ES2964658T3 - Preparaciones mejoradas de Factor VIII para su uso en el tratamiento de la hemofilia A - Google Patents
Preparaciones mejoradas de Factor VIII para su uso en el tratamiento de la hemofilia A Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a preparaciones farmacéuticas que comprenden Factor VIII de dos cadenas que están esencialmente libres de Cadenas Ligeras del Factor Vlll (FVIII-LC) que no están asociadas con Cadenas Pesadas del Factor Vlll (FVIII-HC) que tienen mayor pureza y que son menos inmunogénico. La invención también se refiere a métodos para probar la idoneidad de una preparación farmacéutica de factor VIII y a métodos para reducir en preparaciones farmacéuticas de factor VIII la cantidad de FVIII-HC que no están asociados con FVIII-LC y/o de FVIII-LC que no están asociados. asociado con FVIII-HC. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Preparaciones mejoradas de Factor VIII para su uso en el tratamiento de la hemofilia A
Campo de la invención:
La presente invención se refiere a preparaciones farmacéuticas que comprenden Factor VIII de dos cadenas que están esencialmente libres de Cadenas Ligeras de Factor VIII (FVIII-LCs) que no están asociadas con Cadenas Pesadas de Factor VIII (FVIII-HCs) que tienen mayor pureza y que son menos inmunogénicas.
Antecedentes de la invención:
Existen varios trastornos hemorrágicos causados por deficiencias de los factores de coagulación de la sangre. Algunos de los trastornos hemorrágicos más comunes son la hemofilia A y B, derivadas de deficiencias del Factor VIII y IX de la coagulación sanguínea, respectivamente.
La hemofilia clásica o hemofilia A es un trastorno hemorrágico hereditario. Es el resultado de una carencia del Factor VIII de la coagulación sanguínea, ligada al cromosoma X y afecta casi exclusivamente a varones con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10,000. El defecto del cromosoma X es transmitido por mujeres portadoras no siendo ellas mismas hemofílicas. La manifestación clínica de la hemofilia A es un aumento de la tendencia a la hemorragia. Antes de la introducción del tratamiento con concentrados de Factor VIII, la esperanza media de vida de una persona con hemofilia grave era menos de 20 años. El uso de concentrados de Factor VIII procedentes del plasma y posteriormente de formas recombinantes del Factor VIII, ha mejorado considerablemente la situación de los pacientes con hemofilia, incrementando en gran medida la esperanza media de vida, proporcionando a la mayoría de ellos la posibilidad de tener una vida más o menos normal. Sin embargo, ha habido ciertos problemas con los concentrados derivados del plasma y su uso, el más grave de los cuales ha sido la transmisión de virus. Hasta ahora, los virus causantes de la hepatitis B, la hepatitis no A no B y el sida han afectado gravemente a la población. Desde entonces se han desarrollado diferentes procedimientos de inactivación de virus y nuevos concentrados de Factor VIII altamente purificados que han establecido un estándar de seguridad muy elevado también para el Factor VIII derivado del plasma.
La clonación del ADNc para Factor VIII (Wood et al. 1984. Nature 312:330-336; Vehar et al. 1984. Nature 312:337-342) hicieron posible la expresión recombinante del Factor VIII, lo que condujo al desarrollo de varios productos de Factor VIII recombinante, que fueron aprobados por las autoridades reguladoras entre 1992 y 2003. El hecho de que el dominio B central de la cadena polipeptídica del Factor VIII, situado entre los aminoácidos Arg-740 y Glu-1649, no parezca necesario para una actividad biológica completa también ha conducido al desarrollo de productos de Factor VIII con supresión del dominio B.
La molécula madura de Factor VIII de tipo salvaje consta de 2332 aminoácidos que pueden agruparse en tres dominios A homólogos, dos dominios C homólogos y un dominio B que están dispuestos en el orden: A1-A2-B-A3-C1-C2. La secuencia de aminoácidos completa del Factor VIII humano maduro se muestra en SEQ ID NO:2. Los dominios A también comprenden regiones ácidas resaltadas como a1, a2 y a3 (Figura 1). Durante su secreción en el plasma, el Factor VIII se procesa intracelularmente en una serie de heterodímeros de diferente longitud que se asocian a los iones metálicos a medida que el Factor VIII de cadena simple se escinde en el límite B-A3 y en diferentes sitios dentro del dominio B. Este procesamiento da lugar a moléculas heterogéneas de cadena pesada compuestas por el A1, el A2 y varias partes del dominio B, que tienen un tamaño molecular que oscila entre 90 kDa y 200 kDa, y a moléculas de cadena ligera que tienen un tamaño molecular de aproximadamente 80 kDa. Una cadena pesada está unida de forma no covalente mediante un puente de iones metálicos a una cadena ligera, que consta de los dominios A3, C1 y C2 (Saenko et al. 2002. Vox Sang. 83:89-96). En el plasma, este Factor VIII heterodimérico se une con gran afinidad al Factor von Willebrand, lo que lo protege de un catabolismo prematuro. La semivida del Factor VIII no activado unido al FvW es de aproximadamente 12 horas en plasma.
El Factor VIII de la coagulación se activa a través de la escisión proteolítica por FXa y trombina en los aminoácidos Arg372 y Arg740 dentro de la cadena pesada y en Arg1689 dentro de la cadena ligera, dando lugar a la liberación del Factor von Willebrand y generando el heterotrímero del Factor VIII activado que formará el complejo tenasa en superficies fosfolipídicas con FIXa y FX siempre que el Ca2+ esté presente. El heterotrímero consiste en el dominio A1, un fragmento de 50 kDa, el dominio A2, un fragmento de 43 kDa y la cadena ligera (A3-C1-C2), que es un fragmento de aproximadamente 80 kDa. Así pues, la forma activa del Factor VIII (Factor Villa) consiste en una subunidad A1 asociada a través del enlace de iones metálicos divalentes a una cadena ligera A3-C1-C2 escindida por la trombina y una subunidad A2 libre relativamente poco asociada al dominio A1 y al A3.
Debido a la introducción de pasos de inactivación y eliminación de virus en los procesos de producción de concentrados de Factor VIII recombinante y derivados del plasma, la seguridad vírica de estos productos es muy alta. Por lo tanto, el efecto secundario más grave del tratamiento con Factor VIII en la actualidad es el desarrollo de anticuerpos inhibidores del Factor VIII. Esto puede dar lugar a la neutralización del concentrado de Factor VIII administrado, lo que a veces provoca episodios hemorrágicos potencialmente mortales. Se ha descrito que en el tratamiento de la hemofilia A el riesgo de que el paciente desarrolle un inhibidor a lo largo de su vida es del orden del 25-30%.
Existe, por tanto, una necesidad clínica inigualable de proporcionar productos de Factor VIII, es decir, productos de Factor VlII recombinante con una inmunogenicidad reducida.
Se ha descrito que el riesgo de generación de inhibidores en pacientes con hemofilia A no tratados previamente es mayor cuando se tratan con productos de factor VIII recombinante, y se ha especulado que la unión del FvW a diferentes epítopos en el FVIII-LC (dominios A3 y C2) protege estos epítopos y, por lo tanto, podría tener un efecto beneficioso en la reducción de la inmunogenicidad (C. Escuriola Ettinghausen, W. Kreuz; Haemophilia (2006), 12, (Suppl. 6), 102-106). Los epítopos no blindados del Factor VIII parecen plantear un riesgo de desencadenar la generación de inhibidores. Además, se supone que la interacción del FVIII-HC y el FVIII-LC en el complejo de dos cadenas de FVIII también tiene un efecto de protección sobre epítopos que de otro modo serían de libre acceso en el FVIII-HC y el FVIII-LC.
