ES2974541T3

ES2974541T3 - Derivados de pirido[2,3-d]pirimidina como inhibidores de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana

Info

Publication number: ES2974541T3
Application number: ES20743783T
Authority: ES
Inventors: Eric P Gillis; Christiana Iwuagwu
Original assignee: ViiV Healthcare UK No 5 Ltd
Current assignee: ViiV Healthcare UK No 5 Ltd
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2020-06-17
Publication date: 2024-06-27
Anticipated expiration: 2040-06-17
Also published as: CL2021003388A1; CN114245795A; LT3986561T; EP3986561B1; BR112021025655A2; CN114245795B; CR20210664A; JP2022537047A; IL288750A; HRP20240501T1; AU2020295793A1; DK3986561T3; RS65304B1; CA3143136A1; UY38755A; MA56526A; PL3986561T3; MD3986561T2; US20210323967A1; MX2021016149A

Abstract

Se exponen el compuesto y sus sales farmacéuticamente aceptables, y las composiciones y métodos para tratar la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de pirido[2,3-d]pirimidina como inhibidores de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana

Campo de la invención

La invención se refiere a compuestos, composiciones y compuestos para su uso en métodos para el tratamiento de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Más particularmente, la invención proporciona inhibidores novedosos del VIH, composiciones farmacéuticas que contienen dichos compuestos, y compuestos para su uso en métodos para usar estos compuestos en el tratamiento de la infección por VIH. La invención también se refiere a métodos para elaborar los compuestos descritos en lo sucesivo en el presente documento.

Antecedentes de la invención

El síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es el resultado de la infección por VIH. El VIH sigue siendo un importante problema de salud pública mundial. En 2015, se estima que 36,7 millones de personas vivían con el VIH (incluidos 1,8 millones de niños), una prevalencia mundial del VIH del 0,8 %. La gran mayoría de este número vive en países de ingresos bajos y medios. Ese mismo año, 1,1 millones de personas murieron por enfermedades relacionadas con el SIDA.

La terapia actual para individuos infectados por VIH consiste en una combinación de agentes antirretrovíricos aprobados. Actualmente hay cerca de cuatro docenas de medicamentos aprobados para la infección por VIH, ya sea como agentes individuales, combinaciones de dosis fijas o regímenes de comprimidos individuales; los dos últimos contienen 2-4 agentes aprobados. Estos agentes pertenecen a varias clases diferentes y se dirigen a una enzima vírica o a la función de una proteína vírica durante el ciclo de replicación del virus. Por lo tanto, los agentes se clasifican como inhibidores nucleotídicos de la transcriptasa inversa (NRTI, por sus siglas en inglés), inhibidores no nucleotídicos de la transcriptasa inversa (NNRTI, por sus siglas en inglés), inhibidores de la proteasa (PI, por sus siglas en inglés), inhibidores de transferencia de la cadena de integrasa (INSTI) o inhibidores de la entrada (uno, maraviroc, se dirige a la proteína CCR5 del hospedador, mientras que el otro, enfuvirtida, es un péptido que se dirige a la región gp41 de la proteína vírica gp160). Además, se puede usar un potenciador farmacocinético (cobicistat o ritonavir) junto con agentes antirretrovíricos (ARV) que requieran refuerzo.

A pesar del arsenal de agentes y combinaciones farmacológicas, sigue existiendo la necesidad médica de nuevos agentes antirretrovíricos. La alta heterogeneidad vírica, la toxicidad asociada a los fármacos, los problemas de tolerabilidad y la mala adherencia pueden conducir al fracaso del tratamiento y pueden dar como resultado la selección de virus con mutaciones que confieren resistencia a uno o más agentes antirretrovíricos o incluso a múltiples fármacos medicamentos de una clase completa (Beyrer, C., Pozniak A. HIV drug resistance - an emerging threat to epidemic control. N. Engl. J. Med. 2017, 377, 1605-1607; Gupta, R. K., Gregson J.,et al.HIV-1 drug resistance before initiation or re-initiation of first-line antiretroviral therapy in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-regression analysis. Lancet Infect. Dis. 2017, 18, 346-355; Zazzi, M., Hu, H., Prosperi, M. The global burden of HIV-1 drug resistance in the past 20 years. PeerJ. 2018, DOI 10.7717/peerj.4848). Como resultado, se necesitan nuevos fármacos que sean más fáciles de tomar, tengan altas barreras genéticas para el desarrollo de resistencia, y tengan mayor seguridad sobre los agentes actuales. En esta panoplia de opciones, los novedosos mecanismos de acción (MOA, por sus siglas en inglés) que pueden usarse como parte de la terapia antirretrovírica (ART, por sus siglas en inglés) preferida aún pueden desempeñar un papel importante, ya que deberían ser eficaces contra los virus resistentes a los agentes actuales. Las mejoras que harían que los fármacos fueran más fáciles de tomar durante largos períodos de tiempo o incluso durante toda la vida podrían incluir todos o algunos de los siguientes: efectos secundarios reducidos, interacciones medicamentosas reducidas, mayor duración entre las dosis, o vías de administración alternativas que se ajusten a las preferencias individuales del paciente. Los objetivos de mejorar la seguridad incluirían definitivamente índices terapéuticos elevados frente a cualquier toxicidad que provocaría la interrupción de la dosificación, y también podrían incluir efectos secundarios reducidos o interacciones medicamentosas reducidas. La posibilidad de usar menos fármacos en general en un régimen combinado probablemente también conduciría a un mejor cumplimiento y seguridad. Una mayor potencia contra la diana antivírica, especialmente si se mantiene en presencia de plasma humano y albúmina sérica, también conduciría a una dosis reducida y podría afectar directa y positivamente a la duración de la dosificación y el índice terapéutico sobre los efectos secundarios y las toxicidades. En resumen, se lograrían los máximos beneficios para los pacientes infectados por el VIH si se descubrieran fármacos contra el VIH con nuevos mecanismos de acción que también tuvieran los otros beneficios descritos anteriormente que facilitan el cumplimiento y la seguridad a largo plazo.

Actualmente se han descrito en la técnica determinados compuestos potencialmente terapéuticos y se exponen en Blair, Wade S.et al.Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2009), 53(12), 5080-5087, Blair, Wade S.et al.PLoS Pathogens (2010), 6(12), e1001220, Thenin-Houssier, Suzie; Valente, Susana T. Current HIV Research, 2016, 14, 270-282, y las solicitudes de patente PCT con los siguientes números: WO 2012065062, WO 2013006738, WO 2013006792, WO 2014110296, WO 2014110297, WO 2014110298, WO 2014134566, WO 2015130964, WO2015130966, WO 2016033243, WO2018035359 y WO2018203235.

Lo que ahora se necesita en la técnica son compuestos adicionales que sean novedosos y útiles en el tratamiento del VIH. Adicionalmente, estos compuestos deberían proporcionar ventajas para usos farmacéuticos, por ejemplo, con respecto a uno o más de sus mecanismos de acción, unión, eficacia de inhibición, selectividad de diana, solubilidad, perfiles de seguridad, biodisponibilidad y/o frecuencia reducida de dosificación. También se necesitan nuevas formulaciones y compuestos para su uso en métodos de tratamiento que utilicen estos compuestos.

Sumario de la invención

Brevemente, en un aspecto, la presente invención divulga los compuestos representados a continuación

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos (en lo sucesivo en el presente documento "compuestos y sales de la invención").

En otro aspecto, la presente invención divulga una composición farmacéutica que comprende un compuesto o sal de la invención.

En otro aspecto, la presente invención divulga un compuesto o sal de la invención para su uso en terapia.

En otro aspecto, la presente invención divulga un compuesto o sal de la invención para su uso en el tratamiento de la infección por VIH en un ser humano.

En otro aspecto, la presente invención divulga el uso de un compuesto o sal de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la infección por VIH en un ser humano.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un resumen de los perfiles de concentración plasmática-tiempo media en ratas en el estudio que se describe a continuación.

Descripción detallada de la invención

Preferentemente, los compuestos y sales de la invención tienen la estereoquímica representada a continuación

En otro aspecto, los compuestos y sales de la invención tienen la estereoquímica representada a continuación

Las sales de la invención son farmacéuticamente aceptables. Tales sales pueden ser sales de adición de ácidos o sales de adición de bases. Para una revisión de sales farmacéuticamente aceptables adecuadas, véase, por ejemplo, Bergeet al.,J. Pharm, Sci., 66, 1-19, 1977.

Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables representativas incluyen, pero sin limitación, 4-acetamidobenzoato, acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato (besilato), benzoato, bisulfato, bitartrato, butirato, edetato de calcio, alcanforato, alcanforsulfonato (camsilato), caprato (decanoato), caproato (hexanoato), caprilato (octanoato), cinamato, citrato, ciclamato, digluconato, 2,5-dihidroxibenzoato, disuccinato, dodecilsulfato (estolato), edetato (etilendiaminatetraacetato), estolato (laurilsulfato), etan-1,2-disulfonato (edisilato), etanosulfonato (esilato), formiato, fumarato, galactarato (mucato), gentisato (2,5-dihidroxibenzoato), glucoheptonato (gluceptato), gluconato, glucuronato, glutamato, glutarato, glicerofosforato, glicolato, hexilresorcinato, hipurato, hidrabamina (N,N-di(deshidroabietil)-etilendiamina), bromhidrato, clorhidrato, yodhidrato, hidroxinaftoato, isobutirato, lactato, lactobionato, laurato, malato, maleato, malonato, mandelato, metanosulfonato (mesilato), sulfato de metilo, mucato, naftalen-1,5-disulfonato (napadisilato), naftalen-2-sulfonato (napsilato), nicotinato, nitrato, oleato, palmitato, p-aminobencenosulfonato, p-aminosaliciclato, pamoato (embonato), pantotenato, pectinato, persulfato, fenilacetato, feniletilbarbiturato, fosfato, poligalacturonato, propionato, p-toluenosulfonato (tosilato), piroglutamato, piruvato, salicilato, sebacato, estearato, subacetato, succinato, sulfamato, sulfato, tanato, tartrato, teoclato (8-cloroteofilinato), tiocianato, trietyoduro, undecanoato, undecilenato y valerato.

Las sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables representativas incluyen, pero sin limitación, aluminio, 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (TRIS, trometamina), arginina, benetamina (N-bencilfenetilamina), benzatina (N,N'-dibenciletilendiamina), ó/s-(2-hidroxietil)amina, bismuto, calcio, cloroprocaína, colina, clemizol (1-p-clorobencil-2-pirrolildina-1'-ilmetilbencimidazol), ciclohexilamina, dibenciletilendiamina, dietilamina, dietiltriamina, dimetilamina, dimetiletanolamina, dopamina, etanolamina, etilendiamina, L-histidina, hierro, isoquinolina, lepidina, litio, lisina, magnesio, meglumina (N-metilglucamina), piperazina, piperidina, potasio, procaína, quinina, quinolina, sodio, estroncio, t-butilamina y cinc.

En una realización, las sales de adición de ácidos se seleccionan de clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, bisulfato, nitrato, fosfato, hidrogenofosfato, acetato, benzoato, succinato, sacarato, fumarato, maleato, lactato, citrato, tartrato, gluconato, camsilato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato. En una realización, las sales de adición de bases incluyen sales metálicas (tales como sodio, potasio, aluminio, calcio, magnesio y cinc) y sales de amonio (tales como sales de isopropilamina, dietilamina, dietanolamina). Pueden usarse otras sales (tales como trifluoroacetatos y oxalatos) en la fabricación de los compuestos y sales de la invención, y se incluyen dentro del alcance de la invención.

Todas las formas estequiométricas y no estequiométricas posibles de las sales del compuesto de la invención se incluyen dentro del alcance de la invención. El químico experto puede preparar sales de adición de ácidos y bases mediante el tratamiento de un compuesto de la invención con el ácido o base apropiado en un disolvente adecuado, seguido de cristalización y filtración.

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden además un portador, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una realización, las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En el método de esta descripción, las vías de administración preferidas son la oral y la inyección para suministro por vía subcutánea o intramuscular. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas preferidas incluyen composiciones adecuadas para administración oral (por ejemplo, comprimidos) y composiciones adecuadas para inyección, por ejemplo, inyección subcutánea o intramuscular.

En otro aspecto, la presente invención divulga un compuesto para su uso en métodos para prevenir la infección por VIH en un ser humano o reducir el riesgo de infección, que comprende administrar un compuesto o sal de la invención. La profilaxis previa a la exposición (o PrEP) tiene lugar cuando las personas en riesgo de infección por VIH toman medicamentos diariamente para reducir sus posibilidades de contraer la infección por VIH. Se ha demostrado que la PrEP es eficaz para reducir el riesgo de infección. Como se usa en el presente documento, "VIH" o "virus de la inmunodeficiencia humana" se refiere a VIH-1 y/o a VIH-2.

Se cree que los compuestos y sales de la invención tienen como diana biológica la cápside del VIH y, por lo tanto, su mecanismo de acción es modificar de una o más maneras la función de la cápside del VIH. Por ejemplo, los compuestos y sales de la invención pueden actuar como inhibidores de la cápside.

Los compuestos y sales de la invención pueden emplearse solos o junto con otros agentes terapéuticos. Por lo tanto, las terapias combinadas de acuerdo con la presente invención comprenden la administración de al menos un compuesto o sal de la invención y la administración de al menos otro agente que pueda ser útil en el tratamiento de la infección por VIH. Los compuestos y sales de la invención y cualquier otro agente farmacéuticamente activo pueden administrarse juntos o por separado y, cuando se administran por separado, la administración puede tener lugar simultánea o secuencialmente, en cualquier orden. Por ejemplo, un compuesto o sal de la invención y el otro agente pueden formularse y administrarse juntos en una única composición farmacéutica o pueden formularse y administrarse por separado.

