, o metilamida; en una realización, el polialcohol es un alcohol de azúcar, tal como etilenglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; un glicilglicitol, o cualquier combinación de alcoholes de azúcar. En otra realización, el polialcohol puede ser un glicol, tal como propilenglicol, butanotriol o combinaciones de estos.

Cuando está presente en el líquido envolvente, el crioprotector puede tener una concentración en vol/vol o p/vol entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 2 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 4 %; entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 2 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 3 %; aproximadamente 3 %; entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 4 %; entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 5 %; entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 6 %; aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %; o entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 5 %. Cuando está presente en el medio de recogida, el crioprotector puede tener una concentración en vol/vol o p/vol entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 2 % de crioprotector en volumen; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 4 % de crioprotector en volumen; entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 6 % de crioprotector en volumen; entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 5 % de crioprotector en volumen; aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 % de crioprotector en volumen; entre aproximadamente 3,5 % y aproximadamente 5,5 % de crioprotector en volumen, o a aproximadamente el 4,5 % de concentración en volumen.

Una amplia realización descrita en el presente documento se refiere a un sistema para la manipulación de una muestra de semen en presencia de un crioprotector. El sistema incluye una fuente de muestras que contiene una muestra de semen y una fuente de líquido envolvente que contiene líquido envolvente que tiene un aditivo crioprotector. Una estructura de suministro de fluido forma un flujo coaxial de muestra de semen de la fuente de muestras rodeada por líquido envolvente de la fuente de líquido envolvente y dirige el flujo coaxial a través de una ubicación de consulta. Una fuente de radiación electromagnética ilumina el semen en la ubicación de consulta y al menos un detector genera señales en respuesta a dicha iluminación. Un analizador determina las características del semen basándose en las señales producidas por el al menos un detector.

En algunas realizaciones del sistema para la manipulación de una muestra de semen, la estructura de suministro de líquido comprende una boquilla, tal como una boquilla de orientación. Aunque en otras realizaciones la estructura de suministro de líquido comprende un canal de flujo, tal como en una cubeta o en un chip microfluídico. Algunas realizaciones del sistema incluyen los componentes necesarios para formar, cargar y desviar gotitas del flujo coaxial, mientras que en otras realizaciones, un láser fotodañino (es decir, ablación) daña el semen seleccionado en el flujo coaxial.

El crioprotector presente en el líquido envolvente en dicho sistema puede ser un alcohol de azúcar, tal como etilenglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; un glicilglicitol, o cualquier combinación de alcoholes de azúcar. Alternativamente, el crioprotector puede ser un glicol, tal como propilenglicol, butanotriol o combinaciones de estos. El crioprotector puede estar presentes en el líquido envolvente en una concentración en vol/vol o p/vol entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 2 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 4 %; entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 2 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 3 %; entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 4 %; entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 5 %; entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 6 %; o entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 5 %.

El crioprotector puede ser un alcohol de azúcar, tal como etilenglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; a glicilglicitol, o cualquier combinación de alcoholes de azúcar. Alternativamente, el crioprotector puede ser un glicol, tal como propilenglicol, butanotriol o combinaciones de estos.

Cuando está presente en el líquido envolvente, el crioprotector puede tener una concentración en vol/vol o p/vol inferior al 6 %; inferior al 5 %; inferior al 4 %; inferior al 3 %; inferior al 2 %; inferior a 1 %; entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 2 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 4 %; entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 2 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 3 %; entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 4 %; entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 5 %; entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 6 %; o entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 5 %.

En realizaciones en las que la muestra de semen manipulada se diluye en un diluyente de congelación para la congelación, y donde el crioprotector se ha añadido en más de uno de los medios de tinción, el líquido envolvente, medio de recogida, crioprotector pueden estar presentes en el diluyente de congelación en una concentración en vol/vol o p/vol inferior al 6 %. En dicha realización, el crioprotector puede estar presente a una concentración entre 1 % y 6 %, entre 3,5 % y 5,5 %, entre 4 % y 5 %, o a una concentración de aproximadamente 4,5 %.

Con respecto a todas y cada una de las realizaciones de la invención desveladas en el presente documento, que incluyen las realizaciones mencionadas anteriormente, el líquido envolvente puede comprender cualquiera de los crioprotectores mencionados anteriormente en una concentración en vol/vol o p/vol inferior al 8 %; inferior al 7 %; 6 %; inferior al 6 %; inferior al 5 %; 4,5 %; inferior al 4 %; inferior al 3 %; inferior al 2 %; o inferior al 1 %.

Adicionalmente con respecto a todas y cada una de las realizaciones de la invención desveladas en el presente documento, que incluye las realizaciones mencionadas anteriormente, el líquido envolvente puede comprender cualquiera de los crioprotectores mencionados anteriormente en cualquiera de las siguientes concentraciones: 10 mM a 1000 mM; 10 mM a 500 mM; 10 mM a 300 mM; 10 mM a 200 mM; 10 mM a 150 mM; inferior a 1000 mM; inferior a 900 mM; inferior a 800 mM; inferior a 700 mM; inferior a 600 mM; inferior a 500 mM; inferior a 400 mM; inferior a 300 mM; inferior a 200 mM; inferior a 150 mM; inferior a 100 mM; inferior a 50 mM; o inferior a 25 mM..

En una realización adicional de la invención, el crioprotector para su uso en cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, que incluye en un líquido envolvente, puede comprender eritritol. En una realización adicional, el eritritol está a una concentración de aproximadamente 10 a 300 mM, aproximadamente 15 a 250 mM, aproximadamente 25 a 125 mM, aproximadamente 40 a 80 mM, aproximadamente 0,01 a 1000 mM, aproximadamente 0,01 a 400 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 65 mM, aproximadamente 135 mM, aproximadamente 270 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 400 a 1000 mM, aproximadamente 400 a 500 mM, o aproximadamente 400 a 600 mM.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 ilustra un esquema de un citómetro de flujo para la manipulación de una muestra de semen según ciertas realizaciones descritas en el presente documento.

La FIG. 2 ilustra una representación gráfica de parámetros adquiridos en un citómetro de flujo mientras se manipula una muestra de semen según diversas realizaciones descritas en el presente documento.

La FIG. 3 ilustra una representación gráfica de parámetros adquiridos en un citómetro de flujo mientras se manipula una muestra de semen según diversas realizaciones descritas en el presente documento.

La FIG. 4 ilustra una representación gráfica de los parámetros de selección adquiridos en un citómetro de flujo mientras se selecciona semen según diversas realizaciones descritas en el presente documento.

Las FIG. 5-7 ilustran ejemplos alternativos (fuera del alcance de la invención) del uso de un crioprotector en diversas etapas del procesamiento de muestras de semen.

La FIG. 8 ilustra un ejemplo (fuera del alcance de la invención) que implica la congelación de una muestra de semen.

La FIG. 9 muestra relaciones entre picos y valles obtenidas cuando se usa líquido envolvente que contiene cantidades variables de glicerol.

La FIG. 10 muestra la movilidad después de la descongelación de semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente.

La FIG. 11 muestra la viabilidad después de la descongelación y el porcentaje de acrosomas intactos (PIA) de semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente.

La FIG. 12 muestra PVR obtenidas cuando se usa líquido envolvente que contiene cantidades variables de glicerol. La FIG. 13 muestra la movilidad después de la descongelación, la viabilidad y los PIA de semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente.

La FIG. 14 muestra la convergencia de la movilidad después de la descongelación, la viabilidad y los PIA de semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente.

La FIG. 15 muestra la movilidad después de la descongelación, la viabilidad y los PIA de semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente.

La FIG. 16 muestra la convergencia de la movilidad después de la descongelación, la viabilidad y los PIA de semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente.

La FIG. 17 muestra la movilidad después de la descongelación, la viabilidad y los PIA de semen seleccionado usando diferentes glicoles en líquido envolvente.

La FIG. 18 muestra la convergencia de la movilidad después de la descongelación, la viabilidad y los PIA de semen seleccionado usando diferentes glicoles en líquido envolvente.

La FIG. 19 muestra la movilidad después de la descongelación de semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente.

La FIG. 20 muestra la viabilidad después de la descongelación y los PIA de semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente.

La FIG. 21 muestra la movilidad después de la descongelación de semen seleccionado usando diferentes glicoles en líquido envolvente.

La FIG. 22 muestra la viabilidad después de la descongelación y los PIA de semen seleccionado usando diferentes glicoles en líquido envolvente.

La FIG. 23 muestra la movilidad 0 h después de la descongelación para semen seleccionado usando 3 % de glicerol en el líquido envolvente y crioconservado en medios que tienen concentraciones variables de glicerol. La FIG. 24 muestra la viabilidad 0 h después de la descongelación y los PIA para semen seleccionado usando 3 % de glicerol en el líquido envolvente y crioconservado en medios que tienen concentraciones variables de glicerol. La FIG. 25 muestra la movilidad 3 h después de la descongelación para semen seleccionado usando 3 % de glicerol en el líquido envolvente y crioconservado en medios que tienen concentraciones variables de glicerol. La FIG. 26 muestra la viabilidad 3 h después de la descongelación y los PIA para semen seleccionado usando 3 % de glicerol en el líquido envolvente y crioconservado en medios que tienen concentraciones variables de glicerol. La FIG. 27 muestra la convergencia de la movilidad después de la descongelación para semen seleccionado usando 3 % de glicerol en el líquido envolvente y crioconservado en medios que tienen concentraciones variables de glicerol.

La FIG. 28 muestra la convergencia de la viabilidad después de la descongelación y los PIA para semen seleccionado usando 3 % de glicerol en el líquido envolvente y crioconservado en medios que tienen concentraciones variables de glicerol.

La FIG. 29 muestra la movilidad 0 h después de la descongelación, la viabilidad y los PIA para semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente y crioconservado en medios que tienen concentraciones variables de glicerol.

La FIG. 30 muestra la movilidad 3 h después de la descongelación, la viabilidad y los PIA para semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente y crioconservado en medios que tienen concentraciones variables de glicerol.

La FIG. 31 muestra convergencia de la movilidad después de la descongelación, la viabilidad y los PIA para semen seleccionado usando cantidades variables de glicerol en el líquido envolvente y crioconservado en medios que tienen concentraciones variables de glicerol.

La FIG. 32 muestra resultados de FIV usando semen seleccionado con glicerol en el líquido envolvente o ausente del líquido envolvente.

La FIG. 33 muestra la movilidad después de la descongelación, los PIA, la convergencia y la viabilidad de semen seleccionado con glicerol en el líquido envolvente o ausente del líquido envolvente.

La FIG. 34 muestra las tasas de concepción para semen seleccionado con glicerol en el líquido envolvente o ausente del líquido envolvente.

La FIG. 35 muestra la movilidad después de la descongelación, la viabilidad y los PIA para semen seleccionado congelado con AB preparado con criolizador o con AB preparado con 100 % vol/vol de glicerol.

La FIG. 36 muestra la movilidad después de la descongelación, la viabilidad y los PIA para semen seleccionado con glicerol en el líquido de captura y líquido envolvente o ausente del líquido de captura y líquido envolvente.

La FIG. 37 muestra la movilidad de espermatozoides mantenidos en Caprogen con glicerol y Caprogen con diversas concentraciones de eritritol.

Modos para llevar a cabo la invención

El semen se puede obtener, o proporcionar, mediante la obtención de una muestra de semen o disolución de semen que contiene espermatozoides. Como se usa en todo el presente documento, el término "semen" se refiere al singular o plural de las células reproductoras masculinas, mientras que una "muestra de semen" se refiere al líquido portador, además de a los espermatozoides contenidos en él. Los ejemplos de muestras de semen incluyen semen puro o semen diluido en otra disolución, tal como un diluyente o tampón, e incluye semen congelado-descongelado. Una muestra de semen se puede obtener en la misma ubicación en la que se realizan las restantes etapas, o puede diluirse en un diluyente de semen apropiado para el transporte a una instalación de selección. Una vez obtenido, el semen se puede mantener a temperatura ambiente, refrigerado, o incluso congelado en un diluyente apropiado para su uso posterior. El semen para la tinción y selección puede obtenerse de un mamífero, o puede ser semen comprado de almacenamiento, tal como una pajuela congelada o refrigerada obtenida de almacenamiento. Alternativamente, se pueden combinar semen congelado o diluido.

Una muestra de semen puede proceder de mamíferos, tales como los mamíferos no humanos enumerados por Wilson, D.E. y Reeder, D.M., Mammal Species of the World, Smithsonian Institution Press, (1993). En el momento de la recogida, o descongelación, o incluso reunión, el semen pueden comprobarse para concentración, pH, movilidad y/o morfología. Además, se pueden añadir antibióticos antes de etapas de procesamiento adicionales.

