ES2961976T3

ES2961976T3 - Métodos para modular selectivamente la actividad de distintos subtipos de células

Info

Publication number: ES2961976T3
Application number: ES17720053T
Authority: ES
Inventors: Fejoz Caroline Costa; Els Verhoeyen; François-Loïc Cosset; Ruben Bender; Christian Buchholz; Qi Zhou
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Ecole Normale Superieure de Lyon
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Ecole Normale Superieure de Lyon
Priority date: 2016-04-21
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2024-03-14
Anticipated expiration: 2037-04-20
Also published as: EA201892369A1; EP3235908A1; JP2022087199A; AU2017253364A1; JP2019514373A; CN117126817A; WO2017182585A1; EP3445862B1; SG11201809164TA; JP2021184767A; ZA201807161B; BR112018071584A2; EP4151737A8; MX2018012814A; EP3445862A1; AU2020203813A1; CN109642243A; US20190144885A1; AU2020203813B2; IL262458A

Abstract

La presente invención se refiere a partículas similares a retrovirus pseudotipadas o vectores retrovirales que comprenden glicoproteínas de envoltura diseñadas derivadas de un virus de la familia Paramyxoviridae fusionadas a un dominio de direccionamiento celular y fusionadas a un dominio funcional. La presente invención también se refiere al uso de dichas partículas pseudotipadas similares a retrovirus o vectores retrovirales para modular selectivamente la actividad de subconjuntos específicos de células, en particular de células inmunitarias específicas. Estas partículas pseudotipadas similares a retrovirus o vectores retrovirales son particularmente útiles para terapia génica, terapia inmune y/o vacunación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para modular selectivamente la actividad de distintos subtipos de células

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para modular selectivamente la actividad de distintos subtipos de células.

Antecedentes

Las células del sistema inmunitario participan en muchos tipos de enfermedades. Por lo tanto, muchas estrategias terapéuticas se centran en potenciar o reducir su actividad. Muchos tipos de células inmunitarias con funciones muy distintas pueden distinguirse por la expresión de determinadas proteínas de la superficie celular. Hasta el momento no existe ninguna tecnología disponible que permita la activación o desactivación selectiva de únicamente un subtipo celular específico, especialmentein vivo.

El uso de citocinas para inducir o promover la generación de una respuesta inmunitaria deseable es un enfoque atractivo en la inmunoterapia contra el cáncer. Las citocinas se utilizan normalmente como sustancias auxiliares inespecíficas para ayudar a otras inmunoterapias o se administran además de la quimioterapia. No obstante, hasta ahora, los tratamientos basados en citocinas rara vez se utilizan, a causa de su toxicidad sistémica no resuelta. Además de esto, las citocinas generalmente se aplican de forma sistémica, atacando de este modo a todos los tipos celulares que expresen el receptor de citocinas relevante. Por lo tanto, no es posible una modulación precisa en el sitio relevante de la enfermedad.

Para superar este inconveniente, las citocinas pueden fusionarse con un anticuerpo antitumoral o conectarse a micro o nanopartículas con un anticuerpo antitumoral, dirigiendo de este modo las citocinas al tumor y reduciendo los efectos secundarios sistémicos. Sin embargo, estas proteínas de fusión o partículas cargadas de citocinas-anticuerpos son menos estables y se eliminan rápidamentein vivo,lo que lleva a una concentración relativamente baja de citocinas en los sitios de la enfermedad. Además, la liberación de citocinas por partículas cargadas de citocinas-anticuerpos depende del pH. Asimismo, las citocinas (tales como la IL-2) administradas al tumor mediante estos enfoques anteriores estimulan de forma no selectiva diversos tipos de diferentes células inmunitarias en el complicado microambiente tumoral, incluidas células inmunitarias efectivas y supresoras, limitando así sus aplicaciones para el tratamiento del cáncer.

En cuanto a la terapia génica, las células diana importantes, tales como los linfocitos T humanos en reposo, los linfocitos B y las CMH (células madre hematopoyéticas) son resistentes a la transducción con vectores lentivíricos. La transducción mediada por VSV-LV convencional se produce solo cuando se han activado los linfocitos T. En los ensayos de terapia génica realizados hasta la fecha, Los linfocitos T se han activado a través de receptores de antígenos afines, que generalmente inducen cambios fenotípicos y funcionales en los linfocitos T y finalmente conducen a una menor persistencia de los linfocitos T y un efecto antitumoralin vivo.

Para promover la transferencia génica en linfocitos T en reposo, se han generado varios vectores lentivíricos quiméricos. Por ejemplo, Verhoeyenet al.(Blood, 2003, vol. 101, n.° 6) desvelan vectores seudotipificados procedentes del VIH con dos tipos de glucoproteínas de la envoltura: una glucoproteína (gp) quimérica de la envoltura del VLMu(virus de la leucemia murina)fusionada en el extremo N con IL-7 y VSV-G(glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular).Estas partículas del vector de IL-7 pueden transducir eficientemente los linfocitos T en reposo e inducir la activación de los linfocitos T, pero, del mismo modo, transducen linfocitos T CD4+ y CD8+. Por lo tanto, no pueden diferenciar entre los diferentes subconjuntos de linfocitos T. Asimismo, el hecho de que sea necesaria una gp de envoltura no dirigida, tal como la gp VSV-G, posiblemente permita la transducción de células hematopoyéticas o endoteliales no deseadas. Una excepción son los vectores lentivíricos seudotipificados de glucoproteínas del virus del sarampión (VS) (MV-LV). El MV-LV puede mediar en la transducción de linfocitos T en reposo sin cambiar el estado del ciclo celular G0/G1a. Zhouet al.(J Immunol, 2015, vol. 195, n.° 5) también desvelan que el LV dirigido a CD4 puede transducir linfocitos T en reposo recién aislados, pero con una eficiencia muy baja (menos del 10 %) a dosis altas de partículas.

Por último, las estrategias actuales para generar linfocitos T específicos de tumores menos diferenciados para la terapia adoptiva con linfocitos T se basan en la optimización del protocolo de estimulación y cultivo de linfocitos T. Por ejemplo, para producir más linfocitos T<scm>(linfocitos T de memoria madre)o linfocitos T<cm>(linfocitos T de memoria central),se utilizan combinaciones de IL-15 e IL-7 o IL-21 e IL-7 para la estimulación y expansión de los linfocitos T. Este sistema de cultivo es muy costoso, ya que se requiere un reabastecimiento rutinario de citocinas (cada dos días). A continuación, se implementan, en general, varios pasos de clasificación de células para obtener los tipos celulares deseables.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de proporcionar métodos para modular selectiva y eficientemente la actividad de distintos subtipos de células inmunitarias.

Descripción de la invención

Los inventores han descubierto sorprendentemente que es posible modular selectivamente la actividad de distintos subtipos de células inmunitarias mediante el uso de partículas seudotipificadas de tipo retrovírico o vectores retrovíricos (por ejemplo, partículas de tipo lentivírico (PVL) o vectores lentivíricos (LV)) que portan tanto un dominio de direccionamiento específico de célula (por ejemplo, específico para linfocitos T CD4+ o para linfocitos T CD8+) y un dominio funcional, por ejemplo, una citocina, cada uno de ellos fusionado a una glucoproteína de un virus de la familia Paramyxoviridae. Dichos vectores retrovíricos también administran de manera específica y eficiente un gen empaquetado a las células diana.

De hecho, se descubrió inesperadamente que la combinación de un dominio funcional con un dominio de direccionamiento específico de célula en partículas seudotipificadas de tipo retrovírico o vectores retrovíricos mejoraba en gran medida la modulación selectiva de la actividad de los subtipos diana de células inmunitarias en comparación con las partículas o los vectores correspondientes que comprenden solo el dominio de direccionamiento específico de célula.

Por ejemplo, los inventores han mostrado que las partículas dirigidas a linfocitos T que presentan citocinas estimulantes activan selectivamente los subconjuntos de linfocitos T diana en cultivos de tipos celulares mixtos ein vivoen un modelo de ratón con sistema sanguíneo humano y también administran el gen empaquetado al subtipo de linfocitos T diana, sin necesidad de condiciones de cultivo estimulantes. Las partículas dirigidas a CD4 que presentan IL-7 (interleucina-7) basadas en glucoproteínas de VS (virus del sarampión) (4h/IL7h-VLP) efectivamente activan y promueven de forma de forma específica la supervivencia de las células CD4+ primarias cultivadas, mientras que las partículas dirigidas a CD8 que presentan IL7 basadas en glucoproteínas del VNi (virus de Nipah) (8G/IL7G-VLP) activan y promueven de forma selectiva la supervivencia de los linfocitos T CD8+. Además de esto, la 4h/IL7h-LV administra de manera eficiente y específica transgenes de GFP a linfocitos T CD4+ en la mezcla celular, de una manera dependiente de la dosis. En comparación con la LV parental dirigida a CD4 (que no presenta conjuntamente IL-7), la 4h/IL7h-LV es más eficiente en la administración selectiva del transgén terapéutico de ErbB2CAR a linfocitos T CD4+ en reposo. También se ha observado una transferencia genética exclusiva similar y estimulación de los linfocitos T CD8+ con los vectores lentivíricos seudotipificados con glucoproteína de VNi que presentan de forma conjunta CD8/IL-7 (8G/IL7G-LV). Efectivamente, la 8G/IL7G-LV es más eficiente en la activación selectiva de linfocitos T CD8+ y en la administración de genes dirigidos que 8G-LV (ver ejemplos).

La partícula de tipo retrovírico y el vector retrovírico según la invención presentan muchas ventajas, tales como:

- proporcionar una alta concentración local de citocinas en los sitios diana de las células, mejorando de este modo la eficiencia y previniendo efectos secundarios graves de la terapia con citocinas,

- proporcionar una estimulación más estable y constante de las células diana en comparación con las citocinas solubles, mejorando de este modo la eficiencia de la terapia con citocinas,

- proporcionar un sistema muy flexible que permite combinar diferentes tipos de citocinas y diferentes tipos de dominios de direccionamiento en una sola partícula o vector retrovírico,

- permitir el acoplamiento de la estimulación celular con la transferencia de genes específicos de la célulain vitrooin vivo,lo que da lugar a una transducción más eficiente de los subconjuntos específicos de linfocitos T en reposo, - permitir el acoplamiento de la inducción de un fenotipo de linfocitos T con la transferencia de genesin vitrooin vivo,debido a la interacción con las citocinas presentadas en la superficie de la partícula o del vector, controlándose la diferenciación de las células transducidas y, de manera más general:

- permitir la administración de material biológico y/o fármaco(s) terapéutico(s), incluyendo, pero sin limitación, genes, ARNm, ARNhc, microARN, péptido, proteína, fragmento de proteína y sus combinaciones con células específicas o un subconjunto de células,in vitrooin vivo,

- permitir un proceso de fabricación de células más sencillo (por ejemplo, un proceso de fabricación de linfocitos T o células hematopoyéticas) para la terapia adoptiva,

- prevenir problemas de resistenciain vivocuando se utilizan partículas de tipo retrovírico o vectores retrovíricos seudotipificados con glucoproteínas del virus de Nipah, gracias a los bajos anticuerpos preexistentes en los seres humanos.

Por tanto, la presente invención se refiere a una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o a un vector retrovírico que comprende:

a) al menos una proteína de fusión de direccionamiento celular que comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10;

b) al menos una proteína de fusión moduladora que comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; y

c) al menos una glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y que comprende una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID n O: 11 o la Se Q ID NO: 12.

Dicho virus de la familia Paramyxoviridae puede ser un virus del géneroMorbillivirus,por ejemplo, seleccionado del grupo formado por el virus del sarampión (VS), virus del moquillo, morbilivirus de cetáceos, virus de la peste de los pequeños rumiantes, el virus del moquillo de las focas y el virus de la peste bovina, o un virus del géneroHenipavirus,por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en el virus de Nipah (VNi), el virus Cedar y el virus Hendra.

La proteína de a) y/o b) comprende preferentemente al menos dos mutaciones en comparación con la secuencia de dicha glucoproteína G o H de la envoltura, dando dichas al menos dos mutaciones lugar a la incapacidad al menos parcial de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G o H de la envoltura.

Las células diana pueden seleccionarse del grupo que consiste en células del sistema hematopoyético (incluidos linfocitos T, linfocitos B, monocitos, linfocitos Th1, linfocitos Th2, linfocitos Treg, mastocitos, células dendríticas (CD), linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T citolíticos naturales (NKT), macrófagos, células madre hematopoyéticas, células progenitoras T y/o B, eritroblastos, plaquetas y/o neutrófilos), células del estroma, células endoteliales, células hepáticas, miocitos, células del sistema nervioso, células enfermas y sus combinaciones.

La presente invención también se refiere al usoin vitrooex vivode una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico como se ha definido anteriormente, para modular de forma selectiva la actividad de las células diana y/o transducir de forma selectiva las células diana, siendo las células diana, por ejemplo, las definidas anteriormente.

La presente invención también se refiere a un métodoin vitrooex vivopara modular de forma selectiva la actividad de la células diana y/o transducir de forma selectiva las células diana, en donde dicho método comprende poner en contacto una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico como se ha definido anteriormente con células que comprenden dichas células diana, siendo las células diana, por ejemplo, las definidas anteriormente.

La presente invención también se refiere a una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o a un vector retrovírico como se define en las reivindicaciones para su uso como medicamento, preferentemente en inmunoterapia, terapia génica y/o vacunación, por ejemplo, en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad inmunitaria (por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria), cáncer, enfermedad genética, enfermedad alérgica, enfermedad inflamatoria, enfermedad infecciosa, enfermedad metabólica, enfermedad neurológica (por ejemplo, distrofia neuronal, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer), enfermedad muscular y sus combinaciones.

La presente invención también se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular y una secuencia que codifica una proteína de fusión moduladora, en donde:

(a) dicha proteína de fusión de direccionamiento celular comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado del grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, y

(b) dicha proteína de fusión moduladora comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis o una combinación de los mismos

en donde cada proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae en (a) y (b) de forma independiente:

(i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae;

(ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

La presente invención también se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones.

La presente invención también se refiere a un método para producir una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico como se define en las reivindicaciones, en donde dicho método comprende cotransfectar una línea celular de empaquetamiento con:

(a) al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular, comprendiendo dicha proteína de fusión de direccionamiento celular (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10;

(b) al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión moduladora, comprendiendo dicha proteína de fusión moduladora (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10,

(c) al menos un ácido nucleico que codifica una glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y que comprende una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12,

(d) al menos un vector que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas centrales de dicho retrovirus.

El método puede comprender además cotransfectar la línea celular de empaquetamiento con al menos un vector que comprende un genoma de origen retrovírico competente para empaquetamiento.

La presente invención también proporciona una línea celular de empaquetamiento, que comprende:

(a) al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular, comprendiendo dicha proteína de fusión de direccionamiento celular (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado del grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10;

(b) al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión moduladora, comprendiendo dicha proteína de fusión moduladora (i) una proteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre un citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10;

(c) al menos un ácido nucleico que codifica una glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y que comprende una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12 y

Partícula de tipo retrovírico seudotipificada o vector retrovírico

Una "partícula de tipo retrovírico" como se usa en el presente documento se refiere a una partícula que comprende las proteínas retrovíricas Gag, Pol y Env (envoltura), pero que no comprende ninguna información genética procedente de retrovirus.

Las proteínas Gag, Pol y Env proceden del retrovirus y se proporcionan entransmediante una línea celular de empaquetamiento.

Como se usa en el presente documento, un "vector retrovírico" comprende las proteínas Gag, Pol y Env (envoltura) y una molécula de a Rn . Dicha molécula de ARN no contiene ningún gen gag, env o pol, pero comprende el elemento psi y las RTL que son necesarias para el empaquetamiento eficaz de la molécula de ARN en las partículas resultantes. Dicha molécula de ARN puede comprender además un gen de interés que está bajo el control de un promotor adecuado y, por tanto, se expresa tras la integración de dicho gen en el genoma de la célula hospedadora o diana.

Una partícula de tipo retrovírico o un vector retrovírico es una partícula tipo vírico o un vector vírico, respectivamente, cuyas proteínas centrales, es decir, las proteínas codificadas por los genes Gag y Pol, proceden de un retrovirus.

