ES2986604T3

ES2986604T3 - Microvesículas terapéuticas de bacterias probióticas

Info

Publication number: ES2986604T3
Application number: ES20722692T
Authority: ES
Inventors: Stefan Roos; Wolfgang Kunze; John Bienenstock
Original assignee: Biogaia AB
Current assignee: Biogaia AB
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2024-11-12
Anticipated expiration: 2040-04-17
Also published as: CN113747908A; AU2020258788A1; IL287226A; BR112021019663A2; KR20220007609A; US11857582B2; ZA202106518B; EP4410298A2; MY204586A; EP3773648A1; CA3136978A1; CL2021002527A1; KR102855825B1; US20240082325A1; JP7556881B2; IL287226B2; EP4410298A3; MX2021012631A; HUE067741T2; AU2020258788B2

Abstract

Un método para proporcionar microvesículas terapéuticas a partir de bacterias probióticas comprende exponer las bacterias a un tratamiento inductor durante el cultivo para inducir la producción de microvesículas terapéuticas por parte de las bacterias. Las microvesículas terapéuticas pueden utilizarse en el tratamiento, por ejemplo, de cólicos, trastornos o enfermedades gastrointestinales infantiles o infantiles, trastornos de dolor gastrointestinal, enfermedades de pérdida ósea y/o enfermedades periodontales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Microvesículas terapéuticas de bacterias probióticas

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a microvesículas terapéuticas de bacterias probióticas y a los usos de las mismas.

Antecedentes

La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura ha definido los probióticos como “ microorganismos vivos que, cuando se suministran en cantidades adecuadas, transmiten al huésped un beneficio para la salud” . Los probióticos influyen en las funciones inmunitarias del huésped, ya sea a través de la modulación de la composición de la microbiota, a través de la actividad metabólica, o incluso mediante una interacción directa con el sistema inmunológico subyacente a la mucosa intestinal. Más del 60 % de las células inmunitarias se ubican en la mucosa intestinal, y la información de muestreo sobre la estructura y composición de la microbiota se traduce en efectos locales y sistémicos a través de las células inmunitarias circulantes. Después de las interacciones probióticas, los mecanismos inmunológicos pueden activarse como lo refleja la liberación de mediadores inmunitarios, tales como las citocinas, la producción de anticuerpos y la activación de los linfocitos así como de otras células inmunitarias. Estas células activadas, citocinas y/o compuestos liberados por los probióticos ejercerán funciones inmunomoduladoras en diferentes lugares del cuerpo a través de la circulación sanguínea. Los probióticos también pueden prevenir o inhibir la proliferación de patógenos y suprimir la producción de factores de virulencia por parte de los patógenos.

Actualmente se usan varias cepas bacterianas diferentes como probióticos, incluidas las bacterias productoras de ácido láctico, tales como las cepas seleccionadas deLactobacillusyBifidobacterium.La eficacia de las bacterias probióticas depende de la cepa, y cada cepa puede contribuir a la salud del huésped a través de diferentes mecanismos.

Existen numerosas variedades de suplementos probióticos, pero el efecto beneficioso para la salud varía entre las cepas bacterianas y aún se sabe poco sobre las formas de controlar y regular el efecto probiótico o biológico específico. Cada cepa bacteriana tiene mecanismos distintos mediante los cuales se median efectos específicos para mejorar la salud y aliviar los síntomas de, por ejemplo, trastornos gastrointestinales, como la diarrea y el estreñimiento, la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD, por sus siglas en inglés), el síndrome del intestino irritable (IBS, por sus siglas en inglés) y el cólico infantil. El cólico infantil es una afección que puede resultar extremadamente estresante para las familias afectadas y afectar significativamente la calidad de vida. Además, el cólico infantil podría tener consecuencias a largo plazo para los bebés más adelante en la vida. Se ha demostrado que la bien estudiada cepa bacteriana probióticaLactobacillus reuteriDSM 17938 reduce significativamente el tiempo de llanto en bebés con cólico. Sin embargo, el tiempo que tarda en presentarse este efecto no es inmediato, y pueden pasar de una a tres semanas antes de que el bebé se beneficie del tratamiento.

El documento WO 2018/202657 describe el uso de la cepa ATCC BAA-999 deBifidobacterium longumpara el tratamiento o la profilaxis del cólico infantil.

The Journal of Pediatrics (2013) 162(2): 257-262 describe el uso deLactobacillus reuteriDSM 17938 en el tratamiento del cólico infantil.

Archivum Immunologiate et Therapiae Experimentalis (2014) 62(6): 495-500 describe el uso de laL. reuteriATCC PTA 5289 para reducir la respuesta proinflamatoria de las citocinas en pacientes con periodontitis crónica.

Journal of Cellular Physiology (2014), 229(11): 1822-1830 describe el uso deL. retueriATCC PTA 6475 para suprimir la pérdida ósea en un modelo de ratón ovariectomizado durante la menopausia.

La patente núm. US-2013/195765 describe un método para el tratamiento y/o diagnóstico del cáncer, usando microvesículas derivadas de células bacterianas, que es altamente efectivo en la terapia del cáncer con una reducción significativa de los efectos secundarios. Además, se proporciona un método para suministrar un fármaco terapéutico o diagnóstico para una enfermedad, usando microvesículas derivadas de células bacterianas cargadas con el fármaco, tratando y diagnosticando de este modo la enfermedad de forma efectiva y específica.

Frontiers in Microbiology (2017) 8: El artículo 1783 describe queL. caseiBL23 produce las MV que portan proteínas que se han asociado con su efecto probiótico.

La revista FASEB (2014) 29(2): 684-695 describe que la cepaL. rhamnosusJB-1 produce MV y que las MV reproducen las señales bacterianas parentales para hospedar el sistema nervioso entérico e inmunológico.

Por lo tanto, existe una gran necesidad de intervenciones de acción más rápida, así como de unas aún más eficientes para, por ejemplo, reducir el período de malestar y llanto en los niños con cólico.

Resumen de la invención

Un objetivo general de la invención en la presente memoria es proporcionar microvesículas terapéuticas a partir de bacterias probióticas.

Estos y otros objetivos se cumplen con las realizaciones según se describen en la presente memoria.

La presente invención se define en las reivindicaciones independientes. Otras realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes.

Un aspecto de las realizaciones se refiere a un método para producir microvesículas terapéuticas. El método comprende cultivar bacterias de una cepa bacteriana probiótica en un medio de cultivo. La cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacteriumy una combinación de las mismas. El método también comprende exponer las bacterias a un tratamiento biótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de microvesículas terapéuticas por parte de las bacterias. El tratamiento biótico inductor se selecciona del grupo que consiste en cocultivar las bacterias con bacterias de otra cepa bacteriana, cultivar las bacterias en presencia de un medio acondicionado a partir de bacterias de otra cepa bacteriana y una combinación de las mismas. La otra cepa bacteriana es una cepa deBifdobacteriumy la otra cepa bacteriana es diferente de la cepa bacteriana probiótica.

Otros aspectos de las realizaciones se refieren a una composición probiótica que comprende bacterias de una cepa bacteriana probiótica y microvesículas terapéuticas producidas por la cepa bacteriana probiótica o por otra cepa bacteriana probiótica para su uso en el tratamiento de cólicos y/o para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en un trastorno o enfermedad gastrointestinal en bebés o niños, un trastorno de dolor gastrointestinal, una enfermedad de pérdida ósea, una enfermedad periodontal, y una combinación de los mismos. La cepa bacteriana probiótica y la otra cepa bacteriana probiótica se seleccionan del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacteriumy una combinación de las mismas.

Aspectos adicionales de las realizaciones se refieren a una composición probiótica para su uso en el tratamiento de cólicos y/o para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en un trastorno o enfermedad gastrointestinal en bebés o niños, un trastorno de dolor gastrointestinal, una enfermedad de pérdida ósea, una enfermedad periodontal, y una combinación de los mismos. La composición probiótica comprende un componente de acción rápida en forma de microvesículas terapéuticas de bacterias de una cepa bacteriana probiótica. La cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifídobacterium, y una combinaciónde las mismas. La composición probiótica también comprende un componente de acción lenta en forma de bacterias de la cepa bacteriana probiótica o de otra cepa bacteriana probiótica. La otra cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifídobacterium, y una combinaciónde las mismas. El componente de acción rápida y el componente de acción lenta producen juntos un efecto terapéutico prolongado cuando se suministran a un sujeto.

Aún otros aspectos de las realizaciones se refieren a microvesículas terapéuticas aisladas de bacterias de una cepa bacteriana probiótica para su uso en el tratamiento de cólicos y/o para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en un trastorno o enfermedad gastrointestinal en bebés o niños, un trastorno de dolor gastrointestinal, una enfermedad de pérdida ósea, una enfermedad periodontal, y una combinación de los mismos. La cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacterium,y una combinación de las mismas.

Otro aspecto de las realizaciones se refiere a una cepa bacteriana, en donde la cepa bacteriana esBifidobacterium longumDSM 32947 oBifidobacterium longumDSM 32948.

Un aspecto adicional de las realizaciones se refiere a una composición probiótica que comprende bacterias de una cepa deLactobacillus,preferiblemente una cepa deL. reuteri,y más preferiblemente una cepa deL. reuteriseleccionada del grupo que consiste enL. reuteriDSM 17938,L. reuteriDSM 32846 y una combinación de las mismas. La composición también comprende bacterias de una cepa deBifidobacterium longumseleccionada del grupo que consiste enB. longumDSM 32947,B. longumDSM 32948 y una combinación de las mismas, o un medio acondicionado de la cepa deB. longum.

Las microvesículas terapéuticas, producidas por bacterias probióticas, fueron capaces de recapitular los efectos beneficiosos de las bacterias probióticas tal como se muestra en la presente memoria. Además, las microvesículas terapéuticas fueron, de hecho, más eficientes que las bacterias probióticas que las producen, como lo demuestra su presentación más rápida de efectos beneficiosos específicos, como se muestra en los ejemplos.

Breve descripción de los dibujos

Las realizaciones, junto con otros objetivos y ventajas de las mismas, pueden entenderse mejor haciendo referencia a la siguiente descripción conjuntamente con las figuras adjuntas, en las que:

La figura 1 muestra las mediciones de la actividad de la 5'-nucleotidasa en un medio acondicionado después de la exposición delLactobacillus reuteriDSM 17938 a diferentes tratamientos de inducción.

La figura 2 ilustra los efectos de añadir L.reuteriDSM 17938 (DSM) en la figura 2A, medio acondicionado (CM, por sus siglas en inglés) en la figura 2B, medio de cultivo (caldo) en la figura 2C, microvesículas derivadas de DSM (|<j>V) en la figura 2D o medio acondicionado menos microvesículas (Cm-jV) en la figura 2E sobre la velocidad del complejo contráctil propagado (PCC, por sus siglas en inglés) para los segmentos yeyunales de ratón,in vitro.Paneles superiores: gráficos de barras que muestran medias y errores estándar. Los valores P derivados de las pruebastpareadas se muestran por encima de las barras horizontales. Paneles inferiores: representaciones de diferencia de valores individuales (tratamiento y control de Krebs) con intervalos de confianza del 95 % para cada gráfico coincidente en la fila superior. Las figuras 3 a 7 muestran las mismas relaciones entre los paneles superior e inferior.

La figura 3 ilustra los efectos de añadir DSM (figura 3A), CM (figura 3B), caldo (figura 3C), j V (figura 3D) o CM-jV (figura 3E) sobre la frecuencia de PCC para los segmentos yeyunales de ratón,in vitro.

La figura 4 ilustra los efectos de añadir DSM (figura 4A), CM (figura 4B), caldo (figura 4C),<j>V (figura 4D) o Cm-jV (figura 4E) sobre la amplitud pico del PCC para los segmentos yeyunales de ratón,in vitro.

La figura 5 ilustra los efectos de añadir DSM (figura 5A), CM (figura 5B), caldo (figura 5C), j V (figura 5D) o Cm-jV (figura 5E) sobre la velocidad del PCC para los segmentos de colon del ratón,in vitro.

La figura 6 ilustra los efectos de añadir DSM (figura 6A), CM (figura 6B), caldo (figura 6C),<j>V (figura 6D) o CM-jV (figura 5E) sobre la frecuencia de PCC para los segmentos de colon del ratón,in vitro.

La figura 7 ilustra los efectos de añadir DSM (figura 7A), CM (figura 7B), caldo (figura 7C),<j>V (figura 7D) o CM-jV (figura 7E) sobre la amplitud pico de PCC para los segmentos de colon del ratón,in vitro.

La figura 8 ilustra un resumen de los resultados presentados en las figuras 2 a 7 sobre la velocidad, la frecuencia y la amplitud pico del yeyuno y el colon.

La figura 9 ilustra el efecto de las microvesículas sobre la señalización de TrpVI. El gráfico ilustra la respuesta inducida por la capsaicina obtenida usando microvesículas aisladas deL. reuteriDSM 17938 (DSM-MV) y microvesículas aisladas de la cepa bacterianaLactobacillus rhamnosusJB-1 (MV-JB-1).

La figura 10 es un gráfico que ilustra la temporización de la presentación de una respuesta en un modelo de activación nerviosa mesentérica usandoL. reuteriDSM 17938 (DSM) y microvesículas aisladas deL. reuteriDSM 17938 (MV).

La figura 11 ilustra que las microvesículas (MV) derivadas de L. reuteri DSM 17938 son inmunomoduladoras y amortiguan las respuestas de<i>FN-<y>e IL-17A. Evaluación de los efectos inmunomoduladores de las MV purificadas derivadas deL. reuteriDSM 17938 en cultivos de PBMC. (figura 11A) Las PBMC se cultivaron durante 48 h en presencia de las MV deL. reuteri(L.r) a una relación de 500:1, 100:1, y 20:1 (MV:célula), seguidas de la cuantificación de los niveles secretados de IL-6, IL-10, lL-17A e IFN-y (n=8). (figura 11B) Las PBMC se estimularon conStaphylococcus aureus(S.a) -CFS (2,5 %) en presencia de L.r-MV en una relación de 500:1, 100:1 y 20:1 (MV:célula), seguida de la cuantificación de los niveles secretados de IFN-gamma e IL-17A. Se muestran los valores relativos normalizados S.aureus:CFS solo, (n = 8). Los recuadros cubren los datos entre los percentiles 25° y 75°, con las medianas como línea central y las barras de error que muestran del mínimo al máximo. Los gráficos de barras muestran la mediana con un rango intercuartil.

La figura 12 ilustra que las microvesículas derivadas deL. reuteriDSM 17938 yL. reuteriDSM 17938 protegieron la integridad epitelial de los efectos negativos de laEscherichia colienterotoxigénica (ETEC, por sus siglas en inglés).

La figura 13 ilustra la actividad de la 5'-nucleotidasa en muestras de MV obtenidas deL. reuteriDSM 17938 (cultivandoL. reuteriDSM 17938 con la adición de un 4 % de sobrenadante deB. longumATCC BAA-999 oB. longumDSM 32947 en medios SIM (DSM 17938 4 % DSM 32947 sup. o DSM 17938 4 % de ATCC BAA-999 sup.) en comparación con laL. reuteriDSM 17938 en SIM (control) oL. reuteriDSM 17938 con un 4 % de sobrenadante deL. paracaseiLMG-P-17806 (DSM 17938 en SIM o DSM 17938 4 % de LMG-P-17806 sup.)

La figura 14 muestra los mismos resultados que los presentados en la figura 13, pero que se han normalizado en relación con la actividad de la 5'-nucleotidasa y la densidad óptica del DSM 17938 en SIM.

La figura 15 ilustra la actividad de la 5'-nucleotidasa en muestras de control (DSM 17938 en SIM) en comparación con las muestras obtenidas después de inducir un tratamiento biótico cocultivandoL. reuteriDSM 17938 con un 25 % de células deB. longumd Sm 32947. Los resultados se han normalizado en relación con la actividad de la 5'-nucleotidasa y la densidad óptica del DSM 17938 en SIM.

La figura 16 ilustra la actividad de la 5'-nucleotidasa en muestras de MV después de cultivarL. reuteriDSM 32846 con un 4 % de sobrenadante deB. longumDSM 32947 en un medio SIM (DSM 32846 4 % de DSM 32947 sup.) en comparación con el control deL. reuteriDSM 32846 en SIM (DSM 32846 en SIM). Los resultados se han normalizado en relación con la actividad de la 5'-nucleotidasa y la densidad óptica del DSM 32846 en SIM.

La figura 17 ilustra que las microvesículas derivadas de L.reuteriDSM 32846 son más efectivas para inducir la producción de IL-6 en comparación con las microvesículas aisladas de L.reuteriDSM 17938.

Las figuras 18 y 19 ilustran la inducción de IL-6 por MV aisladas de L.reuteriDSM 32846 y L.reuteriDSM 17938 después de cultivarse con un 4 % de sobrenadante a partir de cepas deB. longum,en comparación con muestras de control (DSM 32846 o DSM 17938, respectivamente).

La figura 20 ilustra la producción inducida de IL-6 con MV derivadas deL. reuteriDSM 17938 después del cocultivo con un 25 % de células delB. longumDSM 32947 en comparación con las muestras de control (DSM 17938).

La figura 21 ilustra que las MV derivadas deL. reuteriDSM 32846 fueron parcialmente capaces de proteger la monocapa epitelial de un desafío con la reducción del TEER inducida por ETE<c>. La figura también ilustra el efecto protector de las MV derivadas deL. reuteriDSM 32846 contra el daño causado por la ETEC a la monocapa en un experimento de flujo de FITC-dextrano.

La figura 22 ilustra una comparación entre el efecto protector de las MV derivadas deL. reuteriDSM 32846 en el experimento de flujo de FITC-dextrano y el efecto obtenido con las MV derivadas deL. reuteriDSM 17938. El tratamiento previo de las monocapas de células epiteliales con MV derivadas deL. reuteriDSM 32846 disminuyó la fuga de FITC-dextrano de modo más eficiente, específicamente a concentraciones más bajas de las MV, en comparación con las MV derivadas deL. reuteriDSM 17938.

Descripción detallada

Definiciones

Las microvesículas (MV,<j>V), también denominadas, por ejemplo, vesículas de membrana, vesículas de membrana externa, o vesículas extracelulares en la técnica, son una forma demostrada de comunicación usada por las bacterias y las células eucarióticas. La liberación de MV bioactivas desde la superficie celular se conserva en toda la vida microbiana, en bacterias, arqueas, hongos, y parásitos, y se ha demostrado la producción de MV tantoin vitrocomoin vivo,incluyendo la influencia de estos orgánulos de superficie en la fisiología microbiana y la patogénesis a través de su suministro de importantes moléculas de señalización, enzimas y toxinas. Las MV bacterianas se producen y eliminan regularmente por bacterias Gram positivas y Gram negativas, y los experimentos proteómicos han demostrado que el contenido de tales MV puede ser distinto del contenido de las bacterias parentales. Las M<v>pueden comprender moléculas de lípidos, moléculas de ARN, moléculas de ADN, y/o proteínas. Además, las MV también pueden contener componentes superficiales de la bacteria parental.

Las MV producidas por bacterias probióticas tal como se describen en la presente memoria se denominan MV terapéuticas para indicar que las MV tienen un efecto terapéutico. Este efecto terapéutico de las MV podría ser el mismo o al menos similar al efecto probiótico de las bacterias probióticas que producen las MV, cuando se suministran a un sujeto. Por consiguiente, las MV ejercerán un efecto terapéutico en el sujeto, que inhibirá, tratará o prevendrá, incluyendo retrasar la presentación de una afección, enfermedad o trastorno médico en el sujeto tal como se describe además en la presente memoria.

Un medio de cultivo o medio de crecimiento es el medio de partida, en el que se cultivarán las bacterias.