Las cantidades del compuesto y sales de la presente invención y el otro u otros agentes farmacéuticamente activos y los tiempos de administración relativos se seleccionarán para lograr el efecto terapéutico combinado deseado. La administración combinada del compuesto de la presente invención y sales, solvatos u otros derivados farmacéuticamente aceptables del mismo con otros agentes de tratamiento puede realizarse en combinación mediante administración concomitante en: (1) una composición farmacéutica unitaria que incluye múltiples compuestos; o (2) composiciones farmacéuticas separadas, incluyendo cada una uno de los compuestos. Como alternativa, la combinación puede administrarse por separado de manera secuencial, en donde un agente de tratamiento se administra primero y el otro segundo o viceversa, y los diferentes agentes podrían administrarse en diferentes programas si fuera apropiado. Tal administración secuencial puede ser cercana en el tiempo o remota en el tiempo. Las cantidades del compuesto de la invención, o sales del mismo y el otro u otros agentes farmacéuticamente activos y los tiempos de administración relativos se seleccionarán para lograr el efecto terapéutico combinado deseado.

Así pues, los compuestos y sales de la presente invención pueden usarse junto con uno o más agentes útiles en la prevención o tratamiento del VIH. Tales agentes incluyen, por ejemplo, inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa del VIH, inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa del VIH, inhibidores de la proteasa del VIH, inhibidores de la fusión del VIH, inhibidores de la unión al VIH, inhibidores de CCR5, inhibidores de CXCR4, inhibidores de la gemación o maduración del VIH, e inhibidores de la integrasa del VIH. Otros agentes adecuados incluyen, por ejemplo, abacavir, atazanavir, bictegravir, cabotegravir, darunavir, delavirdina, didanosina, didesoxiinosina, dolutegravir, doravirina, efavirenz, elvitegravir, emtricitabina, etavirina, fosamprenavir, fostemsavir, GSK3640254, indinavir, eslatravir, lamivudina, lopinavir, maraviroc, nelfinavir, nevirapina, raltegravir, rilpiverina, ritonavir, saquinavir, eslatravir, estavudina, tipranavir, tenofovir, tenofovir alafenamida, tenofovir disoproxil fumarato, zalcitabina, zidovudina, el anticuerpo N6LS, GSK3739937/VH3739937 y S-648414. Otros agentes adicionales adecuados incluyen dolutegravir, lamivudina, fostemsavir, cabotegravir, maraviroc, rilpiverina, reyataz, tenofovir, afenamida, EfDA, doravirina y preziata. Otros agentes adecuados adicionales incluyen dolutegravir, lamivudina, fostemsavir y cabotegravir. Los agentes preferidos incluyen, por ejemplo, bictegravir, cabotegravir, dolutegravir, fostemsavir, islatravir y lamivudina. Los agentes particularmente preferidos incluyen, por ejemplo, bictegravir, cabotegravir, dolutegravir, fostemsavir y lamivudina.

Ejemplos

Preparación de biciclo[3.1.0]hexan-3-ol

A una solución agitada de ciclopent-3-enol (130 g, 1545 mmol) en DCM (1200 ml) en una atmósfera de N<2>a 0-5 °C se le añadió gota a gota una solución de dietil cinc en hexano (1,0 M, 3091 ml, 3091 mmol) durante un período de 3 h. A la solución a 0 °C se le añadió gota a gota una solución de diyodometano (249 ml, 3091 mmol) en DCM (300 ml) durante un período de 1 h. La mezcla de reacción se dejó calentar a 27 °C, después de lo cual se observó la formación de una precipitación de color blanco. La mezcla se agitó durante 16 h. El avance de la reacción se controló por TLC (SiO<2>, EtOAc al 20 %/pet., Fr = 0,3, UV-inactivo, PMA-activo). La mezcla de reacción se inactivó a través de la adición cuidadosa de una solución ac. saturada de NH<4>O (1,5 l). La mezcla se filtró a través de un lecho de Celite. La capa acuosa se extrajo con DCM (2 x 1 l). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na<2>SO<4>anhidro, se filtraron y a continuación se concentraron a presión reducida para proporcionar biciclo[3.1.0]hexan-3-ol en bruto en forma de un líquido de color rojo, 180 g.<1>H RMN (400 MHz, CDCl<a>) 6 = 4,41-4,35 (m, 1H), 2,18-2,05 (m, 2H), 1,73 (d,J =13,9 Hz, 2H), 1,35-1,25 (m, 2H), 1,21-1,14 (m, 1H), 0,57-0,43 (m, 2H). GCMS: m/z = 98,1).

Preparación de biciclo[3.1.0]hexan-3-ona

A una solución agitada de biciclo[3.1.0]hexan-3-ol (210 g, 2054 mmol) en DCM (5000 ml) en una atmósfera de N<2>a 0 °C se le añadió en porciones peryodinano de Dess-Martin (954 g, 225 mmol). La mezcla se dejó calentar a 27 °C y a continuación se agitó durante 16 h. El avance de la reacción se controló por TLC (SO<2>, acetona al 20 %/Hex, Fr = 0,3, UV inactivo, PMA-activo). La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de Celite y el filtrado se lavó con NaOH ac. (1 N, 8 x 1 l). Las fases acuosas combinadas se extrajeron con DCM (5 x 1 l). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na<2>SO<4>anhidro, se filtraron y a continuación se concentraron a presión reducida (temperatura de baño: 20 °C) para proporcionar biciclo[3.1.0]hexan-3-ona en bruto en forma de un líquido de color pardo. El líquido se purificó aún más mediante destilación descendente a 70 °C para proporcionar biciclo[3.1.0]hexan-3-ona en forma de un líquido viscoso de color amarillo pálido, 125 g (62 %).<1>H RMN (400 MHz, CDCh) ó = 2,61-2,54 (m, 2H), 2,17-2,12 (m, 2H), 1,54-1,46 (m, 2H), 0,92-0,86 (m, 1H), -0,01--0,08 (m, 1H); GCMS: M/Z = 96,1.

Preparación de 2-(2,2-difluoroacetil)biciclo[3.1.0]hexan-3-ona

A una solución agitada de biciclo[3.1.0]hexan-3-ona (125 g, 1274 mmol) en THF (1500 ml) en una atmósfera de N<2>a -78 °C se le añadió LDA (2,0 M en T<h>F, 0,701 l, 1402 mmol). La solución se agitó durante 1 h a -78 °C. A la solución se le añadió lentamente durante 30 minutos una solución de difluoroacetato de etilo (174 g, 1402 mmol) en THF (300 ml) manteniendo una temperatura de -78 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar a 27 °C y a continuación se agitó durante 1 h. El avance de la reacción se controló por TLC (SO<2>, acetona al 20 %/hexano, Fr = 0,3, UV-activo). La mezcla de reacción se inactivó a través de la adición de HCl ac. (1 N, 2000 ml). La mezcla se agitó durante 30 min y a continuación se extrajo con EtOAc (3 x 1000 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (1000 ml), se secaron sobre Na<2>SO<4>anhidro y se filtraron. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar 2-(2,2-difluoroacetil)biciclo[3.1.0]hexan-3-ona en forma de un líquido viscoso de color amarillo pálido, 180 g (71 %).<1>H RMN (400 MHz, CDCl<a>) ó = 6,18 (t,J =54,8 Hz, 1H), 2,70-2,62 (m, 1H), 2,35 (d,J =19,4 Hz, 1H), 2,14 (s a, 1H), 1,26 1,21 (m, 1H), 1,04-1,03 (m, 1H), 0,22-0,21 (m, 1H), LCMS: M/Z = 173,17).

Preparación de 2-(3-(difluorometil)-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetato de etilo.

A una solución agitada de 2-(2,2-difluoroacetil)biciclo[3.1.0]hexan-3-ona (180 g, 910 mmol) en etanol (2 l) en una atmósfera de N<2>a 27 °C se le añadió clorhidrato de 2-hidrazinilacetato de etilo (422 g, 2729 mmol) seguido de ácido sulfúrico (20 ml, 375 mmol). La mezcla se agitó durante 30 min, a continuación se calentó a 100 °C y se agitó durante 16 h. El avance de la reacción se controló por TLC (SO<2>, acetona al 20 %/hexano, Fr = 0,3, UV-activo). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc (2000 ml), se lavó con agua (2 x 1 l), salmuera (1,0 l), se secó sobre Na<2>SO<4>anhidro, se filtró y a continuación se concentró a presión reducida. El residuo resultante se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice (pet.:acetona, 100:0^98:2) para proporcionar 2-(3-(difluorometil)-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetato de etilo en forma de un sólido de color blanquecino, 110 g (46 %).<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d<6>)ó= 6,86 (t,J =54,8 Hz, 1H), 4,93 (s, 2H), 4,14 (c,J= 7,2 Hz, 2H), 2,88-2,79 (m, 1H), 2,76-2,68 (m, 1H), 2,14-2,04 (m, 2H), 1,19 (t,J= 7,2 Hz, 3H), 1,10-1,03 (m, 1H), 0,14 (c,J =4,3 Hz, 1H).

Preparación de 2-(3-(difluorometil)-5-oxo-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetato de etilo.

A una solución agitada de 2-(3-(difluorometil)-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetato de etilo (110 g, 422 mmol) y Celite (395 g) en ciclohexano (3,5 l) a 0 °C se le añadió en porciones dicromato de piridinio (794 g, 2110 mmol). A la mezcla en una atmósfera de nitrógeno se le añadió gota a gota hidroperóxido de terc-butilo (355 ml, 2130 mmol) durante un período de 10 min. La mezcla de reacción se calentó a 27 °C y a continuación se agitó a esa temperatura durante 48 h. El avance de la reacción se controló por TLC (SiO<2>, acetona al 30 %/pet., Fr = 0,4, UV-activo). La mezcla de reacción se filtró, y la torta de filtro se extrajo con EtOAc (1000 ml). El filtrado se lavó con NazSzOs ac. saturado (2 x 500 ml); FeSO<4>ac. saturado (300 ml); y a continuación salmuera (500 ml). La capa orgánica se secó sobre Na<2>SO<4>anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida para obtener el compuesto del título en bruto (150 g).

Preparación de 2-(3-(difluorometil)-4,4a-dihidroespiro[ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-5,2'-[1,3]ditiolano]-1(3bH)-il)acetato de etilo.

A una solución agitada de 2-(3-(difluorometil)-5-oxo-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetato de etilo (75 g, 269 mmol) en DCM (1500 ml) a 27 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadió etano-1,2-ditiol (43,0 ml, 511 mmol) seguido de la adición de trifluoruro de boro-ácido acético (72,6 ml, 511 mmol). La solución se agitó durante 16 h. El avance de la reacción se controló por TLC (SiO2, acetona al 20 %/Pet., Fr = 0,35, UV-Activo). Después de la finalización, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se inactivó mediante la adición de NaHCOs ac. saturado (500 ml). La mezcla se extrajo con DCM (2 x 1000 ml). Los productos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (1000 ml), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida para obtener un líquido de color pardo. Este material se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice (Pet.:EtOAc 95:5^90:10) para proporcionar 2-(3-(difluorometil)-4,4a-dihidroespiro[ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-5,2'-[1,3]ditiolano]-1(3bH)-il)acetato de etilo en forma de un sólido de color blanquecino, 80 g (74 %). 1H Rm N (400 MHz, CDCla) ó = 6,61 (t,J =55,2 Hz, 1H), 5,00-4,85 (m, 2H), 4,29-4,19 (m, 2H), 3,55-3,46 (m, 4H), 2,63-2,53 (m, 1H), 2,49 2,38 (m, 1H), 1,30-1,24 (m, 4H), 0,65-0,60 (m, 1H). LCMS M+H = 346,9.

Preparación de 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[l,2-c]pirazol-1-il)acetato de etilo

A una solución agitada de 1,3-dibromo-5,5-dimetilimidazolidin-2,4-diona (26,3 g, 92 mmol) en DCM (20 ml) a -70 °C en una atmósfera de N<2>se le añadió HF-piridina (2,460 g, 24,83 mmol). La solución estuvo durante 30 min. A la solución se le añadió una solución de 2-(3-(difluorometil)-4,4a-dihidroespiro[ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-5,2'-1,3]ditiolano]-1(3bH)-il)acetato de etilo (10 g, 25 mmol) en DCM (20 ml). La mezcla de reacción se dejó calentar a -40 °C y a continuación se agitó a esa temperatura durante 1 h. El avance de la reacción se controló por TLC (SO<2>, EtOAc al 30 %/Pet., Fr = 0,3, UV inactivo). La mezcla de reacción se inactivó a través de la adición de NaHCOs ac. sat. (200 ml). La mezcla se calentó a temperatura ambiente y a continuación se extrajo con EtOAc (2 x 100 ml). Los productos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (50 ml); se secaron sobre Na<2>SO<4>anhidro; se filtraron; y se concentraron a presión reducida para proporcionar un sólido de color pardo. Este material se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice (Pet.:EtOAc 100:0^75-25) para proporcionar 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetato de etilo en forma de un sólido de color amarillo pálido, 8,5 g (91 %).<1>H RMN (400 MHz, CDCl<a>)ó= 6,62 (t, J = 55,2 Hz, 1H), 4,82 (s, 2H), 4,30-4,18 (m, 2H), 2,51-2,37 (m, 2H), 1,42-1,35 (m, 1H), 1,31-1,23 (m, 3H), 1,14-1,08 (m, 1H). LCMS M+H = 293,07.

Preparación de ácido 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b, 4,4a, 5-tetrahidro- 1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acético

A una solución agitada de 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetato de etilo (15 g, 50 mmol) en THF (17 ml) y MeOH (66 ml) a 0 °C en una atmósfera de N<2>se le añadió una solución de LiOH (1,788 g, 74,7 mmol) en agua (66 ml). La mezcla de reacción se dejó calentar a 27 °C y a continuación se agitó durante 3 h a esa temperatura. El avance de la reacción se controló por TLC (SiO<2>, MeOH al 5 %/DCM, Fr = 0,2, UV Activo). Después de la finalización, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida; se diluyó con agua (50 ml); y se lavó con EtOAc (2 x 250 ml) para eliminar las impurezas. La capa acuosa se ajustó a pH 2-3 usando HCl ac. (1 M) y a continuación se extrajo con EtOAc (3 x 1000 ml). Los productos orgánicos combinados se secaron sobre Na<2>SO<4>anhidro; se filtraron; y se concentraron a presión reducida para proporcionar ácido 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acético en forma de un sólido de color blanquecino, 14 g (98 %). LCMS M+H = 265,15.

