KR20220024608A

KR20220024608A - 인간 면역결핍 바이러스 복제의 억제제로서의 피리도[2,3-d]피리미딘 유도체

Info

Publication number: KR20220024608A
Application number: KR1020227001501A
Authority: KR
Inventors: 에릭 피 길리스; 크리스티아나 이와그우
Original assignee: 비브 헬스케어 유케이 (넘버5) 리미티드
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2020-06-17
Publication date: 2022-03-03
Also published as: UY38755A; AU2020295793A1; PE20220510A1; LT3986561T; SI3986561T1; PT3986561T; AU2020295793B2; CR20210664A; CN114245795A; MX2021016149A; EP3986561B1; MA56526A; IL288750A; CA3143136A1; EP3986561A1; BR112021025655A2; AR119174A1; RS65304B1; WO2020254985A1; CO2021017479A2

Abstract

하기 화학식의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염, 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 제시된다:

Description

인간 면역결핍 바이러스 복제의 억제제로서의 피리도[2,3-D]피리미딘 유도체

본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염의 치료를 위한 화합물, 조성물, 및 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 HIV의 신규 억제제, 이러한 화합물을 함유하는 제약 조성물, 및 HIV 감염의 치료에서 이들 화합물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 하기 기재된 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)은 HIV에 의한 감염의 결과이다. HIV는 지속적인 주요한 세계 공중 보건 문제이다. 2015년에는, 약 3,670만명의 사람 (180만명의 소아 포함)이 HIV에 감염된 것으로 추정되었으며 - 이는 전 세계적으로 0.8%의 HIV 유병률이다. 상기 수의 대부분은 저소득 및 중소득 국가에서 살고 있다. 같은 해에, 110만명의 사람들이 AIDS-관련 질병으로 사망하였다.

HIV-감염된 개체를 위한 현행 요법은 승인된 항레트로바이러스제의 조합으로 구성된다. 48종에 가까운 약물이 현재 HIV 감염에 대해 단일 작용제로서 또는 고정 용량 조합물 또는 단일 정제 치료법으로서 승인되어 있으며; 후자 둘은 2-4종의 승인된 작용제를 함유한다. 이들 작용제는 바이러스 복제 주기 동안 바이러스 효소 또는 바이러스 단백질의 기능 중 어느 하나를 표적으로 하는 다수의 상이한 부류에 속한다. 따라서, 작용제는 뉴클레오티드 리버스 트랜스크립타제 억제제 (NRTI), 비-뉴클레오티드 리버스 트랜스크립타제 억제제 (NNRTI), 프로테아제 억제제 (PI), 인테그라제 가닥 전달 억제제 (INSTI) 또는 진입 억제제 (이중 하나인 마라비록은 숙주 CCR5 단백질을 표적으로 하는 한편, 다른 하나인 엔푸비르티드는 바이러스 gp160 단백질의 gp41 영역을 표적으로 하는 펩티드임)로서 분류된다. 또한, 약동학적 인핸서 (코비시스타트 또는 리토나비르)가, 부스팅을 필요로 하는 항레트로바이러스제 (ARV)와 조합되어 사용될 수 있다.

작용제 및 약물 조합물의 의료수단에도 불구하고, 신규한 항레트로바이러스제에 대한 의료 필요가 여전히 존재한다. 높은 바이러스 불균질성, 약물-연관 독성, 내약성 문제, 및 불량한 충실성은 모두 치료 실패로 이어질 수 있고, 1종 이상의 항레트로바이러스제 또는 전체 부류로부터 다수의 약물에 대해 내성을 부여하는 돌연변이를 갖는 바이러스의 선택을 유발할 수 있다 (Beyrer, C., Pozniak A. HIV drug resistance - an emerging threat to epidemic control. N. Engl. J. Med. 2017, 377, 1605-1607; Gupta, R. K., Gregson J., et al. HIV-1 drug resistance before initiation or re-initiation of first-line antiretroviral therapy in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-regression analysis. Lancet Infect. Dis. 2017, 18, 346-355; Zazzi, M., Hu, H., Prosperi, M. The global burden of HIV-1 drug resistance in the past 20 years. PeerJ. 2018, DOI 10.7717/peerj.4848). 결과적으로, 섭취가 보다 용이하고, 내성 발생에 대해 높은 유전적 장벽을 갖고, 현행 작용제에 비해 개선된 안정성을 갖는 신규 약물을 필요로 한다. 이러한 수많은 선택범위에서, 바람직한 항레트로바이러스 요법 (ART)의 일부로서 사용될 수 있는 신규 작용 메카니즘 (MOA)은 현행 작용제에 대해 내성인 바이러스에 대해 효과적일 것이기 때문에 여전히 주요한 역할을 할 수 있다. 장기간 동안 또는 심지어 일생 동안의 약물의 섭취를 보다 용이하게 해주는 개선은 하기와 같은 개선: 감소된 부작용, 감소된 약물-약물 상호작용, 투여 사이의 증가된 지속기간, 또는 개별 환자 선호도에 맞는 대안적 투여 경로 중 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 개선된 안전성의 목표에는, 투여의 중단을 유발할 수 있는 임의의 독성에 대한 높은 치료 지수가 분명히 포함될 것이고, 또한 감소된 부작용 또는 감소된 약물-약물 상호작용이 포함될 수 있다. 조합 요법에서 보다 적은 전체 약물을 사용할 수 있는 잠재성은 또한 개선된 순응도 및 안전성으로 이어질 것이다. 항바이러스 표적에 대한 증가된 효력은, 특히 인간 혈장 및 혈청 알부민의 존재 하에 유지되는 경우에, 또한 용량 감소로 이어질 것이고, 투여 지속기간 및 부작용 및 독성에 대한 치료 지수에 직접적으로 및 긍정적으로 영향을 미칠 수 있다. 요약하면, HIV 감염된 환자에 대한 최대 이익은 장기간 순응도 및 안전성을 용이하게 하는 상기 기재된 다른 이익을 또한 갖는 새로운 작용 메카니즘을 갖는 항-HIV 약물이 발견된 경우에 달성될 것이다.

특정의 잠재적 치료 화합물은 현재 관련 기술분야에 기재되어 있으며, 문헌 [Blair, Wade S. et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2009), 53(12), 5080-5087, Blair, Wade S. et al. PLoS Pathogens (2010), 6(12), e1001220, Thenin-Houssier, Suzie; Valente, Susana T. Current HIV Research, 2016, 14, 270-282], 및 하기 번호의 PCT 특허 출원: WO 2012065062, WO 2013006738, WO 2013006792, WO 2014110296, WO 2014110297, WO 2014110298, WO 2014134566, WO 2015130964, WO2015130966, WO 2016033243, WO2018035359, 및 WO2018203235에 제시되어 있다.

현재 관련 기술분야에서 필요한 것은 HIV의 치료에 유용한 신규한 추가의 화합물이다. 추가적으로, 이들 화합물은, 예를 들어 그의 작용 메카니즘, 결합, 억제 효능, 표적 선택성, 용해도, 안전성 프로파일, 생체이용률 및/또는 감소된 투여 빈도 중 하나 이상과 관련하여, 제약 용도를 위한 이점을 제공한다. 또한, 이들 화합물을 이용하는 신규한 제제 및 치료 방법이 필요하다.

간략하게, 한 측면에서, 본 발명은 하기 도시된 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염 (이하 "본 발명의 화합물 및 염")을 개시한다:

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또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 염을 포함하는 제약 조성물을 개시한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 염을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 HIV 감염을 치료하는 방법을 개시한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 염을 개시한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인간에서 HIV 감염을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 염을 개시한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인간에서 HIV 감염의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 화합물 또는 염의 용도를 개시한다.

도 1은 하기 기재된 연구에서의 래트의 평균 혈장 농도-시간 프로파일의 요약이다.

바람직하게는, 본 발명의 화합물 및 염은 하기 도시된 입체화학을 갖는다:

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또 다른 측면에서, 본 발명의 화합물 및 염은 하기 도시된 입체화학을 갖는다:

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본 발명의 염은 제약상 허용된다. 이러한 염은 산 부가염 또는 염기 부가염일 수 있다. 적합한 제약상 허용되는 염의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Berge et al., J. Pharm, Sci., 66, 1-19, 1977]을 참조한다.

대표적인 제약상 허용되는 산 부가염은 4-아세트아미도벤조에이트, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠술포네이트 (베실레이트), 벤조에이트, 비술페이트, 비타르트레이트, 부티레이트, 에데트산칼슘, 캄포레이트, 캄포르술포네이트 (캄실레이트), 카프레이트 (데카노에이트), 카프로에이트 (헥사노에이트), 카프릴레이트 (옥타노에이트), 신나메이트, 시트레이트, 시클라메이트, 디글루코네이트, 2,5-디히드록시벤조에이트, 디숙시네이트, 도데실술페이트 (에스톨레이트), 에데테이트 (에틸렌디아민테트라아세테이트), 에스톨레이트 (라우릴 술페이트), 에탄-1,2-디술포네이트 (에디실레이트), 에탄술포네이트 (에실레이트), 포르메이트, 푸마레이트, 갈락타레이트 (뮤케이트), 겐티세이트 (2,5-디히드록시벤조에이트), 글루코헵토네이트 (글루셉테이트), 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 글루타메이트, 글루타레이트, 글리세로포스포레이트, 글리콜레이트, 헥실레조르시네이트, 히푸레이트, 히드라바민 (N,N'-디(데히드로아비에틸)-에틸렌디아민), 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 히드로아이오다이드, 히드록시나프토에이트, 이소부티레이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우레이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메탄술포네이트 (메실레이트), 메틸술페이트, 뮤케이트, 나프탈렌-1,5-디술포네이트 (나파디실레이트), 나프탈렌-2-술포네이트 (나프실레이트), 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 팔미테이트, p-아미노벤젠술포네이트, p-아미노살리살레이트, 파모에이트 (엠보네이트), 판토테네이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 페닐아세테이트, 페닐에틸바르비투레이트, 포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, p-톨루엔술포네이트 (토실레이트), 피로글루타메이트, 피루베이트, 살리실레이트, 세바케이트, 스테아레이트, 서브아세테이트, 숙시네이트, 술파메이트, 술페이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트 (8-클로로테오필리네이트), 티오시아네이트, 트리에티오다이드, 운데카노에이트, 운데실레네이트, 및 발레레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

대표적인 제약상 허용되는 염기 부가염은 알루미늄, 2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올 (트리스, 트로메타민), 아르기닌, 베네타민 (N-벤질페네틸아민), 벤자틴 (N,N'-디벤질에틸렌디아민), 비스-(2-히드록시에틸)아민, 비스무트, 칼슘, 클로로프로카인, 콜린, 클레미졸 (1-p 클로로벤질-2-피롤리딘-1'-일메틸벤즈이미다졸), 시클로헥실아민, 디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 디에틸트리아민, 디메틸아민, 디메틸에탄올아민, 도파민, 에탄올아민, 에틸렌디아민, L-히스티딘, 철, 이소퀴놀린, 레피딘, 리튬, 리신, 마그네슘, 메글루민 (N-메틸글루카민), 피페라진, 피페리딘, 칼륨, 프로카인, 퀴닌, 퀴놀린, 소듐, 스트론튬, t-부틸아민, 및 아연을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

한 실시양태에서, 산 부가염은 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로아이오다이드, 술페이트, 비술페이트, 니트레이트, 포스페이트, 히드로겐 포스페이트, 아세테이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 사카레이트, 푸마레이트, 말레에이트, 락테이트, 시트레이트, 타르트레이트, 글루코네이트, 캄실레이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트 및 파모에이트로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 염기 부가염은 금속 염 (예컨대 나트륨, 칼륨, 알루미늄, 칼슘, 마그네슘 및 아연) 및 암모늄 염 (예컨대 이소프로필아민, 디에틸아민, 디에탄올아민 염)을 포함한다. 다른 염 (예컨대 트리플루오로아세테이트 및 옥살레이트)이 본 발명의 화합물 및 염의 제조에 사용될 수 있고, 이는 본 발명의 범주 내에 포함된다.

본 발명의 화합물의 염의 모든 가능한 화학량론적 및 비-화학량론적 형태는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 산 및 염기 부가염은 통상의 화학자에 의해, 본 발명의 화합물을 적합한 용매 중에서 적절한 산 또는 염기로 처리한 다음, 결정화 및 여과함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.

본 발명의 방법에서, 바람직한 투여 경로는 피하로 또는 근육내로 전달하기 위한 주사 및 경구이다. 따라서, 바람직한 제약 조성물은 경구 투여에 적합한 조성물 (예를 들어 정제) 및 주사, 예를 들어 피하 또는 근육내 주사에 적합한 조성물을 포함한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 염을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 HIV 감염을 예방하거나 또는 감염의 위험을 감소시키는 방법을 개시한다. 노출전 예방 (또는 PrEP)은 HIV 감염의 위험이 있는 사람들이 HIV 감염의 기회를 낮추기 위해 매일 의약을 복용하는 경우이다. PrEP는 감염 위험을 감소시키는데 효과적인 것으로 나타났다. 본원에 사용된 "HIV" 또는 "인간 면역결핍 바이러스"는 HIV-1 및/또는 HIV-2를 지칭한다.

본 발명의 화합물 및 염은 HIV 캡시드를 그의 생물학적 표적으로 하는 것으로 여겨지며, 따라서 그의 작용 메카니즘은 HIV 캡시드의 기능을 하나 이상의 방식으로 변형시키는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 및 염은 캡시드 억제제로서 작용할 수 있다.

