ES2984072T3 - Moléculas de unión internalizantes que actúan sobre receptores implicados en la proliferación celular o en ladiferenciación celular - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere al campo de las moléculas de unión que comprenden al menos un dominio de anticuerpo variable único, dirigido a receptores presentes en miofibroblastos y/o células estrelladas hepáticas (HSC). La invención también se refiere a una molécula de unión que comprende al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos, cada uno de los cuales se dirige a un receptor en las HSC y/o en los miofibroblastos. La invención se refiere además a ácidos nucleicos que codifican dichas moléculas de unión, a una célula huésped para la expresión de dichas moléculas de unión y a métodos para preparar dichas moléculas de unión. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden dicha molécula de unión y a usos de dichas moléculas de unión y/o composiciones, en particular para fines profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de unión internalizantes que actúan sobre receptores implicados en la proliferación celular o en la diferenciación celular
La invención se refiere al campo de las moléculas de unión que comprenden al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos, cada uno de los cuales actúa sobre un receptor en las células estrelladas hepáticas (CEH) y/o en los miofibroblastos. La invención en particular se refiere a moléculas de unión multiparatópicas que comprenden al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos y al menos una molécula diagnóstica o terapéutica, en donde el receptor es un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGFRB) y los al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos capaces de unirse específicamente al PDGFRB son al menos un dominio de anticuerpo variable único que comprende o que consiste en la SEQ ID N.°: 9 (SP02P) y al menos un dominio de anticuerpo variable único que comprende o que consiste en la SEQ ID N.°: 153 (SP26P). La invención se refiere además a ácidos nucleicos que codifican tales moléculas de unión; una célula hospedadora para la expresión de dichas moléculas de unión y a métodos para preparar dichas moléculas de unión. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas de unión y a usos de dichas moléculas y/o composiciones de unión, en particular con fines profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Enfermedad hepática crónica
La enfermedad hepática crónica (EHC) en el contexto clínico es un proceso patológico del hígado que implica un proceso de destrucción y regeneración progresiva del parénquima hepático que conduce a la fibrosis hepática (FH) y a la cirrosis hepática (CH), una afección caracterizada por cicatrices fibróticas, regeneración nodular del parénquima hepático y elevación de la presión arterial portal. La EHC puede ser causada por infecciones virales (por ejemplo, VHC), un síndrome metabólico (por ejemplo, EHNA) o el abuso de alcohol. La FH se caracteriza por la acumulación de proteínas de la matriz extracelular (MEC), la contracción del tejido y, como consecuencia, la alteración del flujo sanguíneo. Estos síntomas son causados por la activación de las CEH, que son pericitos que se encuentran en el espacio de Disse (una pequeña área entre los sinusoides y los hepatocitos). En términos generales, los pericitos son células contráctiles que envuelven las células endoteliales que recubren los capilares y las vénulas de todo el cuerpo. Tras la activación, las CEH se transdiferencian en miofibroblastos y comienzan a secretar grandes cantidades de proteínas de la MEC y citocinas profibrogénicas. Si no se trata, la acumulación de proteínas de la MEC hará que la FH progrese a Ch , que está clasificada como la duodécima causa de muerte en todo el mundo.
Terapias en la EHC
Las curas dirigidas a las causas primarias de la enfermedad hepática constituyen actualmente la estrategia más eficaz, pero solo existen para una minoría de etiologías. En general, el trasplante de hígado es el único tratamiento disponible para pacientes con enfermedad hepática crónica terminal. Dado el alto nivel de morbilidad y mortalidad, existe una clara necesidad de desarrollar enfoques terapéuticos (adicionales) para complementar, o potencialmente reemplazar, los métodos de tratamiento actuales. La investigación realizada sobre la EHC durante las últimas décadas ha mejorado la comprensión de la fisiopatología de la enfermedad, permitiendo el desarrollo de nuevos agentes dirigidos a los procesos patológicos subyacentes. Hasta el momento, no existen terapias medicinales específicas aprobadas para la EHC y, aunque actualmente se están evaluando terapias más nuevas, los estudios de estos tratamientos se encuentran en una fase relativamente temprana.
Una alternativa a las terapias actuales sería la reducción y eventual desaparición de la hipertensión portal y/o del tejido cicatricial fibrótico en el hígado. En teoría, las terapias antifibróticas pueden centrarse en diferentes aspectos de la fibrogénesis, incluida la inhibición del depósito de matriz o la síntesis de colágeno y la descomposición del tejido fibrótico recién formado. Se cree que el colágeno recién sintetizado es más susceptible a la degradación que el colágeno viejo; sin embargo, los estudios en animales han demostrado que incluso la cirrosis avanzada es reversible y los datos en humanos sugieren lo mismo. Los avances recientes en la comprensión de la patogénesis de la fibrosis hepática están dando lugar a nuevos enfoques terapéuticos para la fibrosis hepática. Se han estudiado fármacos con “actividad antifibrótica” en ensayos clínicos, pero han demostrado ser ineficaces, especialmente debido a su toxicidad sistémica. La aplicación terapéutica de estas moléculas (a menudo pequeñas), como los inhibidores de la Rho-quinasa y los inhibidores de la quinasa JAK-2, se ha visto obstaculizada por su complejo perfil farmacodinámico y cinético.
Por tanto, existe la necesidad de una terapia y un diagnóstico mejorados para la EHC, en particular para la fibrosis hepática.
Moléculas de unión anti-PDGFRB
En el documento US 9650444 B2 se han descrito anticuerpos anti-PDGFRB antagonistas e internalizantes. En dicho documento, además, se sugiere el uso de dichos anticuerpos anti-PDGFRB en el tratamiento de la fibrosis y se refiere a anticuerpos anti-PDGFRB conjugados con una fracción terapéutica.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona dicha terapia o diagnóstico alternativo y mejorado en forma de una molécula de unión multiparatópica que comprende al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos y al menos una molécula diagnóstica y/o terapéutica, en donde los al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos son capaces de unirse específicamente a un receptor transmembrana expresado en una célula estrellada hepática (CEH) y/o en un miofibroblasto y son al menos un dominio de anticuerpo variable único que comprende o consiste en la SEQ ID N.°: 9 (Sp02P) y al menos un dominio de anticuerpo variable único que comprende o consiste en la SEQ ID N.°: 153 (SP26P).
Dicha molécula de unión permite actuar sobre una célula estrellada hepática o miofibroblasto activado, mediante la unión a un receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRB), que tiene un alto nivel de expresión en dichas células.
Las moléculas de unión se unen preferiblemente a una toxina o un fármaco mediante, por ejemplo, una porción conectora que comprende un complejo de metal de transición Pt(II). En particular, cuando el fármaco es un inhibidor de la quinasa, tal como una RHO-quinasa, un inhibidor de JAK-2 o un inhibidor de la neprilisina, una molécula de unión según la invención proporciona preferiblemente una relajación de las CEH o miofibroblastos activados, que, por ejemplo, atenúa la fibrosis hepática. El uso de la porción conectora reduce la toxicidad (fuera de la diana) que generalmente se observa con estos inhibidores de la quinasa.
En la enfermedad hepática, la administración selectiva de un fármaco a células (activadas) que desempeñan un papel crucial en la aparición, el mantenimiento y la exacerbación de la fibrosis, por ejemplo, las células estrelladas hepáticas (CEH), es una vía interesante que explorar. El direccionamiento del fármaco hacia receptores como PDGFRB e IGF2R, cuyo número está incrementado en las CEH activadas, se puede utilizar para llegar a un tratamiento medicinal eficaz de la enfermedad hepática. En la presente invención, el direccionamiento hacia PDGFRB se considera un medio importante ya que, a través de dicho direccionamiento, se induce la internalización de una molécula proteica que comprende, por ejemplo, un inhibidor de la rhoquinasa, un inhibidor de la quinasa JAK-2 o un inhibidor de la neprilisina.
La invención proporciona además un ácido nucleico que codifica una molécula de unión según la invención y una célula hospedadora para la expresión de una molécula de unión según la invención, que comprende un ácido nucleico según la invención.
Como la molécula de unión según la invención que comprende una molécula terapéutica es particularmente adecuada para el tratamiento de, por ejemplo, la fibrosis o el cáncer, la invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de unión según la invención y al menos un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Dicha composición farmacéutica puede comprender además al menos otro compuesto útil en el tratamiento de la enfermedad hepática crónica. Una composición farmacéutica según la invención es particularmente útil como tratamiento adyuvante del sangrado por varices en presencia de hipertensión portal o para su uso en el tratamiento de enfermedades hepáticas.
Como la molécula de unión según la invención que comprende una molécula diagnóstica es particularmente adecuada para el diagnóstico de, por ejemplo, la fibrosis hepática, la invención proporciona una composición diagnóstica que comprende al menos una molécula de unión según la invención que comprende una molécula diagnóstica, preferiblemente un agente para la formación de imágenes y un diluyente y/o excipiente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Descripción general del proceso de investigación desde (A) la creación de bibliotecas de VHH a partir de muestras de sangre de llamas inmunizadas, hasta (B) la selección de presentación en fagos y (C) la selección de clones para la detección (figura adaptada de Schoonooghe S.et al, Immunobiology2012, 217: 1266-1272).
Figura 2: Ensayo de unión de VHH seleccionados por IGF2R al ectodominio de IGF2R humano.
Figura 3. Producción de fagos de la primera ronda de selección de las bibliotecas de PDGFRB en el ectodominio de PDGFRB humano (bibliotecas 152 y 153) y en el ectodominio de PDGFRB de rata (bibliotecas 154 y 155).Figura 4. Producción de fagos de la segunda ronda de selección de las bibliotecas de PDGFRB en células SCC VII transfectadas con PDGFRB humano (bibliotecas 152 y 153) o PDGFRB de rata (bibliotecas 154 y 155).Figura 5. Secuencia de aminoácidos de VHH de PDGFRB humanos (CDR subrayadas). Las afinidades se miden en el ectodominio (ECD) de PDGFRB humano, células SCC VII transfectadas con el receptor de PDGFRB humano (SCC-hPDGFRB) y la línea de células estrelladas hepáticas humanas (LX-2). Se incluyen datos de los ensayos competitivos para categorizar los VHH en diferentes grupos de epítopos.
Figura 6. Secuencia de aminoácidos de VHH de PDGFRB de rata (CDR subrayadas). Las afinidades se miden en el ectodominio (ECD) de PDGFRB de rata y en células de carcinoma de células escamosas transfectadas con el receptor de PDGFRB de rata (SCC-rPDGFRB). Se incluyen datos de los ensayos competitivos para categorizar los VHH en diferentes grupos de epítopos.
Figura 7. Vector de expresión mostrado esquemáticamente con el inserto de VHH con cola peptídica y etiqueta de purificación.
Figura 8. Construcción y caracterización de construcciones de VHH bivalentes y biparatópicas dirigidas contra IGF2R humano. A. Representación esquemática de los formatos de VHH monovalentes, bivalentes y biparatópicos. En los formatos bivalente y biparatópico, dos VHH se fusionan con una porción conectora flexible (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (GGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID N.°: 369). Todos los formatos contienen una cisteína C-terminal para la conjugación dirigida con sondas reactivas al tiol y una etiqueta de hexahistidina (HHHHHH; SEQ ID N.°: 370) o una etiqueta EPEA (EPEA; SEQ ID N.°: 371) para la purificación por cromatografía de afinidad. B. Unión de construcciones de VHH de IGF2R antihumano al ectodominio de IGF2R humano recombinante. C. Bmax y K<d>+ intervalos de confianza del 95 % para VHH seleccionados.
Figura 9. Unión de VHH seleccionados en células SCC VII transfectadas con el receptor PDGFRB humano o de rata (SCC-hP o SCC-rP) fusionado a GFP. El VHH se detecta utilizando suero de conejo anti-VHH y anticuerpo secundario anti-conejo de burro marcado con IRDye800CW.
Figura 10. Análisis de inmunoadsorción enzimática (ELISA) competitivo con VHH dirigidos contra IGF2R humano.
Figura 11. Análisis de inmunoadsorción enzimática (ELISA) competitivo con SP02P y SP26P en ECD de PDGFRB.
Figura 12. Unión de 13F11-13E8 (F11E8) a células de SCC que expresan IGF2R humano o de rata.
Figura 13. Unión de 13F11-13E8-ABD (F11E8-ABD) a IGF2R y albúmina sérica. A) Ensayo de unión en ECD de IGF2R humano recombinante. B) Ensayo de unión a albúmina sérica de diferentes especies. C) Concentraciones séricas de F11E8-ABD y F11E8 en ratas después de la inyección intravenosa. Se muestran las concentraciones séricas evaluadas mediante ELISA. LDD: aproximadamente 20 nM.
Figura 14. Unión de 13F11-13E8-ABD conjugado con Alexa Fluor 488 (FE-A-A488) a células estrelladas hepáticas primarias de rata activadas.
Figura 15. Ensayos de unión utilizando VHH de PDGFRB. A) Ensayo de unión utilizando VHH específicos de PDGFRB humano en ECD de PDGFRB humano. B) Ensayo de unión utilizando SP28-SP26P biparatópico (SP28-26P) en células diana que expresan PDGFRB humano, de rata e IGF2R humano. C) Ensayo de unión utilizando SP02P-SP26P biparatópico en células diana que expresan PDGFRB humano, de rata e IGF2R humano.
Figura 16. Internalización de 13F11 y 13F11-13E8 en células diana que expresan IGF2R, aumento de 63x. Las barras de escala son de 30 |_im. A. a 549 (positivo para IGF2R). B. NIH 3T32.2 transfectado transitoriamente con IGF2R humano. C. NIH 3T3 2.2 transfectado de manera simulada. D. Control de lavado con ácido en células A549.
Figura 17. Tasas de internalización de 13F11-13E8 (F11E8) y 13E8-13F11 (E8F11) en células de SCC que expresan IGF2R humano o de rata.
Figura 18. Internalización en células LX-2 de VHH monovalentes (13F11) y biparatópicos (13F11-13E8 y 13E8-13F11) conjugados con el colorante rojo pHrodo sensible al pH.
Figura 19. Tasas de internalización de SP02P-SP26P en células de SCC y células LX-2 que expresan PDGFRB humano.
Figura 20. Ensayo de contracción en células estrelladas hepáticas activadas (CEH). Se muestra el área medida del gel después de 6 días de incubación con las NDC. La contracción de las células LX-2 sin ningún inhibidor se fijó en una relajación del 0 %, mientras que BDM 1 pM se fijó en una relajación del 100 %. Nota: para el medio no se observó inhibición de la contracción.
Figura 21. Unión por inmunofluorescencia de 13F11-13E8-ABD (F11E8-ABD) a secciones de hígado de rata cirrótico (BDL) y sano (SHAM).
Figura 22. Expresión de IGF2R en diversos tejidos derivados de ratas cirróticas (BDL) y sanas (SHAM).
Figura 23. Cambio en la presión portal (PP) y la presión arterial media (PAM) en ratas BDL en función de los minutos después de la administración de A) l3F11-13E8-ABD-Y27632 (conjugado de prueba) y B) 13F11-13E8-ABD-etilo (conjugado simulado).
Figura 24. Direccionamientoin vivode 13F11-13E8-ABD-Y27632 (conjugado de prueba) a IGF2R en ratas BDL y SHAM. A) Detecciónin situdel conjugado de prueba infundido. Criosecciones de hígado de ratas BDL (superior) y ratas SHAM (inferior) sondadas para detectar la presencia de conjugado de prueba con un anticuerpo de detección específico de VHH (verde). El conjugado de prueba se detecta claramente en las capas celulares que recubren los sinusoides obstruidos en el hígado cirrótico de ratas BDL, y no en el hígado sano de ratas SHAM. B) Distribución del conjugado de prueba frente a la distribución (en tejido) de IGF2R. Las mismas criosecciones también se tiñeron para detectar IGF2R utilizando F11E8 conjugado con fluoróforo (rojo). El conjugado de prueba muestra colocalización con IGF2R (verde con rojo: amarillo). Cabe destacar que algunas áreas más profundas muestran expresión de IGF2R (rojo) en ausencia del conjugado de prueba, lo que sugiere que la penetración en el tejido aún estaba en curso y no se había completado al final de la única hora del estudioin vivo.De acuerdo con observaciones anteriores, no se detectó IGF2R en el hígado de ratas SHAM.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En primer lugar, cabe señalar que todos los pasos, métodos y técnicas que no se describen específicamente en detalle se pueden realizar de una manera conocida de por sí, como quedará claro para el experto, a menos que se indique lo contrario. Se hace referencia a manuales estándar y al conocimiento general común mencionado en el presente documento que describen técnicas para la ingeniería de proteínas, tales como maduración por afinidad y otras técnicas para mejorar la especificidad y otras propiedades deseadas de restos de unión, presentes en una molécula de unión según la invención, tales como un anticuerpo de dominio variable único de inmunoglobulina (ISVD), un dominio variable de una cadena pesada (VH), un dominio variable de un anticuerpo con una única cadena pesada (VHH), un anticuerpo de dominio (dAb) o un anticuerpo de dominio único (sdAb). Debe tenerse en cuenta que, tal como se utilizan en este documento, las formas singulares "un", "una" y "el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
El término “y/o”, dondequiera que se utilice en este documento, incluye el significado de "y", "o" y "todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término". El término “alrededor de” o "aproximadamente", como se usa en el presente documento, significa dentro del 25 %, preferiblemente dentro del 20 %, más preferiblemente dentro del 15 % y, de la manera más preferible, dentro del 10 % de un valor o rango dado. A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender” y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de la característica indicada, pero no la exclusión de cualquier otra característica. Cuando se utiliza en el presente documento, el término "que comprende" puede sustituirse por el término "que contiene" o "que incluye" o "que tiene". Por el contrario, la palabra “que consiste en”, en combinación con (una) característica(s), significa la inclusión de la(s) característica(s) mencionada(s) pero la exclusión de cualquier otra(s) característica(s).