Un medio acondicionado es un medio de cultivo o de crecimiento, en el que se han cultivado bacterias. Tal medio acondicionado comprende de este modo cualquier compuesto o agente, incluidas las MV, liberadas por las bacterias en el medio de cultivo. Las bacterias se han eliminado del medio de cultivo y por lo tanto no forman parte del medio acondicionado. Puede obtenerse un medio acondicionado, por ejemplo, mediante centrifugación, sedimentación y/o precipitación del cultivo de células bacterianas para obtener el medio acondicionado como un sobrenadante.

Una suspensión celular es la mezcla de bacterias cultivadas y medio de cultivos que incluye cualquier compuesto o agente, tal como las MV, liberadas por las bacterias en el medio de cultivo, es decir, el medio acondicionado. Una suspensión celular es el resultado final de la fermentación.

La cepa bacteriana probiótica es preferiblemente una cepa de bacterias probióticas productoras de ácido láctico, a veces también denominadas bacterias de ácido láctico. Las bacterias productoras de ácido láctico son un grupo de bacterias Gram positivas, con bajo porcentaje de contenido de GC en el genoma, tolerantes a los ácidos, generalmente no esporulantes, no respiratorias, con forma de bastón o cocos que comparten características metabólicas y fisiológicas comunes. Estas bacterias producen ácido láctico como el principal producto final metabólico de la fermentación de carbohidratos. Los géneros que comprenden las bacterias productoras de ácido láctico incluyenLactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, LactococcusyStreptococcus.La bifidobacteria no está incluida en las bacterias del ácido láctico tradicionales debido a su falta de relación genética, pero la bacteria tiene características que se superponen con las bacterias del ácido láctico, y tiene un metabolismo que produce ácido láctico como producto final principal de la fermentación, aunque produce mucho menos ácido láctico que elLactobacillus.Las bifidobacterias son estrictamente anaeróbicas y normalmente se encuentran en abundancia en el intestino grueso.

Las MV producidas por las bacterias probióticas son importantes porque constituyen un medio de comunicación entre las bacterias probióticas y las células huésped circundantes, tales como las células de la mucosa en el cuerpo humano, por ejemplo, las células de la mucosa intestinal del sistema gastrointestinal, la mucosa oral o vaginal. Por lo tanto, las MV pueden transmitir información, tal como la información probiótica, desde las células bacterianas hasta el huésped. Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar la producción de MV terapéuticas a partir de bacterias probióticas que puedan usarse en aplicaciones probióticas y terapéuticas. Los datos experimentales que se presentan en la presente memoria muestran que las MV producidas por bacterias probióticas podrían recapitular los efectos probióticos o terapéuticos de las bacterias probióticas como lo ilustra el efecto de las MV aisladas sobre la señalización del dolor y la motilidad gastrointestinal. Las MV no solo recapitularon los efectos de las bacterias probióticas en la señalización del dolor, sino que en realidad fueron más eficientes, como lo demuestra su capacidad para actuar más rápido que las bacterias probióticas, lo que resulta en una presentación más temprana del efecto observado. Este hallazgo fue muy inesperado. Los datos experimentales que se presentan en la presente memoria también muestran que las MV terapéuticas aisladas de una cepa bacteriana probiótica tenían un efecto inmunoestimulador y eran capaces de amortiguar citocinas específicas relacionadas con enfermedades autoinmunes, y que también protegen la integridad de la barrera epitelial. Los datos experimentales que se presentan en la presente memoria también muestran que la producción de MV puede inducirse mediante un tratamiento biótico durante el cultivo, tal como añadiendo el sobrenadante de otra cepa bacteriana a la cepa bacteriana probiótica o cocultivando la bacteria probiótica con una bacteria de otra cepa bacteriana.

Por lo tanto, la presente invención describe protocolos que pueden usarse para producir MV terapéuticas, y/o para aumentar la producción inherente o endógena de MV terapéuticas.

Un aspecto de las realizaciones comprende un método para producir MV terapéuticas. El método comprende cultivar bacterias de una cepa bacteriana probiótica en un medio de cultivo y exponer las bacterias a un tratamiento biótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de MV terapéuticas por parte de la bacteria. La cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacteriumy una combinación de las mismas. El tratamiento biótico inductor se selecciona, en este aspecto, del grupo que consiste en cocultivar las bacterias de la cepa bacteriana probiótica con bacterias de otra cepa bacteriana, cultivar las bacterias de la cepa bacteriana probiótica en presencia de un medio acondicionado a partir de bacterias de otra cepa bacteriana y una combinación de los mismos. La otra cepa bacteriana es una cepa deBifidobacteriumy la otra cepa bacteriana es diferente de la cepa bacteriana probiótica.

Por lo tanto, en este aspecto, la producción de MV terapéuticas implica cultivar bacterias de la cepa bacteriana probiótica y al mismo tiempo estimular a las bacterias para que produzcan MV terapéuticas exponiendo las bacterias al tratamiento de inducción durante el cultivo para inducir la producción de MV terapéuticas.

Inducir la producción de MV terapéuticas tal como se usa en la presente memoria abarca estimular a las bacterias para que produzcan MV terapéuticas, incluido promover, mejorar o aumentar la producción de MV terapéuticas por parte de las bacterias. Alternativamente, o además, inducir la producción de MV terapéuticas incluye una liberación más eficiente de las MV terapéuticas de las bacterias, resultando de este modo en mayores cantidades de MV terapéuticas liberadas por las bacterias en comparación con cuando las bacterias no están expuestas al tratamiento de inducción. Alternativamente, o además, la producción inducida de MV terapéuticas incluye la producción de MV terapéuticas más potentes o más eficientes por parte de las bacterias. En tal caso, las MV terapéuticas producidas por las bacterias expuestas al tratamiento de inducción tienen un efecto terapéutico mejorado en comparación con las MV producidas por bacterias no estimuladas, es decir, bacterias no expuestas al tratamiento de inducción. Por lo tanto, el tratamiento de inducción de las realizaciones puede usarse para, por ejemplo, aumentar la producción de MV terapéuticas en bacterias de la cepa bacteriana probiótica que ya tienen una producción inherente o endógena de tales MV terapéuticas. En tal caso, el tratamiento de inducción aumenta esta producción de MV inherente o endógena de la bacteria, produciendo más MV terapéuticas cuando se exponen al tratamiento de inducción en comparación con cuando no se exponen al tratamiento de inducción. Inducir la producción de MV terapéuticas también abarca inducir la producción de tales MV terapéuticas en bacterias de una cepa bacteriana probiótica que de otro modo no tienen una producción significativa de MV cuando no se exponen al tratamiento de inducción. Por lo tanto, la producción inductora de MV terapéuticas mediante el tratamiento de inducción abarca tanto el aumento de la producción inherente o endógena de MV terapéuticas en las bacterias como la producción denovo delas MV terapéuticas en las bacterias.

El tratamiento de inducción es, como se describe además en la presente memoria, un tratamiento de las bacterias que induce, incluido el aumento de, la producción de MV terapéuticas por parte de las bacterias. Por lo tanto, al exponer las bacterias a al menos un tratamiento de inducción durante el cultivo según las diversas realizaciones, las bacterias se modifican o inducen para producir MV terapéuticas.

El cultivo de las bacterias puede realizarse según un protocolo de cultivo conocido en un dispositivo de cultivo, fermentador o biorreactor adecuado que incluye, pero no se limita a, biorreactores de tanque agitado, biorreactores de transporte aéreo, biorreactores de fibra hueca y biorreactores del sistema de cultivo celular rotatorio (RCCS, por sus siglas en inglés). Las condiciones de cultivo particulares se seleccionan preferiblemente basado en la cepa bacteriana probiótica particular.

En una realización, el medio de cultivo que comprende las MV terapéuticas y las bacterias probióticas, es decir, la suspensión celular, se conserva, p. ej., mediante deshidratación y/o congelación. Los ejemplos típicos de deshidratación incluyen deshidratación por pulverización, liofilización, liofilización por pulverización y deshidratación al vacío.

La suspensión celular puede concentrarse opcionalmente antes o durante la conservación para reducir el volumen total de la suspensión celular y también para concentrar las células bacterianas, las MV terapéuticas y cualquier otro compuesto o agente presente en esta.

Por ejemplo, la suspensión celular podría concentrarse hasta un volumen correspondiente a desde aproximadamente 5 hasta 95 % del volumen original, tal como el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 % del volumen original.

Pueden emplearse una variedad de métodos y procesos para concentrar la suspensión celular. Por ejemplo, la suspensión celular puede concentrarse eliminando el agua y opcionalmente otras sustancias, tales como ácidos orgánicos, azúcares y sales de la suspensión celular. Puede usarse un dispositivo de filtración que permita que el agua pase principalmente a través de una membrana de filtración. Este proceso se denomina ósmosis y puede ejecutarse en varios modos de operación tal como el modo de ósmosis inversa, el modo de ósmosis directa. En una realización, la concentración también puede realizarse mediante precipitación de la muestra usando productos químicos. La precipitación química puede usarse para concentrar la suspensión celular usando la adición de disolventes o sales desnaturalizantes. También pueden emplearse varios tipos de configuración de cromatografía para la concentración y para separar las muestras de entrada según, por ejemplo, sus propiedades químicas y tamaño por ejemplo. Por ejemplo, la cromatografía de exclusión por tamaño funciona según el principio de separar las muestras según su tamaño, atrapar las moléculas más pequeñas en poros pequeños y excluir las moléculas y partículas más grandes. La cromatografía iónica ayuda a separar las moléculas de ciertas cargas. Por ejemplo, la cromatografía de intercambio aniónico puede usarse para aprovechar la carga negativa neta que se encuentra en las membranas bacterianas y las MV y unirlas a una matriz cromatográfica cargada positivamente. Estas pueden eluirse después aumentando la fuerza iónica de la fase móvil circundante. Otra técnica de concentración es la ultrafiltración. La ultrafiltración se basa en interacciones mecánicas más que químicas. Los dispositivos de filtración pueden tener un límite de peso molecular, lo que significa que todo lo que esté por encima de un cierto peso molecular se retiene, mientras pasa a través de moléculas más pequeñas y sal, etc. Usualmente se emplean membranas con tamaños de poro muy definidos. Este tipo de dispositivos y procesos de ultrafiltración también se emplean en diferentes configuraciones, tal como la filtración de flujo directo (DFF, por sus siglas en inglés) o la filtración de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en inglés). La filtración de flujo tangencial (TFF), también conocida como filtración de flujo cruzado, se diferencia de otros sistemas de filtración en que el fluido pasa paralelo al filtro, en lugar de empujarse a través de una membrana perpendicularmente. Se prefiere este método por su filtración continua y su rendimiento reproducible. Las partículas que atraviesan la membrana, el permeado, se dejan a un lado, mientras que el resto, el retenido, se recicla para volver a la alimentación.

En una realización, las bacterias se exponen al tratamiento de inducción durante el cultivo para inducir, que incluye para mejorar, la producción de las MV terapéuticas y la liberación de las MV terapéuticas en el medio de cultivo. Esto significa que las MV terapéuticas producidas por las bacterias de la cepa bacteriana probiótica tras la exposición al tratamiento de inducción se liberan de la bacteria al medio de cultivo. Además, o alternativamente, al menos algunas de las MV terapéuticas producidas por la bacteria pueden estar asociadas y/o unidas a la membrana celular y/o la pared celular de la bacteria.

En una realización, el método comprende aislar las MV terapéuticas del medio de cultivo, p. ej., de la suspensión celular o del medio acondicionado. En una realización, el aislamiento de las MV terapéuticas comprende exponer el medio de cultivo, p. ej., la suspensión celular, a al menos una centrifugación a una fuerza centrífuga relativa seleccionada dentro de un primer intervalo para obtener un sobrenadante empobrecido en bacterias, es decir, el medio acondicionado, y exponer el medio acondicionado a al menos una ultracentrifugación a una fuerza centrífuga relativa seleccionada dentro de un segundo intervalo para obtener un gránulo que contiene MV. El segundo intervalo es mayor que el primer intervalo.

La primera o al menos una centrifugación a una fuerza centrífuga relativa seleccionada dentro del primer intervalo se realiza para eliminar las bacterias vivas y los residuos grandes del medio de cultivo para formar de este modo un gránulo que se desecha y un sobrenadante que comprende las MV terapéuticas, denominadas medio acondicionado anteriormente. Esta primera etapa del proceso de aislamiento podría incluir una sola etapa de centrifugación, pero preferiblemente comprende al menos dos etapas de centrifugación para eliminar de modo más eficiente las bacterias y los residuos grandes. En el caso de al menos dos etapas de centrifugación, todas pueden realizarse con la misma fuerza centrífuga relativa. Sin embargo, generalmente es más eficiente aumentar la fuerza centrífuga relativa para cada etapa de centrifugación sucesiva. El primer intervalo es preferiblemente de 100*g a 50.000*g, tal como de 200*g a 25.000*g, y preferiblemente de 500*g a 15.000*g. Por ejemplo, una primera etapa de centrifugación puede ser de 4000*g con una segunda etapa de centrifugación a 10.000*g. Alternativamente, podría usarse una sola etapa de centrifugación a 600*g. El sobrenadante también puede, o alternativamente, pasarse a través de un filtro de micrones (de 0,20 |jm a 0,50 |jm, p. ej., 0,45 |jm) para eliminar cualquier residuo y/o bacteria que quede de las centrifugaciones.

El medio acondicionado que comprende las MV terapéuticas se expone a continuación a al menos una ultracentrifugación a la fuerza centrífuga relativa seleccionada dentro del segundo intervalo para obtener un gránulo que contiene la MV. Esta segunda etapa puede comprender una o múltiples etapas de ultracentrifugación. En el caso de múltiples etapas de ultracentrifugación, todas pueden realizarse con la misma fuerza centrífuga relativa o la fuerza centrífuga relativa puede aumentarse como se ha descrito anteriormente. El segundo intervalo es preferiblemente igual a o mayor que 75.000xg, tal como igual a o mayor que 85.000xg, preferiblemente igual a o mayor que 100.000xg. Por ejemplo, puede usarse una fuerza centrífuga relativa de 118.000xg.

En una realización, la etapa de aislamiento también comprende cargar el medio acondicionado en un gradiente de sacarosa o en un cojín de sacarosa y centrifugar a una fuerza centrífuga relativa seleccionada dentro del segundo intervalo.

Además, o alternativamente, el medio acondicionado puede filtrarse antes de la ultracentrifugación. En tal caso, podría usarse un filtro con un tamaño de poro promedio de, por ejemplo, de 0,20 jim hasta 0,50 jim.

Las MV terapéuticas aisladas pueden conservarse, por ejemplo, mediante deshidratación por pulverización, liofilización, liofilización por pulverización o deshidratación al vacío, y/o congelación. En una realización, las MV terapéuticas son estables después de la conservación durante al menos 1 mes, al menos 3 meses, al menos 5 meses o al menos 7 meses.

El tratamiento biótico de inducción se selecciona del grupo que consiste en cocultivar la cepa bacteriana probiótica con bacterias de otra cepa bacteriana, cultivar la cepa bacteriana probiótica en presencia de un medio acondicionado a partir de bacterias de otra cepa bacteriana y una combinación de las mismas. La otra cepa bacteriana es preferiblemente una cepa bacteriana probiótica. Por ejemplo, la otra bacteria podría ser de una cepa deBifidobacterium,preferiblemente una cepa deBifidobacterium longum,y más preferiblemente B.longumDSM 32947 y/o DSM 32948 (depositada por BioGaia AB en virtud del Tratado de Budapest en Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania) el 1 de noviembre de 2018). Las cepas deBifidobacteriumilustradas anteriormente son particularmente útiles en relación con bacterias de una cepa deLactobacilluscomo cepa bacteriana probiótica y, en particular, con bacterias de una cepa deL. reuteri,tal comoL. reuteriDSM 17938 (depositada por BioGaia AB en virtud del Tratado de Budapest en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania) el 30 de enero de 2006) y/oL. reuteriDSM 32846 (depositada por BioGaia AB en virtud del Tratado de Budapest en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Inhoffenstr. 7B, D-38124 Brunswick, Alemania) el 4 de julio de 2018).

En una realización particular, las bacterias de la cepa bacteriana probiótica podrían cocultivarse con bacterias de la otra cepa bacteriana. Alternativamente, o además, podría añadirse un medio acondicionado de bacterias de la otra cepa bacteriana al medio de cultivo que comprende bacterias de la cepa bacteriana probiótica.

En un aspecto, el método también comprende exponer las bacterias a un tratamiento abiótico inductor durante el cultivo para inducir, incluido aumentar, la producción de MV terapéuticas por parte de las bacterias. Por lo tanto, en esta realización, las bacterias están expuestas tanto a un tratamiento biótico de inducción como a un tratamiento abiótico de inducción.

El tratamiento abiótico se refiere al tratamiento con productos químicos y físicos no vivos que afectan a los organismos vivos. El tratamiento biótico se refiere al tratamiento con material biótico, que son organismos vivos, o derivados de organismos vivos.

En un aspecto particular, el tratamiento abiótico es el tratamiento con un factor de estrés abiótico, es decir, un tratamiento abiótico que induce una respuesta de estrés en las bacterias de la cepa bacteriana probiótica cuando se exponen al tratamiento abiótico durante el cultivo. El factor estresante abiótico se selecciona, en un aspecto, del grupo que consiste en estrés oxidativo (tratamiento con oxígeno), estrés por temperatura, estrés por pH, estrés ultravioleta (UV) y una combinación de los mismos.

El tratamiento con oxígeno significa que las bacterias están expuestas a mayores concentraciones de oxígeno. En una realización, el aumento de la concentración de oxígeno es una concentración de oxígeno no tóxica. En una realización particular, exponer bacterias a un tratamiento con oxígeno comprende exponer bacterias anaerobias relativamente tolerantes al oxígeno, bacterias microaerófilas, bacterias aerobias y/o bacterias anaerobias facultativas a concentraciones de oxígeno aumentadas, es decir, concentraciones de oxígeno no tóxicas aumentadas, durante el cultivo para inducir la producción de MV terapéuticas por las bacterias anaerobias relativamente tolerantes al oxígeno, bacterias microaerófilas, bacterias aerobias y/o bacterias anaerobias facultativas.

El tratamiento con oxígeno tal como se usa en la presente memoria no implica la adición de ninguna especie reactiva de oxígeno (ROS, por su siglas en inglés), tales como peróxidos, incluidos el peróxido de hidrógeno, el superóxido, o los radicales hidroxilo.

El aumento de la concentración de oxígeno implica una concentración de oxígeno en el medio de cultivo que es superior a la concentración de oxígeno (normal) que de otro modo se selecciona como óptima, o al menos adecuada, para cultivar bacterias de la cepa bacteriana probiótica, pero no tóxica para las bacterias. En un ejemplo, la concentración no tóxica de oxígeno no provoca una muerte celular bacteriana significativa, lo que significa que las bacterias expuestas siguen siendo viables al menos hasta el 70 %, preferiblemente al menos hasta el 75 %, más preferiblemente al menos hasta el 80 %, tal como al menos hasta el 85 % o el 90 %, o incluso más en comparación con cuando se exponen las bacterias a concentraciones normales de oxígeno. Este aumento en la concentración de oxígeno podría lograrse añadiendo (rociando) oxígeno o aire al medio de cultivo en una o múltiples ráfagas o pulsos, o durante un período de tiempo prolongado. Alternativamente, o además, el aumento de la concentración de oxígeno puede lograrse agitando o agitando el medio de cultivo que comprende las bacterias, incluido el aumento de la cantidad o el nivel de agitación o agitación del medio de cultivo. La concentración de oxígeno, p. ej., la concentración no tóxica, puede variar entre diferentes cepas bacterianas, pero normalmente puede establecerse entre el 0,1 y el 10 %. En una realización, la concentración de oxígeno se establece para que esté entre el 0,5 y el 2 %. En otra realización, la concentración de oxígeno se establece para que esté entre el 2 y el 5 %. En aun otra realización más, la concentración de oxígeno se establece para que esté entre el 5 y el 10 %.