El aislamiento de Factor VIII a partir de plasma humano (pdFVIII) o la producción recombinante de Factor VIII (rFVIII) son hoy en día procedimientos bien conocidos para proporcionar a los pacientes con Hemofilia A los concentrados correspondientes para su tratamiento. Sin embargo, durante la fabricación, estos productos de Factor VIII se someten a condiciones no fisiológicas que pueden provocar daños e inactivación parcial. Esto puede deberse a una inactivación proteolítica o a una modificación química o estructural. Tales modificaciones estructurales como, por ejemplo, la interrupción de la interacción de los diferentes dominios, pueden desencadenarse por la pérdida de iones metálicos estabilizadores o por el contacto con superficies extrañas. En WO 97/33178 se ha descrito que los fragmentos proteolíticos del Factor VIII en un intervalo de peso molecular entre 20 y 50 kDa en una preparación farmacéutica de Factor VIII pueden ser críticos para dar lugar a la formación de inhibidores y se describió un proceso que utiliza cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en el que las fracciones de Factor VIII que contienen dichos fragmentos se separan para obtener un producto de Factor VIII con un menor contenido de estos fragmentos y, por tanto, menor inmunogenicidad. Sin embargo, WO 97/33178 no mencionaba la separación del preparado de Factor VIII de fragmentos de Factor VIII mayores de 50 kDa. Los documentos EE.UU. 4.675.385, EP0321835, EP0399321 y EP0410207 describen el uso de la cromatografía de exclusión por tamaño para la preparación de Factor VIII, pero ninguna de estas patentes describe la presencia ni la eliminación específica de cadenas pesadas de Factor VIII no asociadas (FVIII-HCs) o de cadenas ligeras de Factor VIII no asociadas (Factor VIII-LCs). La SEC nativa también se utilizó para analizar varias preparaciones de Factor VIII disponibles en el mercado (Jankowski et al., Haemophilia (2007), 13, 30-37), pero no se reconoció la presencia de FVIII-HC no asociados o FVIII-LC no asociados en estas preparaciones.
Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que todas las preparaciones farmacéuticas de Factor VIII de dos cadenas comercialmente obtenibles comprenden alguna cantidad de FVIII-LC no asociados. Como en las moléculas intactas de Factor VIII los FVIII-HC se asocian con los FVIII-LC en una asociación metal-dependiente, estos FVIII-LC no asociados exponen epítopos que normalmente están protegidos en la asociación metal-dependiente con los FVIII-HC y su presencia en una preparación farmacéutica de Factor VIII aumenta el riesgo de que dichas preparaciones de Factor FVIII sean inmunogénicas. Probablemente en estas preparaciones de tc-FVIII también están presentes más o menos FVIII-HC que no están asociados con FVIII-LC y entonces también plantean un riesgo de ser inmunogénicos. En ls preparaciones farmacéuticas de Factor VIII de cadena simple descritas en WO 2004/067566 tales FVIII-HC y FVIII-LC no asociados estarán presentes -si es que lo están- en una cantidad mucho menor, ya que existe un enlace covalente entre el FVIII-HC y el FVIII-LC. Sin embargo, también en las preparaciones de Factor VIII de cadena simple hay una minoría de moléculas que se escinden entre el FVIII-HC y el FVIII-L<c>y, por lo tanto, esta minoría de moléculas de tc-FVIII puede separarse parcialmente en FVIII-HC no asociados y FVIII-LC no asociados. Por lo tanto, la invención está dirigida a preparaciones farmacéuticas de Factor VIII de dos cadenas con bajas cantidades de FVIII-HC no asociado y/o bajas cantidades de FVIII-LC no asociado.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Estructura de las moléculas completas de Factor VIII de dos cadenas (A), Factor VIII de dos cadenas truncado en el dominio B (B) y Factor VIII de una cadena truncado en el dominio B (C)
(A) Factor VIII de longitud completa de dos cadenas en el que el FVIII-HC y el FVIII-LC se asocian de forma no covalente mediante una asociación metal-dependiente.
(B) Factor VIII truncado con dominio B de dos cadenas en el que el FVIII-HC y el FVIII-LC se asocian de forma no covalente mediante una asociación dependiente de metales.
(C) Factor VIII truncado de una sola cadena del dominio B en el que el FVIII-HC y el FVIII-LC se asocian covalentemente, por ejemplo, mediante la supresión del sitio de escisión de la furina.
Figura 2: Perfil SE-HPLC representativo obtenido para el rFVIII de longitud completa separado en una columna Yarra SEC-3000@ en condiciones isocráticas. La fracción recogida se indica en el cromatograma.
Figura 3: Perfil SE-HPLC representativo obtenido para el rFVIII de longitud completa separado en una columna Yarra SEC-3000@ en condiciones isocráticas. Las tres fracciones recogidas se indican en el cromatograma.
Figura 4: Perfiles analíticos SE-HPLC obtenidos para las fracciones recogidas 1 a 3 de rFVIII de longitud completa separadas en una columna Yarra SEC-3000@ en condiciones isocráticas
Figura 5: Perfil SE-HPLC obtenido para BDD rFVIII (ReFacto AF@) separado en una columna Yarra SEC-3000@ en condiciones isocráticas. Las cinco fracciones recogidas se indican en el cromatograma.
Figura 6: Perfiles analíticos SE-HPLC obtenidos para las fracciones recogidas de BDD rFVIII separadas en una columna Yarra SEC-3000@ en condiciones isocráticas.
Figura 7 (Aa D): Perfiles analíticos SE-HPLC obtenidos para los grupos/fracciones relevantes de BDD rFVIII analizados en una columna COSMOSIL® SEC en condiciones isocráticas (los cromatogramas se normalizaron).
Breve sumario de la invención
La invención es como se define en las reivindicaciones 1 a 11. y está dirigida a preparaciones farmacéuticas que comprenden Factor VIII de dos cadenas (tc-FVIII) que están esencialmente libres de Cadenas Ligeras de Factor VIII (FVIII-LCs) que no están asociadas con Cadenas Pesadas de Factor VIII (FVIII-HCs) en las que menos del 0,9% de todas las FVIII-LCs dentro de dicha preparación no están asociadas con FVIII-HCs.
En una realización de la invención, el tc-FVIII es un Factor VIII de longitud completa, que puede ser de origen plasmático o recombinante.
En realizaciones específicas de moléculas de FVIII de longitud completa, el peso molecular de los FVIII-LC no asociados es de aproximadamente 70 a 125 kDa, preferentemente de aproximadamente 80 kDa.
En otra realización, el tc-FVIII es un Factor VIII truncado con dominio B.
Otras realizaciones de la invención se dirigen a preparaciones farmacéuticas de tc-FVIII en las que las preparaciones farmacéuticas son menos inmunogénicas en comparación con preparaciones farmacéuticas que comprenden tc-FVIII en las que el 0,9% o más de todos los FVIII-LC dentro de dicha preparación no están asociados con FVIII-HC.
Ciertas realizaciones de la invención se refieren al uso de las preparaciones anteriores en medicina, preferentemente al uso en el tratamiento de la hemofilia A.
Descripción de la invención
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente las personas con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede utilizarse en la práctica o en las pruebas de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos. A efectos de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.
Los artículos "un" y "uno, una" se utilizan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Por "aproximadamente" se entiende una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta en un 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso, longitud de referencia u otra unidad descrita en el presente documento.
En la memoria descriptiva, las formas singulares también incluyen el plural y viceversa, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que las palabras "comprender", "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos indicados, pero no la exclusión de ningún otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos. Por "que consiste en" se entiende que incluye, y limitado a, lo que sigue a la expresión "que consiste en". Por lo tanto, la expresión "que consiste en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por "que consite esencialmente en" se entiende la inclusión de cualquier elemento enumerado después de la expresión, y limitado a otros elementos que no interfieren o contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación para los elementos enumerados. Por lo tanto, la expresión "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no materialmente a la actividad o acción de los elementos enumerados.