Separación que proporcionó ácido 2-((3b5,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acético y ácido 2-((3bR,4aS)3-(difluorometil)-5,5-olifluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acético

Se disolvió ácido 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acético (5,5 g) en isopropanol (20 ml). La solución se sometió en porciones a separación quiral por SFC de la siguiente manera: Instrumento = Thar 80; columna = Chiralpak IC 30 x 250 mm, 5 micrómetros; disolvente A = CO<2>supercrítico; disolvente B = isopropanol con isopropilamina al 0,5 % (v/v); composición de eluyente = 70 % de A:30 % de B; caudal = 65 g/min; contrapresión = 100 bar; temperatura = 30 °C; volumen de inyección = 2,5 ml; detección = 220 nm. Se recogió ácido 2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acético en forma de un pico con elución de 7,5 min a 14 min; se recogió ácido 2-((3bR,4aS)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acético en forma de un pico con elución de 2,7 min a 5,8 min. Para cada enantiómero, la solución resultante se concentró a presión reducida y los sólidos resultantes se disolvieron en EtOAc, a continuación se lavaron dos veces con ácido cítrico ac. (1 M) seguido de agua, seguido de salmuera. La solución orgánica se secó sobre Na<2>SO<4>; se filtró; a continuación se concentró al vacío para proporcionar el enantiómero separado con una recuperación del 80 90 %.

Preparación de 3-bromo-6-cloro-2-fluorobenzonitrilo

A una solución agitada de 3-bromo-6-cloro-2-fluorobenzaldehído (210,0 g, 0,89 mol, 1,0 equiv.) en agua (2,1 l) a temperatura ambiente se le añadió ácido hidroxilamina-O-sulfónico (175,15 g, 1,55 mol, 1,75 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a 50 °C y se agitó durante 18 h). La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se agitó durante 1-1,5 h. Los sólidos se aislaron a través de filtración y a continuación se lavaron con agua. El sólido húmedo se secó al vacío a 50 °C durante 12-15 h para proporcionar 3-bromo-6-cloro-2-fluorobenzaldehído, 190,0 g (91 %).

Preparación de 7-bromo-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-amina

A una solución de 3-bromo-6-cloro-2-fluorobenzonitrilo (360,0 g, 1,55 mol, 1,0 equiv.) en etanol (1,08 l) se le añadió sulfato de metilhidrazina (1,11 kg, 7,73 mol, 5,0 equiv.) seguido de la adición de trietilamina (1,3 l, 9,3 mol, 6,0 equiv.) a 25-35 °C. La mezcla de reacción se calentó a 110 °C y se mantuvo durante 15 h (la reacción se controló por TLC). Después de la finalización de la reacción, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió agua (3,0 l) y la mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Los sólidos se aislaron a través de filtración y se lavaron con agua. El sólido húmedo se secó al vacío a 50 °C durante 12-15 horas. El sólido en bruto se purificó por cromatografía en columna (EA al 10 %/hexanos a EA al 40 %/hexanos) para proporcionar el producto en forma de un sólido de color amarillo pálido. Rendimiento: 185,0 g (46,0 %).

Preparación de N-(7-bromo-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)metanosulfonamida

A una solución de 7-bromo-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-amina (1,40 g, 5,37 mmol) en DCM (30 ml) se le añadió base de Hunig (3,75 ml, 21,5 mmol) y, a continuación, la reacción se enfrió en un baño de hielo y se añadió cloruro de metanosulfonilo (1,26 ml, 16,1 mmol). La mezcla de reacción se agitó a esta temperatura durante 1 h (se formó un precipitado). A continuación, la mezcla se diluyó con diclorometano (100 ml), se lavó con agua, HCl 1 M y salmuera, se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró al vacío. El residuo se recogió en EtOH (30 ml) y 10 ml de NaOH ac. al 20 %. La mezcla resultante se calentó con una pistola térmica hasta que se convirtió en una solución homogénea y se agitó a ta durante 30 min. La mezcla se diluyó con agua (80 ml) y se acidificó con HCl 1 N (60 ml). El precipitado se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío para proporcionar el producto del título (1,5 g) en forma de un sólido de color blanquecino. 1H RMN (500 MHz, CDCls) 57,48 (d,J =7,9 Hz, 1H), 7,24 (s a, 1H), 6,95 (d,J= 7,9 Hz, 1H), 4,38 (s, 3H), 3,42 (s, 3H). LC/MS (M+H)+ = 337,80.

Preparación de N-(7-bromo-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil)metanosulfonamida

A una mezcla de N-(7-bromo-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)metanosulfonamida (1,3 g, 3,84 mmol) y 1-(clorometil)-4-metoxibenceno (0,625 ml, 4,61 mmol) en DMF (30 ml) se le añadió carbonato de cesio (1,626 g, 4,99 mmol) y la mezcla se calentó a 80 °C durante 2 h. La mezcla se vertió en agua (100 ml) y se extrajo con EtOAc (50 ml, 2x). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO<4>, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante Bioateg (EtOAc al 0~35 %-hexanos) para proporcionar el producto del título (1,5 g) en forma de una espuma de color blanco.<1>H RMN (500 MHz, CDCl<s>) 57,44 (d,J =7,9 Hz, 1H), 7,31 (d,J= 8,5 Hz, 2H), 6,99 (d,J= 7,9 Hz, 1H), 6,84 (d,J= 8,5 Hz, 2H), 4,99 (s a, 1H), 4,76 (s a, 1H), 4,40 (s, 3H), 3,80 (s, 3H), 3,01 (s, 3H).

Preparación de N-(7-amino-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil)metanosulfonamida

Siguiendo la referencia: Andersen, Jacobet al, Synlett2005 (14), 2209-2213. A una mezcla de N-(7-bromo-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil)metano sulfonamida (600,0 mg, 1,308 mmol), yoduro de cobre (I) (49,8 mg, 0,262 mmol), ascorbato de sodio (518 mg, 2,62 mmol) y (1R,2R)-N1,N2-dimetilciclohexano-1,2-diamina (46,5 mg, 0,327 mmol) en NMP (10 ml) se le añadió una solución de azida de sodio (255 mg, 3,92 mmol) en agua (2,0 ml). A continuación, la mezcla se selló y se calentó en un sistema de microondas a 120 °C durante 2,5 h. A continuación, la mezcla se filtró a través de un lecho de Celite y el lecho se lavó con EtOAc. El filtrado se vertió en agua (100 ml) y se extrajo con EtOAc (50 ml, 2x). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante Biotage (EtOAc al 5-100 %/hexanos) para proporcionar el producto<del título (400 mg) en forma de un sólido de color blanquecino. 1H RMN (400 MHz, c>D<c>I<3>)<6 7,33-7,29 (m,>2<h>),<6,89>(d,J= 7,8 Hz, 1H), 6,85-6,79 (m, 2H), 6,48 (d,J= 7,8 Hz, 1H), 5,11 (s a, 1H), 4,81 (s a, 1H), 4,30 (s, 3H), 3,80 (s a, 2H), 3,79 (s, 3H), 2,99 (s, 3H). LC/MS (M+H)+ = 395,00.

Preparación de ácido 2-amino-6-(benciloxi)nicotínico

Una solución de ácido 2-amino-6-cloronicotínico (5 g, 29 mmol) y terc-butóxido de potasio (9,75 g, 87 mmol) en alcohol bencílico (97 ml) se calentó a 120 °C durante 3 h. Después del enfriamiento a temperatura ambiente, la mezcla de reacción muy oscura se añadió a agua y se lavó con éter (x3). A continuación, la capa acuosa se acidificó con ácido cítrico 0,5 M. El precipitado de color castaño se filtró para proporcionar el producto (4,4 g, 62 %) que se usó en la<siguiente reacción sin purificación adicional. 1H RMN (500>M<hz>,<DMSO-d6) 6 12,40 (s a, 1H), 7,94 (d, J = 8,55 Hz,>1H), 7,06-7,52 (m, 5H), 6,04 (d, J = 8,24 Hz, 1H), 5,33 (s, 2H). LC/MS: m/z = 245,15 [M+1]+.

Preparación de N-[(6P)-7-{2-[(1S)-1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil]-7-hidroxi-4-oxo-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-3-il}-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il]-N-[(4-metoxifenil)metil]metanosulfonamida

Etapa 1:

A una suspensión de ácido (S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3,5-difluorofenil)propanoico (5,49 g, 18,23 mmol) y ácido 2-amino-6-(benciloxi)nicotínico (4,45 g, 18,23 mmol) en acetonitrilo (92 ml) (solución de color amarillo) a -25 °C se le añadió piridina (9,83 ml, 122 mmol) seguido de 2,4,6-trióxido de 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioxatrifosfinano ("T3P", 45,2 ml, 76 mmol). La mezcla de reacción (se convirtió en una solución transparente después de la adición de T3P) se agitó a -25 °C a 10 °C durante 4,5 h, a continuación se añadió N-(7-amino-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil)metanosulfonamida (6 g, 15,19 mmol) y la mezcla se agitó durante 18 h mientras se calentaba a ta. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con NaOH 1 N, a continuación agua, a continuación ácido cítrico 0,5 M, a continuación agua, a continuación se secó sobre Na2SO4 y se concentró al vacío. El residuo resultante se purificó sobre sílice (columna de 330 g RediSep Gold) usando acetato de etilo al 0-60 % en hexanos durante 15 VC, a continuación mantenimiento en EtOAc al 60 % durante 10 VC. Las fracciones deseadas se agruparon y se concentraron para proporcionar un sólido de color amarillo pálido (8,1 g, 9,14 mmol, 60,1 % de rendimiento), una mezcla de N-[(1S)-1-[(3P,3P)-7-(benciloxi)-3-(4-cloro-3-{N-[(4-metoxifenil)metil]metanosulfonamido}-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-oxo-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-2-il]-2-(3,5-difluorofenil)etil]carbamato de terc-butilo (principal) y N-[(1S)-1-[(3M,3M)-7-(benciloxi)-3-(4-cloro-3-{N-[(4-metoxifenil)metil]metanosulfonamido }-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-oxo- 3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-2-il]-2-(3,5-difluorofenil)etil]carbamato de terc-butilo (secundario). LC/MS: m/z = 886,25 [M+1]+.

Etapa 2:

Se añadió TFA (21,1 ml, 274 mmol) a una solución de (S)-(1-(7-(benciloxi)-3-(4-cloro-3-(N-(4-metoxibencil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-oxo-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5difluorofenil)etil)carbamato de tere-butilo (Producto de la Etapa 1, 8,1 g, 9,14 mmol) en diclorometano (45,7 ml). La mezcla se agitó a ta durante 2 h. La solución de color amarillo pálido resultante se concentró. El residuo se recogió en acetato de etilo, a continuación se lavó tres veces con NaOH 1 N, a continuación se secó sobre Na2SO4 y a continuación se concentró al vacío para proporcionar un residuo oleoso. El residuo se purificó sobre gel de sílice (columna de 330 g RediSep Gold) mediante un método de gradiente de Disolvente A:Disolvente B, 65:35^-0:100 (2 VC), a continuación 0:100 (9 VC); Disolvente A = hexanos; Disolvente B = 9:9:2 de hexanos:acetato de etilo:MeOH. El primer isómero de elución (principal) se recogió y se concentró al vacío para proporcionar N-[(6P)-7-{2-[(1S)-1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil]-7-hidroxi-4-oxo-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-3-il}-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il]-N-[(4-metoxifenil)metil]metanosulfonamida (4,1 g, 5,89 mmol, 64,5 % de rendimiento). 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 57,86 7,98 (m, 1 H) 7,15-7,37 (m, 4 H) 6,97-7,06 (m, 1 H) 6,70-6,89 (m, 4 H) 6,40-6,48 (m, 1 H) 4,70-4,88 (m, 2 H) 3,41-3,81 (m, 7 H) 3,20-3,28 (m, 1 H) 3,08-3,12 (m, 3 H) 2,71-2,79 (m, 1 H) 1,69-2,00 (m, 2 H). LC/MS: m/z = 696,20 [M+1]+.

Preparaeión de N-((S)-1-((3P)-3-(4-eloro-3-(N-(4-metoxibeneil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-7-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidropirido[2,3-d],pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS, 4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b, 4,4a, 5-tetrahidro-1H-eielopropa[3,4]eielopenta[ 1,2-e]pirazol-1-il)aeetamida

A una solución agitada de N-[(6P)-7-{2-[(1S)-1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil]-7-hidroxi-4-oxo-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-3-il}-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il]-N-[(4-metoxifenil)metil]metanosulfonamida (0,926 g, 1,330 mmol) en DMF (13 ml) se le añadió ácido 2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acético (0,351 g, 1,330 mmol), hexafluorofosfato 2-(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-il)-1,1,3,3-tetrametilisouronio (V) ("HATU", 0,531 g, 1,397 mmol) y DIPEA (0,581 ml, 3,33 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 h, después de lo cual la mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. Las extracciones de EtOAc combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron al vacío. El producto en bruto se purificó a través de cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando acetato de etilo al 10-100 % en hexanos para proporcionar N-((S)-1-((3P)-3-(4-cloro-3-(N-(4-metoxibencil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-7-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamida (1,1 g, 88 %) en forma de un sólido espumoso de color blanquecino. LC/MS: m/z = 942,25 [M+1]+.