Una vez obtenido, el semen puede normalizarse opcionalmente a una concentración predeterminada y/o hacia un pH predeterminado. Como se usa en el presente documento, "normalización" se puede entender como una acción realizada para llevar diversas características de una eyaculación a un intervalo predeterminado o próximo a dicho intervalo predeterminado. Aunque las eyaculaciones bovinas, por ejemplo, pueden variar mucho en pH y concentración de espermatozoides, la etapa de normalización de la concentración o pH del semen puede incluir la adición de un tampón de alta capacidad que sirve tanto para normalizar el pH como el tampón contra la tendencia de que las eyaculaciones se acidifiquen con el tiempo.

Cada uno de la concentración y pH predeterminados puede ser específico de diferentes especies, o incluso de diferentes razas de animales dentro de una especie. En una realización, el semen se puede combinar con un diluyente inicial en forma de un tampón de alta capacidad, o un diluyente que tiene una gran capacidad tamponante del pH. Diluyentes adecuados pueden incluir TRIS citrato, citrato de sodio, bicarbonato sódico, HEPES, TRIS, TEST, MOPS, KMT, TALP, derivados de estos y combinaciones de estos. También se puede emplear cualquier diluyente que tenga un tampón con una alta capacidad para tamponar el pH, y se puede usar en combinación con componentes adicionales que promueven la viabilidad de los espermatozoides. Como un ejemplo de un aditivo, se puede incorporar proteína en forma de yema de huevo, leche, lipoproteínas, lecitina, caseína o albúmina u otras fuentes de proteína. También se puede incorporar una fuente de energía en forma de un monosacárido, tal como fructosa, glucosa o manosa, o incluso un disacárido o trisacárido. Además, se pueden emplear antioxidantes y antibióticos en el diluyente inicial para promover la viabilidad de los espermatozoides.

El diluyente inicial puede establecerse a un pH predeterminado para normalizar el pH de todas las muestras de semen obtenidas, tales como un pH entre aproximadamente 6,8 y 7,4. En una realización, el diluyente se ajusta a un pH de 7,2. Además, el semen puede acidificarse cada vez más con el tiempo, posiblemente debido a proteínas en el líquido seminal, o debido a productos ácidos del metabolismo o subproductos de células muertas o moribundas. El diluyente inicial introduce suficientes sitios de unión a protones libres (es decir, H+) para mantener el pH cerca del objetivo predeterminado. Incluso en vista de la tendencia natural del semen a acidificarse con el tiempo, el diluyente inicial proporciona un medio para estabilizar el pH durante etapas de procesamiento adicionales.

El diluyente inicial puede contener aditivos con el fin de mantener la salud del semen. El diluyente inicial puede incluir antibióticos para prevenir la proliferación de bacterias. Como ejemplos no limitantes, tilosina, gentamicina, lincomicina, linco-espectina, espectinomicina, penicilina, estreptomicina y combinaciones de estos, se pueden incorporar en el diluyente inicial.

También se pueden incorporar antioxidantes en el diluyente inicial para reducir los radicales libres y el estrés oxidativo. Aunque la presente discusión se refiere al uso de antioxidantes en un diluyente inicial, se debe apreciar que los antioxidantes se pueden incorporar en múltiples etapas en el proceso de selección del semen, independientemente o en combinación, como se describe en la solicitud de patente internacional WO2012167151. Una lista no limitante de antioxidantes que se pueden incorporar incluye: catalasa, SOD, un mimético de SOD, glutatión, glutatión reductasa, glutatión peroxidasa, piruvato, ácido caproico, mercaptoetanol, BHT, ácido lipoico, flavinas, quininas, vitamina K (y vitámeros relacionados), vitamina B12, vitámeros de vitamina B12, vitamina E (y vitámeros relacionados), tocoferoles, tocotrienoles, a-tocoferilo, alfa-cetoglutarato (AKG), malondialdehído (MDA), dimetilarginina asimétrica (ADMA) y derivados biológicamente activos de estos, y combinaciones de estos.

La concentración de antioxidantes puede estar en el intervalo de 0,01 mg/ml a 0,5 mg/ml, y como ejemplos no limitantes, los antioxidantes enumerados anteriormente se pueden proporcionar en la concentración 0,01 mg/ml a 5,0 mg/ml; 0,01 mg/ml a 0,25 mg/ml; 0,01 mg/ml a 0,5 mg/ml; 0,01 mg/ml a 1 mg/ml; 0,01 mg/ml a 2,5 mg/ml; 0,01 mg/ml a 5 mg/ml; 0,05 mg/ml a 0,1 mg/ml; 0,05 mg/ml a 1,0 mg/ml; 0,05 mg/ml a 2,5 mg/ml; 0,1 mg/ml a 0,25 mg/ml; 0,1 mg/ml a 0,5 mg/ml; 0,1 mg/ml a 1 mg/ml; 0,1 mg/ml a 2,5 mg/ml; 0,1 mg/ml a 5 mg/ml; 0,15 mg/ml a 0,45 mg/ml; 0,15 mg/ml a 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml a 0,35 mg/ml; 0,25 mg/ml a 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml a 1 mg/ml; 0,25 mg/ml a 2,5 mg/ml; 0,25 mg/ml a 5 mg/ml; 0,35 mg/ml a 0,5 mg/ml; 0,35 mg/ml a 1 mg/ml; 0,35 mg/ml a 2.5 mg/ml; 0,35 mg/ml a 5 mg/ml; 0,5 mg/ml a 1 mg/ml; 0,5 mg/ml a 2,5 mg/ml; 0,5 mg/ml a 5 mg/ml; 1 mg/ml a 2.5 mg/ml; y 1 mg/ml a 5 mg/ml.

Como un ejemplo, la muestra de semen se puede diluir en el tampón de alta capacidad en relaciones desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:10. La mezcla resultante tendrá una de concentración de espermatozoides muchas veces por debajo de las concentraciones de espermatozoides naturales para una especie particular. El semen diluido se puede centrifugar para reconcentrar el semen. La centrifugación del semen y la eliminación del sobrenadante permite que el semen sea reconcentrado en una concentración predeterminada. La concentración predeterminada se puede seleccionar basándose en etapas adicionales de procesamiento de semen. Por ejemplo, en el caso de bovinos seleccionados por sexo, el semen se puede reconcentrar entre aproximadamente 2400 millones de espermatozoides por ml y aproximadamente 500 millones de espermatozoides por ml para simular un intervalo natural de concentraciones, a la vez que se sustituyen los componentes del plasma seminal con diluyente. También se pueden lograr otras concentraciones, tales como entre aproximadamente 1400 millones de espermatozoides por ml y aproximadamente 2100 millones de espermatozoides por ml, o entre aproximadamente 1700 millones de espermatozoides por ml y aproximadamente 2100 millones de espermatozoides por ml, por procesamiento adicional.

En una realización, la concentración de espermatozoides y el pH del semen pueden proporcionar un punto de partida uniforme para el procesamiento adicional. Por ejemplo, un pH y concentración relativamente consistentes pueden proporcionar mayor predictibilidad en la tinción del semen, por ejemplo con un colorante selectivo de ADN. Si cada muestra se ajusta al mismo pH y concentración predeterminados, se pueden requerir menos ensayos en cada nueva recogida para garantizar la tinción adecuada para la selección por sexo.

Una población de espermatozoides incluirá tanto espermatozoides portadores del cromosoma X como espermatozoides portadores del cromosoma Y. Además, cada uno de los espermatozoides portadores del cromosoma X y los espermatozoides portadores del cromosoma Y incluirá espermatozoides viables y espermatozoides no viables. Los espermatozoides viables se pueden considerar espermatozoides con membranas intactas, mientras que los espermatozoides no viables se pueden considerar espermatozoides con membranas comprometidas. La distinción entre espermatozoides viables y espermatozoides no viables en la selección convencional del semen se determina con la inclusión de un colorante extintor que atraviesa el espermatozoide de membrana comprometida. El espermatozoide que tiende a estar muerto o moribundo absorbe el colorante extintor y produce señales de fluorescencia distintas de la restante población de espermatozoides, mientras que los espermatozoides que tiene membranas intactas tienden a ser viables y prevendrán la captación del colorante extintor. Los espermatozoides viables, en la dosis apropiada, serán generalmente capaces de lograr la fecundación en una inseminación artificial, mientras que los espermatozoides no viables, o los espermatozoides de membrana comprometida, pueden ser incapaces de lograr la fecundación en una inseminación artificial o tendrán una capacidad enormemente reducida para hacerlo. Sin embargo, algunos espermatozoides capaces de fecundar pueden tener membranas comprometidas, y algunos espermatozoides con membranas intactas pueden ser incapaces de fecundar.

Tanto normalizado como no, el semen se puede teñir con un medio de tinción para introducir un colorante selectivo de ADN. En la etapa de tinción, al menos una porción de la población de espermatozoides se incuba con un medio de tinción y un colorante fluorescente selectivo de ADN para teñir estequiométricamente el contenido de ADN de cada célula en la población de espermatozoides. Hoechst 33342 tiende a ser menos tóxico que otros colorantes selectivos de ADN. El vehículo para administrar este colorante puede estar en forma de un tampón TALP modificado ajustado a un pH de aproximadamente 7,4. Hoechest 33342 se describe en la patente de EE. UU. 5.135.759 y se usa comúnmente para este fin. Sin embargo, también se podrían usar otros colorantes excitables por UV, así como colorantes excitables por luz visible, poliamidas fluorescentes, secuencias de nucleótidos fluorescentes y anticuerpos específicos de sexo.

Los espermatozoides en un estado natural no son frecuentemente tan permeables a dichos colorantes. Para producir una tinción uniforme, la primera etapa de tinción puede incluir incubar al menos una porción de la población de espermatozoides a una temperatura elevada en un medio de tinción (algunas veces denominado en el presente documento un tampón de tinción) a un pH elevado, además del colorante. Los ejemplos de disoluciones de tinción apropiadas pueden ser TALP, TES-TRIS, TRIS citrato, citrato de sodio o un medio basado en HEPES, cada uno descrito en el documento de patente WO2005/095960. Un ejemplo no limitante de un TALP modificado descrito en el documento de patente WO2001/37655 se ilustra en la Tabla 1.

TABLA 1 - Tampón TALP modificado

Ingrediente Concentración

NaCl 95,0 mM

KCl 3,0 mM

NaHPO4 0,3 mM

NaHCO3 10,0 mM

MgCl2-6H2O 0,4 mM

Piruvato de Na 2,0 mM

Glucosa 5,0 mM

Lactato de Na 25,0 mM

HEPES 40,0 mM

Albúmina de suero bovino 3,0 mg/ml

Como un ejemplo, la población de espermatozoides, o una porción de la población de espermatozoides, se podría diluir con los medios de tinción a entre 640 x 106 y 40 x 106 espermatozoides/ml, a entre aproximadamente 320 x 106 y 80 x 106 espermatozoides/ml, o a aproximadamente 160 x 106 espermatozoides/ml en el tampón. El colorante fluorescente selectivo de ADN se puede añadir a los espermatozoides suspendidos en el tampón en una concentración de entre aproximadamente 10 pM y 200 pM; entre aproximadamente 20 pM y 100 pM, o entre aproximadamente 30 pM y 70 pM. El pH del tampón puede ser entre aproximadamente 6,8 y 7,9; aproximadamente 7,1 y 7,6; o a aproximadamente 7,4 para ayudar a garantizar una tinción uniforme del ADN nuclear. Los expertos habituales en la técnica apreciarán que el pH puede elevarse con la adición de NaOH y reducirse con la adición de HCl. Opcionalmente, en la disolución de tinción se pueden incorporar los antioxidantes y concentraciones descritos previamente.

La población de espermatozoides se puede incubar entre 30-39 °C, entre aproximadamente 32-37 °C, o a aproximadamente 34 °C. El periodo de incubación puede variar entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente tres horas, entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 90 minutos, o durante aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 60 minutos. Como un ejemplo, la población de espermatozoides se puede incubar durante aproximadamente 45 minutos a 34 °C. Incluso dentro de una única especie, la concentración de espermatozoides y el pH del semen y otros factores que afectan la capacidad de tinción pueden variar entre animales. Los expertos habituales en la técnica pueden apreciar variaciones menores para la incubación del semen entre especies e incluso entre razas o animales de la misma raza para lograr una tinción uniforme sin teñir en exceso una población de espermatozoides.

Además del colorante fluorescente selectivo de ADN, se puede aplicar un colorante extintor con el fin de atravesar el espermatozoide de membrana comprometida y extinguir las señales que produce. Se puede entender que un colorante extintor incluye colorantes que diferencialmente se asocian con el espermatozoide de membrana comprometida. Puede ser que estos colorantes entren en el espermatozoide de membrana comprometida más fácilmente debido a que las membranas se están rompiendo o sean cada vez más porosas. También puede ser que los colorantes extintores entren fácilmente en todas las membranas del espermatozoide y que los espermatozoides sanos bombeen activamente los colorantes extintores hacia afuera más rápidamente que el espermatozoide de membrana comprometida. En cualquier caso, los espermatozoides con los que se asocian los colorantes extintores incluyen una gran porción de espermatozoides muertos y moribundos, aunque no necesariamente todos son espermatozoides muertos y moribundos. Las señales extinguidas producidas por los espermatozoides de membrana comprometida que tienen una asociación con el colorante extintor son suficientemente distintas de las señales de espermatozoides sanos que se pueden retirar del análisis y selección posteriores aplicados a los espermatozoides viables.