Por el término "retrovirus", se entiende en el presente documento un virus cuyo genoma consiste en una molécula de ARN y que comprende una transcriptasa inversa.

Un retrovirus es un miembro de la familiaRetroviridae.El retrovirus puede ser un oncovirus, lentivirus o espumavirus.

El oncovirus puede ser un alfarretrovirus, un betarretrovirus, un deltarretrovirus, un epsilonretrovirus o un gammarretrovirus.

Cuando el retrovirus es un oncovirus, dicho retrovirus puede ser VLMu (virus de la leucemia murina), VSA (virus del sarcoma aviar), virus de la leucemia felina, virus de la leucemia bovina, VSR (virus del sarcoma de Rous), MPMV (virus del mono Mason-Pfizer), HTLV I (virus de la leucemia de linfocitos T humano-I) o HTLV II (virus de la leucemia de linfocitos T humano-II).

Cuando el retrovirus es un lentivirus, dicho retrovirus puede ser VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), preferentemente VIH-1 o VIH-2, VIS (virus de la inmunodeficiencia de los simios), VAIE (virus de la anemia infecciosa equina), VIF (virus de la inmunodeficiencia felina) o VAEC (virus de la artritis-encefalitis caprina).

Cuando el retrovirus es un espumavirus, dicho retrovirus puede ser HFV (espumavirus humano).

Por ejemplo, el vector retrovírico puede ser un vector lentivírico, un vector alfa retrovírico, un vector retrovírico murino o un vector de VIF.

Los genomas de estos retrovirus están fácilmente disponibles en bases de datos de genes.

En una realización preferida, dicho retrovirus es un lentivirus, más preferentemente VIH, tal como VIH-1 o VIH-2.

Por tanto, la presente invención se refiere preferentemente a una partícula de tipo lentivírico (LVP) o a un vector lentivírico (LV), preferentemente una LVP o un LV procedente de VIH.

El término "seudotipificado" en la expresión "partícula de tipo retrovírico o vector retrovírico seudotipificado" en el presente documento significa que la partícula de tipo retrovírico o el vector retrovírico porta glucoproteínas de la envoltura que proceden de al menos otro virus distinto de dicho retrovirus y/o que son glucoproteínas de la envoltura modificadas genéticamente, por ejemplo, glucoproteínas de la envoltura quiméricas y/o mutadas.

La partícula de tipo retrovírico o el vector retrovírico según la invención se seudotipifica, por ejemplo, con glucoproteínas modificadas genéticamente procedentes de un virus de la familia Paramyxoviridae, preferentemente de un virus del géneroMorbilliviruso de las glucoproteínas del géneroHenipavirus,tal como se detalla a continuación.

Glucoproteínas de la envoltura de la familia Paramyxoviridae

Las glucoproteínas de la envoltura modificadas utilizadas para la seudotipificación de la partícula de tipo retrovírico o del vector retrovírico según la invención proceden de las glucoproteínas G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (i) comprenden al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

El virus de la familia Paramyxoviridae es preferentemente un virus del géneroMorbilliviruso del géneroHenipavirus.

Los virus del géneroMorbillivirusy del géneroHenipavirusutilizan dos tipos de glucoproteínas para entrar en una célula diana: una proteína de unión (llamada glucoproteína G en un virus del géneroHenipaviruso glucoproteína H en un virus del géneroMorbillivirus)y una glucoproteína F (también llamada proteína de fusión o proteína F). La proteína F media en la fusión de las membranas víricas con las membranas celulares de la célula hospedadora. La glucoproteína G/H reconoce el receptor en la membrana diana y ayuda a la proteína F en su función de fusión de membranas. Tanto la glucoproteína G/H como la glucoproteína F se utilizan en forma modificada para seudotipificar la partícula de tipo retrovírico o el vector retrovírico según la invención.

Un virus del géneroMorbillivirus seselecciona, por ejemplo, del grupo que consiste en el virus del sarampión, virus del moquillo, morbilivirus de cetáceos, virus de la peste de los pequeños rumiantes, virus del moquillo de las focas y virus de la peste bovina.

Un virus preferido del géneroMorbilliviruses un virus del sarampión (VS).

Un virus del géneroHenipavirusse selecciona, por ejemplo, del grupo formado por el virus de Nipah, el virus Cedar y el virus Hendra.

Un virus preferido del géneroHenipaviruses un virus de Nipah (VNi).

En una realización preferida, las glucoproteínas de la envoltura modificadas proceden de la glucoproteína H y la glucoproteína F de la envoltura de un virus del sarampión o de la glucoproteína G y la glucoproteína F de la envoltura de un virus de Nipah.

Un ejemplo de secuencia de la glucoproteína G de la envoltura del virus de Nipah es la secuencia SEQ ID NO: 9. Un ejemplo de secuencia de la glucoproteína F de la envoltura del virus de Nipah es la secuencia SEQ ID NO: 11. Un ejemplo de secuencia de la glucoproteína H de la envoltura del virus del sarampión (llamada glucoproteína H) es la secuencia SEQ ID NO: 10.

Un ejemplo de secuencia de la glucoproteína F de la envoltura del virus del sarampión es la secuencia SEQ ID NO: 12.

Proteína procedente de una glucoproteína G/H de la envoltura

La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o vector retrovírico según la invención comprende al menos una proteína de fusión de direccionamiento celular y al menos una proteína de fusión moduladora. La proteína de fusión de direccionamiento celular y/o la proteína de fusión moduladora comprenden una primera proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae.

La glucoproteína G o H de la envoltura es como se ha definido anteriormente en la sección "glucoproteínas de la envoltura de la familia Paramyxoviridae".

El virus de la familia Paramyxoviridae es como se ha definido anteriormente en la sección "partícula de tipo retrovírico seudotipificada o vector retrovírico".

Por la expresión "proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura", se entiende en el presente documento que la proteína comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura.

Una glucoproteína G de la envoltura preferida es una glucoproteína G de la envoltura del virus de Nipah, también conocida como glucoproteína G de la envoltura del VNi, glucoproteína G de VNi o NiV-G.

Una glucoproteína H de la envoltura preferida es una glucoproteína H de la envoltura del virus del sarampión, también conocida como glucoproteína H de VS, hemaglutinina de VS o VS-H.

La glucoproteína G o H de la envoltura es una glucoproteína de la envoltura de un virus natural o de cepa vacunal o una variante de la misma, siempre que dicha variante conserve la capacidad de dicha glucoproteína de natural o de cepa vacunal de reconocer el receptor en la membrana diana y de ayudar a la proteína F en su función de fusión de membranas.

Una secuencia de referencia para una glucoproteína G de la envoltura del VNi es la secuencia SEQ ID NO: 9.

La glucoproteína G de la envoltura del VNi puede tener una secuencia al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 9. Por ejemplo, la glucoproteína de la envoltura del VNi puede ser de la secuencia SEQ ID NO: 9.

Una secuencia de referencia para la hemaglutinina del VS es la secuencia SEQ ID NO: 10.

La hemaglutinina del VS puede tener una secuencia al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10. Por ejemplo, la hemaglutinina del VS puede ser de la secuencia SEQ ID NO: 10.

La proteína procedente de la glucoproteína G de la envoltura carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G de la envoltura.

La proteína que carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G de la envoltura también se denomina proteína truncada en su región citoplasmática.

Las expresiones "proteína que carece de x aminoácidos de la región citoplasmática", "proteína truncada en x aminoácidos en su región citoplasmática" y "proteína Acx" son sinónimas en el presente documento y pueden usarse indistintamente.

El uso de una glucoproteína G de la envoltura truncada en su región citoplasmática mejora mucho su incorporación en partículas de tipo retrovírico y vectores retrovíricos, lo que permite generar partículas de tipo retrovírico seudotipificadas o vectores retrovíricos con títulos y rendimiento de producción más altos.

La región citoplasmática de la glucoproteína G de la envoltura se encuentra en el extremo N.

Por lo tanto, al determinar la ubicación de la parte truncada de una glucoproteína Acx con referencia a la glucoproteína G no truncada, se comienza a contar en el segundo resto de aminoácido del extremo N-terminal de la glucoproteína G de la envoltura, es decir, omitiendo el primer resto de metionina.

Como ejemplo, una proteína que carece de aminoácidos X en la región citoplasmática de la glucoproteína G de la secuencia SEQ ID NO: Z se diferencia de dicha glucoproteína G en que carece de los aminoácidos 2 a 1+X de la secuencia SEQ ID NO: Z.

El experto en la técnica puede determinar fácilmente la localización de la región citoplasmática en la secuencia de la glucoproteína G de la envoltura.

La región citoplasmática de la glucoproteína H del VS consiste, por ejemplo, en los aminoácidos 1 a 34 de la secuencia SEQ ID NO: 10.

La región citoplasmática de la glucoproteína G del VNi consiste, por ejemplo, en los aminoácidos 1 a 45 de la secuencia SEQ ID NO: 9.

Por ejemplo, la proteína procedente de la glucoproteína G o H de la envoltura puede carecer de al menos 10 aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 18 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos en la región citoplasmática.

Por ejemplo, la proteína procedente de la glucoproteína H de la envoltura del virus del sarampión puede carecer de al menos 10 aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 18 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 24 aminoácidos en la región citoplasmática. En una realización preferida, la proteína procedente de la glucoproteína H de la envoltura del virus del sarampión carece de 15, 18, 20 o 24 aminoácidos.

Por ejemplo, la proteína procedente de la glucoproteína G de la envoltura del virus de Nipah puede carecer de al menos 10 aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 18 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos o al menos 30 aminoácidos en la región citoplasmática. En una realización preferida, la proteína procedente de la glucoproteína G de la envoltura del virus de Nipah carece de 34 aminoácidos.

En una realización preferida, la proteína procedente de la glucoproteína G o H de la envoltura es al menos parcialmente incapaz de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G o H de la envoltura.

La incapacidad al menos parcial para unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G o H de la envoltura puede obtenerse mediante al menos una mutación introducida en la secuencia de dicha glucoproteína G o H de la envoltura.

Por ejemplo, la proteína procedente de la glucoproteína G o H de la envoltura puede comprender al menos una mutación puntual, preferentemente al menos dos mutaciones puntuales, en comparación con la secuencia de dicha glucoproteína de la envoltura.

La mutación puntual puede ser una deleción, adición o sustitución de un aminoácido.

En una realización preferida, la mutación puntual es una sustitución.

En una realización preferida, la proteína procedente de la glucoproteína G o H de la envoltura es incapaz de unirse, es decir, completamente incapaz de unirse, al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G o H de la envoltura.

La incapacidad de la proteína procedente de la glucoproteína G o H de la envoltura para unirse a su receptor natural aumenta en gran medida la eficiencia del direccionamiento celular.

La evaluación de la capacidad para unirse al menos a un receptor natural de una glucoproteína G de la envoltura se puede evaluar mediante cualquier método bien conocido por el experto.

Los receptores naturales de VNi son los receptores de VNi Efrina-B2 y B3.

Por lo tanto, la proteína procedente de la glucoproteína G de la envoltura del VNi es preferentemente al menos parcialmente incapaz de unirse al receptor Efrina-B2 y/o al receptor Efrina-B3 del VNi, preferentemente tanto el receptor Efrina-B2 como el receptor Efrina-B3 del VNi.

Por ejemplo, la glucoproteína de la envoltura NiV-G puede comprender al menos dos o al menos tres mutaciones puntuales en comparación con la secuencia SEQ ID NO: 9, en donde dichas mutaciones puntuales se seleccionan del grupo que consiste en E501A, W504A, Q530A y E533A.

En una realización preferida, la glucoproteína NiV-G comprende o consiste en las mutaciones puntuales E501A, W504A, Q530A y E533A, lo que conduce a la incapacidad de unirse al receptor Efrina-B2 y al receptor Efrina-B3 del VNi.

Los receptores naturales del VS son SLAM, nectina-4 y CD46.

Por lo tanto, la proteína procedente de la glucoproteína H de la envoltura del VS es preferentemente al menos parcialmente incapaz de unirse a SLAM, nectina-4 y/o CD46, preferentemente al menos tanto SLAM como CD46.

Por ejemplo, la glucoproteína de la envoltura VS-H puede comprender al menos dos o al menos tres mutaciones puntuales en comparación con la secuencia SEQ ID NO: 10, en donde dichas mutaciones puntuales se seleccionan del grupo que consiste en Y481A, R533A, S548L y F549S.

En una realización preferida, la glucoproteína de la envoltura VS-H comprende o consiste en las mutaciones puntuales Y481A, R533A, S548L y F549S, lo que conduce a la incapacidad de unirse a SLAM y CD46.

Por lo tanto, la proteína derivada de la glucoproteína G o H de la envoltura carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura. Preferentemente, la proteína procedente de la glucoproteína G o H de la envoltura es al menos parcialmente incapaz de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G o H de la envoltura.

Por "una secuencia al menos un x % idéntica a una secuencia de referencia", se entiende en el presente documento que la secuencia es idéntica a la secuencia de referencia o difiere de la secuencia de referencia en hasta 100-x alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de referencia.

La alineación y la determinación del porcentaje de identidad se pueden llevar a cabo de forma manual o automática utilizando, por ejemplo, el programa Needle que se basa en el algoritmo de Needleman y Wunsch, descrito en Needleman y Wunsch (1970) J. Mol Biol. 48:443-453, por ejemplo, con los siguientes parámetros para la comparación de secuencias polipeptídicas: matriz de comparación: BLOSUM62, penalización por apertura de hueco: 10 y penalización por ampliación de hueco: 0,5, penalización por hueco final: falso, penalización por apertura de hueco final = 10, penalización por ampliación de hueco final = 0,5; y los siguientes parámetros para la comparación de secuencias polinucleotídicas: matriz de comparación: DNAFULL; penalización por apertura de hueco = 10, penalización por ampliación de hueco = 0,5, penalización por hueco final: falso, penalización por apertura de hueco final = 10, penalización por ampliación de hueco final = 0,5.

Como se define en el presente documento, una secuencia de aminoácidos "al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica" a una secuencia de referencia puede comprender mutaciones, tales como deleciones, inserciones y/o sustituciones en comparación con la secuencia de referencia.

En caso de sustituciones, la sustitución corresponde preferentemente a una sustitución conservadora como se indica en la tabla 1 a continuación. En una realización preferida, la secuencia al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de referencia solo se diferencia de la secuencia de referencia por sustituciones conservadoras.

T l 1

continuación

En otra realización preferida, la secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%o 99 % idéntica con respecto a una secuencia de referencia corresponde a una variante alélica de origen natural de la secuencia de referencia.

Glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura

La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según la invención comprende además al menos una glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y que comprende una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. Dicha glucoproteína preferentemente carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína F de la envoltura.

La glucoproteína F de la envoltura es como se ha definido anteriormente en la sección "glucoproteínas de la envoltura de la familia Paramyxoviridae".

Una glucoproteína F de la envoltura preferida es una glucoproteína F de la envoltura del virus de Nipah, también conocida como glucoproteína F de la envoltura del VNi, glucoproteína F del VNi o NiV-F.

Otra glucoproteína F de la envoltura preferida es una glucoproteína F de la envoltura del virus del sarampión, también conocida como glucoproteína F del V<s>o VS-F.

La glucoproteína F de la envoltura es una glucoproteína de la envoltura de un virus natural o de una cepa vacunal o una variante de la misma, siempre que dicha variante conserve la capacidad de la glucoproteína F natural o de cepa vacunal para mediar en la fusión de membranas víricas con la membrana celular de la célula hospedadora o diana. Una secuencia de referencia para una glucoproteína F de la envoltura del VNi es la secuencia SEQ ID NO: 11. La glucoproteína F de la envoltura del VNi puede tener una secuencia al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 11. Por ejemplo, la glucoproteína F de la envoltura del VNi puede ser de la secuencia SEQ ID NO: 11.

Una secuencia de referencia para la glucoproteína F de la envoltura del VS es la secuencia SEQ ID NO: 12.

La glucoproteína F de la envoltura del VS puede tener una secuencia al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID<n>O: 12. Por ejemplo, la glucoproteína F de la envoltura del VS puede ser de la secuencia SEQ ID NO: 12.

En una realización preferida, la proteína procedente de la glucoproteína F de la envoltura carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína F de la envoltura.

La proteína que carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína F de la envoltura también se denomina proteína truncada en su región citoplasmática.