Preparaeión del Ejemplo 1: N-((S)-1-((3P)-3-(4-eloro-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofen\\)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b, 4,4a, 5-tetrahidro-1H-eielopropa[3,4]eielopenta[ 1,2-e]pirazol-1-il)aeetamida

Una solución de (E)-diaceno-1,2-dicarboxilato de diisopropilo ("DIAD", 0,125 ml, 0,637 mmol) en THF (0,2 ml) se le añadió gota a gota a una mezcla de N-(1-((3P)-3-(4-cloro-3-(N-(4-metoxibencil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-7-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamida (0,2 g, 0,212 mmol)), 3,3,3-trifluoropropan-1-ol (0,073 g, 0,637 mmol) y trifenilfosfina (0,178 g, 0,679 mmol) en tetrahidrofurano (2,1 ml) a ta. La mezcla de reacción se agitó durante 18 h a ta y a continuación se concentró al vacío. El residuo se purificó sobre gel de sílice (columna de 24 g RediSep Gold) usando un gradiente de acetato de etilo al 0-60 % en hexanos durante 15 VC, y a continuación mantenimiento en acetato de etilo al 60 % en hexanos durante 5 VC. Las fracciones que contenían el producto puro se agruparon y a continuación se concentraron para dar un sólido de color amarillo. Este sólido se recogió en DCM (1 ml):TFA (0,5 ml); la solución se enfrió a 0 °C; y a la solución se le añadió ácido tríflico (0,057 ml, 0,637 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y a continuación se concentró al vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo; se lavó con NaOH 1 N; se lavó con ácido cítrico 0,5 M; se secó sobre Na2SO4; se filtró; y a continuación se concentró al vacío. El residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice (columna de 24 g RediSep Gold) usando acetato de etilo al 0-60 % en hexanos durante 20 VC, a continuación en acetato de etilo al 60 % durante 10 VC. Las fracciones que contenían el producto puro se agruparon y a continuación se concentraron al vacío para dar N-(1-((6P)-3-(4-cloro-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamida (0,078 g, 0,081 mmol, 38,0 % de rendimiento) en forma de un sólido de color pardo. 1H RMN (500 MHz, METANOL-d4) 5 ppm 8,46-8,53 (m, 1 H) 7,28-7,34 (m, 1 H) 7,19-7,24 (m, 1 H) 7,03-7,09 (m, 1 H) 6,53-6,81 (m, 4 H) 4,80 (dd, J =5,96, 2,98 Hz, 3 H) 4,49-4,62 (m, 2 H) 3,58-3,62 (m, 3 H) 3,40-3,49 (m, 1 H) 3,22-3,24 (m, 3 H) 3,06-3,14 (m, 1 H) 2,80-2,89 (m, 2 H) 2,37-2,44 (m, 2 H) 1,32-1,37 (m,<1 H) 0,96-1,01 (m, 1 H). Método de análisis por>LC<m>S:<Columna = Acquity>U<p>L<c BEH C18, 2,1 x 100 mm, partículas>de 1,7 gm; Volumen de inyección = 5,00 gl; Caudal = 0,80 ml/min; Disolvente A = 95:5 de agua:MeCN con ácido fórmico al 0,1 % v/v; Disolvente B = 5:95 de agua:MeCN con ácido fórmico al 0,1 % v/v; Perfil de elución = % de B inicial: 0, % de B final: 100, Tiempo de gradiente: 3,5 min, a continuación mantenimiento al 100 % de B durante 1 min; Longitud de onda de detección 1 = 220 nm, longitud de onda 2 = 254 nm. Tiempo de retención de LCMS = 3,097 min; m/z = 918,05 [M+1]+.

Preparación alternativa de N-(7-amino-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil)metanosulfonamida

Esquema de síntesis:

Etapa 1: Preparación de 2,6-dicloro-3-nitrobenzaldehído

A una solución de ácido sulfúrico (H2SO4) (5,63 l, 4,5 V) en un matraz de fondo redondo a 0-5 °C se le añadió en porciones 2,6-diclorobenzaldehído (1,25 kg, 7,10 mol, 1,0 equiv.) a menos de 15 °C. La masa de reacción se agitó a 0-5 °C durante 30 min. Se añadió una solución de mezcla de nitración recién preparada [preparada a partir de H2SO4 conc. (0,425 l, 0,34 V) y HNOs al 70%(0,85 kg, 13,49 mol, 1,30 equiv.) a 0 °C] a la mezcla de reacción anterior a menos de 10 °C[Nota:La reacción es ligeramente exotérmica (3-6 °C); de modo que se prefiere la adición a temperatura más baja]. La mezcla de reacción se agitó a 5-10 °C durante 2-3 h. Después de la finalización de la reacción (controlada por TLC), se inactivó con agua enfriada con hielo (18,75 l, 15 V) a menos de 25 °C. A continuación, la masa de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. Los sólidos se aislaron por filtración y a continuación se lavaron con agua (2,5 l, 2,0 V). La mayor parte del agua se eliminó de los sólidos manteniendo la filtración al vacío durante 60-90 min. El sólido húmedo en bruto se secó inicialmente en una atmósfera de aire; a continuación en una estufa de aire caliente a 50-55 °C durante 10-12 h (hasta que el contenido de humedad no supere el 5,0 %) para obtener el producto del título seco, 2,6-dicloro-3-nitrobenzaldehído (1,44 kg, 92 % de rendimiento) en forma de un sólido de color amarillo. 1H RMN (400 MHz, CDCl3):510. 44 (s, 1H), 7,88 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 7,56 (d,J= 8,8 Hz, 1H).

Etapa 2: Preparación de 2,6-dicloro-3-nitrobenzonitrilo

(Etapa 2a) A una solución de DMSO (5,9 l, 5,0 V)) en un matraz de fondo redondo se le añadió 2,6-dicloro-3-nitrobenzaldehído (1,17 kg, 5,31 mol, 1,0 equiv.) a temperatura ambiente. Después de la agitación durante 30 min a temperatura ambiente, se añadió clorhidrato de hidroxilamina (0,63 kg, 9,04 mol, 1,70 equiv.) y la masa de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de la finalización de la reacción (controlada por TLC), la masa de reacción se interrumpió mediante la adición de agua enfriada con hielo (18,0 l, 15,0 V) añadida a una velocidad suficiente para mantener la temperatura por debajo de 30 °C (Observación: Se formaron sólidos después de la adición de agua). La masa de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 60-90 min. Los sólidos se aislaron por filtración; se lavaron con agua (2,5 l, 2,0 V); seguido de lavado con una mezcla de acetona y hexanos (6,0 l, relación 1:1). La mayor parte del agua se eliminó de los sólidos manteniendo la filtración al vacío durante 60-90 min. El sólido húmedo se secó inicialmente al aire y a continuación se secó finalmente en una estufa de aire caliente a 50-55 °C durante 10-12 h (hasta que el contenido de humedad no fue superior al 1,0 %) para obtener el producto objetivo seco, 2,6-dicloro-3-nitrobenzaldehído oxima (1,22 kg, 92 % de rendimiento) en forma de un sólido de color blanquecino. El producto en bruto (que contiene el 10-20 % de 2,6-dicloro-3-nitrobenzonitrilo) se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

(Etapa 2b) A una solución agitada de la oxima en bruto (preparación descrita anteriormente, 1,13 kg, 4,80 mol, 1.0 equiv.) en DCM (9,04 l, 8,0 V) a 0-5 °C se le añadió trietilamina ("TEA", 1,02 kg, 10,09 mol, 2,1 equiv.). Después de agitarse durante 5 min, se añadió lentamente cloruro de metanosulfonilo (0,60 kg, 5,29 mol, 1,1 equiv.) (Observación: Se apreció una exotermia durante la adición) a 15 °C. A continuación, la masa de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30-45 min. Después de la finalización de la reacción (el progreso de la reacción se controló por TLC; fase móvil: acetato de etilo al 20 % en hexanos), la masa de reacción se diluyó con agua (6,78 l, 6.0 V); la capa orgánica se separó; y la capa acuosa se extrajo con DCM (3,4 l, 3,0 V). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (5,65 l, 5,0 V); se secaron sobre Na2SO4; y se concentraron al vacío. Los sólidos en bruto resultantes se trituraron con hexanos (4,50 l, 4,0 V) a temperatura ambiente. El material húmedo se secó en una estufa de aire caliente a 50-55 °C durante 5-6 h para obtener el producto seco, 2,6-dicloro-3-nitrobenzonitrilo (0,95 kg, 91 % de rendimiento) en forma de un sólido de color amarillo. 1H RMN (400 MHz, CDCh):58,07 (d,J =8,8 Hz, 1H), 7,63 (d,J= 8,8 Hz, 1H).

Etapa 3: Preparación de 4-cloro-7-nitro-1H-indazol-3-amina

A una solución agitada de 2,6-dicloro-3-nitrobenzonitrilo (750,0 g, 3,45 mol, 1,0 equiv.) en etanol (7,5 l, 10,0 V) a 15 20 °C se le añadió lentamente hidrazina hidrato (519,0 g, 10,36 mol, 3,0 equiv.) mientras se mantuvo la masa de reacción por debajo de 25 °C (Observación: La adición es ligeramente exotérmica y la formación de sólidos comenzará tras la adición). La mezcla de reacción temperatura se elevó lentamente a temperatura ambiente y, a continuación, la mezcla se agitó durante 3 h (Observación: la cantidad de sólidos aumentará durante este tiempo). Después de que se completara la reacción (controlada por TLC), la mezcla se diluyó con agua (7,5 l, 10,0 V) y se agitó adicionalmente durante 1 h a temperatura ambiente. Los sólidos se aislaron a través de filtración y a continuación se lavaron con agua (2,25 l, 3,0 V). El sólido húmedo se lavó con una relación de 1:1 de mezcla de acetona (1,875 l, 2,5 V) y hexanos (1,875 l, 2,5 V). La mayor parte del agua residual se eliminó de los sólidos manteniendo la filtración al vacío durante 60-90 min. Finalmente, el sólido húmedo se secó en una estufa de aire caliente durante 7-8 h a 50 °C (hasta que el contenido de humedad alcanzó menos del 1,5 %) para obtener el producto seco, 4-cloro-7-nitro-1H-indazol-3-amina (549,0 g, 75 % de rendimiento) en forma de un sólido de color rojo ladrillo. 1H RMN (400 MHz, CDCh):510,36 (s a, 1H), 8,20 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 7,07 (d,J= 8,40 Hz, 1H), 4,73 (s a, 2H).

Etapa 4: Preparación de 4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-amina

A una solución agitada de 4-cloro-7-nitro-1H-indazol-3-amina (500 g, 0,42 mol, 1,0 equiv.) en DMF (5,0 l, 10,0 V) a 5 10 °C se le añadió lentamente carbonato de cesio (Cs2CÜ3) (1,91 kg, 5,88 mol, 2,5 equiv.) mientras se mantuvo la masa de reacción por debajo de 10 °C. Después de agitarse durante 5-10 min, se añadió sulfato de dimetilo (326,3 g, 2,59 mol, 1,1 equiv.) mientras se mantuvo la masa de reacción por debajo de 10 °C (Nota: Se prefiere la adición lenta para obtener una regioselectividad más favorable). A continuación, la temperatura de reacción se elevó lentamente a temperatura ambiente y la agitación continuó durante 2 h más a la misma temperatura. Después de que se completara la reacción (controlada por TLC), la masa de reacción se interrumpió mediante la adición de agua enfriada con hielo (15,0 l, 30,0 V) y, a continuación, la mezcla resultante se agitó durante 6-8 h a temperatura ambiente. Los sólidos se aislaron a través de filtración y a continuación se lavaron con agua (1,5 l, 3,0 V). El sólido húmedo se lavó con IPA (1,5 l, 3,0 V) seguido de hexanos (1,0 l, 2,0 V). La mayor parte del agua se eliminó de los sólidos manteniendo la filtración al vacío durante 60-90 min. El sólido húmedo se secó en una estufa de aire caliente durante 7-8 h a 50 °C (hasta que el contenido de humedad está por debajo del 1,0 %). El material aislado, 4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-amina (319,0 g, 60 % de rendimiento), se usó en la etapa siguiente sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, CDCla): 57,97 (d,J =8,32 Hz, 1H), 6,97 (d,J= 8,24 Hz, 1H), 4,63 (s a, 2H), 3,96 (s, 3H).

Etapa 5: Preparación de W-(4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)metanosulfonamida

(Etapa 5a) A una solución de 4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-amina (625,0 g, 2,76 mol, 1,0 equiv.) en DCM (6,25 l, 10,0 V) a 0-5 °C se le añadió trietilamina (TEA) (837,0 g, 8,27 mol, 3,0 equiv.); seguido de la adición de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (20,60 g, 0,165 mol, 0,06 equiv.). La masa de reacción se agitó durante 5-10 min, a continuación se añadió lentamente cloruro de metanosulfonilo (MsCl) (790,0 g, 6,89 mol, 2,5 equiv.) mientras se mantuvo la masa de reacción por debajo de 10 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y a continuación se agitó durante 1,5-2,0 h. Después de la finalización de la reacción (controlada por TLC), la mezcla se diluyó con agua (6,25 l, 10,0 V) y a continuación se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. La capa orgánica se separó, y la capa acuosa se extrajo con DCM (6,25 l, 10,0 V). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (1,25 l, 2,0 V), se secaron sobre Na2SÜ4 y se concentraron para obtener los sólidos en bruto. Los sólidos se trituraron con hexanos (1,25 l, 2,0 V) a temperatura ambiente para obtener el intermedio, N-(4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)-N-(metilsulfonil)metanosulfonamida, que se usó directamente en la siguiente etapa.

(ii) A una solución agitada de N-(4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)-N-(metilsulfonil)metanosulfonamida (preparada anteriormente) en etanol (10,5 l, 20,0 V) a temperatura ambiente se le añadió lentamente una solución ac. al 5 % de NaOH (4,38 l, 7,0 V) [Nota: Se prefiere la adición lenta mediante un embudo de adición por goteo]. La masa de reacción se agitó a la misma temperatura durante 3 h. Después de la finalización de la reacción (controlada por TLC) [Preparación de la muestra para el análisis por TLC: ~1,0 ml de muestra acidificados con HCl ac. 2,0 N para alcanzar el pH: 2-3, extraerla con acetato de etilo y analizar la capa orgánica por TLC], la masa de reacción se enfrió a 0-5 °C y el pH se ajustó a 2-3 mediante la adición de HCl ac. 2,0 N (3,13 l, 5,0 V) mientras se mantuvo la temperatura de reacción por debajo de 10 °C [Nota: La precipitación se produjo tras la adición de HCl y aumentó con la agitación]. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y a continuación se agitó durante 1,5-2,0 h. Los sólidos obtenidos se aislaron a través de filtración y a continuación se lavaron con agua (1,25 l, 2,0 V); seguido de lavado con hexanos (1,25 l, 2,0 V). La mayor parte del agua se eliminó de los sólidos manteniendo la filtración al vacío durante 60-90 min. El material húmedo se secó en una estufa de aire caliente a 50 °C durante 6-7 h (hasta que el contenido de humedad está por debajo del 1,0 %) para obtener el producto seco, N-(4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)metanosulfonamida (640,0 g, 76 %) en forma de un sólido de color amarillo. 1H RMN (400 MHz, CDCl3):58,05 (d,J =8,32 Hz, 1H), 7,32 (s a, 1H), 7,17 (d,J= 8,28 Hz, 1H), 4,15 (s, 3H), 3,45 (s, 3H).