En una primera forma de realización, la invención proporciona una molécula de unión que comprende al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos y al menos una molécula diagnóstica o terapéutica, en donde al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos son capaces de unirse específicamente a un receptor transmembrana que es PDGFRB y se expresa en las CEH y/o miofibroblastos activados, que se caracterizan preferiblemente por una mayor proliferación, contractilidad, quimiotaxis y producción mejorada de proteínas de la matriz extracelular (MEC) (por ejemplo, colágeno), y en donde los al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos son al menos un dominio de anticuerpo variable único que comprende o que consiste en la s Eq ID N.°: 9 (SP02P) y al menos un dominio de anticuerpo variable único que comprende o que consiste en la SEQ ID N.°: 153 (SP26P). Para obtener una descripción completa de cómo determinar preferiblemente si las CEH están activadas o no, véase: Tscuchida et al. (Mechanisms of hepatic stellate cell enable, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2017).
Una molécula terapéutica comprendida dentro de una molécula de unión según la invención induce preferiblemente la relajación de las CEH, que es un signo de activación disminuida de las CEH, disminuyendo así el proceso de fibrogénesis iniciado por la enfermedad hepática primaria. Un ejemplo de dicha molécula terapéutica es Y27632, una molécula pequeña inhibidora de quinasa que se ha demostrado que induce la relajación de CEH en un ejemplo práctico de la presente invención. En particular, se ha demostrado que una molécula de unión de la invención en particular interactúa con los receptores en las CEH activadas. Los estudios demuestran de forma preliminar el planteamiento de que una molécula de unión de la invención puede usarse para tratar a pacientes con fibrosis hepática. También demuestran que una molécula de unión de la invención no interfiere con la actividad plaquetaria.
Una molécula de unión de la presente invención como se define en las reivindicaciones adjuntas debe ser capaz de unirse específicamente a un receptor transmembrana expresado en las células estrelladas hepáticas, en particular en las células estrelladas hepáticas activadas y/o en los miofibroblastos. Algunos ejemplos de receptores que se expresan en cantidad suficiente en las CEH y/o en los miofibroblastos activados son, por ejemplo, PDGFRB e lGF2R. Por tanto, los al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos de la molécula de unión según la invención son capaces de unirse específicamente al receptor transmembrana PDGFRB.
El PDGF es uno de los numerosos factores de crecimiento que regulan el crecimiento y la división celular. En particular, el PDGF desempeña un papel importante en la formación de vasos sanguíneos, el crecimiento de vasos sanguíneos a partir de tejido de vasos sanguíneos ya existente, la mitogénesis, es decir, la proliferación, de células mesenquimales como fibroblastos, osteoblastos, tenocitos, células del músculo liso vascular y células madre mesenquimales, así como la quimiotaxis, la migración dirigida, de células mesenquimales. El PDGF es una glicoproteína dimérica que puede estar compuesta por dos subunidades A (PDGF-AA), dos subunidades B (PDGF-BB) o una de cada (PDGF-AB). El PDGF es un potente mitógeno (una proteína que estimula a una célula para que comience la división celular, desencadenando la mitosis) para las células de origen mesenquimatoso, incluidos los fibroblastos, las células del músculo liso y las células gliales. Tanto en ratones como en seres humanos, la red de señalización de PDGF consiste en cinco ligandos, PDGF-AA, -BB, -AB, -CC y -DD, y dos receptores, PDGFR-alfa (PDGFRA) y PDGFR-beta (PDGFRB). Todos los PDGF funcionan como homodímeros secretados unidos por enlaces disulfuro, pero solo PDGFA y PDGFB pueden formar heterodímeros funcionales. El PDGF se sintetiza excesivamente tras la activación de las CEH, como puede ocurrir en el alcoholismo o la hepatitis. Como tal, se produce la activación y la división celular de los fibroblastos, lo que da lugar a un tejido conectivo que es especialmente frecuente en la cicatrización de heridas. El PDGF es un elemento necesario en este proceso. En esencia, los PDGF permiten que una célula se salte los puntos de control G1 para poder dividirse. Se ha demostrado que, en monocitos-macrófagos y fibroblastos, el PDGF administrado de forma exógena estimula la quimiotaxis, la proliferación y la expresión génica y aumenta significativamente la afluencia de células inflamatorias y fibroblastos, acelerando la formación de la matriz extracelular y de colágeno y reduciendo así el tiempo necesario para que finalice el proceso de cicatrización. Las CEH inactivas expresan PDGFRA, mientras que las CEH cambian a la expresión de PDGFRB tras la activación. Las CEH se activan por la lesión y muerte de las células hepáticas, lo que da como resultado la fibrogénesis. El receptor de manosa 6-fosfato/factor de crecimiento similar a la insulina 2 (M6P/IGF2R) desempeña un papel importante en la fibrogénesis temprana al participar en la activación del PDGFB transformador latente, un potente inductor de las proteínas de la matriz en las CEH activadas que producen la cirrosis hepática. El IGF2R es una glicoproteína transmembrana que participa en la eliminación de ligandos extracelulares (IGF-II), la activación de ligandos extracelulares (TGFP) y en la clasificación de enzimas lisosomales recién sintetizadas, etiquetadas con M6P, de la red trans-Golgi (TGN) a los lisosomas. Debido a esta función, el IGF2R circula entre los endosomas de clasificación, el compartimento de reciclaje endocítico, TGN, los endosomas tardíos y la membrana plasmática (Maxfield & McGraw, Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32).
Una molécula de unión según la invención se puede utilizar para una variedad de enfermedades fibróticas, en las que desempeñan un papel los miofibroblastos que expresan uno de los receptores transmembrana descritos anteriormente, tales como, por ejemplo, la fibrosis hepática, la fibrosis pulmonar o la fibrosis renal. En un ejemplo práctico, la invención proporciona un estudio preliminar de eficacia en CEH (activadas). Sin embargo, en la fibrogénesis hepática, se cree que las células estrelladas hepáticas (CEH) activadas se transdiferencian en miofibroblastos (Yuchang Li, et al. Mesothelial-mesenchymal Transition in theliver. PNAS (2013), 110: 2324 2329), que expresan abundantemente PDGFRB y IGF2R. Otra fuente importante de miofibroblastos hepáticos en el hígado fibrótico, tanto en modelos experimentales de fibrosis hepática como en pacientes con enfermedad hepática, son los fibroblastos portales (Jun Xu, et al. The Types of hepatic myofibroblasts listening toliver fibrosis of different etiologies. Frontiers in pharmacology (2014)), 5: 167). Por lo tanto, en una forma de realización preferida, se proporciona una molécula de unión según la invención, en la que el miofibroblasto es un miofibroblasto hepático. Preferiblemente, el miofibroblasto deriva de una CEH o un fibroblasto portal, más preferiblemente de una CEH. "Derivado de" en este contexto se refiere a la diferenciación de la célula original (el CEH o fibroblasto portal) en el miofibroblasto. El término "miofibroblasto" incluye preferiblemente las células similares a miofibroblastos que están en transición de CEH o fibroblasto portal al miofibroblasto y que pueden tener un fenotipo intermedio entre la célula original y el miofibroblasto. Las CEH inactivas generalmente expresan desmina, marcadores neuronales, como la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), la sinaptofisina, la sinemina y el receptor p75 del factor de crecimiento nervioso (Geerts A. (2001). History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin. Liver Dis. 21 31133510.1055/s-2001-17550; Bataller R., Brenner D. A. (2005). Liver fibrosis. J. Clin. Invest. 115, 209218). Además, se identificaron Nr1d2, Adipor1, Adpf, Dbp, Prei4 y Foxj1 como marcadores únicos asociados con el fenotipo inactivo de CEH (Liu X., Xu J., Brenner D. A., Kisseleva T. (2013). Reversibility of Liver Fibrosis and Inactivation of Fibrogenic Myofibroblasts. Curr. Pathobiol. Rep. 1, 209-214). En respuesta a la lesión hepática fibrogénica y la liberación de TGFP1, las CEH inactivas se activan rápidamente. Reducen el número de gotitas de lípidos y marcadores neuronales que contienen vitamina A, y se diferencian en CEH/miofibroblastos activados que expresan colágeno de tipo I y aSMA (Bataller y Brenner, 2005; Forbes S. J., Parola M. (2011). Liver fibrogenic cell. Best Pract. Res. Res. Clin. Gastroenterol. 25, 207-217). También aumentan la producción de metaloproteinasas de matriz MMP, especialmente MMP13, y sus inhibidores TIMP (Uchinami H., Seki E., Brenner D. A., D'Armiento J. (2006). Loss of MMP 13 attenuates murine hepatic injury and fibrosis during cholestasis. Hepatology 44, 420-429). Además, las CEH activadas aumentan Crlf1, Spp1, Lox, LoxL2, IL-17Ra, Fosl1 y Folr1, genes que están asociados únicamente con el fenotipo CEH/miofibroblastos activados (Liu et al., Reversibility of Liver Fibrosis and Inactivation of Fibrogenic Myofibroblasts. Curr. Pathobiol. Rep. 2013, 1: 209-214).
En particular, cuando la molécula de unión comprende una molécula terapéutica que actúa dentro de la célula, se prefiere que la molécula de unión sea absorbida por la célula, por ejemplo, a través de la internalización de ligandos o anticuerpos. La internalización de ligandos se define como un proceso endocítico mediado por un receptor en el que la célula solo absorberá una molécula extracelular (por ejemplo, un ligando (natural) o un anticuerpo) si se une a su proteína receptora específica en la superficie de la célula. La endocitosis es un proceso mediante el cual las células internalizan materiales no particulados, como proteínas o polisacáridos, envolviéndolos. Por tanto, en una forma de realización preferida, se proporciona una molécula de unión según la invención, en la que la unión de la molécula de unión al receptor permite la inducción de la internalización del ligando o anticuerpo.
Una molécula de unión puede comprender dos dominios de anticuerpo variables únicos que son capaces de unirse a dos antígenos diferentes, por ejemplo, epítopos en el mismo antígeno, es decir, dos epítopos diferentes en un receptor. Esta última también se denomina molécula de unión biparatópica. Una molécula de unión también puede comprender dos dominios de anticuerpo variables únicos que son ambos específicos para el mismo epítopo. Dicha molécula de unión, que también se conoce como molécula de unión bivalente, no puede unirse a dos epítopos en un solo receptor (ya que generalmente no hay dos de esas secuencias de epítopos presentes en la secuencia de un receptor (a menos que sea un dímero), pero es capaz de unir la misma secuencia de epítopo en dos receptores del mismo tipo, por ejemplo, dos receptores de PDGF que están cerca uno del otro. El efecto es que la molécula de unión bivalente entrecruza los dos receptores, induciendo así la internalización de los receptores y la molécula de unión unida a ellos. En el caso de una molécula de unión biparatópica, la unión da como resultado la oligomerización del receptor, lo que mejora aún más la internalización del receptor. Por lo tanto, se proporciona una molécula de unión de acuerdo con la invención, en la que la molécula de unión es una molécula de unión multiparatópica, preferiblemente biparatópica. Alternativamente o en combinación con una especificidad multiparatópica, se prefiere que la molécula de unión sea una molécula de unión multivalente, preferiblemente bivalente. Alternativamente, o en combinación con una especificidad multiparatópica, una especificidad bivalente o ambas, se prefiere que la molécula de unión sea una molécula de unión multiespecífica, preferiblemente biespecífica. Una molécula de unión de la presente invención puede así combinar múltiples dominios de anticuerpo variables únicos, en los que, por ejemplo, dos son bivalentes entre sí y, además, biparatópicos y/o biespecíficos con respecto a un tercer, cuarto, quinto o incluso sexto dominio de anticuerpo variable único. Aunque una molécula de unión según la invención puede comprender más de seis dominios de anticuerpo variables únicos, se prefiere que una molécula de unión según la invención comprenda 2 - 6, preferiblemente 2 - 4, más preferiblemente 2 dominios de anticuerpo variables únicos, para facilitar la producción y que han mostrado excelentes resultados en modelos animales, tal y como se ha definido anteriormente y a continuación.
Un dominio de anticuerpo variable único presente en una molécula de unión según la invención puede ser cualquier tipo de dominio de anticuerpo variable único. Los dominios de anticuerpo variables únicos clásicos son dominios variables de (partes de) anticuerpos, tales como un anticuerpo de dominio (único) o un anticuerpo de dominio variable único de inmunoglobulina. Preferiblemente, los al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos se seleccionan, independientemente entre sí, del grupo que consiste en un anticuerpo de dominio variable único de inmunoglobulina (ISVD), un dominio variable de una cadena pesada (VH), un dominio variable de un anticuerpo con una única cadena pesada (VHH), un anticuerpo de dominio (dAb) o un anticuerpo de dominio único (sdAb). Más preferiblemente, los al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos son anticuerpos de dominio variable único, preferiblemente dominios variables de un anticuerpo con una única cadena pesada. Se prefieren estos ((estas) partes de) anticuerpos más pequeño(a)s porque, en particular en un formato en tándem (por ejemplo, bivalente o biparatópico), muestran una alta capacidad de internalización y una penetración tisular óptima gracias a su tamaño más pequeño.
El término "dominio variable único de inmunoglobulina" ("ISVD"), utilizado indistintamente con "dominio variable único", define moléculas en las que el sitio de unión al antígeno está presente en un único dominio de inmunoglobulina y está formado por este. Esto distingue los dominios variables únicos de inmunoglobulina de las inmunoglobulinas "convencionales" o sus fragmentos, en las que dos dominios de inmunoglobulina, en particular dos dominios variables, interactúan para formar un sitio de unión a antígeno. Normalmente, en las inmunoglobulinas convencionales, un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) interactúan para formar un sitio de unión a antígeno. En este caso, las regiones determinantes de la complementariedad (CDr ) tanto de VH como de VL contribuirán al sitio de unión al antígeno, es decir, un total de seis CDR estarán implicadas en la formación del sitio de unión al antígeno. Por el contrario, el sitio de unión de un dominio variable único de inmunoglobulina está formado por un único dominio VH o VL. Por lo tanto, el sitio de unión al antígeno de un dominio variable único de inmunoglobulina está formado por no más de tres CDR. Por lo tanto, el término "dominio variable único de inmunoglobulina" no comprende inmunoglobulinas convencionales o fragmentos de estas que requieran la interacción de al menos dos dominios variables para la formación de un sitio de unión a antígeno. Este también es el caso de formas de realización de la invención que "comprenden" o "contienen" un dominio variable único de inmunoglobulina. Por lo tanto, una molécula de unión o una composición que "comprende" o "contiene" un dominio variable único de inmunoglobulina puede estar relacionada, por ejemplo, con construcciones que comprenden más de un dominio variable único de inmunoglobulina. Alternativamente, puede haber otros constituyentes distintos de los dominios variables únicos de inmunoglobulina, por ejemplo, agentes auxiliares de diferentes tipos, etiquetas proteicas, colorantes, tintes, etc. Sin embargo, estos términos comprenden fragmentos de inmunoglobulinas convencionales en las que el sitio de unión al antígeno está formado por un único dominio variable. Por lo general, los dominios variables únicos serán secuencias de aminoácidos que consisten esencialmente en cuatro regiones estructurales (FR1 a FR4, respectivamente) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente). Dichos dominios y fragmentos variables únicos comprenden, de la manera más preferible, un dominio de inmunoglobulina o son capaces de formar, en condiciones adecuadas, un dominio de inmunoglobulina. Como tal, el dominio variable único puede, por ejemplo, comprender una secuencia de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia VL) o un fragmento adecuado de la misma; o una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia VH o una secuencia VHH) o un fragmento adecuado de la misma; siempre que sea capaz de formar una única unidad de unión a antígeno (es decir, una unidad de unión a antígeno funcional que consiste esencialmente en un único dominio variable, de modo que el dominio de unión a antígeno único no necesite interactuar con otro dominio variable para formar una unidad funcional de unión a antígenos, como es, por ejemplo, el caso de los dominios variables que están presentes, por ejemplo, en anticuerpos convencionales y fragmentos scFv que necesitan interactuar con otro dominio variable (por ejemplo, a través de una interacción VH/VL) para formar un dominio de unión a antígeno funcional). En una forma de realización de la invención, los dominios variables únicos de inmunoglobulina son secuencias de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia VL) o secuencias de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia V<h>); más específicamente, los dominios variables únicos de inmunoglobulina pueden ser secuencias de dominio variable de cadena pesada que se derivan de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o secuencias de dominio variable de cadena pesada que se derivan de un anticuerpo de cadena pesada (por ejemplo, un VHH). Para una descripción general de los anticuerpos de cadena pesada y sus dominios variables, se hace referencia, entre otros, a la técnica anterior citada en el presente documento, así como a la técnica anterior mencionada en la página 59 del documento WO 08/020079 y a la lista de referencias mencionada en páginas 41-43 de la solicitud internacional WO 06/040153. Como se describe en estas referencias, las secuencias de VHH y las secuencias de VHH parcialmente humanizadas pueden caracterizarse en particular por la presencia de uno o más "residuos distintivos" en una o más de las secuencias estructurales. Una descripción adicional de los VHH, incluyendo la humanización de los VHH, así como otras modificaciones, partes o fragmentos, derivados o "fusiones de VHH", construcciones multivalentes (incluyendo algunos ejemplos no limitantes de secuencias enlazadoras) y diferentes modificaciones para aumentar la semivida en suero de los VHH y sus preparaciones se puede encontrar, por ejemplo, en los documentos WO 08/101985 y WO 08/142164. Un ejemplo es, por ejemplo, la presencia de un dominio de unión con afinidad por la albúmina sérica humana. Por lo tanto, para aumentar la semivida de las moléculas de unión según la presente invención, dichas moléculas de unión comprenden preferiblemente uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión que aumentan dicha semivida en comparación con una molécula de unión sin dichos grupos, residuos, restos o unidades de unión. Estos grupos, residuos, restos o unidades de unión también se denominan prolongadores de la semivida. Los prolongadores de la semivida para su uso en las moléculas de unión según la presente invención aumentan preferiblemente la semivida en suero de las moléculas de unión en humanos al menos 1 hora, preferiblemente al menos 2 horas o más. Pueden aumentar la semivida más de 6 horas, tal como más de 12 horas o incluso más de 24, 48 o 72 horas.