El uso de una glucoproteína F de la envoltura truncada en su región citoplasmática mejora mucho su incorporación en partículas de tipo retrovírico y vectores retrovíricos, lo que permite generar partículas de tipo retrovírico seudotipificadas o vectores retrovíricos con títulos y rendimiento de producción más altos.

La región citoplasmática de la glucoproteína F de la envoltura se encuentra en el extremo C.

Por lo tanto, al determinar la ubicación de la parte truncada de una glucoproteína Acx con referencia a la glucoproteína G no truncada, se comienza a contar desde el extremo C-terminal de la glucoproteína F.

Como ejemplo, una glucoproteína que carece de X aminoácidos en su región citoplasmática en comparación con la glucoproteína F de la secuencia SEQ ID NO: Z que consiste en n aminoácidos se diferencia de dicha glucoproteína F en que carece de los aminoácidos n-x+1 a n de la secuencia SEQ ID NO: Z.

El experto en la técnica puede determinar fácilmente la localización de la región citoplasmática en la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura.

La región citoplasmática de la glucoproteína F del VS consiste, por ejemplo, en los aminoácidos 518 a 550 de la secuencia SEQ ID NO: 12 (33 aminoácidos).

La región citoplasmática de la glucoproteína F del VNi consiste, por ejemplo, en los aminoácidos 519 a 546 de la secuencia SEQ ID NO: 11 (28 aminoácidos).

Por ejemplo, la proteína procedente de la glucoproteína F de la envoltura puede carecer de al menos 10 aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 25 o al menos 30 aminoácidos en la región citoplasmática.

Por ejemplo, la proteína procedente de la glucoproteína F de la envoltura del virus del sarampión puede carecer de 30 aminoácidos en la región citoplasmática en comparación con dicha glucoproteína F de la envoltura del virus del sarampión. Por ejemplo, dicha proteína procedente de la glucoproteína F de la envoltura del virus del sarampión y que carece de 30 aminoácidos en la región citoplasmática comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 15.

Por ejemplo, la proteína procedente de la glucoproteína F de la envoltura del virus de Nipah puede carecer de 22 aminoácidos en la región citoplasmática en comparación con dicha glucoproteína F de la envoltura del virus de Nipah. Por ejemplo, dicha proteína procedente de la glucoproteína F de la envoltura del virus de Nipah y que carece de 22 aminoácidos en la región citoplasmática comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 16.

Células diana

Las células diana son células de interés, cuya actividad se va a modular y/o en las que se va a transducir al menos un gen de interés.

Las células diana expresan en su superficie un receptor de superficie celular específico, lo que permite dirigirse específicamente a estas células y no a las células que no expresan dicho receptor de superficie celular.

Las expresiones "células diana" y "subconjunto de células diana" son sinónimas en el presente documento y pueden usarse indistintamente.

Las células diana pueden seleccionarse del grupo que consiste en células hematopoyéticas, células del estroma, células endoteliales, células hepáticas, miocitos (p. ej., células del corazón), células del sistema nervioso y/o células enfermas.

Las células del sistema nervioso son, por ejemplo, neuronas y/o células gliales.

Por "células hematopoyéticas", se entiende en el presente documento células del sistema hematopoyético.

Las células diana preferidas son las células hematopoyéticas.

Las células hematopoyéticas pueden seleccionarse del grupo que consiste en linfocitos T, linfocitos B, monocitos, linfocitos Th1, linfocitos Th2, linfocitos Treg, mastocitos, células dendríticas (CD), linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T citolíticos naturales (NKT), macrófagos, células madre hematopoyéticas, células progenitoras T y/o B, eritroblastos, plaquetas, neutrófilos y sus combinaciones.

Las células hematopoyéticas diana más preferidas son los linfocitos T, más preferentemente linfocitos T CD8+ o linfocitos T CD4+.

Las células enfermas pueden ser células tumorales, células madre tumorales, células que carecen de un gen funcional específico, que sobreexpresan un gen específico y/o que expresan una forma truncada o mutada de un gen específico, células infectadas y/o células con alteraciones funcionales.

Dominio de direccionamiento específico de células

El dominio de direccionamiento específico de células (también denominado "dominio de direccionamiento celular") permite la unión específica de la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o del vector retrovírico según la invención a un receptor de superficie expresado selectivamente por las células diana.

Las células diana pueden ser las definidas anteriormente en la sección del mismo nombre.

El dominio de direccionamiento celular de la proteína de fusión de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en DARPin, un scFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones.

El término "DARPin" se refiere a proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas.

El término scFv se refiere a un fragmento variable monocatenario de un anticuerpo.

Por ejemplo, el dominio de direccionamiento celular es específico para CD3, CD8, CD4, un marcador de células cancerosas, CD11b, CD19, CD62L, CD56, Glut-1 (transportador de glucosa), CD19, CD22, CD20, CCR5 o CXCR4. Un dominio de direccionamiento celular preferido es una DARPin específica para CD4 o un scFv específico para CD8. Dominio funcional

El dominio funcional permite modular la actividad de las células diana.

Por "modular la actividad de una célula diana", se entiende en el presente documento activar o inhibir, inducir un cambio de fenotipo (por ejemplo, maduración y/o diferenciación), inducir la proliferación y/o inducir la apoptosis de dicha célula diana. Modular la actividad de una célula diana, por ejemplo, comprende mejorar o suprimir la inmunidad, promover respuestas inmunitarias específicas de tipo celular.

El dominio funcional de la proteína de fusión moduladora es un ligando de receptor.

Por "ligando de receptor", se entiende en el presente documento una molécula, preferentemente una proteína, preferentemente liberada de forma normal por las células, y que altera el estado fisiológico de las células que expresan un receptor afín en su superficie celular. El ligando de receptor se selecciona del grupo formado por una citocina, factor de crecimiento, hormona, neuromediador, ligando de apoptosis, una quimiocina, transportador de glucosa y sus combinaciones.

Por ejemplo, la citocina puede seleccionarse del grupo que consiste en interleucina (IL) TNF(factor de necrosis tumoral)o interferón.

La interleucina puede ser, por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL15, IL21, IL-17 o IL-12.

Por ejemplo, el ligando de apoptosis puede ser ligando FAS, ligando CD40 o TNFalfa.

Por ejemplo, la quimiocina puede ser CXCL4, CCL5 o CXCL10.

Por ejemplo, el factor de crecimiento puede ser GM-SCF(factorestimulante de colonias de granulocitos ymacrófagos),factor de células madre (FCM), trombopoyetina (TPO) o ligando Flt-3.

Por ejemplo, la hormona puede ser insulina, hormona del crecimiento o un péptido hormonal, por ejemplo, vasopresina. Por ejemplo, el neuromediador puede ser un neuropéptido, por ejemplo, seleccionado entre insulina, glucagón, calcitonina, neurotensina o bradicinina.

Un dominio funcional preferido es una citocina, preferentemente una interleucina, más preferentemente, IL-7.

Proteínas de fusión moduladoras y de direccionamiento celular

La partícula de tipo retrovírico y el vector retrovírico según la invención comprenden dos tipos de proteínas de fusión: una proteína de fusión de direccionamiento celular y una proteína de fusión moduladora.

La proteína de fusión de direccionamiento celular comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

La proteína de fusión moduladora comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80%de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

La persona experta entenderá claramente que, dado que la proteína de fusión de direccionamiento celular y la proteína de fusión moduladora son dos tipos diferentes de proteínas de fusión, el dominio de direccionamiento celular y el dominio funcional son diferentes.

El dominio transmembrana puede ser cualquier dominio transmembrana de origen natural o no natural.

El dominio transmembrana puede ser un dominio transmembrana de un receptor, una proteína transmembrana, preferentemente una proteína transmembrana vírica, un fragmento de una proteína transmembrana, un péptido transmembrana o una variante del mismo, tal como un dominio transmembrana modificado genéticamente de un receptor, una proteína transmembrana modificada genéticamente, un fragmento modificado genéticamente de una proteína transmembrana o un péptido transmembrana modificado genéticamente.

Son ejemplos de dominio transmembrana el dominio transmembrana (TMD) del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), el dominio transmembrana de CD34 o el dominio transmembrana de la glucoproteína VSVG.

El extremo C de la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae está preferentemente fusionado, directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un conector), con el extremo N del dominio funcional o de direccionamiento celular.

El extremo C del dominio transmembrana está preferentemente fusionado, directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un conector), con el extremo N del dominio funcional o de direccionamiento celular.

La proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae, la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura, el dominio de direccionamiento celular y el dominio funcional son como se ha definido anteriormente.

Cuando ambos están presentes en la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o en el vector retrovírico, la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae en la proteína de fusión de direccionamiento celular y las de la proteína de fusión moduladora pueden proceder del mismo virus de la familia Paramyxoviridae o de diferentes virus de la familia Paramyxoviridae.

Cuando la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae en la proteína de fusión de direccionamiento celular y las de la proteína de fusión moduladora proceden de diferentes virus de la familia Paramyxoviridae, estas proceden preferentemente de un virus del mismo género, más preferentemente de un virus de la misma especie.

La proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae en la proteína de fusión de direccionamiento celular y las de la proteína de fusión moduladora son preferentemente idénticas. En una realización preferida, la proteína de fusión de direccionamiento celular difiere así de la proteína de fusión moduladora por su dominio de direccionamiento en lugar de un dominio funcional y, posiblemente, cuando esté presente, de al menos un conector y/o al menos un marcador.

Las dos proteínas de la proteína de fusión pueden estar unidas entre sí con un conector. Puede usarse cualquier conector adecuado bien conocido por la persona experta.

Por ejemplo, el conector puede ser (G4S)3, G4S, sitio de corte del factor Xa o conector helicoidal (por ejemplo, HL3, HL7, ...).

Las proteínas de fusión pueden estar marcadas, por ejemplo, para facilitar su purificación y/o detección.

Cuando está presente, el marcador está situado preferentemente en el extremo C de la proteína de fusión, es decir, fusionado con el extremo N del dominio de direccionamiento celular y/o del dominio funcional. Puede usarse cualquier marcador adecuado bien conocido por la persona experta.

Por ejemplo, el marcador puede ser un marcador His, marcador RGS-His, tal como RGSH6, marcador HA o marcador c-myc.

Partícula de tipo retrovírico seudotipificada específica o vector retrovírico

En particular, la presente invención se refiere a una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o a un vector retrovírico que comprende:

a) al menos una proteína de fusión de direccionamiento celular que comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la S<e>Q ID NO: 10;

b) al menos una proteína de fusión moduladora que comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la Se Q ID NO: 10 y

c) al menos una glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y que comprende una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11 o la Se Q iD NO: 12.

Por lo tanto, la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico comprende al menos una proteína de fusión que comprende una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae, siendo dicha proteína de fusión una proteína de fusión de direccionamiento celular, como se define en las reivindicaciones. En una realización, la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico comprende dos proteínas de fusión que comprenden cada una una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae, en donde una proteína de fusión es una proteína de fusión de direccionamiento celular y la segunda proteína de fusión es una proteína de fusión moduladora, como se define en las reivindicaciones.

En una realización, la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico comprende:

a) al menos una proteína de fusión de direccionamiento celular, como se define en las reivindicaciones, que comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular,

b) al menos una proteína de fusión moduladora, como se define en las reivindicaciones, que comprende (i) un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional, y

c) al menos una glucoproteína, como se define en las reivindicaciones, que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae.

b) al menos una proteína de fusión moduladora, como se define en las reivindicaciones, que comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio funcional, y

La proteína procedente de una glucoproteína G de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae en la proteína de fusión de direccionamiento celular, las de la proteína de fusión moduladora y la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura pueden proceder del mismo virus de la familia Paramyxoviridae o de diferentes virus de la familia Paramyxoviridae.

Cuando la proteína procedente de una glucoproteína G de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae en la proteína de fusión de direccionamiento celular, las de la proteína de fusión moduladora y/o la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura proceden de diferentes virus de la familia Paramyxoviridae, estas proceden preferentemente de un virus del mismo género, más preferentemente de un virus de la misma especie.

En una realización, la proteína procedente de una glucoproteína G de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae en la proteína de fusión de direccionamiento celular, las de la proteína de fusión moduladora y la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura proceden del mismo virus de la familia Paramyxoviridae.

En otra realización, la proteína procedente de una glucoproteína G de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae en la proteína de fusión de direccionamiento celular y la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae proceden del mismo virus de la familia Paramyxoviridae, mientras que la proteína de fusión moduladora comprende (i) un dominio transmembrana, por ejemplo, el dominio transmembrana (TMD) del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) y (ii) al menos un dominio funcional.

Los diferentes componentes de la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico, en particular la proteína de fusión de direccionamiento celular, la proteína de fusión moduladora, la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y el dominio transmembrana son como se ha definido anteriormente.

Una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico preferido comprende:

a) al menos una proteína de fusión de direccionamiento celular que comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae, careciendo dicha proteína de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G de la envoltura y siendo al menos parcialmente incapaz de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G de la envoltura y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10,

b) al menos una proteína de fusión moduladora que comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae, careciendo dicha proteína de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G de la envoltura y es al menos parcialmente incapaz de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G de la envoltura o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, y

c) al menos una glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y que carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína F de la envoltura y que comprende una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11 o la S<e>Q ID NO: 12.

A continuación en la tabla 2 se proporcionan ejemplos de partículas de tipo retrovírico seudotipificadas o de vectores retrovíricos.

T l 2

continuación

En una realización preferida, la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico se puede obtener o se obtiene mediante el método de producción descrito más adelante en la sección"Método para producir una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico"a continuación en el presente documento.

Ácido nucleico y vector

La presente invención también se refiere a un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de direccionamiento celular y la proteína de fusión moduladora utilizada para seudotipificar la partícula de tipo retrovírico o el vector retrovírico según la invención.

Por lo tanto, la presente invención se refiere en particular a un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular y una secuencia que codifica una proteína de fusión moduladora, en donde:

(a) dicha proteína de fusión de direccionamiento celular comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae, que es preferentemente al menos parcialmente incapaz de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G de la envoltura y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones,

b) dicha proteína de fusión moduladora comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae, que es preferentemente al menos parcialmente incapaz de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G de la envoltura o a un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis o una combinación de los mismos;

El ácido nucleico preferentemente comprende o consiste en:

(i) una secuencia que codifica una proteína procedente de una glucoproteína de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae, como se define en las reivindicaciones, que es preferentemente al menos parcialmente incapaz de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G de la envoltura,

(ii) una secuencia que codifica un dominio de direccionamiento celular o un dominio funcional, como se define en las reivindicaciones, y

(iii) opcionalmente, una secuencia conectora entre las secuencias (i) y (ii),

(iv) opcionalmente, una secuencia que codifica un marcador, preferentemente en el extremo 3' de la secuencia (ii),

en donde las secuencias (i) y (ii) están fusionadas en marco.

La secuencia conectora codifica un conector como se ha definido anteriormente, por ejemplo, codifica (G4S)3.

La secuencia (i) está situada en 5' del ácido nucleico en comparación con la secuencia (ii) situada en 3' del ácido nucleico.

En una realización, el ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 13 y/o comprende o consiste en una secuencia que codifica una secuencia al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 14. En una realización preferida, el ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID No : 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 13 y/o comprende o consiste en una secuencia que codifica una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 14.

Se ha proporcionado anteriormente una definición del porcentaje de identidad de secuencia.

Una secuencia nucleica "al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica" a una secuencia de referencia puede comprender mutaciones, tales como deleciones, inserciones y/o sustituciones en comparación con la secuencia de referencia.

En caso de sustituciones, la sustitución corresponde preferentemente a una sustitución silenciosa o una sustitución que conduce a una sustitución conservadora en la secuencia de aminoácidos traducida, en comparación con la secuencia de referencia, por ejemplo, como se ha indicado en la tabla 1 anterior.

En una realización preferida, la secuencia nucleica al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de referencia solo difiere de la secuencia de referencia por sustituciones silenciosas y/o sustituciones que conducen a una sustitución de aminoácidos conservadora.

También se desvela, pero no se reivindica específicamente, un ácido nucleico que codifica una glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y que carece preferentemente de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína F de la envoltura.

La glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae es como se ha definido anteriormente.

El ácido nucleico es preferentemente un ácido nucleico aislado.