Un aspecto particular comprende un método para producir MV terapéuticas. El método comprende cultivar bacterias de una cepa bacteriana probiótica en un medio de cultivo y exponer las bacterias a un tratamiento oxidativo durante el cultivo para inducir la producción de MV terapéuticas por parte de las bacterias.

Por lo tanto, en este aspecto, la producción de MV se induce, incluso aumenta, en las bacterias al exponerlas a un tratamiento con oxígeno (estrés oxidativo), pero no necesariamente en combinación con la exposición de las bacterias a cualquier tratamiento biótico inductor.

En un aspecto, las bacterias de la cepa bacteriana probiótica se seleccionan del grupo que consiste en bacterias anaerobias relativamente tolerantes al oxígeno, bacterias microaerófilas, bacterias aeróbicas y/o bacterias anaeróbicas facultativas, preferiblemente del grupo que consiste en bacterias aeróbicas y bacterias anaeróbicas facultativas.

Las bacterias se seleccionan del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacteriumy una combinación de las mismas. Las cepas deLactobacillusyBifidobacteriumpreferidas pueden seleccionarse entre los ejemplos ilustrativos descritos a continuación de cepas bacterianas preferidas.

El estrés térmico puede inducirse elevando la temperatura del cultivo por encima de la temperatura normal para cultivar las bacterias en el biorreactor, es decir, el denominado estrés por alta temperatura. Por ejemplo, si la temperatura de cultivo normal es de 37 °C, la temperatura puede aumentarse a al menos 42 °C, al menos 43 °C o al menos 44 °C, y más preferiblemente al menos 45 °C, tal como al menos 46 °C, al menos 47 °C, al menos 48 °C, al menos 49 °C o al menos 50 °C. En lugar de exponer las bacterias a un estrés de alta temperatura, las bacterias pueden exponerse a un estrés de baja temperatura, es decir, reduciendo la temperatura de cultivo por debajo de la temperatura de cultivo normal. Por ejemplo, la temperatura de cultivo podría reducirse a 10 °C, tal como 8 °C o menos, 6 °C o menos, o 4 °C o menos.

El estrés del pH puede inducirse reduciendo el pH del medio de cultivo, en el que se cultivan las bacterias, desde un pH normal o basal hasta un pH ácido o más ácido. Alternativamente, las bacterias pueden retirarse temporalmente del medio de cultivo y, a continuación, exponerse al estrés por pH, añadiendo seguidamente las bacterias expuestas al estrés por pH al medio de cultivo o a un medio de cultivo fresco. Por ejemplo, el pH puede reducirse desde un rango de pH normal de 6,5 a 7 hasta un pH de 2 o menos.

El estrés UV puede inducirse exponiendo las bacterias al tratamiento UV, p. ej., dirigiendo la luz UV al medio de cultivo que comprende las bacterias.

En un aspecto, el método también comprende exponer las bacterias a un agente inductor de estrés durante el cultivo para inducir, incluido el aumento, la producción de MV terapéuticas por parte de las bacterias. Por lo tanto, en esta realización, las bacterias están expuestas tanto a un agente inductor de estrés como a un tratamiento biótico inductor y/o a un tratamiento abiótico inductor.

En un aspecto, el agente inductor de estrés se selecciona del grupo que consiste en fructosa; sacarosa; una lisozima, p. ej., de huevo de gallina, también conocida como muramidasa o N-acetilmuramida glicanhidrolasa; una mucina, p. ej., purificada del intestino porcino; una p-lactama, p. ej., ampicilina, y una combinación de las mismas.

En un aspecto particular, el agente inductor de estrés es la sacarosa. Puede añadirse sacarosa durante el cultivo de las bacterias para inducir la producción de MV por parte de dichas bacterias. Por ejemplo, puede añadirse sacarosa al medio de cultivo para obtener una concentración de sacarosa dentro de un rango del 0,3 % - 10 % en el medio de cultivo, tal como 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 %.

Los ejemplos descritos anteriormente de tratamientos inductores pueden combinarse, tal como combinar múltiples, es decir, al menos dos, tratamientos abióticos, múltiples tratamientos bióticos, tratamientos con múltiples agentes inductores de estrés, al menos un tratamiento abiótico y al menos un tratamiento biótico, al menos un tratamiento abiótico y tratamiento con al menos un agente inductor de estrés, al menos un tratamiento biótico y un tratamiento con al menos un agente inductor de estrés, o al menos un agente abiótico tratamiento ótico, al menos un tratamiento biótico y tratamiento con al menos un agente inductor de estrés.

La duración de la exposición al tratamiento de inducción puede seleccionarse basado en el tipo particular de tratamiento, la cepa bacteriana probiótica particular y las condiciones de cultivo, tal como el tipo de biorreactor. Por ejemplo, las bacterias pueden exponerse a un tratamiento abiótico durante 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1,25 horas, 1,5 horas, 1,75 horas, 2 horas, 2,25 horas, 2,5 horas, 2,75 horas, 3 horas, 3,25 horas, 3,5 horas, 3,75 horas, 4 horas, 4,25 horas, 4,5 horas, 4,75 horas, 5 horas o más, como ejemplos ilustrativos, pero no limitativos. También es posible tener períodos más prolongados de exposición al estrés abiótico, tales como durante la noche, 12 horas, 18 horas, 24 horas, o incluso más. La adición del agente inductor de estrés puede comprender añadir al menos un agente inductor de estrés una vez al medio de cultivo o múltiples veces, es decir, al menos dos veces. La adición de bacterias de otra cepa bacteriana o medio acondicionado de tales bacterias también puede realizarse una vez o varias veces.

La cepa bacteriana probiótica es preferiblemente una cepa de bacterias probióticas productoras de ácido láctico y en particular se selecciona entreLactobacillusyBifidobacterium.LosLactobacillusincluyen L.acetotolerans, L. acidifarinae, L. acidipiscis, L. acidophilus, L. agilis, L. algidus, L. alimentarius, L. amylolyticus, L. amylophilus, L. amylotrophicus, L. amylovorus, L. animalis, L. antri, L. apodemi, L. aviaries, L. bifermentans, L. brevis, L. buchneri, L. camelliae, L. casei, L. catenaformis, L. ceti, L. coleohominis, L. collinoides, L. composti, L. concavus, L. coryniformis, L. crispatus, L. crustorum, L. curvatus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. lactis, L. dextrinicus, L. diolivorans, L. equi, L. equigenerosi, L. farraginis, L. farciminis, L. fermentum, L. fornicalis, L. fructivorans, L. frumenti, L. fuchuensis, L. gallinarum, L. gasseri, L. gastricus, L. ghanensis, L. graminis, L. hammesii, L. hamster, L. harbinensis, L. hayakitensis, L. helveticus, L. hilgardii, L. homohiochii, L. iners, L. ingluviei, L. intestinalis, L. jensenii, L. johnsonii, L. kalixensis, L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. kimchi, L. kitasatonis, L. kunkeei, L. leichmannii, L. lindneri, L. malefermentans, L. mali, L. manihotivorans, L. mindensis, L. mucosae, L. murinus, L. nagelii, L. namurensis, L. nantensis, L. oligofermentans, L. oris, L. panis, L. pantheris, L. parabrevis, L. parabuchneri, L. paracasei, L. paracollinoides, L. parafarraginis, L. parakefiri, L. paralimentarius, L. paraplantarum, L. pentosus, L. perolens, L. plantarum, L. pontis, L. protectus, L. psittaci, L. rennini, L. reuteri, L. rhamnosus, L. rimae, L. rogosae, L. rossiae, L. ruminis, L. saerimneri, L. sakei, L. salivarius, L. sanfranciscensis, L. satsumensis, L. secaliphilus, L. sharpeae, L. siliginis, L. spicheri, L. suebicus, L. thailandensis, L. ultunensis, L. vaccinostercus, L. vaginalis, L. versmoldensis, L. vini, L. vitulinus, L. zeae, y L. zymae.Los ejemplos preferidos de tal cepa bacteriana probiótica incluyenLactobacillus reuteri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus gasseriyLactobacillus plantarum.Los ejemplos actualmente preferidos de tal cepa bacteriana probiótica incluyen cepas deLactobacillus reuteri,tales comoLactobacillus reuteriDSM 17938 yLactobacillus reuteriDSM 32846. Las especies preferidas deBifidobacteriumsonB. ado/escentis, B. breve, B. longum, B. animalis, B. infantis, B. thermophilum, B. bifidum y B. lactis.Otra especie preferida deBifídobacteriumesB. longum.Los ejemplos actualmente preferidos deBifidobacteriumsonB. longumDSM 32947 yB. longumDSM 32948.

L. reuteries un anaerobio tolerante al oxígeno (alternativamente aerotolerante o relativamente tolerante al oxígeno), es decir, solo puede generar ATP por fermentación.

Otros aspectos de las realizaciones se refieren aBifidobacterium longumDSM 32947,Bifidobacterium longumDSM 32948 y composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, composiciones nutricionales, suplementos alimenticios y composiciones probióticas, que comprendenB. longumDSM 32947 y/oB. longumDSM 32948. En una realización particular, la bacteria de la cepa bacteriana, es decir,B. longumDSM 32947 y/oB. longumDSM 32948, está en forma deshidratada o liofilizada.

Los aspectos relacionados incluyen composiciones probióticas que comprenden bacterias de una cepa deBifidobacterium longumseleccionadas del grupo que consiste enB. longumDSM 32947,B. longumDSM 32948 y una combinación de las mismas y bacterias de otra cepa bacteriana probiótica, preferiblemente de una cepa deLactobacillus, y más preferiblemente de un cepa deL. reuteriy, en particular, una cepa deL. reuteriseleccionada del grupo que consiste enL. reuteriDSM 17938,L. reuteriDSM 32846 y una combinación de las mismas.

Otros aspectos incluyen composiciones probióticas que comprenden una cepa bacteriana probiótica, preferiblemente de una cepa deLactobacillus,y más preferiblemente de una cepa deL. reuteri,y en particular una cepa deL. reuteriseleccionada del grupo que consiste enL. reuteriDSM 17938,L. reuteriDSM 32846 y una combinación de las mismas. y medio acondicionado de la cepa deBifidobacterium longumseleccionada del grupo que consiste enBifidobacterium longumDSM 32947,Bifidobacterium longumDSM 32948 y una combinación de las mismas.

Las bacterias comprendidas en la composición probiótica según lo anterior están comprendidas preferiblemente en la composición probiótica como se seca, tal como las bacterias liofilizadas o liofilizadas, deshidratadas por pulverización o liofilizadas o secadas al vacío.

Las bacterias deB. longumDSM 32947 o deB. longumDSM 32948 presentes en las composiciones probióticas descritas anteriormente pueden proporcionarse en forma liofilizada, p. ej., deshidratada por congelamiento (liofilizada), deshidratada por pulverización, deshidratada por congelamiento y pulverización o secada al vacío. Si las composiciones también comprenden bacterias de otra cepa bacteriana probiótica, tal como deL. reuteriDSM 17938 y/oL. reuteriDSM 32846, estas bacterias también pueden proporcionarse en forma deshidratada, tal como en forma deshidratada por congelamiento (liofilizada), deshidratada por pulverización, deshidratada por congelamiento y pulverización o forma deshidratada al vacío, en las composiciones.

La B.longumDSM 32947 y DSM 32948 se han modificado (adaptado o evolucionado) a partir de cepas parentales mediante un proceso de selección de varias etapas para mejorar el crecimiento y reducir el problema de crecimiento heterogéneo. Por lo tanto, B.longumDSM 32947 y d Sm 32948 muestran un crecimiento mejorado. Estas cepas no se encuentran en la naturaleza, ya que se han visto obligadas a evolucionar, es decir, son cepas bacterianas no nativas o de origen no natural.

La selección en varias etapas deBifidobacteriuma partir de muestras clínicas implicó el aislamiento deBifidobacteriumaislado de muestras clínicas en placas de agar MRS. Para mejorar el crecimiento y reducir el problema de crecimiento heterogéneo, las bacterias se sometieron al siguiente procedimiento:

1. Hacer estrías en placas de agar MRS y, después de tres días de cultivo anaeróbico a 37 °C, seleccionar una colonia con buen crecimiento;

2. Inocular la colonia seleccionada en caldo MRS e incubarla a 37 °C en condiciones anaeróbicas;

3. Tomar una muestra y repetir las etapas 1 y 2 hasta que se observen las características deseadas; y

4. Suspender las bacterias en glicerol al 15 % y almacenarlas a -70 °C.

El tratamiento descrito anteriormente mejoró tanto el crecimiento como el problema de la morfología heterogénea de las colonias.

Al exponer las bacterias a al menos un tratamiento de inducción durante el cultivo según la invención, las bacterias se modifican y/o inducen a producir, incluyendo aumentar la producción de, MV terapéuticas y preferiblemente liberan estas M<v>en el medio de cultivo. El tratamiento de inducción se refiere a alteraciones en las condiciones de cultivo, que afectan fuertemente a la producción de MV por parte de las bacterias en comparación con las bacterias no expuestas al tratamiento de inducción durante el cultivo.

Para evaluar y/o medir el aumento de la producción de MV o la eficiencia alterada de las MV que se ha inducido o producido como resultado de diferentes tratamientos de inducción, pueden aplicarse diferentes métodos. Una opción es cuantificar las MV mediante, por ejemplo, un aparato Nanosight o mediante citometría de flujo o mediante el uso de un tinte fluorescente para teñir la membrana y, por lo tanto, cuantificar la cantidad de MV. Por ejemplo, la fluorescencia puede medirse (después del lavado) usando un lector de placas (y comparándolo con una curva estándar). Una forma más sencilla es también hacer una comparación entre el tamaño del gránulo del precipitado o el gránulo después de la centrifugación o medir el peso de los precipitados. Un tamaño de gránulo más grande o un mayor peso de gránulo significa más MV. Otras formas de evaluar la eficacia de las MV son medir la actividad de las MV en modelosin vitrooin vivomás complejos, por ejemplo, como se describe en la sección de ejemplos.

Un proceso metabólico importante en el cuerpo humano es el metabolismo de las purinas, en el que las purinas se metabolizan y descomponen por enzimas específicas. Un ejemplo de tal enzima es la ecto-5'-nucleotidasa (CD73), una 5'-nucleotidasa anclada en la membrana celular, que se considera una enzima clave en la generación de adenosina. Algunas bacterias probióticas tienen un gen de la 5'-nucleotidasa y producen una enzima 5'-nucleotidasa activa y, por lo tanto, son capaces de producir adenosina. La actividad de la 5'-nucleotidasa y, por lo tanto, la producción de adenosina, puede tener lugar extracelularmente, es decir, fuera o sobre la superficie de la bacteria, de modo que puede, por ejemplo, estar presente en el sobrenadante u otro fluido extracelular producido por la bacteria. Por lo tanto, una enzima 5'-nucleotidasa activa puede estar presente en la superficie celular, por ejemplo, en forma de una 5'-nucleotidasa anclada a la pared celular, extracelularmente desde la célula bacteriana, por ejemplo, en el sobrenadante y/o como una 5'-nucleotidasa asociada a la membrana de la MV. Como consecuencia, en este grupo de bacterias, la generación de adenosina y/o la actividad de una 5'-nucleotidasa (EC 3.1.3.5) podrían usarse como marcador para determinar la eficiencia de producción de MV.

Otros modelos posibles incluyen, pero no se limitan a, los modelos que se usan actualmente para evaluar el efecto probiótico de una cepa bacteriana. Por ejemplo, esto incluye modelos preclínicosin vitro,en los que puede medirse la motilidad intestinal o la percepción/señalización del dolor, lo que demuestra, por ejemplo, las molestias típicas relacionadas con los cólicos del lactante y otros trastornos gastrointestinales funcionales. En la presente memoria se usan varios modelos para evaluar los posibles efectos sobre los cólicos infantiles, por ejemplo, los modelos que se describen en los ejemplos 1, 3, 4, 9 y 10. También incluye modelos de estimulación inmunológica basados en células, en los que pueden evaluarse las citocinas seleccionadas. Otro mecanismo, a través del cual las bacterias probióticas ejercen sus efectos, está relacionado con la disminución de la permeabilidad de la mucosa, es decir, con la protección de la integridad de la barrera epitelial. La eficacia de las MV puede, por lo tanto, medirse en un modeloin vitroque desafía la permeabilidad epitelial ETEC(Escherichia colienterotoxigénica). También pueden usarse modelos animales relevantes para investigar los efectos de los diferentes tratamientos inductores y también pueden evaluarse los efectos en un ensayo clínico en humanos.

Las MV terapéuticas pueden administrarse, opcionalmente después de la conservación, a un mamífero, tal como en forma de MV terapéuticas aislados, como una composición probiótica como se describe con más detalle a continuación, o como un medio de cultivo procesado, un medio acondicionado o una suspensión celular, tal como un medio de cultivo seco, que incluye un medio de cultivo liofilizado (liofilizado), deshidratación por pulverización, liofilizado o deshidratación al vacío, medio acondicionado o suspensión celular, a partir del bacterias de la cepa bacteriana probiótica y la cepa bacteriana probiótica.

Una realización se refiere a una composición probiótica que comprende bacterias de una cepa bacteriana probiótica y MV terapéuticas producidas por la cepa bacteriana probiótica o por otra cepa bacteriana probiótica. La cepa bacteriana probiótica y la otra cepa bacteriana probiótica se seleccionan del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacteriumy una combinación de las mismas.

En una realización, la cepa bacteriana probiótica o la otra cepa bacteriana probiótica se ha expuesto a un tratamiento biótico inductor según las realizaciones. Por lo tanto, en una realización, las MV terapéuticas en la composición probiótica se han producido mediante el método para producir MV terapéuticas según las realizaciones. Por lo tanto, en una realización, la composición probiótica comprende bacterias de una cepa bacteriana probiótica y microvesículas terapéuticas producidas por la cepa bacteriana probiótica o por otra cepa bacteriana probiótica al exponer las bacterias de la cepa bacteriana probiótica o la otra cepa bacteriana probiótica a un tratamiento biótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de las microvesículas terapéuticas por parte de la bacteria. La cepa bacteriana probiótica y la otra cepa bacteriana probiótica se seleccionan del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacteriumy una combinación de las mismas. El tratamiento biótico inductor se selecciona del grupo que consiste en cocultivar las bacterias con bacterias de otra cepa bacteriana, cultivar las bacterias en presencia de un medio acondicionado a partir de bacterias de otra cepa bacteriana y una combinación de las mismas. La otra cepa bacteriana es una cepa deBifidobacteriumy la otra cepa bacteriana es diferente de la cepa bacteriana probiótica y la otra cepa bacteriana probiótica.

En una realización, las MV terapéuticas se aíslan de bacterias de una cepa bacteriana probiótica, tal como se ha descrito anteriormente, exponiendo las bacterias a un tratamiento de inducción durante el cultivo y, a continuación, aislando las MV terapéuticas del medio de cultivo. Las MV terapéuticas aisladas pueden añadirse entonces a bacterias aisladas de la misma cepa bacteriana probiótica que se usó para producir las MV terapéuticas. En tal caso, la composición probiótica comprende una mezcla de bacterias aisladas de una cepa bacteriana probiótica y MV terapéuticas aisladas de bacterias de la cepa bacteriana probiótica. En otra realización, la composición probiótica comprende bacterias de una primera cepa bacteriana probiótica y MV terapéuticas aisladas de bacterias de una segunda cepa bacteriana probiótica diferente. En este último caso es posible combinar propiedades o características de diferentes cepas bacterianas probióticas mezclando bacterias aisladas de una cepa bacteriana probiótica con MV terapéuticas aislados de bacterias de otra cepa bacteriana probiótica. También es posible tener una composición probiótica que comprenda bacterias de la primera cepa bacteriana probiótica y MV terapéuticas de bacterias de la primera cepa bacteriana probiótica y MV terapéuticas aisladas de bacterias de la segunda cepa bacteriana probiótica diferente. En otra realización, la composición probiótica comprende una mezcla de al menos una cepa bacteriana y MV terapéuticas de cualquiera de la al menos una cepa bacteriana o producida por otra cepa bacteriana.