본 발명의 화합물 및 염은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조합 요법은 본 발명의 적어도 1종의 화합물 또는 염의 투여, 및 HIV 감염의 치료에 유용할 수 있는 적어도 1종의 다른 작용제의 투여를 포함한다. 본 발명의 화합물 및 염, 및 임의의 다른 제약 활성제(들)는 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있고, 개별적으로 투여되는 경우에 이는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 염, 및 다른 작용제는 단일 제약 조성물로 함께 제제화되고 투여될 수 있거나, 또는 개별적으로 제제화되고 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물 및 염, 및 다른 제약 활성제(들)의 양 및 투여의 상대적 타이밍은 목적하는 조합 치료 효과를 달성하기 위하여 선택될 것이다. 본 발명의 화합물 및 그의 염, 용매화물 또는 다른 제약상 허용되는 유도체와 다른 치료제가 조합된 투여는 (1) 다수의 화합물을 포함하는 단일 제약 조성물; 또는 (2) 화합물 중 1종을 각각 포함하는 개별 제약 조성물로 병용 투여하여 조합될 수 있다. 대안적으로, 조합물은 하나의 치료제가 먼저 투여되고 다른 치료제가 두번째로 투여되거나 또는 그 반대의 경우로 투여되는 순차적 방식으로 개별적으로 투여될 수 있고, 상이한 작용제는 적절한 경우에 상이한 스케줄로 투여될 수 있다. 이러한 순차적 투여는 시간상 근접하거나 또는 시간상 떨어져 있을 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 그의 염 및 다른 제약 활성제(들)의 양 및 투여의 상대적 타이밍은 목적하는 조합 치료 효과를 달성하기 위하여 선택될 것이다.

이와 같이, 본 발명의 화합물 및 염은 HIV의 예방 또는 치료에 유용한 1종 이상의 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 작용제는, 예를 들어 뉴클레오시드 HIV 리버스 트랜스크립타제 억제제, 비-뉴클레오시드 HIV 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 프로테아제 억제제, HIV 융합 억제제, HIV 부착 억제제, CCR5 억제제, CXCR4 억제제, HIV 출아 또는 성숙 억제제, 및 HIV 인테그라제 억제제를 포함한다. 적합한 다른 작용제는, 예를 들어 아바카비르, 아타자나비르, 빅테그라비르, 카보테그라비르, 다루나비르, 델라비르딘, 디다노신, 디데옥시이노신, 돌루테그라비르, 도라비린, 에파비렌즈, 엘비테그라비르, 엠트리시타빈, 에타비린, 포삼프레나비르, 포스템사비르, GSK3640254, 인디나비르, 슬라트라비르, 라미부딘, 로피나비르, 마라비록, 넬피나비르, 네비라핀, 랄테그라비르, 릴피베린, 리토나비르, 사퀴나비르, 슬라트라비르, 스타부딘, 티프라나비르, 테노포비르, 테노포비르 알라페나미드, 테노포비르 디소프록실 푸마레이트, 잘시타빈, 지도부딘, 항체 N6LS, GSK3739937/VH3739937, 및 S-648414를 포함한다. 추가의 적합한 다른 작용제는 돌루테그라비르, 라미부딘, 포스템사비르, 카보테그라비르, 마라비록, 릴피베린, 레이아타즈, 테노포비르, 아페나미드, EfDA, 도라비린 및 프레지아타를 포함한다. 추가의 적합한 다른 작용제는 돌루테그라비르, 라미부딘, 포스템사비르 및 카보테그라비르를 포함한다. 바람직한 작용제는, 예를 들어 빅테그라비르, 카보테그라비르, 돌루테그라비르, 포스템사비르, 이슬라트라비르 및 라미부딘을 포함한다. 특히 바람직한 작용제는, 예를 들어 빅테그라비르, 카보테그라비르, 돌루테그라비르, 포스템사비르 및 라미부딘을 포함한다.

실시예

비시클로[3.1.0]헥산-3-올의 제조

0-5℃에서 N₂ 분위기 하에 DCM (1200 mL) 중 시클로펜트-3-엔올 (130 g, 1545 mmol)의 교반 용액에 헥산 중 디에틸 아연의 용액 (1.0 M, 3091 mL, 3091 mmol)을 3시간에 걸쳐 적가하였다. 0℃에서 용액에 DCM (300 mL) 중 디아이오도메탄 (249 mL, 3091 mmol)의 용액을 1시간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 27℃로 가온되도록 하였으며, 이때 백색 침전물의 형성이 관찰되었다. 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 20% EtOAc/pet, Rf = 0.3, UV-불활성, PMA-활성)에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 수성 포화 NH₄Cl 용액 (1.5 L)을 조심스럽게 첨가하여 켄칭하였다. 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 수성 층을 DCM (2 x 1L)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에 농축시켜 조 비시클로[3.1.0]헥산-3-올, 180 g을 적색 액체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 4.41 - 4.35 (m, 1H), 2.18 - 2.05 (m, 2H), 1.73 (d, J = 13.9 Hz, 2H), 1.35 - 1.25 (m, 2H), 1.21 - 1.14 (m, 1H), 0.57 - 0.43 (m, 2H). GCMS: m/z = 98.1).

비시클로[3.1.0]헥산-3-온의 제조

0℃에서 N₂ 분위기 하에 DCM (5000 mL) 중 비시클로[3.1.0]헥산-3-올 (210 g, 2054 mmol)의 교반 용액에 데스-마르틴 퍼아이오디난 (954 g, 225 mmol)을 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 27℃로 가온되도록 한 다음, 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 20% 아세톤/Hex, Rf = 0.3, UV 불활성, PMA-활성)에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고, 여과물을 수성 NaOH (1N, 8x 1 L)로 세척하였다. 합한 수성 상을 DCM (5 X 1 L)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 (조 온도: 20℃) 하에 농축시켜 조 비시클로[3.1.0]헥산-3-온을 갈색 액체로서 수득하였다. 액체를 70℃에서 하향 증류에 의해 추가로 정제하여 비시클로[3.1.0]헥산-3-온, 125 g (62%)을 담황색 점성 액체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 2.61 - 2.54 (m, 2H), 2.17 - 2.12 (m, 2H), 1.54 - 1.46 (m, 2H), 0.92 - 0.86 (m, 1H), -0.01 - -0.08 (m, 1H); GCMS: M/Z = 96.1.

2-(2,2-디플루오로아세틸)비시클로[3.1.0]헥산-3-온의 제조

-78℃에서 N₂ 분위기 하에 THF (1500 mL) 중 비시클로[3.1.0]헥산-3-온 (125 g, 1274 mmol)의 교반 용액에 LDA (THF 중 2.0 M, 0.701 L, 1402 mmol)를 첨가하였다. 용액을 -78℃에서 1시간 동안 교반하였다. 용액에 THF (300 mL) 중 에틸디플루오로아세테이트 (174 g, 1402 mmol)의 용액을 30분에 걸쳐 천천히 -78℃의 온도를 유지하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 27℃로 가온되도록 한 다음, 1시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 20% 아세톤/헥산, Rf = 0.3, UV-활성)에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 수성 HCl (1N, 2000 mL)을 첨가하여 켄칭하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 이어서 EtOAc (3 x 1000 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 염수 (1000 mL)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켜 2-(2,2-디플루오로아세틸)비시클로[3.1.0]헥산-3-온, 180 g (71%)을 연황색 점성 액체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 6.18 (t, J = 54.8 Hz, 1H), 2.70 - 2.62 (m, 1H), 2.35 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 2.14 (br s, 1H), 1.26 - 1.21 (m, 1H), 1.04-1.03 (m, 1H), 0.22-0.21 (m, 1H), LCMS: M/Z = 173.17).

에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세테이트의 제조.

27℃에서 N₂ 분위기 하에 에탄올 (2 L) 중 2-(2,2-디플루오로아세틸)비시클로[3.1.0]헥산-3-온 (180 g, 910 mmol)의 교반 용액에 에틸 2-히드라지닐아세테이트 히드로클로라이드 (422 g, 2729 mmol)에 이어서 황산 (20 mL, 375 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 이어서 이를 100℃로 가열하고, 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 20% 아세톤/헥산, Rf = 0.3, UV-활성)에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 EtOAc (2000 mL) 중에 용해시키고, 물 (2 x 1 L), 염수 (1.0 L)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 건조시키고, 여과하고, 이어서 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (pet.:아세톤 100:0→98:2)로 처리하여 에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세테이트, 110 g (46%)를 회백색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ = 6.86 (t, J = 54.8 Hz, 1H), 4.93 (s, 2H), 4.14 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.88 - 2.79 (m, 1H), 2.76 - 2.68 (m, 1H), 2.14 - 2.04 (m, 2H), 1.19 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.10 - 1.03 (m, 1H), 0.14 (q, J = 4.3 Hz, 1H).

에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-5-옥소-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세테이트의 제조.

0℃에서 시클로헥산 (3.5 L) 중 에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세테이트 (110 g, 422 mmol) 및 셀라이트 (395 g)의 교반 용액에 피리디늄 디크로메이트 (794 g, 2110 mmol)를 조금씩 첨가하였다. 질소 분위기 하에 혼합물에 tert-부틸 히드로퍼옥시드 (355 mL, 2130 mmol)를 10분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 27℃로 가온한 다음, 그 온도에서 48시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 30% 아세톤/pet, Rf = 0.4, UV-활성)에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 EtOAc (1000 mL)로 추출하였다. 여과물을 포화 수성 Na₂S₂O₃ (2x500 mL); 포화 수성 FeSO₄ (300 mL); 이어서 염수 (500 mL)로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 조 표제 화합물 (150 g)을 수득하였다.

에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-4,4a-디히드로스피로[시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-5,2'-[1,3]디티올란]-1(3bH)-일)아세테이트의 제조.

질소 분위기 하에 27℃에서 DCM (1500 mL) 중 에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-5-옥소-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세테이트 (75 g, 269 mmol)의 교반 용액에 에탄-1,2-디티올 (43.0 mL, 511 mmol)을 첨가하고, 이어서 삼플루오린화붕소 아세트산 (72.6 mL, 511 mmol)을 첨가하였다. 용액을 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 20% 아세톤/Pet, Rf = 0.35, UV-활성)에 의해 모니터링하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 수성 포화 NaHCO₃ (500 mL)을 첨가하여 켄칭하였다. 혼합물을 DCM (2 X 1000 mL)으로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (1000 mL)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 갈색 액체를 수득하였다. 이 물질을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (Pet.:EtOAc 95:5→90:10)로 처리하여 에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-4,4a-디히드로스피로[시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-5,2'-[1,3]디티올란]-1(3bH)-일)아세테이트, 80 g (74%)를 회백색 고체로서 수득하였다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 6.61 (t, J = 55.2 Hz, 1H), 5.00 - 4.85 (m, 2H), 4.29 - 4.19 (m, 2H), 3.55 - 3.46 (m, 4H), 2.63 - 2.53 (m, 1H), 2.49 - 2.38 (m, 1H), 1.30 - 1.24 (m, 4H), 0.65 - 0.60 (m, 1H). LCMS M+H = 346.9.

에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세테이트의 제조

N₂ 분위기 하에 -70℃에서 DCM (20 mL) 중 1,3-디브로모-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온 (26.3 g, 92 mmol)의 교반 용액에 HF-피리딘 (2.460 g, 24.83 mmol)을 첨가하였다. 용액을 30분 동안. 용액에 DCM (20 mL) 중 에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-4,4a-디히드로스피로[시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-5,2'-1,3]디티올란]-1(3bH)-일)아세테이트 (10 g, 25 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -40℃로 가온되도록 한 다음, 그 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO2, 30% EtOAc/Pet, Rf = 0.3, UV 불활성)에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 수성 포화 NaHCO₃ (200 mL)의 첨가를 통해 켄칭하였다. 혼합물을 실온으로 가온한 다음, EtOAc (2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (50 mL)로 세척하고; 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 감압 하에 농축시켜 갈색 고체를 수득하였다. 이 물질을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (Pet.:EtOAc 100:0→75-25)로 처리하여 에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세테이트, 8.5 g (91%)를 연황색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 6.62 (t, J = 55.2 Hz, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.30 - 4.18 (m, 2H), 2.51 - 2.37 (m, 2H), 1.42 - 1.35 (m, 1H), 1.31 - 1.23 (m, 3H), 1.14 - 1.08 (m, 1H). LCMS M+H = 293.07.

2-(3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트산의 제조

N₂ 분위기 하에 0℃에서 THF (17 mL) 및 MeOH (66 mL) 중 에틸 2-(3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세테이트 (15 g, 50 mmol)의 교반 용액에 물 (66 mL) 중 LiOH (1.788 g, 74.7 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 27℃로 가온되도록 한 다음, 그 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 5% MeOH/DCM, Rf = 0.2, UV 활성)에 의해 모니터링하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고; 물 (50 mL)로 희석하고;, EtOAc (2 x 250 mL)로 세척하여 불순물을 제거하였다. 수성 층을 수성 HCl (1M)을 사용하여 pH 2-3으로 조정한 다음, EtOAc (3 x 1000 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고; 여과하고; 감압 하에 농축시켜 2-(3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트산, 14 g (98%)을 회백색 고체로서 수득하였다. LCMS M+H = 265.15.

분리에 의한 2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트산 및 2-((3bR,4aS)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트산의 수득

2-(3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트산 (5.5 g)을 이소프로판올 (20 mL) 중에 용해시켰다. 용액을 하기와 같은 SFC 키랄 분리에 조금씩 적용하였다: 기기 = 타르 80; 칼럼 = 키랄팩(Chiralpak) IC 30x250mm, 5 마이크로미터; 용매 A = 초임계 CO₂; 용매 B = 이소프로판올 (0.5% 이소프로필아민 함유) (v/v); 용리액 조성 = 70%A:30%B; 유량 = 65 g/분; 배압 = 100 bar; 온도 = 30℃; 주입 부피 = 2.5 mL; 검출 = 220 nm. 2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트산을 7.5분에서 14분까지 용리시키는 피크로서 수집하였고; 2-((3bR,4aS)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트산을 2.7분에서 5.8분까지 용리시키는 피크로서 수집하였다. 각각의 거울상이성질체에 대해, 생성된 용액을 감압 하에 농축시키고, 생성된 고체를 EtOAc 중에 용해시킨 다음, 수성 시트르산 (1M)에 이어서 물에 이어서 염수로 2회 세척하였다. 유기 용액을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고; 여과한 다음; 진공 하에 농축시켜 분리된 거울상이성질체를 80-90% 회수율로 수득하였다.