Una unidad de unión particularmente preferida para usar en las moléculas de unión según la presente invención es un dominio de unión a albúmina, un VHH de unión a albúmina o una cola Fc de anticuerpo o fragmento del mismo.
Para el término "dAb" o "sdAb", se hace referencia, por ejemplo, a Wardet al.1989 (Nature 341 (6242): 544-6), a Holtet al.2003(Trends Biotechnol.21(11): 484-490) así como, por ejemplo, a los documentos WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388.
También cabe señalar que, aunque son menos preferidos en el contexto de la presente invención porque no son de origen mamífero, los dominios variables únicos también pueden derivarse de ciertas especies de tiburón (por ejemplo, los llamados "dominios IgNAR", véase, por ejemplo, WO 05/18629) así como de ratones (por ejemplo, los llamados humabodies de Crescendo Biologics). Se puede considerar que la secuencia de aminoácidos y la estructura de una secuencia de inmunoglobulina, en particular un dominio variable único de inmunoglobulina, (sin limitarse, sin embargo, a ello) está compuesta por cuatro regiones estructurales o "FR", a las que se hace referencia en la técnica. y en el presente documento como "Región estructural 1" o "FR1", como "Región estructural 2" o "FR2", como "Región estructural 3" o "FR3", y como "Región estructural 4" o "FR4", respectivamente. Estas regiones estructurales están interrumpidas por tres regiones determinantes complementarias o "CDR", a las que se hace referencia en la técnica como "Región determinante de complementariedad 1" o "CDR1", como "Región determinante de complementariedad 2" o "CDR2", y como "Región determinante de complementariedad 2" o "Región determinante de complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente. El número total de residuos de aminoácidos en un dominio variable único de inmunoglobulina puede estar en la región de 110-120, preferiblemente es 112-115 y, de la manera más preferible, es 113. Sin embargo, cabe señalar que las partes, fragmentos, análogos o derivados de un dominio variable único de inmunoglobulina no están particularmente limitados en cuanto a su longitud y/o tamaño, siempre que dichas partes, fragmentos, análogos o derivados cumplan con los requisitos adicionales descritos en el presente documento y también sean preferiblemente adecuados para los fines descritos en el presente documento. Por lo tanto, el término "dominio variable único de inmunoglobulina" o "dominio de anticuerpo variable único" comprende péptidos que se derivan de una fuente no humana, preferiblemente de un camélido, preferiblemente como un anticuerpo de cadena pesada de camello. Pueden estar humanizados, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, en los documentos WO 08/101985 y WO 08/142164. Además, el término comprende moléculas de unión derivadas de fuentes distintas de camélidos, por ejemplo, de ratón o humano, que se han "camelizado", como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, en los documentos WO 08/101985 y WO 08/142164. El término "dominio variable único de inmunoglobulina" abarca secuencias de inmunoglobulina de diferente origen, que comprenden secuencias de inmunoglobulina de ratón, rata, conejo, burro, ser humano y camélido. También incluye secuencias de inmunoglobulinas completamente humanas, humanizadas o quiméricas. Por ejemplo, comprende secuencias de inmunoglobulina de camélido y secuencias de inmunoglobulina de camélido humanizado o dominios variables únicos de inmunoglobulina de camélido, por ejemplo, dAb camelizado como lo describen Wardet al.(véase, por ejemplo, WO 94/04678 y Davies y Riechmann 1994,Febs Lett.339: 285 y 1996,Protein Engineering9: 531).
Como ya se ha mencionado antes, la al menos una molécula de unión es capaz de unirse específicamente a un dominio extracelular de un receptor expresado en una CEH y/o un miofibroblasto, en donde la molécula de unión según la invención comprende al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos capaces de unirse específicamente a PDGfRb .
En una forma de realización preferida, se proporciona una molécula de unión según la invención, en la que la unión de uno de los dominios de anticuerpo variables únicos a su antígeno modula la unión del otro dominio de anticuerpo variable único a su antígeno, dando como resultado preferiblemente una endocitosis inducida por agrupamiento y una internalización rápida del receptor.
La divulgación proporciona en un ejemplo práctico varios VHH que muestran una excelente unión e internalización del PDGFRB.
El término "competir" significa que, en un ensayo competitivo, como por ejemplo el descrito en el Ejemplo 5 y el Ejemplo 8, la adición de una molécula de unión induce una disminución significativa en la unión de un VHH determinado, es decir, el VHH con el que se determina la competencia. “Significativa” a este respecto es preferiblemente una disminución de > 5 %, preferiblemente > 10 % cuando se añaden 250 nM de una molécula de unión a 10 nM de un VHH marcado con fluorescencia en un ELISA. El ejemplo 8, por ejemplo, muestra una intensidad de fluorescencia inferior a menos del 5 % cuando se permite que 10 nM de 13F11 marcado y 250 nM de 13E8 no marcado se unan al ectodominio IGF2R humano en un ELISA, mientras que se observa una disminución sustancialmente mayor en la intensidad de fluorescencia cuando 10 nM de 13F11 marcado y 250 nM de 13A8, 13C11, 13G10 o 13A12 sin marcar compiten por epítopos iguales o superpuestos. A partir de estos datos se concluye que 13F11 y 13E8 no compiten entre sí, mientras que 13A8, 13C11, 13G10 y 13A12 compiten con 13F11 con respecto a la unión a IGF2R. Las mismas condiciones de prueba y umbral se aplican a una molécula de unión dirigida a PDGFRB al determinar si una molécula de unión compite con un VHH determinado. Tabla 1 - Secuencia de aminoácidos de anticuerpos de dominio único dirigidos a PDGFRB. Las regiones CDR estimadas están subra adas.
La divulgación proporciona además en un ejemplo práctico varios VHH que muestran una excelente unión e intemalización del IGF2R (no reivindicado).
Tabla 2: Las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos de dominio único dirigidos a IGF2R se enumeran en l i i n l. L r i n DR im n r .
Se proporciona una molécula de unión según la invención, donde la molécula de unión comprende al menos 2 dominios de anticuerpo variables únicos, en donde al menos un dominio de anticuerpo variable único comprende o consiste en la SEQ ID N.°: 153 y al menos un dominio de anticuerpo variable único comprende o consiste en cualquiera de las SEQ ID N.°: 9. Dicha molécula incluye una molécula de unión anti-PDGFRB biparatópica.
Para los fines de comparación de dos o más secuencias de aminoácidos, el porcentaje de "identidad de secuencia" o "similitud de secuencia" entre una primera secuencia de aminoácidos y una segunda secuencia de aminoácidos (también denominada en el presente documento "identidad de aminoácidos") se puede calcular dividiendo [el número de residuos de aminoácidos en la primera secuencia de aminoácidos que son idénticos a los residuos de aminoácidos en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de aminoácidos] por [el número total de residuos de aminoácidos en la primera secuencia de aminoácidos ] y multiplicándolo por [100 %], donde cada deleción, inserción, sustitución o adición de un residuo de aminoácido en la segunda secuencia de aminoácidos, en comparación con la primera secuencia de aminoácidos, se considera una diferencia en un(a) único/a (posición de) residuo de aminoácido, es decir, una "diferencia de aminoácidos" como se define en el presente documento. Alternativamente, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se puede calcular usando un algoritmo informático conocido, tal como los mencionados anteriormente para determinar el grado de identidad de secuencia para secuencias de nucleótidos, nuevamente usando configuraciones estándar. Normalmente, con el fin de determinar el porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos de acuerdo con el método de cálculo descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos con el mayor número de residuos de aminoácidos se tomará como la "primera” secuencia de aminoácidos, y la otra secuencia de aminoácidos se tomará como la "segunda" secuencia de aminoácidos. Además, al determinar el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos, los expertos pueden tener en cuenta las denominadas sustituciones de aminoácidos "conservadoras", que generalmente pueden describirse como sustituciones de aminoácidos en las que un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido de estructura química similar y que tiene poca o esencialmente ninguna influencia sobre la función, actividad u otras propiedades biológicas de la molécula de unión. Dichas sustituciones de aminoácidos conservadoras son ampliamente conocidas en la técnica, por ejemplo, por los documentos WO 04/037999, GB-A-3 357 768, WO 98/49185, WO 00/46383 y WO 01/09300; y los tipos y/o combinaciones (preferidos/as) de dichas sustituciones se pueden seleccionar basándose en las enseñanzas pertinentes del documento WO 04/037999, así como del documento WO 38/49185 y de las referencias adicionales citadas en el mismo. Tales sustituciones conservadoras son preferiblemente sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos (a) - (e) está sustituido por otro residuo de aminoácido dentro del mismo grupo: (a) pequeños residuos alifáticos, no polares o ligeramente polares: Ala, Val, Leu, Pro, Ile y Gly; (b) residuos polares con carga negativa y sus amidas (sin carga): Asp, Asn, Glu y Gln; (c) residuos polares con carga positiva: His, Arg y Lys; (d) grandes residuos alifáticos no polares: Met, Ser, Thr, Sec y Cys; y (e) residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Las sustituciones conservadoras particularmente preferidas son las siguientes: Ala a Gly o a Ser; Arg a Lys; Asn a Gln o a His; Asp a Glu; Cys a Ser; Gln a Asn; Glu a Asp; Gly a Ala o a Pro; Su a Asn o a Gln; Ile a Leu o a Val; Leu a Ile o a Val; Lys a Arg, a Gln o a Glu; Met a Leu, a Tyr o a Ile; Phe a Met, a Leu o a Tyr; Ser a Thr; Thr a Ser; Trp a Tyr; Tyr a Trp o a Phe; Val a Ile o a Leu.
Cualquier sustitución de aminoácidos aplicada a las moléculas de unión descritas en el presente documento también puede basarse en el análisis de las frecuencias de variaciones de aminoácidos entre proteínas homólogas de diferentes especies desarrollado por Schulzet al., Principies of Protein Structure,Springer-Verlag, 1978, en los análisis de potenciales de formación de estructuras desarrollados por Chou y Fasman,Biochemistry13: 211, 1974 y Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, y en el análisis de patrones de hidrofobicidad en proteínas desarrollado por Eisenberget al., Proc. Nati. Acad. Sci.USA 81: 140-144, 1984; Kyte y Doolittle;J Molec. Biol.
157: 105-132, 1981, y Goldmanet al., Ann. Rev. Biophys. Chem.15: 321-353, 1986.
La divulgación también abarca variantes optimizadas de estas secuencias de aminoácidos. Por lo general, una "variante optimizada" de una secuencia de aminoácidos según la divulgación es una variante que comprende una o más sustituciones beneficiosas tales como sustituciones que aumentan i) el grado de "humanización", ii) la estabilidad química, y/o iii) el nivel de expresión.
En una forma de realización preferida, se proporciona una molécula de unión según la invención que comprende al menos 2 dominios de anticuerpo variables únicos, en donde los al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos están separados por una secuencia de aminoácidos conectora. En muchos casos, pueden ser suficientes porciones conectaras Gly-Ser únicas de 4-15 aminoácidos, pero si se desea una mayor flexibilidad de la cadena de aminoácidos, se pueden usar porciones conectaras más largas o más complejas. Las porciones conectaras preferidas son (Gly4Ser)n, (GSTSGS)n o cualquier otra porción conectora que proporcione flexibilidad para el plegamiento de proteínas. Los dominios de unión pueden estar separados solo por una porción conectora, pero se pueden introducir otras secuencias de aminoácidos útiles entre los dominios de unión o en el extremo N o en el extremo C de la primera o última secuencia del dominio de unión, respectivamente. Por tanto, en una forma de realización, se proporciona una molécula de unión según la invención, que comprende además una secuencia de aminoácidos que codifica una porción conectora. Dicha secuencia conectora proporciona preferiblemente flexibilidad dentro de la molécula y aumenta la distancia que puede ser unida por la molécula de unión para (cruzar) dos epítopos. Además, dicha porción conectora puede disminuir el impedimento estérico que puede ocurrir cuando uno de los dominios de anticuerpo variables únicos se ha unido a su primera diana y el segundo dominio de anticuerpo variable único debe encontrar y unirse a la segunda diana.
Se ha observado que una molécula de unión según la invención se internaliza cuando un dominio de anticuerpo variable único dentro de la molécula se une a su diana con suficiente afinidad. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, se proporciona una molécula de unión según la invención, en la que al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos, independientemente entre sí, son capaces de unirse específicamente al receptor con una constante de disociación (K<d>) de 10E-5 a 10E-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10E-7 a 10E-12 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10E-9 a 10E-12 moles/litro.
En el contexto de la presente divulgación, "unirse y/o tener afinidad por" un determinado antígeno tiene el significado habitual en la técnica tal como se entiende, por ejemplo, como "unión" y/o "tener afinidad por" un determinado antígeno en el contexto de los anticuerpos y sus respectivos antígenos. En formas de realización particulares de la invención, el término "se une y/o tiene afinidad por" significa que al menos un dominio de anticuerpo variable único interactúa específicamente con un antígeno. El término "especificidad" se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos a los que se puede unir una secuencia de inmunoglobulina, un resto de unión a antígeno o una molécula de unión a antígeno particular (tal como una molécula de unión de la invención). La especificidad de una molécula de unión a antígeno se puede determinar basándose en la afinidad y/o avidez hacia la(s) molécula(s) diana con respecto a la afinidad y/o avidez hacia moléculas no diana. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (K<d>), es una medida de la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno: cuanto menor sea el valor de K<d>, más fuerte será la fuerza de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión al antígeno (alternativamente, la afinidad también se puede expresar como la constante de afinidad (K<a>), que es 1/K<d>). Los métodos para determinar la K<d>estarán claros para los expertos y, por ejemplo, incluyen las técnicas mencionadas en el presente documento. La afinidad denota la fuerza o estabilidad de una interacción molecular. La afinidad comúnmente viene dada por la K<d>, o constante de disociación de equilibrio, que tiene unidades de mol/litro (o M). La afinidad también se puede expresar como una constante de asociación, K<a>, que equivale a 1/K<d>y tiene unidades de litro/mol. En la presente especificación, la estabilidad de la interacción entre dos moléculas (tal como una secuencia de aminoácidos, una secuencia de inmunoglobulina o una molécula de unión de la invención y su diana prevista) se expresará principalmente en términos del valor K<d>de su interacción; queda claro para los expertos que, en vista de la relación K<a>= 1/K<d>, la especificación de la fuerza de la interacción molecular mediante su valor K<d>también se puede utilizar para calcular el valor K<a>correspondiente.
El valor K<d>caracteriza la fuerza de una interacción molecular también en un sentido termodinámico, ya que está relacionado con la energía libre de la unión. Como quedará claro para los expertos (por ejemplo, basándose en la descripción adicional del presente documento), la afinidad se puede determinar de una manera conocida de por sí, dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez da una medida de la fuerza general de un complejo anticuerpo-antígeno. Depende de tres parámetros principales: la afinidad del anticuerpo por el epítopo (véase lo anterior), la valencia tanto del anticuerpo como del antígeno y la disposición estructural de las partes que interactúan. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión al antígeno en la molécula de unión al antígeno como con el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión al antígeno. Normalmente, las secuencias de inmunoglobulina de la presente divulgación (tales como las secuencias de aminoácidos, ISVD y/o moléculas de unión de la invención) se unirán a su antígeno con una K<d>de 10E-5 a 10E-12 moles/litro o menos, y preferiblemente 10E-7 a 10E-12 moles/litro o menos y más preferiblemente 10E-9 a 10E-12 moles/litro. Por lo general, se considera que cualquier valor de K<d>superior a 10E-5 M indica una unión no específica. Preferiblemente, una secuencia de inmunoglobulina monovalente de la divulgación se unirá al antígeno deseado con una afinidad menor que 500 nM, preferiblemente menor que 200 nM, más preferiblemente menor que 10 nM, de la manera más preferible, menor que 500 pM. La especificidad de unión y la afinidad de unión de una proteína de unión a antígeno o de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o determinante antigénico se pueden determinar de cualquier manera adecuada conocida de por sí, incluyendo, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y ensayos competitivos tipo sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas de por sí en la técnica; así como las demás técnicas mencionadas en el presente documento. Las K<d>para interacciones biológicas, tales como la unión de una molécula de unión de la invención al antígeno asociado a células como se define en el presente documento, que se consideran significativas (por ejemplo, específicas), normalmente están en el rango de 10E-10 M (0,1 nM) a 10E-6 M (1 pM).
La K<d>también se puede expresar como la relación entre la constante de velocidad de disociación de un complejo, denotada como koff, y la velocidad de su asociación, denotada kon (de modo que K<d>=koff/kon y K<a>= kon/koff). La afinidad de una interacción molecular entre dos moléculas se puede medir mediante diferentes técnicas conocidas de por sí, tales como la conocida técnica del biosensor de resonancia de plasmón superficial (SPR) (véase por ejemplo Oberet al., Intern. Immunology,13, 1551- 1559, 2001) donde una molécula se inmoviliza en el chip biosensor y la otra molécula se pasa sobre la molécula inmovilizada en condiciones de flujo que producen mediciones de kon, koff y, por tanto, valores de K<d>(o K<a>). Esto se puede realizar, por ejemplo, con los conocidos instrumentos Biacore. Las mediciones de afinidad en los receptores transmembrana que se expresan en las células se realizan preferiblemente mediante ELISA.
También quedará claro para los expertos que la K<d>medida puede corresponder a la K<d>aparente si el proceso de medición influye de algún modo en la afinidad de unión intrínseca de las moléculas implicadas, por ejemplo, mediante artefactos relacionados con el recubrimiento del biosensor de una molécula. Además, se puede medir una K<d>aparente si una molécula contiene más de un sitio de reconocimiento para la otra molécula. En tal situación, la afinidad medida puede verse afectada por la avidez de la interacción de las dos moléculas. Otro método que puede usarse para evaluar la afinidad es el procedimiento ELISA de 2 pasos de Friguetet al. (J. Immunol.Methods, 77, 305-19, 1985). Este método establece una medición del equilibrio de unión de la fase de solución y evita posibles artefactos relacionados con la adsorción de una de las moléculas sobre un soporte como el plástico. Sin embargo, la medición precisa de la K<d>puede requerir bastante trabajo y, como consecuencia, a menudo se determinan valores aparentes de KD para evaluar la fuerza de unión de dos moléculas. Cabe señalar que siempre que todas las mediciones se realicen de manera sistemática (por ejemplo, manteniendo las condiciones del ensayo sin cambios), las mediciones de la KD aparente se pueden usar como una aproximación de la KD verdadera y, por lo tanto, en el presente documento se deben tratar la KD y la KD aparente con igual importancia o relevancia.