En una realización, se realiza una segunda etapa de tinción que además reduce la concentración de espermatozoides e introduce el colorante extintor. El pH del segundo medio de tinción puede ser seleccionado para lograr un pH objetivo en la muestra de semen final. Los ejemplos no limitantes de procesos de tinción de dos etapas se describen en la solicitud internacional PCT publicada w O 2011/123166 y la solicitud internacional PCT/US12/58008.

En otra realización, el colorante extintor y el colorante selectivo de ADN se aplican juntos en una única dilución. En esta realización, el colorante extintor se incuba junto con el colorante selectivo de ADN a una temperatura elevada en la disolución de tinción. Como un ejemplo, los medios de tinción pueden ser un TALP modificado con un pH de 7,4. Sin embargo, se pueden emplear otras tinciones que incluye TES-TRIS, TRIS citrato, citrato de sodio o un medio basado en HEPES que tiene el colorante selectivo de ADN y el colorante extintor y el pH puede variar entre aproximadamente 7,0 y 7,8. En una realización, puede existir una sinergia cuando el semen se normaliza a un pH elevado de aproximadamente 7,2 antes de la tinción a un pH de 7,4. De esta forma, el pH al que se exponen el semen sigue en un intervalo constante con variaciones mínimas. Debido a que tanto los medios de tinción como el diluyente inicial tienen elevadas capacidades tamponantes, se cree que se evitará la tendencia natural del semen a acidificarse con el tiempo.

Se debe entender que, como se usa en el presente documento, el término "crioprotector" se refiere a una sustancia que protege las células o el tejido biológico del daño por congelación. Los crioprotectores pueden incluir las sustancias que actúan retirando el agua intracelular para prevenir el daño asociado a la formación y expansión de hielo intracelular. Dicha acción se puede inducir aumentando las concentraciones de soluto dentro de las células. Las sustancias que protegen las células y el tejido de otros tipos de daño, tales como el choque osmótico y el enfriamiento, pero no la congelación, no se consideran crioprotectores. Por citar sólo algunos ejemplos, las fuentes de lipoproteínas, fosfolípidos, lecitina y similares, tales como yema de huevo, un extracto de yema de huevo, leche, un extracto de leche, caseína, albúmina, lecitina y colesterol, no son crioprotectores, como el término se usa en el presente documento. Además, fuentes de energía, tales como monosacáridos, disacáridos y trisacáridos, no son crioprotectores, como se usa en el presente documento.

La tinción puede ser complementada con un antioxidante en los intervalos de concentración descritos previamente. En algunas realizaciones, presiones elevadas pueden aumentar los radicales libres y el estrés oxidativo soportado por el semen que se tiñe. Por consiguiente, los antioxidantes pueden servir para neutralizar radicales libres y reducir el estrés oxidativo soportado por el semen que se tiñe. Una lista no limitante de antioxidantes que se pueden incorporar en el proceso de tinción incluye: catalasa, SOD, un mimético de SOD, glutatión, glutatión reductasa, glutatión peroxidasa, piruvato, ácido caproico, mercaptoetanol, BHT, ácido lipoico, flavinas, quininas, vitamina K (y vitámeros relacionados), vitamina B12, vitámeros de vitamina B12, vitamina E (y vitámeros relacionados), tocoferoles, tocotrienoles, a-tocoferilo, alfa-cetoglutarato (AKG), malondialdehído (MDA), dimetilarginina asimétrica (ADMA) y derivados biológicamente activos de estos, y combinaciones de estos. Se puede usar cualquiera de las concentraciones descritas previamente.

La etapa o etapas de tinción pueden incluir opcionalmente componentes para reducir la movilidad o respiración de los espermatozoides durante la tinción. Por citar sólo algunos ejemplos, la etapa o etapas de tinción pueden reducir la respiración de los espermatozoides al incluir aditivos, o al reducir y/o reduciendo la exposición de los espermatozoides a ciertas sustancias. En particular, se puede utilizar una tinción baja en azúcar en la que sólo está presente un nivel residual de fructosa, sacarosa, glucosa u otro azúcar. Similarmente, la respiración de los espermatozoides se puede reducir por tinción bajo una presión parcial de nitrógeno o dióxido de carbono para desplazar el oxígeno en la tinción. Alternativamente, se pueden añadir sustancias a la tinción que tienen ciertas relaciones entre potasio y sodio que tienden a reducir la respiración de los espermatozoides. Como otra alternativa, se pueden añadir fluoruro o fluoruro de sodio a la etapa o etapas de tinción para reducir la respiración de los espermatozoides.

Tanto normalizados como no, y tanto teñidos en una única etapa como en dos etapas, la población de espermatozoides puede ser seleccionada por un instrumento de selección de partículas, tal como un citómetro de flujo, que incluye, sin limitación, un citómetro de flujo de chorro de aire, un citómetro de flujo con una cubeta, o un chip microfluídico. Con referencia a la FIG. 1, se ilustra un citómetro de flujo de chorro de aire (10), aunque la selección se puede realizar con chips microfluídicos u otros tipos de citómetros de flujo, que incluyen un citómetro de flujo que tiene cámaras cerradas y citómetros y citómetros que incorporan láseres de ablación. El citómetro de flujo (10) incluye una fuente de células (12) para producir un flujo de muestra de semen, tal como un flujo de muestra de semen teñida, para la selección. La tasa a la que la muestra de semen se administra a la boquilla (14) se puede considerar el caudal de la muestra, y se puede determinar por una presión de muestra. El flujo de muestra de semen teñida se deposita dentro de una boquilla (14) y se introduce dentro de, o se hace circular dentro de, una corriente de líquido (16) de líquido envolvente (18). El líquido envolvente (18) se puede suministrar por una fuente de líquido envolvente (20) de manera que, a medida que la fuente de células (12) suministra el semen en el líquido envolvente (18), se alimentan simultáneamente a través de la boquilla (14). El líquido envolvente (18) se puede suministrar a un caudal de líquido envolvente que viene determinado por una presión del líquido envolvente.

Aunque los líquidos envolventes anteriores utilizados en la citometría de flujo comprendían en general una solución salina tamponada con fosfato (PBS), quizás complementada con albúmina de suero bovino (BSA), la selección del semen ha incorporado citrato de sodio, TRIS citrato o ácido cítrico como líquido envolvente para conservar la salud del semen durante el proceso de selección. Como se describe en la solicitud de patente internacional WO 99/33956, se pueden incorporar tampones adecuados como líquidos envolventes. En ciertas realizaciones de la presente invención, los líquidos envolventes anteriores se complementan con un crioprotector. Como se ha descrito anteriormente, crioprotectores se refiere a sustancias que protegen las células o el tejido biológico del daño por congelación y pueden incluir las sustancias que actúan retirando el agua intracelular para prevenir el daño asociado a la formación y expansión de hielo intracelular. Dicha acción se puede inducir aumentando las concentraciones de soluto dentro de las células. Las sustancias que protegen las células y el tejido de otros tipos de daño, tales como choque osmótico y enfriamiento, pero no congelación, no se consideran crioprotectores.

Los crioprotectores incluyen varios alcoholes de azúcar y glicoles descritos anteriormente. Como ejemplos no limitantes, en el líquido envolvente se pueden incluir como crioprotector alcoholes de azúcar tales como etilenglicol; glicerol; eritritol; treitol; arabitol; ribitol; xilitol; sorbitol; galactitol; iditol; volemitol; fucitol; inositol; a glicilglicitol, y combinaciones de estos. Además, en el líquido envolvente se pueden incluir como crioprotector glicoles tales como propilenglicol, butanotriol. Inesperadamente, como se describe en más detalle en los ejemplos, se ha mostrado que la presencia de un crioprotector en el líquido envolvente mejora la movilidad después de la descongelación del semen congelado posteriormente y mejora la resolución de la selección del semen. Sorprendentemente, como se observa en el Ejemplo 1, la modificación de un instrumento de selección por la inclusión de un crioprotector en el líquido envolvente según ciertas realizaciones de la invención mejoró la resolución de la selección, lo que significa que la productividad, el rendimiento y la pureza podrían mejorarse simultáneamente para grados variables.

En algunas realizaciones, el crioprotector se puede proporcionar en el líquido envolvente a concentraciones entre aproximadamente 0,1 % vol/vol o p/vol y aproximadamente 6 % vol/vol o p/vol. Por ejemplo, la disolución de semen teñida que se va a someter a procesamiento adicional, tal como selección en un citómetro de flujo, puede comprender crioprotector en una concentración en vol/vol o p/vol entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 2 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 4 %; entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 2 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 3 %; entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 4 %; entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 5 %; entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 6 %; entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 6 %; o entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 5 %.

Los expertos en la técnica pueden apreciar que la realización descrita se refiere a un citómetro de flujo de chorro de aire que forma gotitas, pero que el líquido envolvente que tiene un aditivo crioprotector proporciona los mismos beneficios en otros sistemas de selección, tales como en sistemas que utilizan cambio de líquidos, sistemas que utilizan láseres fotodañinos y en chips microfluídicos.

Durante la operación, la operación de selección de semen, el líquido envolvente (18) forma una corriente de líquido que rodea coaxialmente la muestra de semen que tiene semen teñido que sale de la boquilla (14) en el orificio de la boquilla (22). Proporcionando un oscilador (24) que puede ser controlado con precisión con un control del oscilador (26), se pueden establecer ondas de presión dentro de la boquilla (14) y transmitirse a los líquidos que salen de la boquilla (14) en el orificio de la boquilla (22). En respuesta a las ondas de presión, la corriente de líquido (16) que sale del orificio de la boquilla (22) forma con el tiempo gotitas regulares (28) en intervalos precisos. La frecuencia, y de algún modo la forma de las gotitas formadas, se puede controlar por una frecuencia de transmisión de gotitas y amplitud de transmisión de gotitas suministrada al oscilador (24) o el controlador del oscilador (26).

Cada gotita, así formada, retiene el líquido envolvente y la muestra de semen que formó previamente una porción de la corriente de líquido (16). Debido a que el semen teñido está rodeado por la corriente de líquido (16) o el entorno de líquido envolvente, las gotitas (28) contienen idealmente espermatozoides aislados individualmente. Sin embargo, la concentración de espermatozoides, la presión de la muestra y otros parámetros instrumentales imponen la frecuencia con la que múltiples células ocuparán regularmente una única gotita, así como el porcentaje de gotitas que contienen espermatozoides.

El citómetro de flujo (10) actúa seleccionando las gotitas basándose en las características de los espermatozoides que se predice que están contenidos dentro de las gotitas. Esto se puede llevar a cabo mediante un sistema detector de células (30) en comunicación con un analizador (36). El sistema detector de células (30) incluye al menos un sensor (32) sensible a las células contenidas dentro de la corriente de líquido (16). Como un ejemplo, se pueden incorporar dos tubos fotomultiplicadores ortogonales (PMT) en un citómetro de flujo de selección de semen para detectar la fluorescencia a 0 grados y 90 grados, aunque se pueden emplear fácilmente otras configuraciones de sensor, tales como las descritas en el documento de patente WO2010/021627.

El sistema detector de células (30) proporciona datos al analizador (36), que puede provocar una acción que depende de la presencia relativa o ausencia relativa de una característica de las células en la corriente de líquido (16). Ciertas características, tales como el contenido relativo de ADN de los espermatozoides, se pueden detectar a través de la excitación con una fuente de radiación electromagnética (34), tal como un láser que genera un haz de irradiación al que es sensible el semen teñido. La fuente de radiación electromagnética (34) puede ser un láser operado a una longitud de onda UV, tal como a aproximadamente 355 nm. Un ejemplo de dicho láser puede ser un Vanguard 350 (disponible de Spectra-Physics), que funciona a 350 mW. Se pueden emplear diversas ópticas para formar el perfil del haz del láser, dividir el haz en más de una corriente, o reducir la potencia del haz en una corriente. Los ejemplos no limitantes de dicha óptica se pueden encontrar en los documentos de patente WO/2004/104178 y WO/2001/85913.

Las características de los espermatozoides individuales, particularmente la presencia de un cromosoma X o un cromosoma Y, se pueden determinar a partir de la fluorescencia detectada producida en respuesta a la fuente de radiación electromagnética (34). En particular, las configuraciones del sistema detector de células (30) pueden estar en comunicación con un analizador (36) para proporcionar una variedad de fluorescencia en la formación, tal como la fluorescencia hacia adelante de un evento, la fluorescencia lateral de un evento, o la cantidad de dispersión asociada a un evento. El analizador (36) puede incluir instrucciones escritas para analizar las señales producidas por el uno o más sensores (32) en el sistema detector de células (30). El colorante fluorescente selectivo de ADN se une estequiométricamente al ADN del espermatozoide. Debido a que los espermatozoides portadores del cromosoma X contienen más ADN que los espermatozoides portadores del cromosoma Y, los espermatozoides portadores del cromosoma X pueden unirse a una mayor cantidad de colorante fluorescente selectivo de ADN que los espermatozoides portadores del cromosoma Y. Por lo tanto, midiendo la fluorescencia emitida por el colorante unido tras la excitación, es posible diferenciar entre los espermatozoides portadores de X y los espermatozoides portadores de Y. El analizador (36) puede diferenciar distinciones, tales como espermatozoides que son viables o no viables, además de espermatozoides orientados y no orientados, según las regiones de apertura incorporadas en la lógica de selección.