3-브로모-6-클로로-2-플루오로벤조니트릴의 제조

물 (2.1 L) 중 3-브로모-6-클로로-2-플루오로벤즈알데히드 (210.0 g, 0.89 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 실온에서 히드록실아민-O-술폰산 (175.15 g, 1.55 mol, 1.75 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃로 가열하고, 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 1-1.5시간 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시킨 다음, 물로 세척하였다. 습윤 고체를 진공 하에 50℃에서 12-15시간 동안 건조시켜 3-브로모-6-클로로-2-플루오로벤즈알데히드, 190.0 g (91%)을 수득하였다.

7-브로모-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-아민의 제조

에탄올 (1.08 L) 중 3-브로모-6-클로로-2-플루오로벤조니트릴 (360.0 g, 1.55 mol, 1.0 당량)의 용액에 메틸히드라진 술페이트 (1.11 kg, 7.73 mol, 5.0 당량)를 첨가한 후, 25-35 ℃에서 트리에틸아민 (1.3 L, 9.3 mol, 6.0 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 110℃로 가열하고, 15시간 동안 유지하였다 (반응을 TLC에 의해 모니터링함). 반응이 완결된 후, 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 물 (3.0 L)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시키고, 물로 세척하였다. 습윤 고체를 진공 하에 50℃에서 12-15시간 동안 건조시켰다. 조 고체를 칼럼 크로마토그래피 (10% EA/헥산 → 40% EA/헥산)에 의해 정제하여 생성물을 연황색 고체로서 수득하였다. 수율: 185.0 g (46.0%).

N-(7-브로모-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)메탄술폰아미드의 제조

DCM (30 mL) 중 7-브로모-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-아민 (1.40 g, 5.37 mmol)의 용액에 휘니그(Hunig) 염기 (3.75 mL, 21.5 mmol)를 첨가한 다음, 반응물을 빙조에서 냉각시키고, 메탄술포닐 클로라이드 (1.26 mL, 16.1 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 교반하였다 (침전물이 형성됨). 이어서 혼합물을 디클로로메탄 (100 mL)으로 희석하고, 물, 1 M HCl 및 염수로 세척하고, 건조시키고 (Na₂SO₄), 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOH (30 ml) 및 20% 수성 NaOH 10 ml에 녹였다. 생성된 혼합물을 균질 용액이 될 때까지 열선총으로 가열하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 물 (80 mL)로 희석하고, 1 N HCl (60 mL)로 산성화시켰다. 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 표제 생성물 (1.5 g)을 회백색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.48 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.24 (br s, 1H), 6.95 (d, J=7.9 Hz, 1H), 4.38 (s, 3H), 3.42 (s, 3H). LC/MS (M+H)⁺ = 337.80.

N-(7-브로모-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄술폰아미드의 제조

DMF (30 mL) 중 N-(7-브로모-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)메탄술폰아미드 (1.3 g, 3.84 mmol) 및 1-(클로로메틸)-4-메톡시벤젠 (0.625 mL, 4.61 mmol)의 혼합물에 탄산세슘 (1.626 g, 4.99 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 물 (100 mL)에 붓고, EtOAc (50 ml, 2x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 바이오타지 (0~35% EtOAc-헥산)에 의해 정제하여 표제 생성물 (1.5 g)을 백색 발포체로서 수득하였다. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.44 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.31 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.99 (d, J=7.9 Hz, 1H), 6.84 (d, J=8.5 Hz, 2H), 4.99 (br s, 1H), 4.76 (br s, 1H), 4.40 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.01 (s, 3H).

N-(7-아미노-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄술폰아미드의 제조

참고 문헌: Andersen, Jacob et al., Synlett 2005 (14), 2209-2213에 따름. NMP (10 mL) 중 N-(7-브로모-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄 술폰아미드 (600.0 mg, 1.308 mmol), 아이오딘화구리(I) (49.8 mg, 0.262 mmol), 아스코르브산나트륨 (518 mg, 2.62 mmol) 및 (1R,2R)-N1,N2-디메틸시클로헥산-1,2-디아민 (46.5 mg, 0.327 mmol)의 혼합물에 물 (2.0 mL) 중 아지드화나트륨 (255 mg, 3.92 mmol)의 용액을 첨가하였다. 이어서 혼합물을 밀봉하고, 마이크로웨이브 시스템에서 120℃에서 2.5시간 동안 가열하였다. 이어서 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고, 패드를 EtOAc로 세척하였다. 여과물을 물 (100 mL)에 붓고, EtOAc (50 ml, 2x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 바이오타지 (5-100% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 생성물 (400 mg)을 회백색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.33 - 7.29 (m, 2H), 6.89 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.85 - 6.79 (m, 2H), 6.48 (d, J=7.8 Hz, 1H), 5.11 (br.s, 1H), 4.81 (br.s, 1H), 4.30 (s, 3H), 3.80 (br s, 2H), 3.79 (s, 3H), 2.99 (s, 3H). LC/MS (M+H)⁺ = 395.00.

2-아미노-6-(벤질옥시)니코틴산의 제조

벤질 알콜 (97 mL) 중 2-아미노-6-클로로니코틴산 (5 g, 29 mmol) 및 칼륨 tert-부톡시드 (9.75 g, 87 mmol)의 용액을 120℃로 3시간 동안 가열하였다. 주위 온도로 냉각시킨 후, 매우 암색의 반응 혼합물을 물에 첨가하고, 에테르 (x3)로 세척하였다. 이어서 수성 층을 0.5 M 시트르산으로 산성화시켰다. 황갈색 침전물을 여과하여 생성물 (4.4 g, 62%)을 수득하였으며, 이를 후속 반응에 추가 정제 없이 사용하였다. ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12.40 (br s, 1H), 7.94 (d, J=8.55 Hz, 1H), 7.06-7.52 (m, 5H), 6.04 (d, J=8.24 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H). LC/MS: m/z = 245.15 [M+1]⁺.

N-[(6P)-7-{2-[(1S)-1-아미노-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸]-7-히드록시-4-옥소-3H,4H-피리도[2,3-d]피리미딘-3-일}-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일]-N-[(4-메톡시페닐)메틸]메탄술폰아미드의 제조

반응식:

단계 1:

-25℃에서 아세토니트릴 (92 mL) 중 (S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-(3,5-디플루오로페닐)프로판산 (5.49 g, 18.23 mmol) 및 2-아미노-6-(벤질옥시)니코틴산 (4.45 g, 18.23 mmol)의 현탁액 (황색 용액)에 피리딘 (9.83 mL, 122 mmol)에 이어서 2,4,6-트리프로필-1,3,5,2,4,6-트리옥사트리포스피난 2,4,6-트리옥시드 ("T3P", 45.2 ml, 76 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물 (T₃P 첨가 후에 투명한 용액이 됨)을 -25℃ 내지 10℃에서 4.5시간에 걸쳐 교반한 다음, N-(7-아미노-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄술폰아미드 (6 g, 15.19 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온으로 가온하면서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 1N NaOH에 이어서 물에 이어서 0.5 M 시트르산에 이어서 물로 세척한 다음, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 (330 g 레디셉 골드(RediSep Gold) 칼럼) 상에서 헥산 중 0-60% 에틸 아세테이트를 사용하여 15 CV에 걸쳐 정제한 다음, 60% EtOAc에서 10 CV 동안 유지하였다. 목적 분획을 풀링하고, 농축시켜 연황색 고체 (8.1 g, 9.14 mmol, 60.1% 수율), tert-부틸 N-[(1S)-1-[(3P,3P)-7-(벤질옥시)-3-(4-클로로-3-{N-[(4-메톡시페닐)메틸]메탄술폰아미도}-1-메틸-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-3H,4H-피리도[2,3-d]피리미딘-2-일]-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸]카르바메이트 (주요) 및 tert-부틸 N-[(1S)-1-[(3M,3M)-7-(벤질옥시)-3-(4-클로로-3-{N-[(4-메톡시페닐)메틸]메탄술폰아미도}-1-메틸-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-3H,4H-피리도[2,3-d]피리미딘-2-일]-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸]카르바메이트 (부차)의 혼합물을 수득하였다. LC/MS: m/z = 886.25 [M+1]⁺.

단계 2:

TFA (21.1 mL, 274 mmol)를 디클로로메탄 (45.7 mL) 중 tert-부틸 (S)-(1-(7-(벤질옥시)-3-(4-클로로-3-(N-(4-메톡시벤질)메틸술폰아미도)-1-메틸-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)카르바메이트 (단계 1로부터의 생성물, 8.1 g, 9.14 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 연황색 용액을 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 녹인 다음, 1 N NaOH로 3회 세척한 다음, Na₂SO₄ 상에서 건조시킨 다음, 진공 하에 농축시켜 유성 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 (330 g 레디셉 골드 칼럼) 상에서 용매 A:용매 B 65:35→0:100 (2 CV), 이어서 0:100 (9 CV); 용매 A = 헥산; 용매 B = 9:9:2 헥산:에틸 아세테이트:MeOH의 구배 방법에 의해 정제하였다. 제1 용리 이성질체 (주요)를 수집하고, 진공 하에 농축시켜 N-[(6P)-7-{2-[(1S)-1-아미노-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸]-7-히드록시-4-옥소-3H,4H-피리도[2,3-d]피리미딘-3-일}-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일]-N-[(4-메톡시페닐)메틸]메탄술폰아미드 (4.1 g, 5.89 mmol, 64.5% 수율)를 수득하였다. ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 7.86 - 7.98 (m, 1 H) 7.15 - 7.37 (m, 4 H) 6.97 - 7.06 (m, 1 H) 6.70 - 6.89 (m, 4 H) 6.40 - 6.48 (m, 1 H) 4.70 - 4.88 (m, 2 H) 3.41 - 3.81 (m, 7 H) 3.20 - 3.28 (m, 1 H) 3.08 - 3.12 (m, 3 H) 2.71 - 2.79 (m, 1 H) 1.69 - 2.00 (m, 2 H). LC/MS: m/z = 696.20 [M+1]⁺.

N-((S)-1-((3P)-3-(4-클로로-3-(N-(4-메톡시벤질)메틸술폰아미도)-1-메틸-1H-인다졸-7-일)-7-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트아미드의 제조

DMF (13 ml) 중 N-[(6P)-7-{2-[(1S)-1-아미노-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸]-7-히드록시-4-옥소-3H,4H-피리도[2,3-d]피리미딘-3-일}-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일]-N-[(4-메톡시페닐)메틸]메탄술폰아미드 (0.926 g, 1.330 mmol)의 교반 용액에 2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트산 (0.351 g, 1.330 mmol), 2-(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일)-1,1,3,3-테트라메틸이소우로늄 헥사플루오로포스페이트(V) ("HATU", 0.531 g, 1.397 mmol), 및 DIPEA (0.581 ml, 3.33 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 EtOAc 추출물을 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 헥산 중 10-100% 에틸 아세테이트를 사용하여 정제하여 N-((S)-1-((3P)-3-(4-클로로-3-(N-(4-메톡시벤질)메틸술폰아미도)-1-메틸-1H-인다졸-7-일)-7-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트아미드 (1.1 g, 88%)를 회백색 발포성 고체로서 수득하였다. LC/MS: m/z = 942.25 [M+1]⁺.

실시예 1의 제조: N-((S)-1-((3P)-3-(4-클로로-1-메틸-3-(메틸술폰아미도)-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트아미드

THF (0.2 mL) 중 디이소프로필 (E)-디아젠-1,2-디카르복실레이트 ("DIAD", 0.125 ml, 0.637 mmol)의 용액을 테트라히드로푸란 (2.1 mL) 중 N-(1-((3P)-3-(4-클로로-3-(N-(4-메톡시벤질)메틸술폰아미도)-1-메틸-1H-인다졸-7-일)-7-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트아미드 (0.2 g, 0.212 mmol)), 3,3,3-트리플루오로프로판-1-올 (0.073 g, 0.637 mmol) 및 트리페닐포스핀 (0.178 g, 0.679 mmol)의 혼합물에 실온에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 다음, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 (24 g 레디셉 골드 칼럼) 상에서 15 CV에 걸쳐 헥산 중 0-60% 에틸 아세테이트의 구배를 사용한 다음, 5 CV 동안 헥산 중 60% 에틸 아세테이트에서 유지하여 정제하였다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 풀링한 다음, 농축시켜 황색 고체를 수득하였다. 이 고체를 DCM (1 mL):TFA (0.5 mL)에 녹이고; 용액을 0℃로 냉각시키고; 용액에 트리플산 (0.057 mL, 0.637 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 녹이고; 1 N NaOH로 세척하고; 0.5M 시트르산으로 세척하고; Na₂SO₄ 상에서 건조시키고; 여과한 다음; 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 헥산 중 0-60% 에틸 아세테이트를 사용하여 20 CV에 걸쳐, 이어서 60% 에틸 아세테이트에서 10 CV 동안 실리카 겔 크로마토그래피 (24 g 레디셉 골드 칼럼)로 처리하였다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 풀링한 다음, 진공 하에 농축시켜 N-(1-((6P)-3-(4-클로로-1-메틸-3-(메틸술폰아미도)-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트아미드 (0.078 g, 0.081 mmol, 38.0% 수율)를 갈색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (500 MHz, 메탄올-d₄) δ ppm 8.46 - 8.53 (m, 1 H) 7.28 - 7.34 (m, 1 H) 7.19 - 7.24 (m, 1 H) 7.03 - 7.09 (m, 1 H) 6.53 - 6.81 (m, 4 H) 4.80 (dd, J=5.96, 2.98 Hz, 3 H) 4.49 - 4.62 (m, 2 H) 3.58 - 3.62 (m, 3 H) 3.40 - 3.49 (m, 1 H) 3.22 - 3.24 (m, 3 H) 3.06 - 3.14 (m, 1 H) 2.80 - 2.89 (m, 2 H) 2.37 - 2.44 (m, 2 H) 1.32 - 1.37 (m, 1 H) 0.96 - 1.01 (m, 1 H). LCMS 분석 방법: 칼럼 = 액퀴티 UPLC BEH C18, 2.1 x 100 mm, 1.7 μm 입자; 주입 부피 = 5.00 μL; 유량 = 0.80 mL/분; 용매 A = 95:5 물:MeCN w/ 0.1% v/v 포름산; 용매 B = 5:95 물:MeCN w/ 0.1% v/v 포름산; 용리 프로파일 = 출발 %B: 0, 종료 %B: 100, 구배 시간: 3.5분. 이어서 100% B에서 1분 동안 유지; 검출 파장 1 = 220 nm, 파장 2 = 254 nm. LCMS 체류 시간 = 3.097분; m/z = 918.05 [M+1]⁺.