La molécula terapéutica o diagnóstica también está unida preferiblemente al resto de la molécula de unión mediante una porción conectora y/o un espaciador. Las porciones conectoras están unidas al resto de direccionamiento, por ejemplo, como una molécula de unión de la invención, usando estrategias para la conjugación de fármacos aleatoria/heterogénea o específica del sitio. La primera estrategia se basa principalmente en la química convencional de éster activo o maleimida para la conjugación del fármaco con residuos de lisina o cisteína (región bisagra), respectivamente, mientras que la segunda utiliza residuos químicos que se han introducido en sitios específicos de un “resto de direccionamiento modificado” que han sido modificados genéticamente, enzimáticamente o por otros medios. El dominio de anticuerpo variable único puede comprender un residuo de cisteína o histidina en la parte C-terminal o N-terminal. La conjugación específica del sitio con un resto de direccionamiento da como resultado una mezcla homogénea con una variabilidad mínima entre lotes. Las porciones conectoras pueden ser escindibles o no escindibles. Se supone que ambos tipos de porciones conectoras son estables en la circulación, pero, según un análisis detallado de la integridad en la sangre y los perfiles de toxicidad de ciertos ADC, la estabilidad es un punto de preocupación para los ADC actualmente aprobados. En el caso de los ADC con una porción conectora escindible, después de la internalización por la célula diana, la porción conectora escindible y el anticuerpo se degradan en los lisosomas, lo que hace que el fármaco esté libremente disponible para ejercer actividad tóxica. En el caso de los ADC con una porción conectora no escindible, solo el anticuerpo se degrada en los lisosomas y se liberan complejos fármaco-porción conectora. Los conocimientos antes mencionados abren vías para potenciar las porciones conectoras con funciones fisicoquímicas ajustables que pueden alterar las propiedades del ADC y del fármaco de forma beneficiosa, por ejemplo, al hacer que el proceso de producción de ADC sea más fácil y económico y/o al ampliar la ventana terapéutica. Además de ser un pegamento estable entre el fármaco y el mAb, una porción conectora ideal podría (1) mejorar la solubilidad del fármaco y del ADC y hacer que la conjugación del fármaco con el mAb sea más eficiente, (2) mejorar el tráfico celular y la interacción del fármaco con su diana celular, (3) disminuir la salida del fármaco por las células tumorales a través de proteínas de resistencia a múltiples fármacos y (4) prevenir la absorción del complejo fármaco-porción conectora por parte de las células sanas. Dado que la mayoría de las porciones conectoras orgánicas convencionales proporcionan ADC subóptimos, durante los últimos años se ha iniciado una extensa investigación sobre nuevas tecnologías de conjugación.
La presente divulgación proporciona una porción conectora particular, denominada además "Lx", que comprende un complejo de platino (II) funcional que tiene dos grupos reactivos tales como, por ejemplo, entre otros, los descritos en la publicación de patente internacional WO2013103301. El primer grupo reactivo de Lx es capaz de ser reemplazado por un inhibidor de quinasa y el segundo grupo reactivo por un resto de direccionamiento, como una molécula de unión de la invención. Al usar Lx, la inmunorreactividad de la molécula de unión conjugada sigue siendo sustancialmente la misma que la de la molécula de unión nativa no unida. Esto es particularmente importante porque solo cuando la inmunorreactividad de la molécula de unión siga siendo suficientemente alta, será posible administrar el fármaco conjugado como compuesto terapéutico en el lugar correcto del cuerpo. Además, como no lleva mucho tiempo unir la molécula de unión a Lx y las condiciones de reacción para realizar este acoplamiento son suaves y altamente independientes del resto funcional utilizado, los restos de direccionamiento utilizados pueden personalizarse según las necesidades específicas del paciente. Debido a las condiciones suaves de reacción, la molécula de unión permanece en excelentes condiciones y conserva su inmunorreactividad original (no conjugada). La presente divulgación proporciona la tecnología para permitir la unión rápida, eficiente, estable y dirigida al sitio de pequeñas moléculas terapéuticas o diagnósticas a moléculas de unión. Un polipéptido biparatópico conjugado a través de Lx mostró una actividad de relajación superior en modelos celulares. La porción conectora Lx es resistente a la degradación en la sangre y, al mismo tiempo, permite la liberación de la carga útil en la diana. Además, Lx permite, a diferencia de otros sistemas, la unión de fármacos de diferentes clases químicas. Como se ha indicado anteriormente, dirigir fármacos a través de moléculas de unión a CEH es conceptualmente atractivo para mejorar la especificidad, disminuir la toxicidad sistémica y permitir el uso terapéutico de compuestos que, en principio, son menos adecuados o inadecuados como fármacos sistémicos, por ejemplo, por su perfil de toxicidad. Esto requiere un acoplamiento estable y dirigido al sitio de un fármaco a una molécula de unión de la invención para actuar sobre receptores que han sufrido un aumento en número y están expuestos en la membrana externa de las CEH activadas. Por lo tanto, la porción conectora y/o el espaciador comprende o consiste preferiblemente en un complejo de metal de transición.
En una forma de realización preferida, el complejo de metal de transición comprende Pt(II). En una forma de realización aún más preferida, dicha porción conectora comprende un complejo cis-platino (II), más preferiblemente un complejo cis-platino (II) que comprende un resto bidentado inerte, en el que dicho resto bidentado es preferiblemente etano-1,2-diamina.
Como ya se ha mencionado anteriormente, la inhibición de la contracción del citoesqueleto de las CEH o miofibroblastos activados atenúa la fibrosis. Por lo tanto, en una forma de realización preferida se proporciona una molécula de unión según la invención, en la que la molécula terapéutica es capaz de inhibir la contracción del citoesqueleto de las CEH activadas.
Los inhibidores de quinasas, por ejemplo, pueden inhibir la contracción del citoesqueleto de las CEH activadas. Las quinasas sobre las que se actúa están involucradas en una vía de señalización llamada sistema reninaangiotensina (SRA), que desempeña un papel en la fibrosis hepática y la hipertensión portal. El SRA desempeña un papel central en la regulación de la presión arterial al regular el tono del músculo liso vascular. Dos quinasas involucradas en el SRA son la tirosina quinasa Janus-quinasa 2 (JAK2) y la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK). La expresión de estas proteínas quinasas se ha asociado con la hipertensión portal en la cirrosis humana.
La hipertensión portal está presente en la fibrosis hepática y en todas las etapas de la cirrosis hepática. En la cirrosis hepática, las CEH activadas se contraen alrededor de los sinusoides en los que residen. Esto conduce a una hipertensión portal en la que se obstruye el flujo sanguíneo a través del sistema venoso portal en el hígado. En el SRA, JAK2 se fosforila y activa Arhgef1, el factor de intercambio de nucleótidos responsable de la activación de la pequeña GTPasa RhoA, que a su vez activa su efector ROCK. ROCK es un regulador del citoesqueleto de actomiosina que promueve la generación de fuerza contráctil. ROCK fosforila y, por lo tanto, inactiva la fosfatasa de la cadena ligera de miosina (MLCP), lo que aumenta la fosforilación y contracción de la cadena ligera de miosina. Por tanto, el uso de un inhibidor de ROCK, Y27632, conduciría a una disminución de la contracción de CEH inducida por SRA. A su vez, debido a que JAK2 desempeña un papel en la activación de ROCK, su inhibición a través de SB1518 (también llamado pacritinib, que es un inhibidor de JAK2) puede ayudar a relajar las CEH. Estas pequeñas moléculas son altamente tóxicas e inespecíficas, por lo que sufren toxicidades limitantes de la dosis, lo que las hace inadecuadas para la administración sistémica de por sí. Una molécula de unión de la invención que lleva una cantidad eficaz de fármaco de molécula pequeña conjugado está diseñada para superar las limitaciones de la administración sistémica de la molécula pequeña de por sí. Preferiblemente, la molécula terapéutica es un inhibidor de quinasa, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de Rho-quinasa, JAK-2 y neprilisina, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en Y27632, SB1518 y LBQ657. En otra forma de realización preferida, la molécula terapéutica es una toxina, tal como taxanos, antraciclinas, alcaloides de la vinca, caliqueamicinas, maitansinoides, auristatinas, preferiblemente auristatina F, y análogos de CC 10065.
Normalmente, la unión a un receptor transmembrana induce una cascada de señalización intracelular. Por ejemplo, la unión de PDGF a PDGFRB induce la fosforilación del propio receptor y de otras proteínas, activando así vías de señalización intracelular que desencadenan respuestas celulares como la migración y la proliferación. Como el propósito de una molécula de unión de la presente invención es el transporte de su carga útil al citosol de las células diana y no la activación del receptor que se usa para el transporte, se prefiere que la unión de la molécula de unión al dominio extracelular del receptor transmembrana no induzca la cascada de señalización intracelular del receptor. Se prefiere además que la unión de la molécula de unión al receptor transmembrana conduzca a una internalización, endocitosis y liberación del fármaco o toxina mediada por el receptor dentro del compartimento endolisosomal.
En una forma de realización preferida, se proporciona una molécula de unión según la invención, donde la molécula de unión comprende un residuo de cisteína o histidina N-terminal o C-terminal, preferiblemente una cisteína N-terminal o C-terminal que sirve para el propósito de conjugación a la molécula conectora. En una forma de realización, la invención proporciona una molécula de unión biparatópica que comprende al menos dos moléculas de unión según la invención.
Como se ha mencionado anteriormente, una molécula de unión según la invención, que comprende una molécula terapéutica, sirve para administrar la molécula terapéutica al citosol de una célula diana, por ejemplo, una célula hepática fibrótica, permitiendo así el tratamiento de la fibrosis hepática. Por lo tanto, la invención proporciona una molécula de unión internalizante según la invención para su uso como medicamento. El término "tratar" o "tratamiento" se refiere a la administración de una terapia en una cantidad, forma y/o modo eficaz para mejorar una afección, síntoma o parámetro asociado con una enfermedad o para prevenir la progresión de una enfermedad, ya sea en un grado estadísticamente significativo o en un grado detectable para un experto en la técnica. En el caso de un uso terapéutico, el tratamiento puede mejorar, curar, mantener o disminuir la duración de la enfermedad o afección en el sujeto. En usos terapéuticos, el sujeto puede presentar una manifestación parcial o total de los síntomas. En un caso típico, el tratamiento mejora la enfermedad o afección del sujeto hasta un punto detectable por un médico o previene el empeoramiento de la enfermedad o afección. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "prevenir" o "preveción” significa mitigar un síntoma del trastorno al que se hace referencia. En particular, dicho término abarca la gama completa de efectos terapéuticamente positivos de la administración de una molécula de unión de la invención a un sujeto, incluyendo reducir, paliar y aliviar un trastorno relacionado con la EHC, por ejemplo, la hemorragia por varices esofágicas y sus síntomas. El término "prevención" incluye la prevención o el retraso del desarrollo de la enfermedad, la prevención o el retraso del desarrollo de síntomas y/o una reducción en la gravedad de dichos síntomas que se desarrollarán o se espera que se desarrollen. Estos incluyen además la mejora de los síntomas existentes, la prevención de síntomas adicionales y la mejora o prevención de las causas subyacentes de los síntomas. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "sujeto" y "sujetos" se refieren a un animal, por ejemplo, un mamífero que incluye un no primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un caballo, un burro, una cabra, un camello, un gato, un perro, un conejillo de indias, una rata, un ratón, una oveja) y un primate (por ejemplo, un mono, tal como un macaco cangrejero, un gibón, un orangután, un gorila, un chimpancé y un ser humano). Un "paciente" se refiere preferiblemente a un ser humano. Dicho paciente puede incluir ancianos, adultos, adolescentes y niños, de cualquier edad, por ejemplo, niños desde 2 años hasta menos de 12 años, adolescentes desde 12 años hasta menos de 18 años, adultos desde 18 años hasta menos de 65 años y ancianos de 85 años en adelante.
Preferiblemente, dicho medicamento es para su uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con o caracterizado por la expresión aumentada de PDGFRB.
Preferiblemente, dicho medicamento está destinado a usarse en un método para la prevención y/o el tratamiento de la cirrosis hepática, la fibrosis hepática y/o la hipertensión portal. Por ejemplo, la hipertensión portal (HP) está presente en la fibrosis hepática y en todas las fases de la cirrosis hepática. En la cirrosis hepática, las CEH activadas se contraen alrededor de los sinusoides en los que residen. Esto conduce a HP, en la que se obstruye el flujo sanguíneo a través del sistema venoso portal en el hígado. El sistema venoso portal está formado por la vena porta, en la que se une un gran volumen de sangre procedente del estómago, intestino, bazo y páncreas, ramificándola a través de vasos más pequeños que recorren el hígado. Si los vasos del hígado están bloqueados debido a un daño hepático, la sangre no puede fluir adecuadamente a través del hígado, lo que provoca presión arterial alta. Si la HP empeora y se obstruye el flujo sanguíneo a través de la vena porta, la sangre se redirige a través de vasos sanguíneos más pequeños, como los del esófago, que no están diseñados para transportar volúmenes tan grandes de sangre. Esto provoca venas dilatadas (varices) en el esófago distal y/o el estómago proximal, que tienen un mayor riesgo de romperse (hemorragias varicosas), provocando hemorragias internas de graves a mortales. Una molécula de unión según la invención es particularmente útil para actuar sobre las células que causan o exacerban la cirrosis hepática, la fibrosis hepática y/o la hipertensión portal.
Preferiblemente, dicho medicamento está destinado a uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con las varices esofágicas y/o las hemorroides. Preferiblemente, dicho medicamento es para su uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por hemorragias varicosas internas o externas.
En una forma de realización, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica una molécula de unión según la invención. Aunque una de las ventajas de la presente invención es la facilidad de producción y la simplicidad de las moléculas de la invención, la elección de un único ácido nucleico que codifique por sí mismo todas las funciones necesarias permite la adición relativamente fácil (en la medida en que haya espacio en los vectores de expresión elegidos, etc.) de otras funcionalidades en la molécula de unión resultante. Dicho ácido nucleico permite la producción de una molécula de unión según la invención cuando se transfecta en una célula hospedadora adecuada. Por lo tanto, la invención proporciona una célula hospedadora para la expresión de una molécula de unión según la invención, que comprende un ácido nucleico según la invención.
Una molécula de unión de la invención se puede producir mediante cualquier método de uso común. Los ejemplos típicos incluyen la expresión recombinante en sistemas hospedadores adecuados, por ejemplo, bacterias, levaduras o células de mamífero. Las moléculas de unión de la invención se someterán a un régimen de purificación adecuado antes de formularse de acuerdo con la presente invención. En general, las moléculas de unión de la invención son producidas por células hospedadoras vivas que se han modificado genéticamente para que produzcan la molécula de unión. Los métodos de ingeniería genética de células para producir proteínas son ampliamente conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo. Ausubelet al.,eds. (1990),Current Protocols in Molecular Biology(Wiley, Nueva York). Dichos métodos incluyen la introducción de ácidos nucleicos que codifican y permiten la expresión de la molécula de unión en células hospedadoras vivas. Estas células hospedadoras pueden ser células bacterianas, células fúngicas o células animales cultivadas en cultivo. Las células hospedadoras bacterianas incluyen, entre otras, células deEscherichia coli.Los ejemplos de cepas deE. coliadecuadas incluyen: BL21(D3), HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, NM538, IMM539 y cualquier cepa deE. colique no pueda escindir ADN exógeno. La preferida es la cepa BL21(D3) deE. coli.Las células hospedadoras fúngicas que pueden usarse incluyen, entre otras, células deSaccharomyces cerevisiae, Pichia pastorisyAspergillus.Algunos ejemplos de líneas celulares animales que pueden usarse son CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, HEK293, 3T3 y WI38. Se pueden establecer nuevas líneas celulares animales usando métodos ampliamente conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, mediante transformación, infección viral y/o selección). Opcionalmente, la molécula de unión puede ser secretada por las células hospedadoras al medio. En algunas formas de realización, las moléculas de unión pueden producirse en células bacterianas, por ejemplo, en células deE. coli.