Una vez un analizador diferencia los espermatozoides basándose en una característica de los espermatozoides, las gotitas que arrastran los espermatozoides portadores del cromosoma X pueden ser cargadas positivamente y así desviarse en una dirección, mientras que las gotitas que arrastran los espermatozoides portadores del cromosoma Y pueden ser cargadas negativamente y así desviarse en la otra dirección, y la corriente residual (que es gotitas que no arrastran una partícula o célula o arrastran células no deseadas o no seleccionables) puede quedar sin carga y así es recogida de una corriente no desviada en un tubo de succión o similares. Alternativamente, se puede recoger uno de los espermatozoides portadores del cromosoma X o los espermatozoides portadores del cromosoma Y, mientras que los otros se desechan con residuo.

Como resultado, el citómetro de flujo (10) actúa separando los espermatozoides teñidos al provocar que las gotitas (28) que contienen espermatozoides sean dirigidas a uno o más recipientes de recogida (40). Los recipientes de recogida (40) pueden ser un tubo de recogida, tal como tubos de centrifugación o tubos Falcon. En una realización, el uno o más recipientes de recogida comprenden un tubo de centrifugación de 50 ml. El uno o más recipientes de recogida pueden incluir un medio de recogida que actúa tanto amortiguando las células en las gotitas desviadas del impacto con el fondo del recipiente como incluyendo componentes para conservar la salud de los espermatozoides seleccionados. A modo de ejemplo, se puede emplear un líquido de captura de T ris-citrato y yema de huevo con ciertas realizaciones de la presente invención. Otros líquidos de captura que se pueden usar en ciertas realizaciones incluyen TRIS-citrato, citrato de sodio, bicarbonato sódico, HEPES, TRIS, TEST, MOPS, KMT, TALP, derivados de estos y combinaciones de estos. Sin embargo, también se pueden emplear otros diluyentes que tienen un tampón para tamponar el pH, y se pueden usar en combinación con componentes adicionales que promueven la viabilidad de los espermatozoides después del separador. Como un ejemplo de un aditivo, comúnmente se incorpora proteína en el líquido de captura en forma de yema de huevo. Sin embargo, alternativamente podrían usarse otras formas de proteína, tales como, leche, lipoproteínas, lecitina, caseína o albúmina u otras fuentes de proteína, o incluso usarse en combinación con yema de huevo. En una realización, se puede usar un sustituto de yema de huevo, tal como fosfolípido disponible de lecitina de soja, en lugar de la yema de huevo. También se puede incorporar una fuente de energía en forma de un monosacárido, tal como fructosa, glucosa o manosa, o incluso un disacárido o trisacárido. Además, se pueden emplear antioxidantes y antibióticos en el diluyente inicial para promover la viabilidad de los espermatozoides.

En una realización alternativa, las placas de desviación (38) y otros componentes requeridos para formar gotitas, tales como el oscilador (24) o el controlador del oscilador (26), se pueden sustituir por un láser fotodañino, algunas veces también denominado ablación por láser. En dicha realización, el analizador (36) y el controlador (42) pueden cooperar en desencadenar un láser fotodañino programado para golpear células en la corriente de líquido (16) en una segunda ubicación aguas abajo de la fuente de radiación electromagnética (34) basándose en las clasificaciones de las células. Dicho láser puede ser operado a una longitud de onda diferente en comparación con la fuente de radiación electromagnética (34), o a una mayor potencia para garantizar que los espermatozoides sean ablacionados, desactivados o incapaces de fecundar. Las realizaciones que incorporan dicho láser fotoperjudicial todavía utilizan un medio de tinción y un líquido envolvente y opcionalmente pueden utilizar un medio de recogida. Según ciertas realizaciones de la presente invención, uno cualquiera de los medios de tinción, líquido envolvente y medio de recogida, cuando está presente, puede incluir un crioprotector.

En una alternativa adicional, ciertos aspectos de la presente invención pueden ser igualmente aplicables en chips microfluídicos. Por citar sólo un ejemplo, los chips microfluídicos, tales como los descritos en las solicitudes internacionales WO 2011/097032 y WO 2011/097032, pueden asimismo beneficiarse de la inclusión de un líquido envolvente que contiene un crioprotector. Similarmente, las realizaciones que incorporan canales de flujo en chips microfluídicos todavía utilizan un medio de tinción y opcionalmente pueden utilizar un líquido envolvente y un medio de recogida. Según ciertas realizaciones de la presente invención, uno cualquiera de los medios de tinción, líquido envolvente y medio de recogida, cuando está presente, puede incluir un crioprotector.

La FIG. 2 ilustra un gráfico bivariante representativo de fluorescencia lateral y fluorescencia hacia delante de un citómetro de flujo de chorro de aire de semen teñido, que se puede generar por un analizador (36). Un operador puede usar una representación visual de datos para recibir información referente a la muestra que se somete a la selección y para demostrar gráficamente ciertos aspectos de la lógica de selección actual. R1, por ejemplo, se puede observar como una región de apertura que se puede aplicar a la lógica de selección del citómetro de flujo. Se puede proporcionar una salida numérica adicional en una pantalla del analizador (36). Dicha salida numérica puede ser en forma de parámetros de selección medidos, tales como una tasa de eventos, una tasa de fracasos, tasa de selecciones, eficiencia de la selección, o el porcentaje de partículas en cualquier región o puerta. R1 se ilustra como una región que se puede considerar la región orientada viva, debido a que los límites de R1 incluyen dos poblaciones densas de células que reflejan una población de espermatozoides portadores del cromosoma X y una población de espermatozoides portadores del cromosoma Y estrechamente relacionadas. R2 es una región de apertura establecida alrededor de espermatozoides no viables, o de espermatozoides de membrana comprometida cuya fluorescencia se inactiva por un colorante extintor. Aunque se puede emplear una variedad de lógicas de selección, dos estrategias referentes a R1 y R2 podrían ser una primera etapa en una lógica de selección, por la cual todos los eventos que se encuentren en R1 son aceptados para procesamiento o apertura adicional. Alternativamente, todos los eventos que se encuentran fuera de R2 son aceptados para procesamiento o apertura adicional.

La FIG. 3 ilustra un gráfico univariante en forma de un histograma que puede producir el analizador (36) y generado en una presentación gráfica para un operador. Los datos ilustrados en la FIG. 3 pueden representar el número de aparición de intensidades de señal pico de la fluorescencia lateral o hacia adelante dentro de un cierto periodo. En el caso del semen, los espermatozoides portadores del cromosoma X y los espermatozoides portadores del cromosoma Y tienden a tener intensidades pico que varían entre el 2 y el 5 %, dependiendo de la especie, y esta diferencia se refleja en la distribución bimodal de las intensidades pico observadas en la FIG. 2. Debido a que los espermatozoides portadores del cromosoma X y los espermatozoides portadores del cromosoma Y tienden a tener valores de fluorescencia diferentes, cada uno de los picos representa espermatozoides portadores del cromosoma X o espermatozoides portadores del cromosoma Y. Basándose en la lógica de selección aplicada dentro del analizador (36), la población de células en el histograma puede ser solo las células que se determinó que eran células orientadas viables, tales como las que se encuentran en R1 en la FIG. 2, o puede representar células que no se determinó que estuvieran muertas o fueran no deseables, tales como todos los eventos, excepto los que se encuentran en R2. Se puede derivar una variedad de parámetros de selección de la información contenida dentro de este histograma. Por ejemplo, el nivel de distintividad entre los dos picos puede proporcionar una indicación de cómo puede ser una pureza seleccionada. La FIG. 3 ilustra además mediciones de intensidad relativa en el punto más bajo entre los dos grupos, que se puede considerar un valor V y una segunda intensidad relativa en el pico o picos del histograma en P. Una inspección visual de un histograma puede dar a operador una idea de cómo un citómetro de flujo está funcionando, pero las instrucciones ejecutadas por ordenador para determinar un valor P, un valor V y una relación entre V y P no han sido implementadas en los separadores comerciales de semen. La relación entre valles y picos se puede determinar como un parámetro de selección medido periódicamente durante el transcurso de la selección. La relación entre valles y picos, aunque no es necesariamente determinante de las purezas de selección, puede proporcionar un medio para estimar rápidamente los valores de pureza, ya sea automáticamente mediante la ejecución de instrucciones escritas en el analizador (36), o manualmente mediante la inspección visual de un operador. Alternativamente, la relación inversa, concretamente una relación entre picos y valles, proporciona información similar como el valor inverso.

Volviendo a la FIG. 4, el analizador (36) puede generar un segundo gráfico bimodal en respuesta a señales adquiridas por el sistema detector de células (30). El gráfico bimodal puede representar un primer eje que ilustra el valor de intensidad pico de una señal de fluorescencia hacia adelante o la intensidad pico de la señal de fluorescencia lateral. Al igual que la FIG. 3, los datos ilustrados en la FIG. 4 pueden ser seleccionados de forma que sólo se incluyan los eventos que se encuentren dentro de R1 en la FIG. 2. Alternativamente, en el caso de semen, también se pueden mostrar todos los eventos que no se seleccionan en la puerta muerta R2.

R3 puede representar una puerta de selección de X para recoger los espermatozoides portadores del cromosoma X. El término puerta de selección de X se puede usar indistintamente en el presente documento con el término puerta de X. Con referencia a la FIG. 4, ésta puede demostrar cómo el cambio de las dimensiones de las regiones de apertura puede afectar la eficiencia, la pureza y la productividad. Si la región R3 fuera a ampliarse, se podría observar que cada segundo sería seleccionado más semen como espermatozoides portadores del cromosoma X, dando como resultado mayor eficiencia de selección y mayor productividad. Sin embargo, la ampliación de la puerta o región R3 empezaría incluyendo eventos que tienen una probabilidad cada vez mayor de ser espermatozoides portadores del cromosoma Y. Para aumentar la pureza del semen seleccionado, la región R3 se pueden hacer más pequeña y/o alejarse de la región del cromosoma Y. Como menos eventos entran dentro de la puerta de selección X, menos semen se selecciona en la población de espermatozoides portadores del cromosoma X, y los que están tienen una mayor probabilidad de ser en realidad espermatozoides portadores del cromosoma X, lo que significa que la pureza recogida se puede aumentar. Sin embargo, tanto la eficiencia, en términos de células recogidas, como la productividad, en términos de selecciones por segundo, disminuirán, ya que menos eventos entran dentro de la región R3 y fracasan más eventos coincidentes. Además, como se modifican otros parámetros del instrumento, los gráficos ilustrados de las FIG. 2, FIG.

3 y FIG. 4 pueden cambiar en forma y naturaleza. Por ejemplo, aumentar la presión de una muestra o el caudal de una muestra puede dar como resultado una reducción en la relación entre valles y picos, o puede reducir de otro modo la distinción bimodal entre espermatozoides portadores del cromosoma X y espermatozoides portadores del cromosoma Y.

A continuación, se puede reunir y congelar el semen procesado según metodologías conocidas para semen convencional o seleccionado por sexo. Por citar sólo un ejemplo, las metodologías de congelación descritas en la solicitud de patente internacional WO/200137655 pueden beneficiarse particularmente de ciertas realizaciones de la invención descrita en las que un crioprotector se introduce en los procesos de selección de semen en etapas iniciales, tales como en el momento de la tinción, en el líquido envolvente, o incluso en el líquido de captura. Alternativamente, la inclusión de un crioprotector en una o más etapas iniciales se puede incorporar en una nueva metodología de congelación.

En una realización, el semen recogido seleccionado se puede enfriar hasta una temperatura de aproximadamente 5 °C, o hasta otra temperatura enfriada adecuada basándose en el semen de especies particulares. Alternativamente, el semen se puede recoger en un recipiente de recogida que ya está enfriado. Dependiendo del tamaño del recipiente de recogida, el semen recogido se puede combinar con recipientes de recogida adicionales. Los recipientes de recogida combinados se pueden centrifugar y eliminarse el sobrenadante. Según algunas metodologías previas, el semen aislado se resuspendería en una fracción A (o fracción libre de crioprotector) de diluyente y una fracción B (o fracción que contiene crioprotector) que tiene dos veces la concentración deseada de crioprotector se añadiría a un volumen igual a la fracción A. Algunas metodologías previas añadieron la fracción B en dos volúmenes iguales separados aproximadamente 15 minutos, mientras que otras metodologías introdujeron la fracción B mediante un goteo continuo.