N-(7-아미노-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄술폰아미드의 대안적 제조

합성 반응식:

단계 1: 2,6-디클로로-3-니트로벤즈알데히드의 제조

0-5℃에서 둥근 바닥 플라스크 내의 황산 (H₂SO₄) (5.63 L, 4.5 V)의 용액에 2,6-디클로로벤즈알데히드 (1.25 kg, 7.10 mol, 1.0 당량)를 15℃ 미만에서 조금씩 첨가하였다. 반응물을 0-5℃에서 30분 동안 교반하였다. 새로 제조된 니트로화 혼합물의 용액 [0℃에서 농축 H₂SO₄ (0.425 L, 0.34 V) 및 70% HNO₃ (0.85 kg, 13.49 mol, 1.30 당량)로부터 제조됨]을 상기 반응 혼합물에 10℃ 미만에서 첨가하였다 [주: 반응은 약간 발열성 (3-6℃)이므로; 첨가는 보다 낮은 온도에서 바람직함]. 반응 혼합물을 5-10℃에서 2-3시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 (TLC에 의해 모니터링함), 이를 빙냉수 (18.75 L, 15 V)로 25℃ 미만에서 켄칭하였다. 이어서 반응물을 실온으로 가온되도록 하고, 2시간 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시킨 다음, 물 (2.5 L, 2.0 V)로 세척하였다. 벌크 잔류 물을 60-90분 동안 진공 여과를 유지함으로써 고체로부터 제거하였다. 조 습윤 고체를 처음에 공기 분위기 하에; 이어서 열풍 오븐에서 50-55℃에서 10-12시간 동안 (수분 함량이 5.0% 이하일 때까지) 건조시켜 건조된 표제 생성물, 2,6-디클로로-3-니트로벤즈알데히드 (1.44 kg, 92% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 10.44 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 8.8 Hz, 1H).

단계 2: 2,6-디클로로-3-니트로벤조니트릴의 제조

(단계-2a) 둥근 바닥 플라스크에 들은 DMSO (5.9 L, 5.0 V)의 용액에 2,6-디클로로-3-니트로벤즈알데히드 (1.17 kg, 5.31 mol, 1.0 당량)를 실온에서 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 교반한 후, 히드록실아민 히드로클로라이드 (0.63 kg, 9.04 mol, 1.70 당량)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 (TLC에 의해 모니터링함), 반응물을 30℃ 미만의 온도를 유지하기에 충분한 속도로 첨가되는 빙냉수 (18.0 L, 15.0 V)의 첨가에 의해 켄칭하였다 (관찰: 고체는 물 첨가 시 형성됨). 반응물을 실온에서 60-90분 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시키고; 물 (2.5 L, 2.0 V)로 세척하고; 이어서 아세톤 및 헥산의 혼합물 (6.0 L, 1:1 비)로 세척하였다. 벌크 잔류수를 60-90분 동안 진공 여과를 유지함으로써 고체로부터 제거하였다. 습윤 고체를 초기에 공기 건조시킨 다음, 최종적으로 열풍 오븐에서 50-55℃에서 10-12시간 동안 (수분 함량이 1.0% 이하가 될 때까지) 건조시켜 건조된 목적 생성물, 2,6-디클로로-3-니트로벤즈알데히드 옥심 (1.22 kg, 92% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다. 조 생성물 (이는 10-20%의 2,6-디클로로-3-니트로벤조니트릴을 함유함)을 직접 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.

(단계-2b) 0-5℃에서 DCM (9.04 L, 8.0 V) 중 조 옥심 (상기 기재된 제조, 1.13 kg, 4.80 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 트리에틸아민 ("TEA", 1.02 kg, 10.09 mol, 2.1 당량)을 첨가하였다. 5분 동안 교반한 후, 메탄술포닐 클로라이드 (0.60 kg, 5.29 mol, 1.1 당량)를 15℃에서 천천히 첨가하였다 (관찰: 첨가 동안 발열이 나타남). 반응물을 실온에서 30-45분 동안 교반하였다. 반응의 완결 후 (반응의 진행을 TLC에 의해 모니터링함; 이동상: 헥산 중 20% 에틸 아세테이트), 반응물을 물 (6.78 L, 6.0 V)로 희석하고; 유기 층을 분리하고; 수성 층을 DCM (3.4 L, 3.0 V)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 (5.65 L, 5.0 V)로 세척하고; Na₂SO₄ 상에서 건조시키고; 진공 하에 농축시켰다. 생성된 조 고체를 헥산 (4.50 L, 4.0 V)으로 실온에서 연화처리하였다. 습윤 물질을 뜨거운 공기 오븐에서 50-55℃에서 5-6시간 동안 건조시켜 건조된 생성물, 2,6-디클로로-3-니트로벤조니트릴 (0.95 kg, 91% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.07 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.8 Hz, 1H).

단계 3: 4-클로로-7-니트로-1H-인다졸-3-아민의 제조

에탄올 (7.5 L, 10.0 V) 중 2,6-디클로로-3-니트로벤조니트릴 (750.0 g, 3.45 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 15-20℃에서 히드라진 수화물 (519.0 g, 10.36 mol, 3.0 당량)을 반응물을 25℃ 미만으로 유지하면서 천천히 첨가하였다 (관찰: 첨가는 약간 발열성이고, 첨가 시 고체 형성이 시작될 것임). 반응 혼합물 온도를 실온으로 천천히 상승시키고, 이어서 혼합물을 3시간 동안 교반하였다 (관찰: 이 동안 고체의 양이 증가할 것임). 반응이 완결된 후 (TLC에 의해 모니터링함), 혼합물을 물 (7.5 L, 10.0 V)로 희석하고, 실온에서 1시간 동안 추가로 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시킨 다음, 물 (2.25 L, 3.0 V)로 세척하였다. 습윤 고체를 아세톤 (1.875 L, 2.5 V) 및 헥산 (1.875 L, 2.5 V)의 1:1 비율 혼합물로 세척하였다. 벌크 잔류수를 60-90분 동안 진공 여과를 유지함으로써 고체로부터 제거하였다. 습윤 고체를 최종적으로 50℃에서 7-8시간 동안 (수분 함량이 1.5% 미만에 도달할 때까지) 열풍 오븐에서 건조시켜 건조 생성물, 4-클로로-7-니트로-1H-인다졸-3-아민 (549.0 g, 75% 수율)을 벽돌 적색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 10.36 (bs, 1H), 8.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.40 Hz, 1H), 4.73 (bs, 2H).

단계 4: 4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-아민의 제조

DMF (5.0 L, 10.0 V) 중 4-클로로-7-니트로-1H-인다졸-3-아민 (500 g, 0.42 mol, 1.0 당량)의 교반 용액에 5-10℃에서 탄산세슘 (Cs₂CO₃) (1.91 kg, 5.88 mol, 2.5 당량)을 반응물을 10℃ 미만으로 유지하면서 천천히 첨가하였다. 5-10분 동안 교반한 후, 디메틸 술페이트 (326.3 g, 2.59 mol, 1.1 당량)를 반응물을 10℃ 미만으로 유지하면서 첨가하였다 (주: 보다 유리한 위치-선택성을 수득하기 위해 느린 첨가가 바람직함). 이어서 반응 온도를 천천히 실온으로 상승시키고, 추가 2시간 동안 동일한 온도에서 교반을 지속하였다. 반응이 완결된 후 (TLC에 의해 모니터링함), 반응물을 빙냉수 (15.0 L, 30.0 V)의 첨가에 의해 켄칭한 다음, 생성된 혼합물을 실온에서 6-8시간 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시킨 다음, 물 (1.5 L, 3.0 V)로 세척하였다. 습윤 고체를 IPA (1.5 L, 3.0 V)에 이어서 헥산 (1.0 L, 2.0 V)으로 세척하였다. 60-90분 동안 진공 여과를 유지함으로써 고체로부터 벌크 잔류수를 제거하였다. 습윤 고체를 50℃에서 7-8시간 동안 열풍 오븐에서 건조시켰다 (수분 함량이 1.0% 미만이 될 때까지). 단리된 물질, 4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-아민 (319.0 g, 60% 수율)을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.97 (d, J = 8.32 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 4.63 (bs, 2H), 3.96 (s, 3H).

단계 5: N-(4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-일)메탄술폰아미드의 제조

(단계 5a) DCM (6.25 L, 10.0 V) 중 4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-아민 (625.0 g, 2.76 mol, 1.0 당량)의 용액에 0-5℃에서 트리에틸아민 (TEA) (837.0 g, 8.27 mol, 3.0 당량)을 첨가하고; 이어서 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) (20.60 g, 0.165 mol, 0.06 당량)을 첨가하였다. 반응물을 5-10분 동안 교반한 다음, 메탄술포닐 클로라이드 (MsCl) (790.0 g, 6.89 mol, 2.5 당량)를 반응물을 10℃ 미만으로 유지하면서 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 한 다음, 1.5-2.0시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 (TLC에 의해 모니터링함), 혼합물을 물 (6.25 L, 10.0 V)로 희석한 다음, 실온에서 15분 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (6.25 L, 10.0 V)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 (1.25 L, 2.0 V)로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 조 고체를 수득하였다. 고체를 헥산 (1.25 L, 2.0 V)으로 실온에서 연화처리하여 중간체, N-(4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-일)-N-(메틸술포닐)메탄술폰아미드를 수득하였으며, 이를 직접 후속 단계에 사용하였다.

(ii) 실온에서 에탄올 (10.5 L, 20.0 V) 중 N-(4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-일)-N-(메틸술포닐)메탄술폰아미드 (상기 제조됨)의 교반 용액에 수성 5% NaOH 용액 (4.38 L, 7.0 V)을 천천히 첨가하였다 [주: 적하 깔때기를 통한 느린 첨가가 바람직함]. 반응물을 동일한 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 (TLC에 의해 모니터링함) [TLC 분석을 위한 샘플 제조: ~1.0 ml의 샘플을 수성 2.0 N HCl을 사용하여 pH: 2-3에 도달할 때까지 산성화시키고, 이를 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기 층을 TLC에 의해 분석함], 반응물을 0-5℃로 냉각시키고, 반응 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서 pH를 수성 2.0 N HCl (3.13 L, 5.0 V)의 첨가에 의해 2-3으로 조정하였다 [주: HCl의 첨가 시 침전이 발생하였고, 교반하면서 증가함]. 반응 혼합물을 실온으로 가온한 다음, 1.5-2.0시간 동안 교반하였다. 수득된 고체를 여과에 의해 단리시킨 다음, 물 (1.25 L, 2.0 V)로 세척하고, 이어서 헥산 (1.25 L, 2.0 V)으로 세척하였다. 벌크 잔류 물을 60-90분 동안 진공 여과를 유지함으로써 고체로부터 제거하였다. 습윤 물질을 고온 공기 오븐에서 50℃에서 6-7시간 동안 건조시켜 (수분 함량이 1.0% 미만이 될 때까지) 건조된 생성물, N-(4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-일)메탄술폰아미드 (640.0 g, 76%)를 황색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.05 (d, J = 8.32 Hz, 1H), 7.32 (bs, 1H), 7.17 (d, J = 8.28 Hz, 1H), 4.15 (s, 3H), 3.45 (s, 3H).

단계 6: N-(4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄술폰아미드의 제조

DMF (6.35 L, 10.0 V) 중 N-(4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-일)메탄술폰아미드 (635.0 g, 2.08 mol, 1.0 당량) 및 1-(클로로메틸)-4-메톡시벤젠 (359.0 g, 2.30 mol, 1.1 당량)의 혼합물에 실온에서 탄산칼륨 (374.7 g, 2.70 mol, 1.3 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80-90℃로 가열하고, 그 온도에서 3시간 동안 유지하였다. 반응이 완결된 후 (TLC에 의해 모니터링함), 혼합물을 빙냉수 (19.05 L, 30.0 V)에 부었다 [주: 생성물이 침전되면서 뭉치는 것을 피하기 위해 격렬하게 교반하면서 천천히 켄칭시키는 것이 바람직함]. 생성된 고체를 여과에 의해 단리시키고, 물 (1.90 L, 3.0 V)로 세척하고; 이어서 고체를 헥산 (1.27 L, 2.0 V)으로 세척하였다. 60-90분 동안 진공 여과를 유지함으로써 고체로부터 벌크 잔류수를 제거하였다. 단리된 고체를 에틸 아세테이트 (12.7 L, 20.0 V) 중에 용해시키고, 목탄 (63.5 g)을 첨가하였다. 혼합물을 60-70℃로 가열한 다음, 상기 온도에서 30-45분 동안 교반하였다. 혼합물을 여전히 뜨거운 (40-50℃) 상태에서 셀라이트의 패드를 통해 여과한 다음, 셀라이트 패드를 에틸 아세테이트 (3.17 L, 5.0 V)로 추출하였다. 합한 여과물을 감압 하에 50℃ 미만에서 농축 건조시켰다. 에틸 아세테이트 (0.635 L, 1.0 V)를 고체에 실온에서 첨가하였다. 생성된 고체 현탁액을 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시킨 다음, 헥산 (1.27 L, 2.0 V)으로 세척하였다. 45-60분 동안 진공 여과를 유지함으로써 고체로부터 잔류 물을 제거하여 생성물 N-(4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질) 메탄 술폰아미드 (705.0 g, 80% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.99 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.68 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 8.44 Hz, 2H), 4.95-4.76 (m, 2H), 4.17 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.01 (s, 3H).