Factor VIII
Los términos "Factor VIII de la coagulación sanguínea", "Factor VIII" y FVIII" se utilizan indistintamente en el presente documento. "Factor VIII de la coagulación sanguínea" incluye el Factor VIII de la coagulación sanguínea de tipo salvaje, así como los derivados del Factor VIII de la coagulación sanguínea de tipo salvaje que tengan la actividad procoagulante del Factor VIII de la coagulación sanguínea de tipo salvaje. Los derivados pueden tener deleciones, inserciones y/o adiciones en comparación con la secuencia de aminoácidos del Factor VIII salvaje. El término Factor VIII incluye las formas del Factor VIII procesadas proteolíticamente, por ejemplo, la forma previa a la activación, que comprende la cadena pesada y la cadena ligera.
El término "Factor VIII" incluye cualquier variante o mutante del Factor VIII que tenga al menos el 10%, preferiblemente al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 75% de la actividad biológica molar específica del Factor VIII de tipo salvaje. La actividad biológica del Factor VIII puede determinarse con ensayos conocidos por el experto que, por ejemplo, son ensayos de coagulación del Factor VIII en una etapa (OS) utilizando plasma empobrecido en Factor VIII y un activador del sistema intrínseco de coagulación como reactivos o ensayos de actividad del Factor VIII en sustrato cromogénico (CS) utilizando kits de ensayo correspondientes disponibles comercialmente.
El término "cadena pesada del Factor VIII" o "Factor VIII HC" o "FVIII-HC" se refiere a una subunidad del Factor VIII compuesta de una parte de la proteína madura que cubre en términos de la molécula del Factor VIII de tipo salvaje los aminoácidos 1 a 740 (es decir, el dominio A1 y elA2) y más grande si contiene todavía partes del dominio B del Factor VIII. Los FVIII-HC de FVIII de longitud completa tienen un peso molecular de entre 80 y 200 kDa, dependiendo de la cantidad de dominio B que se conserve. El peso molecular de un FVIII-HC de un FVIII truncado en el dominio B es de al menos 80 kDa y, dependiendo de cuánto se conserve aún del dominio B original, puede ser de hasta 85 kDa, o al menos 90 kDa o al menos 95 kDa o hasta 100 kDa o hasta 105 kDa o hasta 110 kDa o hasta 120 kDa o hasta 130 kDa o hasta 140 kDa o hasta 150 kDa o hasta 160 kDa o hasta 170 kDa o hasta 180 kDa o hasta 190 kDa o hasta 200 kDa.
El término "Factor VIII de cadena ligera" o "Factor VIII LC" o "FVIII-LC" se refiere a una subunidad del Factor VIII compuesta por parte de la proteína madura que abarca en términos de la molécula de Factor VIII de tipo salvaje los aminoácidos 1649 a 2332 (es decir, el dominio A3, el C1 y el C2). Los FVIII-LC del FVIII de longitud completa suelen tener un peso molecular de unos 80 kDa, pero pueden encontrarse entre 70 kDa y 125 kDa. Jankowski et al. publicaron (Jankowski et al., Hemofilia (2007), 13, 30-37) que el preparado de Factor VIII vendido bajo el nombre comercial Advate® comprende, además del FVIII-LC normal de 80 kDa (escindido antes de Glu1649), también una especie escindida antes de Asp1658 y otra con una escisión antes de Ala1314, esta última dando lugar a un FVIII-LC de un peso molecular de aproximadamente 125 kDa. Los FVIII-LC del FVIII truncado en el dominio B y del FVIII completo tienen una longitud comparable.
Factor VIII, tc-FVIII, FVIII-HC y FVIII-LC o FVIII-HCs y FVIII-LCs comprenden también variantes como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales de las secuencias de Factor VIII de tipo salvaje. También se incluyen fragmentos modificados de Factor o Factor VIII como fusiones a cualquier polipéptido como albúmina, partes Fc de inmunoglobulinas, CTP o XTEN. También se incluyen los FVIII-HC y los FVIII-LC unidos covalentemente a cualquier sustancia que prolongue la vida media, como PEG, HES o ácido polisialico. Siempre que se mencionen pesos moleculares relativos al Factor VIII en esta memoria descriptiva, se refieren al Factor VIII de tipo salvaje y cualquier peso molecular de cualquier modificación, como una proteína de fusión o una fracción de PEG, no se incluye en este peso molecular.
En el Factor VIII de tipo salvaje, es decir, en todas las preparaciones de Factor VIII de origen plasmático y también en todas las preparaciones de Factor VIII de origen recombinante actualmente obtenibles, el Factor VIII se presenta predominantemente como un heterodímero de dos cadenas que consiste en un FVIII-HC y un FVIII-LC, ya que el Factor VIII naciente se escinde intracelularmente dentro del aparato de Golgi entre Arg1648 y Glu1649 y en varias partes del dominio B (si está presente). Las dos cadenas se mantienen unidas en una asociación dependiente de metales, que parece deberse principalmente a un ion cúprico que ocupa como ion cúprico (Cu+) un sitio en el dominio A1 que comprende His267, Cys310 e His315. El papel de un segundo ion de cobre unido en el dominio A3 por His1954, Cys2000 e His2005 y de un calcio unido dentro del dominio A1 por Glu110, Asp116, Asp125, Asp126, Glu122 y Lys107 con respecto a la asociación de las dos cadenas del Factor VIIi está menos claro. También se ha descrito un sitio de unión de Zn2+ dentro del dominio A3.
El término "Factor VIII de dos cadenas" o "tc-FVIII", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un Factor VIII que se escinde durante el proceso de secreción intracelular dentro de la célula que expresa el tc-FVIII o que se ha reconstituido a partir de FVIII-HC y FVIII-LC expresados independientemente, de modo que consta de dos cadenas polipeptídicas: el FVIII-HC (que comprende el dominio A1, el dominio A2) y opcionalmente diversas longitudes del dominio B se asocia con el FVlII-LC (que comprende el dominio A3, el dominio C1 y el dominio C2) en una asociación metal-dependiente. Por lo tanto, en un tc-FVIlI el FVIII-HC no está conectado al FVIII-LC por un enlace peptídico.
El término "FVIII-HC asociado" o "FVIII-LC asociado" significa un FVIII-HC que forma parte de un heterodímero estable con un FVIII-LC o un FVIII-LC que forma parte de un heterodímero estable con un FVIII-HC, que los heterodímeros eluirán como un heterodímero en una cromatografía de exclusión por tamaño nativa según lo descrito por Jankowski et al. (Figura 2a, Jankowski et al., Hemofilia (2007), 13, 30-37). Esta asociación de un FVIII-HC a un FVIII-LC se debe principalmente a la asociación metal-dependiente descrita anteriormente. Como se muestra en la Figura 1 (A) y (B) una molécula FVIII-HC de un FVIII de dos cadenas se asocia en una asociación dependiente del metal a una molécula de FVIII-LC o viceversa.
El término "FVIII-HC no asociado" o "FVIII-LC no asociado" significa un FVIII-HC que no forma parte de un heterodímero estable con un FVIII-LC o un FVIII-LC que no forma parte de un heterodímero estable con un FVIII-HC y cuyos FVIII-HC no asociados y/o FVIII-LC no asociados, por lo tanto, no eluirán como parte de un heterodímero en una cromatografía de exclusión por tamaño nativo según lo descrito por Jankowski et al. (Figura 2a, Jankowski et al., Hemofilia (2007), 13, 30-37) sino como monómeros de FVIII-HC no asociados y FVIII-LC no asociados.
Como ejemplos no limitantes, las moléculas de Factor VIII, o FVIII-HCs o FVIII-LCs derivadas de las mismas incluyen mutantes de Factor VIII que previenen o reducen la escisión APC (Amano 1998. Thromb. Haemost. 79:557-563), mutantes del Factor VIII que estabilizan aún más el dominio A2 (WO 97/40145), mutantes del Factor VIII que dan lugar a una mayor expresión (Swaroop et al. 1997. JBC 272:24121-24124), mutantes del Factor VIII que reducen su inmunogenicidad por intercambio de secuencias de aminoácidos (Lollar 1999. Thromb. Haemost. 82:505-508), Factor VIII reconstituido a partir de cadenas pesadas y ligeras expresadas de forma diferente (Oh et al. 1999.Exp.Mol. Med.