Tanto normalizado como no, el colorante fluorescente selectivo de ADN puede ser Hoechst 33342 suministrado en un tampón TALP modificado (Tabla 1). La etapa de tinción en sí se puede realizar en una única dilución que incluye además un colorante extintor. Alternativamente, la etapa 510 se puede realizar en dos diluciones, tales como en una primera dilución con un TALP modificado que tiene el colorante fluorescente selectivo de ADN seguido por una segunda dilución en un TALP modificado que tiene un colorante extintor. Se puede entender que según este ejemplo se pueden usar otros colorantes fluorescentes selectivos de ADN y otros colorantes extintores. Con el fin de esta realización, cada uno se denominará un medio de tinción.

Independientemente de que se consiga en una dilución o en dos, la muestra de esperma se puede diluir a entre 640 x 106 y 40 x 106 espermatozoides/ml, a entre aproximadamente 320 x 106 y 80 x 106 espermatozoides/ml, a aproximadamente 160 x 106 espermatozoides/ml o a aproximadamente 120 x 106 espermatozoides/ml en los medios de tinción. El colorante fluorescente selectivo de ADN se puede añadir al semen suspendido en los medios de tinción en una concentración de entre aproximadamente 10 pM y 200 pM; entre aproximadamente 20 pM y 100 pM, o entre aproximadamente 30 pM y 70 pM. El pH de los medios de tinción puede estar entre aproximadamente 6,8 y 7,9; aproximadamente 7,1 y 7,6; o a aproximadamente 7,4. En el caso de dos diluciones, la segunda dilución se puede realizar a o cerca del mismo pH que la primera dilución o a un bajo pH, tal como entre 5,0 y 6,0, o a aproximadamente 5.5. Opcionalmente, los antioxidantes y concentraciones previamente descritos se pueden incorporar en los medios de tinción. La muestra de semen se puede incubar entre 30-39 °C, entre aproximadamente 32-37 °C, o a aproximadamente 34 °C. El periodo de incubación puede variar entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente tres horas, entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 90 minutos, o durante aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 60 minutos.

Independientemente de que se consiga en una dilución o en dos, la muestra de esperma se puede diluir a entre 640 x 106 y 40 x 106 espermatozoides/ml, a entre aproximadamente 320 x 106 y 80 x 106 espermatozoides/ml, a aproximadamente 160 x 106 espermatozoides/ml o a aproximadamente 120 x 106 espermatozoides/ml en los medios de tinción. El colorante fluorescente selectivo de ADN se puede añadir al semen suspendido en los medios de tinción en una concentración de entre aproximadamente 10 pM y 200 pM; entre aproximadamente 20 pM y 100 pM, o entre aproximadamente 30 pM y 70 pM. El pH de los medios de tinción puede ser entre aproximadamente 6,8 y 7,9; aproximadamente 7,1 y 7,6; o a aproximadamente 7,4. En el caso de dos diluciones, la segunda dilución se puede realizar en o cerca del mismo pH que la primera dilución o a un pH bajo, tal como entre 5,0 y 6,0, o a aproximadamente 5.5. Opcionalmente, los antioxidantes y concentraciones previamente descritos se pueden incorporar en los medios de tinción. La muestra de semen se puede incubar entre 30-39 °C, entre aproximadamente 32-37 °C, o a aproximadamente 34 °C. El periodo de incubación puede variar entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente tres horas, entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 90 minutos, o durante aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 60 minutos.

Tanto normalizado como no, el colorante fluorescente selectivo de ADN puede ser Hoechst 33342 suministrado en un tampón TALP modificado (Tabla 1). La etapa de tinción en sí se puede realizar en una única dilución que incluye además un colorante extintor. Alternativamente, la etapa 510 se puede realizar en dos diluciones, tales como en una primera dilución con un TALP modificado que tiene el colorante fluorescente selectivo de ADN seguido por una segunda dilución en un TALP modificado que tiene un colorante extintor. Se puede entender que según este ejemplo se pueden usar colorantes fluorescentes selectivos de ADN y otros colorantes extintores. Con el fin de esta realización, cada uno se denominará un medio de tinción.

Independientemente de que se consiga en una dilución o en dos, la muestra de esperma se puede diluir a entre 640 x 106 y 40 x 106 espermatozoides/ml, a entre aproximadamente 320 x 106 y 80 x 106 espermatozoides/ml, a aproximadamente 160 x 106 espermatozoides/ml o a aproximadamente 120 x 106 espermatozoides/ml en los medios de tinción. El colorante fluorescente selectivo de ADN se puede añadir al semen suspendido en los medios de tinción en una concentración de entre aproximadamente 10 pM y 200 pM; entre aproximadamente 20 pM y 100 pM, o entre aproximadamente 30 pM y 70 pM. El pH de los medios de tinción puede estar entre aproximadamente 6,8 y 7,9; aproximadamente 7,1 y 7,6; o a aproximadamente 7,4. En el caso de dos diluciones, la segunda dilución se puede realizar a o cerca del mismo pH que la primera dilución o a un pH bajo, tal como entre 5,0 y 6,0, o a aproximadamente 5,5. Opcionalmente, los antioxidantes y concentraciones previamente descritos se pueden incorporar en los medios de tinción. La muestra de semen se puede incubar entre 30-39 °C, entre aproximadamente 32-37 °C, o a aproximadamente 34 °C. El periodo de incubación puede variar entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente tres horas, entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 90 minutos, o durante aproximadamente 45 minutos a aproximadamente 60 minutos.

Configuración y condiciones para los Ejemplos 1-10

Configuración del separador - Todos los análisis de selección y la selección se realizaron en un separador de semen MoFlo-SX modificado (Beckman Coulter, Brea California) usando actualizaciones del hardware de procesamiento digital Genesis (disponible en CytonomeST, Boston, Massachusetts) y software específico de selección de semen. El software de selección Genesis incluye una función de registro de parámetros que registra los valores promedio de diversos parámetros, tales como la tasa de eventos (en KHz), la tasa de selección (en KHz), la tasa de fracasos (en KHz), la cantidad de espermatozoides muertos (como tasa de eventos de espermatozoides muertos dividida por la tasa de eventos - en %), la cantidad de orientados vivos (como la tasa de eventos de espermatozoides orientados vivos dividida por la tasa de eventos - en %), la cantidad de seleccionados de X (como porcentaje de espermatozoides vivos orientados elegidos para ser recogidos) y la relación entre picos y valles (PVR). La selección en masa se refiere al uso de la cantidad de puerta de X para incluir tanto espermatozoides portadores del cromosoma X como del cromosoma Y para proporcionar espermatozoides que son tratados por el método de selección, pero no son seleccionados por sexo, basándose en la experiencia de que la calidad de los espermatozoides después de la selección y congelación no está influida por el sexo de los espermatozoides y la selección en masa es aproximadamente dos veces más rápida que la selección por sexo. Se proporcionó líquido envolvente presurizado tanto de una bolsa estéril de líquido envolvente en el interior de un tanque presurizado con cabezal de aire, como de una bolsa o vaso de precipitados abierto de líquido envolvente que suministra a un sistema de precisión de suministro de fluidos SheathMaster™ (CytonomeST) donde se aplica presión a un plénum presurizado de volumen pequeño. En ambos vasos, el caudal del líquido envolvente se controla con precisión por la presión del aire controlada por la estación de muestras MoFlo. Para todas las selecciones se usó un líquido envolvente basado en TRIS para la producción comercial de semen sexado.

Método discontinuo de cambio de líquido envolvente - Se dispusieron múltiples líquidos envolventes basados en TRIS, cada uno de los cuales contenía una cantidad especificada de glicerol, en bolsas estériles o vasos de precipitados abiertos y se usaron para suministrar al separador desde un tanque presurizado o sistema de suministro de líquido SheathMaster™, respectivamente. La concentración del glicerol para cada líquido envolvente es conocida por su composición.

Tinción de semen - Se tiñen 160 millones de espermatozoides bovinos por ml recién eyaculados con Hoechst 33342 65,0 mM en TALP modificado durante 60 minutos a 34 °C, se enfrió hasta temperatura ambiente y se diluyó con 1/3 de volumen del mismo TALP modificado complementado con 8 % v/v de yema de huevo clarificada para crear un concentración de espermatozoides final de 120 millones de espermatozoides por mililitro y una concentración de yema de huevo de 2 % v/v, a continuación se filtró a través de un filtro Partec de 50 micrómetros.

Alineación de semen para establecer/medir una PVR - La PVR (relación entre picos y valles) es una medición objetiva del gráfico univariante representado gráficamente en la interfaz gráfica de usuario del ordenador Genesis que ejecuta el separador. El gráfico unifactorial de la FIG. 3 ilustra la frecuencia de eventos que tienen diferentes intensidades de fluorescencia en la dirección hacia adelante. La representación en una muestra de semen teñida correctamente alineada corresponde a dos curvas superpuestas, con números similares de eventos en dos intensidades pico diferentes (dos máximos), junto con una ubicación donde las dos curvas empiezan a superponerse y el número de muestras de cada una de las dos curvas es aproximadamente igual (único mínimo local aproximadamente equidistante entre los dos máximos). El mínimo local se puede denominar un valle (V), mientras que los dos máximos locales se pueden denominar picos (P), el valor P como se utiliza en el ejemplo es un promedio de los dos valores de intensidad pico. Los valores ordinales para P y V se determinaron en el software, a partir de los que se calculó PVR con la siguiente ecuación: ((P-V)/P)* 100. Antes del análisis, la alineación se realizó en el separador de semen por un operador cualificado, para corregir el posicionamiento de la óptica, la boquilla y punta de selección de semen, así como el detector de fluorescencia hacia adelante (FAF) y el detector fluorescencia lateral (SAF). Además, se debe aplicar una ganancia de señal apropiada a FAF y SAF.

Análisis de datos registrados para PVR - El software de operación del separador Genesis proporciona un cálculo en tiempo real de PVR. Para cada 25.000 eventos, se calcula la PVR y almacena como un valor bruto, mientras se promedian 100 mediciones de valores brutos de PVR que ocurren consecutivamente. El valor promedio de PVR se puede registrar (anotar) a demanda del operador. En general, el funcionamiento de un citómetro de flujo a tasas de eventos más bajas crea relaciones de PVR mejoradas debido a la precisión mejorada de los valores medidos de eventos individuales (semen) causados por una sección transversal de la corriente de muestra central más estrecha. La alineación se optimizó en primer lugar seleccionando 40.000 eventos por segundo, a continuación se aplicó la puerta de selección (cuyos ejemplos se observan como R1, R3 y R4 en la FIG. 4) para recoger tanto las poblaciones vivas-X como vivas-Y simultáneamente (selección masiva) y el separador se hizo funcionar sin modificación adicional alguna durante una cantidad de tiempo correspondiente a 500.000 a 700.000 células seleccionadas antes de la necesidad del valor promedio, lo que asegura que los parámetros registrados son un promedio representativo. Después de la necesidad del valor promedio a 40.000 eventos por segundo, el operador reduce la presión de la muestra de semen teñida para ajustar a una nueva presión que estableció un tasa de eventos de aproximadamente 30.000, con la puerta de selección aplicada a poblaciones vivas-X y vivas-Y simultáneamente (selección masiva) y el separador se hace funcionar sin modificación adicional alguna durante una cantidad de tiempo correspondiente a 500.000 a 700.000 células seleccionadas antes de la necesidad de valor promedio. Lo mismo se repite para una muestra que se ejecuta a 20.000 eventos por segundo. A continuación se aumenta la presión de la muestra para establecer una tasa de eventos promedio de 40.000 por segundo, seguido por alineación (si es necesario) y tres mediciones consecutivas como antes. Esto se hace en serie con el tiempo y a continuación se analizan los datos registrados.

Ejemplo 1

La Tabla 2 resume los tratamientos para el Ejemplo 1.

Tabla 2.

1. Se obtuvo una eyaculación de un toro.

2. Se comprobó la calidad (QC) de la eyaculación para la movilidad y morfología y se estimaron las concentraciones de espermatozoides.

3. Se normalizó la eyaculación combinando con medios de almacenamiento (sales de solución salina fisiológica y tampón con yema de huevo y nutrientes) en una relación 1:3 respectivamente y a continuación se tiñó según el procedimiento de tinción referenciado anteriormente.

4. Se conectó el líquido envolvente (LE) de control al citómetro de flujo y se recogió líquido residual en un tuvo previamente pesado durante 3 minutos.

5. Se pesó el líquido en el tubo para determinar el caudal con cada líquido envolvente específico.

6. La muestra teñida se colocó en el separador y se verificó el retraso de la gota.

7. Se recogieron datos registrados del citómetro de flujo para 1 millón de espermatozoides seleccionados por sexo a 30.000, 20.000 y 40.000 eps.

8. Después de la recopilación de los datos registrados, se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta de 20 ml.

9. Para los grupos de tratamiento, se repitieron las etapas 7 y 8 usando cada líquido envolvente de tratamiento descrito anteriormente en la Tabla 2.

10. Después de la recopilación de los datos registrados, se seleccionó en masa 1 tubo de captura por tratamiento hasta 40 ml.