Etapa 6: Preparación de N-(4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil)metanosulfonamida

A una mezcla de N-(4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)metanosulfonamida (635,0 g, 2,08 mol, 1,0 equiv.) y 1-(clorometil)-4-metoxibenceno (359,0 g, 2,30 mol, 1,1 equiv.) en DMF (6,35 l, 10,0 V) a temperatura ambiente se le añadió carbonato de potasio (374,7 g, 2,70 mol, 1,3 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a 80-90 °C y se mantuvo a esa temperatura durante 3 h. Después de la finalización de la reacción (controlada por TLC), la mezcla se vertió en agua enfriada con hielo (19,05 l, 30,0 V) [Nota: Se prefiere una inactivación lenta con agitación vigorosa para evitar la formación de grumos a medida que precipita el producto]. Los sólidos resultantes se aislaron a través de filtración y se lavaron con agua (1,90 l, 3,0 V); a continuación los sólidos se lavaron con hexanos (1,27 l, 2,0 V). La mayor parte del agua se eliminó de los sólidos manteniendo la filtración al vacío durante 60-90 min. El sólido aislado se disolvió en acetato de etilo (12,7 l, 20,0 V) y se añadió carbón (63,5 g). La mezcla se calentó a 60-70 °C y a continuación se agitó durante 30-45 min a esa temperatura. La mezcla se filtró mientras aún estaba caliente (40-50 °C) a través de un lecho de Celite y, a continuación, el lecho de Celite se extrajo con acetato de etilo (3,17 l, 5,0 V). Los filtrados combinados se concentraron a sequedad a presión reducida por debajo de 50 °C. Se añadió acetato de etilo (0,635 l, 1,0 V) a los sólidos a temperatura ambiente. La suspensión sólida resultante se agitó durante 30 min. Los sólidos se aislaron a través de filtración y a continuación se lavaron con hexanos (1,27 l, 2,0 V). El agua residual se eliminó de los sólidos manteniendo la filtración al vacío durante 45-60 min para proporcionar el producto N-(4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil) metano sulfonamida (705,0 g, 80 % de rendimiento) en forma de un sólido de color amarillo.<1>H RMN (400 MHz, CDCl<s>):57,99 (d,J= 8,24 Hz, 1H), 7,27 (d,J= 8,68 Hz, 2H), 7,19 (d,J= 8,24 Hz, 1H), 6,80 (d,J= 8,44 Hz, 2H), 4,95-4,76 (m, 2H), 4,17 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,01 (s, 3H).

Etapa 7: Preparación de N-(7-amino-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil)metanosulfonamida

A una suspensión agitada de polvo de cinc (540,0 g, 8,23 mol, 10,0 equiv.) en una mezcla de THF (3,50 l, 10,0 V) y agua (7,0 l, 20,0 V) a temperatura ambiente se le añadió cloruro de amonio (NH<4>Cl) (449,0 g, 8,23 mol, 10,0 equiv.). A la mezcla se le añadió N-(4-cloro-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil)metanosulfonamida (350 g, 0,823 mol, 1,0 equiv.) en THF (7,0 l, 20,0 V). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3-4 h. Después de la finalización de la reacción (controlada por TLC/HPLC durante el proceso), la mezcla se diluyó con acetato de etilo (3,5 l, 10,0 V) y agua (1,12 l, 2,5 V). La mezcla se agitó durante 15 min. La masa de reacción se filtró a través de un lecho de Celite con lavado de acetato de etilo (1,75 l, 5,0 V). El filtrado bifásico se recogió, y las fases se separaron. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3,50 l, 10,0 V). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (3,50 l, 10 V), se secaron sobre Na<2>SO<4>y a continuación se concentraron al vacío para proporcionar un sólido en bruto. Al producto en bruto se le añadió m Tb E (3,25 l, 10 V) y la suspensión se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. Los sólidos se aislaron por filtración. La mayor parte del agua se eliminó de los sólidos manteniendo la filtración al vacío durante 30-45 min. El producto húmedo se secó en una estufa de aire caliente (50 °C) durante 2 h para proporcionar el producto del título, N-(7-amino-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil)metanosulfonamida (276,0 g, 85 % de rendimiento) en forma de un sólido de color blanquecino.<1>H<r>M<n>(400 MHz, CDCl<s>):57,29-7,26 (m, 2H), 6,86-6,79 (m, 2H), 6,42 (d,J= 7,80 Hz, 1H), 4,99-4,70 (m, 2H), 4,25 (s, 3H), 3,77 (s, 5H), 2,98 (s, 3H).

Preparación de ácido 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotínico

Esquema de síntesis:

Etapa 1: Preparación de ácido 2-amino-6-(benciloxi) nicotínico

A una solución agitada de ácido 2-amino-6-cloronicotínico (200 g, 1159 mmol) en alcohol bencílico (1400 ml, 13464 mmol) a 26 °C en una atmósfera de N2 se le añadió ferc-butóxido de potasio (390 g, 3477 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 120 °C y se agitó durante 16 h a esa temperatura. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO2, MeOH al 10 % en DCM, Fr = 0,5). Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con agua (3 l) y se extrajo con éter dietílico (2 x 1000 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se acidificó a pH 4 usando una solución ac. de ácido cítrico (0,5<m>). El sólido precipitado se recogió por filtración y a continuación se secó a presión reducida para proporcionar ácido 2-amino-6-(benciloxi)nicotínico en forma de un sólido de color blanquecino (220 g, rendimiento = 72 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 12,56-12,32 (m, 1H), 7,97-7,91 (m, 1H), 7,52-7,41 (m, 2H), 7,38-7,11 (m, 5H), 6,03 (d,J= 8,5 Hz, 1H), 5,39-5,31 (m, 2H). Pureza por LCMS = 93 %; m/z = 245,29 (M+H). Etapa 2: Preparación de 2-amino-6-(benciloxi)nicotinato de metilo

A una solución agitada de ácido 2-amino-6-(benciloxi)nicotínico (220 g, 901 mmol) en DMF (2,5 l) a 26 °C en una atmósfera de N2 se le añadieron lentamente carbonato de potasio (373 g, 2702 mmol) y yodometano (0,282 l, 4504 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 27 °C durante 16 h. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO2, EtOAc al 40 %/Pet., Fr = 0,6). Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con agua (5 l). El sólido precipitado se aisló por filtración y a continuación se secó al vacío para proporcionar 2-amino-6-(benciloxi)nicotinato de metilo en forma de un sólido de color blanquecino (220 g, rendimiento = 92 %). 1H RMN (400 MHz, CDCh)5= 8,00 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 7,42-7,40 (m, 2H), 7,39-7,35 (m, 2H), 7,34-7,31 (m, 1H), 6,01 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 5,33 (s, 2H), 3,84 (s, 3H). Pureza por LCMS = 97 %, m/z = 259,30 (M+H).

Etapa 3: Preparación de 2-amino-6-hidroxinicotinato de metilo

A una solución agitada de 2-amino-6-(benciloxi)nicotinato de metilo (50 g, 190 mmol) en DCM (500 ml) a 26 °C en una atmósfera de N2 se le añadieron lentamente TFA (800 ml) y ácido tríflico (25 ml, 282 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 26 °C durante 16 h. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO2, EtOAc, Fr = 0,2). Una vez completada, los volátiles se eliminaron al vacío para proporcionar el producto en bruto. Este material se trituró con éter dietílico (3 x 1000 ml) y, a continuación, el sólido precipitado se aisló por filtración. Al sólido se le añadió agua (2 l) y, a continuación, la mezcla se 5 h. El sólido se recogió por filtración y se lavó con agua. El sólido se secó al vacío para proporcionar 2-amino-6-hidroxinicotinato de metilo en forma de un sólido de color blanquecino (25 g, rendimiento = 78 %). 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6)5= 10,92-10,76 (m, 1H), 7,65 (d,J= 9,5 Hz, 1H), 7,43-6,87 (m, 2H), 5,51 (d,J= 9,5 Hz, 1H), 3,69 (s, 3H). Pureza por LCm S = 99,32 %; m/z = 169,32 (M+h ). La ausencia de TFA y ácido tríflico en el producto se confirmó mediante 19F RMN. El producto se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Etapa 4: Preparación de 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de metilo

A una solución agitada de 2-amino-6-hidroxinicotinato de metilo (50 g, 297 mmol) en THF (1000 ml) a 27 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadió trifenilfosfina (156 g, 595 mmol). La masa de reacción se enfrió a 0 °C y a la masa de reacción se le añadió gota a gota azodicarboxilato de diisopropilo ("DIAD" 116 ml, 595 mmol). La solución se agitó durante 30 min. A la solución a 0 °C se le añadió una solución de 3,3,3-trifluoropropan-1-ol (52,4 ml, 595 mmol) en THF (200 ml). A continuación, la masa de reacción se dejó calentar lentamente a 27 °C y a continuación se agitó a esa temperatura durante 16 h. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO2, EtOAc al 10 %/Pet. Fr = 0,5). Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con agua (500 ml) y se extrajo con EtOAc (2 x 500 ml). Los productos orgánicos combinados se lavaron con agua (500 ml) y a continuación una solución de salmuera (500 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y a continuación se concentró a presión reducida para proporcionar el producto en bruto en forma de un semisólido de color amarillo (100 g). Este material se purificó a través de cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 5-10 % en pet. Las fracciones que contenían el producto deseado se agruparon y se concentraron a presión reducida para proporcionar 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de metilo en forma de un líquido de color amarillo (50 g, 60 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 5: 8,01 (d,J= 8,8 Hz, 1H), 7,21-6,85 (s a, 1H), 6,04 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 4,50 (t,J= 6,6 Hz, 2H), 3,84<(s, 3H), 2,63-2,55 (m, 2H). Método de análisis por>L<c>M<s>:<Columna = Acquity BEH C18 (50 mm x 2,1 mm, 1,7 um);>Fase móvil A = ácido fórmico al 0,05 % en agua; Fase móvil B = ácido fórmico al 0,05 % en CAN; Gradiente = Tiempo (min)/% de B: 0/3, 0,4/3, 2,5/98, 3,4/98, 3,5/3, 4/3; Temp. de columna = 35 °C; Caudal = 0,6 ml/min. Resultado de la L<c>MS:<tiempo de retención = 2,03 min; ion observado = 265,15 (M+H); pureza de LCMS = 93 %.>

Etapa 5: Preparación de ácido 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotínico

A una solución agitada de 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de metilo (50 g, 189 mmol) en tetrahidrofurano (THF) (500 ml), metanol (150 ml) y agua (80 ml) a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadió hidróxido de litio monohidrato (22,66 g, 946 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 50 °C durante 16 h. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO2, EtOAc al 50 %/Pet. Fr = 0,3). Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida para proporcionar un residuo acuoso. A continuación, el residuo se acidificó a pH 4 a través de la adición de HCl 1 N. El precipitado resultante se recogió a través de filtración, se lavó con agua (500 ml), a continuación n-hexano (400 ml) y a continuación se secó para proporcionar ácido 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotínico en forma de un sólido de color blanquecino (45 g, 90 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5: 12,47 (s a, 1H), 7,93 (d,J= 8,8 Hz, 1H), 7,35 (s a, 2H), 5,98 (d,J= 8,8 Hz, 1H), 4,44 (t,J= 6,1 Hz, 2H), 2,84-2,73 (m, 2H). El producto se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Preparación alternativa de ácido 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotínico

Esquema de síntesis:

Etapa 1: Preparación de ácido 2-amino-6-fluoronicotínico

Una mezcla de NH3 en agua ("NH3 al 25 % en H2O", 1 l, 4 V) e isopropanol (6,5 l, 26 V) a 0 °C se roció con amoniaco gaseoso durante 1 h. A la mezcla se le añadió en un autoclave (25 l) ácido 2,6-difluoronicotínico (250 g, 1571 mmol). A continuación, la mezcla de reacción se agitó a 105 °C durante 20 h. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO2, EtOAc al 80 %/Pet. Fr = 0,3). Una vez completada, la mezcla de reacción se dejó enfriar a 20 °C y a continuación se concentró a presión reducida por debajo de 20 °C a un volumen de 4-6 V (1,5 l). El residuo se disolvió en agua (5 l), se acidificó a pH 2-3 a través de la adición de HCl 2 N (700 ml) y a continuación se agitó durante 2 h. El precipitado resultante se recogió a través de filtración, se lavó con agua (4000 ml), a continuación n-hexano (5000 ml) y a continuación se secó en una estufa de vacío a 50 °C para proporcionar ácido 2-amino-6-fluoronicotínico en forma de un sólido de color blanquecino (250 g, 92 % de rendimiento). Este producto se mezcló con el producto de otros lotes preparados mediante el mismo método para proporcionar 2000 g de producto combinado. El disolvente residual se eliminó de los sólidos suspendiendo los sólidos en tolueno (10 l) y a continuación eliminando el tolueno mediante destilación. Los sólidos resultantes se secaron en una estufa de vacío a 60 °C durante 7 días para proporcionar ácido 2-amino-6-fluoronicotínico en forma de un sólido de color blanquecino (1,6 kg, 77 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5: 12,94 (s a, 1H), 8,17 (t,J= 8,8 Hz, 1H), 7,56 (s a, 2H), 6,25 (dd,J= 8,2, 2,8 Hz, 1H). Método de LCMS: Columna = Acquity B<e>H C18 (50 mm x 2,1 mm, 1,7 um); Fase móvil A = ácido fórmico al 0,05 % en agua; Fase móvil B = ácido fórmico al 0,05 % en acetonitrilo; Gradiente = Tiempo (min)/% de B: 0/3, 0,4/3, 2,5/98, 3,4/98, 3,5/3, 4/3; Temperatura de columna = 35 °C; Caudal = 0,6 ml/min. Resultado de la LCMS: tiempo de retención = 1,24 min; ion observado = 157,04 (M+H); pureza de LCMS = 96 %.