31:95-100), mutantes del Factor VIII que reducen la unión a receptores que conducen al catabolismo del Factor VIII como HSPG (proteoglicanos de heparán sulfato) y/o LRP (proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad) (Ananyeva et al. 2001. TCM, 11:251-257), variantes del Factor VIII estabilizadas por enlaces disulfuro (Gale et al., 2006. J. Thromb. Hemost. 4:1315-1322), mutantes del Factor VIII con propiedades de secreción mejoradas (Miao et al., 2004. Blood 103:3412-3419), mutantes del factor VIII con mayor actividad específica del cofactor (Wakabayashi et al., 2005. Biochemistry 44:10298-304), mutantes del Factor VIII con biosíntesis y secreción mejoradas, interacción reducida de la chaperona ER, transporte ER-Golgi mejorado, activación aumentada o resistencia a la inactivación y semivida mejorada (resumido por Pipe 2004. Sem. Thromb. Hemost. 30:227-237). También se han utilizado preparados farmacéuticos a base de Factor VIII porcino para tratar a pacientes. Todos estos mutantes y variantes del Factor VIII se incorporan aquí por referencia en su totalidad.
Una prueba adecuada para determinar la actividad biológica del Factor VIII es el ensayo de coagulación de una o dos etapas (Rizza et al. 1982. Ensayo de coagulación del Factor VIII:C y FIXa en Bloom ed., The Hemophilias. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992) o el ensayo sustrato cromogénico Factor VIII:C (S. Rosen, 1984. Scand J Immunol 33: 139-145). El contenido de estas referencias se incorpora aquí como referencia.
Sorprendentemente, ahora se ha encontrado mediante SE-HPLC analítica nativa que todas las preparaciones comerciales de tc-FVIII probadas contienen entre aproximadamente 0,9% (Refacto®) y aproximadamente 5% (Advate®) de FVIII-LC no asociado. Los FVIII-HC no asociados también pueden estar presentes en estas preparaciones. Por lo tanto, las preparaciones farmacéuticas de Refacto® representan el estado de la técnica más cercano.
Las preparaciones de factor VIII de la invención comprenden menos del 0,9% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,8% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,7% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,6% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,5% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,5% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,3% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,5% de FVIII-LC no asociados.5% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,4% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,3% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,2% de FVIII-LC no asociados, o menos del 0,1% de FVIII-LC no asociados. Lo más preferible es que las preparaciones de tc-FVIII de la invención estén esencialmente libres de FVIII-LC no asociados.
Menos del x% de FVIII-LC no asociados significa que menos del x% de FVIII-LC de todos los FVIII-LC en una preparación de Factor dada no están asociados.
El Factor VIII en las preparaciones de Factor VIII de la invención es preferentemente Factor VIII humano y puede ser Factor VIII de longitud completa de origen plasmático o recombinante o Factor VIII truncado de dominio B recombinante. "De origen plasmático" significa purificado a partir de plasma, preferentemente de plasma humano. "De origen recombinante" significa expresado por células huésped que han sido modificadas mediante tecnología recombinante para expresar Factor VIII. "Factor VIII truncado con dominio B": Factor VIII codificado por un ADNc que ha sido modificado de tal manera que no codifica un Factor VIII con un dominio B completo de tipo natural, sino sólo un fragmento más pequeño del dominio B o ningún dominio B.
La secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de la forma madura de tipo salvaje del Factor VIII de la coagulación sanguínea humana se muestran en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente. La referencia a una posición de aminoácido de una secuencia específica significa la posición de dicho aminoácido en la proteína de tipo salvaje del Factor VIII y no excluye la presencia de mutaciones, por ejemplo, deleciones, inserciones y/o sustituciones en otras posiciones de la secuencia referida. Por ejemplo, una mutación en "Glu2004" referida a SEQ ID NO:2 no excluye que en el homólogo modificado falten uno o más aminoácidos en las posiciones 1 a 2332 de SEQ ID NO:2.
La proteína recombinante del factor VIII, que se acumula en el medio de células secretoras de los tipos anteriores, se puede concentrar y purificar por una variedad de procedimientos bioquímicos y cromatográficos, incluyendo procedimientos que utilizan diferencias en el tamaño, la carga, la hidrofobicidad, la solubilidad, la afinidad específica, etc..
Un ejemplo de tal purificación es la adsorción de la proteína recombinante a un anticuerpo monoclonal, que se inmoviliza en un soporte sólido. Después de la desorción, la proteína se puede purificar aún más mediante una variedad de técnicas cromatográficas en base a las propiedades anteriores. El orden de las etapas de purificación se elige, por ejemplo, en función de la capacidad y selectividad de las etapas, la estabilidad del soporte u otros aspectos. Las etapas de purificación preferidas comprenden, por ejemplo, pero no se limitan a, etapas de cromatografía de intercambio iónico, etapas de cromatografía de afinidad inmune, etapas de cromatografía de afinidad, etapas de cromatografía de interacción hidrofóbica, etapas de cromatografía de colorantes y etapas de cromatografía de exclusión por tamaño.
Para minimizar el riesgo teórico de contaminaciones por virus, se pueden incluir etapas adicionales en el procedimiento que permitan la inactivación o eliminación efectiva de virus. Dichas etapas incluyen, por ejemplo, tratamiento térmico en estado líquido o sólido, tratamiento con disolventes y/o detergentes, radiación en el espectro visible o UV, radiación gamma y nanofiltración.
Los factores de coagulación descritos en esta invención pueden formularse en preparaciones farmacéuticas para uso terapéutico. La proteína purificada se puede disolveren soluciones reguladoras acuosas fisiológicamente compatibles convencionales a las que se pueden agregar, opcionalmente, excipientes farmacéuticos para proporcionar preparaciones farmacéuticas.
Tales portadores y excipientes farmacéuticos, así como las formulaciones farmacéuticas adecuadas, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) o "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3a edición, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)). En particular, la composición farmacéutica que comprende la variante de polipéptido de la invención se puede formular en forma soluble liofilizada o estable. La variante de polipéptido se puede liofilizar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyen antes de su uso mediante la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables, como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril.
Las formulaciones de la composición se administran al individuo mediante cualquier medio de administración farmacéuticamente adecuado. Se conocen diversos sistemas de suministro que pueden utilizarse para administrar la composición por cualquier vía conveniente. Preferentemente las composiciones de la invención se administran sistémicamente. Para el uso sistémico, las proteínas terapéuticas de la invención se formulan para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intrapulmonar, intranasal o transdérmica) o entérica (por ejemplo, oral, vaginal o rectal) de acuerdo con procedimientos convencionales. Las vías de administración más preferenciales son la administración intravenosa y subcutánea. Las formulaciones se pueden administrar de forma continua por infusión o por inyección en bolo. Algunas formulaciones abarcan sistemas de liberación lenta.
Las composiciones farmacéuticas pueden utilizarse para tratar afecciones médicas, preferentemente hemofilia A, en la que la hemofilia A puede ser hemofilia A congénita o hemofilia A adquirida. También se incluye el tratamiento de la hemofilia A con inhibidores, que comprende el tratamiento con dosis altas para inducir tolerancia a los anticuerpos inhibidores, también denominado terapia de tolerancia inmunitaria (ITT).
La composición farmacéutica de la invención se puede administrar sola o en combinación con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte de la misma composición farmacéutica. Un ejemplo de este tipo de agente es el factor von Willebrand.