11. Todos los tubos de captura se colocaron en un cuarto frío durante 90 minutos.

12. Se añadieron 20 ml de medio de congelación (12 % vol/vol de glicerol) al control (adición de dos etapas). 13. Se centrifugaron todos los tubos de captura y se decantó el sobrenadante.

14. Se añadió un volumen apropiado de AB (6 % de glicerol vol/vol) a cada tubo de captura para llevar la concentración de espermatozoides por pajuela de IA de % cm3 a 4 millón de células/pajuela.

15. Los espermatozoides se mantuvieron en un cuarto frío durante la noche.

16. Se colocaron los espermatozoides en pajuelas y se crioconservaron.

17. Las etapas 1-16 se repitieron dos veces más usando eyaculaciones del mismo toro.

18. Se evaluó la PVR para el control y cada tratamiento. Los resultados se muestran en la Figura 9. También se evaluaron la movilidad de los espermatozoides (IVOS II), la viabilidad (PI) y el PIA (PNA) 0 y 3 horas después de la descongelación. Los resultados se muestran en las Figuras 10 y 11, respectivamente.

Ejemplo 2

En lugar del método discontinuo de cambio de líquido envolvente descrito anteriormente, el Ejemplo 2 utilizó un método de líquido envolvente en gradiente de cambio de líquido envolvente del siguiente modo.

Método de líquido envolvente en gradiente de cambio de líquido envolvente - Se agita con una barra de agitación magnética el vaso de precipitados 1, proporcionando líquido envolvente al sistema de suministro de líquido SheathMaster™ que contenía el líquido envolvente bovino con 0 % de glicerol. El líquido envolvente bovino que contiene 6 % vol/vol de glicerol (820 mM) en el vaso de precipitados 2 se bombea lentamente al vaso de precipitados 1 con una bomba peristáltica que proporciona una concentración continuamente creciente de glicerol en el vaso de precipitados 1 durante un periodo de aproximadamente 3 horas, donde la concentración final de glicerol es aproximadamente 5,5 % vol/vol (750 mM). La concentración de glicerol en los intervalos de tiempo se determina midiendo la osmolaridad del líquido envolvente que sale de la boquilla y comparando la medición con una curva patrón apropiada. La curva típica para el glicerol en el líquido envolvente es Porcentaje de glicerol (G) = (mOsm medidos (X) - 300)/161, o dicho de otro modo, cada aumento en 161 mOsm corresponde a un aumento de un 1 % (vol/vol) en la concentración de glicerol.

1. Se obtuvieron eyaculaciones recientes de tres toros.

2. Se comprobó QC de las eyaculaciones, se normalizaron y se tiñeron según los procedimientos descritos en el Ejemplo 1.

3. Se conectó un vaso de precipitados que contenía 0 % de líquido envolvente de glicerol al sistema de suministro de líquido de un citómetro de flujo. El líquido se mezcló continuamente con una barra de agitación magnética. 4. La muestra de semen teñida se colocó en el citómetro de flujo y se verificó el retraso de la gota.

5. Se seleccionar por sexo 1 millón de espermatozoides a 20.000 eps, luego a 30.000 eps y finalmente 40.000 eps.

6. Se bombeó 6,0 % vol/vol de líquido envolvente de glicerol con una bomba peristáltica en el 0 % de líquido envolvente de glicerol a un caudal promedio de 204 g/h.

7. Se recopilaron continuamente los datos registrados del citómetro de flujo a las diferentes tasas de eventos hasta que solo estuvo disponible el 6,0 % vol/vol de líquido envolvente de glicerol.

8. Se calculó la PVR para cada control y muestra de tratamiento. Los resultados se muestran en la Figura 12.Ejemplo 3

La Tabla 3 resume los tratamientos para el Ejemplo 3.

1. Se obtuvieron eyaculaciones de diez toros.

3. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 20 ml.

Control - Poner los tubos en un cuarto frío durante 90 minutos.

Se añadieron 20 ml de medio de congelación (12 % vol/vol de glicerol) al control (adición de dos etapas). 4. Se repitió la etapa 3. Se seleccionaron en masa 4 tubos de captura de hasta 40 ml usando 3,5 % de glicerol vol/vol en líquido envolvente (LE).

Tratamiento 1 - Los tubos se pusieron en un cuarto frío durante 90 minutos.

Tratamiento 2 - Los tubos se pusieron en un cuarto frío durante 30 minutos.

Tratamiento 3 - Se mantuvieron a temperatura ambiente hasta que estuvieron listos para la centrífuga Tratamiento 4 - Se mantuvieron a temperatura ambiente hasta que estuvieron listos para la centrífuga 5. Se centrifugaron todos los tubos de captura y se decantó el sobrenadante.

6. Se añadió un volumen apropiado de AB fría (6 % de glicerol vol/vol) a cada tubo de captura para llevar la concentración de espermatozoides por pajuela de IA de % cm3 a 4 millón de células/pajuela, excepto que se añadió AB a temperatura ambiente al tratamiento 4.

7. Los espermatozoides diluidos se mantuvieron durante la noche en el cuarto frío.

8. Los espermatozoides se pusieron en pajuelas y se crioconservaron (3 pajuelas por tratamiento a 4 millones de células/pajuela).

9. Se evaluaron la movilidad (IVOS), viabilidad (PI) y PIA (PNA) 0 y 3 h después de la descongelación. Los resultados se muestran en la Figura 13. En la Figura 14 se muestran la convergencia (3 h/0 h) para la movilidad, viabilidad y PIA.

Ejemplo 4

La Tabla 4 resume los tratamientos para el Ejemplo 4.

1. Se obtuvieron eyaculaciones de cinco toros.

3. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 20 ml.

Control - Los tubos de captura se pusieron en un cuarto frío durante 90 minutos.

Se añadieron 20 ml de medio de congelación (12 % vol/vol de glicerol) al control (adición de dos etapas). Se centrifugaron todos los tubos de captura y se decantó el sobrenadante.

Se añadió un volumen apropiado de AB (6 % de glicerol vol/vol) a cada tubo de captura para llevar la concentración de espermatozoides por pajuela de IA de % cm3 a 4 millón de células/pajuela.

4. Se conectó 3,0 % de glicerol en líquido envolvente (LE) y se presurizó el tanque.

5. Se seleccionaron en masa 2 tubos de captura de hasta 40 ml:

Tratamiento 1 - Los tubos de captura se pusieron en un cuarto frío durante 90 minutos.

Tratamiento 2 - Los tubos de captura se pusieron en un cuarto frío durante 0 minutos.

6. Se conectó 5,0 % de glicerol vol/vol en líquido envolvente y se presurizó el tanque.

7. Se seleccionaron en masa 4 tubos de captura de hasta 40 ml:

Tratamiento 3 - Los tubos de captura se pusieron en un cuarto frío durante 90 minutos.

Tratamiento 4 - Los tubos de captura se pusieron en un cuarto frío durante 0 minutos.

Se centrifugaron todos los tubos y se decantó el sobrenadante.

Se añadió AB (5 % de glicerol vol/vol) a cada tubo para un final de 4 millones de espermatozoides por pajuela.

8. Los espermatozoides diluidos se mantuvieron durante la noche en el cuarto frío.

9. Los espermatozoides se pusieron en pajuelas y se crioconservaron.

10. Se evaluaron la movilidad (IVOS), viabilidad (PI) y PIA (PNA) 0 y 3 h después de la descongelación. Los resultados se muestran en la Figura 15. En la Figura 16 se muestran la convergencia (3 h/0 h) para la movilidad, viabilidad y PIA.

Ejemplo 5

La Tabla 5 resume los tratamientos para el Ejemplo 5.

Tabla 5.

1. Se obtuvieron eyaculaciones de cuatro toros.

3. Se conectó el control del líquido envolvente y se presurizó el tanque de líquido envolvente.

4. La muestra teñida se colocó en un citómetro de flujo y se verificó el retardo de gota.

5. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 3,5 % de glicerol vol/vol en líquido envolvente (LE).

6. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 3,5 % de etilenglicol vol/vol en LE.

7. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 3,5 % de propilenglicol vol/vol en LE.

8. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 3,5 % de eritritol vol/vol en LE

9. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 5,0 % de eritritol vol/vol en LE.

10. Todos los tubos se centrifugaron y decantaron.

11. Se añadió AB 5 % de glicerol vol/vol a cada tubo en una cantidad capaz de dar 4 millones de espermatozoides por pajuela.

12. Los espermatozoides diluidos se mantuvieron durante la noche en el cuarto frío.

13. Los espermatozoides se pusieron en pajuelas y se crioconservaron.

14. Se evaluaron la movilidad (IVOS), viabilidad (PI) y PIA (PNA) 0 y 3 h después de la descongelación. Los resultados se muestran en la Figura 17. En la Figura 18 se muestran la convergencia (3 h/0 h) para la movilidad, viabilidad y PIA.

Ejemplo 6

La Tabla 6 resume los tratamientos para el Ejemplo 6.

Tabla 6.

1. Se obtuvieron eyaculaciones recientes de cuatro toros.

4. Selección en masa de 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 0,0 % de glicerol en líquido envolvente (LE) (control)

5. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 1,0 % de glicerol vol/vol LE (T1)

6. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 3,0 % de glicerol vol/vol LE (control 2) 7. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 3,0 % de glicerol vol/vol LE (T2)

8. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 5,0 % de glicerol vol/vol LE (T3)

9. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 7,0 % de glicerol vol/vol LE (T4)

10. Los tubos de control se pusieron en un cuarto frío durante 90 minutos y se añadió 20 ml de medio de congelación (12 % v/v de glicerol) (adición de dos etapas).

11. Todos los tubos se centrifugaron y decantaron.

12. Se añadió AB suficiente a cada tubo para dar 4 millones de espermatozoides por pajuela:

AB 6,0 % de glicerol vol/vol (control)

AB 1,0 % de glicerol vol/vol (T1)

AB 3,0 % de glicerol vol/vol (T2)

AB 5,0 % de glicerol vol/vol (T3 y control 2)

AB 7,0 % de glicerol vol/vol (T4)

13. A continuación se mantuvieron los espermatozoides diluidos durante la noche en el cuarto frío.

14. Los espermatozoides se pusieron en pajuelas y se crioconservaron.

15. En la Figura 19 se muestra la movilidad 0 y 3 h después de la descongelación (IVOS II). En la Figura 20 se muestra la viabilidad (PI) y PIA (PNA) 0 y 3 h después de la descongelación.

Ejemplo 7

La Tabla 7 resume los tratamientos para el Ejemplo 7.

Tabla 7.

1. Se obtuvieron eyaculaciones recientes de cuatro toros.

4. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 20 ml usando 0,0 % de glicerol vol/vol en líquido envolvente (LE) (control)

5. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 3,0 % de glicerol vol/vol LE (Control 2) 6. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 1,0 % de propilenglicol vol/vol LE (T1) 7. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 3,0 % de propilenglicol vol/vol LE (T2) 8. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 5,0 % de propilenglicol vol/vol LE (T3) 9. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml usando 7,0 % de propilenglicol vol/vol LE (T4) 10. Los tubos de control se pusieron en un cuarto frío durante 90 minutos y se añadieron 20 ml de medio de congelación (12 % vol//vol. de glicerol) (adición de dos etapas).

11. Todos los tubos se centrifugaron y decantaron.

AB 6,0 % de glicerol vol/vol (Control)

AB 5,0 % de glicerol vol/vol (Control 2)

AB 1,0 % de propilenglicol vol/vol (T1)

AB 3,0 % de propilenglicol vol/vol (T2)

AB 5,0 % de propilenglicol vol/vol (T3)

AB 7,0 % de propilenglicol vol/vol (T4)

14. Los espermatozoides se pusieron en pajuelas y se crioconservaron.

15. En la Figura 21 se muestra la movilidad 0 y 3 h después de la descongelación (IVOS II). En la Figura 22 se muestra la viabilidad (PI) y PIA (PNA) 0 y 3 h después de la descongelación.

Ejemplo 8

La Tabla 8 resume los tratamientos para el Ejemplo 8.

Tabla 8.

1. Se obtuvieron eyaculaciones recientes de cuatro toros.

5. Se seleccionaron en masa 7 tubos de captura de hasta 40 ml usando 3,0 % de glicerol en líquido envolvente (LE).

6. Todos los tubos se centrifugaron y decantaron.

7. Se añadió AB suficiente a cada tubo para dar 4 millones de espermatozoides por pajuela:

AB 3,0 % de glicerol vol/vol (T1)

AB 3,5 % de glicerol vol/vol (T2)

AB 4,0 % de glicerol vol/vol (T3)

AB 4,5 % de glicerol vol/vol (T4)

AB 5,0 % de glicerol vol/vol (T5)

AB 5,5 % de glicerol vol/vol (T6)

AB 6,0 % de glicerol vol/vol (T7)

8. A continuación, los espermatozoides diluidos se mantuvieron durante la noche en el cuarto frío.

9. Los espermatozoides se pusieron en pajuelas y se crioconservaron.

10. En las Figuras 23 y 25 se muestran la movilidad a 0 h y 3 h (visual y IVOS). En las Figuras 24 y 26 se muestran la viabilidad (PI) y PIA (PNA) a 0 h y 3 h. En la Figura 27 se muestra la convergencia (3 h/0 h) para la movilidad. En la Figura 28 se muestra la convergencia para la viabilidad y PIA.