Etapa 2: Preparación de 2-amino-6-fluoronicotinato de metilo

A una solución agitada de ácido 2-amino-6-fluoronicotínico (150 g, 961 mmol) y carbonato de potasio (398 g, 2882 mmol) en DMF (1500 ml) se le añadió yodometano (300 ml, 4804 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 27 °C durante 16 h en una atmósfera de nitrógeno. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO2, EtOAc al 30 %/Pet. Fr = 0,7). Una vez completada, la mezcla de reacción se inactivó mediante la adición de agua enfriada con hielo (5000 ml). El precipitado resultante se recogió a través de filtración y se lavó con agua (2000 ml), a continuación nhexano (1000 ml) y a continuación se secó para proporcionar 2-amino-6-fluoronicotinato de metilo en forma de un sólido de color pardo (120 g, 70 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5: 8,20 (t,J= 8,8 Hz, 1H), 7,54 (s a, 2H), 6,29 (dd,J= 8,4, 2,8 Hz, 1H), 3,82 (m, 3H). Método de LCMS: Columna = Acquity BEH C18 (50 mm x 2,1 mm, 1,7 um); Fase móvil A = ácido fórmico al 0,05 % en agua; Fase móvil B = ácido fórmico al 0,05 % en acetonitrilo; Gradiente = Tiempo (min)/% de B: 0/3, 0,4/3, 2,5/98, 3,4/98, 3,5/3, 4/3; Temp. de columna = 35 °C; Caudal = 0,6 ml/min. Resultado de la LCMS: tiempo de retención = 1,55 min; ion observado = 171,07 (M+H); pureza de LCMS = 96 %. El producto se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Etapa 3: Preparación de 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de metilo y 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de 3,3,3-trifluoropropilo

A una solución agitada de 2-amino-6-fluoronicotinato de metilo (25 g, 147 mmol) y 3,3,3-trifluoropropan-1-ol (15,54 ml, 176 mmol) en THF (500 ml) a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadió en porciones hidruro de sodio (disp. al 60 % en aceite, 8,82 g, 220 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 30 min y a continuación se dejó calentar lentamente a 27 °C y se agitó a esa temperatura durante 16 h. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO2, EtOAc al 10 %/Pet. Fr = 0,5). Una vez completada, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se inactivó con una solución acuosa saturada de NH4Cl (300 ml). La mezcla se extrajo con EtOAc (2 x 500 ml). Los productos orgánicos combinados se lavaron con una solución de salmuera (200 ml), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y a continuación se concentraron a presión reducida para proporcionar 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de metilo en forma de un líquido de color amarillo (40 g). También se observó en la reacción la formación del subproducto de transesterificación 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de 3,3,3-trifluoropropilo. Método de LCMS: Columna = Acquity BEH C18 (50 mm x 2,1 mm, 1,7 um); Fase móvil A = ácido fórmico al 0,05 % en agua; Fase móvil B = ácido fórmico al 0,05 % en acetonitrilo; Gradiente = Tiempo (min)/% de B: 0/97, 0,4/97, 2,5/2, 3,4/2, 3,5/97, 4,0/97; Temp. de columna = 35 °C; Caudal = 0,6 ml/min. Resultado de la LCMS: tiempo de retención = 2,04 y 2,22 min; ion observado = 265,18 y 347,29 (M+H); Pureza por LCMS = 57 % de 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de metilo y 15 % de 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de 3,3,3-trifluoropropilo. Esta mezcla de producto en bruto se mezcló con otros dos lotes de producto en bruto preparados mediante el mismo método (40 g y 50 g). El material combinado (130 g) se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 10-20 % en pet. Las fracciones que contenían el producto deseado se agruparon y se concentraron a presión reducida para proporcionar una mezcla 6:1 de 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de metilo y 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de 3,3,3-trifluoropropilo en forma de un líquido de color amarillo pálido (100 g, 90 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5: 8,02-7,97 (m, 1H), 7,04-6,48 (m, 1H), 6,08-6,03 (m, 1H), 4,52-4,47 (m, 2H), 3,83 (s, 3H), 2,64-2,54 (m, 2H). Método de LCMS: Columna = Acquity BEH C18 (50 mm x 2,1 mm, 1,7 um); Fase móvil A = ácido fórmico al 0,05 % en agua; Fase móvil B = ácido fórmico al 0,05 % en acetonitrilo; Gradiente = Tiempo (min)/% de B: 0/97, 0,4/97, 2,5/2, 3,4/2,<3,5/97, 4,0/97; Temp. de columna = 35 °C; Caudal = 0,6 ml/min. Resultado de la>L<c>MS:<tiempo de retención = 2,02 y>2,21 min; ion observado = 264,97 y 346,97 (M+H); Pureza por LCMS = 66 % de 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de metilo y 11 % de 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de 3,3,3-trifluoropropilo.

Etapa 4: Preparación de ácido 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotínico

A una solución agitada de 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de metilo y 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotinato de 3,3,3-trifluoropropilo (6:1, 100 g, 310 mmol) en tetrahidrofurano (THF) (800 ml), Se añadió metanol (300 ml) y agua (200 ml) a 27 °C en una atmósfera de nitrógeno hidróxido de litio monohidrato (37,2 g, 1552 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 50 °C durante 8 h. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO2, EtOAc al 50 %/Pet. Fr = 0,3). Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y, a continuación, el residuo acuoso resultante se acidificó a pH 4 a través de la adición de HCl 1 N. El precipitado resultante se recogió a través de filtración, se lavó con agua (2000 ml), a continuación n-hexano (1000 ml) y a continuación se secó para proporcionar ácido 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotínico en forma de un sólido de color blanquecino (80 g, 97 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5: 12,47 (s a, 1H), 7,93 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 7,33 (s a, 2H), 5,99 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 4,45 (t,J= 6,2 Hz, 2H), 2,83-2,74 (m, 2H). Método de LCMS: Columna = Acquity BEH C18 (50 mm x 2,1 mm, 1,7 um); Fase móvil A = ácido fórmico al 0,05 % en agua; Fase móvil B = ácido fórmico al 0,05 % en acetonitrilo; Gradiente = Tiempo (min)/% de B: 0/3, 0,4/3, 2,5/98, 3,4/98, 3,5/3, 4/3; Temp. de columna = 35 °C; Caudal = 0,6 ml/min. Resultado de la LCMS: tiempo de retención = 1,73 min; ion observado = 251,17 (M+H); pureza de LCMS = 94 %. El producto se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Preparación alternativa del Ejemplo 1: N-((S)-1-((3P)-3-(4-Cloro-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-( (3bS, 4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b, 4,4a, 5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[ 1,2-c]pirazol-1-il)acetamida

Esquema de síntesis:

Etapa 1: Preparación de (S)-(1-(3-(4-cloro-3-(N-(4-metoxibencil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)carbamato de ferc-butilo

A una solución agitada de ácido (S)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3,5-difluorofenil)propanoico (62,3 g, 207 mmol) y ácido 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoxi)nicotínico (55 g, 207 mmol) en acetonitrilo (600 ml) en una atmósfera de nitrógeno a -25 °C se le añadió piridina (41,8 ml, 517 mmol). A la mezcla resultante se le añadió gota a gota durante 15 min 2,4,6-trióxido de 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioxatrifosfinano ("T3P", 50 % en peso en EtOAc, 609 ml, 1033 mmol). La solución se agitó a -25 °C durante 1 h, a continuación se dejó calentar lentamente a 13 °C y se agitó durante 5 h. A la solución a 13 °C se le añadió N-(7-amino-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoxibencil)metanosulfonamida (82 g, 207 mmol). A continuación, la masa de reacción se dejó calentar lentamente a 27 °C y a continuación se agitó a esa temperatura durante 16 h. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO<2>, EtOAc al 40 %/Pet. Fr = 0,4). Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc (500 ml) y a continuación se lavó con ácido cítrico ac. (0,5 M, 2 x 500 ml) seguido de NaOH ac. (1 N, 3 x 500 ml). La capa orgánica se secó sobre Na<2>SO<4>, se filtró y a continuación se concentró a presión reducida para proporcionar el producto en bruto (180 g) que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 40-50 % en pet. Las fracciones que contenían el producto deseado se agruparon y se concentraron a presión reducida para proporcionar (S)-(1-(3-(4-cloro-3-(N-(4-metoxibencil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)carbamato de ferc-butilo en forma de un sólido de color blanquecino (85 g, 39 % de rendimiento). El producto es una mezcla de atropisómeros homoquirales (diastereómeros). Método de LCMS: Columna = Acquity BEH C18 (50 mm x 2,1 mm, 1,7 um); Fase móvil A = ácido fórmico al 0,05 % en agua; Fase móvil B = ácido fórmico al 0,05 % en acetonitrilo; Gradiente = Tiempo (min)/% de B: 0/3, 0,4/3, 2,5/98, 3,4/98, 3,5/3, 4/3; Temp. de columna = 35 °C; Caudal = 0,6 ml/min. Resultado de la LCMS: tiempo de retención = 2,46 min; ion observado = 892,53 (M+H); pureza de LCMS = 85 %.

Etapa 2: Preparación de (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)pirido[2,3-d]pirimidin-3(4H)-il)-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)metanosulfonamida

A una solución agitada de (S)-(1-(3-(4-cloro-3-(N-(4-metoxibencil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)carbamato de ferc-butilo (85 g, 95 mmol) en DCM (300 ml) a 0 °C se le añadió ácido trifluoroacético (TFA, 294 ml, 3810 mmol) seguido de ácido tríflico (25,4 ml, 286 mmol). La solución se dejó calentar a 27 °C y se agitó durante 1 h en una atmósfera de nitrógeno. El progreso de la reacción se controló por TLC (SiO2, EtOAc al 80 %/Pet. Fr = 0,3). Una vez completada, los volátiles se eliminaron en una corriente suave de nitrógeno gaseoso. El residuo se disolvió en EtOAc (1000 ml) y se lavó con NaOH 2 N (2 x 500 ml) y a continuación salmuera (500 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y a continuación se concentró a presión reducida para proporcionar el producto en bruto que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 50-99 % en Pet. Las fracciones que contenían el producto deseado se agruparon y se concentraron a presión reducida para proporcionar (S)-N-(7-(2-(1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)pirido[2,3-d]pirimidin-3(4H)-il)-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)metanosulfonamida en forma de un sólido de color amarillo pálido (63 g). El material es una mezcla de atropisómeros homoquirales (diastereómeros) en una relación de 64:26 como se determina por LCMS. Este producto se mezcló con tres lotes adicionales de productos preparados siguiendo el mismo procedimiento. El producto combinado (195 g) se disolvió en metanol:acetonitrilo (80:20, 1300 ml) y esta solución se purificó por SFC prep. usando el siguiente método: Columna = (R,R) Whelk-01 (250 x 30 x 5 p); eluyente = CO2:MeOH (65:35); Caudal = 90 g/min; Contrapresión = 120 bar; Detección = 214 nm (UV); Tiempo de apilamiento = 14 min; Carga por inyección = 430 mg. El pico principal puro se recogió y se concentró a presión reducida para proporcionar para proporcionar el estereoisómero individual (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)pirido[2,3-d]pirimidin-3(4H)-il)-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)metanosulfonamida en forma de un sólido de color blanquecino (113 g, 63 % de rendimiento).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5: 8,42 (d,J= 8,8 Hz, 1H), 7,43 (d,J= 8,1 Hz, 1H), 7,37 (d,J= 8,1 Hz, 1H), 7,06 (d,J= 8,8 Hz, 1H) 7,03-6,97 (m, 1H), 6,75-6,70 (m, 2H), 4,73-4,69 (m, 2H), 3,68 (s, 3H), 3,58-3,52 (m, 1H), 3,28-3,24 (m,<1H), 3,22 (s, 3H), 2,97-2,83 (m, 3H). Método de>L<c>MS:<Columna = XBridge C18 (75 mm x 4,6 mm, 3,5 pm); Fase>móvil A = bicarbonato de amonio 5 mM en agua; Fase móvil B = acetonitrilo; Gradiente = Tiempo (min)/% de B: 0/5, 0,5/5, 1,0/15, 4,0/98, 7,0/98, 7,5/5, 8,0/5; Temp. de columna = 35 °C; Caudal = 1,3 ml/min. Resultado de la LCMS: tiempo de retención = 4,03 min; ion observado = 672,07 (M+H); Pureza por LCMS = 98 %; Pureza por HPLC = 98 %; Pureza por HPLC quiral = 98 %.

Etapa 3: Preparación de N-((S)-1-((3P)-3-(4-cloro-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamida

A una solución agitada de (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)pirido[2,3-d]pirimidin-3(4H)-il)-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)metanosulfonamida (55 g, 82 mmol) y ácido 2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acético (22,70 g, 86 mmol) en acetato de etilo (818 ml) se le añadió 2,6-lutidina (23,83 ml, 205 mmol). A la mezcla se le añadió gota a gota 2,4,6-trióxido de 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioxatrifosfinano ("T3P", 50 % en peso en acetato de etilo) (97 ml, 164 mmol), después de lo cual la temperatura interna se elevó de 17 °C a 24 °C. La mezcla se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. La reacción se interrumpió mediante la adición de agua (500 ml). Las fases se repartieron y la fase orgánica se lavó con agua (500 ml) y a continuación se secó sobre Na2SO4. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró hasta 1/4 del volumen original para proporcionar el producto en bruto en forma de una solución en acetato de etilo.

Se preparó un segundo lote de producto siguiendo el mismo procedimiento modificado de la siguiente manera: la reacción se realizó usando (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)pirido[2,3-d]pirimidin-3(4H)-il)-4-cloro-1-metil-1H-indazol-3-il)metanosulfonamida (53,4 g, 79 mmol) y las cantidades de todos los demás reactivos se ajustaron en consecuencia. El tratamiento concluyó con un lavado con salmuera (300 ml) antes del secado sobre MgSO4.