단계 7: N-(7-아미노-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄술폰아미드의 제조

THF (3.50 L, 10.0 V) 및 물 (7.0 L, 20.0 V)의 혼합물 중 아연 분말 (540.0 g, 8.23 mol, 10.0 당량)의 교반 현탁액에 실온에서 염화암모늄 (NH₄Cl) (449.0 g, 8.23 mol, 10.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물에 THF (7.0 L, 20.0 V) 중 N-(4-클로로-1-메틸-7-니트로-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄술폰아미드 (350 g, 0.823 mol, 1.0 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3-4시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 (공정중 TLC/HPLC에 의해 모니터링함), 혼합물을 에틸 아세테이트 (3.5 L, 10.0 V) 및 물 (1.12 L, 2.5 V)로 희석하였다. 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 반응물을 에틸 아세테이트 (1.75 L, 5.0 V)로 세척하면서 셀라이트 층의 패드를 통해 여과하였다. 2상 여과물을 수집하고, 상을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트 (3.50 L, 10.0 V)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 (3.50 L, 10 V)로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시킨 다음, 진공 하에 농축시켜 조 고체를 수득하였다. 조 생성물에 MTBE (3.25 L, 10 V)를 첨가하고, 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시켰다. 벌크 잔류수를 30-45분 동안 진공 여과를 유지함으로써 고체로부터 제거하였다. 습윤 생성물을 고온 공기 오븐 (50℃)에서 2시간 동안 건조시켜 표제 생성물, N-(7-아미노-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄술폰아미드 (276.0 g, 85% 수율)를 회백색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.29-7.26 (m, 2H), 6.86-6.79 (m, 2H), 6.42 (d, J = 7.80 Hz, 1H), 4.99-4.70 (m, 2H), 4.25 (s, 3H), 3.77 (s, 5H), 2.98 (s, 3H).

2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코틴산의 제조

합성 반응식:

단계 1: 2-아미노-6-(벤질옥시)니코틴산의 제조

N₂ 분위기 하에 26℃에서 벤질 알콜 (1400 mL, 13464 mmol) 중 2-아미노-6-클로로니코틴산 (200 g, 1159 mmol)의 교반 용액에 포타슘 tert-부톡시드 (390 g, 3477 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 120℃로 가열하고, 그 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, DCM 중 10% MeOH, Rf = 0.5)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 반응 혼합물을 물 (3 L)로 희석하고, 디에틸 에테르 (2 x 1000 mL)로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 수성 시트르산 용액 (0.5 M)을 사용하여 pH 4로 산성화시켰다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집한 다음, 감압 하에 건조시켜 2-아미노-6-(벤질옥시) 니코틴산을 회백색 고체 (220 g, 수율 = 72%)로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ = 12.56 - 12.32 (m, 1H), 7.97 - 7.91 (m, 1H), 7.52 - 7.41 (m, 2H), 7.38 - 7.11 (m, 5H), 6.03 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.39 - 5.31 (m, 2H). LCMS 순도 = 93%; m/z = 245.29 (M+H).

단계 2: 메틸 2-아미노-6-(벤질옥시)니코티네이트의 제조

N₂ 분위기 하에 26℃에서 DMF (2.5 L) 중 2-아미노-6-(벤질옥시)니코틴산 (220 g, 901 mmol)의 교반 용액에 탄산칼륨 (373 g, 2702 mmol) 및 아이오도메탄 (0.282 L, 4504 mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 27℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 40% EtOAc/Pet., Rf = 0.6)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 반응 혼합물을 물 (5 L)로 희석하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 단리한 다음, 진공 하에 건조시켜 메틸 2-아미노-6-(벤질옥시)니코티네이트를 회백색 고체 (220 g, 수율= 92%)로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.42-7.40 (m, 2H), 7.39-7.35 (m, 2H), 7.34-7.31 (m, 1H), 6.01 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H), 3.84 (s, 3H). LCMS 순도 = 97%, m/z = 259.30 (M+H).

단계 3: 메틸 2-아미노-6-히드록시니코티네이트의 제조

N₂ 분위기 하에 26℃에서 DCM (500 mL) 중 메틸 2-아미노-6-(벤질옥시)니코티네이트 (50 g, 190 mmol)의 교반 용액에 TFA (800 mL) 및 트리플산 (25 mL, 282 mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 26℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, EtOAc, Rf = 0.2)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 휘발성 물질을 진공 하에 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 이 물질을 디에틸 에테르 (3 x 1000 mL)로 연화처리한 다음, 침전된 고체를 여과에 의해 단리하였다. 고체에 물 (2 L)을 첨가한 다음, 혼합물을 5시간 동안 첨가하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 메틸 2-아미노-6-히드록시니코티네이트를 회백색 고체 (25 g, 수율= 78%)로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ = 10.92-10.76 (m, 1H), 7.65 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.43-6.87 (m, 2H), 5.51 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.69 (s, 3H). LCMS 순도 = 99.32%; m/z = 169.32 (M+H). 생성물 중 TFA 및 트리플산의 부재는 ¹⁹F-NMR에 의해 확인되었다. 생성물을 직접 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.

단계 4: 메틸 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트의 제조

질소 분위기 하에 27℃에서 THF (1000 mL) 중 메틸 2-아미노-6-히드록시니코티네이트 (50 g, 297 mmol)의 교반 용액에 트리페닐포스핀 (156 g, 595 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 0℃로 냉각시키고, 반응물에 디이소프로필 아조디카르복실레이트 ("DIAD" 116 mL, 595 mmol)를 적가하였다. 용액을 30분 동안 교반하였다. 0℃에서 용액에 THF (200 mL) 중 3,3,3-트리플루오로프로판-1-올 (52.4 mL, 595 mmol)의 용액을 첨가하였다. 이어서 반응물을 27℃로 천천히 가온되도록 한 다음, 그 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 10% EtOAc/Pet. Rf = 0.5)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 반응 혼합물을 물 (500 mL)로 희석하고, EtOAc (2 x 500 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 물 (500 mL)에 이어서 염수 용액 (500 mL)으로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na₂SO₄,상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에 농축시켜 조 생성물을 황색 반고체 (100 g)로서 수득하였다. 이 물질을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 pet 중 5-10% EtOAc로 용리시키면서 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 감압 하에 농축시켜 메틸 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트를 황색 액체 (50 g, 60% 수율)로서 수득하였다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.21-6.85 (brs, 1H), 6.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.50 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.63-2.55 (m, 2H). LCMS 분석 방법: 칼럼 = 액퀴티 BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); 이동상 A = 물 중 0.05% 포름산; 이동상 B = CAN 중 0.05% 포름산; 구배= 시간 (분) /%B: 0/3, 0.4/3, 2.5/98, 3.4/98, 3.5/3, 4/3; 칼럼 온도 = 35℃; 유량 = 0.6 mL/분. LCMS 결과: 체류 시간 = 2.03분; 관찰치 이온 = 265.15 (M+H); LCMS 순도 = 93%.

단계 5: 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코틴산의 제조

질소 분위기 하에 0℃에서 테트라히드로푸란 (THF) (500 mL), 메탄올 (150 mL) 및 물 (80 mL) 중 메틸 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트 (50 g, 189 mmol)의 교반 용액에 수산화리튬 1수화물 (22.66 g, 946 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 50% EtOAc/Pet. Rf = 0.3)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 수성 잔류물을 수득하였다. 이어서 잔류물을 1N HCl의 첨가를 통해 pH 4로 산성화시켰다. 생성된 침전물을 여과를 통해 수집하고, 물 (500 mL)에 이어서 n-헥산 (400 mL)으로 세척한 다음, 건조시켜 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코틴산을 회백색 고체 (45 g, 90% 수율)로서 수득하였다. ¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.47 (brs, 1H), 7.93 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.35 (brs, 2H), 5.98 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.44 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.84-2.73 (m, 2H). 생성물을 직접 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.

2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코틴산의 대안적 제조

합성 반응식:

단계 1: 2-아미노-6-플루오로니코틴산의 제조

0℃에서 물 중 NH₃ ("H₂O 중 25% NH₃", 1 L, 4V) 및 이소프로판올 (6.5 L, 26V)의 혼합물을 암모니아 기체로 1시간 동안 폭기하였다. 오토클레이브 (25 L) 내의 혼합물에 2,6-디플루오로니코틴산 (250 g, 1571 mmol)을 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물을 105℃에서 20시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 80% EtOAc/Pet. Rf = 0.3)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 반응 혼합물을 20℃로 냉각되도록 한 다음, 감압 하에 20℃ 미만에서 4-6V (1.5 L)의 부피로 농축시켰다. 잔류물을 물 (5 L) 중에 용해시키고, 2N HCl (700 mL)의 첨가를 통해 pH 2-3으로 산성화시킨 다음, 2시간 동안 교반하였다. 생성된 침전물을 여과를 통해 수집하고, 물 (4000 mL)에 이어서 n-헥산 (5000 mL)으로 세척한 다음, 진공 오븐에서 50℃에서 건조시켜 2-아미노-6-플루오로니코틴산을 회백색 고체 (250 g, 92% 수율)로서 수득하였다. 이 생성물을 동일한 방법에 의해 제조된 다른 배치의 생성물과 블렌딩하여 합한 생성물 2000 g을 수득하였다. 고체를 톨루엔 (10 L) 중에 현탁시킨 다음, 톨루엔을 증류에 의해 제거함으로써 잔류 용매를 고체로부터 제거하였다. 생성된 고체를 진공 오븐에서 60℃에서 7일 동안 건조시켜 2-아미노-6-플루오로니코틴산을 회백색 고체 (1.6 kg, 77% 수율)로서 수득하였다. ¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.94 (brs, 1H), 8.17 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.56 (brs, 2H), 6.25 (dd, J = 8.2, 2.8 Hz, 1H). LCMS 방법: 칼럼 = 액퀴티 BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); 이동상 A = 물 중 0.05% 포름산; 이동상 B = 아세토니트릴 중 0.05% 포름산; 구배 = 시간 (분)/%B: 0/3, 0.4/3, 2.5/98, 3.4/98, 3.5/3, 4/3; 칼럼 온도 = 35℃; 유량 = 0.6 mL/분. LCMS 결과: 체류 시간 = 1.24분; 관찰치 이온 = 157.04 (M+H); LCMS 순도 = 96%.

단계 2: 메틸 2-아미노-6-플루오로니코티네이트의 제조

DMF (1500 mL) 중 2-아미노-6-플루오로니코틴산 (150 g, 961 mmol) 및 탄산칼륨 (398 g, 2882 mmol)의 교반 용액에 아이오도메탄 (300 mL, 4804 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 27℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 30% EtOAc/Pet. Rf = 0.7)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 반응 혼합물을 빙냉수 (5000 mL)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 생성된 침전물을 여과를 통해 수집하고, 물 (2000 mL)에 이어서 n-헥산 (1000 mL)으로 세척한 다음, 건조시켜 메틸 2-아미노-6-플루오로니코티네이트를 갈색 고체 (120 g, 70% 수율)로서 수득하였다. ¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.20 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.54 (brs, 2H), 6.29 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 1H), 3.82 (m, 3H). LCMS 방법: 칼럼 = 액퀴티 BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); 이동상 A = 물 중 0.05% 포름산; 이동상 B = 아세토니트릴 중 0.05% 포름산; 구배 = 시간 (분)/%B: 0/3, 0.4/3, 2.5/98, 3.4/98, 3.5/3, 4/3; 칼럼 온도 = 35℃; 유량 = 0.6 mL/분. LCMS 결과: 체류 시간 = 1.55분; 관찰치 이온 = 171.07 (M+H); LCMS 순도 = 96%. 생성물을 직접 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.

단계 3: 메틸 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트 및 3,3,3-트리플루오로프로필 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트의 제조

질소 분위기 하에 0℃에서 THF (500 mL) 중 메틸 2-아미노-6-플루오로니코티네이트 (25 g, 147 mmol) 및 3,3,3-트리플루오로프로판-1-올 (15.54 mL, 176 mmol)의 교반 용액에 수소화나트륨 (오일 중 60% 분산액, 8.82 g, 220 mmol)을 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반한 다음, 27℃로 천천히 가온되도록 하고, 그 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 10% EtOAc/Pet. Rf = 0.5)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 포화 수성 NH₄Cl 용액 (300 mL)으로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc (2 x 500 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 용액 (200 mL)으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에 농축시켜 메틸 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트를 황색 액체 (40 g)로서 수득하였다. 에스테르교환 부산물 3,3,3-트리플루오로프로필 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트의 형성이 또한 반응에서 관찰되었다. LCMS 방법: 칼럼 = 액퀴티 BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); 이동상 A = 물 중 0.05% 포름산; 이동상 B = 아세토니트릴 중 0.05% 포름산; 구배 = 시간 (분)/%B: 0/97, 0.4/97, 2.5/2, 3.4/2, 3.5/97, 4.0/97; 칼럼 온도 = 35℃; 유량 = 0.6 mL/분. LCMS 결과: 체류 시간 = 2.04 & 2.22분; 관찰치 이온 = 265.18 & 347.29 (M+H); LCMS 순도 = 57%의 메틸 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트 및 15%의 3,3,3-트리플루오로프로필 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트. 이 조 생성물 혼합물을 동일한 방법에 의해 제조된 조 생성물의 2개의 다른 배치 (40 g 및 50 g)와 블렌딩하였다. 합한 물질 (130 g)을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 pet 중 10-20% EtOAc로 용리시키면서 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 감압 하에 농축시켜 메틸 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트 및 3,3,3-트리플루오로프로필 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트의 6:1 혼합물을 연황색 액체 (100 g, 90% 수율)로서 수득하였다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.02-7.97 (m, 1H), 7.04-6.48 (m, 1H), 6.08-6.03 (m, 1H), 4.52-4.47 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 2.64-2.54 (m, 2H). LCMS 방법: 칼럼 = 액퀴티 BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); 이동상 A = 물 중 0.05% 포름산; 이동상 B = 아세토니트릴 중 0.05% 포름산; 구배 = 시간 (분)/%B: 0/97, 0.4/97, 2.5/2, 3.4/2, 3.5/97, 4.0/97; 칼럼 온도 = 35℃; 유량 = 0.6 mL/분. LCMS 결과: 체류 시간 = 2.02 & 2.21분; 관찰치 이온 = 264.97 & 346.97 (M+H); LCMS 순도 = 66%의 메틸 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트 및 11%의 3,3,3-트리플루오로프로필 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트.