Fabricación de preparaciones farmacéuticas de FVIII sin FVIII-LC no asociados
Para la fabricación de preparaciones farmacéuticas de Factor VIII libres de FVIII-LC no asociados, el tc-FVIII se aplica en una columna SE-HPLC o SEC y se eluye utilizando un eluyente adecuado para mantener las condiciones nativas a un pH fisiológico en condiciones isocráticas. Las resinas SEC adecuadas para la SEC preparativa a diferentes escalas de fabricación son, por ejemplo, Superdex 200®, Sephacryl S 200® (GE Healthcare) y otras conocidas por los expertos en la materia. Los FVIII-LC no asociados eluyen más tarde que el tc-FVIII asociado debido al menor peso molecular de la proteína. Por lo tanto, las fracciones de elución temprana están desprovistas de FVIII-LC no asociados. El pico de elución se fracciona y las fracciones recogidas se analizan con respecto a los FVIII-LC no asociados mediante SE-HPLC analítica utilizando un eluyente a pH fisiológico en condiciones isocráticas. Las fracciones libres de FVIII-LC no asociados se identifican por la ausencia de FVIII-LC no asociados. Para obtener preparaciones farmacéuticas de FVIII esencialmente exentas de FVIII-LC no asociados, las fracciones que han demostrado estar exentas de FVIII-LC no asociados pueden agruparse, intercambiarse con el tampón de formulación, ajustarse la actividad, filtrarse estérilmente y secarse por congelación.
Fabricación de preparaciones farmacéuticas de FVIII sin FVIII-HC no asociados
La detección de FVIII-HC no asociados en preparaciones de tc-FVIII se lleva a cabo utilizando una columna SE-HPLC analítica adecuada para la separación de FVIII-HC no asociados de FVIII-LC no asociados. Para obtener información sobre el intervalo de tiempo de retención de los FVIII-HC no asociados, se llevan a cabo experimentos de recuperación de picos utilizando preparaciones de tc-FVIII complementadas con FVIII-HC no asociados. Para obtener FVIII-HC no asociados, una preparación de tc-FVIII se somete a SE-HPLC o SEC utilizando una fase móvil suplementada con EDTA para la interrupción de la asociación metal-dependiente de los FVIII-HC y FVIII-LC. Los FVIII-HC liberados eluyen como un pico anterior a los FVIII-LC debido a su mayor peso molecular. El pico se fracciona y las fracciones recogidas se intercambian con un tampón fisiológico sin EDTA para eliminar el agente quelante. Las fracciones recogidas se analizan mediante SE-HPLC analítica para detectar la presencia de FVIII-HC no asociados. Las fracciones seleccionadas también pueden analizarse mediante RP-HPLC o secuenciación Edman para confirmar su identidad. Las fracciones que contienen únicamente FVIII-HC no asociados pueden emplearse para experimentos de recuperación de picos.
Para obtener preparaciones farmacéuticas de FVIII esencialmente libres de FVIII-HC no asociados, la preparación de tc-FVIII se aplica a una columna SE-HPLC o SEC y se eluye utilizando un eluyente a pH fisiológico en condiciones isocráticas. El analito se detecta con un detector de UV ajustado a una longitud de onda de 280 nm o utilizando un detector de fluorescencia con la longitud de onda de excitación ajustada a 280 nm y la detección de la emisión a 340 nm. El pico de elución se fracciona y las fracciones recogidas se analizan hacia los FVIII-HC no asociados mediante SE-HPLC analítica utilizando un eluyente a pH fisiológico en condiciones isocráticas y una columna adecuada para la separación de los FVIII-HC no asociados de los FVIII-LC.
Los FVIII-HC no asociados eluyen después del tc-FVIII y antes de los FVIII-LC no asociados. Para confirmar la identidad, las fracciones seleccionadas pueden complementarse con FVIII-HC no asociados. Las fracciones seleccionadas también pueden analizarse mediante RP-HPLC o secuenciación Edman para confirmar su identidad. Para obtener un Factor VIII farmacéutico esencialmente libre de FVIII-HC no asociados, las fracciones SE-HPLC o SEC, respectivamente, que carecen de FVIII-HC no asociados pueden agruparse, intercambiarse con el tampón de formulación, ajustarse a la actividad, filtrarse estérilmente y secarse por congelación.
Alternativamente para el análisis así como para la preparación, las fracciones recogidas se aplican individualmente sobre una columna analítica de cromatografía de inmunoafinidad (CAI) que consiste en un anticuerpo inmovilizado o molécula relacionada con anticuerpo dirigida contra los FVIII-LCs. Las moléculas heterodiméricas de tc-FVIII compuestas de FVIII-HC asociados y FVIII-LC se inmovilizan en la columna mediante la unión de los FVIII-LC al ligando de afinidad. Los FVIII-HC potencialmente no asociados no son retenidos en la columna y eluyen en la fracción de flujo. Las fracciones de flujo se analizan posteriormente mediante RP-HPLC en combinación con secuenciación Edman con fines de confirmación de identidad y para la detección de FVIII-HC no asociados. Para obtener una preparación farmacéutica de Factor VIII libre de FVIII-HC no asociados, las fracciones SE-HPLC o SEC, respectivamente, que carecen de FVIII-HC no asociados (como lo muestra la cromatografía IA en combinación con RP-HPLC y/o secuenciación Edman) pueden agruparse, intercambiarse con el tampón de formulación, ajustarse a la actividad, filtrarse estérilmente y secarse por congelación.
Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es un procedimiento que puede aplicarse para la purificación y/o análisis de proteínas en condiciones nativas. Dependiendo del tamaño de partícula de la resina de separación utilizada, el SEC se realiza como un SE-HPLC en el que se aplican partículas de resina más pequeñas y presiones más altas o como un SEC en el que se aplican partículas de resina más grandes y presiones más bajas o medias. Las resinas SEC adecuadas para fines preparativos son, por ejemplo, Superdex 200®, Sepahycryl S 200® (GE Healthcare) u otras conocidas por los expertos en la materia con un intervalo de MW adecuado. Las proteínas se separan en función de su tamaño, que a su vez se correlaciona con el peso molecular respectivo. La fase estacionaria utilizada para SE-HPLC o SEC, respectivamente, suele ser un soporte sólido poroso con una distribución definida del tamaño de los poros. El tamaño de los poros define qué moléculas pueden atravesar las partículas de la fase estacionaria y, por tanto, ser retenidas en la columna. Las moléculas grandes que no son capaces de difundirse en los poros eluyen antes, mientras que las moléculas más pequeñas quedan retenidas en la columna y eluyen en un intervalo de tiempo de retención superior. Los materiales de relleno típicos de las columnas son los soportes reticulados de dextrano, poliacrilamida y agarosa o las perlas de sílice porosa. El eluyente, también denominado fase móvil, suele ser un tampón que estabiliza la proteína en solución y, por lo general, no tiene un efecto directo en la separación del analito. El eluyente SEC suele estar compuesto de sales (por ejemplo, NaCl), agentes tamponadores (por ejemplo, histidina, Tris, HEPES, imidazol), aditivos tamponadores para la estabilización de la proteína (por ejemplo, Polisorbato 80, PEG) y, en algunos casos, aditivos del eluyente (por ejemplo, 2-propanol). Para el análisis de proteínas, el tampón suele ajustarse a un valor de pH fisiológico y el procedimiento se lleva a cabo en condiciones isocráticas. Dado que la proteína no interactúa directamente con la fase estacionaria y no se somete a condiciones de desnaturalización debido al uso de un tampón fisiológico y temperaturas moderadas, la cromatografía de exclusión por tamaño se considera un procedimiento nativo. En estas condiciones, las interacciones/asociaciones proteína-proteína no covalentes y los complejos proteicos no se ven afectados, a diferencia de los procedimientos de desnaturalización.
Cromatografía de inmunoafinidad
La cromatografía de inmunoafinidad representa una subcategoría de la cromatografía de afinidad que se basa en la interacción altamente específica de un anticuerpo o molécula relacionada con anticuerpos con el compuesto diana. Este tipo de cromatografía puede realizarse con fines preparativos o de análisis de un compuesto diana en condiciones nativas. Las moléculas que carecen de afinidad hacia el anticuerpo inmovilizado o la molécula relacionada con el anticuerpo no quedan retenidas en la columna, lo que convierte a la CAI en un procedimiento altamente específico para el análisis o la purificación del compuesto diana. El compuesto diana inmovilizado en la columna puede eluirse posteriormente utilizando tampones de elución adecuados.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ensayo cromogénico de la actividad del factor VIII
La actividad del Factor VIII se midió por su función fisiológica altamente específica en la activación del FX como cofactor del FIXa (según Ph. Eur.2.7.4. En presencia de calcio y fosfolípidos, el Factor X es activado por el Factor IXa a Factor Xa. Esta reacción es estimulada por el Factor Villa como cofactor. El Factor Villa se forma por bajas cantidades de trombina en la mezcla de reacción a partir del Factor VIII de la muestra a medir. El Factor X activado libera el cromóforo pNAdel sustrato cromogénico S-2765. La liberación de pNA, medida a 405 nm, es por tanto proporcional a la actividad del Factor VIII de la muestra. La actividad del Factor VIII de la coagulación se cuantificó por comparación directa con un preparado estándar con una actividad conocida del Factor VIII calibrada con el preparado de referencia actual de la OMS. El ensayo se llevó a cabo en un Behring Coagulation System (BCS, Siemens) que funcionaba según las instrucciones del fabricante y los protocolos establecidos.
Ejemplo 2: Secuenciación N-terminal (secuenciación Edman)
La secuencia N-terminal de los productos se determinó por escisión química sucesiva y derivatización de los aminoácidos N-terminales. A continuación, los aminoácidos derivados se separaron mediante RPC y se identificaron y cuantificaron por UV. Como resultado, se informó de la secuencia de los doce aminoácidos N-terminales presentes en el producto analizado. La secuenciación Edman se llevó a cabo en un secuenciador de proteínas Procise 492® (ABI) según el protocolo proporcionado por el fabricante. La identidad de los aminoácidos liberados y derivados se confirmó empleando una mezcla estándar de aminoácidos derivados de PTH disponible en el mercado.
Ejemplo 3: Ensayos analíticos SE-HPLC y análisis de diferentes productos de FVIII disponibles en el mercado
El análisis analítico por cromatografía líquida de exclusión por tamaño y alto rendimiento (SE-HPLC) de diferentes productos de FVIII disponibles comercialmente se llevó a cabo utilizando una columna SE-HPLC analítica (COSMOSIL 5Diol-300-II®, 600 mm x 7.5 mm, 300 A de tamaño de poro, 5 pm de tamaño de partícula, Nacalai Tesque) en combinación con una columna de guarda (SecurityGuard Guard Cartridge System®, GFC 3000, 4 mm x 3 ID mm, Phenomenex) y una fase móvil (300 mM NaCl, 20 mM HEPES, 10 mM CaCl2, 0,005% Polisorbato 80, 10% isopropanol) a pH neutro (7,0) en condiciones isocráticas en un instrumento System Gold (Beckman Coulter). El instrumento funcionó con un caudal de 500 pL/min y la columna a temperatura ambiente. Los analitos se detectaron utilizando un detector de fluorescencia (FLD) ajustado a una longitud de onda de excitación de 280 nm y detección de la emisión a 340 nm. La cuantificación relativa de FVIII-LC no asociado en productos BDD rFVIII (ReFacto AF@ (Pfizer) y Novo8® (Novo Nordisk)) se llevó a cabo en un instrumento HPLC Ultimate 3000 (Dionex Thermo Fisher) utilizando los parámetros del procedimiento descritos anteriormente.
Además, se utilizó una columna SE-HPLC alternativa (YARRA SEC-3000®, 300 mm x 7,8 mm, 290A de tamaño de poro, 3 pm de tamaño de partícula, Phenomenex) en combinación con una columna de guarda (SecurityGuard Guard Cartridge System®, GFC 3000, 4 mm x 3 ID mm, Phenomenex) y una fase móvil (300 mM NaCl, 20 mM HEPES, 10 mM CaCl2, 0,005% Polisorbato 80) en condiciones isocráticas en un instrumento System Gold HPLC (Beckman Coulter).005% Polisorbato 80) a pH neutro (7,0) en condiciones isocráticas en un instrumento System Gold HPLC (Beckman Coulter). El instrumento funcionó con un caudal de 300 pL/min y la columna a temperatura ambiente. Los analitos se detectaron utilizando un detector de fluorescencia (FLD) ajustado a una longitud de onda de excitación de 280 nm y detección de la emisión a 340 nm.
Ejemplo 4: Aislamiento preperativo de rFVIII libre de FVIII-LCs que no están asociados con FVIII-HCs (rFVIII de longitud completa (Advate®))
Se aplicó rFVIII de longitud completa (Advate®, 350-400 UI en columna en 100 pL) en una columna SE-HPLC (YARRA SEC-3000®, 300 mm x 7.8 mm, 290 A de tamaño de poro, 3 pm de tamaño de partícula, Phenomenex) en combinación con una columna de guarda (SecurityGuard Guard Cartridge System®, Security Guard Cartridge, GFC 3000, 4 mm x 3 ID mm, Phenomenex) y se eluyó utilizando una fase móvil (300 mM NaCl, 20 mM HEPES, 10 mM CaCh, 0,005% Polisorbato 80) a pH neutro (7,0) en condiciones isocráticas en un instrumento System Gold HPLC (Beckman Coulter). El instrumento funcionó con un caudal de 300 pL/min y la columna a temperatura ambiente. Los analitos se detectaron utilizando un detector de fluorescencia (FLD) ajustado a una longitud de onda de excitación de 280 nm y detección de la emisión a 340 nm. Se recogió una fracción de elución tardía (30,5 - 34 min) (Figura 2). Este procedimiento de fraccionamiento se llevó a cabo seis veces y las fracciones recogidas se agruparon. El grupo se sometió a secuenciación Edman para confirmar su identidad. Se pudieron identificar dos especies de proteínas basadas en la secuencia N-terminal por secuenciación Edman, ambas representando FVIII-LCs (Tabla 1). La fracción también puede analizarse por RP-HPLC para confirmar la identidad.
Tabla 1:Resultados de la secuenciación N-terminal de la fracción de elución tardía.
Después de confirmar que la fracción de elución tardía contiene FVIII-LC no asociados, se llevó a cabo una cuantificación relativa de los FVIII-LC separados en el análisis SE-HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Advate® comprende una cantidad aproximada del 5% de FVIII-LC no asociado, según la cuantificación relativa del material de partida no fraccionado.
Tabla 2:Resultados obtenidos para la cuantificación relativa de FVIII-LC no asociados observados durante la SE-HPLC preparativa de Advate®.
En un enfoque adicional se fraccionó Advate® siguiendo el protocolo establecido y se recogieron tres fracciones del pico de elución (Figura 3 y Tabla 3). El fraccionamiento se repitió cuatro veces y se juntaron fracciones idénticas 1, 2 y 3.
Tabla 3:Intervalos de tiempo de retención representativos de las fracciones respectivas.
Se analizaron estas tres fracciones para detectar la presencia de FVIII-LC no asociados, es decir, no asociados con su contraparte respectiva a través de una asociación dependiente del metal mediante SE-HPLC analítica (HPLC de exclusión por tamaño) utilizando una columna SE-HPLC analítica (YARRA SEC-3000®, 300 mm x 7.8 mm, 290 A de tamaño de poro, 3 pm de tamaño de partícula, Phenomenex) en combinación con una columna de guarda (SecurityGuard Guard Cartridge System®, GFC 3000, 4 mm x 3 ID mm, Phenomenex) y utilizando una fase móvil (300 mM NaCl, 20 mM HEPES, 10 mM CaCh, 0,005% Polisorbato 80) a pH neutro (7,0) en condiciones isocráticas en un instrumento System Gold HPLC (Beckman Coulter) (véase la figura 4). El instrumento funcionó con un caudal de 300 pL/min y la columna a temperatura ambiente. Las fracciones seleccionadas también pueden analizarse mediante RP-HPLC o secuenciación Edman para confirmar su identidad.
Se demostró mediante SE-HPLC analítica que las fracciones combinadas 1 estaban esencialmente libres de FVIII-LC no asociados, mientras que las fracciones combinadas 3 contenían predominantemente FVIII-LC no asociados.
Además, durante el análisis SE-HPLC de las fracciones combinadas 1 no se observan FVIII-LC no asociados recién formados, lo que confirma la estabilidad del complejo heterodimérico FVIII-LC/HC en el que los FVIII-LC están asociados con sus respectivas contrapartes FVIII-HC.
Se demostró que los FVIII-LC de la fracción 3 no estaban asociados con el FVIII- debido a las condiciones no desnaturalizantes aplicadas durante la SEC (SEC nativa).
Para obtener una preparación farmacéutica de Factor VIII esencialmente libre de FVIII-LC no asociados, las fracciones 1 de rFVIII combinadas pueden intercambiarse con tampón de formulación, ajustarse a la actividad, filtrarse estérilmente y secarse por congelación.
Ejemplo 5: Aislamiento preparativo de rFVIII libre de FVIII-LC no asociados (BDD rFVIII (ReFacto AF®))
Se aplicó BDD rFVIII (ReFacto AF®, 525 UI en columna en 70 pL) en una columna SE-HPLC (YARRA SEC-3000®, 300 mm x 7.8 mm, 290 A de tamaño de poro, 3 pm de tamaño de partícula, Phenomenex) en combinación con una columna de guarda (SecurityGuard Guard Cartridge System®, GFC 3000, 4 mm x 3 ID mm, Phenomenex) y se eluyó utilizando una fase móvil (300 mM NaCl, 20 mM HEp Es , 10 mM CaCh, 0,005% Polisorbato 80) a pH neutro (7,0) en condiciones isocráticas en un instrumento System Gold HPLC (Beckman Coulter). El instrumento funcionó con un caudal de 300 pL/min y la columna a temperatura ambiente. Los analitos se detectaron utilizando un detector de fluorescencia (FLD) ajustado a una longitud de onda de excitación de 280 nm y detección de la emisión a 340 nm. Se recogieron cinco fracciones del pico de elución (Figura 5 y Tabla 4).
Table 4:Intervalos de tiempo de retención de las fracciones respectivas.
El fraccionamiento se repitió seis veces y se juntaron fracciones idénticas 1 a 5. Las fracciones recogidas se analizaron para detectar la presencia de FVIII-LC no asociado mediante SE-HPLC analítica utilizando una columna SE-HPLC analítica (YARRA SEC-3000®, 300 mm x 7.8 mm, 290 A de tamaño de poro, tamaño de partícula 3pm, Phenomenex) en combinación con una columna de guarda (SecurityGuard Guard Cartridge System®, GFC 3000, 4 mm x 3 ID mm, Phenomenex) y se eluyó utilizando una fase móvil (300 mM NaCl, 20 mM HE<p>E<s>, 10 mM CaCh, 0,005% Polisorbato 80) a pH neutro (7,0) en condiciones isocráticas en un instrumento System Gold HPLC (Beckman Coulter) (véase la Figura 6). El instrumento funcionó con un caudal de 300 pL/min y la columna a temperatura ambiente. Las fracciones seleccionadas también pueden analizarse mediante RP-HPLC o secuenciación Edman para confirmar su identidad.
Las fracciones combinadas 3 contenían un heterodímero estable de tc-FVIII y se demostró mediante SE-HPLC analítica que estaban esencialmente libres de FVIII-LCs que no está asociado con FVIII-HCs. Durante el análisis SE-HPLC de las fracciones combinadas 3 no se observan FVIII-LC no asociados recién formados, lo que confirma la estabilidad del complejo heterodimérico FVIII-LC/HC en el que los FVIII-LC están asociados con sus respectivos homólogos FVIII-HC.
En contraste, las fracciones combinadas 5 comprenden FVIII-LCs que no están asociadas con FVIII-HCs (a appr. 31.5 min) y otro pico a aproximadamente 30,5 min que contiene tc-FVIII. Los FVIII-LCs en la Fracción 5 a 31.5 min no estaban asociados con los FVIII-HCs debido a las condiciones no desnaturalizantes aplicadas durante la SE-HPLC (SE-HPLC nativa). Además, se llevó a cabo una cuantificación relativa de los FVIII-LC no asociados observados durante el análisis SEC de ReFacto AF® en un sistema Ultimate 3000 (véase el Ejemplo 3) utilizando material no fraccionado. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Para obtener una preparación farmacéutica de Factor VIII esencialmente libre de FVIII-LC no asociados, las fracciones 3 de rFVIII combinadas pueden intercambiarse con tampón de formulación, ajustarse a la actividad, filtrarse estérilmente y secarse por congelación.
Table 5:Resultados obtenidos para la cuantificación relativa de FVIII-LC no asociados observados durante el análisis SE-HPLC de ReFacto AF®.
Ejemplo 6: Aislamiento preparativo de rFVIII libre de FVIII-LC no asociado utilizando una columna Superdex® SEC
Se aplicó rFVIII de dominio B suprimido (BDD) (ReFacto AF®, 1200 UI en columna en 400<j>L) en una columna Superdex SEC (Superdex® 20010/300 GL, 300 mm x 10 mm, 24 mL de volumen de lecho, tamaño medio de partícula 13 jm , GE Healthcare) y se eluyó utilizando una fase móvil (300 mM NaCl, 20 mM HEPES, 10 mM CaCh, 0.005% Polisorbato 80) a pH neutro (7,0) en condiciones isocráticas en un sistema de cromatografía ICS-3000 (Dionex Thermo Fisher). El instrumento funcionó con un caudal de 300 jL/min y la columna a temperatura ambiente. Los analitos se detectaron utilizando un detector UV (VWD) ajustado a 280 nm. El rFVIII BDD se aplicó en un volumen de aproximadamente el 2% del volumen de la columna (400<j>L). Las fracciones del pico de elución se recogieron y agruparon según el esquema descrito en la Tabla 6.
Las fracciones agrupadas se analizaron para la actividad cromogénica del sustrato FVIII utilizando un BCS según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 7. Se descubrió que los grupos 2-4 comprendían la mayor parte de la actividad del FVIII, con aproximadamente el 86,1% de la actividad del FVIII aplicada a la columna o el 90,8% de la actividad del FVIII:CS recuperada en todas las fracciones. Estos grupos/fracciones relevantes también se analizaron mediante SE-HPLC analítica para detectar la presencia de FVIII-LC no asociados. Este análisis SE-HPLC se llevó a cabo utilizando una columna SE-HPLC analítica (COSMOSIL 5Diol-300-II®, 600 mm x 7,5 mm, 300 A de tamaño de poro, 5 jm de tamaño de partícula, Nacalai Tesque) en combinación con una columna de guarda (SecurityGuard Guard Cartridge System®, g Fc 3000, 4 mm x 3 ID mm, Phenomenex) y una fase móvil (300 mM NaCl, 20 mM HEPES, 10 mM CaCh, 0,005% Polisorbato 80, 10% isopropanol) a pH neutro (7,0) en un instrumento System Gold HPLC (Beckman Coulter).005% Polisorbato 80, 10% isopropanol) a pH neutro (7,0) en condiciones isocráticas en un instrumento System Gold HPLC (Beckman Coulter). El instrumento funcionó con un caudal de 500 jL/min y la columna a temperatura ambiente. Los analitos se detectaron utilizando un detector de fluorescencia (FLD) ajustado a una longitud de onda de excitación de 280 nm y detección de la emisión a 340 nm (Figuras 7a-d). El análisis de las fracciones combinadas 2-4 mediante SE-HPLC analítica demostró que las preparaciones de FVIII en los grupos 2-4 estaban esencialmente libres de FVIII-LC no asociados, mientras que el grupo 5 contenía FVIII-LC no asociados. Además, durante el análisis SE-HPLC de los grupos 2-4 no se observan FVIII-LC no asociados recién formados, lo que confirma la estabilidad del complejo heterodimérico FVIII-LC/HC en el que los FVIII-LC están asociados con sus homólogos respectivos FVIII-HC.
Las fracciones seleccionadas también pueden analizarse por RP-HPLC o secuenciación Edman para confirmar la identidad.
Para obtener una preparación farmacéutica de Factor FVIII esencialmente libre de FVIII-LC, las fracciones combinadas de rFVIII de los grupos 2 a 4 pueden intercambiarse con tampón de formulación, ajustarse a la actividad, filtrarse estérilmente y secarse por congelación.
Tabla6: Esquema de fraccionamiento y agrupación de BDD rFVIII separado en
una columna Superdex®200 SEC.
Tabla 7:Visión general de la actividad del sustrato cromogénico FVIII determinada para las fracciones/grupos recogidos.
Ejemplo 7: Determinación de FVIII-LC no asociados en NovoEight® (Novo Nordisk)
La cuantificación relativa de FVIII-LC no asociado en NovoEight® (presentación de 500 UI, Novo Nordisk) se llevó a cabo en un instrumento HPLC Ultímate 3000 (Dionex Thermo Fisher) utilizando una columna SE-HPLC analítica (COSMOSIL5Diol-300-II®, 600 mm x 7.5 mm, 300 A de tamaño de poro, 5 pm de tamaño de partícula, Nacalai Tesque) en combinación con una columna de guarda (SecurityGuard Guard CartridgeSystem®, GFC 3000, 4 mm x 3 ID mm, Phenomenex) y una fase móvil (300 mM NaCl, 20 mM HEPES, 10 mMCaCh, 0,005% Polisorbato 80, 10% isopropanol) a pH neutro (7,0) en condiciones isocráticas. El instrumento funcionó con un caudal de 500 pL/min y la columna a temperatura ambiente. Los analitos se detectaron utilizando un detector de fluorescencia (FLD) ajustado a una longitud de onda de excitación de 280 nm y detección de la emisión a 340 nm. Se determinó que la cantidad de FVIII-LC no asociados era del 1,6-1,7%.
Ejemplo 8: Fabricación de preparaciones farmacéuticas de Factor VIII libres de FVIII-HC no asociados
Para la fabricación de preparaciones farmacéuticas de Factor VIII libres de FVIII-HC no asociados, el tc-FVIII se aplica en una columna SEC (por ejemplo, Superdex® 20010/300 GL, 300 mm x 10 mm, 24 mL de volumen de lecho, tamaño medio de partícula de 13 pm, Ge Healthcare, COSMOSIL 5Diol-300-II®, 600 mm x 7.5 mm, tamaño de partícula de 300 A, Nacalai Tesque, YARRA SEC-3000®, 300 mm x 7.8 mm, tamaño de partícula de 290 A, tamaño de partícula de 3 pm, Nacalai Tesque).5 mm, 300 A de tamaño de poro, 5 pm de tamaño de partícula, Nacalai Tesque, YARRA SEC-3000®, 300 mm x 7,8 mm, 290 A de tamaño de poro, 3 pm de tamaño de partícula, Phenomenex; u otras resinas SEC o SE-HPLC de grado preparatorio adecuadas y eluidas utilizando un eluyente adecuado para mantener las condiciones nativas a un pH fisiológico en condiciones isocráticas. Los analitos se detectan con un detector de UV ajustado a una longitud de onda de 280 nm o utilizando un detector de fluorescencia con la longitud de onda de excitación ajustada a 280 nm y la detección de la emisión a 340 nm. El pico de elución se fracciona y las fracciones recogidas se analizan en relación con los FVIII-HC no asociados.
Para ello, las fracciones recogidas se aplican individualmente en una columna analítica de cromatografía de inmunoafinidad (CAI) que consiste en un anticuerpo inmovilizado o una molécula relacionada con anticuerpos dirigida contra los FVIII-LC. Las moléculas heterodiméricas de tc-FVIII compuestas de FVIII-HC asociados y FVIII-LC se inmovilizan en la columna mediante la unión de los FVIII-LC al ligando de afinidad. Los FVIII-HC potencialmente no asociados no son retenidos en la columna y eluyen en la fracción de flujo. Las fracciones de flujo se analizan posteriormente mediante RP-HPLC en combinación con secuenciación Edman con fines de confirmación de identidad y para la detección de FVIII-HC no asociados. Las fracciones recogidas también pueden analizarse mediante SE-HPLC analítica para detectar la presencia de FVIII-HC no asociados. Para obtener una preparación farmacéutica de Factor VIII libre de FVIII-HC no asociados, las fracciones SEC que carecen de FVIII-HC no asociados (como lo demuestra la cromatografía IAen combinación con RP-HPLC y/o secuenciación Edman) pueden intercambiarse con tampón de formulación, ajustarse a la actividad, filtrarse estérilmente y secarse por congelación.
Claims (11)
1. Preparación farmacéutica que comprende factor VIII de dos cadenas (tc-FVIII) en la que menos del 0,9%de todos los FVIII-LC dentro de dicha preparación no están asociados con FVIII-HC, en la que FVIII-LC no asociados significan FVIII-LC que no forman parte de un heterodímero estable con FVIII-HC y cuyos FVIII-LC no asociados, por lo tanto, no eluirán como parte de un heterodímero en una cromatografía de exclusión por tamaño nativo sino más bien como monómeros de FVIII-LC no asociados, obtenibles mediante una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en la que un tc-FVIII es i) aplicado sobre una columna SE-HPLC o SEC y eluido utilizando un eluyente adecuado para mantener las condiciones nativas a un pH fisiológico en condiciones isocráticas, ii) los picos de elución temprana se fraccionan y iii) las fracciones recogidas se analizan en relación con los FVIII-LC no asociados mediante SE-HPLC analítica utilizando un eluyente a pH fisiológico en condiciones isocráticas, iv) las fracciones libres de FVIII-LC no asociados se identifican por la falta de FVIII-LC no asociados y, opcionalmente, se agrupan, se intercambian con tampón portampón de formulación, se ajusta la actividad, se filtran estérilmente y se secan por congelación.
2. Preparación farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el tc-FVIII es un Factor VIII de longitud completa.
3. Preparación farmacéutica según las reivindicaciones 1 a 2, en la que el tc-FVIII es un Factor VIII de longitud completa de origen plasmático.
4. Preparación farmacéutica según las reivindicaciones 1 a 2, en la que el tc-FVIII es un Factor VIII de longitud completa de origen recombinante.
5. Preparación farmacéutica según las reivindicaciones 3 a 4, en la que el peso molecular de los FVIII-LC no asociados es de aproximadamente 70 a 125 kDa.
6. Preparación farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el tc-FVIII es un Factor VIII truncado de dominio B.
7. Preparación farmacéutica según la reivindicación 6, en la que el peso molecular de los FVIII-LC no asociados es de aproximadamente 70 a 125 kDa.
8. Preparación farmacéutica según las reivindicaciones 1 a 7, en la que la preparación farmacéutica es menos inmunogénica en comparación con una preparación farmacéutica que comprende tc-FVIII, en la que el 0,9 % o más de todos los FVIII-LC dentro de dicha preparación no están asociados con FVIII-HC en la que FVIII-LC no asociados significa FVIII-LC que no son parte de un heterodímero estable con FVIII-HC y que, por lo tanto, FVIII-LC no asociados no eluirán como parte de un heterodímero en una cromatografía de exclusión por tamaño nativa sino más bien como monómeros de FVIII-LC no asociados..
9. Preparación farmacéutica según las reivindicaciones 1 a 8, en la que el Factor VIII es Factor VIII humano.
10. Preparación farmacéutica según las reivindicaciones 1 a 9 para uso en medicina..
11. Preparación farmacéutica según la reivindicación 1 a 10 para su uso en el tratamiento de la hemofilia A.
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