En una forma de realización, las moléculas de unión se expresan en una célula de levadura tal comoPichia(véase, por ejemplo, Powerset al., J Immunol Methods251:123-35 (2001)),HansenulaoSaccharomyces.En una forma de realización, las moléculas de unión se producen en células de mamífero. Las células hospedadoras de mamífero típicas para expresar los anticuerpos clonados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980), usadas con un marcador seleccionable DHF, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, Mol. 159:601-621 (1982)), líneas celulares linfocíticas, por ejemplo, células de mieloma NS0 y células SP2, células COS y una célula de un animal transgénico, por ejemplo, de un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial mamaria. Además de las secuencias de ácido nucleico que codifican la molécula de unión, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.° 4.399.216; 4.634.665; y 5.179.017). Por ejemplo, normalmente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Pueden usarse técnicas de biología molecular estándar para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar la molécula de anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, las moléculas de unión de la invención se pueden aislar mediante cromatografía de afinidad. En una forma de realización, la molécula de unión de la invención se purifica como se describe en el documento WO 10/058550. En una forma de realización ejemplar, la molécula de unión se purifica respecto a uno o más contaminantes: poniendo en contacto una mezcla de molécula de unión y contaminantes con un soporte basado en proteína A y/o un soporte de intercambio iónico, en condiciones que permitan que la molécula de unión se una al soporte o se absorba en este; eliminando uno o más contaminantes mediante lavado del soporte unido en condiciones en las que la molécula de unión permanezca unida al soporte, y eluyendo selectivamente la molécula de unión del soporte mediante la elución de la molécula de unión adsorbida con un tampón de elución. Las moléculas de unión de la invención también pueden ser producidas por un animal transgénico. Por ejemplo, en la patente estadounidense número 5.849.992 se describe un método para expresar un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Se construye un transgén que incluye un promotor específico de la leche y ácidos nucleicos que codifican la molécula de anticuerpo y una secuencia señal para la secreción. La leche producida por las hembras de dichos mamíferos transgénicos incluye, secretada en ellas, el dominio único de interés. La molécula de anticuerpo puede purificarse a partir de la leche o, para algunas aplicaciones, usarse directamente. La presente divulgación abarca métodos para producir las formulaciones como se definen en el presente documento.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de unión según la invención y al menos un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
Una molécula de unión de la invención se puede administrar o usar para la administración en forma de solución líquida (por ejemplo, soluciones para inyección e infusión). Tales composiciones se pueden administrar por vía parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular) o por inhalación. Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" como se usan en el presente documento significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección, e incluyen la administración subcutánea (s.c.) o intramuscular así como intravenosa (i.v.), intracapsular, intraorbitaria, inyección e infusión intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcuticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. Preferiblemente, la segunda dosis o dosis adicionales de una molécula de unión de la invención descrita en el presente documento se administran por vía subcutánea u oral, para una liberación lenta y, por tanto, un efecto sostenido. Preferiblemente, y en particular en situaciones agudas, se prefiere administrar una molécula de unión de la invención por vía oral, ya que las moléculas de unión serán transportadas a través de la circulación esplácnica directamente hacia el hígado enfermo después de su absorción en el intestino.
La presente divulgación también proporciona formulaciones de moléculas de unión que comprenden al menos un dominio variable único de inmunoglobulina contra PDGF o IGF, que son estables y preferiblemente adecuadas para usos farmacéuticos, incluida la preparación de medicamentos (también denominada "composición farmacéutica de la invención"). El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo (la molécula de unión de la invención) sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administre la formulación. Tales formulaciones son preferiblemente estériles. Los excipientes (vehículos, aditivos) "aceptables desde el punto de vista farmacéutico" son aquellos que pueden administrarse razonablemente a un mamífero en cuestión para proporcionar una dosis eficaz del ingrediente activo empleado.
El término "excipiente" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia inerte de uso común como diluyente, vehículo, conservante, lioprotector, tensioactivo, aglutinante, vehículo o estabilizante para compuestos que imparte una propiedad física beneficiosa a una formulación. Los expertos están familiarizados con excipientes adecuados para fines farmacéuticos, que pueden tener funciones particulares en la formulación, tales como lioprotección, estabilización, conservación, etc.
Los ejemplos no limitantes de agentes que pueden coformularse con una molécula de unión de la invención incluyen, por ejemplo, tratamiento complementario (por ejemplo, corticosteroides tales como (metil)prednisolona o (metil)prednisona, diuréticos, albúmina, vitamina K, antibióticos y terapia nutricional y agentes reductores de la presión arterial sistémica, como agentes betabloqueantes) y terapia de apoyo con transfusión de glóbulos rojos. Dichas terapias combinadas pueden utilizar ventajosamente dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias. En una forma de realización, la presente invención se refiere a una terapia combinada de una molécula de unión de la invención junto con un tratamiento para reducir la presión arterial sistémica. Preferiblemente, la terapia combinada se proporciona hasta que se normalice la presión portal. La medición de la presión portal ayuda a confirmar el diagnóstico y controlar el curso de la enfermedad y la posible necesidad de tratamientos adicionales. La eficacia de cualquier molécula proteica particular de la divulgación o régimen de administración puede determinarse mediante métodos disponibles para los expertos en la técnica. Brevemente, durante un ensayo clínico, los pacientes pueden ser observados por personal médico y el estado de la enfermedad se evalúa mediante cualquier combinación de criterios. La mejora del estado de la enfermedad de un paciente se determina según estos criterios en numerosos puntos temporales y la combinación de estas determinaciones en una población de pacientes se analiza para evaluar la eficacia del tratamiento. En formas de realización ejemplares, la evaluación de la eficacia se puede medir mediante cualquiera o todos los criterios establecidos a continuación:
• Tiempo de respuesta del tratamiento
• Número de sujetos con remisión completa
• Número de (sujetos con) exacerbaciones de EVH y tiempo transcurrido hasta la primera exacerbación de EVH
• Mejora de la disfunción orgánica y mejora de los signos y síntomas relacionados con la EHC
• Mortalidad total dentro del período de tratamiento del fármaco del estudio (incluida la reducción gradual) • Determinación de biomarcadores de la EHC.
La dosis de una molécula de unión según la invención debe determinarse mediante estudios en animales y estudios clínicos en los llamados experimentos de dosis creciente. Normalmente, las dosis serán comparables a las dosis actuales de anticuerpos (a nivel molar, el peso de las moléculas inventadas puede diferir del de los anticuerpos). Normalmente, dichas dosis son de 3 a 15 mg/kg de peso corporal o de 25 a 1000 mg por dosis.
En especial en las fases más crónicas de la enfermedad hepática, las primeras aplicaciones de una molécula de unión según la invención probablemente se realizarán (al menos inicialmente) en combinación con otros tratamientos (tratamiento de referencia). Por tanto, la invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión según la invención y una terapia convencional, por ejemplo, un medicamento para reducir la presión arterial, como el propranolol, o medios quirúrgicos para detener las hemorragias, por ejemplo, las varices en el esófago. Además, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión según la invención para su uso en un tratamiento adyuvante, por ejemplo, de las enfermedades hepáticas. Además, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión según la invención para su uso en un tratamiento medicinal combinado de una enfermedad hepática.
Por lo tanto, el compuesto terapéutico ideal debería permitir la administración de compuestos efectores que sean mucho más potentes que las moléculas utilizadas actualmente, como el propranolol, y que, de otro modo, tendrían una ventana terapéutica demasiado estrecha para permitir su uso como fármaco libre. Preferiblemente, la conjugación estable del fármaco con el resto de direccionamiento evita la toxicidad sistémica mediante la liberación del compuesto (que, de otro modo, sería tóxico) en la circulación. Una vez que la CEH internaliza la molécula, el fármaco debe liberarse para poder desactivar la CEH.
Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además al menos otro compuesto útil en el tratamiento de la enfermedad hepática crónica. Una composición farmacéutica según la invención se utiliza preferiblemente como tratamiento adyuvante de la hemorragia por varices en presencia de hipertensión portal y/o se utiliza en el tratamiento de una enfermedad hepática.
Una molécula de unión según la invención, que comprende una molécula diagnóstica, es en particular útil para el diagnóstico de, por ejemplo, la fibrosis hepática. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, se proporciona una molécula de unión según la invención que comprende una molécula diagnóstica, en donde la molécula diagnóstica es un agente para la formación de imágenes. Además, se proporciona una composición diagnóstica que comprende al menos una molécula de unión según la invención que comprende una molécula diagnóstica y un diluyente y/o excipiente.
En formas de realización particularmente preferidas de la presente invención, la molécula de unión según la presente invención comprende al menos dos dominios variables únicos que son capaces, independientemente entre sí, de unirse específicamente a un receptor PDGFRB de una célula estrellada hepática y/o miofibroblasto y donde dichos dominios están unidos a través de una porción conectora que comprende un complejo cis-platino (II) a una molécula terapéutica elegida de entre un inhibidor de quinasa, tal como un inhibidor de Rho-quinasa, inhibidor de quinasa Jak-2, inhibidor de neprilisina o antagonista del receptor de angiotensina II. Preferiblemente, el complejo cis-platino (II) de la porción conectora comprende un resto bidentado inerte, más preferiblemente etano-1,2-diamina. Además, dicha molécula de unión también comprende preferiblemente un denominado prolongador de la semivida, que se elige preferiblemente de entre un dominio de unión a albúmina, VHH de unión a albúmina o una cola Fc de anticuerpo o fragmento de este. En los ejemplos siguientes, entre otros, se han descrito con más detalle especies específicas de estas formas de realización preferidas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1:Selección de fragmentos de anticuerpos humanos específicos para IGF2R o PDGFRB. Inmunización de llamas, recolección de células, selecciones de VHH de fagos y la constitución de bibliotecas. Selección de VHH basada en la afinidad diana e internalización de CEH: IGF2R (de rata y humano). Selección de VHH basada en la afinidad diana e internalización de CEH: IGF2R (de rata y humano).
Un procedimiento general para generar y caracterizar VHH específicos de antígeno está representado en la figura 1.
1.1 IGF2R
Nuestro objetivo fue identificar los VHH que se unen específicamente con alta afinidad al receptor IGF2R en células estrelladas hepáticas humanas y de rata (CEH). El material de partida para el estudio fue una biblioteca de ADNc de VHH de llama generada previamente. La biblioteca consistió en un gran grupo de secuencias de VHH extraídas de células mononucleares de sangre periférica de llamas inmunizadas con células A549 que expresaban IGF2R humano (hIGF2R). El tamaño de la biblioteca, evaluado mediante titulaciones de colonias tras la transformación del ADN, fue de aproximadamente 108 unidades formadoras de colonias (UFC).
Los fagos se prepararon a partir de la biblioteca de A549 de VHH y se realizaron dos rondas de selecciones en el dominio extracelular humano recombinante de IGF2R (hIGF2R-ECD). En cada ronda, se incubaron aproximadamente 1011 unidades formadoras de colonias (UFC) de fagos en diferentes concentraciones de la diana, se eluyeron, se amplificaron y luego se usaron para la siguiente ronda de selecciones. La producción de fagos después de la segunda ronda de selección fue claramente mayor que en la primera ronda, respectivamente 1,2 x 109 y 3,3 x 107, lo que demuestra que se estaban amplificando los aglutinantes de VHH. Después de la ronda de selección final, se seleccionaron aleatoriamente 94 clones de fagos y se analizaron para determinar su unión a hIGF2R-ECD en un ELISA de fagos. Los clones con alta afinidad de unión se caracterizaron posteriormente mediante un análisis de patrones usando digestión con HinfI y se clasificaron según su patrón de restricción. De cada categoría, se seleccionaron múltiples clones y se identificaron las secuencias de aminoácidos de estos aglutinantes (tabla 2). Esta selección condujo a un panel de 15 aglutinantes hIGF2R únicos derivados de la biblioteca de A549 (figura 2).
1.2 PDGFRB
La selección de VHH que se unen específicamente y con alta afinidad al receptor PDGFRB, de rata y humano, se inició mediante la inmunización de llamas. Para cada receptor, se inyectaron 5 veces a 2 llamas, 4 veces con dominio extracelular (ECD) y 1 vez con células SCC VII transfectadas con PDGFRB, según el calendario de inmunización en la tabla 3. Cabe señalar que las dos llamas inmunizadas con rPDGFRB también se inmunizaron con células SCC VII transfectadas con rIGF2R para la generación de VHH que se unen específicamente y con alta afinidad a rIGF2R. Ocho días después de la última inmunización, se recogió sangre, se purificaron los linfocitos de sangre periférica (PBL) y se extrajo su ARN.
Tabla 3. Calendario de inmunización
Las bibliotecas de PDGFRB (para PDGFRB tanto humano como de rata) se crearon según el siguiente procedimiento. El ARN extraído (40 pg, 4 reacciones de 10 pg cada una) se transcribió en ADNc usando el kit de transcriptasa inversa (Invitrogen) y el ADNc se limpió con un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen), ambos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los fragmentos de IGH (cadena pesada y convencional) se amplificaron usando cebadores que se hibridan en la región de la secuencia líder y en la región de CH2. El producto de PCR se cargó en un gel de agarosa al 1 %, después que lo cual se cortó el fragmento de 700 pb del gel y se purificó con el kit QIAquick (Qiagen) según el protocolo del fabricante. Posteriormente, se usaron 80 ng del ADN purificado como plantilla para una PCR anidada para introducir sitios de restricción (volumen final 800 pl). El fragmento amplificado se limpió con un kit de purificación de PCR QIAquick según el protocolo del fabricante y se eluyó en 120 pl de tampón de elución. El ADN eluido se digirió con BstEII y SfiI, después de lo cual la muestra se pasó por un gel de agarosa-TAE al 1,5 % y el fragmento de 400 pb se aisló del gel. Los fragmentos de ADN se aislaron con el kit de limpieza QIAquick (Qiagen) según el protocolo del fabricante y se eluyeron en 100 pl de tampón de elución. Posteriormente, los fragmentos de ADN (330 ng) se ligaron en un vector fagémido (derivado de pHEN1, 1 pg) y se transformaron en células bacterianas TG1. Antes de la ligación, el vector fagémido se preparó mediante digestiones con SfiI y BstEII, seguidas de defosforilación con FastAP. Los números de transformantes se calcularon a partir de diluciones de las células TG1 sembradas en placas (8 ml). El título de la biblioteca (tabla 4) se calculó contando las colonias en la dilución más alta y usando la siguiente fórmula:
Tamaño de la biblioteca = (cantidad de colonias) x (dilución) x 8 ml/0,005 m, (volumen manchado). La frecuencia de inserto se determinó seleccionando 24 clones diferentes de cada una de las transformaciones de la biblioteca y ejecutando una PCR de colonias. La frecuencia de inserción fue del 100 % para las bibliotecas 1, 2 y 4, y del 96 % para la biblioteca 3.
Tabla 4. Tamaños de biblioteca calculados
Los fagos se prepararon a partir de las bibliotecas y se realizaron dos ciclos de selección. La primera ronda de selección se llevó a cabo en el dominio extracelular (hPDGFRB-ECD o rPDGFRB-ECD). Los fagos se incubaron en diferentes concentraciones de la diana, se eluyeron, se amplificaron y luego se usaron para la siguiente ronda de selección. Los resultados de los fagos de la primera ronda de selección se muestran en la figura 3. La segunda ronda de selección se llevó a cabo en las células SCC VII transfectadas con hPDGFRB o rPDGFRB para la selección de fagos de unión e internalización. Usando un lavado con ácido, los fagos que solo se unían a PDGFRB se separaron de los fagos que internalizaban a través de PDGFRB después de la unión. Esta ronda de selección se llevó a cabo con el resultado de la primera ronda de los pocilios con la menor densidad de ECD. Lo resultados de los fagos de la segunda ronda de selección se muestran en la figura 4.
Después de la segunda ronda de selección, se seleccionaron aleatoriamente 94 clones de fagos de internalización y se analizó su unión a PDGFRB-ECD en un ELISA de fagos. Luego se caracterizaron adicionalmente los clones con alta afinidad de unión mediante análisis de patrones de restricción usando digestión con HinfI. Los clones se categorizaron según su patrón de restricción y solo se seleccionó un clon de cada categoría y se identificaron las secuencias de aminoácidos de estos aglutinantes, lo que dio lugar a 18 VHH de unión de hPDGFRB únicos y 11 VHH de unión de rPDGFRB únicos (tabla 1, figuras 5-6).
Ejemplo 2: Diseño de genes para la producción de moléculas de unión que comprenden VHH.
Para producir los VHH, se clonaron genes de los VHH seleccionados en un vector pET-21 o pET-28 que contenía las siguientes secuencias en el inserto del vector de expresión (figura 7). La secuencia de PelB que dirige el transporte de la proteína producida en las células bacterianas al periplasma. Un promotor y terminador de T7, y entre ellos un operón lac, que permite la inducción de la proteína VHH tras la adición de IPTG. Gen de resistencia a ampicilina o kanamicina para la resistencia a los antibióticos ampicilina o kanamicina, respectivamente. Una es una cisteína C-terminal libre disponible para la conjugación selectiva de sitio de restos semifinales o restos modificados con maleimida que comprenden cargas útiles, tales como colorantes o inhibidores de quinasa. Se utilizan histidina, EPEA u otras etiquetas de purificación por afinidad y un sitio de escisión de trombina para eliminar la etiqueta de purificación cuando sea necesario.
Ejemplo 3: La producción de moléculas de unión monoméricas, diméricas y multiméricas que comprenden dominios VHH.
Las BL21-DE3 Codonplus deE. Coli(Stratagene) se transformaron por choque térmico con ADN plasmídico que codifica VHH (ejemplo 2) y se cultivaron en presencia de antibióticos apropiados. Se recogió una sola colonia y se usó para inocular 10 ml de 2xYT (suplementado con glucosa al 2 % (p/v), 35 mg/ml de cloranfenicol y 100 mg/ml de ampicilina o 30 mg/ml de kanamicina) y el medio inoculado se incubó durante la noche a 37 °C y 180 r.p.m. Posteriormente, el cultivo nocturno se diluyó 1/100 1/100 en 900 ml de Terrific Broth (suplementado con 100 ml de tampón KPO, glucosa al 0,1 % (p/v) y 100 mg/ml de ampicilina o 30 mg/ml de canamicina) y el cultivo se incubó a 37 °C y 180 r.p.m. hasta que la DO600 alcanzó valores entre 0,5 y 0,8, después de lo cual se añadió 1 ml de IPTG 1 M al cultivo para inducir la producción de proteínas y se continuó la incubación durante la noche a 25 °C y 180 r.p.m. Las células bacterianas se recogieron centrifugando el cultivo a 4700 r.p.m. durante 15 min a 4 °C, seguido de la resuspensión de las células bacterianas en PBS (30 ml de PBS por 800 ml de cultivo bacteriano). El contenido periplásmico que contenía el VHH se liberó de las células mediante congelación y descongelación de la suspensión dos veces, después de lo cual la suspensión se centrifugó a 4 °C y 4700 r.p.m. Los VHH se purificaron mediante purificación de cromatografía de afinidad por metales inmovilizado (IMAC) en resina de afinidad por metales Talon (Clontech) (0,75 ml por litro de cultivo bacteriano). La resina se lavó previamente con PBS 3 veces, después de lo cual se añadió la resina al periplasma y se incubó durante 30 min a 4 °C y 15 r.p.m. La resina se separó del periplasma centrifugando la suspensión durante 3 minutos a 4 °C y 900 r.p.m. y se lavó con TWEEN20 al 0,05 % (v/v) en PBS, seguido de 2 etapas de lavado con PBS. Posteriormente, la resina se añadió a columnas de cromatografía Poly-Prep (Bio-Rad), seguido de una preelución de la proteína unida no específicamente con 1 ml de una solución de imidazol 15 mM en PBS, después de lo cual la proteína de interés se eluyó con una solución de imidazol 150 mM en PBS. La concentración de proteína de las fracciones recogidas se midió en un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (ThermoFisher Scientific) a 280 nm (establecido en 1 Abs = 1 mg/ml) y las fracciones que contenían el VHH se agruparon y dializaron frente a una solución de TCEP-HCl 1 mM en PBS con un tubo de diálisis SnakeSkin MWCO de 3,5 kDa (ThermoFisher Scientific) durante toda la noche a 4 °C. La proteína purificada se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -20 °C. Todos los clones se purificaron exitosamente, como se ve mediante una banda singular clara alrededor de 15 kDa en SDS-PAGE.