단계 4: 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코틴산의 제조

질소 분위기 하에 27℃에서 테트라히드로푸란 (THF) (800 mL), 메탄올 (300 mL) 및 물 (200 mL) 중 메틸 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트 및 3,3,3-트리플루오로프로필 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코티네이트 (6:1, 100 g, 310 mmol)의 교반 용액에 수산화리튬 1수화물 (37.2 g, 1552 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 50% EtOAc/Pet. Rf = 0.3)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시킨 다음, 생성된 수성 잔류물을 1N HCl의 첨가를 통해 pH 4로 산성화시켰다. 생성된 침전물을 여과를 통해 수집하고, 물 (2000 mL)에 이어서 n-헥산 (1000 mL)으로 세척한 다음, 건조시켜 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코틴산을 회백색 고체 (80 g, 97% 수율)로서 수득하였다. ¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.47 (brs, 1H), 7.93 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.33 (brs, 2H), 5.99 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.83-2.74 (m, 2H). LCMS 방법: 칼럼 = 액퀴티 BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); 이동상 A = 물 중 0.05% 포름산; 이동상 B = 아세토니트릴 중 0.05% 포름산; 구배 = 시간 (분)/%B: 0/3, 0.4/3, 2.5/98, 3.4/98, 3.5/3, 4/3; 칼럼 온도 = 35℃; 유량 = 0.6 mL/분. LCMS 결과: 체류 시간 = 1.73분; 관찰치 이온 = 251.17 (M+H); LCMS 순도 = 94%. 생성물을 직접 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.

실시예 1의 대안적 제조: N-((S)-1-((3P)-3-(4-클로로-1-메틸-3-(메틸술폰아미도)-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트아미드

합성 반응식:

단계 1: tert-부틸 (S)-(1-(3-(4-클로로-3-(N-(4-메톡시벤질)메틸술폰아미도)-1-메틸-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)카르바메이트의 제조

-25℃에서 질소 분위기 하에 아세토니트릴 (600 mL) 중 (S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-(3,5-디플루오로페닐)프로판산 (62.3 g, 207 mmol) 및 2-아미노-6-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)니코틴산 (55 g, 207 mmol)의 교반 용액에 피리딘 (41.8 mL, 517 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물에 15분에 걸쳐 2,4,6-트리프로필-1,3,5,2,4,6-트리옥사트리포스피난 2,4,6-트리옥시드 ("T3P", EtOAc 중 50 중량%, 609 mL, 1033 mmol)을 적가하였다. 용액을 -25℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 13℃로 천천히 가온되도록 하고, 5시간 동안 교반하였다. 13℃에서 용액에 N-(7-아미노-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄술폰아미드 (82 g, 207 mmol)를 첨가하였다. 이어서 반응물을 27℃로 천천히 가온되도록 한 다음, 그 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 40% EtOAc/Pet. Rf = 0.4)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc (500 mL) 중에 용해시킨 다음, 수성 시트르산 (0.5M, 2 x 500 mL)에 이어서 수성 NaOH (1N, 3 x 500 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에 농축시켜 조 생성물 (180 g)을 수득하였으며, 이를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 pet 중 40-50% EtOAc로 용리시키면서 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 감압 하에 농축시켜 tert-부틸 (S)-(1-(3-(4-클로로-3-(N-(4-메톡시벤질)메틸술폰아미도)-1-메틸-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)카르바메이트를 회백색 고체 (85 g, 39% 수율)로서 수득하였다. 생성물은 호모키랄 회전장애이성질체 (부분입체이성질체)의 혼합물이었다. LCMS 방법: 칼럼 = 액퀴티 BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); 이동상 A = 물 중 0.05% 포름산; 이동상 B = 아세토니트릴 중 0.05% 포름산; 구배 = 시간 (분)/%B: 0/3, 0.4/3, 2.5/98, 3.4/98, 3.5/3, 4/3; 칼럼 온도 = 35℃; 유량 = 0.6 mL/분. LCMS 결과: 체류 시간 = 2.46분; 관찰치 이온 = 892.53 (M+H); LCMS 순도 = 85%.

단계 2: (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-아미노-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리도[2,3-d]피리미딘-3 (4H)-일)-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)메탄술폰아미드의 제조

0℃에서 DCM (300 mL) 중 tert-부틸 (S)-(1-(3-(4-클로로-3-(N-(4-메톡시벤질)메틸술폰아미도)-1-메틸-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)카르바메이트 (85 g, 95 mmol)의 교반 용액에 트리플루오로아세트산 (TFA, 294 mL, 3810 mmol)에 이어서 트리플산 (25.4 mL, 286 mmol)을 첨가하였다. 용액을 27℃로 가온되도록 하고, 질소 분위기 하에 1시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC (SiO₂, 80% EtOAc/Pet. Rf = 0.3)에 의해 모니터링하였다. 완결 시, 휘발성 물질을 질소 기체의 온화한 스트림 하에 제거하였다. 잔류물을 EtOAc (1000 mL) 중에 용해시키고, 2N NaOH (2 x 500 mL)에 이어서 염수 (500 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압 하에 농축시켜 조 생성물을 수득하였으며, 이를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 Pet 중 50-99% EtOAc로 용리시키면서 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 감압 하에 농축시켜 (S)-N-(7-(2-(1-아미노-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리도[2,3-d]피리미딘-3 (4H)-일)-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)메탄술폰아미드를 연황색 고체 (63 g)로서 수득하였다. 물질은 LCMS에 의해 결정 시 64:26 비의 호모키랄 회전장애이성질체 (부분입체이성질체)의 혼합물이다. 이 생성물을 동일한 절차에 따라 제조된 3개의 추가의 생성물 배치와 블렌딩하였다. 합한 생성물 (195 g)을 메탄올:아세토니트릴 (80:20, 1300 mL) 중에 용해시키고, 이 용액을 정제용-SFC에 의해 하기 방법을 사용하여 정제하였다: 칼럼 = (R,R) 웰크(Whelk)-01 (250 x 30 x 5 μ); 용리액 = CO₂:MeOH (65:35); 유량 = 90 g/분; 배압 = 120 bar; 검출 = 214 nm (UV); 스택 시간 = 14분; 주입당 로드 = 430 mg. 순수한 주요 피크를 수집하고, 감압 하에 농축시켜 단일 입체이성질체 (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-아미노-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리도[2,3-d]피리미딘-3 (4H)-일)-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)메탄술폰아미드를 회백색 고체 (113 g, 63% 수율)로서 수득하였다. ¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.42 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 1H) 7.03-6.97 (m, 1H), 6.75-6.70 (m, 2H), 4.73-4.69 (m, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.58-3.52 (m, 1H), 3.28-3.24 (m, 1H), 3.22 (s, 3H), 2.97-2.83 (m, 3H). LCMS 방법: 칼럼 = 엑스브리지(XBridge) C18 (75 mm x 4.6 mm, 3.5 μm); 이동상 A = 물 중 5 mM 중탄산암모늄; 이동상 B = 아세토니트릴; 구배 = 시간 (분)/%B: 0/5, 0.5/5, 1.0/15, 4.0/98, 7.0/98, 7.5/5, 8.0/5; 칼럼 온도 =35℃; 유량 = 1.3 mL/분. LCMS 결과: 체류 시간 = 4.03분; 관찰치 이온 = 672.07 (M+H); LCMS 순도 = 98%; HPLC 순도 = 98%; 키랄 HPLC 순도 = 98%.

단계 3: N-((S)-1-((3P)-3-(4-클로로-1-메틸-3-(메틸술폰아미도)-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트아미드의 제조

에틸 아세테이트 (818 ml) 중 (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-아미노-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리도[2,3-d]피리미딘-3 (4H)-일)-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)메탄술폰아미드 (55 g, 82 mmol) 및 2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트산 (22.70 g, 86 mmol)의 교반 용액에 2,6-루티딘 (23.83 ml, 205 mmol)을 첨가하였다. 혼합물에 2,4,6-트리프로필-1,3,5,2,4,6-트리옥사트리포스피난 2,4,6-트리옥시드 ("T3P", 에틸 아세테이트 중 50 중량%) (97 mL, 164 mmol)를 적가하였으며, 이때 내부 온도는 17℃에서 24℃로 상승하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 물 (500 mL)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 상을 분배하고, 유기 상을 물 (500 mL)로 세척한 다음, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고, 여과물을 원래 부피의 1/4로 농축시켜 조 생성물을 에틸 아세테이트 중 용액으로서 수득하였다.

생성물의 제2 배치를 하기와 같이 변형된 동일한 절차에 따라 제조하였다: 반응을 (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-아미노-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)피리도[2,3-d]피리미딘-3 (4H)-일)-4-클로로-1-메틸-1H-인다졸-3-일)메탄술폰아미드 (53.4 g, 79 mmol)를 사용하여 수행하고, 모든 다른 시약의 양을 그에 따라 조정하였다. 후처리를 염수 (300 mL) 세척으로 종결한 후에 MgSO₄ 상에서 건조시켰다.

조 생성물을 합한 다음, 셀라이트 상에 흡착시켰다. 생성된 분말을 헥산 중 30-85% 에틸 아세테이트로 용리시키면서 실리카 겔 크로마토그래피 (3 kg 레디셉 골드 칼럼)하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 풀링하고, 감압 하에 농축시켜 황색 발포체를 수득하였다. 물질을 고진공 하에 18시간 동안 두었다. 물질을 막자사발 및 막자를 사용하여 미세 분말로 전환시키고, 고체를 진공 오븐에 50℃에서 48시간 동안 두어 N-((S)-1-((3P)-3-(4-클로로-1-메틸-3-(메틸술폰아미도)-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트아미드를 황색 분말 (134.1 g, 90% 수율)로서 수득하였다. ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 9.84 - 9.91 (1 H, m) 9.49 (1 H, d, J=8.34 Hz) 8.47 (1 H, d, J=8.35 Hz) 7.79 (1 H, d, J=7.75 Hz) 7.49 (1 H, d, J=8.05 Hz) 7.11 (1 H, d, J=8.64 Hz) 6.80 - 7.09 (2 H, m) 6.66 (2 H, dd, J=8.20, 2.24 Hz) 4.69 - 4.75 (3 H, m) 4.57 (1 H, d, J=16.39 Hz) 4.48 (1 H, ddd, J=11.03, 8.35, 2.68 Hz) 3.51 (3 H, s) 3.42 (1 H, dd, J=14.01, 2.38 Hz) 3.20 (3 H, s) 3.05 (1 H, dd, J=14.01, 11.03 Hz) 2.89 - 2.99 (2 H, m) 2.42 - 2.48 (2 H, m) 1.32 - 1.40 (1 H, m) 0.81 - 0.86 (1 H, m). LCMS 방법: 칼럼 = 액퀴티 UPLC BEH C18 (2.1 x 100 mm, 1.7 um 입자); 용매 A = 물:MeCN (95:5), 0.1% v/v 포름산 함유; 용매 B = MeCN:물 (95:5), 0.1% v/v 포름산 함유; 구배 = 시간 (분)/%B: 0/0, 3.5/100, 4.5/100; 유량 = 0.8 mL/분. LCMS 결과: 체류 시간 = 3.173분; 관찰 질량 = 917.95 (M+H). UPLC 순도 = 99.8%.