Ejemplo 9

La Tabla 9 resume los tratamientos para el Ejemplo 9.

Tabla 9.

1. Se obtuvieron eyaculaciones nuevas de diez toros.

4. Se seleccionaron en masa 2 tubos de captura de hasta 20 ml (o 15 millones de espermatozoides) usando 0,0 % de glicerol vol/vol. en líquido envolvente (LE).

5. Los tubos se colocaron en un cuarto frío durante 90 minutos y se añadieron 20 ml de medio de congelación (12 % vol/vol de glicerol) (adición de dos etapas).

6. Se conectó el líquido envolvente de tratamiento y se presurizó el tanque de líquido envolvente.

7. La muestra teñida se colocó en un citómetro de flujo y se verificó el retardo de gota.

8. Se seleccionó en masa 1 tubo de captura de hasta 40 ml (o 30 millones de espermatozoides) usando 3,0 % de glicerol vol/vol LE alfa-cetoglutarato (AKG).

9. Todos los tubos se centrifugaron y decantaron.

10. Se añadió AB a cada tubo:

1200 ul de AB 6,0 % de glicerol vol/vol (control 1 y control 2)

1200 ul de AB 4,5 % de glicerol vol/vol (T1 y T2)

11. Se mantuvieron el control 1 y los espermatozoides T1 durante 2 horas en AB y a continuación se crioconservaron en pajuelas de IA (2 pajuelas por tratamiento a 4 mill. espermatozoides/pajuela).

12. Se mantuvieron el control 2 y T2 durante la noche en AB y a continuación se crioconservaron en pajuelas de IA (2 pajuelas por tratamiento a 4 mill. espermatozoides/pajuela).

13. La movilidad a 0 y 3 h (visual y IVOS), viabilidad (PI), PIA (PNA) y convergencia (0 h/3 h) se evaluaron después de la descongelación. En la Figura 29 se muestran la movilidad (visual y IVOS), viabilidad y PIA a 0 h. En la Figura 30 se muestran la movilidad (visual y IVOS), viabilidad y PIA a 3 h. En la Figura 31 se muestran la convergencia (3 h/0 h) para la movilidad, viabilidad y PIA.

Ejemplo 10

La Tabla 10 resume los tratamientos para el Ejemplo 10.

1. Se obtuvieron eyaculaciones recientes de tres toros.

3. Se conectó el líquido envolvente del tratamiento 1 (control) (no glicerol) y se presurizó el tanque de líquido envolvente.

4. Se seleccionaron en masa 4 tubos de captura de control hasta 20 ml (o 15 millones de espermatozoides). 5. Los tubos se colocaron en el cuarto frío durante 90 minutos y se añadieron 20 ml de medio de congelación (12 % de glicerol vol/vol) (adición de dos etapas).

6. Se conectó el líquido envolvente del tratamiento 2 (3 % de glicerol vol/vol con AKG) y se presurizó el tanque. 7. Se seleccionaron en masa 2 tubos de captura de hasta 40 ml (o 30 millones de espermatozoides).

8. A continuación se centrifugaron todos los tubos y se decantaron. Se consolidaron los sedimentos para T1 (4 tubos). Se consolidaron los sedimentos para T2 (2 tubos).

9. Se añadió AB a cada tubo:

AB 6,0 % de glicerol vol/vol al tratamiento 1

AB 4,5 % de glicerol vol/vol al tratamiento 2

10. Los espermatozoides diluidos se mantuvieron durante 2 horas en AB y a continuación se crioconservaron en pajuelas de IA (4 mill. espermatozoides/pajuela).

11. A continuación se fecundaron 200 ovocitos por tratamiento por FIV. Los resultados de la FIV se muestran en la Figura 32.

Ejemplo 11

El Ejemplo 11 consiste en un ensayo de campo para probar la tasa de concepción lograda con los espermatozoides seleccionados por sexo usando líquido envolvente que comprende 3 % de glicerol vol/vol y 0,0875 mg/ml de alfacetoglutarato. Se utilizaron 5 sementales y más de 3000 vaquillas (hasta la 3.a lactación) recibieron 1 a 3 inseminaciones de IA con 90 % de espermatozoides femeninos seleccionados por sexo.

Los resultados del Ejemplo 11 se muestran en las Figuras 33 y 34. La Figura 33 muestra la movilidad, PIA, convergencia y viabilidad después de la descongelación de los espermatozoides usados en el ensayo de campo. La Figura 34 muestra las tasas de concepción alcanzadas.

Ejemplo 12

El Ejemplo 12 probó la eficacia de una disolución diluida de glicerol ("criolizador") que, cuando se mezcla con una cantidad calculada de TRIS A (TRIS 20 % de yema de huevo) se convierte en AB, eliminando la necesidad de glicerol puro en los laboratorios de selección de semen.

La Tabla 11 resume los tratamientos para el Ejemplo 12.

Tabla 11.

1. Se obtuvieron cinco eyaculaciones de un toro.

3. Se seleccionaron en masa 4 tubos de captura usando líquido envolvente que contenía 3,0 % de glicerol vol/vol alfa-cetoglutarato (AKG).

4. Los tubos se colocaron en un cuarto frío durante 15 minutos.

5. Todos los tubos se centrifugaron y decantaron y los sedimentos se consolidaron.

6. Los sedimentos se separaron en 5 tubos que contenían AB 4,5 % de glicerol logrado del siguiente modo: CONTROL - preparado con glicerol puro (100 % v/v)

TRATAMIENTO 1 - preparado con 20 % de criolizador

TRATAMIENTO 2 - preparado con 45 % de criolizador

TRATAMIENTO 3 - preparado con 65 % de criolizador

7. Los espermatozoides se mantuvieron durante la noche y congelados.

8. Realizar la movilidad a 0 y 3 h (visual y IVOS), viabilidad (PI) y PIA (PNA).

Los resultados del Ejemplo 12 se muestran en la Figura 35, que muestra un efecto beneficioso cuando AB se prepara con criolizador (glicerol diluido) en lugar de 100 % de glicerol vol/vol.

Ejemplo 13

La Tabla 12 resume los tratamientos para el Ejemplo 13.

Tabla 12.

1. Se obtuvieron eyaculaciones de 8 toros.

3. CONTROL - Se usó líquido envolvente (0,0 % de glicerol) en el separador A para los toros 1 -4, y en el separador B para los toros 5-8.

Se seleccionó en masa 1 tubo de captura por toro hasta 20 ml (o 15 millones) en Tris A (0,0 % de glicerol, sin AKG).

Los tubos se colocaron en un cuarto frío durante 90 minutos. Se añadió medio de congelación (12 % vol/vol de glicerol) después de enfriar.

4. TRATAMIENTO - Se usó líquido envolvente que comprende 3,0 % de glicerol y 0,0875 mg/ml de AKG en el separador B para los toros 1 -4, y en el separador A para los toros 5-8.

Se seleccionó en masa 1 tubo de captura por toro hasta 40 ml (o 30 millones) en líquido de captura que comprendía 2,4 % de glicerol vol/vol.

El tubo se colocó en un cuarto frío durante 15 minutos.

5. Todos los tubos se centrifugaron y decantaron.

6. Se añadió lo siguiente a los tubos de control y tubos de tratamiento, respectivamente:

AB 6,0 % de glicerol a tubos de CONTROL

AB 4,5 % de glicerol a tubos de TRATAMIENTO

7. Los espermatozoides se mantuvieron durante 12 horas (durante la noche) en AB y luego se congelaron. 8. Se realizaron la movilidad visual y por IVOS, viabilidad (PI) y PIA (PNA) a 0 y 3 h. La convergencia se calculó para cada parámetro.

Los resultados del Ejemplo 13 se muestran en la Figura 36.

Ejemplo 14

El Ejemplo 14 demuestra que se puede usar eritritol hasta 400 milimolar en un diluyente bovino recién preparado con buen apoyo de la movilidad de espermatozoides bovinos durante un periodo de 4 días. Esto es con semen "convencional" (sin selección) teñido con Hoechst 33342 (para facilitar CASA usando fluorescencia).

El diluyente recién preparado es un medio similar a Caprogen, que contiene 5 % (v/v) de yema de huevo y se burbujea con gas nitrógeno antes de diluir el semen.

Caprogen con glicerol es uno de los medios comparados en este ejemplo y comprende los siguientes componentes: Citrato de sodio tribásico dihidratado, 20,0 gramos, ácido cítrico monohidratado, 0,25 gramos, glicina, 10,0 gramos, D-(+)-glucosa, 3,0 gramos, fosfato de potasio dibásico anhidro, 0,609 gramos, ácido n-hexanoico (ácido caproico), 0,231 ml, cianocobalamina, 0,250 gramos, alfa-cetoglutarato disódico dihidratado, 0,35 gramos, trehalosa dihidratada, 0,750 gramos, glicerol, 10,0 ml, sulfato de estreptomicina, 0,150 gramos, gentamicina, 0,500 gramos, tilosina, 0,100 gramos, lincomicina, 0,300 gramos, espectinomicina, 0,500 gramos, yema de huevo de gallina, 5,0 ml.

Caprogen con eritritol es el otro medio comparado en este ejemplo y comprende los siguientes componentes: citrato de sodio tribásico dihidratado, 20,0 gramos, ácido cítrico monohidratado, 0,225 gramos, glicina, 8,653 gramos, D-(+)-glucosa, 2,50 gramos, fosfato de potasio dibásico anhidro, 0,609 gramos, sal de sodio de ácido n-hexanoico (ácido caproico), 0,276 gramos, cianocobalamina, 0,250 gramos, alfa-cetoglutarato disódico dihidratado, trehalosa dihidratada, 0,750 gramos, 0,35 gramos, eritritol, 14,64 gramos, sulfato de estreptomicina, 0,150 gramos, gentamicina, 0,500 gramos, tilosina, 0,100 gramos, lincomicina, 0,300 gramos, espectinomicina, 0,500 gramos, yema de huevo de gallina, 5,0 ml.

En Caprogen con glicerol, la concentración de glicina es 135 milimolar y la concentración de glicerol es 135 milimolar. El medio de control 1 se preparó con estas mismas concentraciones, mientras que el equilibrio de los medios de prueba (medios 2-7) se hizo con las siguientes concentraciones como se muestra en la Tabla 13:

Tabla 13.

Se diluyeron eyaculaciones bovinas recientes de 5 toros a 160 millones de espermatozoides por ml en tinción TALP, combinada con la tinción de ADN Hoechst 33342, se incubaron 60 minutos a 34 °C (como tinción patrón para la selección de espermatozoides XY). Una vez teñidos, los espermatozoides en TALP se diluyeron en los medios relacionados hasta una nueva concentración de 15 millones de espermatozoides por ml y se pusieron en pajuelas de 0,25 cm3, se cerraron y se mantuvieron horizontales a 18 °C durante 4 días. Cada día se calentó una pajuela de espermatozoides durante 15 minutos a 34 °C y el contenido de aproximadamente 200 microlitros de la pajuela se combinó con 100 microlitros de medio recién preparado idéntico al medio de prueba especificado usado para mantener los espermatozoides. Los espermatozoides se analizaron en CASA fluorescente (Hamilton Thome IVOS II) usando iluminación UV. La movilidad total y progresiva promedio para los 5 toros se resume en la Tabla 14 y en la Figura 37.

Esta prueba muestra que el glicerol 135 milimolar es beneficioso para apoyar la movilidad de los espermatozoides durante hasta 4 días y que la sustitución de glicerol con eritritol en un medio recién preparado Caprogen proporciona un apoyo similar de la movilidad de los espermatozoides, mostrando un beneficio del eritritol en el periodo más largo de 4 días.

Ejemplo 15

El Ejemplo 15 demuestra que el glicerol en la formulación patrón de Caprogen para la dilución del semen bovino conservado durante hasta nueve días a 17 °C se puede sustituir completamente con eritritol dando un tiempo de almacenamiento más largo del semen cuando se comparan movilidades visuales y CASA. El patrón Caprogen (con glicerol) se denomina "CaproGLI" y Caprogen que contiene eritritol se denomina ''CaproERI''.

Preparación de medios en volumen de 100 ml: se combinan 95 ml de la disolución de trabajo de medios respectivos con 5 ml de yema de huevo, se agita durante 15 minutos, se mantiene durante la noche a 4 °C, se centrifuga durante 60 minutos a 1200 g en tubos Falcon de 50 ml (clarificados). En el día de uso, se burbujea gas nitrógeno a través de los medios clarificados durante 15 minutos. La Tabla 15 muestra las propiedades de los 2 medios.

Tabla 15.