Ejemplo 4: Caracterización de dominios VHH monoméricos.
4.1 IGF2R
Los 15 aglutinantes únicos de hIGF2R (Ejemplo 1.1, figura 2) se produjeron y purificaron como se describe en los ejemplos 2 y 3. Las afinidades aparentes se determinaron con ensayos de unión en hIGF2R-ECD. Brevemente, se añadieron diluciones de VHH en serie triples, comenzando desde 1 pM, sobre placas recubiertas con hIGF2R-ECD. Después de 2 horas de incubación, las placas se lavaron y se detectó el VHH unido usando un anticuerpo IgG específico de VHH, seguido de un anticuerpo específico de IgG conjugado con IRD800CW. Los resultados de los ensayos de unión se muestran en la figura 2. VHH 13F11 también se produjo con una cisteína libre C-terminal y conjugada usando química de maleimida con Alexa Fluor 647 (13F11-A647 en la figura 8A, método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2). Se llevó a cabo un ELISA de titulación (lectura directa a 647 nm) con esta construcción en hIGF2R-ECD para determinar si la afinidad se vio afectada después de la conjugación dirigida al sitio (figura 8B). La K<d>y la Bmax se calcularon en Graphpad (versión 8.3), utilizando un análisis de unión específico de un sitio (figura 8C). La afinidad calculada de 13F11-A647 fue 1,00 ± 0,61 nM (K<d>± SEM, n=2), que es ligeramente menor que la afinidad calculada para 13F11 no conjugado (0,23 ± 0,05 nM (K<d>± SEM, n=2)). Esto sugiere que la conjugación dirigida al sitio con el terminal libre C-terminal conduce a una ligera, pero aceptable, disminución de la afinidad.
4.1 PDGFRB
Los 18 aglutinantes de hPDGFRB únicos y los 11 aglutinantes de rPDGFRB únicos (ejemplo 1.2, figuras 5 y 6) se produjeron y purificaron como se describe en los ejemplos 2 y 3 y las afinidades aparentes se determinaron con ensayos de unión en hPDGFRB-ECD y rPDGFRB-ECD, respectivamente, como se describió anteriormente. Los resultados se resumen en las figuras 5 y 6 para los VHH de hPDGFRB y rPDGFRB, respectivamente. Posteriormente se analizó la unión de los VHH de unión de hPDGFRB y rPDGFRB que tenían una alta afinidad de unión en ECD en células SCC VII transfectadas con hPDGFRB y rPDGFRB en las figuras 9A y 9B, respectivamente. Además, las afinidades de unión de los VHH de hPDGFRB humanos también se determinaron en la línea LX-2 de células estrelladas hepáticas (CEH) humanas (figura 5).
Ejemplo 5: Determinación de la unión de VHH a epítopos de receptores no superpuestos para permitir la construcción de moléculas de unión biparatópicas.
5.1 VHH de IGF2R
Del panel de 15 aglutinantes específicos de hIGF2R (figura 2), se eligieron los VHH 13A8, 13A12, 13C11, 13E8, 13F11 y 13G10 para una caracterización adicional. Se realizó un ensayo de competición para determinar si los VHH seleccionados reconocen distintos epítopos en hIGF2R. Para esto, se incubó una cantidad no saturante (10 nM) de 13F11 conjugado con Alexa Fluor 647 (13F11-A647, método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2) con hIGF2R-ECD inmovilizado en presencia de un competidor no conjugado (250 nM) (figura 10). La incubación de hIGF2R-ECD con 13F11-A647 13F11 se usó como control positivo y la incubación de hIGF2R-ECD solo con 13F11-A647 se usó para definir la intensidad máxima de fluorescencia. VHH 13A8 mostró competencia completa con VHH 13F11, lo que demuestra que estos dos VHH reconocían (al menos parcialmente) epítopos superpuestos. De los otros VHH, solo 13E8 no compitió con 13F11, lo que demuestra que 13F11 y 13E8 reconocían epítopos no superpuestos. Por lo tanto, estos dos VHH calificarían como componentes básicos para una construcción VHH biparatópica.
5.2 VHH de PDGFRB
Se llevaron a cabo ELISA de competición para determinar si los aglutinantes específicos de hPDGFRB (figura 5) y los aglutinantes específicos de rPDGFRB (figura 6) reconocen epítopos distintos en hPDGFRB o rPDGFRB, respectivamente. Los VHH de unión de hPDGFRB SP02P, SP05P, SP12P y SP14P y el aglutinante de rPDGFRB SP26P se conjugaron con IRDye800CW (VHH-IRDye800CW, método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2) y cada VHH conjugado se mezcló con un competidor no conjugado en diluciones en series triples y se incubó en hIGF2R-ECD inmovilizado. Dos VHH comparten (parte de) el mismo epítopo cuando la señal de fluorescencia del VHH-IRDye800CW disminuye al aumentar la concentración de VHH no conjugado. Los epítopos determinados mediante el ensayo de competición para los VHH de unión de hPDGFRB y los VHH de rPDGFRB se resumen en las figuras 5 y 6, respectivamente. Además, usando un método similar al descrito en la sección 5.1, se realizó una competencia de epítopo de unión entre el VHH SP02P de unión de hPDGFRB y el VHH SP26P de unión de rPDGFRB. No se observó competencia entre los dos VHH, lo que los califica como componentes básicos para moléculas de unión biparatópicas (figura 11).
Ejemplo 6: Construcción y caracterización de VHH biparatópicos.
6.1 IGF2R
En función de su alta afinidad y unión a epítopos de receptores no superpuestos, se seleccionaron los VHH 13F11 y 13E8 para el diseño de construcciones VHH biparatópicas y bivalentes. Se fisionaron dos VHH con una porción conectora flexible, que consiste en tres repeticiones Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (figura 8A). Las secuencias se optimizaron con codones para la expresión enE. Coliy se obtuvieron como fragmentos de ADN sintetizados de GeneArt. Los fragmentos de ADN que codifican VHH se clonaron en un vector basado en el vector pET28 que introduce una cisteína libre C-terminal para la conjugación dirigida al sitio y una etiqueta His6 para la purificación de IMAC (figura 8A). Las construcciones se produjeron y purificaron como se describe en el ejemplo 3. Las construcciones se conjugaron con Alexa Fluor 647 (método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2) y se realizaron ELISA de titulación en hIGF2R-ECD recombinante (como se describe en el ejemplo 4.1) para determinar la K<d>y Bmax (calculadas en Graphpad (versión 8.3), usando análisis de unión específica de un sitio) (figura 8C). Las afinidades calculadas para 13F11, 13F11-13F11, 13F11-13E8 y 13E8-13F11 son 1,00 ± 0.61 nM (K<d>± SEM, n=2), 3,10± 0,87 nM, 2,5 ± 1,87 nM y 2,5 ± 1,56 nM (K<d>± SEM, n=2), respectivamente (figura 8C).
Para determinar si 13F11-13E8 tiene reactividad cruzada contra rIGF2R, la construcción se conjugó con IRDye800CW (13F11-13E8-IRDye800CW, método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2) y la afinidad de unión se determinó usando un ensayo de unión en células SCC VII que sobreexpresan IGF2R humano o de rata (figura 12). 13F11-13E8-IRDie800CW se une a IGF2R tanto humano como de rata con afinidad comparable (<10 nM) como se muestra en la figura 12 que confirma reactividad cruzada.
A continuación, se rediseñó genéticamente 13F11-13E8 para incluir un prolongador de vida mediain vivoen forma de un dominio de unión a albúmina (ABD), como lo describen Johanssonet al. (Structure,specificity, and mode of interaction forbacterium albumin-binding module,J. Biol. Chem. 2002 (277): 8114-8120) y posteriormente se produjo y purificó como se describe en el ejemplo 3. Posteriormente, se conjugó 13F11-13E8-ABD con IRDye800CW (F11E8-ABD-IRD800, método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2) y se determinaron las afinidades de unión del VHH biparatópico, así como de la unidad ABD. Se encontró una baja afinidad de unión nanomolar a hIGF2R-ECD para F11-E8-ABD-IRD800, lo que indica que la adición del dominio ABD no tiene ningún efecto sobre la unión del F11-E8 biparatópico a hIGF2R (figura 13A). La afinidad de unión (K<d>) de F11-E8-ABD-IRD800 a la albúmina sérica de rata (RSA) fue de 30 nM y a la albúmina sérica de ratón (MSA) y a la albúmina sérica humana (HSA) la afinidad de unión fue de aproximadamente 200 nM. No se observó unión a la albúmina sérica bovina (BSA) (figura 13B).
La reactividad cruzada de F11E8-ABD se evaluó adicionalmente en experimentos de unión a células estrelladas hepáticas (CEH) de rata activadas primarias mediante la conjugación de la construcción con Alexa Fluor 488 (FE-A-A488, método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2). Las CEH activadas se obtuvieron de un hígado perfundido de una rata cirrótica ligada al conducto biliar (BDL), las CEH se aislaron usando centrifugación en gradiente de densidad. Las células se mantuvieron en cultivo durante 6 días para permitir la activación completa y luego se tiñeron con FE-A-A488 50 nM. La activación se determinó mediante una tinción adicional con actina alfa del músculo liso (a-SMA). FE-A-A488 se une a HEC de rata, como se puede observar en la figura 14 y la activación se confirmó por la presencia de polímeros de actina largos, o las denominadas fibras de tensión (figura 14).
6.2 PDGFRB
En base a su alta afinidad y su unión a epítopos de hPDGRB no superpuestos, se seleccionaron los VHH SP02P, SP12P SP14P y SP26P para el diseño de construcciones VHH biparatópicas y se produjeron de una manera similar a la descrita en el ejemplo 6.1 (figura 15A). Las afinidades de unión de las construcciones biparatópicas se determinaron con un ensayo ELISA con el periplasma (figura 15A). Además, en función de su alta afinidad y unión a epítopos de rPDGRB no superpuestos, se seleccionaron los VHH SP26P y SP28P para el diseño de una construcción VHH biparatópica y se produjeron de una manera similar a la descrita en el ejemplo 6.1. El SP28P-SP26P biparatópico formado se conjugó con IRDye800CW (método de conjugación SP28p-SP26P-IRDye800CW como se describe en el ejemplo 9.2) y se sometió a un ensayo de unión. Se realizaron células SCC VII transfectadas con hPDGFRB, rPDGFRB o hIGF2R (figura 15B). La construcción mostró una afinidad de unión muy alta a rPDGFRB (K<d>< 1 nM), mientras que la afinidad de unión a hPDGFRB es unas pocas órdenes de magnitud menor. Para crear una construcción VHH biparatópica que tenga reactividad cruzada para hPDGFRB y rPDGFRB, se seleccionaron VHH SP02P que se une a hPDGFRB y VHH SP026P que se une a rPDGFRB y se produjo la construcción biparatópica SPO2P-SP26P de una manera similar a la descrita en el ejemplo 6.1 (figura 15<c>). La construcción SP02P-SP26P se conjugó con IRDye800CW (SP02P-SP26P-IRDye800CW, método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2) y se sometió a ensayos de unión en células SCC VII transfectadas con hPDGFRB, rPDGFRB o hIGF2R (figura 15<c>). Las afinidades de unión tanto a hPDGFRB como a rPDGFRB están por debajo de 5 nM, lo que hace que la SP02P-SP26P biparatópica sea particularmente prometedora para su uso en la unión de moléculas según la presente invención.
Ejemplo 7: Mejora de la farmacocinética in vivo en ratas de 13F11-13E8 mediante la adición de un dominio de unión de albúmina.
Las propiedades farmacocinéticasin vivode 13F11-13E8-ABD se compararon con 13F11-13E8 sin el resto de ABD en ratas Sprague-Dawley sanas. En resumen, a las ratas se les administró por vía intravenosa aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal y se tomaron muestras de sangre en diferentes puntos temporales y se determinó la concentración de las construcciones VHH usando un ELISA en hIGF2R-ECD inmovilizado. El nivel sérico máximo (Cmax) de 13F11-13E8-ABD superó los 1000 nM, como se muestra en la figura 13C. Con aproximadamente 20 nmoles infundidos en el animal y un volumen sérico estimado de 10 ml, esta Cmax correspondería a aproximadamente el 50 % de la dosis infundida que aún está en circulación una hora después de la administración, lo que demuestra una buena biodisponibilidad. Por otro lado, 13F11-13E8 se retiró rápidamente de la circulación y ya no pudo detectarse dentro de las dos horas posteriores a la inyección (figura 13C).
Ejemplo 8: Síntesis y caracterización analítica de complejos semifinales de Lx y restos funcionalizados con maleimida con inhibidores de quinasa de molécula pequeña: Y27632, pacritinib, sacubitril(at), losartán.
8.1. Estructuras de SFM (restos semifinales) de Y27632-Lx y restos funcionalizados con maleimida Y27632 que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención.
��
8.1.1. Síntesis y caracterización analítica de Y27632-Lx-Cl (1a)
Se añadió AgNO3 (85 mg, 500 pmol, 1,0 eq.) a una suspensión de PtCl2(etano-1 ,2-diamina) (LxCl2, 163 mg, 500 pmol, 1,0 eq.) en DMF seca (24,8 ml). La mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente en la oscuridad bajo una atmósfera de argón. Después de eso, la suspensión se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 pm para dar una solución madre 20,2 mM de complejo de Pt activado. A continuación, a una solución de Y27632 x 2 HCl (40 mg, 125 pmol, 1,0 eq.) en agua MilliQ (14 ml) (pH ajustado a 6,95 usando NaOH 1 M), se añadió la solución madre 20,2 mM preparada anteriormente del complejo de Pt activado (12,4 ml, 250 pmol, 2,0 eq.). La mezcla reactiva se agitó durante 4,5 h a 60 °C en la oscuridad bajo una atmósfera de argón. Posteriormente, la mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de 0,2 pm y NaCl al 0,9 % a la solución (1 ml), después de lo cual los solventes se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en agua MilliQ/MeOH (85:15, 6 ml) y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 pm. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna Grace Alltima C18 de 5 pm, 22 x 250 mm; gradiente: 15 % a 35 % de MeOH/TFA al 0,1 % en agua/TFA al 0,1 % en 36 min.). Las fracciones del producto se liofiliaron y el producto1ase obtuvo como un sólido incoloro (41,8 mg, rendimiento del 43,8 %).
RMN de 1H (400 MHz, CD3OD): 58,57 - 8,47 (m, 2 H), 7,74 - 7,68 (m, 2 H), 6,09 - 5,78 (m, 2 H), 5,72 - 5,40 (m, 2 H), 3,21 - 3,11 (m, 1 H), 2,80 - 2,51 (m, 4 H), 2,48 - 2,37 (m, 1 H), 2,10 - 2,01 (m, 2 H), 1,98 - 1,84 (m, 2 H), 1,67 -1,51 (m, 3H), 1,32 - 1,15 (m, 5h ).
RMN de 195Pt (86,0 MHz, CD3OD): 5 -2512.
La HPLC (columna Grace Alltima C18 de 5 pm, 25 x 4,6 mm) indicó que el producto tenía una pureza del 95,6 % (tiempo de retención 15,8 min; gradiente: 5 % a 25 % de MeCN/TFA al 0,1 % en agua/TFA al 0,1 % en 18 min medido a una longitud de onda de 273 nm).
8.1.2. Síntesis y caracterización analítica de Y27632-Lx-I (1c)
Y27632 x 2 HCl (10 mg, 31 pmol, 1,0 eq.) en agua MilliQ (125 pl) y Pt(etano-1 ,2-diamina)l2 (Lxb; 14,90 mg, 29 pmol, 0,95 eq.) se disolvieron en DMF seca (250 pl) y la mezcla de reacción se agitó durante 48 h a 60 °C. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con Nal 10 mM en MilliQ/MeOH (1:1, 3 ml) y se incubó durante 1 h a 25 °C, después de lo cual la suspensión se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 pm. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna Grace Alltima C18 de 5 pm, 22 x 250 mm; gradiente: 15 % a 50 % B, mientras que eluyente A: 95/5 agua/MeOH (+0,1 % TFA) y eluyente B: 5/95 agua/MeOH (+0,1% TFA) en 40 min). Se recogieron y liofilizaron las fracciones que contenían el producto y se obtuvo el producto1ccomo un sólido amarillo (11,0 mg, rendimiento del 41,1 %).
HRMS (ESI+) C16H29N5OPt [M+H]+ 629,1065, encontrado 629,1092.
La HPLC (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 25 x 4,6 mm) indicó que el producto tenía una pureza del 99,1%(tiempo de retención 13,3 min.; gradiente: 5 % a 50 % de MeCN/TFA al 0,1 % en agua/TFA al 0,1 % en 20 min. medido a una longitud de onda de 273 nm).