실시예 1의 명명:

상기 제조된 실시예 1의 화합물은 축 키랄성을 함유하는 호모키랄 물질이다. 축 키랄성은 IUPAC 골드북 (doi:10.1351/goldbook.A00547)에 상술된 바와 같은 P/M 명명법을 사용하여 기재될 수 있다. 그러나, 현시점에 P/M 명명법을 포함하는 화학 명칭을 생성할 수 있는 소프트웨어 도구는 제한된 수만이 이용가능하고, 이 명명법을 사용하는 화학 명칭을 분자의 구조 표현으로 전환시키기 위해 훨씬 더 적은 옵션이 이용가능하다. 따라서, 명확성 및 편의를 위해, 실시예 1에 대한 여러 명칭이 하기에 제공된다:

켐드로우 울트라 12(ChemDraw Ultra 12)에 의해 생성된 실시예 1의 명칭 (P/M 명명법 부재)은 하기와 같다:

N-((S)-1-(3-(4-클로로-1-메틸-3-(메틸술폰아미도)-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트아미드

엑셀용 제이켐(JChem)에 의해 생성된 실시예 1의 화학 명칭 (P/M 명명법 포함)은 하기와 같다:

N-[(1S)-1-[(3P,3P)-3-(4-클로로-3-메탄술폰아미도-1-메틸-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3H,4H-피리도[2,3-d]피리미딘-2-일]-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸]-2-[(2S,4R)-9-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-7,8-디아자트리시클로[4.3.0.0^2,4]노나-1(6),8-디엔-7-일]아세트아미드

수동으로 추가된 P/M 명명법을 갖는 켐드로우 울트라 12에 의해 생성된 화학 명칭은 하기와 같다:

N-((S)-1-((3P)-3-(4-클로로-1-메틸-3-(메틸술폰아미도)-1H-인다졸-7-일)-4-옥소-7-(3,3,3-트리플루오로프로폭시)-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)-2-(3,5-디플루오로페닐)에틸)-2-((3bS,4aR)-3-(디플루오로메틸)-5,5-디플루오로-3b,4,4a,5-테트라히드로-1H-시클로프로파[3,4]시클로펜타[1,2-c]피라졸-1-일)아세트아미드

비교 시험:

실시예 1의 화합물을 다수의 시험에서 WO2018203235 (반응식 1)에 기재된 실시예 60.2의 화합물과 비교하였다. 이들 비교의 목적을 위해, 본 발명자들은 각각의 화합물의 호모키랄 물질의 사용을 선택하였으며, 이는 이러한 수준의 순도가 인간 임상 시험에서 사용되는 바를 가장 대표하기 때문이다. 구체적으로, 인다졸의 나타낸 C-N 결합에 대한 제한된 회전은 실시예 1 및 실시예 60.2 둘 다에서 회전장애이성질체 (부분입체이성질체)를 생성하며, 이는 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있고, 실온에서 비-상호전환된다. 따라서, 크로마토그래피를 사용하여 본 발명자들은 반응식 2에 도시된 입체이성질체를 순수한 형태로 단리하였다.

반응식 1

반응식 2

LC-MS/MS를 통해 화합물을 정량화하기 위한 일반적 절차:

모든 시험관내 샘플을 엑시온(Exion) LC 4500 트리플 쿼드(Triple Quad)^TM LC-MS/MS 시스템 상에 주입하였다. 사용된 분석 칼럼은 실온에서 유지된 페노메넥스(Phenomenex) C18 (C18, 4.6 mm x 50 mm, 5 μm)이었다. 이동상 A는 밀리큐(MilliQ) 물 중 0.1% (v/v) 포름산으로 이루어졌다. 이동상 B는 100% 메탄올로 이루어졌다. 유량은 1ml/분이었다. 구배는 하기와 같았다: 이동상 B를 0.7분에 걸쳐 5%에서 90%로 선형으로 증가시키고, 1.4분 동안 90%에서 유지하고, 0.7분 동안 5%에서 유지하였다.

모든 생체내 샘플을 60℃에서 유지된 칼럼을 갖는 트리플 쿼드^TM 6500 LC-MS/MS 시스템 상에 주입하였다. 이동상 A는 H₂O, 1 mM NH₄OAc, 0.025% 포름산으로 이루어졌다. 이동상 B는 MeOH, 5mM NH₄OAc로 이루어졌다. 유량은 0.6 ml/분이었다. 칼럼 및 용리 구배를 하기 기재된 일반적 분석 방법 중 하나로부터 선택하였다.

일반적 분석 방법 A:

칼럼 = 워터스 엑스-브리지(Waters X-Bridge) BEH C18 (2.1 x 50 mm, 1.7 μm 입자); 구배: 시간(분)/%B = 0.0/10, 0.2/10, 0.8/90, 1.3/90, 1.31/10, 2.0/10.

일반적 분석 방법 B:

칼럼 = 워터스 BEH C18 (2.1 x 50mm, 2.5 μm 입자); 구배: 시간(분)/%B = 0.0/10, 0.2/10, 0.8/90, 1.3/90, 1.31/10, 2.0/10.

일반적 분석 방법 C:

칼럼 = 워터스 BEH C18 (2.1 x 50mm, 1.7 μm 입자); 구배: 시간(분)/%B = 0.0/2, 0.40/2, 0.7/65, 1.3/90, 1.9/90, 1.91/2, 2.5/2.

효력 및 세포독성을 측정하기 위한 절차:

MT-2 세포, 293T 세포 및 NL_4-3 바이러스의 프로바이러스 DNA 클론을 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)으로부터 입수하였다. MT-2 세포를 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS), 100 mg/ml 페니실린 G 및 100 유닛/ml 이하의 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 증식시켰다. 293T 세포를 10% 열 불활성화 FBS, 100 mg/ml 페니실린 G 및 100 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 배지 중에서 증식시켰다. nef 유전자의 섹션이 레닐라 루시페라제 유전자로 대체된 재조합 NL_4-3 프로바이러스 클론을 사용하여, 이들 연구에 사용된 참조 바이러스를 제조하였다. 미루스 바이오 엘엘씨(Mirus Bio LLC) (위스콘신주 매디슨)로부터의 트랜짓(Transit)-293 형질감염 시약을 사용하여 재조합 NL_4-3 프로바이러스 클론의 293T 세포 내로의 형질감염을 통해 재조합 바이러스를 제조하였다. 2-3일 후에 상청액을 수거하고, 마커로서 루시페라제 효소 활성을 사용하여 루시페라제 효소 활성을 측정함으로써 MT-2 세포에서 존재하는 바이러스의 양을 적정하였다. 루시페라제는 프로메가(Promega) (위스콘신주 매디슨)로부터의 엔두렌 살아있는 세포 기질(EnduRen Live Cell Substrate)을 사용하여 정량화하였다. 재조합 바이러스에 대한 화합물의 항바이러스 활성은 화합물의 연속 희석물의 존재 하에 재조합 바이러스로 4-5일 동안 감염시킨 MT-2 세포에서 루시페라제 활성을 측정함으로써 정량화하였다.

50% 유효 농도 (EC₅₀)는 지수 형태의 중앙 효과 방정식 (Fa) = 1/[1+ (ED₅₀/약물 농도)m]을 사용하여 계산하였다 (Johnson VA, Byington RT. Infectivity Assay. In Techniques in HIV Research. ed. Aldovini A, Walker BD. 71-76. New York: Stockton Press.1990). 50% 억제 농도 (EC₅₀)를 지수 형태의 중앙 효과 방정식을 사용하여 계산하였으며, 여기서 퍼센트 억제 = 1/[1 + (EC₅₀/약물 농도)m]이고, 여기서 m은 농도-반응 곡선의 기울기를 반영하는 파라미터이다.

화합물 세포독성 및 상응하는 CC₅₀ 값을, 비감염된 세포를 사용한 것을 제외하고는 항바이러스 검정에 기재된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 결정하였다. 세포독성은 비감염된 MT2 세포에서 XTT (2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐]-2H-테트라졸륨-5-카르복시아닐리드 내부 염)-기반 비색 검정 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 제4일에 평가하였다.

결과:

실시예 1 및 실시예 60.2의 효능은 초기 항-HIV 바이러스학 검정의 오차 내에 있다 (EC₅₀ 실시예 1 = 25 ± 8 pM, EC₅₀ 실시예 60.2 = 18 ± 13 pM). 실시예 1의 EC₅₀은 초기에 시험한 경우 0.034 nM이었지만, 추가로 시험한 결과 평균 25 ± 8 pM로 수정되었음에 유의한다. 측정된 세포독성 CC₅₀은 실시예 1 및 실시예 60.2에 대해 각각 >0.5 μM 및 >10 μM이다.

간 마이크로솜에서 대사를 측정하기 위한 절차:

인간, 래트, 개 및 원숭이로부터의 간 마이크로솜을 해동시키고, 100 mM 인산칼륨 완충제 (pH 7.4) 중에 1 mg/mL의 최종 농도로 희석하였다. 시험 화합물 및 대조군을 1:1 아세토니트릴:물 (v/v) 중 1 μM의 100x 최종 농도로 제조하고, 마이크로솜 혼합물로 분취하였다. 혼합물을 진탕 수조에서 37℃에서 10분 동안 사전인큐베이션하였다. 인큐베이션을 이중으로 수행하였다. 3개의 대조군; 와파린, 페나세틴 및 베라파밀을 인큐베이션에 포함시켰다. 사전인큐베이션 후에, 반응을 1 mM의 최종 농도의 NADPH로 개시하였다. 0, 5, 15, 30, 45 및 60분에, 25 μL의 샘플을 제거하고, 내부 표준 (텔미사르탄(Telmisartan))을 함유하는 300 μL의 아세토니트릴로 켄칭하였다. 샘플을 1200 rpm에서 5분 동안 볼텍싱한 다음, 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 100 μL의 상청액 분취물을 물로 3배 희석하고, 엑시온 LC 4500 트리플 쿼드 LC-MS/MS 시스템 상에 주입하였다. 결과를 남아있는 모 화합물의 백분율로서 보고하고, 각각의 시점 후에 남아있는 시험 화합물의 피크 면적 비로부터 계산하고, 제0 시점 인큐베이션과 비교하였다.

결과:

실시예 1은 개 간 마이크로솜에서 실시예 60.2보다 6배 더 안정하고, 실시예 1은 원숭이 간 마이크로솜에서 실시예 60.2보다 적어도 2배 더 안정하다. 이 데이터는 실시예 1이 개 및 원숭이에서 생체내 대사에 대해 실시예 60.2보다 유의하게 더 안정할 것임을 시사한다.

표 1.

인간 간세포에서의 대사를 측정하기 위한 절차:

인간, 원숭이, 개, 래트 및 마우스로부터의 현탁액 중에 동결보존된 간세포를 해동시키고, 사전-가온된 윌리암스 배지 E(William's Medium E) (pH 7.4) 중에 희석하였다. 간세포 현탁액의 분취물을 사전-가온된 윌리암스 배지 E (pH 7.4)에서 제조된 시험 화합물 작업 용액에 첨가하여 밀리리터당 0.5 x 10⁶개 세포로 0.5 μM 및 ≤0.25% DMSO의 최종 농도를 달성하였다. 이들 샘플을 5% 이산화탄소와 함께 37℃에서 인큐베이션하고, 200 rpm에서 진탕시켰다. 인큐베이션을 1회로 수행하였다. 시점 0, 10, 30, 60, 120 및 240분에, 인큐베이션 혼합물의 50 μL 분취물을 제거하고, 내부 표준을 함유하는 아세토니트릴의 100 μL 용액에 첨가하고, 혼합물을 볼텍싱한 다음, 4℃ 및 3500 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 실험 완료 후, 샘플을 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 대사 안정성 결과는 남아있는 모 시험 화합물의 백분율로서 보고하였다. 이 백분율은 인큐베이션 후 (t_x) 시험 화합물의 피크 면적 비를 인큐베이션 직전 제0 시점 (t₀)에서의 시험 화합물의 피크 면적 비로 나눔으로써 계산된다.

제거 속도 상수 (k, min^-1)는 하기 방정식으로 비선형 회귀 피팅을 사용하여 계산된다:

여기서:

C₀은 피크 면적 비 (시험 화합물 피크 면적/내부 표준 피크 면적)로서 나타낸 초기 농도이고;

C_t은 면적비 (시험 화합물 피크 면적/내부 표준 피크 면적)로 나타낸 t에서의 농도이고;

e는 자연 로그의 밑이고,

t는 시간 (분)이고;

k는 제거 속도 상수 (min^-1)이다.

반감기 (t_1/2, min)는 하기 방정식을 사용하여 계산된다:

여기서:

k는 제거 속도 상수 (min^-1)이다.

시험관내 고유 클리어런스 (CL_int, mL/분/백만개 세포)를 하기 방정식을 사용하여 계산된다:

여기서:

t_1/2은 반감기이고;

n은 mL당 세포의 수이다.

결과:

인간 간세포에서의 실시예 1의 반감기는 >480분으로 계산된 반면, 인간 간세포에서의 실시예 60.2의 반감기는 350분으로 계산되었다. 인간 간세포에서의 실시예 60.2의 고유 클리어런스는 0.465 mL/분/g 간이며, 이는 실시예 1에서 실측된 0.312 mL/분/g 간 클리어런스보다 1.5배 더 신속하다.

생체내 약동학적 파라미터 (PK)를 측정하기 위한 절차:

PK를 수컷 CD1 마우스, 위스타 한 래트(Wistar Han Rat), 시노몰구스 원숭이 및 비글 개에서 조사하였다. 2개의 동물 군 (군당 N= 3)에게 시험 화합물을 정맥내 (IV) 용량 (1 mg/kg)으로서 또는 경구 위관영양 (5 mg/kg 용액 및 현탁액)에 의해 제공하였다. 약물을 IV 투여를 위해 90% PEG 400, 10% 에탄올 중에 및 PO 투여를 위해 90% PEG400, 5% 에탄올 중에 제제화하였다. 혈액 샘플을 IV의 경우 투여후 0.167, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 5, 7, 24, 48, 72 및 96시간에; 경구의 경우 투여후 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 5, 7, 24, 48, 72 및 96시간에 수집하였다. 혈액 샘플을 K₃EDTA 튜브 내로 수집하고, 1500 내지 2000 x g에서 원심분리하여 혈장을 수득하였다. 혈장 샘플을 LC-MS/MS에 의한 분석까지 -20℃에서 저장하였다.

모든 생체내 샘플을 엑시온 LC 4500 트리플 쿼드^TM LC-MS/MS 시스템 상에 주입하였고, 여기서 칼럼은 60℃에서 유지되었고, 유량은 0.6 mL/분이었다. 모든 LC-MS/MS 분석 파라미터는 미가공 데이터 파일로 전자적으로 캡쳐된다. 래트 IV, 개 IV, 원숭이 IV 및 원숭이 PO PK 샘플을 일반적 분석 방법 A에 의해 분석하였다. 마우스 IV, 마우스 PO 및 개 PO PK 샘플을 일반적 분석 방법 B에 의해 분석하였다. 래트 PO 샘플을 일반적 분석 방법 C에 의해 분석하였다.