Selección del semen a mantener en los dos diluyentes recién preparados: Eyaculaciones recientes de 3 toros Jersey se seleccionan en masa según métodos habituales propios de selección por sexo desvelados en otras patentes. En resumen, se lava el semen, se concentra y se resuspende en un diluyente de TRIS-citrato tamponado con Hepes para normalizar la concentración a aproximadamente 1200 espermatozoides por ml y pH de aproximadamente 7,15. Cada 1 ml de tinción comprende: 0,150 ml de disolución de espermatozoides (aproximadamente 160 millones de espermatozoides), 64 nanomoles de Hoechst 33342 en 8 microlitros, 592 ml de tinción TALP y 100 nanomoles del colorante alimentario FD&C. La muestra se incuba en un tubo de muestra de 4 ml a 34 °C durante 60 minutos, tras lo cual 0,25 ml de 8 % (v/v) de yema de huevo en TALP, que diluye los espermatozoides a aproximadamente 120 millones por ml y proporciona una concentración final de yema de huevo del 2 % para la muestra a seleccionar.

Espermatozoides recién teñidos se seleccionan en masa a tasas de eventos de aproximadamente 40.000 por segundo, donde selección en masa significa recoger los espermatozoides orientados vivos que portan tanto los cromosomas X como Y, explícitamente, los espermatozoides seleccionados son de calidad equivalente a los espermatozoides patrón seleccionados, pero no enriquecidos por sexo. 80 millones de espermatozoides de cada uno de los 3 toros de Jersey se seleccionan en un líquido de captura de TRIS A, se enfrían durante un mínimo de 90 minutos en un armario frío (temperatura típica 4-7 °C), se mezclan en volúmenes iguales con una disolución de TRIS B no de yema de huevo, se concentran por centrifugación y recuperación de sedimentos de espermatozoides y determinación de concentración final (espermatozoides concentrados) en el intervalo de 100-115 millones de espermatozoides por ml. A continuación se combinan 3 volúmenes de CaproGLI o CaproERI con 1 volumen de los espermatozoides concentrados hasta una concentración formulada final de aproximadamente 20-24 millones por ml (aproximadamente 5,0-5,5 millones de espermatozoides por pajuela de 0,25 cm3).

Los espermatozoides formulados se llenan en pajuelas de 0,25 cm3, se cierran y se conservan horizontalmente a 17 °C durante hasta nueve días. En los días de prueba especificados, se abre una pajuela y se verifica la movilidad visual (contada a simple vista por un técnico usando análisis por microscopio en pletina calentada), movilidad total por CASA y movilidad progresiva por CASA usando un sistema Hamilton Thorne IVOS. Además de las pajuelas, una muestra de 0,50 ml de cada una de las seis muestras se conserva en un tubo de muestra de 4 ml a 17 °C para la comparación en el octavo día.

La Tabla 16 resume las movilidades promedio de los tres toros de Jersey en diferentes días.

Tabla 16.

Los resultados anteriores muestran que cuando se sigue el principio de tener molaridad igual de glicina y el poliol acompañante (glicerol o eritritol), la sustitución completa del glicerol con eritritol crea un diluyente de espermatozoides Caprogen comparable que es tan bueno o mejor que el preparado con glicerol. Para tiempos de mantenimiento superiores a 4 días, el eritritol es mejor en conservar la calidad como se ve en la movilidad. También parece que el almacenamiento en tubos puede ser mejor que en las pajuelas.

Ejemplo 16

El Ejemplo 16 demuestra que los espermatozoides seleccionados por sexo conservados en un medio Caprogen usando eritritol en lugar de glicerol son capaces de crear varios embarazos similares al patrón Caprogen.

Para evaluar previamente los posibles resultados de fertilidad usando CaproERI como sustituto en este ámbito donde CaproGLI ha funcionado bien, se crió un número pequeño (aproximadamente 145) de vaquillas en cuatro segmentos de tiempo y se compararon con datos de los mismos toros en las mismas granjas usando espermatozoides seleccionados por sexo conservados en CaproGLI. Normalmente, con semen recién diluido, las vaquillas se crían en 1-2 días desde el día de selección y formulación.

La Tabla 17 a continuación resume los resultados para la prueba de campo de la investigación con CaproERI.

En esta prueba de campo de investigación no se usó un procesamiento dividido, no se distribuyó uniformemente el número de pajuelas en cada tratamiento y no se distribuyó equitativamente entre toros y granjas. Por consiguiente, los valores nominales relativos (57,4 % frente a 53,1 %) no son estadísticamente diferentes. Ambos valores están perfectamente dentro del intervalo estándar observado para CaproGLI durante el periodo de 40 meses y, por consiguiente, CaproERI proporciona una fertilidad similar.

Ejemplo 17

El Ejemplo 17 demuestra que el eritritol se puede usar (con o sin glicina) en líquido envolvente para la selección de espermatozoides o diluyentes de congelación a concentraciones entre 15-110 mMolar y ser igual o mejor que los medios de control patrón sin eritritol.

La selección patrón de espermatozoides bovinos usa líquido envolvente que comprende fructosa 68 mM, citrato 80 mM y TRIS 243 mM a pH 6,80 y osmolaridad 290-300 mOsm (líquido envolvente de CONTROL). La combinación de 80 volúmenes de dicho líquido envolvente de control con 20 volúmenes de yema de huevo fresca seguido por clarificación da como resultado una disolución de enfriamiento de CONTROL llamada TRIS A (la "fracción A"). La combinación de 88 volúmenes de TRIS A con 12 volúmenes de glicerol puro crea una disolución llamada TRIS B (la "fracción B"). En el caso de la selección patrón de espermatozoides, la "fracción B" puede no contener opcionalmente yema de huevo y se puede denominar "fracción B sin huevo", conteniendo todavía 12 volúmenes de glicerol puro.

La Tabla 18 muestra las concentraciones milimolares de los componentes usados en esta prueba, donde el medio de control no contiene ni glicina ni eritritol y las muestras de prueba contienen diversas cantidades de eritritol y en algunos casos glicina. El pH de todos los medios fue 6,70-6,75 y la osmolaridad fue 290-305 mOsm.

Tabla 18.

Se usaron los dos mismos toros para cada una de las dos pruebas y se midieron para la calidad después de la descongelación al mismo tiempo. La primera prueba se hizo con espermatozoides no seleccionados no teñidos similar a la "congelación convencional" estándar. La segunda prueba se hizo usando diferentes líquidos envolventes para seleccionar los espermatozoides.

La primera prueba comparó el control (medios patrón) con 7 medios alternos (A-G) con composiciones que incluían diversas cantidades de eritritol y en algunos casos glicina. Se enfriaron 10 mililitros de semen de cada toro a una concentración de 100 millones de espermatozoides por mililitro en el patrón TRIS A (medio de control) durante 90 minutos desde temperatura ambiente hasta aproximadamente 4-6 °C. A continuación, las muestras se dividieron en alícuotas de 1 mililitro y se añadieron 0,5 ml de medio frío PRUEBA-B, se mantuvo durante 15 minutos antes de que se añadieran 0,5 ml adicionales del medio PRUEBA-B. Esto produjo concentraciones finales de espermatozoides de 50 millones por ml. Estas muestras se cargaron en pajuelas de crioconservación de 0,25 cm3 y se congelaron en un método de congelación a vapor controlado usado normalmente para congelar espermatozoides convencionales.

Las concentraciones de glicerol en el medio PRUEBA-B fueron siempre 6,0 % (vol/vol), dando como resultado concentraciones finales de glicerol del 3,0 % (vol/vol). Todos los medios PRUEBA-B tuvieron 0 % de yema de huevo que produjeron concentraciones finales de yema de huevo del 10 % (vol/vol). Las concentraciones de componentes químicos, en el momento de la congelación, se muestran en la tabla (CONTROL frente a A-G). Estas condiciones enfriaron los espermatozoides en la cantidad habitual de yema de huevo (20 %), crioconservándolos en / de la cantidad estándar de yema de huevo y glicerol. Los resultados de la movilidad visual muestran que, en dichas condiciones de control, los 7 medios que contenían eritritol soportaron la crioconservación tan bien como o mejor que el control sin eritritol. Los resultados muestran que se pueden usar hasta aproximadamente 110 mM de eritritol en la congelación de espermatozoides bovinos, lográndose resultados de congelación óptimos con eritritol 15-50 mM.

La segunda prueba comparó un líquido envolvente de CONTROL (patrón) con tres líquidos envolventes alternos (H-J). Las composiciones de todos los líquidos envolventes se muestran en la tabla. Después de seleccionar todas las muestras, se manipularon en un modo idéntico a la selección de espermatozoides habitual. Un volumen de 3,5 ml de líquido de captura (TRIS A) se pone en cada tubo de captura y los espermatozoides seleccionados se seleccionan en el tubo de captura de hasta un volumen de 20 ml. Este volumen de líquido se enfría a continuación durante 90 minutos a aproximadamente 4-6 °C, a continuación se añade un volumen igual de fracción B sin huevo fría. Se concentran los espermatozoides por centrifugación y se desecha el sobrenadante y se resuspende en una fracción TRIS AB de yema de huevo preparada mezclando volúmenes iguales de fracción A y fracción B. Las células se formularon a aproximadamente 18 millones por ml y se congelaron en pajuelas de 0,25 cm3 en un método de congelación por vapor controlado usado normalmente para congelar espermatozoides convencionales (mismo que antes).

Los resultados muestran que eritritol hasta 60 mM puede estar presente en líquido envolvente y ser beneficioso para la calidad de los espermatozoides en el método convencional para la manipulación posterior a la selección de los espermatozoides.

Como puede ser entendido fácilmente de lo anterior, los conceptos básicos de la presente invención pueden incorporarse en una variedad de formas. La invención implica numerosas realizaciones y variadas del procesamiento de semen que incluyen, pero no se limitan a, el mejor modo de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de procesamiento de semen que comprende: tinción de una muestra de semen que tiene espermatozoides viables portadores del cromosoma X y espermatozoides viables portadores del cromosoma Y con un medio de tinción; poner en contacto la muestra de semen teñida con un líquido envolvente en una trayectoria de flujo; y manipular una relación entre espermatozoides viables portadores del cromosoma X y espermatozoides viables portadores del cromosoma Y para formar al menos una población de espermatozoides manipulada; en donde el líquido envolvente comprende glicerol en una concentración en vol/vol entre 1 % y 6 %.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de manipular una relación entre espermatozoides viables portadores del cromosoma X y espermatozoides viables portadores del cromosoma Y para formar al menos una población de espermatozoides manipulada comprende además seleccionar semen para la separación y recogida o para la fotodañinos y recogida.

3. El método de la reivindicación 1 que comprende además la etapa de congelación de la muestra de semen manipulada.

4. El método de la reivindicación 1, que comprende además una o más de las siguientes etapas de procesamiento: mantener; transportar; tamponar; enfriar; calentar; diluir; concentrar; excitar con un láser; cargar; desviar; ablacionar; recoger; agitar; oscilar; separar magnéticamente; oxigenar; marcar; precipitar; centrifugar; resuspender; mezclar; dializar; crioestabilizar; procesar microchips; y procesar por citometría de flujo.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de procesamiento y la etapa de poner en contacto la muestra de semen teñida con un líquido envolvente comprende además: inyectar la muestra de semen teñida en un flujo de líquido envolvente; exponer la muestra de semen teñida en el flujo de líquido envolvente a una fuente de radiación electromagnética que provoca una respuesta detectable en el colorante selectivo de ADN; detectar la respuesta del colorante selectivo de ADN a la exposición a radiación electromagnética; analizar la respuesta detectada; clasificar los espermatozoides en la muestra de semen basándose en el análisis de la respuesta detectada; y recoger una o más subpoblaciones de espermatozoides viables de la muestra de semen en uno o más medios de recogida basándose en la clasificación del semen.

6. El método de la reivindicación 5, que comprende además la etapa de desviar electromagnéticamente las gotitas que contienen semen basándose en la clasificación.

7. El método de la reivindicación 1, en donde al menos uno del líquido envolvente y los medios de tinción comprende además un antioxidante.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el antioxidante comprende un antioxidante seleccionado del grupo que consiste en: piruvato, vitamina B12; vitámeros de vitamina B12; vitamina E; vitámeros de vitamina E; tocoferol; tocotrienol; a-tocoferilo; alfa-cetoglutarato; derivados de estos y combinaciones de estos.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el líquido envolvente comprende el glicerol en una concentración en vol/vol entre 1 % y 2 %; entre 2 % y 4 %; entre 4 % y 6 %; entre 1 % y 2 %; entre 2 % y 3 %; entre 3 % y 4 %; entre 4 % y 5 %; entre 5 % y 6 %; entre 2 % y 6 %; o entre 3 % y 5 %.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el glicerol se añade a los medios de tinción en una primera cantidad y se añade al líquido envolvente en una segunda cantidad, y en donde la segunda cantidad es mayor que la primera cantidad.

11. El método de la reivindicación 1, en donde el medio de tinción comprende el glicerol en una concentración en vol/vol entre 1 % y 5 %.

12. El método de la reivindicación 1, en donde el medio de tinción comprende el glicerol en una concentración en vol/vol entre 1 % y 2 %; entre 2 % y 3 %; entre 3 % y 4 %; entre 2 % y 4 %; o entre 1,5 % y 3 %.