8.1.3. Síntesis y caracterización analítica de Mal-PEG4-Val-Cit-PAB-Y27632 (1e)
Y27632 x 2 HCl (18 mg, 56 |_imol, 1,0 eq.), Mal-PEG4-Val-Cit-PAB-PNP (49 mg, 56 |_imol, 1 eq.) y trietilamina (19,6 |_il, 112 |_imol, 2,0 eq.) se disolvieron en DMSO seco (1 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante 45 min a 25 °C. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con MilliQ/MeOH (1:1, 3 ml), después de lo cual la suspensión se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 |_im. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 22 x 250 mm; gradiente: 20 % a 40 % B, mientras que eluyente A: 95/5 agua/MeCN (TFA a 0,1 %) y eluyente B: 5/95 agua/MeCN (TFA a 0,1 %) en 80 min.). Se recogieron y liofilizaron las fracciones que contenían el producto y se obtuvo el producto1ecomo un sólido amarillo (22,3 mg, rendimiento del 36,3 %).
HRMS (ESI+) C48H70N9O13 M+H]+ 980.5088, encontrado 980.5093.
La HPLC (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 25 x 4,6 mm) indicó que el producto tenía una pureza del 97,1 % (tiempo de retención 10,1 min.; gradiente: 20 % a 100 % de MeCN/TFA al 0,1 % en agua/TFA al 0,1 % en 20 min., medido a una longitud de onda de 273 nm).
8.1.4. Síntesis y caracterización analítica de Mal-Val-Cit-PAB-Y27632 (1f)
Y27632 x 2 HCl (20 mg, 62 pmol, 1,0 eq.), Mal-Val-Cit-PAB-PNP (48 mg, 66 pmol, 1,05 eq.) y trietilamina (22,2 l_il, 125 |_imol, 2,0 eq.) se disolvió en DMSO seco (1 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante 45 min a 25 °C. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con MilliQ/MeOH (1:1, 3 ml), después de lo cual la suspensión se filtró a través de un litro de jeringa de 0,2 |_im. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 22 x 250 mm; gradiente: 20 % a 40 % B, mientras que eluyente A: 95/5 agua/MeCN (TFA a 0,1 %) y eluyente B: 5/95 agua/MeCN (TFA a 0,1 %) en 80 min.). Se recogieron y liofilizaron las fracciones que contenían el producto y se obtuvo el producto1fcomo un sólido amarillo (23,5 mg, rendimiento del 39,2 %).
HRMS (ESI+): C43H60N9O9 [M+H]+ 846,4509, encontrado 846,4472.
La HPLC (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 25 x 4,6 mm) indicó que el producto tenía una pureza del 95,6 % (tiempo de retención 10,5 min.; gradiente: 20 % a 100 % de MeCN/TFA al 0,1 % en agua/TFA al 0,1 % en 20 min., medido a una longitud de onda de 273 nm).
8.2. Estructuras de SFM de sacubitril-Lx que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención
2i (se representa uno de los posibles diastereoisómeros)
2j (se representa uno de los posibles diastereoisómeros)
O
F,C”''0'
k (se representa uno de los posibles diastereoisómeros)
8.2.1. Síntesis y caracterización analítica de sacubitril-py-Lx-I (2c)
8.2.1.1. S ín te s is y c a ra c te r iz a c ió n a n a lít ica d e sacu b itr il-py .
Se disolvieron hemicalcio de sacubitrilo (100 mg, 0,232 mmol, 1,0 eq.), piridin-4-ilmetanol (30 mg, 0,279 mmol, 1,2 eq.) y DMAP (3 mg, 0,023 mmol, 0,1 eq.) en DMF seca (1,5 ml). Posteriormente, se añadieron EDC * HCl (67 mg, 0,348 mmol, 1,5 eq.) y DMF adicional (0,5 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante cuatro días bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se diluyó con agua (20 ml) y se extrajo con EtOAc (2 * 20 ml). La fase orgánica se secó con Na2SO4, se filtró, y los solventes se retiraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre sílice (eluyente: MeOH al 0-3 %/DCM) proporcionando un sólido incoloro (73 mg, rendimiento del 62,4 %).
RMN de 1H (400 MHz, CDCl3): 58,58 (d, 2 H), 7,60 - 7,54 (m, 2 H), 7,54 - 7,49 (m, 2 H), 7,46 - 7,40 (m, 2 H), 7,37 - 7,30 (m, 1 H), 7,27 - 7,22 (m, 4 H), 5,62 (d, 1 H), 5,13 (s, 2 H), 4,31-4,19 (m, 1 H), 4,13 (q, 2 H) ), 2,89 -2,80 (m, 2 H), 2,76 - 2,69 (m, 2 H), 2,66 - 2,50 (m, 2 H), 2,49 - 2,42 (m, 2 H), 1,99-1,90 (m, 1 H) ), 1,59-1,49 (m, 1 H), 1,24 (t, 3 H), 1,16 (d, 3 H).
HRMS (ESI+) C30H35N2O5 [M+H]+ calc 503,2540, encontrado 503,2599.
8.2.1.2. Síntesis y caracterización analítica de sacubitril-py-Lx-I(2c)
Se disolvió Pt(etano-1,2-diamina)l2 (Lxh; 76,0 mg, 149,2 pmol, 5,0 eq.) en una solución de sacubitril-py (15,0 mg, 29,8 pmol, 1,0 eq.) en DMF seca (200 pl) y la mezcla de reacción se agitó durante 22 h a 25 °C. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con agua/MeOH (1:1,3 ml) y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 pm. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna Grace Alltima C18 de 5 pm, 22 x 250 mm; gradiente: 45 % a 100 % B, mientras que eluyente A: 95/5 agua/MeOH (TFA a 0,1 %) y eluyente B: 5/95 agua/MeOH (TFA a 0,1 %) en 40 min.). Se recogieron las fracciones que contenían el producto y se liofilizaron, lo que dio como resultado un sólido amarillo (14 mg, rendimiento del 47,0 %).
HRMS (ESI+) C32H42lN4O5195Pt [M]+ calc 884.1845, encontrado 884.1856.
La HPLC (columna Grace Alltima C18 de 5 pm, 25 x 4,6 mm) indicó que el producto tenía una pureza del 95,8 % (tiempo de retención 15,9 min.; gradiente: 20 % a 100 % de MeCN/TFA al 0,1 % en agua/TFA al 0,1 % en 20 min., medido a una longitud de onda de 273 nm).
8.2.2. S ín te s is y c a ra c te r iza c ió n a n a lít ica de s a c u b itr il-C H<2>C H<2>N H C O -p y -L x -I (2o)
Ácido 3-(piridin-4-il)propiónico (500 mg, 3,3 mmol, 1,0 eq.), 2,3,5,6-tetrafluorofenol (604 mg, 3,6 mmol, 1,1 eq.) y EDC x HCl (761 mg , 4,0 mmol, 1,2 eq.) se disolvieron en DCM seco (10 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Posteriormente, la mezcla se extrajo con HCl 0,1 M (2x), salmuera (1x) y se secó con Na2SO4, después de lo cual se retiró el disolvente a presión reducida. La reacción proporcionó un sólido blanco (530 mg, rendimiento del 47,7 %).
RMN de 1H (400 MHz, CDCl3): 58,49 (m, 2 H), 7,91 (m, 1 H), 7,35 (d, 2 H), 3,21 (t, 2 H), 3,02 (t, 2 H).
8.2.2.2. Síntesis y caracterización analítica de N-(2-hidroxietil)-3-(piridin-4-il)propanamida
3-(piridin-4-il)propiónico-TFP (478 mg, 1,6 mmol, 1,0 eq.), 2-aminoetanol (98 mg, 1,6 mmol, 1,0 eq.) y DIPEA (222 pl, 1,6 mmol, 1,0 eq.) se disolvieron en DCM seco (10 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente, el disolvente se retiró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre sílice (eluyente: MeOH al 0-3 %/DCM), lo que proporcionó un sólido incoloro (260 mg, rendimiento del 83,3 %).
RMN de 1H (400 MHz, CD3OD): 58,36 - 8,44 (m, 2 H), 7,31 (d, 2 H), 3,54 (t, 2 H), 3,26 (t, 2 H), 2,97 (t, 2 H), 2,55 (t, 2H).
8.2.2.3. Síntesis y caracterización analítica de sacubitril-CH2CH2NHCO-py
sacubltrll-CH 2CH2NHCO-Py
Hemicalcio de sacubitrilo (200 mg, 0,487 mmol, 1,0 eq.), W-(2-hidroxietil)-3-(piridin-4-il)propanamida (114 mg, 0,584 mmol, 1,2 eq.) y DMAP (6 mg, 0,049 mmol, 0,1 eq.) se disolvieron en<d>M<f>seca (1,5 ml). Posteriormente, se añadieron EDC x HCl (140 mg, 0,751 mmol, 1,5 eq.) y DMF adicional (0,5 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 20 h bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se diluyó con agua (20 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 20 ml). La fase orgánica se secó con Na2SO4, se filtró y los solventes se retiraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre sílice (eluyente: MeOH al 0-5 %/DCM), lo que proporcionó un sólido incoloro (99 mg, rendimiento del 33,5 %).
HRMS (ESI+) C35H41IN3O6 [M+H]+ calc 588,3068, encontrado 588,3083.
La HPLC (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 25 x 4,6 mm) indicó que el producto era 100 % puro (tiempo de retención 14,0 min.; gradiente: 20 % a 100 % de MeCN/TFA al 0,1 % en agua/TFA al 0,1 % en 20 min., medido a una longitud de onda de 273 nm).
8.2.2.4. Síntesis y caracterización analítica de sacubitril-CH2CH2NHCO-py-Lx-I (2o)
2o
Se disolvió Pt(etano-1,2-diamina)l2 (LXI2; 34,6 mg, 272,8 |_imol, 4,0 eq.) en una solución de sacubitrilo CH2CH2NHCO-py (40,0 mg, 68,2 |_imol, 1,0 eq.) en DMF seca (416 |_il) y la mezcla de reacción se agitó durante 27 h a 50 °C. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con agua/MeOH (1:1,3 ml) y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 |_im. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 22 x 250 mm; gradiente: 65 % a 90 % B, mientras que eluyente A: 95/5 agua/MeOH (TFA a 0,1 %) y eluyente B: 5/95 agua/MeOH (TFA a 0,1 %) en 40 min.). Las fracciones que contenían el producto se recogieron y se liofilizaron, lo que dio como resultado un sólido amarillo (26,7 mg, rendimiento del 36,2 %). HRMS (ESI+) C36H49lN5O6195Pt [M]+ calc 969,2370, encontrado 969,2388.
La HPLC (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 25 x 4,6 mm) indicó que el producto tenía una pureza del 96,4 % (tiempo de retención 15,2 min.; gradiente: 20 % a 100 % de MeCN/TFA al 0,1 % en agua/TFA al 0,1 % en 20 min., medido a una longitud de onda de 273 nm).
8.3. Estructuras de SFM de pacritinib-Lx y restos de pacritinib funcionalizados con maleimida que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención.
��
8.3.1. Síntesis y c
Se disolvieron pacritinib (20 mg, 42,3 |_imol, 1 eq.) y Pt(etano-1,2-diamina)I2 (Lx^; 96,9 mg, 190,4 |_imol, 4,5 eq.) en DMF seca (250 |_il) y la mezcla de reacción se agitó durante 48 h a 60 °C. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con agua/MeOH (1:1, 3 ml) y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 |_im. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 22 x 250 mm; gradiente: 45 % a 80 % B, mientras que eluyente A: 95/5 agua/MeOH (TFA a 0,1 %) y eluyente B: 5/95 agua/MeOH (TFA 0,1 %) en 40 min.). Se recogieron y liofilizaron las fracciones que contenían el producto y se obtuvo el producto3ccomo un sólido amarillo (13,1 mg, rendimiento del 28,6 %).
HRMS (ESI+) C30H41lN6Os195Pt [M]2+ calc 427,5962, encontrado 427,5999.
La HPLC (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 25 x 4,6 mm) indicó que el producto tenía una pureza del 92,7 % (tiempo de retención 10,7 min.; gradiente: 20 % a 100 % de MeCN/TFA al 0,1 % en agua/TFA al 0,1 % en 20 min., medido a una longitud de onda de 273 nm).
8.3.2. Síntesis y caracterización analítica de Mal-PEG4-Val-Cit-PAB-pacritinib (3e)
8.3.2.I. Síntesis y caracterización analítica de Mal-PEG4-Val-Cit-PAB-Cl.
Se disolvió Mal-PEG4-Val-Cit-OH (10 mg, 14,2 |_imol, 1,0 eq.) en DMF (200 |_il) y se enfrió a 0 °C en un baño de hielo/agua. Posteriormente, se añadió cloruro de tionilo (1,9 mg, 15,6 |_imol, 1,1 eq.) y la mezcla se agitó durante 15 min. a 0 °C, después de lo cual el disolvente se eliminó a presión reducida.
HRMS (ESI+) C3sH4935ClN6O10 [M+H]+ calc 725,3271, encontrado 725,3298.
La HPLC (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 25 x 4,6 mm) indicó que el producto era >90 % puro (tiempo de retención 9,6 min.; gradiente: 20 % a 50 % B, mientras que eluyente A: 95/5 agua/MeCN (t Fa a 0,1 %) y eluyente B: 5/95 agua/MeCN (TFA a 0,1 %) en 20 min medido a una longitud de onda de 273 nm).
8.3.2.2. S ín te s is y c a ra c te r iza c ió n a n a lít ica d e M a l-P E G<4>-V a l-C it-P A B -p a c rit in ib (3e)
Se disolvió pacritinib (6,7 mg, 14,2 pmol, 1,0 eq.) en DMF (300 pl) y se añadió a Mal-PEG4-Val-Cit-Cl (10,3 mg, 14,2 pmol, 1,0 eq.). Posteriormente, se añadieron DIPEA (4,6 mg, 35,5 pmol, 2,5 eq.) y yoduro de tetrabutilamonio (1,0 mg, 2,8 pmol, 0,2 eq.) y la mezcla se agitó durante 24 h a 60 °C. La formación del producto se confirmó mediante HRMS.
HRMS (ESI+) C61H81N10O13 [M+H]+ calc 1161,5979, encontrado 1161,5886.
8.4. Estructuras de SFM de losartán-Lx que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención
8.4.1. Síntesis y caracterización analítica de losartán-Lx-Cl (4a)
Se añadió AgNO3 (26,1 mg, 153,3 |_imol, 1,0 eq.) a una suspensión de PtCl2(etano-1,2-diamina) (LxC^; 50 mg, 153,3 |_imol, 1,0 eq.) en DMF seca (8,3 ml) y se agitó durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad bajo una atmósfera de argón. A continuación, se filtró la suspensión a través de un filtro de jeringa de 0,2 |_im para dar una solución madre 18,5 mM del complejo de Pt activado. Luego, a una solución de losartán potásico (20 mg, 43,4 |_imol, 1,0 eq.) en DMF seca (500 |_il), se añadió la solución madre 18,5 mM preparada del complejo de Pt activado anteriormente (1,76 ml, 32,5 |_imol, 0,75 eq.). La mezcla de reacción se agitó durante 1,5 h a 22 °C. Posteriormente, se añadieron a la mezcla HCl 1 M (70,4 |_il, 2 eq.) y NaCl al 0,9 % (1 ml), después de lo cual los disolventes se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en agua MilliQ/MeOH (1:1, 3 ml) y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 |_im. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 22 x 250 mm; gradiente: 20 % a 50 % B, mientras que eluyente A: 95/5 agua/MeCN (TFA a 0,1 %) y eluyente B: 5/95 agua/MeCN (TFA a 0,1 %) en 40 min.). Se liofilizaron las fracciones que contenían el producto y se obtuvo el producto4acomo un sólido incoloro (11 mg, rendimiento del 47,4 %).
HRMS (ESI+) C24H3135Cl2NsO195Pt [M]+ calc 712,1641, encontrado 712,1628.
La HPLC (columna Grace Alltima C18 de 5 |_im, 25 x 4,6 mm) indicó que el producto tenía una pureza del 94,3 % (tiempo de retención 9,6 min.; gradiente: 5 % a 25 % de MeCN/TFA al 0,1 % en agua/TFA al 0,1 % en 18 min. medido a una longitud de onda de 273 nm).
Ejemplo 9: La conjugación de un complejo semifinal y de un resto funcionalizado con maleimida con una molécula de unión.
9.1. Conjugación de SFM de Lx a una molécula de unión
Se diluyó 13F11-13E8 biparatópico (PM ~27,9 kD, 105 |_il, 5 nmol, 1,33 mg/ml, 1,0 eq.) con tampón borato (20 |_il, borato de sodio 250 mM, NaCl 250 mM y ácido dietilentriaminopentaacético 10 mM, pH 8,0) y H2O (200 |_il), después de lo cual se añadió una solución de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP x HCl; 2 |_il, 10 mM en H2O, 10 nmol, 2,0 eq.). La mezcla se incubó en un termoagitador a 37 °C durante 2 h. Simultáneamente, se mezcló una solución de SFM1c(10 |_il, 5 mM en Nal 20 mM, 50 nmol, 10,0 eq.) con una solución acuosa de tiourea (10 |_il, 20 mM) y se incubó en un termoagitador a 37 °C durante 2h. Posteriormente, las soluciones preparadas anteriores de una molécula de unión y el SMF tratado con tiourea se mezclaron y se incubaron en un termoagitador a 37 °C durante 1 h. Los conjugados se purificaron mediante filtración por rotación utilizando filtros MWCO de 10 kDa (lavados 4 veces con p BS), después de lo cual se reconstituyeron y almacenaron en PBS. La relación Y27632 a 13F11-13E8 determinada por SEC-MS fue 1,0.
9.2. Conjugación de restos funcionalizados con maleimida con una molécula de unión
Se diluyó 13F11-13E8 biparatópico (PM ~27,9 kD, 105 |_il, 5 nmol, 1,33 mg/ml, 1,0 eq.) con tampón borato (20 |_il, borato de sodio 250 mM, NaCl 250 mM y ácido dietilentriaminopentaacético 10 mM, pH 8,0) y H2O (200 |_il), después de lo cual se añadió una solución de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP<x>HCl; 2 |_il, 10 mM en H2O, 120 nmol, 2,0 eq.). La mezcla se incubó en un termoagitador a 37 °C durante 2 h. Posteriormente, la solución preparada anteriormente de una molécula de unión se mezcló con el resto1efuncionalizado con maleimida (2,5 |_il, 10 mM en DMSO, 50 nmol, 10,0 eq.) y se incubó a 0 °C durante 1 h. Los conjugados se purificaron mediante filtración por rotación utilizando filtros MWCO de 10 kDa (lavados 4 veces con PBS), después de lo cual se reconstituyeron y almacenaron en PBS. La relación Y27632 a 13F11-13E8 determinada por SEC-MS fue 1,0.