Como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, la cepa bacteriana probiótica es preferiblemente una cepa bacteriana probiótica productora de ácido láctico (tal comoLactobacillus),tal como una cepa probiótica deLactobacillus reuteri,y más preferiblementeL. reuteriDSM 17938 y/oL. reuteriDSM 32846.

Los datos experimentales presentados en la presente memoria muestran que las MV terapéuticas, producidas y aisladas a partir de cepas bacterianas probióticas, no solo pudieron recapitular los efectos beneficiosos sobre la motilidad gastrointestinal y la señalización del dolor de las bacterias productoras de MV probióticas. Es importante destacar que estas MV terapéuticas fueron, de hecho, más eficientes que las propias bacterias probióticas, como lo demuestra la presentación más rápida de los efectos beneficiosos de las MV terapéuticas en comparación con las de las bacterias. Los datos experimentales que se presentan en la presente memoria también muestran que las MV terapéuticas aisladas de una cepa bacteriana probiótica tenían un efecto inmunoestimulador. Las MV fueron capaces de reducir citocinas específicas relacionadas con enfermedades autoinmunes, y también se demostró que protegen la integridad de la barrera epitelial. Los datos experimentales revelaron que las MV terapéuticas de los ejemplos pueden usarse para inhibir, tratar o prevenir diversas enfermedades o trastornos que anteriormente se ha demostrado que se inhiben, tratan o previenen mediante el uso de bacterias probióticas. De la misma manera, puede esperarse que las MV terapéuticas, cuando se suministran a un mamífero, produzcan efectos generales y/o específicos similares, y posiblemente también efectos mejorados, en comparación con las bacterias probióticas cuando se suministran a un sujeto, tal como cualquier mamífero. Los datos experimentales que se presentan en la presente memoria también muestran que la producción de MV puede inducirse mediante un tratamiento biótico durante el cultivo, tal como añadiendo sobrenadante de otra cepa bacteriana a la cepa bacteriana probiótica o añadiendo células bacterianas de una cepa bacteriana diferente a la cepa bacteriana probiótica durante el cultivo (denominado cocultivo). Tal tratamiento biótico inductor genera MV más eficientes o potentes en diferentes modelos en comparación con las MV de preparaciones bacterianas no inducidas o no estimuladas.

La presentación más rápida de los efectos beneficiosos, tal como se observa en las MV terapéuticas, puede usarse en la composición probiótica de los ejemplos para lograr un efecto terapéutico prolongado cuando se suministra a un mamífero. Por lo tanto, las MV terapéuticas en la composición probiótica inducen o producen un efecto temprano en el mamífero debido a su presentación más rápido, mientras que las bacterias de la cepa bacteriana probiótica comprendida en la composición probiótica inducen o producen un efecto posterior, pero normalmente prolongado. Además, las MV terapéuticas también pueden producir un efecto terapéutico mejorado en comparación con el efecto terapéutico provocado por las bacterias de la cepa bacteriana probiótica. Esto significa que la composición probiótica de los ejemplos logra efectos terapéuticos significativamente mejorados en el mamífero en comparación con el simple suministro de las bacterias probióticas.

En otras palabras, una composición que comprende tanto células bacterianas probióticas como MV terapéuticas proporciona ventajas sobre las composiciones con células bacterianas probióticas o MV por sí mismas. En una composición que comprende tanto células bacterianas probióticas como MV terapéuticas, la presentación más rápida de los efectos beneficiosos, como se observa con las MV terapéuticas, se combina con los efectos prolongados de las células bacterianas probióticas para mejorar la composición probiótica para una presentación rápida y un efecto terapéutico prolongado cuando se suministra a un sujeto, tal como un mamífero.

Por lo tanto, un aspecto de las realizaciones se refiere a una composición probiótica que comprende un componente de acción rápida en forma de MV terapéuticas de bacterias de una cepa bacteriana probiótica. La cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacteriumy una combinación de las mismas. La composición probiótica también comprende un componente de acción lenta, o prolongada, en forma de bacterias de la cepa bacteriana probiótica productora de MV o de otra cepa bacteriana probiótica. La otra cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacteriumy una combinación de las mismas. El componente de acción rápida y el componente de acción lenta juntos producen, por lo tanto, una presentación terapéutica, mejorada, temprana, y un efecto terapéutico prolongado cuando se suministra a un sujeto.

En una realización, la cepa bacteriana probiótica o la otra cepa bacteriana probiótica se ha expuesto a un tratamiento biótico inductor según las realizaciones. Por lo tanto, en una realización, las MV terapéuticas en el componente de acción rápida de la composición probiótica se han producido mediante el método para producir MV terapéuticas según las realizaciones. Por lo tanto, en una realización, la composición probiótica comprende un componente de acción rápida en forma de microvesículas terapéuticas producidas por bacterias de una cepa bacteriana probiótica al exponer la bacteria a un tratamiento biótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de las microvesículas terapéuticas por parte de la bacteria. La cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacterium,y una combinación de las mismas. El tratamiento biótico inductor se selecciona del grupo que consiste en cocultivar las bacterias con bacterias de otra cepa bacteriana, cultivar las bacterias en presencia de un medio acondicionado a partir de bacterias de otra cepa bacteriana y una combinación de las mismas. La otra cepa bacteriana es una cepa deBifidobacteriumy la otra cepa bacteriana es diferente de la cepa bacteriana probiótica. La composición probiótica también comprende un componente de acción lenta en forma de bacterias de la cepa bacteriana probiótica o de otra cepa bacteriana probiótica. La otra cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacterium,y una combinación de las mismas. La otra cepa bacteriana probiótica es diferente de la otra cepa bacteriana. El componente de acción rápida y el componente de acción lenta producen juntos un efecto terapéutico prolongado cuando se suministran a un sujeto.

En una realización, el componente de acción rápida tiene una presentación más temprana del efecto terapéutico en el sujeto en comparación con el componente de acción lenta. Por lo tanto, la rapidez y la lentitud con respecto al componente de acción rápida y al componente de acción lenta definen las presentaciones relativas del efecto terapéutico inducido por estos componentes. En otras palabras, el componente de acción rápida es un componente de acción más rápida o más rápida en comparación con el componente de acción lenta, que podría considerarse como un componente de acción más lenta o más lenta en comparación con el componente de acción rápida en términos de inducir el efecto terapéutico en el sujeto.

En una realización, el componente de acción rápida está en forma de MV terapéuticas aisladas de bacterias de la cepa bacteriana probiótica.

La discusión presentada anteriormente con respecto al uso de la misma cepa bacteriana probiótica o diferentes cepas bacterianas probióticas para las bacterias y las MV terapéuticas también se aplica a esta realización.

Las composiciones probióticas de las realizaciones pueden usarse como medicamento y, en particular, usarse en el tratamiento de un trastorno gastrointestinal.

Un aspecto de las realizaciones define una composición probiótica que comprende bacterias de una cepa bacteriana probiótica y MV terapéuticas producidas por la cepa bacteriana probiótica o por otra cepa bacteriana para su uso como medicamento y, en particular, para su uso en el tratamiento de cólicos. Un aspecto de las realizaciones también define una composición probiótica que comprende el componente de acción rápida descrito anteriormente y el componente de acción lenta para su uso como medicamento y, en particular, para su uso en el tratamiento de los cólicos.

En una realización, el cólico es un cólico infantil (también denominado cólico infantil).

Otros aspectos de las realizaciones definen la composición probiótica que comprende las bacterias de la cepa bacteriana probiótica y las MV terapéuticas producidas por la cepa bacteriana probiótica o por otra cepa bacteriana o la composición probiótica que comprende el componente de acción rápida y el componente de acción lenta para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en un trastorno o enfermedad gastrointestinal en bebés o niños, un trastorno de dolor gastrointestinal, una enfermedad de pérdida ósea, una enfermedad periodontal, y una combinación de los mismos.

Las MV terapéuticas pueden producirse por bacterias de la misma cepa bacteriana probiótica que se incluye en la composición probiótica. Alternativamente, o además, las MV terapéuticas pueden producirse por bacterias de otra cepa bacteriana probiótica distinta de las bacterias incluidas en la composición probiótica.

En una realización, las bacterias de la cepa bacteriana probiótica en la composición probiótica han estado expuestas al tratamiento biótico inductor según las realizaciones.

Las MV terapéuticas aisladas de bacterias de una cepa bacteriana probiótica pueden usarse en el tratamiento del cólico, tal como el cólico infantil. La cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacteriumy una combinación de las mismas.

Las realizaciones también se refieren a las MV terapéuticas aisladas de bacterias de una cepa bacteriana probiótica que pueden usarse en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en un trastorno o enfermedad gastrointestinal en bebés o niños, un trastorno de dolor gastrointestinal, una enfermedad de pérdida ósea, una enfermedad periodontal, y una combinación de los mismos. La cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacteriumy una combinación de las mismas.

Las MV terapéuticas son preferiblemente de una cepa deLactobacillus reuterie incluso más preferiblemente deLactobacillus reuteriDSM 17938 y/oLactobacillus reuteriDSM 32846.

Las MV terapéuticas aisladas o las MV terapéuticas en la composición probiótica se han producido preferiblemente por bacterias de una cepa bacteriana probiótica expuestas a un tratamiento biótico inductor como se describe en la presente memoria. Una realización se refiere a microvesículas terapéuticas aisladas de bacterias de una cepa bacteriana probiótica expuestas a un tratamiento biótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de las microvesículas terapéuticas por parte de la bacteria. La cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacterium,y una combinación de las mismas. El tratamiento biótico inductor se selecciona del grupo que consiste en cocultivar las bacterias con bacterias de otra cepa bacteriana, cultivar las bacterias en presencia de un medio acondicionado a partir de bacterias de otra cepa bacteriana y una combinación de las mismas. La otra cepa bacteriana es una cepa deBifidobacteriumy en donde la otra cepa bacteriana es diferente de la cepa bacteriana probiótica.

En un aspecto, la composición probiótica y/o las MV terapéuticas pueden usarse como alternativa para tratar un trastorno gastrointestinal. El trastorno gastrointestinal es preferiblemente un trastorno gastrointestinal funcional seleccionado del grupo que consiste en un trastorno esofágico funcional, tal como acidez estomacal funcional, dolor torácico funcional de origen esofágico, disfagia funcional y globo; un trastorno gastroduodenal funcional, tal como dispepsia funcional, aerofagia, eructos excesivos no especificados, náuseas idiopáticas crónicas, vómitos funcionales, síndrome de vómitos cíclicos y síndrome de rumiación; un trastorno funcional del intestino, tal como el síndrome del intestino irritable (SII, por sus siglas en inglés), el estreñimiento funcional, la diarrea funcional y el trastorno funcional del intestino no especificado; síndrome de dolor abdominal funcional, tal como el dolor abdominal funcional (PAF), un trastorno funcional de la vesícula biliar y el esfínter de Oddi, tal como el trastorno funcional de la vesícula biliar, el trastorno del esfínter biliar funcional de Oddi y el trastorno del esfínter pancreático funcional de Oddi; un trastorno anorrectal funcional, tal como la incontinencia fecal funcional, el dolor anorrectal funcional y el trastorno funcional de la defecación; un trastorno gastrointestinal funcional infantil, tal como la regurgitación infantil, el síndrome de rumiación infantil, el síndrome de vómitos cíclicos en los bebés, la diarrea funcional, la disquecia infantil y el estreñimiento funcional.

En una realización particular, el trastorno gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en un trastorno de la motilidad gastrointestinal, dolor gastrointestinal, cólico, síndrome del intestino irritable, y estreñimiento.

En un aspecto, el trastorno o enfermedad gastrointestinal del bebé o del niño es un trastorno o enfermedad gastrointestinal del bebé, tal como un trastorno o enfermedad gastrointestinal funcional del bebé. En una realización particular, el trastorno o enfermedad gastrointestinal infantil se selecciona del grupo que consiste en un trastorno de la motilidad gastrointestinal infantil, dolor gastrointestinal infantil, cólico infantil, síndrome del intestino irritable infantil, intolerancia alimentaria en bebés, estreñimiento infantil, diarrea infantil, regurgitación infantil, síndrome de rumiación infantil, disquecia infantil, estreñimiento funcional en bebés y una combinación de los mismos.

En otro aspecto particular, el trastorno o enfermedad gastrointestinal infantil se selecciona del grupo que consiste en cólicos infantiles o intolerancia alimentaria en bebés y una combinación de los mismos.

En otro aspecto particular, el trastorno o enfermedad gastrointestinal infantil es un trastorno de la motilidad gastrointestinal infantil, preferiblemente estreñimiento infantil y/o diarrea infantil y una combinación de los mismos.

En otro aspecto particular, el trastorno o enfermedad gastrointestinal infantil es un trastorno de la motilidad gastrointestinal infantil y/o un cólico infantil.

En un aspecto, el trastorno o enfermedad gastrointestinal en bebés o niños es un trastorno o enfermedad gastrointestinal infantil, tal como un trastorno o enfermedad gastrointestinal funcional infantil.

En un aspecto particular, el trastorno o enfermedad gastrointestinal infantil se selecciona del grupo que consiste en regurgitación infantil, síndrome de rumiación infantil, diarrea funcional en niños, disquecia infantil, estreñimiento funcional en niños y una combinación de los mismos.

En otro aspecto particular, el trastorno gastrointestinal infantil se selecciona del grupo que consiste en regurgitación infantil, disquecia infantil y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el trastorno de dolor gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en dolor abdominal funcional (FAP, por sus siglas en inglés), dolor tipo cólico abdominal, dolor abdominal recurrente frecuente (FRAP, por sus siglas en inglés), y una combinación de los mismos.

En un aspecto, la enfermedad de pérdida ósea se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis, osteopenia, y una combinación de las mismas.

En un aspecto, las composiciones probióticas son para su uso en el tratamiento de la osteoporosis u osteopenia.

En un aspecto, la enfermedad periodontal se selecciona del grupo que consiste en periodontitis, gingivitis y una combinación de las mismas.

En otro aspecto, las composiciones probióticas son para su uso en el tratamiento de la periodontitis.

En aspecto particular adicional, el trastorno de la motilidad gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en distensión abdominal, obstrucción recurrente, dolor tipo cólico abdominal, estreñimiento, enfermedad por reflujo gastroesofágico, vómitos recurrentes e intratables, diarrea, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), incontinencia fecal, dolor abdominal recurrente frecuente (FRAP), regurgitación o intolerancia alimentaria. Las realizaciones también se refieren al uso de una composición probiótica o MV terapéuticas aisladas de una cepa bacteriana probiótica como medicamento y a un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno gastrointestinal.

La descripción abarca además un método para inhibir, tratar o prevenir un trastorno gastrointestinal. El método comprende administrar una composición probiótica o MV terapéuticas aisladas de una cepa bacteriana probiótica a un sujeto para inhibir, tratar o prevenir el trastorno gastrointestinal.

Los datos experimentales que se presentan en la presente memoria también muestran que las MV terapéuticas aisladas de una cepa bacteriana probiótica tenían un efecto inmunoestimulador y eran capaces de amortiguar la secreción de IFN-gamma e IL-17A. También se observaron efectos en el aumento de la secreción de IL-6. Por lo tanto, tales MV terapéuticas pueden usarse como moduladores de la inmunidad humana.

Las composiciones probióticas de la invención y/o las MV terapéuticas según la invención podrían usarse para amortiguar o reducir la cantidad de las citocinas IFN-gamma y/o IL-17A cuando se suministran a un sujeto. Por consiguiente, las composiciones probióticas y/o las MV terapéuticas pueden usarse para inhibir, tratar o prevenir enfermedades caracterizadas por la expresión aberrante de IFN-gamma y/o IL-17A, incluidas las enfermedades inflamatorias, autoinflamatorias y autoinmunes. En una realización particular, la enfermedad inflamatoria, autoinflamatoria y autoinmune se selecciona del grupo que consiste en SLE, MCTD, RA, SS, DM, SSc, EM, psoriasis, pérdida ósea, osteoporosis, osteopenia, periodontitis, gingivitis, sarcopenia, caquexia, malnutrición y alergia, tales como AD, AR, y asma, así como intolerancia alimentaria y alergia.

Las composiciones probióticas de la invención y/o las MV terapéuticas según la invención podrían usarse para aumentar la secreción de la citocina IL-6 cuando se suministran a un sujeto. La IL-6 es una citocina pleiotrópica con una variedad de funciones en el cuerpo. La mayoría de estas funciones y procesos están relacionados con las respuestas inflamatorias, sin embargo, estas funciones y respuestas son importantes, p. ej., para la protección contra los patógenos. Sin embargo, los procesos proinflamatorios en el cuerpo tienen que estar bien equilibrados y también se ha descrito queL. reuteriDSM 17938 aumenta la cantidad de células T reguladoras (p. ej., Liu, Y., Fatheree, N. Y., Dingle, B. M., Tran, D. Q. y Rhoads, J. M. (2013). ElLactobacillus reuteriDSM 17938 cambia la frecuencia de las células T reguladoras de Foxp3+ en el intestino y el ganglio linfático mesentérico en la enterocolitis necrosante experimental. PloS One, 8(2), e56547. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0056547). Un aumento de la expresión de la IL-6 en combinación con una mayor frecuencia de células T reguladoras podría ser una forma de hacer que el sistema inmunológico esté más alerta y mejorar la protección contra las infecciones sin aumentar el riesgo de inflamación. Por consiguiente, las composiciones probióticas y/o las MV terapéuticas pueden usarse para equilibrar los procesos antiinflamatorios y proinflamatorios del sistema inmunológico.

LaEscherichia colienterotoxigénica (ETEC) es un tipo de E.coliy una de las principales causas bacterianas de diarrea en los países en desarrollo, así como la causa más común de diarrea del viajero. Se estima que cada año se producen aproximadamente 157.000 muertes, en su mayoría en niños, a causa de la ETEC. Las principales características de la ETEC son la expresión de una o más enterotoxinas y la presencia de fimbrias que se usan para unirse a las células intestinales del huésped.

Los datos experimentales que se presentan en la presente memoria muestran que las MV terapéuticas aisladas de una cepa bacteriana probiótica protegieron la integridad de la barrera epitelial del efecto perjudicial de la ETEC, que es un modelo para estudiar los efectos de la permeabilidad epitelial. La función principal de la barrera intestinal es regular la absorción de nutrientes, electrolitos y agua del lumen a la circulación y, por otro lado, evitar el paso de microorganismos patógenos y sustancias luminales tóxicas a la circulación, por lo que una barrera intacta es esencial para obtener un estado saludable. Una barrera intestinal alterada se asocia con varias enfermedades y afecciones diversas, tales como el síndrome del intestino irritable (SII), la enfermedad de Crohn, la depresión, los trastornos del espectro autista, la enfermedad diverticular, la periodontitis, la osteopenia y la osteoporosis.

También se ha informado de que las alteraciones de la barrera intestinal pueden ser el principal impulsor de varias características caquécticas (Bindels y col. (2018)).

La integridad de la barrera epitelial no solo es importante en el intestino, sino que una barrera intacta también es importante en la cavidad oral, por ejemplo. El epitelio gingival es el primero en la línea de defensa de la cavidad oral contra el ataque microbiano. Si se interrumpen, las bacterias acceden colectivamente al tejido conectivo subyacente, lo que puede provocar inflamación y destrucción del aparato de unión del diente (DiRienzo (2014)). En consecuencia, las composiciones probióticas y/o las MV terapéuticas pueden usarse para inhibir, tratar o prevenir enfermedades o afecciones que causan una alteración en la integridad de la barrera epitelial, es decir, la disfunción de la barrera epitelial, que incluye el SII, la enfermedad de Crohn, la caquexia, la osteopenia, la osteoporosis, la gingivitis, la periodontitis, la depresión, los trastornos del espectro autista, la enfermedad diverticular y/o la inhibición, el tratamiento o la prevención de la infección por ETEC y para inhibir, tratar o prevenir la diarrea y/o la enfermedad de los viajeros diarrea causada por ETEC u otras bacterias patógenas.