Por la expresión "ácido nucleico", se entiende en el presente documento la forma polimérica de éster fosfato de ribonucleósidos (también denominada "molécula de ARN"), desoxirribonucleósidos (también llamados "molécula de ADN") o cualquier análogo de fosfoéster de los mismos, tales como fosforotioatos y tioésteres, ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria.

El término "aislado" en referencia a un componente biológico (tal como un ácido nucleico, un vector o una proteína) se refiere a un componente biológico que se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo, o el propio organismo, en el que el componente es de origen natural, tal como otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas, células y orgánulos. Los "ácidos nucleicos aislados" o "vectores aislados" incluyen moléculas de ácido nucleico purificadas mediante métodos de purificación convencionales. Estos términos también abarcan ácidos nucleicos y vectores preparados mediante amplificación y/o clonación, así como ácidos nucleicos y vectores sintetizados químicamente.

El ácido nucleico según la invención se clona preferentemente en un vector.

El término "vector" tiene, por lo tanto, un significado diferente al de "vector retrovírico".

Por el término "vector", se entiende en el presente documento un vector de ácido nucleico.

Un vector comprende generalmente un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable.

Un vector comprende preferentemente un casete de expresión, es decir, un ácido nucleico según la invención colocado bajo el control de al menos una señal de expresión que permite su expresión.

La señal de expresión se selecciona particularmente entre un promotor, un terminador, un potenciador y sus combinaciones.

Los promotores, terminadores y potenciadores adecuados son bien conocidos por la persona experta.

Un ejemplo de vector es, por ejemplo, un plásmido.

Por "plásmido", se entiende en el presente documento un ADN circular bicatenario. El plásmido puede incluir un gen marcador que permite seleccionar las células que comprenden dicho plásmido, un origen de replicación para permitir que la célula replique el plásmido y/o un sitio de clonación múltiple que permite la inserción de un ácido nucleico según la invención.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones.

El vector es, preferentemente, un vector aislado.

El vector puede comprender o consistir en:

(a) un primer ácido nucleico que comprende o consiste en:

(i) una secuencia que codifica una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae, que es preferentemente al menos parcialmente incapaz de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G o H de la envoltura,

(ii) una secuencia que codifica un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones,

(iii) opcionalmente, una secuencia conectora entre las secuencias (i) y (ii),

(iv) opcionalmente una secuencia que codifica un marcador, preferentemente en el extremo 3' de la secuencia (ii),

en donde las secuencias (i) y (ii) están fusionadas en marco,

(b) un segundo ácido nucleico que comprende o consiste en:

(i) una secuencia que codifica a) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae, que es preferentemente al menos parcialmente incapaz de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G o H de la envoltura o b) un dominio transmembrana,

(ii) una secuencia que codifica un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos,

(iii) opcionalmente, una secuencia conectora entre las secuencias (i) y (ii),

en donde las secuencias (i) y (ii) están fusionadas en marco,

en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae en el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico, de forma independiente:

Por lo tanto, dicho primer ácido nucleico codifica la proteína de fusión de direccionamiento celular y dicho segundo ácido nucleico codifica la proteína de fusión moduladora.

Gen de interés

Cuando se utiliza un vector retrovírico seudotipificado, puede estar presente al menos un gen de interés en el genoma procedente de retrovirus de dicho vector retrovírico.

El gen de interés puede codificar una proteína terapéutica, proteína apoptótica, receptor de antígeno quimérico, receptor de la superficie celular, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, ARNhc, antígeno, citocina, microARN, CRISPR(grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares)/elementosCAS (por ejemplo, CAS9 y/o ARN guía, en particular para la alteración o corrección de genes específicos), otro sistema de nucleasa, tal como las nucleasas de dedos de cinc, S/MAR (región de fijación de armazón/matriz) - episomas, ligando y/o receptor.

Se inserta un S/MAR-episoma en el núcleo celular mediante vectores retrovíricos que después se replican con el ADN de la célula hospedadora.

Los ejemplos de genes de interés incluyen el gen de la globina, gen del factor de crecimiento hematopoyético (por ejemplo, gen de la eritropoyetina (EPO)), gen de interleucina (especialmente gen de interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-6 o interleucina-12), gen del factor estimulante de colonias (tal como el gen del factor estimulante de colonias de granulocitos, gen del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos o gen del factor estimulante de colonias de células madre), el gen de la integrina allbp específica de plaquetas, gen de resistencia a múltiples fármacos, los genes gp91 o gp 47, que son defectuosos en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (EGC), gen antivírico que hace que las células sean resistentes a infecciones con patógenos (tales como el virus de la inmunodeficiencia humana), gen que codifica los factores de coagulación sanguínea VIII o IX que están mutados en la hemofilia, gen que codifica un ligando implicado en las respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T (tales como receptores de antígenos de linfocitos T, receptores de antígenos quiméricos (CAR), receptores de antígenos de linfocitos B (inmunoglobulinas, anticuerpos neutralizantes contra el VIH, hepatitis C, hepatitis B y/u otras enfermedades infecciosas), el gen de la cadena<y>común del receptor de interleucina, gen de TNF, gen de interferón gamma, gen de CTLA4, genes expresados en células tumorales tales como Melana, genes de MAGE (tales como MAGE-1, MAGE-3), gen de P198, gen de P1A, gen de gp100.

Método para producir una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico

La presente invención también se refiere a un método para producir una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico como se ha definido anteriormente, en donde dicho método comprende cotransfectar una línea celular de empaquetamiento con:

(i) al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular, comprendiendo dicha proteína de fusión de direccionamiento celular (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10,

(ii) al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión moduladora, comprendiendo dicha proteína de fusión moduladora (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: (i) comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae; (ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10,

(iii) al menos un ácido nucleico que codifica una glucoproteína, que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y que comprende una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12 y preferentemente que carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína F de la envoltura,

(iv) al menos un vector que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas centrales de dicho retrovirus y (v) opcionalmente, al menos un vector que comprende un genoma de origen retrovírico competente para empaquetamiento,

obteniendo de este modo células cotransfectadas.

El al menos un vector que comprende un genoma de origen retrovírico competente para empaquetamiento es necesario solo para producir un vector retrovírico.

Puede usarse cualquier línea celular de empaquetamiento adecuada bien conocida por la persona experta.

Por "línea celular de empaquetamiento", se entiende en el presente documento una línea celular que es capaz de expresar los diferentes componentes de la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico de la invención.

Los ácidos nucleicos y los vectores que codifican los diferentes componentes de la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o del vector retrovírico de la invención pueden integrarse en el genoma de la línea celular de empaquetamiento, por ejemplo, en el caso de vectores basados en leucemia murina.

La línea celular de empaquetamiento es preferentemente compatible con la expresión de los genes lentivíricos Gag y Pol.

Por ejemplo, la línea celular de empaquetamiento puede seleccionarse del grupo que consiste en células 293T, células de insecto, células TE 671 y células HT1080.

El término "transfección" significa la introducción de al menos un ácido nucleico o vector extraño (por ejemplo, ADN, ADNc o ARN) en una célula, de modo que la célula hospedadora exprese las proteínas codificadas por dichos ácidos nucleicos o vectores. Los ácidos nucleicos o vectores extraños pueden incluir secuencias reguladoras o de control, tales como secuencias de inicio, parada, promotoras, de señal, de secreción u otras utilizadas por la maquinaria genética de una célula.

Un vector que comprende la secuencia de psi necesaria para la encapsidación se denomina vector psi positivo, mientras que un vector que no comprende dicha secuencia de psi se denomina vector psi-negativo.

Solo el vector que comprende un genoma de origen retrovírico competente para empaquetamiento es un vector psipositivo. Los demás ácidos nucleicos y vectores utilizados para la cotransfección son psi negativos.

El ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular, el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión moduladora y el ácido nucleico que codifica una glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae son como se ha definido anteriormente. Pueden proporcionarse en forma de dos vectores separados: por ejemplo, dos vectores separados, tal como el primero que comprende o consiste en el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular y el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión moduladora y el segundo que comprende o consiste en un ácido nucleico que codifica una glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae. Como alternativa, el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular, el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión moduladora y el ácido nucleico que codifica una glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae se pueden proporcionar en un único vector que comprende o consiste en estos tres ácidos nucleicos.

También se utiliza un vector que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas centrales de dicho retrovirus. Por "proteínas centrales de un retrovirus", se entiende en el presente documento las proteínas codificadas por los genes gag y pol. El gen gag codifica una poliproteína que la proteasa retrovírica procesa adicionalmente en proteínas estructurales que componen el núcleo. El gen pol codifica en particular la proteasa retrovírica, transcriptasa inversa e integrasa.

Por lo tanto, un ácido nucleico que codifica proteínas centrales de un retrovirus comprende el gen gag y el gen pol de dicho retrovirus.

Al menos una proteína central del retrovirus puede ser una modificada, por ejemplo, en comparación con la proteína central correspondiente de un retrovirus natural.

En una realización, al menos una proteína central del retrovirus está modificada en al menos una mutación de aminoácido, tal como una deleción, inserción o sustitución de aminoácidos.

En una realización preferida, dicha al menos una proteína central modificada es una integrasa deficiente. Un ejemplo de integrasa deficiente porta la mutación D116A.

Por lo tanto, el ácido nucleico que codifica proteínas centrales puede comprender al menos una mutación en el gen pol y/o al menos una mutación en el gen gag. Dicha al menos una mutación puede ser una deleción, inserción o sustitución de nucleótidos.

En una realización preferida, el ácido nucleico que codifica proteínas centrales comprende al menos una mutación en el gen pol, codificando de este modo una integrasa deficiente.

Un vector retrovírico que comprende una integrasa deficiente se denomina vector retrovírico de integración deficiente. Dicho vector permite transferir transitoriamente una molécula de ARN encapsidada que codifica un gen de interés. Un vector retrovírico de integración deficiente preferido es un IDLV (vector lentivírico de integración deficiente). El origen de los genes gag y pol da nombre a la partícula de tipo retrovírico o el vector retrovírico. Por ejemplo, la expresión "partícula de tipo retrovírico o vector retrovírico procedente del VIH-1" normalmente indica que los genes gag y pol son los del VIH-1 o son genes gag y pol modificados del VIH-1.

Para la cotransfección también se puede utilizar un vector que comprende un genoma de origen retrovírico competente para empaquetamiento, en particular para la producción de un vector retrovírico.

Por "vector que comprende un genoma de origen retrovírico competente para empaquetamiento", se entiende en el presente documento un vector que comprende las secuencias de ácido nucleico retrovíricas conocidas como secuencias "que actúan encis".Estas incluyen las repeticiones terminales largas (RTL) o (RTL) modificadas, por ejemplo, que carecen de al menos una parte de la región U3, para el control de la transcripción y la integración, la secuencia psi necesaria para la encapsidación y las secuencias del sitios de unión de cebadores (PBS) y tramos de polipurina (PPT) necesarias para la transcripción inversa del genoma retrovírico.

Un vector retrovírico producido usando un vector que comprende RTL que carecen de al menos una parte de la región U3 es, por ejemplo, un vector autoinactivante (SIN-RTL).

En una realización, dicho vector que comprende un genoma procedente de retrovirus competente para empaquetamiento comprende además genes de interés, incluidos elementos CRISPR/CAS y/o un S/MAR-episoma.

Cuando se utiliza el sistema CRISPR/CAS, el vector que comprende un genoma de origen retrovírico competente para empaquetamiento comprende normalmente un gen que codifica una endonucleasa CAS (por ejemplo CAS9), una secuencia de ADN correspondiente al ARN guía (ARNg) específico del gen de interés diana y, opcionalmente, una secuencia para la corrección genética.

Dicho genoma de origen retrovírico tiene preferentemente replicación defectuosa, en ausencia de cualquier función transcomplementaria. Un genoma competente para replicación comprendería además los genes retrovíricos gag, pol y env. En un genoma con replicación defectuosa, los genes víricos gag, pol y env se eliminan. El ensamblaje de las partículas de tipo retrovírico o vectores retrovíricos de la invención se logra proporcionando entransotro vector que codifica gag y pol, pero que es defectuoso para las secuencias encis(tales como el vector de (iv)), y al menos otro vector o ácido nucleico que codifica las glucoproteínas de la envoltura seudotipificadas (tales como los ácidos nucleicos de (i), (ii) y (iii) o vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos). Su expresión permite la encapsidación del gen de interés, excluyendo los genes necesarios para la multiplicación del genoma vírico y para la formación de partículas víricas completas.

El método para producir una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico como se ha definido anteriormente puede comprender además una etapa de:

b) cultivar las células cotransfectadas durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de las proteínas codificadas por dicho(s) ácido(s) nucleico(s) y vector(es); y

c) permitir que las proteínas codificadas formen partículas de tipo retrovírico o vectores retrovíricos.

Modulación de la actividad y/o transducción de células o subtipos de células específicas

Otro objeto de la invención es el usoin vitrooex vivode una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico como se ha definido anteriormente para modular selectivamente la actividad de las células diana y, opcionalmente, transducir selectivamente las células diana.

Otro objeto más de la invención es un métodoin vitrooex vivopara modular selectivamente la actividad de las células diana y, opcionalmente, transducir selectivamente las células diana, en donde dicho método comprende poner en contacto una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico como se ha definido anteriormente con células que comprenden dichas células diana.

El término "selectivamente" en la expresión "modular selectivamente la actividad de las células diana" significa que esencialmente solo dichas células diana tienen su actividad modulada por la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico. Por ejemplo, las células cuya actividad está modulada representan menos del 10 %, por ejemplo, menos del 5 % o menos del 1 % de células no diana.

El término "selectivamente" en la expresión "transducir selectivamente células diana" en el presente documento significa que esencialmente solo se transducen las células diana. Por ejemplo, las células transducidas comprenden menos del 10 %, por ejemplo, se transducen menos del 5 % o menos del 1 % de las células no diana.

La expresión "modular la actividad de una célula diana" es como se ha definido anteriormente en la sección "dominio funcional".

Como se usa en el presente documento, el término "transferir" o "transducir" se refiere a la capacidad de la partícula de tipo retrovírico o vector retrovírico para administrar un material biológico a la membrana o al citoplasma de las células diana, tras unirse a las células diana. Tras la administración, el material biológico puede trasladarse a otro(s) compartimento(s) de la célula.

Como se usa en el presente documento, la expresión "material biológico" se refiere a uno o más compuestos susceptibles de alterar la estructura y/o la función de una célula. Dentro del contexto de la presente invención, se prefiere que el material biológico sea uno o más ácidos nucleicos que comprendan un gen de interés, que puede estar comprendido dentro del genoma del vector retrovírico, como se ha explicado anteriormente.

Las condiciones para realizar la transducción de células son bien conocidas por la persona experta y normalmente incluyen incubar las células que se van a transducir, preferentemente cultivadas en matraces, platos o placas recubiertas, por ejemplo, con retronectina, y opcionalmente preestimuladas con cócteles de citocinas, con el vector retrovírico seudotipificado, preferentemente a una MDI (multiplicidad de infección) entre 0,5 y 100.

Las células diana son particularmente como se ha definido anteriormente en la sección del mismo nombre.

La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico se pueden poner en contacto con células que comprenden las células diana en un medio de cultivo.

La persona experta conoce el medio de cultivo adecuado para determinadas células.

Por lo tanto, se puede utilizar la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovíricoin vitrooin vivopara cambiar una función celular definida, proporcionando de este modo nuevas herramientas para la investigación básica.

Composición farmacéutica

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico como se define en las reivindicaciones.

La cantidad de partícula de tipo retrovírico seudotipificada o vector retrovírico que se va a utilizar en una composición farmacéutica depende, por ejemplo, de la inmunogenicidad, el estado del sujeto destinado a la administración (p. ej., el peso, la edad, el sexo, la salud, los tratamientos simultáneos, si los hubiera, y la frecuencia del tratamiento), el modo de administración, el tipo de formulación y/o el número de células diana.