Ejemplo 10: Internalización de VHH.
10.1. VHH de IGF2R
Para evaluar si 13F11 monovalente y 13F11-13E8 biparatópico se internalizan en las células que expresan hIGF2R, se incubaron células A549 (figura 16A) y células NIH 3T3 2.2 transfectadas transitoriamente con hIGF2R (figura 16B) con VHH 25 nM conjugado con Alexa Fluor 647 (método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2). Se incluyó un mAb anti-IGF2R de ratón para detectar la expresión de IGF2R en las células transfectadas con hIGF2R NIH 3T32.2 (figura 16B, columna derecha), el mAb se detectó con un mAb anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 555. Además, se incubaron células NIH 3T3 2.2 transfectadas simuladamente con 13F11 y 13F11-13E8 (figura 16C). Para garantizar que solo estuviera presente la señal de VHH internalizado o anti-IGF2R de ratón, se usó un lavado con ácido (glicina-HCl 0,2 M, NaCl 150 mM, pH 2,3) para eliminar VHH o anti-IGF2R de ratón unidos a los receptores diana en la superficie celular. La eficacia del procedimiento de lavado con ácido se verificó incubando las células NIH 3T32.2 transfectadas con hIGF2R con 13F11-13E8-A647 en hielo y posteriormente tratando estas células con un lavado con ácido mientras permanecían en hielo para evitar la internalización (figura 10D). El 13F11-13E8 biparatópico se internalizó claramente en las células A549, mientras que para el 13F11 monovalente no se observó internalización (figura 16A). Por otro lado, ambos VHH se internalizaron en células NIH 3T3 2.2 transfectadas transitoriamente con hGF2R, aunque se observó una tinción de mayor intensidad para 13F11-13E8 (figura 16B). Las diferencias en la intemalización posiblemente estén relacionadas con las diferencias en los niveles de expresión de IGF2R en las células diana. Como se esperaba, ambas construcciones VHH no se internalizaron en las células NIH 3T3 2.2 transfectadas de forma simulada (figura 16C). El experimento de control de lavado con ácido indicó que el tratamiento de lavado con ácido fue suficiente para eliminar todos los VHH unidos a la membrana (figura 16D). En resumen, el 13F11-13E8 biparatópico se internaliza claramente en células que expresan hIGF2R en la superficie celular.
La tasa de internalización (constante de tasa endocítica, ke) de construcciones biparatópicas 13F11-13E8 y 13E8-13F11 se determinó con un ensayo de internalización cinética en células SCC-VII transfectadas con hIGF2R y rIGF2R. Brevemente, se añadieron 10 nM de 13F11-13E8 o 13E8-13F11 conjugada con IRD800CW (método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2) a células de SCC que expresan hIGF2R o células de SCC que expresan rIGF2R y se incubaron a 37 °C durante diferentes puntos temporales hasta 12 minutos. A continuación, se detuvo deliberadamente la internalización poniendo las células en hielo. Posteriormente, las células se lavaron con PBS frío y la construcción VHH no internalizada (fracción unida) se separó de la construcción internalizada (fracción internalizada) usando un lavado con ácido, como se describió anteriormente, después de lo cual se midió la fluorescencia de ambas fracciones. Ambas construcciones se internalizan con constantes de velocidad endocítica similares (ke alrededor de 1,5 min-1) en las células de SCC que expresan hIGF2R (figura 17). También se observó internalización en células de SCC que expresan rIGF2R, ya que en la figura 17 se puede mostrar un claro aumento de la fluorescencia con el tiempo (ke alrededor de 0,7 min-1).
La internalización de 13F11 monovalente y 13F11-13E8 y 13E8-13F11 biparatópicos en CEH vivas activadas LX-2 se visualizó utilizando la sonda dependiente de pH pHrodo (ThermoFisher Scientific). La sonda de pH se vuelve más fluorescente a medida que el pH del entorno disminuye en consecuencia. Los endosomas y lisosomas tienen un pH mantenido en 6,5 y 4,5, respectivamente, en comparación con el pH citoplásmico de 7,0 y, por lo tanto, la internalización de una construcción VHH-pHrodo se puede visualizar cuando se internaliza a través de la vía endosomal. Las células LX-2 se incubaron a 37 °C durante 2 horas con 50 nM de 13F11, 13F11-13E8 y 13E8-13F11 conjugados con pHrodo-rojo (método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2). Las imágenes fueron tomadas a intervalos de 5 minutos utilizando un microscopio PEXScope de campo amplio (Nikon) con un filtro mCherry y un objetivo de aceite de 40x. En comparación con la construcción monovalente, se observó un aumento más pronunciado en la fluorescencia intracelular a partir de los 15 min. en adelante para ambas construcciones biparatópicas 13F11-13E8 y 13E8-13F11 (figura 18). El 13F11-13E8 biparatópico muestra claramente mayor aumento de fluorescencia durante el período de 40 minutos en comparación con 13E8-13F11, lo que indica una mayor tasa de internalización. Además, tanto 13F11-13E8 como 13E8-13F11 internalizados se acumulan en compartimentos perinucleares (endosomas/lisosomas).
10.2. VHH de PDGFRB
Para determinar la tasa de internalización de la construcción VHH SP02P-SP26P, se realizaron ensayos de internalización cinética en células de SCC que expresan hPDGFRB y células LX-2 usando un método similar al descrito para las construcciones IGF2R en el ejemplo 10.1. Se observó la internalización de SP02P-SP26P tanto en células de SCC que expresan hPDGFRB como en células LX-2 (figura 19).
Ejemplo 11: NDC-Lx-pacritinib induce la relajación de células estrelladas hepáticas (CEH) activadas en un ensayo de contracción.
La potencia relajante del VHH biparatópico 13F11-13E8 conjugado con el inhibidor de JAK2 pacritinib (3c) (método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.1) se evaluóin vitrousando un ensayo de contracción con la línea CEH humana LX-2. Los pocillos de una placa de 24 pocillos se llenaron con 0,5 ml de BSA y se dejaron a 37 °C durante 1 h, después de lo cual los pocillos se lavaron con PBS y se secaron. Posteriormente, se añadió a los pocillos una mezcla de NaOH 1 M, PBS 10x, agua esterilizada, DMEM 2x, HEPES 0,2 M y 1 mg/ml de colágeno tipo I y se incubó a 37 °C durante 1 h, lo que permitió la gelificación del colágeno. Las células LX-2, cuyo medio se reemplazó con DMEM suplementado con FBS al 2 % durante 24 h antes del ensayo, se recogieron y se resuspendieron a 2x105 células por ml de medio (FCS al 2 % en DMEM) y se añadieron 500 pl al gel y se incubaron a 37 °C durante 3 h. Después de unir las células al gel de colágeno, el medio se eliminó y se reemplazó con 500 pl de medio nuevo con 13F11-13E8-Lx-pacritinib 1 mM, 13F11-13E8-Cy5 1 mM (método de conjugación como se describe en 9.2, control negativo) o inhibidor de la contracción monoxima de 2,3-butanodiona 1 mM (BDM, control positivo). Los geles de colágeno se separaron de los lados de los pocillos moviendo la punta de una pipeta o una espátula alrededor de los bordes y las células se incubaron a 37 °C hasta 7 días. Cada 24 h, se tomaron fotografías de los geles de colágeno con una cámara (JAI CV-A55-IR) a una distancia o altura fija. Las áreas de los geles de colágeno se cuantificaron en píxeles utilizando Adobe Photoshop (CC 2017). El porcentaje de inhibición de la contracción se determinó estableciendo el gel incubado sin ningún inhibidor con una inhibición de la contracción del 0 % y el gel incubado con BDM 1 pM (control positivo) con una inhibición de la contracción del 100 %. La construcción 13F11-13E8-Lx-pacritinib fue capaz de inducir una inhibición de la contracción hasta un 76 %, mientras que una construcción de nanocuerpo no equipada con un inhibidor de quinasa (13F11-13E8-mal-Cy5) no inhibió la contracción (figura 20).
Ejemplo 12: Expresión de IGF2R sobre el que se actúa en secciones de hígado cirrótico.
Para evaluar si la expresión del receptor IGF2R está regulada positivamente en un hígado cirrótico, se tiñeron varias criosecciones de tejidos (hígado, riñón, bazo, corazón, íleon, cerebro) obtenidas de ratas sanas (SHAM) y cirróticas (BDL) (procedimiento de preparación como se describe en el ejemplo 13) con la construcción biparatópica 13F11-13E8-ABD conjugada con Alexa Fluor 647 (13F11-13E8-a Bd-A647, método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2). Después de la criosección, las secciones de tejido se tiñeron con 13F11-13E8-ABD-AF647 fluorescente 50 nM y se incubaron durante la noche a 4 °C. Posteriormente, las secciones se lavaron y tiñeon con DAPI y se montaron con medio de montaje mowiol (Merck) y se tomaron imágenes en un microscopio confocal de barrido láser Zeiss LSM700 con un objetivo de 20x. 13F11-13E8-ABD-AF647 se une claramente a células en un hígado de ratas BDL y no a células en un hígado de ratas SHAM (figura 21), lo que indica una fuerte regulación positiva de IGF2R en hígados cirróticos. Adicionalmente, se pudo observar una tinción mínima o nula en otros tejidos de ratas BDL y SHAM, lo que muestra que la expresión de IGF2R está muy restringida al hígado cirrótico (figura 22).
Ejemplo 13: Disminución selectiva de la hipertensión portal dirigiéndose a células estrelladas hepáticas activadas in vivo con una molécula de unión a IGF2R conjugada con una molécula pequeña inhibidora de quinasa.
Para evaluar la funcionalidadin vivo,se conjugó 13F11-13E8-ABD con un resto funcional modificado con Y27632-maleimida (1e) (el conjugado de prueba), como se describe en el ejemplo 9.2. Para proporcionar un comparador, se conjugó una cantidad similar de 13F11-13E8-ABD con W-etilmaleimida en una preparación paralela y similar (el conjugado simulado).
Para establecer animales que presenten hipertensión portal Kleinet al., Fibrosis: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. 2017(1627):91-122.), se sometieron ratas Sprague-Dawley a ligadura de conductos biliares (BDL) mediante laparotomía mediana bajo anestesia inducida por ketamina/xilazina i.p. (ratas BDL). Para proporcionar controles sanos, una segunda cohorte de ratas se sometió al mismo procedimiento quirúrgico excepto por la ligadura real del conducto biliar (ratas SHAM). La cirugía fue seguida con medicación analgésica (carprofeno s.c.). Aproximadamente cinco semanas después de la cirugía, las ratas anestesiadas con ketamina/xilazina fueron sometidas a una laparotomía mediana, después de la cual se insertó un catéter a través de una vena ileocecal hasta la vena porta y un catéter se insertó en la arteria femoral. Los catéteres se conectaron a un equipo registrador de presión para evaluación de presión portal y la presión arterial media, respectivamente.
Después del cateterismo y la estabilización hemodinámica, las ratas recibieron 5 mg/kg de conjugado de prueba o conjugado simulado i.v. a través de la vena lateral de la cola y las presiones se monitorearon continuamente (ejemplo 13.1.). Una hora después de la dosificación, los animales se sacrificaron, después de lo cual se aislaron los tejidos para el análisisex vivo(ejemplo 13.2.).
13.1. Disminución selectiva de la presión portal mediante una molécula de unión a IGF2R conjugada con un inhibidor de quinasa de molécula pequeña.
En ratas BDL, la infusión del conjugado de prueba, pero no del conjugado simulado, dio como resultado una disminución gradual de la presión portal (PP), mientras que la presión arterial (PAM) permaneció constante, lo que indica un alivio selectivo de la hipertensión portal (figura 23A). En los animales a los que se les infundió el conjugado simulado, ambas presiones permanecieron constantes, lo que indica que la disminución de la presión portal mediante el conjugado de prueba estaba mediada por la molécula pequeña del inhibidor de quinasa (figura 23B). En ratas SHAM, ni el conjugado de prueba ni el conjugado simulado afectaron a la presión portal o arterial, lo que indica que el efecto observado en ratas BDL fue específico de la enfermedad.
13.2. Direccionamiento in vivo del IGF2R mediante una molécula de unión a IGF2R conjugada con un inhibidor de quinasa de molécula pequeña
Después del aislamiento, los hígados obtenidos de ratas BDL y SHAM infundidas con el conjugado de prueba se fijaron con paraformaldehído, se empaparon en sacarosa al 30 % (p/v) en PBS y se seccionaron utilizando un criomicrotomo.
Para detectar el conjugado de pruebain situ,se tiñeron secciones de tejido con un antisuero policlonal de conejo anti-VHH que reconoce el resto 13F11-13E8 del conjugado, seguido de un anticuerpo anti-conejo conjugado con el fluoróforo Alexa-488 para su visualización mediante microscopía de fluorescencia confocal (consulte el ejemplo 12). Como se muestra en la figura 24A, el conjugado de prueba se detectó en el hígado de ratas BDL y no en el hígado de ratas SHAM. Además, una segunda tinción de las mismas secciones con exceso de 13F11-13E8 conjugado con el fluoróforo Alexa-647 (13F11-13E8-A647, método de conjugación como se describe en el ejemplo 9.2.) demostró que la distribución del conjugado de prueba en el hígado de ratas BDL se superpusieron con la distribución (tejida) de IGF2R (figura 24B). Estos resultados indican que la presencia del conjugado de prueba en el hígado fue impulsada por la expresión (específica de cirrosis) de IGF2R y, de hecho, se había logrado el direccionamientoin vivode la diana molecular. Cabe destacar que la segunda tinción utilizando 13F11-13E8 conjugado con Alexa-647 para detectar la distribución de IGF2R mostró claramente que el conjugado de prueba no había alcanzado todas las moléculas de IGF2R dentro de la única hora del estudioin vivo.Es probable que se haya producido una mayor acumulación del conjugado de prueba en el hígado de BDL más allá de este tiempo de una hora.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Molécula de unión multiparatópica que comprende al menos dos dominios de anticuerpo de variables únicos y al menos una molécula diagnóstica o terapéutica,
donde al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos son, independientemente entre sí, capaces de unirse específicamente a un receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRB) y donde al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos capaces de unirse específicamente al PDGFRB son:
al menos un dominio de anticuerpo variable único que comprende o consiste en la SEQ ID N.°: 9 (SP02P) y al menos un dominio de anticuerpo variable único que comprende o consiste en la SEQ ID N.°: 153 (SP26P).
2. Molécula de unión según la reivindicación 1, donde al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos se seleccionan, independientemente entre sí, del grupo que consiste en un anticuerpo de dominio variable único de inmunoglobulina (ISVD), un dominio variable de una cadena pesada (VH), un dominio variable de un anticuerpo de una sola cadena pesada (VHH) y un anticuerpo de dominio único (sdAb), preferiblemente, donde los al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos son anticuerpos de dominio tanto únicos como variables, donde son preferiblemente dominios variables de anticuerpos de una sola cadena pesada (VHH).
3. Molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula terapéutica o diagnóstica está unida a al menos un dominio de anticuerpo de variable único mediante una porción conectora y/o un espaciador.
4. Molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula de unión comprende un prolongador de vida media,
preferiblemente donde el prolongador de vida media comprende o consiste en uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión que proporcionan a la molécula de unión una vida media aumentada en comparación con una molécula de unión sin un prolongador de vida media,
más preferiblemente, donde los grupos, residuos, restos o unidades de unión que proporcionan a la molécula de unión una vida media aumentada son un dominio de unión a albúmina, un VHH de unión a albúmina o una cola Fc de anticuerpo o un fragmento del mismo.
5. Molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos están separados por una secuencia de aminoácidos conectora.
6. Molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula terapéutica es un inhibidor de quinasa, preferiblemente seleccionado de entre inhibidores de Rho-quinasa, inhibidores de JAK-2 o inhibidores de neprilisina, o antagonistas del receptor de angiotensina II, como losartán.
7. Molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula terapéutica es una toxina.
8. Molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula de unión comprende un residuo de cisteína o histidina N-terminal o C-terminal, preferiblemente un residuo de cisteína N-terminal o C-terminal.
9. Molécula de unión que comprende al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos y al menos una molécula terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso como medicamento, preferiblemente para su uso en terapia de fibrosis, por ejemplo, fibrosis hepática, fibrosis pulmonar o fibrosis renal, o de cáncer
más preferiblemente, para su uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de cirrosis hepática, fibrosis hepática y/o hipertensión portal,
incluso más preferiblemente para su uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de varices esofágicas y/o hemorroides asociadas a cirrosis hepática, fibrosis hepática y/o hipertensión portal, de la manera más preferible, para su uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de hemorragias por varices internas o externas asociados a cirrosis hepática, fibrosis hepática y/o hipertensión portal.
10. Ácido nucleico que codifica una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
11. Célula huésped para la expresión de una molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la célula huésped comprende un ácido nucleico según la reivindicación 10.
12. Composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de unión que comprende al menos dos dominios de anticuerpo variables únicos y al menos una molécula terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable,
que comprende preferiblemente, además, al menos otro compuesto útil en el tratamiento de la enfermedad hepática crónica.
13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso como tratamiento adyuvante del sangrado por varices en presencia de hipertensión portal o para su uso en el tratamiento de enfermedades hepáticas seleccionadas de entre cirrosis hepática y/o fibrosis hepática.
14. Molécula de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende una molécula diagnóstica, donde la molécula diagnóstica es un agente para la formación de imágenes.
15. Composición diagnóstica que comprende la molécula de unión según la reivindicación anterior y un diluyente y/o excipiente.
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