Los productos en bruto se combinaron y a continuación se adsorbieron sobre Celite. El polvo resultante se sometió a cromatografía sobre gel de sílice (columna de 3 kg RediSep Gold) eluyendo con acetato de etilo al 30-85 % en hexanos. Las fracciones que contenían el producto deseado se agruparon y se concentraron a presión reducida para proporcionar una espuma de color amarillo. El material se colocó a alto vacío durante 18 h. El material se convirtió en un polvo fino usando un mortero y los sólidos se colocaron en una estufa de vacío a 50 °C durante 48 h para proporcionar N-((S)-1-((3P)-3-(4-cloro-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamida en forma de un polvo de color amarillo (134,1 g, 90 % de rendimiento). 1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) 6 ppm 9,84-9,91 (1 H, m) 9,49 (1 H, d,J= 8,34 Hz) 8,47 (1 H, d,J= 8,35 Hz) 7,79 (1 H, d,J= 7,75 Hz) 7,49 (1 H, d,J= 8,05 Hz) 7,11 (1 H, d,J =8,64 Hz) 6,80-7,09 (2 H, m) 6,66 (2 H, dd,J =8,20, 2,24 Hz) 4,69-4,75 (3 H, m) 4,57 (1 H, d,J= 16,39 Hz) 4,48 (1 H, ddd,J =11,03, 8,35, 2,68 Hz) 3,51 (3 H, s) 3,42 (1 H, dd,J =14,01, 2,38 Hz) 3,20 (3 H, s) 3,05 (1 H, dd,J =14,01, 11,03 Hz) 2,89-2,99 (2 H, m) 2,42 2,48 (2 H, m) 1,32-1,40 (1 H, m) 0,81-0,86 (1 H, m). Método de LCMS: Columna = Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 100 mm, partículas de 1,7 um); Disolvente A = Agua:MeCN (95:5) con ácido fórmico al 0,1 % v/v; Disolvente B = MeCN:Agua (95:5) con ácido fórmico al 0,1 % v/v; Gradiente = Tiempo (min)/% de B: 0/0, 3,5/100, 4,5/100; Caudal = 0,8 ml/min. Resultado de la LCMS: tiempo de retención = 3,173 min; masa observada = 917,95 (M+H). Pureza por UPLC = 99,8 %.

Denominación del Ejemplo 1:

El compuesto del Ejemplo 1 como se ha preparado anteriormente es un material homoquiral que contiene quiralidad axial. La quiralidad axial se puede describir usando la nomenclatura P/M que se detalla en el IUPAC Gold Book (doi:10.1351/goldbook.A00547). Sin embargo, en este momento sólo está disponible un número limitado de herramientas de software que sean capaces de generar nombres químicos que contengan la nomenclatura P/M, y hay incluso menos opciones disponibles para convertir nombres químicos usando esta nomenclatura en representaciones estructurales de las moléculas. Por lo tanto, para mayor claridad y conveniencia, a continuación se proporcionan varios nombres para el Ejemplo 1:

El nombre del Ejemplo 1 generado por ChemDraw Ultra 12 (sin nomenclatura P/M) es: N-((S)-1-(3-(4-cloro-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamida

El nombre químico del Ejemplo 1 generado por JChem para Excel (incluyendo la nomenclatura P/M) es:

N-[(1S)-1-[(3P,3P)-3-(4-cloro-3-metanosulfonamido-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-2-il]-2-(3,5-difluorofenil)etil]-2-[(2S,4R)-9-(difluorometil)-5,5-difluoro-7,8-diazatriciclo[4.3.0.024]nona-1(6),8-dien-7-il]acetamida

El nombre químico generado por ChemDraw Ultra 12 con la nomenclatura P/M añadida manualmente es:

N-((S)-1-((3P)-3-(4-cloro-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-oxo-7-(3,3,3-trifluoropropoxi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciclopropa[3,4]ciclopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamida

Pruebas comparativas:

El compuesto del Ejemplo 1 se comparó con el compuesto del Ejemplo 60.2 descrito en el documento WO2018203235 (Esquema 1) en varias pruebas. A los efectos de estas comparaciones, se elige el uso de material homoquiral de cada compuesto, ya que este nivel de pureza es el más representativo de lo que se usaría en ensayos clínicos en seres humanos. Específicamente, la rotación restringida en torno al enlace C-N indicado del indazol da lugar a atropisómeros (diastereómeros) tanto en el Ejemplo 1 como en el Ejemplo 60.2 que pueden separarse mediante cromatografía y no se interconvierten a temperatura ambiente. Por lo tanto, mediante cromatografía, se aislaron en forma pura los estereoisómeros representados en el Esquema 2.

Esquema 1

Ejemplo 60.2 como se representa en

el documento WO2018203235

Esquema 2

Ejemplo 60.2 que representa la Ejemplo 1 de la presente patente que estereoquímica del material homoquiral representa la estereoquímica del

usado en las pruebas comparativas material homoquiral usado en las

descritas pruebas comparativas descritas

Procedimiento general para cuantificar el compuesto mediante LC-MS/MS:

Todas las muestrasin vitrose inyectaron en un sistema LC-MS/MS Exion LC 4500 Triple Quad™. La columna analítica usada fue una Phenomenex C18 (C18, 4,6 mm x 50 mm, 5 pm) mantenida a temperatura ambiente. La fase móvil A consistía en ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en agua MilliQ. La fase móvil B consistió en metanol al 100 %. El caudal fue de 1 ml/min. El gradiente fue el siguiente: La fase móvil B se aumentó linealmente del 5 % al 90 % durante 0,7 min, se mantuvo al 90 % durante 1,4 min, y se mantuvo al 5 % durante 0,7 min.

Todas las muestrasin vivose inyectaron en un sistema 6500 LC-MS/MS Triple Quad™ con columnas mantenidas a 60 °C. La fase móvil A consistió en H2O, NHUOAc 1 mM, ácido fórmico al 0,025 %. La fase móvil B consistió en MeOH, NHUOAc 5 mM. El caudal fue de 0,6 ml/min. La columna y el gradiente de elución se seleccionaron de uno de los métodos de análisis generales que se describen a continuación.

Método de análisis general A:

Columna = Waters X-Bridge BEH C18 (2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm); Gradiente: Tiempo (min)/% de B = 0,0/10, 0,2/10, 0,8/90, 1,3/90, 1,31/10, 2,0/10.

Método de análisis general B:

Columna = Waters BEH C18 (2,1 x 50 mm, partículas de 2,5 pm); Gradiente: Tiempo (min)/% de B = 0,0/10, 0,2/10, 0,8/90, 1,3/90, 1,31/10, 2,0/10.

Método de análisis general C:

Columna = Waters BEH C18 (2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm); Gradiente: Tiempo (min)/% de B = 0,0/2, 0,40/2, 0,7/65, 1,3/90, 1,9/90, 1,91/2, 2,5/2.

Procedimiento para medir la potencia y la citotoxicidad:

Las células MT-2, las células 293T y el clon de ADN provírico del virus NL<4-3>se obtuvieron del Programa de Reactivos de Referencia e Investigación del SIDA del NIH. Las células MT-2 se propagaron en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10 %, 100 mg/ml de penicilina G y hasta 100 unidades/ml de estreptomicina. Las células 293T se propagaron en medio DMEM complementado con FBS inactivado por calor al 10 %, 100 mg/ml de penicilina G y 100 mg/ml de estreptomicina. Para elaborar el virus de referencia usado en estos estudios se usó un clon provírico recombinante de NL<4-3>, en el que una sección del gen nef se reemplazó por el gen de la luciferasa de Renilla. El virus recombinante se preparó mediante la transfección del clon provírico recombinante de NL<4-3>en células 293T usando el reactivo de transfección Transit-293 de Mirus Bio LLC (Madison, WI). El sobrenadante se recogió después de 2-3 días y la cantidad de virus presente se valoró en células MT-2 usando la actividad de la enzima luciferasa como marcador midiendo la actividad de la enzima luciferasa. La luciferasa se cuantificó usando el sustrato de células vivas EnduRen de Promega (Madison, WI). Las actividades antivirales de los compuestos frente al virus recombinante se cuantificaron midiendo la actividad luciferasa en células MT-2 infectadas durante 4-5 días con el virus recombinante en presencia de diluciones en serie del compuesto.

La concentración eficaz del 50 % (CE<50>) se calculó usando la forma exponencial de la ecuación de la mediana del efecto donde (Fa) = 1/[1 (DE<50>/conc. de fármaco)m] (Johnson VA, Byington RT. Infectivity Assay. In Techniques in HIV Research, ed. Aldovini A, Walker BD. 71-76. Nueva York: Stockton Press.1990). La concentración inhibidora del 50 % (CE<50>) se calculó usando la forma exponencial de la ecuación de la mediana del efecto donde el porcentaje de inhibición = 1/[1 (CE<50>/concentración del fármaco)m], dondemes un parámetro que refleja la pendiente de la curva de respuesta a la concentración.

La citotoxicidad del compuesto y los valores CC<50>correspondientes se determinaron usando el mismo protocolo que se describe en el ensayo antivírico, excepto que se usaron células no infectadas. La citotoxicidad se evaluó el día 4 en células MT2 no infectadas mediante el uso de un ensayo colorimétrico a base de XTT (sal interna de 2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolio-5-carboxianilida) (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo).

Resultados:

Las potencias del Ejemplo 1 y del Ejemplo 60.2 están dentro del error del ensayo de virología anti VIH inicial (CE<50>Ejemplo 1 = 25 ± 8 pM, CE<50>Ejemplo 60.2 = 18 ± 13 pM). Cabe apreciar que la CE<50>del Ejemplo 1 fue de 0,034 nM cuando se ensayó inicialmente, sin embargo, las pruebas adicionales dieron como resultado un promedio revisado de 25 ± 8 pM. La citotoxicidad CC<50>medida es >0,5 pM y >10 pM para el Ejemplo 1 y el Ejemplo 60.2, respectivamente.

Procedimiento para medir el metabolismo en microsomas hepáticos:

Se descongelaron y se diluyeron microsomas hepáticos de humanos, de rata, perro y mono hasta una concentración final de 1 mg/ml en tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,4). Los compuestos de prueba y los controles se prepararon a una concentración final de 100x de 1 pM en 1:1 (v/v) de acetonitrilo:agua y se dividieron en alícuotas en una mezcla microsomal. La mezcla se incubó previamente a 37 °C en un baño de agua con agitación durante 10 minutos. Las incubaciones se realizaron por duplicado. Se incluyeron tres controles en las incubaciones; warfarina, fenacetina y verapamilo. Después de la preincubación, la reacción se inició con NADPH a una concentración final de 1 mM. A los 0, 5, 15, 30, 45 y 60 minutos, se retiraron 25 pl de muestra y se inactivaron con 300 pl de acetonitrilo que contenía un patrón interno (telmisartán). Las muestras se agitaron vorticialmente durante 5 minutos a 1200 rpm y a continuación se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min. Una alícuota de 100 pl de sobrenadante se diluyó tres veces con agua y se inyectó en un sistema LC-MS/MS Triple Quad Exion LC 4500. Los resultados se informaron como un porcentaje del precursor restante y se calcularon a partir de las relaciones de área pico del compuesto de prueba restante después de cada punto temporal y se compararon con el tiempo cero de incubación.

Resultados:

El Ejemplo 1 es seis veces más estable en microsomas hepáticos de perro que el Ejemplo 60.2, y el Ejemplo 1 es al menos dos veces más estable en microsomas hepáticos de mono que el Ejemplo 60.2. Estos datos sugieren que el Ejemplo 1 debería ser significativamente más estable que el Ejemplo 60.2 en cuanto al metabolismoin vivoen perros y monos.

Tabla 1.

Procedimiento para medir el metabolismo en hepatocitos humanos:

Se descongelaron y se diluyeron hepatocitos criopreservados en suspensión de ser humano, mono, perro, rata y ratón en medio E de William precalentado (pH 7,4). Se añadieron alícuotas de la suspensión de hepatocitos a las soluciones de trabajo del compuesto de prueba preparadas en medio E de William precalentado (pH 7,4) para lograr concentraciones finales de 0,5 pM en 0,5 x 10<6>células por mililitro y DMSO <0,25 %. Estas muestras se incubaron a 37 °C con dióxido de carbono al 5 % y agitación a 200 rpm. Las incubaciones se realizaron en singlete. En los puntos temporales 0, 10, 30, 60, 120 y 240 minutos, se retiró una alícuota de 50 pl de las mezclas de incubación y se añadió a una solución de 100 pl de acetonitrilo que contenía patrón interno y la mezcla se agitó vorticialmente y a continuación se centrifugó a 4 °C y 3500 rpm durante 15 minutos. Una vez finalizado el experimento, las muestras se analizaron mediante LC-MS/MS. Los resultados de estabilidad metabólica se informaron como porcentaje del compuesto de prueba precursor restante. Este porcentaje se calcula dividiendo la relación del área pico del compuesto de prueba después de la incubación (t<x>) por la relación del área pico del compuesto de prueba en el tiempo cero (t<ü>) justo antes de la incubación.

La constante de la tasa de eliminación (k, min<-1>) se calcula usando un ajuste de regresión no lineal con la siguiente ecuación:

Ct = Co x e<~k x t>

donde:

Coes la concentración inicial representada como la relación de áreas pico (área pico del compuesto de prueba/área pico del patrón interno);

Ctes la concentración entrepresentada como la relación de áreas (área pico del compuesto de prueba/área pico del patrón interno);

ees la base del logaritmo natural

tes el tiempo (min);

kes la constante de la tasa de eliminación (min-1).

La semivida (t-i/2, min) se calcula usando la siguiente ecuación:

0,693

donde:

kes la constante de la tasa de eliminación (min<-1>).

El aclaramiento intrínsecoin vitro(CL<int>, ml/min/millón de células) se calcula usando la siguiente ecuación:

CLint -0,693/ti/2/n

donde:

11/2 es la semivida;

nes el número de células por ml.

Resultados:

Se calculó que la semivida del Ejemplo 1 en hepatocitos humanos era >480 minutos, mientras que se calculó que la semivida del Ejemplo 60.2 en hepatocitos humanos era de 350 minutos. El aclaramiento intrínseco del Ejemplo 60.2 en hepatocitos humanos es de 0,465 ml/min/g de hígado, que es 1,5 veces más rápido que el aclaramiento hepático de 0,312 ml/min/g encontrado en el Ejemplo 1.