La composición farmacéutica comprende preferentemente al menos una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, se entiende que la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" abarca cualquier vehículo, que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del principio activo y preferentemente que no sea tóxico para el hospedador al que se administra.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en una composición farmacéutica de la invención son bien conocidos por la persona experta. Por ejemplo, incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas de administración de medicamentos autoemulsionantes (SEDDS), tales como succinato de d-a-tocoferol polietilenglicol 1000, tensioactivos usados en formas farmacéuticas como Tween u otras matrices de administración poliméricas similares, proteínas séricas, tales como seroalbúmina humana, sustancias tamponantes, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina. Las ciclodextrinas, tales como a-, p- y Y-ciclodextrina o derivados químicamente modificados, tales como hidroxialquilciclodextrinas, incluidas las 2- y 3-hidroxipropil-pciclodextrinas, u otros derivados solubilizados también pueden usarse ventajosamente para mejorar la administración de composiciones según la invención.

La composición farmacéutica puede comprender de 106 UI a 1012 UI de vector retrovírico seudotipificado, preferentemente a partir de 107 Ul a 109 UI, más preferentemente de 107 UI a 108 UI.

Los términos "UI" o "unidad de infección" en el presente documento significan la cantidad de partículas de vector infeccioso determinada mediante valoración en una línea celular y expresada como UI/ml.

La administración puede realizarse en una dosis única o en varias dosis de la composición farmacéutica según la invención, inyectándose dichas varias dosis al mismo tiempo o por separado a lo largo del tiempo.

En una realización, las composiciones farmacéuticas se presentan en formas farmacéuticas unitarias para facilitar la dosificación precisa. La expresión "formas farmacéuticas unitarias" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado. Las formas farmacéuticas unitarias típicas incluyen ampollas o jeringas precargadas, previamente medidas, de las composiciones líquidas. En tales composiciones, la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico es habitualmente un componente menor, siendo el resto diversos vehículos o transportadores y adyuvantes de procesamiento útiles para formar la forma de dosificación deseada.

La invención proporciona además kits que comprenden una composición farmacéutica que comprende una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico como se ha definido anteriormente e instrucciones con respecto al modo de administración. Estas instrucciones pueden, p. ej., indicar la indicación médica, la vía de administración, la dosis y/o el grupo de pacientes que se van a tratar.

Sujeto que se va a tratar

El sujeto que se va a tratar puede ser un mamífero, por ejemplo, un ser humano o un mamífero no humano.

A un ser humano también se le denomina "individuo" o "paciente".

Dicho ser humano puede ser de cualquier edad, por ejemplo, un bebé, un niño, un adolescente, un adulto, personas mayores y de cualquier sexo.

Un mamífero no humano es preferentemente un roedor (por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo), un felino (por ejemplo, un gato), un canino (por ejemplo, un perro) o un primate (por ejemplo, un chimpancé).

El sujeto que se va a tratar es preferentemente un ser humano.

Prevención y/o tratamiento de una enfermedad

La presente invención es particularmente útil para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad que puede prevenirse y/o curarse modulando selectivamente la actividad de células o subconjunto de células específicas y, opcionalmente, transduciendo de forma selectiva dichas células o subconjunto de células específicas.

Dicha enfermedad involucra preferentemente a células o un subconjunto de células específicas.

Por tanto, el sujeto que se va a tratar puede padecer o es probable que se vea afectado por una enfermedad que puede prevenirse y/o curarse modulando selectivamente la actividad de células o un subconjunto de células específicas y, opcionalmente, transduciendo de forma selectiva dichas células o subconjunto de células específicas.

Dicha enfermedad puede seleccionarse del grupo que consiste en una enfermedad inmunitaria (por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria), cáncer, enfermedad genética, enfermedad alérgica, enfermedad inflamatoria, enfermedad infecciosa (en particular, infecciones bacterianas y/o víricas), enfermedad metabólica, enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, distrofia neuronal, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer), enfermedad muscular y sus combinaciones.

Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad autoinmunitaria" se refiere a una enfermedad debida a una respuesta inmunitaria hiperactiva del cuerpo contra sustancias y/o tejidos normalmente presentes en el cuerpo. En consecuencia, al dirigirse específicamente a las células inmunitarias involucradas en esta respuesta inmunitaria hiperactiva, la partícula de tipo retrovírico seudotipificada y el vector retrovírico de la invención son herramientas útiles para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, en particular, la encefalomielitis aguda diseminada, leucoencefalitis hemorrágica aguda, enfermedad de Addison, agammaglobulinemia, alopecia areata, esclerosis lateral amiotrófica, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, síndrome antisintetasa, alergia atópica, anemia aplásica autoinmunitaria, miocardiopatía autoinmunitaria, enteropatía autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, neuropatía periférica autoinmunitaria, pancreatitis autoinmunitaria, síndrome poliendocrino autoinmunitario, dermatitis autoinmunitaria por progesterona, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, urticaria autoinmunitaria, uveítis autoinmunitaria, enfermedad de Baló, esclerosis concéntrica de Baló, síndrome de Behget, enfermedad de Berger, encefalitis de Bickerstaff, síndrome de Blau, penfigoide ampolloso, enfermedad de Castleman, enfermedad celíaca, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, osteomielitis multifocal recurrente crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de Cogan, enfermedad por crioaglutininas, deficiencia del componente 2 del complemento, arteritis craneal, síndrome de CREST, enfermedad de Crohn, síndrome de Cushing, vasculitis leucocitoclástica cutánea, enfermedad de Degos, enfermedad de Dercum, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, diabetesmellitusde tipo 1, esclerosis sistémica cutánea difusa, síndrome de Dressler, lupus eritematoso discoide, eccema, artritis asociada a entesitis, fascitis eosinofílica, gastroenteritis eosinofílica, epidermólisis ampollosa adquirida, eritema nodoso, crioglobulinemia mixta esencial, síndrome de Evan, fibrodisplasia osificante progresiva, alveolitis fibrosante, gastritis, penfigoide gastrointestinal, arteritis de células gigantes, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (SGB), encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, hipogammaglobulinemia, enfermedades desmielinizantes inflamatorias idiopáticas, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática, nefropatía por IgA, miositis por cuerpos de inclusión, polineuropatía desmielinizante inflamatoria, cistitis intersticial, artritis idiopática juvenil, artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Kawasaki, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, enfermedad de IgA lineal (EAL), enfermedad de Lou Gehrig, hepatitis lupoide, lupus eritematoso, síndrome de Majeed, enfermedad de Méniére, poliangitis microscópica, síndrome de Miller-Fisher, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, morfea, enfermedad de Mucha-Habermann, esclerosis múltiple, miastenia grave, miositis, neuropielitis óptica, neuromiotonía, penfigoide cicatricial ocular, síndrome de opsoclonía-mioclonía, tiroiditis de Ord, reumatismo palindrómico, degeneración cerebelosa paraneoplásica, hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, pars planitis, pénfigo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, encefalomielitis perivenosa, síndrome de POEMS, poliarteritis nodosa, polimialgia reumática, polimiositis, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, neuropatía inflamatoria progresiva, psoriasis, artritis psoriásica, pioderma gangrenoso, aplasia pura de la serie roja, encefalitis de Rasmussen, fenómeno de Raynaud, policondritis recidivante, síndrome de Reiter, síndrome de las piernas inquietas, fibrosis retroperitoneal, artritis reumatoide, fiebre reumatoide, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, síndrome de Schnitzler, escleritis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatía, enfermedad de Still, síndrome de la persona rígida, endocarditis bacteriana subaguda, síndrome de Susac, síndrome de Sweet, corea de Sydenham, oftalmia simpática, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversa, colitis ulcerosa, enfermedad indiferenciada del tejido conjuntivo, espondilartropatía indiferenciada, vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.

Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" engloba cualquier tipo de cáncer, tal como glioblastoma, neuroblastoma, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, cáncer de mama, carcinoma hepatocelular, cáncer que surge de las células hematopoyéticas, incluida la leucemia, en particular LLC-B (leucemia linfocítica crónica de linfocitos B), LMC (leucemia mielógena crónica) o leucemia basada en linfocitos T tales como LTA (leucemia de linfocitos T aguda), LLA (leucemia linfoblástica aguda), LMA (Leucemia Mieloide Aguda) y/o melanoma.

Aplicaciones terapéuticas

La presente invención también se refiere a una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o a un vector retrovírico como se define en las reivindicaciones para su uso como medicamento, preferentemente en inmunoterapia, terapia génica y/o vacunación.

La terapia génica es una terapia que utiliza genes como medicamento, que puede obtenerse, por ejemplo, administrando en una célula un gen de interés y/o corrigiendo el gen o los genes de interés en el sitio endógeno. En la terapia génica, se administra un ácido nucleico que comprende el gen o los genes de interés en las células de un paciente, la expresión de la(s) proteína(s) codificada(s) por el(los) gen(es) de interés y/o la corrección del(de los) gen(es) de interés lo que permite prevenir y/o tratar una enfermedad.

Dicho(s) gen(es) de interés pueden estar presentes en la molécula de ARN comprendida en el vector retrovírico según la invención.

La corrección de genes puede llevarse a cabo mediante el sistema CRISPR/CAS.

La terapia inmunitaria, también llamada inmunoterapia, es una terapia basada en la modulación de la actividad del sistema inmunitario (por ejemplo, estimulación o inhibición) para prevenir y/o tratar una enfermedad.

En el contexto de la presente invención, la inmunoterapia consiste en modular la actividad únicamente de células inmunitarias diana específicas, utilizando la partícula de tipo retrovírico o el vector retrovírico según la invención, y opcionalmente transduciendo de forma selectiva dichas células inmunitarias diana. Por ejemplo, el vector retrovírico puede usarse para activar los linfocitos B, tal como hacer que se diferencien en células plasmáticas, y opcionalmente transducirlos con un ácido nucleico que codifique un anticuerpo ectópico contra un agente infeccioso (por ejemplo, contra VIH, VHC o HBC).

La inmunoterapia también comprende la terapia con linfocitos T. En la terapia con linfocitos T, los linfocitos T podrían, además de estar modulados en su función, ser más permisivos a la transferencia de genes, por ejemplo, para la transferencia de genes del receptor de linfocitos T (CAR).

La terapia adoptiva con linfocitos T es una terapia en la que se transfunden linfocitos T a un sujeto que las necesita. En el contexto de la presente invención, la actividad de dichos linfocitos T puede haberse estado modulando antes de la transfusión, mediante el uso de la partícula de tipo retrovírico o el vector retrovírico según la invención.

En el contexto de la presente invención, la vacunación consiste en presentar en la superficie de la partícula de tipo retrovírico o del vector retrovírico epítopos víricos específicos que se dirigirán y activarán al mismo tiempo las células presentadoras de antígenos (por ejemplo, macrófagos) que posteriormente presentarán los epítopos al sistema inmunitario (linfocitos T y B).

La presente invención también se refiere a una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o a un vector retrovírico como se ha definido anteriormente para su uso como medicamento, en donde dicha partícula de tipo retrovírico seudotipificada o vector retrovírico modula selectivamente la actividad de las células diana y opcionalmente transduce selectivamente las células diana.

La presente invención se refiere en particular a una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o a un vector retrovírico para su uso como se ha definido anteriormente, en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad como se ha definido anteriormente en la sección "Prevención y/o tratamiento de una enfermedad".

Dicha enfermedad es, por ejemplo, una enfermedad inmunitaria (por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria), cáncer, enfermedad genética, enfermedad alérgica, enfermedad inflamatoria, enfermedad infecciosa (en particular, infecciones bacterianas y/o víricas), enfermedad metabólica, enfermedad neurológica (tal como distrofia neuronal, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington), enfermedad muscular y sus combinaciones.

En una realización, la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico se utiliza para mejorar la vacuna de CD(células dendríticas),por ejemplo, presentando conjuntamente el ligando específico de las células CD (tal como CD11b) y GM-SCF(factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos)en la superficie del vector, para la transferencia de proteínas o genes.

En una realización ventajosa, La activación de los linfocitos T se combina con la transferencia de genes específicos de los linfocitos T, lo que ha mejorado significativamente la eficiencia de la transferencia génica en los linfocitos T en reposo, por ejemplo, en la terapia génica basada en linfocitos T. La transferencia génica eficientein vivoal subconjunto de linfocitos T es una revolución en el campo de la terapia genética y celular, ya que permite omitir procesos de cultivo y transducciónex vivoque inducen altos costes para la aplicación clínica. Asimismo, dejar las células en su microambiente normalin vivoles permite conservar su fenotipo y persistir a largo plazo en un paciente (p. ej., células citotóxicas CD8 específicas de tumor).

En otra realización, la invención puede usarse para mejorar la administración selectiva de genes a linfocitos B en reposo, por ejemplo, en la terapia génica basada en linfocitos B, tal como la inmunoterapia que permite a los linfocitos B producir anticuerpos neutralizantes contra agentes infecciosos o permite la secreción de proteínas recombinantes por parte de linfocitos B que son toleradas por el sistema inmunitario, ya que los linfocitos B pueden actuar como células tolerogénicas.

Asimismo, presentar una o más citocinas en la superficie de la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o del vector retrovírico puede inducir que el subconjunto de linfocitos T se diferencie en fenotipos como TSCM o TCM, que podrían persistir a largo plazoin vivo.

En otra realización, la invención se puede utilizar para la expansiónin vivode linfocitos citolíticos naturales (autólogos) antineoplásicos, para la terapia del cáncer.

En una realización, la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico se usa para inducir la apoptosis de un subconjunto de células definido presentando conjuntamente un ligando de apoptosis y un dominio de direccionamiento específico de células inmunitarias o tumorales.

La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico se pueden proporcionar en forma de una composición farmacéutica.

La composición farmacéutica es preferentemente como se ha definido anteriormente en la sección del mismo nombre.

La presente invención también se refiere a la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o al vector retrovírico, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico, preferentemente en el marco de una inmunoterapia, terapia génica y/o vacunación.

La presente invención también se refiere a la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o al vector retrovírico, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico, en donde dicha partícula de tipo retrovírico seudotipificada o vector retrovírico modula selectivamente la actividad de las células diana y opcionalmente transduce selectivamente las células diana.

La presente invención también se refiere a la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o al vector retrovírico, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para prevenir y/o tratar una enfermedad, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico, en donde dicha enfermedad es preferentemente como se ha definido anteriormente.

Puede usarse cualquier método de administración adecuado conocido por un experto en la técnica. En particular, la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según la invención se puede administrar por vía oral, vía parenteral (preferentemente mediante inyección intravenosa), vía medular, en particular inyección intrafemoral (tal como en la cavidad de la médula ósea) o por vía medular del húmero y/o inyección intratumoral local.

Cuando se selecciona la vía parenteral, la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico puede estar en forma de solución o suspensión inyectable, por ejemplo, acondicionado en una ampolla o matraz.

La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico se usa o administra preferentemente en una cantidad terapéuticamente eficaz.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de partícula de tipo retrovírico seudotipificada o vector retrovírico que confiere un efecto terapéutico al sujeto tratado. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible mediante alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto proporciona una indicación de o percibe un efecto). Como sabrá la persona experta, las dosis eficaces también variarán dependiendo de la vía de administración, la edad y/o el peso del sujeto, así como la posibilidad de uso conjunto con otros agentes.

La expresión "que comprende", como se utiliza en el presente documento, abarca la expresión "que consiste en".

La presente invención se ilustrará mejor a la vista de los siguientes ejemplos y figuras.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína truncada y mutada (Y481A, R533A, S548L, F549S) H VS (HcDelta18) fusionada con la proteína con repeticiones de anquirina diseñada (DARPin)-29.2 específica para CD4 humano.

La SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 3 corresponde a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína truncada y mutada (E501A, W504, Q530A, E533A) G VNi (GcA34) fusionada con un anticuerpo monocatenario dirigido al CD8 humano (scFvC8-Vh1) unido con un conector adicional (G4S)3.

La SEQ ID NO: 4 corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia SEQ ID NO: 3.

La SEQ ID NO: 5 corresponde a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína truncada y mutada (E501A, W504, Q530A, E533A) G VNi (GcA34) fusionada con IL-7.

La SEQ ID NO: 6 corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia SEQ ID NO: 5.

La SEQ ID NO: 7 corresponde a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína truncada y mutada (E501A, W504, Q530A, E533A) G VNi (GcA34) fusionada con una proteína con repeticiones de anquirina diseñada (DARPin) dirigida contra EpCAM humana.

La SEQ ID NO: 8 corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia SEQ ID NO: 7.

La SEQ ID NO: 9 corresponde a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la glucoproteína G de la envoltura del virus de Nipah.