La presentación más rápida del efecto médico o probiótico, tal como se observa en las MV terapéuticas en comparación con las bacterias probióticas, podría ser útil en el tratamiento de sujetos que padecen una enfermedad o trastorno, tal como un trastorno gastrointestinal, una enfermedad inflamatoria, autoinflamatoria o autoinmune, una disfunción de la barrera epitelial, una infección por ETEC, diarrea y/o diarrea del viajero. Esto significa que al suministrar las MV terapéuticas o una composición probiótica que comprenda tales MV terapéuticas, puede obtenerse una presentación más rápida del efecto terapéutico, tal como médico o probiótico, en comparación con simplemente suministrar las bacterias probióticas. Los diferentes tiempos en las presentaciones de los efectos médicos o probióticos, tal como se observa entre las MV terapéuticas y las bacterias probióticas, también pueden usarse, como se ha mencionado anteriormente, para lograr un efecto médico o probiótico prolongado en el sujeto. Por lo tanto, las MV terapéuticas administradas al sujeto contribuirán a un efecto terapéutico rápido o inmediato en el sujeto, mientras que las bacterias probióticas administradas, ya sea por separado o junto con las MV terapéuticas, al sujeto contribuirán a un efecto terapéutico más lento o retrasado en el sujeto. Como consecuencia, al administrar al sujeto tanto las MV terapéuticas como las bacterias probióticas, ya sea por separado o juntas, puede obtenerse un efecto médico o probiótico prolongado, es decir, tanto inmediato como retardado.

Puede seleccionarse un modo apropiado de administración y formulación de la composición probiótica o las MV terapéuticas basado en la enfermedad o trastorno. Un modo preferido de administración es oral. Otros modos de administración incluyen administración nasal, intraocular, tópica o alguna otra forma de administración local a la piel, recto, nariz, ojos, vagina o encías, o inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular. Las dosis adecuadas de la composición probiótica o de las VM terapéuticas definidas en la presente memoria pueden elegirse fácilmente en función de la enfermedad o trastorno que se vaya a tratar, del modo de administración y de la formulación de que se trate. Por ejemplo, se elige un régimen de dosificación y administración para asegurar que las VMs terapéuticas o la composición probiótica, administradas al sujeto según la presente invención puedan dar como resultado efectos terapéuticos, efectos profilácticos o beneficios para la salud deseados. Por lo tanto, preferiblemente, la dosificación es una dosificación terapéutica o profilácticamente efectiva que es adecuada para el tipo de sujeto y enfermedad que se está tratando. Por ejemplo, pueden usarse dosis diarias de 104 a 1010, por ejemplo de 105 a 109, o de 106 a 108, o de 108 a 1010 CFU totales de bacterias. Una dosis diaria preferida es de aproximadamente 108 CFU totales, p. ej., de 107 a 109 o de 108 a 109 CFU totales de bacterias. Por ejemplo, pueden usarse dosis diarias de 104 a 1014, por ejemplo, de 105 a 1013, o de 106 a 1012, o de 108 a 1012 o de 1010 a 1012, o 1010 a 1014 de número total de MV terapéuticas. Una dosis diaria preferida es de aproximadamente 1010 MV terapéuticas, p. ej., 109 a 1011 o 1010 a 1011 de MV terapéuticas. Otra dosis diaria preferida es<aproximadamente 109 del número total de>M<v terapéuticas, p. ej., de 108 a 1010 de MV terapéuticas. Otra dosis diaria>preferida es aproximadamente 108 del número total de MV terapéuticas, p. ej., de 107 a 109 de MV terapéuticas. Otro ejemplo sería usar las MV producidas por un número fijo de bacterias, tal como 108 o 109 CFU de bacterias.

La presente descripción también se refiere a métodos para inhibir, tratar o prevenir el cólico, en particular el cólico en bebés, y/o una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en un trastorno o enfermedad gastrointestinal en bebés o niños, un trastorno de dolor gastrointestinal, una enfermedad de pérdida ósea, una enfermedad periodontal, y una combinación de los mismos en un sujeto. El método comprende suministrar al sujeto una composición probiótica y/o MV terapéuticas según la invención.

Inhibir una enfermedad o trastorno, tal como se usa en la presente memoria, abarca retrasar la presentación de la enfermedad o trastorno, o un síntoma asociado con la enfermedad o trastorno.

El sujeto es preferiblemente un sujeto mamífero, y más preferiblemente un sujeto humano.

Los ejemplos descritos en la presente memoria describen protocolos para la producción y el aislamiento de MV terapéuticas a partir de la cepa bacterianaL. reuteríDSM 17938, bien estudiada, con el propósito de investigar y usar el efecto probiótico de la cepa bacteriana probiótica y sus MV terapéuticas. El efecto probiótico de las MV aisladas se comparó con el de la bacteria completa. Se descubrió que las MV son capaces de recapitular los efectos beneficiosos de toda la bacteria en un modelo exvivopara estudiar la motilidad gastrointestinal y en un modelo¡n vitropara estudiar la señalización del dolor. Sorprendentemente, las MV no solo recapitularon el efecto probiótico bacteriano, sino que fueron incluso más eficientes en comparación con las bacterias completas, como lo demuestra su capacidad para actuar más rápido en un modelo de señalización nerviosa, lo que resultó en una presentación más temprana del efecto observado. Para reforzar aún más los resultados, se investigó otra cepa de L.reuteri(L.reuteriDSM 32846), que también mostró efectos similares. Además, el efecto deL. reuteriDSM 17938 yL. reuteriDSM 32846 podría mejorarse aún más si se sometieran a la bacteria a tratamientos de inducción, incluidos experimentos de cocultivo con otras cepas bacterianas o con medio acondicionado de otras cepas bacterianas, lo que aumentaba la capacidad de las bacterias para producir y liberar MV.

Para estudiar las MV terapéuticas de cepas bacterianas probióticas y su efecto en diferentes modelos fisiológicos, se aislaron fracciones de MV aisladas mediante el cultivo de bacterias seguido del aislamiento de las MV liberadas. Los inventores han identificado formas mejoradas de cultivar bacterias probióticas para aumentar la producción de MV que retienen y también muestran una actividad biológica mejorada.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Alteración de la actividad enzimática asociada con la producción de MV

ElLactobacillus reuteriDSM 17938 se cultivó y se sometió a diferentes tratamientos de inducción en momentos específicos. La respuesta a estos tratamientos inductores se determinó mediante un ensayo enzimático y se comparó con la respuesta obtenida con los tratamientos de control. Los tratamientos inductores implicaron inducir estrés en las bacterias durante su fase de crecimiento y, a continuación, se midió el efecto sobre la actividad enzimática en el medio acondicionado bacteriano.

Materiales y métodos

Cultivo/recolección de muestras

L. reuteriDSM 17938 se inoculó a partir de material congelado en 25 ml de medio Man-Rogosa-Sharpe (MRS) en condiciones de cultivo normales, es decir, se cultivó anaeróbicamente a 37 °C durante la noche. A continuación, la bacteria (20 ml) se volvió a inocular en 200 ml de MRS y se aplicaron diferentes tratamientos de inducción, como se describe con mayor detalle a continuación. Las muestras bacterianas se centrifugaron a 5000*g durante 10 min, los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo y a continuación se centrifugaron a 10000*g durante 10 min. Los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 0,45 pm y se mantuvieron en hielo antes de seguir centrifugándolos con una ultracentrífuga a 32.000 rpm a 4 °C durante 3 h (rotor Beckman SW 32 Ti, balde pendular, tubos de 30 ml). Los sobrenadantes se desecharon (se vertieron suavemente, con la ayuda de una pipeta). Los gránulos se resuspendieron cuidadosamente en medios de resuspensión (solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés)). El volumen de resuspensión varió, entre 100-300 pl, según el tamaño del gránulo. Las muestras se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70 °C.

Tratamiento con oxígeno

El aumento de las concentraciones de oxígeno (estrés oxidativo) se simuló mediante una agitación intensa del cultivo bacteriano. La simulación del estrés oxidativo se mantuvo en agitación continua durante 24 horas.

Tratamiento a alta temperatura

El estrés inducido por la temperatura se indujo elevando la temperatura de T = 37 °C a T = 50 °C en el punto temporal en el que la densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) alcanzó una absorbancia de aproximadamente 1,6 y se mantuvo a T=50 °C durante 20 minutos. Después de este tratamiento a alta temperatura, las bacterias se cultivaron en condiciones normales a T=37 °C. El tiempo total de cultivo fue de 24 horas.

Cambio en el tratamiento del pH

El estrés inducido por el pH se indujo al reducir el pH de pH 6,5 a pH 2 en el momento en que la densidad óptica (OD) alcanzó una absorbancia de aproximadamente 1,6. El cambio de pH se obtuvo haciendo girar las células bacterianas hacia abajo y añadiendo jugo gástrico simulado al sedimento bacteriano para alcanzar un pH 2. El pH reducido se mantuvo durante 10 minutos antes de volver a añadir el sobrenadante a las células bacterianas para normalizar el pH a 6,5. El tiempo de cultivo varió debido a que se tomaron dos muestras diferentes. Se nombraron de modo diferente como se muestra en la figura 1. pH: La muestra se tomó después de 24 h de tiempo de cultivo; pH líquido gástrico: La muestra se tomó directamente después de 10 minutos de inducción del fluido gástrico.

Tratamiento de cocultivo

En este tratamiento,L. reuteriDSM 17938 se cocultivó conBifidobacterium longumDSM 32947 yB. longumDSM 32948 en SIM (medio intestinal simulado, receta como se describe más adelante) mediante la adición de sobrenadante, es decir, medio acondicionado, deB. longumDSM 32947 oB. longumDSM 32948. Como control,L. reuteriDSM 17938 se cultivó en SIM.

Tabla 1: receta para el SIM (medio intestinal simulado)

Medio intestinal simulado (por litro)

2 g de triptona (Oxoid)

2 g de extracto de levadura

1,0 g de NaCl

0,5 g de K<2>HPO<4>

0,5 g de KH<2>PO<4>

0,1 g de MgSO<4>x7 H<2>O

0,01 g de CaC<b>*2 H<2>O

5,58 g de MOPS

1 ml de Tween 80

2,5 mg de Hemin (1,0 mg/ml, 2,5 ml; disuelto en NaOH 0,05 M)

1 mg de vitamina K (vitamina K<2>; 2 mg/ml, 0,5 ml; disuelto en etanol)

0,4 g de cisteína-HCl

0,5 g de bilis (porcina)

0,005 g de FeSO<4>x7 H<2>O

0,05 g de MnSO<4>

100 ng de CoC<b>x6 H<2>O (100 pg/ml, 1 ml)

El pH se ajustó a 6,8; autoclave a 121 °C por 15 minutos. Antes de la inoculación se añadieron soluciones estériles filtradas de azúcar y aceptores de electrones. Concentraciones finales: 15 mM de cada uno. Azúcar: Galactooligosacáridos (GOS) o glucosa. Aceptor de electrones: Citrato, 1,2-propanodiol o fructosa.

Actividad enzimática

Las muestras obtenidas de los tratamientos inductores anteriores se descongelaron y después se probaron en un ensayo de actividad de 5'-nucleotidasa usando el kit de ensayo de 5'-nucleotidasa Crystal Chem (Crystal Chem, Elk Grove Village, IL, EE. UU.). En resumen, el procedimiento se llevó a cabo en dos etapas. En primer lugar, se añadió el reactivo 1 (CC1) que contenía AMP a las muestras sobrenadantes para convertir el AMP en adenosina mediante cualquier enzima 5'-nucleotidasa presente en las muestras sobrenadantes. La adenosina se hidrolizó posteriormente en inosina e hipoxantina por los componentes del reactivo 1. En la segunda etapa, se añadió el reactivo 2 (CC2) para convertir la hipoxantina en ácido úrico y peróxido de hidrógeno, que se usó para generar un colorante quinona que se midió cinéticamente a 550 nm en un espectrofotómetro. La actividad de la 5'-nucleotidasa en las muestras se determinó calculando el cambio de absorbancia entre 3 y 5 minutos y comparándolo con el valor de una muestra de calibrador.

Resultados

Como puede verse en los resultados presentados en la figura 1, la actividad de la 5'-nucleotidasa aumentó mediante el tratamiento con oxígeno (DSM 17938+02) y el cocultivo deL. reuteriDSM 17938 yB. longumDSM 32947 oB. longumDSM 32948 en medios SIM (DSM 17938+DSM 32947 en SIM o DSM 17938+DSM 32948 en SIM).

Otros tratamientos inductores no indujeron ningún aumento en la actividad de la 5'-nucleotidasa en comparación con elL. reuteriDSM 17938 cultivado como control (DSM 17938 en medios MRS o DSM 17938 en medios SIM).

Ejemplo 2 - Las condiciones de cultivo específicas están asociadas con un aumento de la producción de MV ElLactobacillus reuteriDSM 17938 se cultivó y se sometió a diferentes tratamientos de inducción. La cantidad de MV producida como resultado de estos tratamientos de inducción se determinó mediante un análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA, por sus siglas en inglés) y los resultados se compararon con la respuesta obtenida con los tratamientos de control. Los tratamientos de inducción implicaron el tratamiento con oxígeno y el tratamiento con sacarosa, y el efecto sobre la producción de MV se midió a continuación en el medio acondicionado bacteriano. Materiales y métodos

Tratamiento con oxígeno

L.reuteriDSM 17938 se cultivó en condiciones de cultivo normales, es decir, se cultivó anaeróbicamente en medio de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) a 37 °C en una botella/matraz. El tratamiento con oxígeno se indujo mediante agitación intensa del cultivo bacteriano durante 24 horas. Como control, elL. reuteriDSM 17938 se cultivó en condiciones de cultivo normales, es decir, se cultivó anaeróbicamente en medio MRS a 37 °C en una botella/matraz sin aumentar la concentración de oxígeno (sin tratamiento con oxígeno).

Tratamiento con sacarosa

L. reuteriDSM 17938 se cultivó en condiciones de cultivo normales, es decir, se cultivó anaeróbicamente en medio portador de Lactobacillus (LCM) a 37 °C en una botella/matraz. El estrés se indujo añadiendo sacarosa (concentración final del 2 % en LCM) al cultivo bacteriano al inicio de la fermentación. El tiempo total de cultivo fue de 24 horas. Como control,L. reuteriDSM 17938 se cultivó en condiciones de cultivo normales con la adición de glucosa al 2 % en lugar de sacarosa al 2 %. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)

La caracterización fisicoquímica del MV se investigó mediante el uso de la NTA. Las MV se diluyeron adecuadamente con PBS libre de partículas (filtrado a 0,02 pm) para obtener una concentración dentro del rango de medición recomendado (1-10*10® partículas/ml), y se rastrearon directamente mediante el sistema NanoSight NS300 (tecnología NanoSight™, Malvern, Reino Unido). El análisis se llevó a cabo según la siguiente configuración instrumental:

1. Carga de muestras: Cargar la muestra con una bomba de jeringa en la placa superior de la junta tórica, que estaba montada en el módulo láser (haz láser de 488 nm).

2. Medición de la muestra: Tras optimizar la imagen, los vídeos se recopilaron a 25 °C con una cámara sCMOS de alta sensibilidad y se analizaron con el software NTA (versión 3.2) después de capturarlos en modo de control de guión (3 vídeos de 90 s por medición) usando una bomba de jeringa a una velocidad 50.

3. Análisis de muestras: Las muestras se capturaron y analizaron mediante la aplicación de ajustes optimizados para el instrumento, que es la mejor visualización de las partículas mediante la aplicación de ajustes de software (nivel de cámara, enfoque y umbral de detección) para optimizar los resultados del análisis con respecto a diferentes muestras. Otros ajustes, tales como el desenfoque, la longitud mínima de la pista y el tamaño mínimo esperado, se establecieron en «automático» y la viscosidad en 0,890 cP. El software de la NTA se optimizó y a continuación rastreó cada partícula sobre una base de cuadro por cuadro, y su movimiento browniano se rastreó y midió cuadro a cuadro mediante la captura de un archivo de vídeo. El software rastreó muchas partículas de forma individual y, usando la ecuación de Stokes-Einstein calculó sus diámetros hidrodinámicos. Se grabaron varios vídeos de 90 s de duración que generaron histogramas replicados que se promediaron para cada muestra.

Resultados

Tanto el tratamiento con oxígeno como la adición de sacarosa dieron como resultado un aumento en la producción de MV en comparación con los controles correspondientes, véase la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2 - Producción de MV

Ejemplo 3 - Las microvesículas bacterianas aisladas recapitulan el efecto de las bacterias sobre la motilidad intestinal Materiales y métodos

Animales

Se adquirieron ratones Swiss Webster machos adultos (6-8 semanas) de Charles River Laboratories (Wilmington, MA,<EE. u>U.).<Los animales se alojaron 4-5/jaula en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se les proporcionó alimento y>aguaad libitum.Los procedimientos posteriores se realizaron in vitro, después de una dislocación cervical, según la Junta de Investigación Ética Animal de McMaster (AREB, por sus siglas en inglés) (permiso 16-08-30).

Grabaciones de baños de flotación de tejidos

Las grabaciones de baños de flotación de tejidos se realizaron como se describe en Wu y col. (2013). Se extrajeron segmentos de yeyuno y colon de al menos cuatro centímetros de largo y se montaron en un baño de flotación tisular de 20 ml lleno de Krebs oxigenados a 34 °C. El extremo oral de los segmentos se canuló y los contenidos se purgaron del lumen mediante perfusión por gravedad con Krebs gaseados con carbono usando botellas Mariotte. Una vez despejado, el extremo anal de los segmentos se canuló hasta el tubo del flujo de salida de silicio. El compartimento intraluminal se perfundió con Krebs a temperatura ambiente a 5 ml/min. El compartimento seroso se perfundió con Krebs gaseados con carbono calentado a 34 °C a una velocidad de 2 ml/min. El Krebs oxigenado estaba compuesto por (mmol L_1): NaCl 118, KCI 4,8, NaHCOs 25, NaH2PO41,0, MgSO41,2, glucosa 11,1 y CaCb 2,5 burbujeados con carbógeno (95 % de O<2>- 5 % de CO<2>). Antes del registro, la presión intraluminal se ajustó a 2-3 hPa aumentando y disminuyendo las alturas de los tubos de entrada y salida. Los tratamientos se aplicaron abriendo y cerrando las válvulas de paso respectivas para detener el flujo intraluminal de Krebs y comenzar el flujo de bacterias. ElL. reuteri_DSM 17938 se aplicó a una concentración de 8 unidades logarítmicas formadoras de colonias (CFU) /ml. El medio acondicionado de L.reuteriDSM 17938, las microvesículas producidas porL. reuteriDSM 17938 y el medio acondicionado con las microvesículas eliminadas se aplicaron a concentraciones iguales a las de las bacterias completas.

Grabación de vídeo

Los vídeos se grabaron usando una cámara web de vídeo de JVC colocada a 7 cm por encima del segmento de tejido. Los videoclips se grabaron y guardaron en un formato de archivo MOV a una velocidad de fotogramas de 10 fps y una relación de aspecto de 4:3 con NCH Debut Video Capture. La duración de la grabación varió de 20 minutos a 40 minutos. Usando VideoPad Video Editor, los vídeos se ampliaron a cuatro centímetros con una relación de aspecto forzada de 4:3. El vídeo se convirtió a blanco y negro ajustando las curvas de color y aplicando un filtro de dos tonos. El vídeo en blanco y negro se exportó a 10 fps con una resolución de 400*300 píxeles.