Procedimiento para medir parámetros farmacocinéticos (PK)in vivo:

Se investigó la PK en ratones CD1 macho, ratas Wistar Han, macacos cangrejeros y perros Beagle. Dos grupos de animales (N - 3 por grupo) recibieron el compuesto de prueba como una dosis intravenosa (IV) (1 mg/kg) o por sonda nasogástrica (5 mg/kg de solución y suspensión). El fármaco se formuló en PEG 400 al 90 %, etanol al 10 % para administración IV y en PEG400 al 90 %, etanol al 5 % para administración PO. Se extrajeron muestras de sangre 0,167, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 5, 7, 24, 48, 72 y 96 h posteriores a la dosis por vía IV; 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 5, 7, 24, 48, 72 y 96 h posteriores a la dosis por vía oral. Se extrajeron muestras de sangre en tubos K3EDTA y se centrifugaron a razón de 1500 a 2000 x g para obtener plasma. Las muestras de plasma se almacenaron a -20 °C hasta su análisis por LC-MS/MS. Todas las muestrasin vivose inyectaron en un sistema LC-MS/MS Exion LC 4500 Triple Quad™ donde la columna se mantuvo a 60 °C y el caudal fue de 0,6 ml/min. Todos los parámetros de análisis LC-MS/MS se capturan electrónicamente en los archivos de datos sin procesar. Las muestras PK de rata IV, perro IV, mono IV y mono PO se analizaron mediante el método de análisis general A. Las muestras de PK de ratón IV, ratón PO y perro PO se analizaron mediante el método de análisis general B. Las muestras de rata PO se analizaron mediante el método de análisis general C.

Los parámetros PK se obtuvieron mediante análisis no compartimental de la concentración plasmática frente a los datos de tiempo (Phoenix WinNonlin v8.1). La concentración máxima (Cmáx) y el tiempo para Cmáx (Tmáx) se registraron directamente a partir de observaciones experimentales. El área bajo la curva desde el tiempo cero hasta el último tiempo de muestreo [AUC0-T] y el área bajo la curva desde el tiempo cero hasta el infinito [AUCinf] se calcularon usando la regla trapezoidal logarítmica lineal. El aclaramiento plasmático total (CLtp), el volumen de distribución en estado estacionario (Vss), la semivida de eliminación aparente (T-HALF) y el tiempo de residencia medio (MRT) se estimaron después de la administración IV. Las estimaciones de AUC y T-HALF se realizaron usando un mínimo de tres puntos temporales con concentraciones cuantificables. La biodisponibilidad oral absoluta (F) se estimó como la relación de los valores de AUC normalizados por dosis después de dosis orales e IV.

Resultados:

Se midieron los parámetros (PK) IV del Ejemplo 1 y del Ejemplo 60.2 en cuatro especies preclínicas: ratón, rata, perro y mono. El Ejemplo 1 mostró un aclaramiento mejorado en las cuatro especies en relación con el Ejemplo 60.2. De acuerdo con los resultados del ensayo de microsomas hepáticos mencionado anteriormente, las diferencias en el aclaramiento fueron más significativas para perros y monos, donde la eliminación mejoró 4,9 veces y 2,6 veces, respectivamente. Asimismo, la semivida del Ejemplo 1 en circulación en perros y monos fue 3,4 veces y dos veces mayor que la del Ejemplo 60.2, respectivamente.

Tabla 2.

Tabla 3.

Antes de que un posible medicamento pueda entrar en ensayos clínicos en seres humanos, la seguridad del compuesto típicamente debe evaluarse en dos especies preclínicas: un roedor y otra diferente de un roedor. Estas especies suelen ser ratas, perros o monos. Uno de los objetivos de un estudio de seguridadin vivoes lograr concentraciones de fármaco en circulación que sean muy superiores a las que se esperarían si un ser humano recibiera una dosis eficaz del fármaco. La diferencia entre las concentraciones del fármaco alcanzadas en el estudio de seguridad y las concentraciones del fármaco que se esperarían en una persona que toma una dosis eficaz del fármaco se denomina "margen". Lograr márgenes altos en un estudio de seguridad es importante porque a medida que aumentan los márgenes también aumenta la confianza de que, si fuera posible un acontecimiento adverso relacionado con el fármaco, se observaría durante la evaluación de seguridad preclínica.

Los parámetros PK mejorados en ratas, perros o monos significan que se requeriría una dosis más baja de compuesto para lograr una alta concentración de fármaco en circulación para estas especies preclínicas. Por lo tanto, un mono o un perro al que se le administrara una dosis del Ejemplo 1 lograría márgenes más altos que si se le administrara la dosis del mismo tamaño del Ejemplo 60.2. Debido a limitaciones prácticas del tamaño de la dosis, el margen (y, por lo tanto, la confianza) que podría lograrse con el Ejemplo 1 en un estudio de evaluación de seguridad sin roedores es mayor que el margen que podría lograrse con el Ejemplo 60.2.

Procedimiento para el escalado alométrico de parámetros PK preclínicos para proporcionar una predicción de dosis en seres humanos:

Las predicciones de dosis humanas se realizaron usando el software Phoenix WinNonlin (v. 8.0) y Microsoft Excel usando el complemento ModelRisk para el modelado de poblaciones. Las estimaciones humanas para el CLtp de cada compuesto se obtuvieron basándose en el escalado alométrico promedio de datos IV de ratón, rata, mono y perro (factor de escala de peso corporal de 0,75) y un promedio (factor de escala de peso corporal de 1,0) de todas las especies para el Vss. Los parámetros IV humanos (Vc, Ka, K12, K21, Kel) se determinaron usando la escala del tiempo de residencia medio (MRT) de especies preclínicas (ratón, rata, perro y macaco cangrejero) usando las estimaciones de Vss y CLtp en seres humanos. La absorción (Ka) se determinó mediante deconvolución (PO) o a partir de la semivida (SC) en especies preclínicas (Ka = LN(2)/t1/2). La dosis humana prevista para PO y SC se calcula teniendo en cuenta la variabilidad humana y se calcula para cubrir el 95 % de la población humana.

Resultados:

Los parámetros PK de especies preclínicas se usan comúnmente para predecir los parámetros PK humanos antes de los ensayos clínicos en humanos. Los métodos usados para esta predicción se denominan "escalado alométrico" y generalmente se analizan y se ponen en práctica en la bibliografía. Usando escalado alométrico, la dosis oral prevista una vez al día requerida para mantener una concentración plasmática eficaz del fármaco en seres humanos es 7 veces menor para el Ejemplo 1 que para el Ejemplo 60.2. Específicamente, la dosis CD PO humana prevista del Ejemplo 1 es inferior a 10 mg mientras que la dosis CD PO humana prevista del Ejemplo 60.2 es superior a 30 mg.

Si bien las reacciones idiosincrásicas a los fármacos (es decir, reacciones de hipersensibilidad) son impredecibles y graves por naturaleza y, por lo tanto, representan un problema clínico importante, se ha afirmado que los fármacos administrados en una dosis diaria de 10 mg o menos rara vez, o nunca, se asocian con una alta incidencia de reacciones idiosincrásicas a fármacos (Uetrecht, J. P. New Concepts in Immunology Relevant to Idiosyncratic Drug Reactions: The "Danger Hypothesis" and Innate Immune System. Chem. Res. Toxicol. 1999, 12(5), 387-395, DOI:10.1021/tx980249i).

Procedimiento para medir parámetros farmacocinéticos en un experimento subcutáneoin vivo:

El fármaco se formuló en Kolliphor P188 al 1 %/PEG3350 al 1 %/manitol al 3,5 %/agua al 94,5 % y a continuación se administró a ratas Wistar Han como una inyección subcutánea a una dosis de 20 mg/kg. Se extrajeron muestras de sangre a las 0,167, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 5, 7, 24, 48, 72, 96 h y a continuación cada 3 días durante un máximo de 122 días. Se extrajeron muestras de sangre en tubos K<3>EDTA y se centrifugaron a razón de 1500 a 2000 x g para obtener plasma. Las muestras de plasma se almacenaron a -20 °C hasta su análisis por LC-MS/MS.

Resultados:

La idoneidad de cada compuesto para la administración subcutánea (SC) se evaluó en un experimento PK SC en ratas. Según lo determinado por este experimento, la semivida aparente del compuesto en plasma fue de 13 días para el Ejemplo 1 y de 11,5 días para el Ejemplo 60.2. El AUC<ü.infinito>para el Ejemplo 1 fue de 4.941 días*ng/ml (2,89 % del A<u>C extrapolado). El AUC<ü.infinito>para el Ejemplo 60.2 fue de 609 días*ng/ml (12,8 % del AUC extrapolado). La biodisponibilidad fue del 93 % para el Ejemplo 1 y del 25 % para el Ejemplo 60.2. Las concentraciones de fármaco se mantuvieron por encima de 7 ng/ml para todos los animales durante 73 días con el Ejemplo 1, y 24 días con el Ejemplo 60.2 (figura 1). Las dosis subcutáneas mensuales previstas (CM SC) para seres humanos se calcularon usando las semividas aparentes y la biodisponibilidad procedente de la PK de rata SC junto con los valores de aclaramiento humano previstos procedentes del escalado alométrico. La dosis SC CM prevista requerida para mantener una concentración plasmática eficaz del fármaco en seres humanos es 15 veces menor para el Ejemplo 1 que para el Ejemplo 60.2.

Procedimiento para medir la inducción del citocromo P450 en hepatocitos humanos criopreservados:

Siguiendo las directrices de la FDA("In VitroMetabolism- and Transporter- Mediated Drug-Drug Interaction Studies Guidance for Industry"), se ensayó el potencial del Ejemplo 1 y el Ejemplo 60.2 para inducir la expresión de CYP2B6 usando hepatocitos de los mismos tres donantes individuales (en lugar de donantes agrupados), y los cambios en los niveles de ARNm de la enzima se evaluaron usando el "método de factor de cambio". En esta prueba, un factor de cambio en los niveles de ARNm de menos de 2 veces se considera un hallazgo negativo, mientras que un cambio >2 veces se considera un hallazgo positivo.

Los compuestos se ensayaron en un ensayo de inducción de CYP usando hepatocitos primarios humanos criopreservados inducibles de tres donantes para determinar el potencial para causar la inducción (según lo medido por un aumento en la transcripción de ARNm) de CYP2B6. Los compuestos de prueba (concentración final de 0,12 a 30 pM) se incubaron durante 48 horas con hepatocitos humanos primarios que expresaban de forma natural todos los receptores nucleares implicados en la regulación de los niveles de expresión de diversas enzimas CYP. Se diluyeron soluciones nuevas de compuestos de prueba y controles en medios de ensayo y se añadieron cada 24 horas durante dos días consecutivos, con una concentración final de DMSO del 0,1 %. Al final de la incubación, la integridad de las monocapas celulares, la densidad celular y la viabilidad se evaluaron para evaluar los efectos de citotoxicidad. A continuación, las células se solubilizaron en tampón de lisis celular y se purificó el ARN total de cada muestra de ensayo. A continuación, las muestras se usaron en reacciones en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) para cuantificar la cantidad de especies de ARNm específicas que codifican el gen CYP2B6 humano.

El potencial de inducción de los compuestos de prueba y los controles se comparó con el inductor conocido de CYP2B6, fenobarbital (1000 pM). Los resultados de este ensayo se expresan como el factor de inducción. El factor de inducción se calculó como una relación entre el nivel de ARNm en las células tratadas con el compuesto de prueba respecto al de las células tratadas con DMSO (control de disolvente) solo, el nivel de ARNm inicial y, por lo tanto, representa el potencial de inducción del compuesto de prueba. Se usaron valores del factor de inducción para calcular el porcentaje de los valores de actividad de control, que a continuación se ajustaron a un modelo de regresión logística de 4 parámetros para determinar los valores de CE<50>y E<máx>(si se observa inducción). La citotoxicidad también se evaluó en paralelo para evitar resultados de inducción de CYP falsos positivos debido a la citotoxicidad. Debe evitarse la evaluación e interpretación del potencial de inducción de CYP a concentraciones citotóxicas.

Resultados:

No se observó citotoxicidad con ninguno de los compuestos en ninguna de las concentraciones ensayadas (hasta 30 pM). Para el Ejemplo 1, se encontró un resultado negativo (sin inducción) en los tres donantes. Para el Ejemplo 60.2, se encontró un hallazgo positivo (inducción) con 2 de 3 donantes (valores de CE<50>de 1,5 pM y 1,8 pM).

La inducción de la expresión de la enzima CYP se reconoce como la causa fundamental de las interacciones entre fármacos, lo que conduce a un aumento del aclaramiento del fármaco víctima cuyo metabolismo está gobernado por la isoforma CYP inducida. Entre las isoformas de CYP, CYP2B6 es de particular importancia en el contexto del tratamiento del VIH porque efavirenz (EFV), un medicamento ampliamente usado para tratar el VIH (incluido en la lista de medicamentos esenciales de la Organización Mundial de la Salud de 2019), se metaboliza principalmente por CYP2B6 (Ward, B. A., Gorski, J. C., Jones, D. R., Hall, S. D., Flockhard, D. A., Desta, Z. The Cytochrome P4502B6 (CYP2B6) Is the Main Catalyst of Efavirenz Primary and Secondary Metabolism: Implication for HIV/AIDS Therapy and Utility of Efavirenz as a Substrate Marker of CYP2B6 Catalytic Activity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 306, 287-300, DOI: 10.1124/jpet.103.049601

Claims

REIVINDICACIONES 1. El compuesto:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 2. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene la estereoquímica representada a continuación
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 3. El compuesto de la reivindicación 2 que tiene la estereoquímica representada continuación
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 4. El compuesto de la reivindicación 1 como se representa a continuación:
5. El compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es una sal de sodio.
6. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7 adecuada para administración oral, para inyección intramuscular o para inyección subcutánea.
9. El compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en el tratamiento, prevención o reducción del riesgo de infección por VIH en un ser humano.
10. El compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable, para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el compuesto se administra por vía oral.
11. El compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable, para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el compuesto se administra mediante inyección intramuscular o inyección subcutánea.
12. El compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable, para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el uso comprende además la administración de al menos otro agente usado para el tratamiento de la infección por VIH en un ser humano.
13. El compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable, para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde al menos otro agente se selecciona del grupo que consiste en abacavir, atazanavir, bictegravir, cabotegravir, dolutegravir, darunavir, doravirina, fostemsavir, lamivudina, maraviroc, rilpiverina, tenofovir disoproxilo, tenofovir, tenofovir afenamida, 5-648414, GSK3640254, el anticuerpo N6LS y GSK3739937/VH3739937.
14. El compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable, para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el al menos otro agente se selecciona del grupo que consiste en dolutegravir, lamivudina, fostemsavir, cabotegravir, el anticuerpo N6LS y GSK3739937/VH3739937.
15. El compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el al menos otro agente es cabotegravir.
16. El compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el al menos otro agente es dolutegravir.
17. Un compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en terapia.
18. Un compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en el tratamiento de la infección por VIH.