La SEQ ID NO: 10 corresponde a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la glucoproteína H de la envoltura del virus del sarampión.

La SEQ ID NO: 11 corresponde a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la glucoproteína F de la envoltura del virus de Nipah.

La SEQ ID NO: 12 corresponde a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la glucoproteína F de la envoltura del virus del sarampión.

La SEQ ID NO: 13 corresponde a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína H VS truncada y mutada (HcA15) fusionada con IL-7.

La SEQ ID NO: 14 corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia SEQ ID NO: 13. La SEQ ID NO: 15 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la proteína F del virus del sarampión truncada en 30 aminoácidos en la cola citoplasmática (FcA30).

La SEQ ID NO: 16 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la proteína F del virus de Nipah truncada en 22 aminoácidos en la cola citoplasmática (FcA22).

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Transferencia eficiente y estable del gen de ErbB2-CAR a linfocitos T CD4+ en reposo por 4H/IL7H-LV. Para evaluar si 4H/IL7H-LV puede transferir eficientemente genes terapéuticos (CAR específico de ErbB2, ErbB2-CAR) a linfocitos T en reposo, los linfocitos T CD3+ recién aislados fueron transducidos con 4H-LV o 4H/IL7H-LV. Las células transducidas con VSV-LV o sin transducir (st) se utilizaron como controles negativos. Tres días más tarde, la mitad de las células transducidas fueron analizadas por FACS para determinar el porcentaje de células ErbB2-CAR+ en las células activadas por CD4 o CD8. Para confirmar la expresión estable de ErbB2-CAR, la otra mitad de las células transducidas se cultivó adicionalmente en presencia de estímulo anti-CD3/anti-CD28/IL-2, después de una etapa de lavado, durante tres días adicionales. A continuación, los porcentajes de células CD4+/ErbB2+ y CD8+/ErbB2+ se determinaron mediante FACS.

Figura 2: Mutación de la glucoproteína G de la envoltura del VNi para eliminar el reconocimiento del receptor natural. Se muestra la unión de Efrina-B2 (A) y B3 (B) a mutantes de NiV-G. Se transfectaron células 293T de forma simulada, plásmidos que codifican GcA34His o con diferentes mutantes GcA134EpCAM: sin mutación (GcA34epcam), E533A (GcA34EpCAMmut1), Q530A+E533A (GcA34EpCAMmut2.1), E501A+W504A (GcA34EpCAMmut2.2) o E501A+W504A+Q530A+E533A (GcA34EpCAMmut4) y se incubaron con 1 pg/ml de FcEfrinaB2 o B3 recombinante. Las cantidades de unión del receptor por los diferentes mutantes se muestran como valores de IFM. Las estadísticas se relacionan con GA34-DARPin-Ac1 no mutado (n=3; se muestran la media ± desviaciones típicas (DT); *, P<0,1 **, P<0,01; ***, P<0,001 mediante prueba de la t para datos independientes). Figura 3: Activación selectiva de linfocitos T CD4+ por 4H/IL7H-VLP. Los linfocitos T c D3+ recién aislados se dejaron sin transducir (st) o se transdujeron con diferentes tipos de VLP seudotipificadas con CD4-DARPin-Hmut (4H-VLP), CD4-DARPin/IL7-Hmut (4<h>/I<l>7<h>-VLP) o IL7-Hnse (Hnse/IL7H-VLP). Tres días después, las células se tiñeron con anticuerpos CD8, CD4 y CD71. Se muestra la expresión de CD71 en los linfocitos T activados por CD4 o CD8. Figura 4: La IL7 presentada funcionalmente en las VLP diana promueve la supervivencia de los linfocitos T. Los perfiles de dispersión frontal/lateral de linfocitos T CD3+ en reposo adultos que se incubaron durante 6 días con partículas de tipo vírico (VLP) seudotipificadas con VS-H dirigida a CD4 (4H-VLP), VS-H dirigida a CD8 (8"-VLP), VS-H dirigida a CD4 que presenta IL7 (4H/IL7H-VLP) o VS-H dirigida a CD8 que presenta IL7 (8<h>/IL7<h>-V<l>P). Como controles se utilizaron células cultivadas en el medio solo (sin transducir, st) o en presencia de IL7 15 ng/ml. El porcentaje de células viables se indica en cada transferencia puntual.

Figura 5: La IL7 presentada funcionalmente en los LV dirigidos a CD4 promueve la supervivencia de los linfocitos T. Los perfiles de dispersión frontal/lateral de linfocitos T CD3+ en reposo adultos que se incubaron durante 6 días con vectores lentivíricos (LV) seudotipificados con VSVG (VSV-LV), VS-Hmut (Hnse-LV), VS-H dirigida a CD4 (4H-LV) o VS-H dirigido a CD4 que presenta IL7 (4H/IL7H-LV). Como controles se utilizaron células cultivadas en el medio solo (sin transducir, st) o en presencia de IL7 15 ng/ml. El porcentaje de células viables se indica en cada transferencia puntual.

Figura 6: Activación selectiva de linfocitos T CD4+ por 4H/IL7H-LV. Los linfocitos T CD3+ recién aislados se dejaron sin transducir (st) o se transdujeron con diferentes tipos de LV seudotipificados con CD4-DARPin-Hmut (4Hñ18 -LV), Hnse (Hnse-LV) o VSVG (VSVG-LV). Aquí IL7 se presentó en dos versiones diferentes de Hmut, ya sea con 20 aminoácidos C-truncados (HA20) o con l5 aminoácidos C-truncados (HA15). En consecuencia, se produjeron dos tipos de 4H/IL7H-LV y se transdujeron los linfocitos T en reposo. Tres días después, las células se tiñeron con anticuerpos CD3, CD8, CD69 y CD71. Se muestra la expresión de los marcadores de activación CD69 y CD71 en células CD8+ y CD8- (CD4+).

Figura 7: Representación esquemática de vectores lentivíricos seudotipificados (LV). 4H-LV es un LV dirigido a CD4 basado en pseudotipos de glucoproteína de VS. 4H/IL7H-LV es un LV dirigido a CD4 que presenta IL7 basado en pseudotipos de glucoproteínas de VS. La glucoproteína H de la envoltura (VS-H) está truncada en su cola citoplasmática, por ejemplo, en 15, 18 o 20 aminoácidos y al menos dos de cuatro mutaciones puntuales (Y481A, R533A, S548L y F549S) se introducen para cegar el reconocimiento natural de sus receptores de SLAM y CD46, lo que da lugar a la glucoproteína de la envoltura Hmut. A continuación, un dominio de direccionamiento (por ejemplo, CD4-DARPin) y/o una citocina (por ejemplo, IL7) están fusionados con el mutante H (Hmut), con o sin un conector. La glucoproteína F de la envoltura de Vs está truncada en su cola citoplasmática en 30 aminoácidos (VS-F<a>3<o>).

Figura 8: Representación esquemática de partículas tipo vírico (VLP) seudotipificadas. 8G-VLP es una VLP dirigida a CD8 basada en pseudotipos de glucoproteínas de VNi. 8G/IL7G-VLP es una VLP dirigida a CD8 que presenta IL7 basada en pseudotipos de glucoproteínas de VNi. La glucoproteína de la envoltura de NiV-G está truncada en su cola citoplasmática por 34 aminoácidos (A34) y cuatro mutaciones puntuales (E501A, W504A, Q530A y E533A) se introducen para cegar el reconocimiento natural de su receptor de Efrina-B2/B3, lo que da lugar a la glucoproteína de la envoltura NÍV-G<a>34. A continuación, un dominio de direccionamiento (CD8-scFv) y/o una citocina (IL7) se fusionan con la proteína G mutante (NÍV-G<a>34) con o sin un conector. La glucoproteína F de la envoltura de VNi está truncada en su cola citoplasmática en 22 aminoácidos (NÍV-F<a22>).

Figura 9: Transducción eficiente y selectiva de linfocitos T CD4+ en reposo por 4H/IL7H-LV. Los linfocitos T CD3+ recién aislados se dejaron sin transducir (st) o se transdujeron con diferentes tipos de LV seudotipificados con CD4-DARPin-Hmut (4HA18 -LV), Hnse (Hnse-LV) o VSVG (VSVG-LV). Aquí IL7 se presentó en dos versiones diferentes de Hmut, ya sea con 20 aminoácidos C-truncados (HA20) o con 15 aminoácidos C-truncados (HA15). En consecuencia, se produjeron dos tipos de 4H/IL7H-LV (4HA18/IL7HA15-LV y 4HA18/|L7HA20-LV) y transdujeron los linfocitos T en reposo. Tres días después, las células se tiñeron con anticuerpos CD3, CD8 y CD4. Se muestra la expresión de GFP en los linfocitos T activados por CD4 o CD8.

Figura 10: Neutralización de LV seudotipificados de glucoproteína de VNi. Se transdujeron células CHO-EpCAM o CHO-Ephrin-B2 con NiVmutEpCAM-LV (círculo), MVEpCAM-LV (cuadrado), NiVwt-LV (triángulo) o VSVG-LV (rombo) a una MDI de 0,4 después de la incubación con diluciones en serie de suero humano combinado (IGIV) durante 2 h a 37 °C. Después de 72 h, Las células GFP+ se determinaron mediante citometría de flujo y se muestra el número de células GFP+ con respecto al control sin tratar (n=3).

Figura 11: Activación selectiva de linfocitos T CD8+ por 8G/IL7G-LV. Los linfocitos T CD3+ recién aislados se dejaron sin transducir (st) o se transdujeron con diferentes tipos de LV seudotipificados con CD8-scFv-Gmut (8<g>-L<v>) o CD8-scFv-Gmut /IL7-Gmut (8G/IL7G-LV). Tres días después, las células se tiñeron con anticuerpos CD8, CD4 y CD71. Se muestra la expresión de CD71 en los linfocitos T activados por CD4 o CD8.

Figura 12: Transducción eficiente y selectiva de linfocitos T CD8+ en reposo por 8G/IL7G-LV. Los linfocitos T CD3+ recién aislados se dejaron sin transducir (st) o se transdujeron con diferentes tipos de LV seudotipificados con CD8-scFv-Gmut (8G-LV) o CD8-scFv-Gmut /IL7-Gmut (8G/IL7G-LV). Tres días después, las células se tiñeron con anticuerpos CD3, CD8 y CD4. Se muestra la expresión de GFP en los linfocitos T activados por CD4 o CD8. Figura 13: Transferencia eficiente del gen de CAR19 a linfocitos T CD8+ en reposo por 8G/IL7G-LV. Los linfocitos T CD3+ recién aislados se dejaron sin transducir (st) o se transdujeron con diferentes tipos de LV seudotipificados con CD8-scFv-Gmut (8G-LV), CD8-scFv-Gmut /IL7-Gmut (8G/IL7G-LV) o VSVG (VSV-LV). Los LV administraron el gen terapéutico que codifica un CAR específico de CD19 (CAR19). Tres días después de la transducción, la expresión de CAR19 fue detectada por el anticuerpo anti-cmyc. Se muestra el porcentaje de células que expresan CAR19 en linfocitos T CD4+ o CD8+.

Figura 14: Los 4H/IL7H-LV permiten la activación de linfocitos T CD4+ dirigidain vivoen ratones humanizados.

Al ratón NOD/SCID gc-/- se le inyectaron linfocitos T de sangre del cordón umbilical y 2 meses después del injerto (reconstitución de linfocitos T al 20 %), se inyectaron 100 microlitros de 4H/IL7H-LV (1E6 IU) o 4H/IL7H-LV por vía intravenosa. Dos semanas después de la inyección de los vectores, los ratones se sacrificaron y los esplenocitos se evaluaron en cuanto al % de linfocitos T CD71+ CD4+ (marcador de activación).

Ejemplos

Material y métodos

Generación de las construcciones

El plásmido pHL3-Ac1 codifica la proteína MV HcA18mut truncada y mutada y un conector (G4S)3 (L3) entre H y DARPin Ac1 marcado con His se generó insertando la secuencia codificante amplificada por PCR del DARPin Ac1 específico de EpCAM (Stefanet al.2011) de pQE30ss_Ac1_corr en la cadena principal del plásmido pHL3-HRS3opt2#2 (Friedelet al.2015) mediante Sfil/Notl.

Todos los plásmidos que codifican variantes de la proteína G del virus de Nipah se obtuvieron del plásmido pCAGGS-NiV-codonop-Gn. La secuencia codificante del dominio de direccionamiento Ac1 se fusionó con el extremo C del marco de lectura de la proteína G mediante amplificación por PCR de cada fragmento e introduciendo simultáneamente un sitio de restricción Agel común, que se usó para el ligamiento, lo que dio lugar al plásmido pCAGGS-NiV-G-DARPin-Ac1. Todos los demás dominios de direccionamiento se intercambiaron a través de Agel/Notl. Se introdujeron truncamientos de la cola citoplasmática de la proteína G mediante amplificación por PCR del marco de lectura de la proteína G e inserción de los fragmentos de PCR en pCAGGS-NiV-G-DARPin-Ac1, lo que dio lugar a los plásmidos pCAGGS-NiV-GcA33-DARPin-Ac1 y pCAGGS-NiV-GcA34-DARPin-Ac1. Las proteínas G y GcA34 marcadas con His se generaron mediante amplificación por PCR a partir de pCAGGS-NiV-codonop-Gn. Los fragmentos se clonaron mediante restricción con Pacl/Notl en la cadena principal plasmídica de pCAGGS-NiV-G-DARPin-Ac1, lo que dio lugar a pCAGGS-NiV-G-His y pCAGGS-NiV-GcA34-His, respectivamente. Se introdujeron mutaciones que interfieren con el reconocimiento del receptor natural en la secuencia codificante de la proteína NiV-GcA34-DARPin-Ac1 mediante mutagénesis dirigida. Cada mutación se generó mediante amplificación de dos fragmentos que portaban la mutación designada con regiones homólogas en el sitio de la mutación. Estos fragmentos se fusionaron y amplificaron mediante un par de cebadores flanqueantes. Los fragmentos resultantes se clonaron en pCAGGS-NiV-GcA34-DARPin-Ac1 mediante Rsrll/Agel, generando los plásmidos pCAGGS-NiV-GcA34EpCAMmut.

Para la generación de las variantes NiV-F, las secuencias codificantes para FcA22 y FcA25 se amplificaron a partir de pCAGGS-NiV-F y se clonaron mediante restricción con Pacl/Sacl en la cadena principal plasmídica de pCAGGS-NiV-codonop-Gn, lo que dio lugar a los plásmidos pCAGGS-NiV-FcA22 y pCAGGS-NiV-FcA25. Las variantes de NiV-F marcadas con AU1 utilizadas para el análisis de transferencia de Western de partículas de vector se generaron amplificando las variantes de NiV-F de pCAGGS-NiV-F y añadiendo simultáneamente el marcador AU1 en el extremo N-terminal. Los fragmentos de PCR resultantes se clonaron mediante digestión de restricción con Pacl/Sacl en la cadena principal de pCAGGS-NiV-codonop-Gn, lo que da lugar a los plásmidos pCAGGS-AU1-NiV-F, pCAGGS-AU1-NiV-FcA22 y pCAGGS-AU1-NiV-FcA25.

Producción de vectores

Las partículas de vector se generaron mediante transfección transitoria de células HEK-293T usando polietilenimina (PEl). Veinticuatro horas antes de la transfección, se sembraron 2,5x107 células en un matraz T175. El día de la transfección, el medio de cultivo celular se reemplazó por 10 ml de DMEM con FCS al 15 % y L-glutamina 3 mM. La mezcla de ADN se preparó mezclando 35 |jg de ADN total con 2,3 ml de DMEM sin aditivos.