Análisis

Toda la generación, manipulación, y análisis de los mapas de diámetros espaciotemporales se realizaron como se describe en Wu y col. (2013). Las grabaciones de vídeo se analizaron usando un complemento StMap para el software NIH Image J. Usando una rutina de detección de bordes, el diámetro de cada posición a lo largo del intestino se representó como un valor de tonalidad de 0 a 255. Las contracciones del intestino donde el diámetro es más pequeño se acercan a un valor de tonalidad de 0, y se representan como áreas negras más oscuras. Las áreas de dilatación o relajación se aproximan a un valor de matiz de 255 y son blancas. El software genera un mapa espacio-temporal a lo largo de la duración del vídeo. El mapa muestra tonos oscuros y claros alternados según la posición a lo largo del intestino, el tiempo, y el diámetro. El mapa espacio-temporal va de oral a anal en el eje vertical y a lo largo del tiempo en el eje horizontal. La velocidad de propagación de los complejos contráctiles (PCC) se determinó midiendo la pendiente de las grandes contracciones oscuras. Las frecuencias de PPC se determinaron midiendo el número de contracciones entre los intervalos. La amplitud se midió como la altura (diámetro intestinal) de las contracciones máximas.

Bacterias

LasL. reuteriDSM 17938 de la cepa se cultivaron en medio de Man-Rogosa-Sharpe (MRS), se cosecharon entre 48 y 72 h, se lavaron en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y se almacenaron a -20 °C en alícuotas de 1,1 ml a 1*1010 CFU/ml, y sus microvesículas se aislaron como se describe a continuación.

Las MV se aislaron del cultivo en caldo de cultivo deL. reuteriDSM 17938 (48-72 h). Después de la centrifugación a 600*g durante 30 minutos, los sobrenadantes se filtraron a través de filtros de 0,22 pm, se lavaron dos veces en PBS a 100000*g a 4 °C, se resuspendieron en PBS estéril correspondiente al volumen del cultivo inicial deL. reuteriDSM 17938 y se almacenaron a -80 °C en alícuotas de 0,5 ml que representan 1*1012 CFU/ml. Las MV se cuantificaron por referencia al número de bacterias viables en el cultivo y también se estandarizaron según el contenido de proteína (consistentemente de 5 a 8 mg/ml de proteína, 25 a 60 ng/ml de ADN y 18 a 30 ng/ml de ARN); n=10) medido con NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.). Las preparaciones MV se usaron a un equivalente de 1010 CFU/ml a lo largo de los experimentos salvo que se indique lo contrario.

Las bacterias se diluyeron a una concentración de 8 log CFU/ml para su uso.

Resultados

L. reuteriDSM 17938 y los productos de su cultivo se aplicaron intraluminalmente a preparacionesin vitrode yeyuno y colon de ratones para determinar si las microvesículas producidas por L.reuteriDSM 17938 podían reproducir el efecto de la bacteria parental sobre la motilidad intestinal. El medio acondicionado (CM, por sus siglas en inglés) se definió como el medio de crecimiento (caldo), en el que se habían cultivado las bacteriasL. reuteriDSM 17938. Las bacterias se separaron del CM mediante centrifugación y el CM restante se aplicó intraluminalmente a las preparaciones intestinalesin vitrocomo se ha descrito anteriormente. Las microvesículas (MV) se aislaron mediante centrifugación deL. reuteriDSM 17938 cultivado durante 72 horas, y a continuación se resuspendieron en un regulador Krebs. El medio acondicionado restante después de eliminar las microvesículas y las bacterias (CM-MV) se suministró entonces por vía intraluminal al tejido. Como control negativo, el medio de cultivo usado para cultivar las bacterias (caldo) se aplicó por separado. El efecto de estos tratamientos se comparó con el control del regulador de Krebs y se midió en tres parámetros de la propagación de complejos contráctiles (PCC) en los segmentos intestinales: velocidad, frecuencia, y amplitud.

Los resultados se reprodujeron con confianza con 24 horas de preparación.

L.reuteriDSM 17938 y sus productos disminuyeron la motilidad del intestino delgado

Velocidad de PCC yeyunal

L. reuteriDSM 17938, CM y MV redujeron la velocidad del PCC en un grado similar en el yeyuno. ElL. reuteriDSM 17938 redujo significativamente la velocidad del PCC yeyunal en un 34 % cuando se aplicó por vía intraluminal (p=0,0067, n=20) (figura 2A). El CM recapituló el efecto de la bacteria parental y disminuyó la velocidad del PCC en un 29 % (p=0,0107, n=28) (figura 2B). Como control negativo, el caldo usado como medio para cultivar las bacterias se probó de forma independiente y tuvo un efecto insignificante sobre la velocidad del PCC yeyunal (disminución del 5 %) en comparación con el control de Krebs (p=0,0877, n=20) (figura 2C). Las microvesículas aisladas del cultivo de 72 horas disminuyeron significativamente la velocidad del PCC yeyunal en un 19 % (p=0,0002, n=20) (figura 2D). La CM-MV no cambió la velocidad del PCC yeyunal cuando se aplicó al lumen (p=0,5203, n=20) (figura 2E).

Frecuencia de PCC yeyunal

L. reuteriDSM 17938, CM y MV también produjeron disminuciones en la frecuencia de PCC en el yeyuno.L. reuteriDSM 17938 redujo significativamente la frecuencia del PCC en un 26 % en el yeyuno (p=0,0482, n=20) (figura 3A). Del mismo modo, CM redujo la frecuencia de PCC en un 21 % (p=0,0139, n=28) (figura 3B). El caldo no cambió significativamente la frecuencia de PCC yeyunal (disminución del 6 %) cuando se aplicó al lumen (p=0,2424, n=20) (figura 3C). Las microvesículas disminuyeron significativamente la frecuencia de PCC yeyunal en un 26 % en comparación con las bacterias (p=0,0004, n=20) (figura 3D). La frecuencia de PCC yeyunal no se vio afectada significativamente por la adición luminal de CM-MV (p=0,3408, n=20) (figura 3E).

Amplitud de PCC yeyunal

La amplitud del PCC en el yeyuno no se alteró significativamente en ninguno de los grupos de tratamiento, con la excepción de las microvesículas. Las microvesículas disminuyeron la amplitud del PCC yeyunal en un 17 % (p=0,0453, n=20) (figura 4D), a pesar de que este efecto no estuvo presente en los ensayos conL. reuteriDSM 17938 o CM (p=0,3917, n=20 y p=0,1989, n=28, respectivamente, figuras 4A y 4B). El caldo y la CM-MV no cambiaron la amplitud del PCC yeyunal (p=0,8472 y p=0,5627, n=20) (figuras 4C y 4E).

L. reuteriDSM-17938 y sus productos aumentaron los parámetros de motilidad colónica

Velocidad del PCC colónico

La motilidad contráctil del colon se estimuló mediante la adición deL. reuteriDSM 17938, CM, o MV.L. reuteriDSM 17938 aumentó significativamente la velocidad de las contracciones del PCC en el colon en un 65 % (p=0,0004, n=20) (figura 5A). Esto se recapituló por el CM, que aumentó significativamente la velocidad del PCC en un 72 % en el colon (p=0.0021, n=28) (figura 5B). El caldo continuó teniendo poco efecto sobre la motilidad intestinal, aumentando la velocidad del PCC del colon en un 8 %, pero no dentro del rango de significancia de 0,05 (p=0,1861, n=20) (figura 5C). Las microvesículas aumentaron significativamente la velocidad de las PCC en el colon en un 24 % (p=0.0051, n=20), pero en menor grado que la producida porL. reuteriDSM 17938 y CM (figura 5D). La CM-MV aplicada intraluminalmente no logró cambiar significativamente la velocidad del PCC del colon (p=0,6475, n=20) (figura 5E).

Frecuencia de PCC colónica

L. reuteriDSM 17938, CM y MV estimularon la motilidad del colon al aumentar la frecuencia de las contracciones del PCC.L. reuteriDSM 17938 aumentó significativamente la frecuencia del PCC del colon en un 30 % (p=0,0231, n=20) (figura 6A). En la misma capacidad, CM aumentó significativamente la frecuencia de PCC en un 31 % en el colon (p=0,0073, n=28) (figura 6B). El caldo aumentó la frecuencia de la PCC del colon en tan solo un 4 %, pero no de manera significativa (p=0,7219, n=20) (figura 6C). De manera similar a lo observado con la velocidad del PCC, las microvesículas aumentaron la frecuencia de los PCC del colon en un 18 % (p=0,0424, n=20); (figura 6D). La CM-MV no afectó significativamente la frecuencia de PCC en el colon (p=0,3298, n=20) (figura 6E).

Amplitud del PCC colónico

La amplitud del PCC en el colon no se vio afectada significativamente porL. reuteriDSM 17938 ni por ninguno de los otros grupos de tratamiento (figuras 7A-E).

Conclusión

L.reuteriDSM 17938 tuvo efectos regionales específicos sobre la motilidad intestinal; disminución de la velocidad del PCC yeyunal y aumento de la velocidad y frecuencia de las contracciones del PCC del colon. El presente estudio demuestra que tanto las microvesículas como los medios acondicionados recapitulan el efecto de L.reuteriDSM 17938 sobre la motilidad intestinal tanto en el intestino delgado como en el colon. Además, estos resultados no se observaron cuando se aplicó el medio acondicionado después de la eliminación de las microvesículas (CM-MV). Todos los resultados se han resumido en la figura 8.

Estos resultados demuestran el papel de las microvesículas en la señalización de los probióticos deLactobacilluscon el organismo huésped y su mecanismo de acción dentro del eje microbioma-intestino-cerebro. Esto demuestra que las microvesículas producidas o desprendidas por las bacterias son responsables de los cambios en la motilidad intestinal inducidos porL. reuteriDSM 17938

Ejemplo 4 - Las microvesículas bacterianas aisladas recapitulan el efecto de las bacterias en la señalización del dolor

El efecto de las microvesículas aisladas del medio de cultivoL. reuteriDSM 17938 sobre la señalización del dolor se probó usando células Jurkat que expresan TrpV1 en presencia de 10 pM de capsaicina.

Materiales y métodos

Cultivo celular

Las células Jurkat (clon E6-1 (ATCC® TIB-152™), ATCC) se suspendieron en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) de suero fetal bovino (FBS) al 2 % a una concentración de ~5x106 células/ml con un volumen total de 20 ml.

L. reuteriDSM 17938 se cultivó, cosechó y almacenó como se describe en el Ejemplo 3 anterior. La preparación para el aislamiento de microvesículas deL. reuteriDSM 17938 también se realizó según el Ejemplo 3 anterior (48 h). Las bacterias se diluyeron en caldo MRS hasta una concentración final de 1010 CFU/ml y se mantuvieron congeladas a -80 °C hasta que se usaron para experimentos.

Flujo de calcio radiométrico medido por citometría de flujo

50 |jg de cada uno de los dos colorantes, Fluo-3 AM (F1242); Sigma) y rojo Fura AM (F3021; Sigma), se disolvieron en 100 ml de ácido plurónico al 0,1 % (PLURONIC® F127 disuelto en sulfóxido de dimetilo (DMSO)). A continuación, se añadieron 50 j l de las soluciones de Fluo-3 y 100 j l de rojo Fura a 20 ml de células Jurkat, lo que resultó en una relación de Fluo-3 a rojo Fura de 1:2,5. A continuación, las células se incubaron a 37 °C durante 1 h y se lavaron con PBS (centrifugación a 300 xgdurante 10 min). A continuación, las células se resuspendieron en el medio Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco o en el medio RPMI 1640 que contenía un 2 % de FBS.

El día del experimento, las bacterias se descongelaron, se lavaron en PBS tres veces y a continuación se añadieron a los cultivos celulares. Alternativamente, las microvesículas aisladas de las bacterias (tal como se describe en el ejemplo 3) se descongelaron, se lavaron y se añadieron a los cultivos celulares. La incubación se continuó a 37 °C durante una hora adicional. La suspensión celular se centrifugó entonces como anteriormente y se resuspendió en PBS que contenía 1,25 mM de Ca2+.

Todos los experimentos se realizaron en un BD FACSCelesta (BD Bioscience, Mississauga, Canadá) equipado con los siguientes láseres: Láser azul que emite a 488 nm, láser rojo que emite a 640 nm y láser violeta que emite a 406 nm. La calibración se realizó usando BD PMT Beads (BD, Mississauga, Canadá). Las compensaciones se realizaron con perlas de compensación BD de un solo color.

Para el experimento FACS, se transfirió un ml de la suspensión celular a un tubo de 5 ml con una tapa coladora de células (Falcon 352235) y se centrifugó durante 1 minuto antes del análisis. La capsaicina se preparó a partir de una solución madre de 100 mM y se diluyó a 100 jM en PBS que contenía calcio y magnesio.

El fondo correspondiente al flujo de calcio no específico se registró durante 30 segundos. Todas las muestras se adquirieron durante un tiempo fijo (30 o 60 segundos) con un caudal constante (número de células/segundo). Se añadieron 100 |jl de la solución de capsaicina (dando como resultado una concentración final de 10 j M) a la suspensión celular inmediatamente antes del registro mediante FACS-Celesta.

La grabación fue continua a una velocidad de 400-600 eventos/segundo durante 30 a 60 segundos en total.

Tanto Fluo-3 como rojo Fura se excitaron a 488 nm, detectándose la emisión de Fluo-3 a 575 nm y detectándose la emisión de rojo Fura a 610 nm. Los datos se recopilaron en histogramas que muestran la relación entre la fluorescencia del Fluo-3 violeta y azul frente al tiempo y la fluorescencia del rojo Fura frente al tiempo.

El análisis radiométrico de Fluo-3/rojo Fura se midió mediante excitación con el láser azul (488 nm). La emisión se detectó mediante dos conjuntos de filtros diferentes: los aumentos en la emisión se controlaron con el láser violeta (610/20 nm), mientras que se detectó una disminución en la emisión con el láser azul (575/25 nm). La relación radiométrica, 'Fluo-3/rojo Fura' se calculó como la señal creciente estimulada por el láser violeta sobre la señal decreciente estimulada por el láser azul (406 nm/488 nm) usando la herramienta Kinetics del software FlowJo (Tree Star Inc., OR, EE. UU.).

Resultados

La capsaicina sola o las MV aisladas de otra cepa bacteriana, la JB-1, (MV-JB-1) se usaron como control. La lectura (figura 9) para la activación de la capsaicina fue la entrada de calcio en las células Jurkat, lo que aumentó la relación de fluo-3/rojo Fura. La capsaicina por sí sola a 10 jM indujo la entrada de calcio en las células Jurkat, una respuesta que se bloqueó significativamente mediante el uso de MV aisladas deL. reuteriDSM 17938 (DSM-MV) a una concentración alta correspondiente a L.reuteriDSM 17938 a 1011 CFU/ml. Las concentraciones más bajas de L.reuteriDSM 17938 MV correspondientes a L.reuteriDSM 17938 a 109 -1010 CFU/ml tuvieron un efecto similar, pero ligeramente reducido, mientras que las MV deL. rhamnosusJB-1 a una concentración alta correspondiente a JB-1 a 1011 CFU/ml no tuvieron un tuvo un efecto significativo en la respuesta al tratamiento con capsaicina.

Ejemplo 5 - La presentación del efecto sobre la activación del nervio espinal con microvesículas bacterianas aisladas es más rápido en comparación con la presentación del efecto obtenido con bacterias completas

Los inventores de la presente memoria observaron sorprendentemente que las microvesículas delLactobacillus reuteriDSM 17938 no solo recapitulaban el efecto de las bacterias completas sobre la activación del nervio mesentérico, sino que las MV podían producir un efecto mejorado en comparación con las bacterias completas. Este hallazgo se obtuvo analizando la cantidad de tiempo que transcurre desde el inicio del tratamiento hasta la respuesta pico (presentación del efecto total) cuando se usan microvesículas aisladas deL. reuteriDSM17938 en comparación con el uso de bacterias completas.

Materiales y métodos

LasL. reuteriDSM 17938 se cultivaron, cosecharon y almacenaron como se describe en el Ejemplo 3 anterior. El aislamiento y la preparación de microvesículas a partir delL. reuteriDSM 17938 se realizaron según el Ejemplo 3 anterior.

Los registros del nervio mesentérico yeyunal se realizaron como se ha descrito anteriormente (Pérez-Burgos y col. (2013); Pérez-Burgos y col. (2015)). En resumen, se extirpó un segmento de 3 cm de yeyuno de ratón y se montó en una placa de Petri recubierta de agar llena con el regulador de Krebs oxigenado y un bloqueador de los canales de calcio de tipo L, nicardipina (3<j>M). El contenido luminal del yeyuno se enjuagó con Krebs y los extremos oral y anal se canularon con tubos de silicona para permitir el flujo de los tratamientos a través del segmento yeyuno. El conjunto de nervios mesentéricos se aisló cuidadosamente del segmento yeyuno raspando suavemente el mesenterio adjunto con unas pinzas finas. La placa que contenía la preparación nerviosa se montó a continuación en el escenario del microscopio y se perfundió continuamente usando una bomba con Krebs calientes y oxigenados.

El conjunto nervioso expuesto se succionó con una micropipeta de vidrio unida a un soporte de electrodos con forma de pinza tipo parche. La actividad eléctrica de múltiples unidades se registró en el conjunto de nervios usando un amplificador Multi-Clamp 700B y un convertidor de señal Digidata 1440A. Los períodos de control se registraron durante 15-30 minutos durante la perfusión luminal de Krebs. Las microvesículas luminales deL. reuteriDSM 17938 o se aplicaron inmediatamente después del control durante un período de 20-30 minutos.

La actividad eléctrica de varias unidades se analizó para determinar la actividad de una sola unidad mediante el análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en inglés) y el análisis de la forma de onda de los picos en el programa Dataview (Heitler (2007)). El tiempo hasta la respuesta máxima se midió desde el momento en que se inició el tratamiento hasta el momento en que se observó la respuesta (cambio en la velocidad de disparo).

Resultados

LasL. reuteriMV (MV) pudieron iniciar una respuesta de activación nerviosa más rápidamente, lo que llevó a una presentación más temprana del efecto, en comparación con la bacteria completa (DSM), como se muestra en la figura 10.

Ejemplo 6 - Protocolo de cultivo y aislamiento

Un flujo de trabajo típico de preparación de MV comprende las siguientes etapas: cultivo, eliminación de bacterias intactas y aislamiento de MV del filtrado de cultivo y, opcionalmente, la preconcentración y purificación. La selección de métodos particulares depende de muchos factores, p. ej., la cantidad de material a procesar y la pureza requerida según las aplicaciones posteriores.

Condiciones de cultivo

Los inventores identificaron los parámetros de cultivo para las cepas bacterianas que dieron como resultado la producción de MV terapéuticas con un efecto mejorado en los modelos preferidos de motilidad gastrointestinal y dolor gastrointestinal.L. reuteriDSM 17938 se cultivó en condiciones de cultivo normales, es decir, se cultivó anaeróbicamente en medio de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) a 37 °C durante 24 h en una botella/matraz, con la adición de sacarosa al 2 % como factor inductor.

Condiciones de aislamiento

La preparación de las MV bacterianas incluyó las etapas definidas anteriormente descritas de cultivar las bacterias seguidas del aislamiento de las MV. Para obtener fracciones MV de altos números, alta pureza, y con un efecto biológico retenido, el sobrenadante bacteriano se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos (centrífuga Beckman de alta velocidad con rotor de ángulo fijo JA-18), seguido de centrifugación por segunda vez a 10.000*g durante 20 minutos y a continuación se filtró a través de un filtro de 0,45 pm. Estas primeras etapas eliminaron las bacterias vivas y los residuos grandes. A continuación, el gránulo se desechó y el sobrenadante que contenía las MV se cargó en una almohadilla de sacarosa y se ultracentrifugó a 118000*g a 4 °C durante 20,5 horas. Finalmente, el gránulo se lavó y se centrifugó a 118.000*g, a 4 °C durante la noche para obtener las MV terapéuticas en forma de gránulo.