PK 파라미터는 혈장 농도 대 시간 데이터의 비-구획 분석에 의해 수득하였다 (포에닉스 윈논린(Phoenix WinNonlin) v8.1). 피크 농도 (C_max) 및 C_max에 대한 시간 (T_max)을 실험적 관찰로부터 직접 기록하였다. 제0 시점으로부터 마지막 샘플링 시간까지의 곡선하 면적 [AUC_0-T] 및 제0 시점으로부터 무한대까지의 곡선하 면적 [AUC_INF]을 선형-로그 사다리꼴 규칙을 사용하여 계산하였다. 총 혈장 클리어런스 (CL_Tp), 정상-상태 분포 부피 (V_ss), 겉보기 제거 반감기 (T-HALF), 및 평균 체류 시간 (MRT)을 IV 투여 후에 추정하였다. AUC 및 T-HALF의 추정은 정량가능한 농도로 최소 3개의 시점을 사용하여 이루어졌다. 절대 경구 생체이용가능성 (F)을 경구 및 IV 투여에 따른 투여량-정규화된 AUC 값의 비로 추정하였다.

결과:

실시예 1 및 실시예 60.2의 IV 약동학 (PK) 파라미터를 4종의 전임상 종: 마우스, 래트, 개 및 원숭이에서 측정하였다. 실시예 1은 4종 모두에서 실시예 60.2에 비해 개선된 클리어런스를 나타내었다. 상기 언급된 간 마이크로솜 검정의 결과와 일치하게, 클리어런스에서의 차이는 개 및 원숭이에서 가장 유의하였으며, 여기서 클리어런스는 각각 4.9배 및 2.6배 개선되었다. 마찬가지로, 개 및 원숭이에서 순환 중의 실시예 1의 반감기는 실시예 60.2보다 각각 3.4배 및 2배 더 높았다.

표 2.

표 3.

유망한 의약을 인간 임상 시험에 투입하기 전에, 화합물의 안전성이 전형적으로 2종의 전임상 종: 1종의 설치류 및 1종의 비-설치류에서 평가되어야 한다. 이들 종은 통상적으로 래트, 및 개 또는 원숭이이다. 생체내 안전성 연구의 한 목적은 인간에게 유효 용량의 약물을 제공한 경우에 예상되는 것보다 수배 더 높은 순환 중의 약물 농도를 달성하는 것이다. 안전성 연구에서 달성된 약물 농도와 유효 용량의 약물을 복용하는 사람에서 예상되는 약물 농도 사이의 배수-차이를 "안전역 (margin)"으로 지칭한다. 안전성 연구에서 높은 안전역을 달성하는 것이 중요한데, 이는 안전역이 클수록, 약물-관련 유해 사건이 일어날 수 있는 경우 그 유해 사건이 전임상 안전성 평가 동안 관찰될 것이라는 신뢰도도 증가하기 때문이다.

래트, 개 또는 원숭이에서의 개선된 PK 파라미터는 이들 전임상 종에 대한 순환 중의 높은 약물 농도를 달성하기 위해 보다 낮은 용량의 화합물이 요구될 것임을 의미한다. 따라서, 실시예 1의 용량을 제공받는 원숭이 또는 개는 동일한 크기의 용량의 실시예 60.2를 제공받는 경우보다 더 높은 안전역을 달성할 것이다. 용량 크기의 실제적 제한으로 인해, 비-설치류 안전성 평가 연구에서 실시예 1로 달성될 수 있는 안전역 (및 이에 따른 신뢰도)은 실시예 60.2로 달성될 수 있는 안전역보다 높다.

인간에서의 용량의 예측을 제공하기 위한 전임상 PK 파라미터의 알로메트릭 스케일링 절차:

인간 용량 예측은 포에닉스 윈논린 (v 8.0) 소프트웨어 및 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)을 사용하여 집단 모델링을 위한 모델리스크 애드-인(ModelRisk add-in)을 사용하여 수행하였다. 각각의 화합물의 CL_Tp에 대한 인간 추정치는 마우스, 래트, 원숭이 및 개 IV 데이터의 평균 알로메트릭 스케일링 (0.75의 체중 스케일링 인자) 및 Vss에 대한 모든 종으로부터의 평균 (1.0의 체중 스케일링 인자)에 기초하여 수득하였다. 인간 IV 파라미터 (Vc, Ka, K12, K21, Kel)는 인간 Vss 및 CL_Tp 추정치를 사용하여 전임상 종 (마우스, 래트, 개 및 원숭이)으로부터의 평균 체류 시간 (MRT) 스케일링을 사용하여 결정하였다. 전임상 종에서의 디컨볼루션(deconvolution) (PO)에 의해 또는 반감기 (SC)로부터 흡수 (Ka)를 결정하였다 (Ka = LN(2)/t1/2). PO 및 SC에 대한 예측된 인간 용량은 인간 가변성을 고려하여 계산되고, 인간 집단의 95%를 포괄하도록 계산된다.

결과:

전임상 종 PK 파라미터는 인간-임상 시험 전에 인간 PK 파라미터를 예측하는데 통상적으로 사용된다. 이 예측에 사용된 방법은 "알로메트릭 스케일링"으로 불리고, 일반적으로 문헌에서 논의되고 실시된다. 알로메트릭 스케일링을 사용하여, 인간에서 약물의 효과적인 혈장 농도를 유지하는데 요구되는 예측된 1일-1회 경구 용량은 실시예 60.2에서보다 실시예 1에서 7배 더 낮다. 구체적으로, 실시예 1의 예측된 인간 QD PO 용량은 10 mg 미만인 반면, 실시예 60.2의 예측된 인간 QD PO 용량은 30 mg 초과이다.

특발성 약물 반응 (즉, 과민 반응)은 사실상 예측불가능하고 심각하며, 따라서 유의한 임상 문제를 나타내지만, 10 mg 이하의 1일 용량으로 제공된 약물은 특발성 약물 반응의 높은 발생률과 연관되는 경우가 거의 드물다고 언급되어 있다 (Uetrecht, J. P. New Concepts in Immunology Relevant to Idiosyncratic Drug Reactions: The "Danger Hypothesis" and Innate Immune System. Chem. Res. Toxicol. 1999, 12(5), 387-395, DOI:10.1021/tx980249i).

피하 생체내 실험에서 약동학적 파라미터를 측정하기 위한 절차:

약물을 1% 콜리포르(Kolliphor) P188/1% PEG3350/3.5% 만니톨/94.5% 물 중에 제제화한 다음, 위스타 한 래트에게 20 mg/kg의 용량으로 피하 주사로서 투여하였다. 혈액 샘플을 0.167, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 5, 7, 24, 48, 72, 96시간에, 이어서 최대 122일 동안 3일마다 수집하였다. 혈액 샘플을 K₃EDTA 튜브 내로 수집하고, 1500 내지 2000 x g에서 원심분리하여 혈장을 수득하였다. 혈장 샘플을 LC-MS/MS에 의한 분석까지 -20℃에서 저장하였다.

결과:

피하 (SC) 투여에 대한 각각의 화합물의 적합성을 래트 SC PK 실험에서 평가하였다. 이 실험에 의해 결정된 바와 같이, 혈장 중 화합물의 겉보기 반감기는 실시예 1의 경우 13일이었고, 실시예 60.2의 경우 11.5일이었다. 실시예 1에 대한 AUC_0-무한대는 4,941일*ng/mL (외삽된 AUC의 2.89%)였다. 실시예 60.2에 대한 AUC_0-무한대는 609일*ng/mL (외삽된 AUC의 12.8%)였다. 생체이용률은 실시예 1의 경우 93%였고, 실시예 60.2의 경우 25%였다. 약물 농도는 실시예 1에서 73일 동안, 실시예 60.2에서 24일 동안 모든 동물에 대해 7 ng/mL 초과로 유지되었다 (도 1). 인간에 대한 예측된 매월-1회 피하 (Q1M SC) 용량을, 알로메트릭 스케일링으로부터 유도된 예측된 인간 클리어런스 값과 함께 SC 래트 PK로부터 유도된 겉보기 반감기 및 생체이용률을 사용하여 계산하였다. 인간에서 약물의 유효 혈장 농도를 유지하는데 요구되는 예측된 Q1M SC 용량은 실시예 60.2에서보다 실시예 1에서 15배 더 낮다.

동결보존된 인간 간세포에서 시토크롬 P450 유도를 측정하기 위한 절차:

FDA의 안내 ("In Vitro Metabolism- and Transporter- Mediated Drug-Drug Interaction Studies Guidance for Industry")에 따라, CYP2B6 발현을 유도하는 실시예 1 및 실시예 60.2의 잠재력을 (풀링된 공여자보다는) 동일한 3명의 개별 공여자로부터의 간세포를 사용하여 시험하고, 효소 mRNA 수준의 변화를 "배수-변화 방법"을 사용하여 평가하였다. 이 시험에서, 2배 미만의 mRNA 수준의 배수-변화는 음성 소견으로 간주되는 반면, ≥ 2배의 변화는 양성 소견으로 간주된다.

화합물을 3명의 공여자로부터의 유도성 동결보존된 인간 1차 간세포를 사용하는 CYP 유도 검정에서 시험하여 CYP2B6의 유도 (mRNA 전사의 증가에 의해 측정됨)를 유발하는 잠재력을 결정하였다. 시험 화합물 (0.12 내지 30 μM 최종 농도)을 다양한 CYP 효소의 발현 수준의 조절에 관여하는 모든 핵 수용체를 자연적으로 발현하는 1차 인간 간세포와 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 시험 화합물 및 대조군의 새로운 용액을 검정 배지 중에 희석하고, 연속 2일 동안 24시간마다 0.1%의 최종 DMSO 농도로 첨가하였다. 인큐베이션 종료 시에, 세포 단층의 완전성, 세포 밀도 및 생존율을 평가하여 세포독성 효과를 평가하였다. 이어서 세포를 세포 용해 완충제 중에 가용화시키고, 총 RNA를 각각의 검정 샘플로부터 정제하였다. 이어서 샘플을 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)에 사용하여 인간 CYP2B6 유전자를 코딩하는 특이적 mRNA 종의 양을 정량화하였다.

시험 화합물 및 대조군의 유도 잠재력을 공지된 CYP2B6 유도제 페노바르비탈(Phenobarbital) (1000 μM)과 비교하였다. 본 검정의 결과는 배수 유도로 표현된다. 배수 유도는 DMSO (용매 대조군) 단독으로 처리된 세포에서의 mRNA 수준에 대한 시험 화합물로 처리된 세포에서의 mRNA 수준의 비로서 계산하였고, 따라서 이는 시험 화합물의 유도 잠재력을 나타낸다. 배수 유도 값을 사용하여 대조군 활성 값의 퍼센트를 계산하였고, 이어서 이를 4-파라미터 로지스틱 회귀 모델에 피팅하여 EC₅₀ 및 E_max 값 (유도가 관찰되는 경우)을 결정하였다. 세포독성으로 인한 거짓 양성 CYP 유도 결과를 피하기 위해 세포독성을 또한 병행하여 평가하였다. 세포독성 농도에서의 CYP 유도 잠재력의 평가 및 해석은 피해야 한다.

결과:

시험된 임의의 농도 (30 μM 이하)에서 어느 화합물에서도 세포독성은 관찰되지 않았다. 실시예 1의 경우, 모든 3명의 공여자에서 음성 소견 (유도 없음)이 나타났다. 실시예 60.2의 경우, 3명의 공여자 중 2명에서 양성 소견 (유도)이 나타났다 (1.5 μM 및 1.8 μM의 EC₅₀ 값).

CYP 효소 발현의 유도는 약물-약물 상호작용의 근본 원인으로 인식되며, 이는 유도된 CYP 이소형에 의해 약물의 대사가 지배되는 희생 약물의 증가된 클리어런스를 유발한다. CYP 이소형 중에서, HIV를 치료하는데 널리 사용되는 의약인 에파비렌즈 (EFV) (2019 세계 보건 기구 필수 의약 목록에 포함됨)가 CYP2B6에 의해 주로 대사되기 때문에, CYP2B6은 HIV 치료의 맥락에서 특히 중요하다 (Ward, B. A., Gorski, J. C., Jones, D. R., Hall, S. D., Flockhard, D. A., Desta, Z. The Cytochrome P450 2B6 (CYP2B6) Is the Main Catalyst of Efavirenz Primary and Secondary Metabolism: Implication for HIV/AIDS Therapy and Utility of Efavirenz as a Substrate Marker of CYP2B6 Catalytic Activity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 306, 287-300, DOI: 10.1124/jpet.103.049601).

Claims

하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:

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제1항에 있어서, 하기 도시된 입체화학을 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:

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제2항에 있어서, 하기 도시된 입체화학을 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:

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제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염을 포함하는 제약 조성물.
제4항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 경구 투여, 근육내 주사 또는 피하 주사에 적합한 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염의 투여를 포함하는, 인간에서 HIV 감염을 치료하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 투여가 경구 투여인 방법.
제7항에 있어서, 상기 투여가 근육내 주사 또는 피하 주사인 방법.
제7항에 있어서, 인간에서 HIV 감염의 치료에 사용되는 적어도 1종의 다른 작용제의 투여를 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 적어도 1종의 다른 작용제가 아바카비르, 아타자나비르, 빅테그라비르, 카보테그라비르, 돌루테그라비르, 다루나비르, 도라비린, 포스템사비르, 라미부딘, 마라비록, 릴피베린, 테노포비르 디소프록실, 테노포비르, 테노포비르 아페나미드, S-648414, GSK3640254, 항체 N6LS 및 GSK3739937/VH3739937로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 적어도 1종의 다른 작용제가 돌루테그라비르, 라미부딘, 포스템사비르, 카보테그라비르, 항체 N6LS, 및 GSK3739937/VH3739937로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HIV 감염을 치료하는데 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HIV 감염의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.