Por ejemplo, tras la optimización de las relaciones de G con respecto a F, se mezclaron 0,9 jg de plásmido que codificaba las variantes GcA34DARPin/scFv con 4,49 jg de plásmido que codificaba las variantes F. Se utilizaron 14,4 jg de plásmido de empaquetamiento de VIH-1 pCMVAR8.9 y 15,1 jg de plásmidos de transferencia-LV. La mezcla de reactivos de transfección se preparó mezclando 140 j l de solución de PEI 18 mM en H2O con 2,2 ml de DMEM sin aditivos. Esta solución se mezcló con la mezcla de ADN, se agitó en vórtex, se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente y se añadió a las células HEK-293T, lo que dio lugar a DMEM con FCS al 10 %, L-glutamina 2 mM en total. 24 h más tarde, el medio se intercambió con DMEM con FCS al 10 %, L-glutamina 2 mM para eliminar los complejos PEI/ADN restantes. El segundo día después de la transfección, el sobrenadante celular que contenía los vectores lentivíricos se filtró a través de un filtro de 0,45 jm . Si fue necesario, las partículas del vector se purificaron mediante centrifugación a 450 x g durante 24 h sobre un colchón de sacarosa al 20 %. El sedimento se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para la transducción, se sembraron 8x103 células CHO-EpCAM y SK-OV-3 o 2x104 células Molt4.8 y Raji en un único pocillo de una placa de 96 pocillos y se transdujeron al día siguiente. Cuando fue necesario, el medio de células se reemplazó con medio que contenía diferentes concentraciones de bafilomicina A1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Dallas, EE. UU.) y las células se preincubaron durante 30 minutos a 37 °C antes de añadir el vector. Para la valoración, se utilizaron al menos cuatro diluciones en serie de partículas de vector. Después de 72 h, el porcentaje de células positivas para proteína verde fluorescente (GFP) se determinó mediante citometría de flujo. Las unidades de transducción/ml (u.t./ml) se calcularon seleccionando las diluciones que mostraban una correlación lineal entre el factor de dilución y el número de células positivas para GFP (número de células transducidas/volumen de vector en jl/0,001).

En las figuras 7 y 8 se representan presentaciones esquemáticas de la partícula de tipo retrovírico seudotipificada o del vector retrovírico según la invención.

Ejemplo 1: Activación selectiva de linfocitos T CD4+

Para activar linfocitos CD4+ pero no CD8+, se generaron VLP que presentan una DARPin específica de CD4 como ligando de direccionamiento e IL-7 como dominio de activación en la proteína H de VS junto con la proteína de fusión (F), lo que da lugar a la 4H/IL7H-VLP (que comprende proteínas de las secuencias SEQ ID NO: 2, 14 y 15). Para generar las partículas, se estableció un protocolo de transfección. En resumen, se usaron 0,45 |jg de pCG-Hmut-CD4-DARPin (Zhouet al.,J Immunol, 2015), 0,45 jg de pCG-HA15-IL7 (proporcionado por Els Verhoeyen), 4,7 jg de pCG-FcA30 (Funkeet al.,Molecular therapy, 2008), 14,4 jg de plásmido de empaquetamiento de VIH-1 pCMVAR8.9 (Funkeet al.,Molecular Therapy, 2008) y 15,1 jg de pCG-1 para la transfección de células HEK293T en un matraz T175. Después de la recogida, las partículas del vector se concentraron adicionalmente mediante ultracentrifugación. Se obtuvieron títulos de ~107 ut/ml para LV y títulos de ~1,5 ug p24/ml para VLP.

La función de 4H/IL7H-VLP se demostró en linfocitos T en reposo recién aislados. En resumen, los linfocitos T CD3+ se aislaron mediante selección negativa utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T universal (Miltenyi Biotech) de sangre periférica de adultos. Posteriormente, las células se incubaron con 4H/IL7H-VLP en ausencia de cualquier estimulación. Tres días más tarde, los linfocitos T CD4+ pero no los linfocitos T CD4- se activaron en el cultivo celular, según lo confirmado por el análisis de FACS para el marcador de activación de CD71(figura3). Las partículas no diana que presentaban IL-7 activaron ambos, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD4-. Se sabe que la IL-7 es una citocina de supervivencia de los linfocitos T. Por consiguiente, se demostró que todas las VLP que presentaban IL7 eran tan eficaces como la IL-7 humana recombinante para prevenir la muerte de los linfocitos T primarios, mientras que la mayoría de los linfocitos T en reposo colocados en cultivo murieron después de seis días en presencia de partículas VLP convencionales deficientes en IL7(figura4).

La capacidad de promover la supervivencia de los linfocitos T y activar selectivamente los linfocitos T CD4+ también fue adquirida por LV dirigidos a CD4 que presentan IL7 (4H/IL7H-LV). Las partículas víricas se produjeron como se ha descrito anteriormente, excepto que el pCG-1 fue sustituido por el plásmido de transferencia que codifica GFP. Además, para probar la flexibilidad del sistema y si la función de las partículas podría mejorarse utilizando otra versión de Hmut, se utilizaron dos plásmidos diferentes que codifican Hmut-IL7 para la producción de vectores. El pCG-HA15-IL7 tiene un truncamiento citoplasmático de 15 aa de Hmut-IL7 (para la producción de 4H/IL7HA15-LV) y pCG-HA20-IL7 tiene un truncamiento citoplasmático de 20 aa de Hmut-IL7 (para la producción de 4H/IL7HA20-LV). Sin indicación específica, se produjeron VLP y LV que presentaban IL7 con pCG-HA15-IL7. De forma similar a lo logrado por 4H/IL7H-VLP, cuando se incubaron los linfocitos T CD3+ humanos recién aislados con los LV indicados en ausencia de estimulación durante 6 días, 4H/IL7H-LV promovió significativamente la supervivencia de los linfocitos T en comparación con el 4H-LV parental y el Hnse-LV no dirigido(figura5). Como se esperaba, el mayor porcentaje de células viables se observó en el grupo positivo tratado con rhlL-7 y las células menos viables estaban en los grupos VSV-LV transducidos o sin transducir (st)(figura5). Asimismo, 4H/IL7H-LV era tan potente como 4H/IL7H-VLP en la estimulación selectiva de su población celular diana en el cultivo celular mixto. Como se muestra en la figura 6, 4H/IL7H-LV regula al alza de forma selectiva las células CD4+ con expresión de los marcadores de activación CD69 y CD71, pero no las células CD4\ No hubo diferencias entre 4H/IL7HLA15-LV y 4H/IL7HA20-LV en la estimulación de linfocitos T CD4+. Por consiguiente, se generan con éxito LV dirigidos que muestran IL7 funcionales.

Ejemplo 2: Administración de receptores de antígenos quiméricos específicos de tumores a linfocitos T en reposo

Ya que los vectores que presentan IL7 desencadenaron la activación de los linfocitos T en reposo, se espera que estas células sean permisivas para la transducción lentivírica. Para demostrarlo, se generaron dos versiones de 4H/IL7H-LV que administran el transgén de GFP. Como se muestra en la figura 9, tanto 4H/IL7HA15-LV y 4H/IL7HA20-LV pueden transducir de manera eficiente y selectiva linfocitos T CD4+ en la mezcla de células.

Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) son una herramienta poderosa para la terapia del cáncer. Hasta ahora, los subconjuntos de linfocitos T deben purificarse y activarse para la administración genética de CAR. Aquí, se demuestra que los CAR pueden administrarse selectivamente a células CD4+ en reposo. Las partículas se generaron como se ha descrito en el ejemplo 1, excepto que pCG-1 fue sustituido por el plásmido de transferencia que codifica CAR. Cuando los linfocitos T en reposo se transdujeron con 4H/IL7H-LV que administra receptores de antígeno quimérico específicos de ErbB2 (ErbB2-CAR), la expresión de ErbB2-CAR solo se observó en la población de linfocitos T CD4+. En comparación con el LV dirigido a CD4 con deficiencia de IL7 (4H-LV), el 4H/IL7H-LV fue más eficiente en la administración del gen de CAR manteniendo al mismo tiempo la selectividad por los linfocitos T CD4+(figura 1).

Ejemplo 3: Las glucoproteínas de VS pueden reemplazarse por las de VNi para activar y transducir selectivamente los linfocitos T CD8+ humanos en reposo

Para seudotipificar VLP o LV de manera eficiente con glucoproteínas de VNi, se truncó el NiV-G en su cola citoplasmática en 34 aminoácidos (GcA34) y se truncó el NiV-F en su cola citoplasmática en 22 aminoácidos (FA22). A continuación, se destruyó el reconocimiento natural del receptor de GcA34 para Efrina-B2/B3 mediante la introducción de cuatro mutaciones puntuales (E501A, W504A, Q530A, E533A) en GcA34. Los LV seudotipificados con esta proteína G modificada perdieron por completo su unión a los receptores naturales Efrina-B2 y -B3 del VNi(figura 2)y no entró en las células que expresaban estos receptores.

Asimismo, los LV seudotipificados para VNi tienen algunas características atractivas, como alto rendimiento de producción y resistencia a las inmunoglobulinas intravenosas. Ya que no existe vacuna contra el VNi y que los escasos brotes se limitan a unos pocos casos en Malasia, Bangladés e India (SEARO | Región de Asia Suroriental de la OMS), no debería haber anticuerpos neutralizantes presentes en los seres humanos. Para demostrar esto, se incubó inmunoglobulina intravenosa (IglV; Intratecta®) que abarcaba la gama más amplia de donantes de suero humano, con NiVwt-LV, NiVmutEpCAM-LV, MVEpCAM-LV y VSV-LV en concentraciones crecientes antes de la transducción de las células diana. A continuación, se determinó la expresión de GFP mediante citometría de flujo tres días después de la transducción. Como se esperaba, la transducción mediada por VSVG-LV y NiVwt-LV no se vio afectada por el tratamiento con IgIV. MVEpCAM-LV, por otro lado, mostró una disminución dependiente de la dosis en las tasas de transducción con una neutralización completa a 100 pg/ml de IgIV. Por el contrario, NiVmutEpCAM-LV fue resistente a IgIV a todas las concentraciones utilizadas y, por lo tanto, debe ser al menos 10000 veces menos sensible a inmunoglobulina humana que el correspondiente vector basado en VS(figura 10).Estos resultados muestran que los vectores dirigidos a receptores basados en glucoproteínas del VNi no se neutralizarán cuando se inyecten en seres humanos.

Por consiguiente, debido a las características anteriores del NiV-G, los pseudotipos de VNi se utilizaron además para generar partículas dirigidas a CD8 que presentan citocinas. Aquí, se presentó un scFv específico de CD8 procedente de OKT8 en NiV-GA34mut4 para generar el plásmido de la envoltura pCG-Gmut-CD8scFv y se presentó IL7 humana en el NiV-GA34mut4 para generar el plásmido de la envoltura pCG-Gmut-IL7. Con el fin de producir 8G/IL7G-LV, se usaron 0,45 pg de pCG-Gmut-CD8scFv, 0,45 pg de pCG-Gmut-IL7, 4,7 pg de pCG-FcA22, 14,4 pg de plásmido de empaquetamiento de VIH-1 pCMVAR8.9 y 15,1 pg de plásmidos de transferencia-LV para la transfección de células HEK293T en un matraz T175. Se obtuvieron títulos de ~107 ut/ml para LV y títulos de ~1,5 ug p24/ml para VLP.

De forma similar a lo logrado por 4H/IL7H-LV, 8G/IL7G-LV (que comprende proteínas de las secuencias SEQ ID NO: 4, 6 y 16) fue capaz de estimular y transducir selectivamente linfocitos T CD8+ en la mezcla de sangre periférica. Como se muestra en la figura 11, cuando se incubaron linfocitos T CD3+ humanos recién aislados con 8G/IL7G-LV durante 3 días, no solo los subconjuntos de linfocitos T CD8+ en el cultivo regularon positivamente la expresión de CD71, sino que también solo esta población de células expresó de manera eficiente el transgén indicador GFP(figura 12)o el transgén terapéutico CAR19(figura 13).Además, en comparación con el LV dirigido a CD8 con deficiencia de IL7 precursor (8G-LV), el 8G/IL7G-LV fue más eficiente a la hora de activar las células diana y administrar transgenes sin comprometer la especificidad para la transducción de los linfocitos T CD8+.

Ejemplo 4: Identificación de una relación óptima de NiV-G dirigido a CD8 con respecto a NiV-G que presenta IL7

Para alcanzar más células diana, mejorar el título y mejorar la especificidad de las partículas para la activación selectiva y la transducción de una población celular distinta, mientras se reduce al máximo el efecto inespecífico, el protocolo de transfección se optimiza adicionalmente para la producción de vectores y se determinan cuidadosamente las cantidades de NiV-Gd°mini° de direccionamiento (o MV-Hd°mini° de direccionamiento) y NiV-Gd°mini° funcional (MV-Hd°mini° funcional) que codifican plásmidos mantenidos en las células de empaquetamiento.

Para la producción de G8/GIL7-LV, como se ha descrito en el ejemplo 3, se usaron cantidades totales de 0,9 pg de plásmidos pCG-Gmut junto con 4,7 pg de pCG-FcA22, 14,4 pg de plásmido de empaquetamiento del VIH-1 pCMVAR8.9 y 15,1 pg de pSEW para la transfección de células HEK293T en un matraz T175. Al mismo tiempo, los plásmidos pCG-Gmut-CD8scFv y pCG-Gmut-IL7 se mezclan en diferentes relaciones de 20:1, 10:1,5:1, 1:1 o 1:5. Los respectivos sobrenadantes celulares que contienen 8G/IL7G-LV se utilizan para la transducción de Molt CD8+ o células A301 y, 48 h después de la transducción, el porcentaje de células GFP+ se mide mediante FACS para calcular los títulos. Además, se utilizan 8G/IL7G-LV para la transducción de linfocitos T CD3+ recién aislados y después se determina la expresión de CD71 y GFP en células CD8+ y CD8'. Se identifica la mejor relación como la que proporciona el mayor título, la mayor expresión de CD71 y GFP en la población diana y la menor expresión en la población no diana.

Ejemplo 5: Caracterización de los linfocitos T en reposo transducidos mediante VLP y LV dirigidos que presentan IL7

Los compartimentos de linfocitos T son muy heterogéneos y los subconjuntos de linfocitos T son fenotípica y funcionalmente distintos. En lo que respecta a la terapia con linfocitos T para el cáncer, las células menos diferenciadas generalmente se correlacionan con un mejor efecto antitumoralin vivo.Por consiguiente, es importante identificar los subconjuntos de linfocitos T que se activaron o modificaron mediante las partículas del vector según la invención. Tomando 8G/IL7G-LV-CAR como ejemplo, los fenotipos de los linfocitos T en reposo transducidos deben caracterizarse en comparación con los linfocitos T preestimulados transducidos (con el protocolo más utilizado de estimulación con CD3/CD28). En resumen, 3 días después de la transducción de linfocitos T CD3+ en reposo o preestimulados, se controla la expresión de múltiples marcadores de linfocitos T, incluidos CD11a, CD11b, CD25, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69,<c>D71, CD95, CD127 y CCR7. Estas moléculas se eligen porque se han utilizado en el pasado para diferenciar linfocitos T CD45RA+CD45RO' CD62Lalt°CD95'CD27alt°CCR7alt° vírgenes (T<n>), D45RA+CD45RO- CD62LaltoCD95+CD27altoCCR7alto de memoria de células madre (T<scm>), CD45RA-CD45ROaltoCD62L+CD95+CD27+ de memoria centrales (T<cm>), CD45RA-/+CD45ROaltoCD62L CD95+CD27-/+CCR7- de memoria efectores (T<em>) y CD45RA'/+CD45RO+CD62L' CD95altoCD27'CD28'CCR7' efectores (Tmi). Los fenotipos de los linfocitos T CAR+ se analizan mediante citometría de flujo.

Además, los subconjuntos de linfocitos T CD4+ preclasificados (T<scm>, T<cm>, T<em>y T<e>) se incuban con 4H/IL7H-VLP, por ejemplo, para demostrar las ventajas de la presente invención para la activación de linfocitos T sobre la estimulación conversora de TCR. En resumen, 3 días después de la incubación con 4H/IL7H-VLP o estimulación mediante anticuerpos CD3/28, los subconjuntos de linfocitos T indicados anteriormente se analizan para determinar la asimetría del fenotipo y los niveles de activación. Se espera que las partículas de vector dirigidas a linfocitos T que presentan IL7 activen y transduzcan linfocitos T menos diferenciados.