EJEMPLO 7 - Estimulación inmunológica por microvesículas (MV) derivadas deLactobacillus reuteriDSM 17938

En este ejemplo, se ha demostrado que las MV derivadas de sobrenadante libre de células (CFS, por sus siglas en inglés) delLactobacillus reuteriDSM 17938 tenían una actividad inmunoestimuladora y amortiguadora del interferón gamma (IFN-y), demostrando que las MV extracelulares derivadas de bacterias intestinales pueden ser importantes moduladores de la inmunidad humana.

Material y método

Declaración ética y aislamiento de células mononucleares de sangre periférica

Se incluyeron voluntarios adultos sanos y anónimos (de 18 a 65 años) en este estudio, que se aprobó por el Comité de Ética Regional del Instituto Karolinska, de Estocolmo, Suecia {Dnr 04-106/1 y 2014/2052-32}. Todos los sujetos del estudio dieron su consentimiento informado por escrito. La sangre venosa se recogió en tubos vacutainer heparinizados (BD Biosciences Pharmingen) y se diluyó con medio de cultivo celular RPMI-1640 suplementado con HEPES 20 mM (HyClone Laboratories, Inc.). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) se aislaron después mediante separación en gradiente de Ficoll-Hypaque (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Las PBMC se lavaron en RPMI-1640, se resuspendieron en un medio de congelación que contenía RPMI-1640 al 40 %, suero fetal de ternera al 50 % y DMSO al 10 %, y se congelaron gradualmente en un recipiente de congelación (Mr Frosty, Nalgene Cryo 1 °C); Nalge Co.) y se almacena en nitrógeno líquido.

Estimulaciónin vitrode PBMC

Las PBMC se descongelaron, se lavaron y la viabilidad se evaluó mediante tinción con azul tripano seguida de un recuento con un microscopio óptico de 40x. Las células se resuspendieron en medio de cultivo celular (RPMI-1640 suplementado con HEPES (20 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml), L-glutamina (2 mM) (todas de HyClone Laboratories, Inc.) y suero fetal de ternera al 10 % (Gibco de Life Technologies)) a una concentración final de 1 x 106 células/ml. Las células se sembraron en placas de cultivo celular de fondo plano y se incubaron a 37 °C con una atmósfera de CO2 al 5 %. El sobrenadante exento de células (CFS) deStaphylococcus aureusse usó como estímulo al 2,5 % (v/v), y las MV aisladas deLactobacillus reuteriDSM 17938 se añadieron a las PBMC en una relación de MV/célula de 500:1, 100:1 y 20:1.

Aislamiento de microvesículas

Las células bacterianas deLactobacillus reuteriDSM 17938 se cultivaron en medio de Man Rogosa Sharpe (Oxoid) durante 24 h a 37 °C. Las células bacterianas se retiraron del caldo de cultivo mediante centrifugación a 5000 xgdurante 10 min a 4 °C y seguido de otra centrifugación a 10000 xgdurante 10 min a 4 °C. A continuación, los sobrenadantes se filtraron usando un filtro de poros de 0,45 pm (Millipore). Los sobrenadantes libres de células se concentraron usando una unidad de filtro Amicon Ultra con un MwCO de 100 kDa, que elimina las proteínas y otras moléculas de menos de 100 kDa. Los sobrenadantes se cargaron sobre un cojín de sacarosa al 12 % con un regulador Tris 50 mM, pH de 7,2, con la relación de volumen de 5:1, y se centrifugaron con una ultracentrífuga Beckman Coulter Optima L-80XP. (Beckman Coulter, Estados Unidos) a 118000*g a 4 °C durante 3 h. Los sobrenadantes se desecharon, se resuspendió el sedimento en regulador PBS y se ultracentrifugaron por segunda vez (118000*g a 4 °C durante 3 h). Los gránulos se disolvieron a continuación en PBS, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70 °C.

Procedimiento experimental

Las MV aisladas delLactobacillus reuteriDSM 17938 se añadieron a las PBMC en una relación de MV/célula de 500:1, 100:1 y 20:1 y se incubaron durante 48 h. Los sobrenadantes del cultivo celular se recogieron y analizaron para la inducción de citocinas usando ELISA.

Elisa

Los niveles secretados de las citocinas IL-1 ra (R&D Systems- BioTechne), IL-10, IL-6, IL-10, IL-17A e IFN-gamma (MabTech AB) se midieron en sobrenadantes de cultivos celulares usando kits de ELISA tipo sándwich según las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 405 nm usando un lector de microplacas (Molecular Devices Corp.) y los resultados se analizaron usando SoftMax Pro 5.2 rev C (Molecular Devices Corp.). Estadística

Todas las pruebas estadísticas se realizaron usando GraphPad Prism (software GraphPad). Todos los datos se consideraron no paramétricos, por lo que se emplearon las pruebas t de Mann-Whitney o de comparación múltiple de Dunn. Las diferencias se consideraron significativas cuando p<0,05 y se usaron los siguientes niveles de significación *p<0,05; **p<0,01.

Resultados

Las MV DSM 17938 deLactobacillus reuteriindujeron claramente la producción de IL-6 e IL-10 de una manera dependiente de la concentración, mientras que no se detectó ninguna inducción de IFN-<y>o IL-17A (figura 11A). Además, la adición de MV aisladas a las PBMC estimuladas por S.aureusdisminuyó significativamente la secreción de IFN-y e IL-17A en un grado similar al de la fracción de MV alto (figura 11B).

Ejemplo 8 - Las microvesículas (MV) derivadas deLactobacillus reuteriprotegen la integridad de la barrera epitelial del efecto perjudicial de laEscherichia colienterotoxigénica

Material y método

Aislamiento de microvesículas extracelulares (MV)

Las células bacterianas DSM 17938 deLactobacillus reuterise cultivaron en Man-Rogosa-Sharpe, se cosecharon después de 24 h y se retiraron del caldo de cultivo centrifugando a 5000*g durante 10 min a 4 °C y, a continuación, se centrifugaron a 10000*g durante 10 min a 4 °C, después de lo cual cualquier célula residual se retiró del sobrenadante mediante filtración usando un filtro de poros de 0,45 pm. Los sobrenadantes se concentraron usando el filtro Amicon Ultra (100 kDa), que elimina las proteínas y otras moléculas de menos de 100 kDa. Los sobrenadantes se centrifugaron mediante la ultracentrífuga Beckman Coulter Optima L - 80XP (Beckman coulter, Estados Unidos) a 118000*g a 4 °C durante 3 h. Los sobrenadantes se desecharon, los gránulos se resuspendieron en regulador PBS y se ultracentrifugaron por segunda vez (118000*g a 4 °C durante 3 h). Los gránulos se disolvieron a continuación en PBS, una alícuota y se almacenaron a -70 °C. Permeabilidad intestinalin vitro(cocultivos de células Caco-2/HT29)

Cultivo de células epiteliales (Caco-2/HT29)

Las células Caco-2 y HT29 se cultivaron por separado en frascos de cultivo de tejidos en el Modified Eagle's Medium de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) suplementado con un 10 % de suero bovino fetal, un 1 % de aminoácidos no esenciales, y un 1 % de penicilina y estreptomicina, a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 con 90 % de humedad relativa. Las células Caco-2 y HT29 se cultivaron en matraces de cultivo tisular de 25 cm2 y se dividieron a una confluencia del 80-90 % usando una solución de tripsina al 0,25 % y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés) al 0,02 %. Las células se sembraron a una densidad de 6x104 células por matraz de 25 cm2.

Cocultivos celulares

Las células Caco-2 y HT29 se sembraron en la cámara apical de los insertos Transwell (filtros de membrana recubiertos con colágeno Transwell-COL) con una relación de 9:1 y se cultivaron en placas Transwell de 12 pocillos con una densidad final de 1x105 células/cm2 en cada inserto. Las células se mantuvieron en las mismas condiciones y se dejaron crecer durante 21 días con cambios de medio (0,5 ml en el lado apical y 1,5 ml en el lado basolateral) cada dos días para permitir que las células se diferenciaran.

Integridad de la capa celular

La integridad de la capa celular se determinó usando dos métodos: Resistencia eléctrica transepitelial (TEER, por sus siglas en inglés) y determinación de la permeabilidad de la fluoresceína al isotiocianato dextrano (FITC-dextrano).

La integridad de la monocapa celular durante los experimentos se determinó mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) usando el sistema de resistencia eléctrica Millicell (Millipore, Darmstadt, Alemania). Se eligieron tres áreas diferentes para detectar los valores de TEER en cada pocillo y los promedios fueron los resultados finales. Para los estudios de permeabilidad se usaron valores de TEER superiores a 250 O cm2.

Las células Caco-2/HT29 sembradas se trataron previamente con células DSM 17938 deLactobacillus reuterivivas con una multiplicidad de bacterias (MOB, por sus siglas en inglés) del 100 % o microvesículas extracelulares (MV) de células DSM 17938 deLactobacillus reuteria una multiplicidad del 200 de MV durante 6 h antes de la exposición a ETEC(E. colienterotoxigénica patógena, conocida por tener un efecto perturbador en la integridad epitelial) a una multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés) del 100 % para un adicional de 6 h. La TEER se midió antes del pretratamiento y el desafío con ETEC, y a continuación se midió cada dos horas durante todo el desafío. Para cuantificar la permeabilidad paracelular de las monocapas, 1 mg/ml de isotiocianato-dextrano de fluoresceína (FITC-dextrano) de 4 kDa; Sigma) se añadió al lado apical de los insertos al principio del desafío con ETEC. Se tomaron muestras del compartimento basolateral después de 6 h de incubación. El trazador fluorescente difuso se analizó entonces por triplicado mediante fluorometría (excitación, 485 nm); emisión, 520 nm) usando un lector de microplacas FLUOstar Omega (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania).

Resultados

El desafío con ETEC indujo una reducción del TEER. Tanto las MV derivadas deL. reutericomo las células bacterianas pudieron proteger parcialmente la monocapa epitelial de este desafío (figura 12).6 horas después del tratamiento con ETEC, la disminución de la TEER en el grupo con ETEC alcanzó el 35 %, y tanto el pretratamiento con las células como las MV de la bacteriaL. reuterimostraron una TEER significativamente mayor en comparación con el grupo tratado con ETEC.

El efecto protector de las MV y las células bacterianas derivadas deL. reutericontra el daño causado por el ETEC a la monocapa también fue evidente en los experimentos de flujo de FITC-dextrano (figura 12). El pretratamiento de las monocapas con células bacterianas y Mv derivadas deL. reuteridisminuyó la fuga de FITC-dextrano en comparación con el grupo ETEC.

Por lo tanto, las MV derivadas deL. reuteriy las células bacterianas mostraron un efecto protector del daño inducido por la ETEC en las monocapas de los cocultivos de Caco-2/HT29.

Ejemplo 9 - Alteración de la actividad enzimática asociada con la producción de MV

Lactobacillus reuteriDSM 17938 yLactobacillus reuteriDSM 32846 y se sometieron a varios tratamientos bióticos de inducción. La respuesta, con respecto a las alteraciones en la producción de MV, a estos tratamientos inductores se determinó usando un ensayo enzimático y se comparó con la respuesta obtenida para los controles, es decir, cultivos bacterianos sin tratamientos inductores. La actividad enzimática se midió entonces en el medio acondicionado bacteriano.

Materiales y métodos

Cultivo y tratamiento biótico

L. reuteriDSM 17938 oL. reuteriDSM 32846 se inocularon a partir de material congelado en 25 ml del medio Man-Rogosa-Sharpe (MRS) en condiciones de cultivo normales, es decir, se cultivaron anaeróbicamente a 37 °C durante la noche. A continuación, las bacterias (40 ml) se volvieron a inocular en 400 ml de SIM junto con el sobrenadante (4 %) de otros cultivos bacterianos o mediante la adición de otras células bacterianas (25 %, lavadas y suspendidas en PBS) y a continuación se cultivaron durante otras 48 horas. Las muestras bacterianas investigadas se resumen en la siguiente tabla.

Tabla 3: descripción general de las muestras y tratamientos bacterianos

Bifídobacterium longumATCC BAA-999 yLactobacillus paracaseiLMG-P-17806 son cepas bacterianas disponibles comercialmente y se han depositado en la ATCC (American Type Culture Collection) y en la Colecciones Coordinadas de Microorganismos del Laboratorio de Microbiología de Bélgica, respectivamente.

La configuración experimental se refiere a las cepas bacterianas probióticas y a diferentes tratamientos bióticos y se ha diseñado para imitar la verdadera situación de aumento de escala en los entornos de producción, o para imitar la situación en el tracto gastrointestinal humano. El sobrenadante al 4 % de los tratamientos bióticos durante el cultivo se eligió por ser una concentración relevante, ya que era suficiente para tener un efecto, por un lado, pero, por otro lado, no añadía demasiado debido al riesgo de incluir componentes de las bacterias bióticas inductoras como parte del producto final. La concentración más alta, el 25 %, de células del tratamiento biótico se seleccionó para imitar el efecto que se produciría localmente en el tracto gastrointestinal humano si las dos (o más) cepas bacterianas se administraran juntas como una composición combinada.

Muestreo

Las muestras bacterianas se centrifugaron primero a 5000*g durante 10 min, después de lo cual los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo y a continuación se centrifugaron por segunda vez a 10000*g durante 10 min para eliminar las células bacterianas y los restos celulares bacterianos. Los sobrenadantes, que ahora contienen las MV, se filtraron a través de un filtro de 0,45 pm y se mantuvieron en hielo antes de seguir centrifugando usando una ultracentrífuga a 32.000 rpm a 4 °C durante 3 h (rotor Beckman SW 32 Ti, balde pendular, tubos de 30 ml). Los sobrenadantes se desecharon (se vertieron suavemente, con la ayuda de una pipeta). Los gránulos que contenían el MV se resuspendieron cuidadosamente en medios de resuspensión (solución salina amortiguada con fosfato (PBS)) y se centrifugaron nuevamente a 32000 rpm a 4 °C, eliminando los restos del medio de cultivo. El volumen de resuspensión varió, entre 100-300 |jl, según el tamaño del gránulo. Las muestras se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70 °C.

Actividad enzimática

La actividad de la enzima 5'-nucleotidasa se usó como medida para cuantificar las alteraciones en el número y/o la potencia de las MV producidas por los diferentes tratamientos bióticos inductores. Las muestras obtenidas de los tratamientos inductores bióticos se descongelaron y después se probaron en un ensayo de actividad de 5'-nucleotidasa usando el kit de ensayo de 5'-nucleotidasa Crystal Chem (Crystal Chem, Elk Grove Village, IL, EE. UU.). En resumen, el procedimiento se llevó a cabo en dos etapas. En primer lugar, se añadió el reactivo 1 (CC1) que contenía AMP a las muestras sobrenadantes para convertir el AMP en adenosina mediante cualquier enzima 5'-nucleotidasa presente en las muestras sobrenadantes. La adenosina se hidrolizó posteriormente en inosina e hipoxantina por los componentes del reactivo 1. En la segunda etapa, se añadió el reactivo 2 (CC2) para convertir la hipoxantina en ácido úrico y peróxido de hidrógeno, que se usó para generar un colorante quinona que se midió cinéticamente a 550 nm en un espectrofotómetro. La actividad de la 5'-nucleotidasa en las muestras se determinó calculando el cambio de absorbancia entre 3 y 5 minutos y comparándolo con el valor de una muestra de calibrador.

Resultados

La figura 13 ilustra la actividad de la 5'-nucleotidasa en muestras de MV obtenidas deL. reuteriDSM 17938 (para muestras de control y tratadas). Como puede verse en la figura, la actividad de la 5'-nucleotidasa aumentó en las muestras obtenidas del cultivo delL. reuteriDSM 17938 con la adición de un 4 % de sobrenadante deB. longumATCC BAA-999 o B longum DSM 32947 en medios SIM (DSM 17938+4 % DSM 32947 sup. o DSM 17938 4 % ATCC BAA-999 sup.) en comparación conL. reuteriDSM 17938 en SIM (control) oL. reuteriDSM 17938 con un 4 % de sobrenadante deL. paracaseiLMG-P-17806 (DSM 17938 en SIM o DSM 17938+4 % sobrenadante LMG-P-17806) El efecto de la inducción del tratamiento biótico sobre la actividad de la 5'-nucleotidasa fue más pronunciado cuandoL. reuteriDSM 17938 se cultivó con un sobrenadante deB. longumDSM 32947, pero también se obtuvo un efecto con el sobrenadante deB. longumATC BAA-999. Las puntuaciones de densidad óptica (DO) de cada muestra ilustran que el recuento relativo de células no se alteró significativamente entre los tratamientos.

Los resultados presentados en la figura 14 son los mismos que los presentados en la figura 13, pero se han normalizado en relación con la actividad de la 5'-nucleotidasa y la densidad óptica del DSM 17938 en SIM, facilitando la comparación del cambio de pliegue en la actividad de la 5'-nucleotidasa entre diferentes experimentos.

Los resultados de la figura 15 (normalizados) ilustran además que la actividad de la 5'-nucleotidasa aumentó después de inducir el tratamiento biótico en comparación con las muestras de control (es decir, el DSM 17938 en SIM) al cocultivarL. reuteriDSM 17938 con un 25 % de células deB. LongumDSM 32947 en medios SIM. Las puntuaciones de OD de estas muestras ilustran la diferencia relativa en el número de células obtenidas mediante estos diferentes tratamientos bióticos (es decir, una mayor puntuación en las muestras de tratamiento biótico inductoras debido a un mayor número total de células bacterianas).

La figura 16 ilustra los valores normalizados de la actividad de la 5'-nucleotidasa obtenida en muestras de control y tratadas usandoL. reuteriDSM 32846. Como puede verse en el gráfico, la actividad enzimática se incrementó cultivandoL. reuteriDSM 32846 con la adición de un 4 % de sobrenadante deB. LongumDSM 32947 en medios SIM (DSM 32846 4%DSM 32947 sup.) en comparación conL. reuteriDSM 32846 en SIM de control (DSM 32846 en SIM). Las puntuaciones de OD de estas muestras ilustran la diferencia relativa en el número de células obtenidas mediante estos diferentes tratamientos bióticos.

EJEMPLO 10 - Efecto antagonista mejorado deLactobacillus reuteriDSM 17938 sobre la señalización del dolor mediada por TrpV1 tras el cocultivo conBifidobacterium longumDSM 32947 oBifidobacterium longumATCC BAA-999

El efecto de los tratamientos bióticos en la producción de MV por parte delLactobacillus reuteriDSM 17938 se probó en un modelo de estimulación de campo eléctrico (EFS)in vitrousando neuronas que expresan TrpV1 obtenidas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG, por sus siglas en inglés) de ratas y la plataforma Cellectricon Cellaxess Elektra.L. reuteriDSM 17938 se cultivó durante 48 horas como control en un medio intestinal simulado (DSM 17938 control SIM 48 h) o usando un tratamiento biótico inductor que consistía en cocultivar con un 25 % de células bacterianas de una de las dos cepas deBifidobacteriumlongum DSM 32947 o ATCC BAA-999 en SIM durante 48 horas. (La receta de los medios SIM puede encontrarse en el Ejemplo 1). Las MV se aislaron de las diferentes preparaciones bacterianas según el ejemplo 6. Los cultivos neuronales d Rg primarios de rata se cultivaron durante 48 horas en placas de 384 pocillos junto con el factor de crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en inglés) para imitar la sensibilización periférica. A continuación, se evaluó el efecto antagonista de las preparaciones MV obtenidas sobre la activación del TrpV1 inducida por la capsaicina. El día del experimento, los cultivos d Rg se tiñeron con un indicador de Ca<2+>(Ca5; sin kit de detección de lavado) para permitir la obtención de imágenes de los transitorios de calcio provocados por la capsaicina, un agonista específico del TrpV1. En primer lugar, se determinó la EC<50>de la capsaicina en experimentos de EFS separados, y esta concentración se añadió a continuación a todos los cultivos de DRG para inducir la activación del TrpV1. A continuación, se evaluó el efecto de las preparaciones de MV sobre la activación del TrpV1 en un formato de respuesta a la dosis (se probaron seis concentraciones por triplicado en cada placa) con una concentración inicial de 1:10 de la concentración de materia prima de MV original y usando etapas de dilución de 1:3. Los cultivos DRG se incubaron con las preparaciones MV durante 1 hora antes de ejecutar el experimento EFS. Las placas se colocaron en la plataforma Cellaxess y se aplicaron una serie de protocolos EFS. Estos protocolos de EFS incluían trenes de pulsos para capturar los cambios en la excitabilidad que se producen en los cultivos DRG debido a la incubación con preparaciones de MV. A continuación, se analizó el efecto de las preparaciones de MV sobre la activación del TrpV1 inducida por la capsaicina y se determinaron los valores de EC<50>para cada uno de las preparaciones (EC<50>se describe generalmente como la concentración media máxima efectiva y se refiere a la concentración de una sustancia que induce una respuesta a medio camino entre el valor basal y el máximo después de un tiempo de exposición específico). En la presente memoria, EC<50>representa el % de concentración de materia prima de las MV extraídas de 400 ml de cultivo bacteriano líquido). El experimento se realizó dos veces y se calculó un valor medio de EC<50>. El valor de EC<50>para el experimento de control fue de 7,4, mientras que los valores de EC<50>para ambos tratamientos bióticos de inducción fueron mucho más bajos (1,8 para DSM 17938+DSM 32947); 2.7 para DSM 17938+ATCC BAA-999). Estos resultados muestran que los tratamientos bióticos inductores aumentan el efecto antagonista de la preparación de MV sobre la señalización de TrpV1, es decir, se requiere una cantidad menor de las preparaciones de MV inducidas para inhibir la señalización de TrpV1 inducida por capsaicina en comparación con la preparación de MV de control. Un aspecto importante a mencionar en la presente memoria es que el control (DSM 17938 SIM 48 h) ha mostrado previamente un efecto inhibidor sobre la señalización de TrpV1 (véase el Ejemplo 4) y, por lo tanto, puede considerarse un control positivo. En resumen, al exponer las bacterias a tratamientos bióticos inductores durante el cultivo según la invención, se indujo a las bacterias a producir MV terapéuticas. Esto, a su vez, mejoró el efecto inhibidor/bloqueante sobre la activación del TrpV1 inducida por la capsaicina.

Tabla 4: Valor de EC<50>bacteriano para la inhibición de TrpV1

Los valores de EC<50>se presentan como el % de la concentración materia prima de las MV extraídos de 400 ml de un cultivo bacteriano líquido e ilustran el aumento del efecto antagónico de las preparaciones de MV del DSM 17938 sobre el TrpV1 en respuesta a un tratamiento biótico inductor.

Ejemplo 11 - Alteraciones en la modulación inmunológica como resultado de tratamientos bióticos durante el cultivo

En este ejemplo, se ha demostrado que las MV derivadas del sobrenadante libre de células (CFS) deLactobacillus reuteri<d>S<m>32846 tienen un efecto inmunomodulador más fuerte (aumento de IL-6) en comparación con las MV derivadas de sobrenadante libre de células (CFS) deLactobacillus reuteriDSM 17938. También se ha demostrado que el efecto inmunomodulador de las MV derivadas del sobrenadante libre de células (CFS) deLactobacillus reuteriDSM 32846 oLactobacillus reuteriDSM 17938 mejora después de un tratamiento biótico durante el cultivo.

Material y método

En este estudio se incluyeron voluntarios adultos sanos y anónimos (de 18 a 65 años), que se aprobó por el Comité de Ética Regional del Instituto Karolinska de Estocolmo, Suecia {Dnr 04-106/1 y 2014/2052-32}. Todos los sujetos del estudio dieron su consentimiento informado por escrito. La sangre venosa se recogió en tubos vacutainer heparinizados (BD Biosciences Pharmingen) y se diluyó con medio de cultivo celular RPMI-1640 suplementado con HEPES 20 mM (HyClone Laboratories, Inc.). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron después mediante separación en gradiente de Ficoll-Hypaque (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Las PBMC se lavaron en RPMI-1640, se resuspendieron en un medio de congelación que contenía RPMI-1640 al 40 %, suero fetal de ternera al 50 % y DMSO al 10 %, y se congelaron gradualmente en un recipiente de congelación (Mr Frosty, Nalgene Cryo 1 °C); Nalge Co.) y se almacena en nitrógeno líquido.

Estimulación¡n vitrode PBMC

Las PBMC se descongelaron, se lavaron y la viabilidad se evaluó mediante tinción con azul tripano seguida de un recuento con un microscopio óptico de 40x. Las células se resuspendieron en medio de cultivo celular (RPMI-1640 suplementado con HEPES (20 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml), L-glutamina (2 mM) (todas de HyClone Laboratories, Inc.) y suero fetal de ternera al 10 % (Gibco de Life Technologies)) a una concentración final de 1 x 106 células/ml. Las células se sembraron en placas de cultivo celular de fondo plano y se incubaron a 37 °C con una atmósfera de CO2 al 5 %. Las MV aisladas de las diferentes preparaciones bacterianas que se describen con mayor detalle a continuación se añadieron a las PBMC en una relación MV/célula de 500:1.

Aislamiento de microvesículas

Las células bacterianas DSM 17938 o DSM 32846 deLactobacillus reuterise cultivaron en SIM (medio intestinal simulado, receta descrita en el Ejemplo 1) durante 48 h a 37 °C. Para los experimentos en los que se investigaron diferentes tratamientos bióticos, se cultivaron células bacterianas deLactobacillus reuteriDSM 17938 o DSM 32846 en presencia de sobrenadantes deBifidobacterium longumDSM 32947 oBifidobacterium longumATCC BAA-999 cultivados por separado en SIM durante 48 h a 37 °C. También se cultivaron células bacterianas deLactobacillus reuteriDSM 17938 en presencia de un 25 % de células bacterianas deBifidobacterium longumDSM 32947.

Las células bacterianas se retiraron del caldo de cultivo mediante centrifugación a 5000 xgdurante 10 min a 4 °C y seguidas por otra centrifugación a 10000 xgdurante 10 min a 4 °C. A continuación, los sobrenadantes se filtraron usando un filtro de poros de 0,45 pm (Millipore). Los sobrenadantes libres de células se concentraron usando una unidad de filtro Amicon Ultra con un MwCO de 100 kDa, que elimina las proteínas y otras moléculas de menos de 100 kDa. Los sobrenadantes se centrifugaron con una ultracentrífuga Beckman coulter Optima L - 80XP (Beckman coulter, Estados Unidos) a 118000 *ga 4 °C durante 3 h. Los sobrenadantes se desecharon, se resuspendió el sedimento en el regulador PBS y se ultracentrifugaron por segunda vez (118000*g a 4 °C durante 3 h). Los gránulos se disolvieron a continuación en el suplemento B27 Glutamax de Neurobasal A , se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70 °C.

Procedimiento experimental

Las MV aisladas de las diferentes preparaciones bacterianas descritas anteriormente se añadieron a las PBMC en una relación de MV/célula de 500:1 y se incubaron durante 48 h. Los sobrenadantes del cultivo celular se recogieron y analizaron para determinar la inducción de citocinas usando ELISA.

ELISA

Los niveles secretados de la citocina IL-6 se midieron en sobrenadantes de cultivos celulares usando kits de ELISA tipo sándwich según las instrucciones del fabricante (MabTech AB). La absorbancia se midió a una longitud de onda de 405 nm usando un lector de microplacas (Molecular Devices Corp.) y los resultados se analizaron usando SoftMax Pro 5.2 rev C (Molecular Devices Corp.).

Resultados

Las microvesículas deLactobacillus reuteriDSM 32846 fueron más eficientes para inducir la producción de IL-6 en comparación con las microvesículas aisladas deLactobacillus reuteriDSM 17938 (figura 17). Además, las MV aisladas de ambas cepas deLactobacillus reuteritras el cultivo conjunto con una cepa deBifidobacterium longum(tanto con un 4 % de sobrenadante como con un 25 % de células) aumentaron la producción inducida de IL-6 en comparación con los controles (figuras 18, 19 y 20). Estos resultados muestran que las MV aisladas son más eficientes después de un tratamiento biótico durante el cultivo.

Ejemplo 12 - Las microvesículas (MV) derivadas deLactobacillus reuteriprotegen la integridad de la barrera epitelial del efecto perjudicial de laEscherichia colienterotoxigénica

Material y método

Aislamiento de microvesículas extracelulares (MV)

Las células bacterianasLactobacillus reuteriDSM 17938 oLactobacillus reuteriDSM 32846 se cultivaron en el medio Man-Rogosa-Sharpe, se recolectaron después de 24 h y se retiraron del caldo de cultivo centrifugando a 5000 *gdurante 10 min a 4 °C y seguido de centrifugación a 10000*g durante 10 min a 4 °C, tras lo cual cualquier célula residual se retiró del sobrenadante mediante filtración usando filtro de poros de 0,45 pm. Los sobrenadantes se concentraron usando el filtro Amicon Ultra (100 kDa), que elimina las proteínas y otras moléculas de menos de 100 kDa. Los sobrenadantes se centrifugaron mediante la ultracentrífuga Beckman Coulter Optima L - 80XP (Beckman coulter, Estados Unidos) a 118000*g a 4 °C durante 3 h. Los sobrenadantes se desecharon, los gránulos se resuspendieron en regulador PBS y se ultracentrifugaron por segunda vez (118000*g a 4 °C durante 3 h). Los gránulos se disolvieron a continuación en PBS, una alícuota y se almacenaron a -70 °C.

Permeabilidad intestinalin vitro(cocultivos de células Caco-2/HT29)

Cultivo de células epiteliales (Caco-2/HT29)

Las células epiteliales Caco-2 y HT29 se cultivaron por separado en frascos de cultivo de tejidos en el Modified Eagle's Medium de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10 % de suero bovino fetal, un 1 % de aminoácidos no esenciales y un 1 % de penicilina y estreptomicina, a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 con 90 % de humedad relativa. Las células Caco-2 y HT29 se cultivaron en matraces de cultivo tisular de 25 cm2 y se dividieron a una confluencia del 80-90 % usando una solución de tripsina al 0,25 % y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,02 %. Las células se sembraron a una densidad de 6x104 células por matraz de 25 cm2.

Cocultivos celulares

Integridad de la capa celular

La integridad de la capa celular se determinó usando dos métodos: Resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y determinación de la permeabilidad de la fluoresceína al isotiocianato dextrano (FITC-dextrano).

Las células Caco-2/HT29 sembradas se trataron previamente con células vivas deLactobacillus reuteriDSM 17938 oLactobacillus reuteriDSM 32846 con una multiplicidad del 100 % de bacterias (MOB) o microvesículas extracelulares (MV) deLactobacillus reuteriDSM 17938 oLactobacillus reuteriDSM 32846 con una multiplicidad de 200 MV (MOM) para 6 h antes del desafío con ETEC (patógenoE. colienterotoxigénica, conocida por tener un efecto perturbador en la integridad epitelial) con una multiplicidad de infecciones (MOI) del 100 % durante 6 h más. La TEE<r>se midió antes del pretratamiento y la exposición con ETEC, y a continuación se midió cada dos horas durante todo el desafío. Para cuantificar la permeabilidad paracelular de las monocapas, 1 mg/ml de isotiocianatodextrano de fluoresceína (FITC-dextrano) de 4 kDa; Sigma) se añadió al lado apical de los insertos al principio del desafío con ETEC. Se tomaron muestras del compartimento basolateral después de 6 h de incubación. El trazador fluorescente difuso se analizó entonces por triplicado mediante fluorometría (excitación, 485 nm); emisión, 520 nm) usando un lector de microplacas FLUOstar Omega (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania).

Resultados

El desafío con ETEC indujo una reducción del TEER, lo que ilustra que las MV derivadas deL. reuteriDSM 32846 fueron parcialmente capaces de proteger la monocapa epitelial de este desafío (figura 21). 6 h después de la exposición con ETEC, la disminución del TEER en el grupo ETEC alcanzó el 27 %, mientras que antes del tratamiento con las MV derivadas deL. reuteriDSM 32846 de 10, 50, 100 y 200 MOM mostraron una TEER considerablemente más alta en comparación con el grupo tratado con ETEC. Las células no tratadas permanecieron en torno al 90 %.

Este efecto protector de las MV derivadas deL. reuteriDSM 32846 contra el daño de ETEC en la monocapa también fue evidente en los experimentos de flujo de FITC-dextrano (figura 21). El tratamiento previo de las monocapas con MV derivadas de L. reuteri DSM 32846 de 10, 50, 100 y 200 MOM disminuyó la fuga de FITC-dextrano en comparación con el grupo ETEC.

Por lo tanto, las MV derivadas deL. reuteriDSM 32846 mostraron un efecto protector del daño inducido por ETEC a las monocapas de los cocultivos de Caco-2/HT29.

En la figura 22, se comparó el efecto protector de las MV derivadas de L.reuteriDSM 32846, tal como se muestra en el experimento de flujo de FITC-dextrano, con el efecto obtenido con las MV derivadas de L.reuteriDSM 17938. El tratamiento previo de las monocapas de células epiteliales con MV derivadas de L.reuteriDSM 32846 disminuyó la fuga de FITC-dextrano de modo más eficiente, específicamente a concentraciones más bajas de MV, en comparación con las MV derivadas deL. reuteriDSM 17938. Esto demuestra que las MV derivadas deL. reuteriDSM 32846 son más eficientes que las MV derivadas deL. reuteriDSM 17938 para proteger la integridad de la barrera epitelial. Las realizaciones descritas anteriormente deben entenderse como unos pocos ejemplos ilustrativos de la presente invención. Será evidente para los expertos en la técnica que pueden realizarse diversas modificaciones, combinaciones y cambios en las realizaciones sin abandonar el ámbito de la invención. En particular, pueden combinarse diferentes soluciones parciales en las diferentes realizaciones en otras configuraciones, cuando sea técnicamente posible. El ámbito de la presente invención queda definido, sin embargo, por las reivindicaciones adjuntas.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

i .Un método para producir microvesículas terapéuticas, el método comprende:

cultivar bacterias de una cepa bacteriana probiótica en un medio de cultivo, en donde la cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifídobacterium,y una combinación de las mismas; y

exponer la bacteria a un tratamiento biótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de microvesículas terapéuticas por parte de las bacterias, en donde el tratamiento biótico inductor se selecciona del grupo que consiste en cocultivar la bacteria con bacterias de otra cepa bacteriana, cultivar la bacteria en presencia de un medio acondicionado a partir de bacterias de otra cepa bacteriana y una combinación de las mismas, en donde la otra cepa bacteriana es una cepa deBifidobacteriumy en donde la otra cepa bacteriana es diferente de la cepa bacteriana probiótica.
2. El método según la reivindicación 1, en donde exponer las bacterias comprende exponer las bacterias al tratamiento biótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de las microvesículas terapéuticas y la liberación de las microvesículas terapéuticas en el medio de cultivo y, opcionalmente aislar las microvesículas terapéuticas del medio de cultivo.
3. El método según las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además exponer las bacterias a un tratamiento abiótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de microvesículas terapéuticas por parte de las bacterias, en donde el tratamiento abiótico inductor es preferiblemente un tratamiento con oxígeno, preferiblemente agitando las bacterias durante el cultivo y/o el burbujeo.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la otra cepa bacteriana es una cepa deBifídobacteriumlongum,preferiblemente seleccionada del grupo que consiste enB. longumDSM 32947,B. longumDSM 32948 y una combinación de las mismas.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la cepa bacteriana probiótica es una cepa deLactobacillus reuteri,preferiblemente seleccionada del grupo que consiste enL. reuteriDSM 17938,L. reuteriDSM 32846, y una combinación de las mismas.
6. Microvesículas terapéuticas aisladas de bacterias de una cepa bacteriana probiótica para su uso en el tratamiento de cólico, preferiblemente cólico infantil, o un trastorno o enfermedad gastrointestinal en bebés o niños, en donde la cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus, una cepa deBifidobacterium,y una combinación de las mismas.
7. Las microvesículas terapéuticas para su uso según la reivindicación 6, en donde la cepa bacteriana probiótica es una cepa deLactobacillus reuteri,preferiblemente seleccionada del grupo que consiste enL. reuteriDSM 17938,L. reuteriDSM 32846, y una combinación de las mismas.
8. Una cepa bacteriana, en donde la cepa bacteriana esBifidobacterium longumDSM 32947 oBifidobacterium longumDSM 32948, preferiblemente en forma deshidratada o liofilizada.
9. Una composición probiótica que comprende:

bacterias de una cepa deLactobacillus,preferiblemente una cepa deL. reuteri,y más preferiblemente una cepa deL. reuteriseleccionada del grupo que consiste enL. reuteriDSM 17938,L. reuteriDSM 32846, y una combinación de las mismas; y

las bacterias de una cepa deBifidobacterium longumseleccionadas del grupo que consiste enB. longumDSM 32947,B. longumDSM 32948 y una combinación de las mismas, o un medio acondicionado de la cepa deB. longum.
10. Una composición probiótica que comprende bacterias de una cepa bacteriana probiótica y microvesículas terapéuticas producidas por la cepa bacteriana probiótica o por otra cepa bacteriana probiótica al exponer las bacterias de la cepa bacteriana probiótica o la otra cepa bacteriana probiótica a un tratamiento biótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de las microvesículas terapéuticas por parte de la bacteria, en donde

la cepa bacteriana probiótica y la otra cepa bacteriana probiótica se seleccionan del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacterium,y una combinación de las mismas;

el tratamiento biótico inductor se selecciona del grupo que consiste en cocultivar las bacterias con bacterias de otra cepa bacteriana, cultivar las bacterias en presencia de un medio acondicionado a partir de bacterias de otra cepa bacteriana y una combinación de las mismas;

la otra cepa bacteriana es una cepa deBifidobacterium;y

la otra cepa bacteriana es diferente de la cepa bacteriana probiótica y la otra cepa bacteriana probiótica.
11. La composición probiótica según la reivindicación 10, en donde la composición probiótica comprende

un componente de acción lenta en forma de bacterias de la cepa bacteriana probiótica; y un componente de acción rápida en forma de microvesículas terapéuticas producidas por bacterias de la una cepa bacteriana probiótica o por la otra cepa bacteriana probiótica al exponer las bacterias al tratamiento biótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de las microvesículas terapéuticas por parte de las bacterias, en donde el componente de acción rápida y el componente de acción lenta producen juntos un efecto terapéutico prolongado cuando se suministran a un sujeto.
12. Microvesículas terapéuticas aisladas a partir de bacterias de una cepa bacteriana probiótica expuestas a un tratamiento biótico inductor durante el cultivo para inducir la producción de las microvesículas terapéuticas por parte de la bacteria, en donde

la cepa bacteriana probiótica se selecciona del grupo que consiste en una cepa deLactobacillus,una cepa deBifidobacterium,y una combinación de las mismas;

el tratamiento biótico inductor se selecciona del grupo que consiste en cocultivar las bacterias con bacterias de otra cepa bacteriana, cultivar las bacterias en presencia de un medio acondicionado a partir de bacterias de otra cepa bacteriana y una combinación de las mismas; y la otra cepa bacteriana es una cepa deBifidobacteriumy en donde la otra cepa bacteriana es diferente de la cepa bacteriana probiótica.
13. Una composición probiótica según la reivindicación 10 u 11 o las microvesículas terapéuticas según la reivindicación 12 para su uso como medicamento.
14. La composición probiótica según la reivindicación 10 u 11 o las microvesículas terapéuticas según la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de cólico, preferiblemente cólico infantil.
15. La composición probiótica según la reivindicación 10 u 11 o las microvesículas terapéuticas según la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en un trastorno o enfermedad gastrointestinal de bebés o niños, un trastorno de dolor gastrointestinal, una enfermedad de pérdida ósea y una enfermedad periodontal.