Ejemplo 6: Mejorar la función de células CART producidas ex vivo y simplificar el procedimiento de producción de células CART

Se ha demostrado que la inmunoterapia adoptiva con linfocitos T es un régimen eficaz en la clínica para el tratamiento de diversos tipos de enfermedades. Sin embargo, su aplicación más amplia se ha visto limitada por varios problemas. Por un lado, la producción de linfocitos T modificados con CAR o TCR es muy amplia y laboriosa debido a la estimulaciónin vitro,la expansión a largo plazo y el aislamiento y la purificación celular. Por otro lado, los linfocitos T efectores que se han expandidoin vitroa menudo persisten malin vivo,y no logran presentar un efecto antitumoral constante. La presente invención proporciona soluciones potenciales para estos desafíos al combinar la estimulación celular y la transferencia génica en una sola etapa y permitir la transducción de linfocitos T en reposo. Al usar esta invención, el proceso de producción de linfocitos T se puede simplificar significativamente, reduciendo así el coste de fabricación de linfocitos T. Asimismo, en comparación con las células producidas convencionalmente, los linfocitos T modificados con CAR/TCR producidos por la presente invención pueden ser más potentesin vivo,debido al potencial de diseñar eficientemente células menos diferenciadas como se demuestra en el ejemplo 5.

Para demostrar estas características, se transducen linfocitos T PBMC o CD8+ humanos recién aislados, por ejemplo, con 8G/IL7G-LV-CAR o VSV-LV-CAR como control. Al mismo tiempo, los linfocitos T CAR convencionales se preparan en paralelo según el protocolo más utilizado. En resumen, los linfocitos T PBMC o CD8+ humanos aisladas del mismo donante se simulan con anticuerpos de CD3/CD28 e IL2. A continuación, las células se transducen con 8G/IL7G-LV-CAR o VSV-LV-CAR seguido de 10 días de expansión en presencia de IL2. 2-3 días después de la transducción del vector de linfocitos T en reposo o 12 días después de la transducción de linfocitos T estimulados, estas células se cultivan conjuntamente con células tumorales dianain vitroo se infunden en el ratón humanizado que porta el tumor. A continuación, se evalúan la lisis de células tumoralesin vitroy remisión tumoralin vivo,la supervivencia de los animales, la persistencia y proliferación de linfocitos T reactivos frente a tumores.

Ejemplo 7: Activación selectiva y transducción mediante partículas dirigidas que presentan IL7 en condiciones similares a las de in vivo

En una siguiente etapa, se investiga la viabilidad de utilizar las partículas víricas para dirigirse y modificar funcionalmente las distintas células en la configuraciónin vivo.Por lo tanto, se realiza la transducción de sangre periférica humana nueva con las partículas víricas, por ejemplo, con G8/GIL7-LV. Esto permite la evaluación de la activación dirigida y la transferencia génica en una población de linfocitos T CD8+ en presencia de un sistema del complemento humano activo, un obstáculo encontrado por las partículas víricasin vivo.

En resumen, se incuba sangre periférica nueva con 8g/IL7g-LV-GFP u otros vectores de control (VSV-LV, 8H/IL7H -LV, 8G-LV o VSV/IL7G-LV) durante 6-8 h. Después, las PBMC totales se aíslan de la sangre y se cultivan adicionalmente en el medio de cultivo de linfocitos T sin añadir ningún reactivo estimulante. Después de 3-4 días, las células CD8+ y CD8' en el cultivo se evalúan para determinar la expresión de CD71 y GFP. Para confirmar la transferencia genética estable, una pequeña fracción de células se transfiere al medio de cultivo complementado con anticuerpos de CD3/CD28 e IL2 durante 3 días adicionales antes de analizar los porcentajes de células GFP+.

Ejemplo 8: Las partículas dirigidas que presentan IL7 activan y transducen selectivamente los linfocitos T circulantes en reposo en modelos de ratones humanizados

Para demostrar que las partículas según la invención se pueden aplicar local o sistémicamentein vivo parapermitir la activación o modificación específica del tipo celular, se aplican en ratones con injertos de células madre hematopoyéticas (CMH) CD34+ humanas de donantes sanos. En este modelo de ratón, se pueden generar células hematopoyéticas humanas multilinaje y estas células son toleradas por el ratón hospedador.

Aquí, se toma como ejemplo la aplicación de partículas seudotipificadas G8/GIL7 para la activación y modificación de linfocitos T CD8+ humanos. En resumen, después de haber confirmado que el sistema inmunitario humano se había establecido con éxito al detectar alrededor del 10 % de linfocitos T CD3+ humanos, las partículas seudotipificadas G8/GIL7 se aplican sistémicamente mediante inyección intravenosa (iv) o localmente mediante inyección intraesplénica o intratímica. Se inyecta G8/GIL7-VLP para evaluar la viabilidad de la activación selectiva del linfocitos T CD8+ humanosin vivo.En este contexto de experimento, el nivel/duración de la activación y la proliferación de linfocitos T CD8+ se analizan en diferentes momentos después de la inyección de VLP. Se inyecta G8/GIL7-LV-GFP para evaluar la función de administración de genesin vivo.En este contexto de experimento, la expresión de GFP, los fenotipos de las células transducidas y su proliferación y persistencia se analizan en los diferentes momentos posteriores a la inyección del LV. Se inyecta G8/GIL7-LV-CAR para evaluar la viabilidad de la administración de genes terapéuticos y la generaciónin vivode linfocitos T CAR. En este contexto de experimento, se analizan la expresión de CAR, los fenotipos de las células transducidas, la proliferación y persistencia de las células transducidas en presencia/ausencia de células/antígenos tumorales diana y la eliminación del tumor local/sistémico en los diferentes momentos posteriores a la inyección del LV.

Ejemplo 9: Activación selectiva de linfocitos T CD4+ de macaco de la India

Los linfocitos T de primates no humanos (PNH) son fenotípicamente similares a los linfocitos T humanos, lo le convierte en el mejor modelo animal para la inmunidad humana y las inmunoterapias. En lo que respecta a la terapia con linfocitos T, el modelo de PNH podría ser más fiable para predecir el efecto, la dosis, las vías de aplicación y la seguridad de posibles medicamentos. Por consiguiente, es muy deseable una herramienta para modificar o inducir específicamente un cambio funcional en un tipo celular distinto en PNH.

Aquí, el vector 4H/IL7H-SIV y su aplicación para macacos de la India se describen en detalle a modo de ejemplo. En primer lugar, se utiliza una DARPin57.2 específica para CD4 (CD4D572) de macaco de la India como dominio de direccionamiento presentado en la proteína Hmut (H-CD4D572) y se utiliza la IL7 reactiva del macaco de la India como dominio funcional presentado en el Hmut (H-rmIL7). A continuación, las dos proteínas H anteriores, por ejemplo, con las relaciones determinadas en el ejemplo 4, se utilizan para pseudotipificar el LV procedente del virus de la inmunodeficiencia de los simios mac 251 (SIVmac251). Después de determinar el rendimiento del vector y los títulos mediante P27 ELISA/Nano-sight y transducción de células de simio CD4+, los linfocitos T CD3+ de simio recién aislados se transducen con 4H/IL7H-SIV que suministra GFP o CAR. A continuación, se determinaron los marcadores de activación y la expresión transgénica en linfocitos T CD4+ frente a CD4- como se ha descrito anteriormente. A continuación, la posibilidad de aplicaciónin vivose evalúa en modelos de PNH. Con este fin, se inyecta lentamente una dosis única de vectores en dos ganglios linfáticos axilares de cada uno de los animales inscritos (p. ej., macaco de la India). Una semana después de la inyección, se recogen muestras de sangre y uno de los dos ganglios linfáticos inyectados se extirpa mediante cirugía y se disocia en suspensiones celulares individuales. Se realiza el análisis detallado para analizar los fenotipos, la activación específica, los niveles de expresión del transgén y/o la función (cuando se administra el transgén terapéutico) de linfocitos T transducidosin vivo.Asimismo, el segundo ganglio linfático recibe una segunda dosis del mismo vector y se supervisa a los animales inscritos durante seis meses para evaluar la proliferación, la persistencia y/o la función (cuando se administra el transgén terapéutico) de linfocitos T transducidosin vivo.

Ejemplo 10: Activar selectivamente y expandir linfocitos T específicos de antígeno en un modelo de ratón inmunocompetente

El potencial de dirigir las citocinas para que actúen en el sitio de la enfermedad evitando al mismo tiempo la toxicidad sistémica se puede evaluar bien en un modelo tumoral de melanoma en ratón inmunocompetente. Se toma como ejemplo VLP murina dirigida a CDS que presenta IL12 (m8G/mIL12G-VLP). Se ha mostrado en estudios anteriores que la aplicación de IL12 puede mejorar la tolerancia a los linfocitos T reactivos frente a tumores transferidos y la eficacia antitumoral, pero es sistémicamente muy tóxica. Para superar este inconveniente, en este estudio, se utiliza m8G/mIL12G-VLP para controlar la función de IL12 para que tenga lugar en los sitios tumorales. Se trasplantan en un ratón C57/BI6 natural células de melanoma B16/OVA, después del establecimiento del tumor, el ratón se trata mediante irradiación y se le transfieren linfocitos T aislados de ratón transgénico C57/BI6 OT-I. Después del trasplante de linfocitos T OT-I, los ratones se tratan con m8G/mIL12G-VLP, o con IL12 murina, o con PBS como controles mediante inyección iv. Se analizan el volumen tumoral, la persistenciain vivoy la función de los linfocitos T OT-I y la supervivencia del ratón.

Ejemplo 11: Activación dirigida in vivo de linfocitos T CD4+ humanos.

Para evaluar el rendimientoin vivode los MV-4H/IL7H-LV para activar linfocitos T CD4+ humanos, se injertaron linfocitos T CD3+ de la sangre del cordón umbilical en ratones NOD/SCID gc-/- (NSG). Se determinó la reconstitución de los linfocitos T humanos semanalmente en la sangre. Cuando se detectó el 20 % de las células hT (% de células hCD3+/células hCD45++mCD45+ totales), se inyectaron a los ratones por vía intravenosa 1E6 UI de m V-4h/IL7h-LV o MV-4H- LV. Dos semanas después de la inyección de los vectores, se sacrificaron los ratones y se aislaron los esplenocitos y las células mononucleares de sangre periférica. Resulta notable que se encontrara una activación específica más fuerte de IL-7 revelada por un marcador de activación tardía CD71 de los linfocitos T CD4+ humanos en el caso de los MV-4H/IL7H-LV (25 % de células CD4+ CD71+) en comparación con MV-4H-LV (8 % de células CD4+ CD71+)(figura14). Asimismo, los linfocitos T CD4-, que representan los linfocitos T CD8+, muestran una expresión idéntica de CD71 para ambos vectores de direccionamiento. Esto último enfatiza que la señalización de supervivencia de IL-7 solo activaba los linfocitos T CD4+ diana y no los linfocitos CD8+. En conclusión, al lado de la activación específicain vitrode las células diana lograda con MV-4H/IL7H-LV, la activación específica de los linfocitos T CD4+ por<m>V-4<h>/IL7h-LV se confirmóin vivoen el modelo de ratón del sistema sanguíneo humano.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico que comprende:

a) al menos una proteína de fusión de direccionamiento celular que comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae:

(ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10,

b) al menos una proteína de fusión moduladora que comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae:

(ii) carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína G o H de la envoltura; y (iii) tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, y

2. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según la reivindicación 1, en donde dicho virus de la familia Paramyxoviridae es un virus del géneroMorbilliviruso del géneroHenipavirus.

3. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae carece de al menos 10 aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 18 aminoácidos o al menos 20 aminoácidos en la región citoplasmática.

4. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según la reivindicación 3, en donde la glucoproteína G de la envoltura es una glucoproteína G de la envoltura del virus de Nipah (VNi) o la glucoproteína H de la envoltura es una glucoproteína H de la envoltura del virus del sarampión (VS).

5. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae procede de la glucoproteína G de la envoltura del virus de Nipah y carece de al menos 25 aminoácidos o al menos 30 aminoácidos en el dominio citoplasmático, preferentemente en donde la proteína procedente de la glucoproteína G de la envoltura del virus de Nipah carece de 34 aminoácidos.

6. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según la reivindicación 1-5, en donde dicha proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae es al menos parcialmente incapaz de unirse al menos a un receptor natural de dicha glucoproteína G o H de la envoltura.

7. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según la reivindicación 6, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae procede de la glucoproteína G de la cubierta del VNi y es al menos parcialmente incapaz de unirse al receptor Efrina-B2 y/o al receptor Efrina-B3, preferentemente tanto el receptor Efrina-B2 como el receptor Efrina-B3.

8. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae procede de la glucoproteína G de la envoltura del VNi y comprende al menos dos o al menos tres mutaciones puntuales en comparación con la SEQ ID NO: 9, en donde dichas mutaciones puntuales se seleccionan del grupo que consiste en E501A, W504A, Q530A y E533A, preferentemente en donde las mutaciones puntuales comprenden E501A, W504A, Q530A y E533A y conducen a la incapacidad de unirse al receptor Efrina-B2 y al receptor Efrina-B3.

9. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la glucoproteína F de la envoltura es una glucoproteína F de la envoltura del virus de Nipah o es una glucoproteína F de la envoltura del virus del sarampión.

10. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae carece de al menos una parte de la región citoplasmática de dicha glucoproteína F de la envoltura.

11. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según la reivindicación 10, en donde la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae carece de al menos 10 aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos o al menos 30 aminoácidos en la región citoplasmática.

12. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde:

la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae es una glucoproteína F de la envoltura del virus del sarampión que carece de 30 aminoácidos en el dominio citoplasmático, opcionalmente expuesta en la SEQ ID NO:15; o

la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae es una glucoproteína F de la envoltura del virus de Nipah que carece de 22 aminoácidos en el dominio citoplasmático, opcionalmente expuesta en la SEQ ID NO:16.

13. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae comprende una proteína que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 o la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae comprende una proteína que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10.

14. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae comprende una proteína que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11, en donde la glucoproteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína F de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae comprende una proteína que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12.

15. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende un gen que codifica un receptor de antígeno quimérico.

16. Un usoin vitrooex vivode una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para modular selectivamente la actividad de las células diana y opcionalmente transducir selectivamente dichas células diana.

17. Un métodoin vitrooex vivopara modular selectivamente la actividad de células diana y/o transducir selectivamente células diana, en donde dicho método comprende poner en contacto una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 con células que comprenden dichas células diana.

18. Una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso como medicamento.

19. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico para su uso según la reivindicación 18 en inmunoterapia, terapia génica y/o vacunación.

20. La partícula de tipo retrovírico seudotipificada o el vector retrovírico para su uso según la reivindicación 18 o 19, en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad inmunitaria, cáncer, enfermedad genética, enfermedad alérgica, enfermedad inflamatoria, enfermedad infecciosa, enfermedad metabólica, enfermedad neurológica, enfermedad muscular y sus combinaciones.

21. Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular y una secuencia que codifica una proteína de fusión moduladora, en donde:

(a) dicha proteína de fusión de direccionamiento celular comprende (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, y

(b) dicha proteína de fusión moduladora comprende (i) una proteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre un citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis o una combinación de los mismos;

22. El ácido nucleico según la reivindicación 21, en donde dicho virus de la familia Paramyxoviridae es un henipavirus.

23. El ácido nucleico según la reivindicación 21, en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 13 y/o comprende una secuencia que codifica una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 14.

24. Un vector que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 21-23.

25. Un método para producir una partícula de tipo retrovírico seudotipificada o un vector retrovírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde dicho método comprende cotransfectar una línea celular de empaquetamiento con:

(a) al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular, comprendiendo dicha proteína de fusión de direccionamiento celular (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado entre el grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae:

(b) al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión moduladora, comprendiendo dicha proteína de fusión moduladora (i) una proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre una citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae:

26. Una línea celular de empaquetamiento, que comprende

(a) al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de direccionamiento celular, comprendiendo dicha proteína de fusión de direccionamiento celular (i) una proteína que comprende la procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae y (ii) al menos un dominio de direccionamiento celular seleccionado del grupo que consiste en una DARPin, ScFv, péptido de direccionamiento y sus combinaciones, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae:

(b) al menos un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión moduladora, comprendiendo dicha proteína de fusión moduladora (i) una proteína que comprende al menos una modificación en comparación con la secuencia de la glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae o un dominio transmembrana y (ii) al menos un dominio funcional elegido entre un citocina, factor de crecimiento, hormona, neurotransmisor, ligando de apoptosis, o una combinación de los mismos, en donde la proteína procedente de una glucoproteína G o H de la envoltura de un virus de la familia Paramyxoviridae: