CN117659133A

CN117659133A - 间皮素靶向结合蛋白、其编码核酸以及用途

Info

Publication number: CN117659133A
Application number: CN202311679938.6A
Authority: CN
Inventors: 刘宝瑞; 王颖
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2023-12-06
Filing date: 2023-12-06
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明公开了一种间皮素靶向结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4之一所示。本发明公开的间皮素靶向结合蛋白可以特异性地与表达间皮素的肿瘤细胞结合，本发明的间皮素靶向结合蛋白用于制备核素探针、荧光探针、肿瘤诊断试剂盒，制备肿瘤靶向治疗药物或肿瘤靶向药物递送体系载体，包括蛋白药物偶联物、多特异性融合蛋白，用于免疫细胞因子靶向治疗等，发挥对间皮素阳性肿瘤的预防、影像学及病理学诊断以及治疗作用。

Description

间皮素靶向结合蛋白、其编码核酸以及用途

技术领域

本发明涉及生物靶向药物领域，具体涉及间皮素靶向结合蛋白、其编码核酸以及用途。

背景技术

间皮素(mesothelin，MSLN)是一种细胞表面肿瘤分化抗原，间皮素在少数非关键器官与组织的间皮细胞中呈低表达，如胸膜、心包、腹膜、扁桃体、胸腺、精囊、输卵管、子宫和胎盘，而在卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、恶性间皮瘤、肺腺癌、三阴乳腺癌、胃癌、宫颈癌和胆管癌等多种实体瘤中呈高表达。基于间皮素在肿瘤组织的特异性分布及其差异表达，靶向间皮素的肿瘤免疫治疗策略可以降低非特异性毒性的风险，使其成为一个理想的肿瘤免疫治疗靶点。

人间皮素基因编码一个71kDa的前体蛋白，由628个氨基酸组成，该前体蛋白在第295位的氨基酸Arg处经弗林蛋白酶加工后分裂释放出两种蛋白质产物：脱落的巨核细胞增强因子(megakaryocyte potentiating factor，MPF)和锚定在细胞膜上的成熟间皮素。MPF是一个31kDa的可溶性蛋白，被释放进入血清，具有刺激骨髓巨核细胞集落形成的活性作用。间皮素是通过糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上的膜结合蛋白，产生于前体蛋白的C末端，大小为40kDa，包含一个CA125/MUC16结合位点。其中，CA125/MUC16是粘蛋白家族的一员，在卵巢癌和恶性间皮瘤中表达。

当间皮素处于过表达状态时，细胞内信号通路NF-κB、MAPK和PI3K便会被激活，从而在肿瘤细胞的粘附、增殖、抗凋亡以及肿瘤化疗耐药等过程中发挥作用。间皮素在细胞内主要通过两条途径来发挥调节细胞功能的作用，一方面，间皮素可以通过与受体CA125/MUC16之间的结合来激活下游信号通路；另一方面，异常过表达的间皮素可以通过自身的GPI结构域激活细胞内途径。CA125/MUC16和间皮素之间的相互作用在体外介导异型细胞粘附，因此被认为是卵巢肿瘤腹膜转移的潜在机制。文献报道，CA125/MUC16与间皮素的结合通过SGK3/FOXO3信号通路下调DKK1(Dickkopf-1，WNT信号通路抑制剂)，进而促进迁移。阻断CA125/MUC16和间皮素结合能够恢复DKK1水平并防止卵巢癌转移。

间皮素在正常组织中表达有限，而在多种恶性肿瘤中过表达，因此是靶向治疗的理想候选。以间皮素为靶点的抗肿瘤策略在多个方向进行研发，并在临床前和临床试验中进行了评估，包括单克隆抗体、抗体-药物偶联物、免疫毒素、肿瘤疫苗、嵌合抗原受体T细胞疗法等。一项I期临床试验结果(NCT02414269)将间皮素CAR-T细胞联合PD-1抑制剂应用于恶性胸膜间皮瘤、转移性肺癌和乳腺癌。靶向间皮素的CAR-T细胞在胸腔内给药耐受性良好，对表达间皮素的正常组织没有明显毒性，并展现出了治疗实体瘤的潜力。由美国国立癌症研究所研发的靶向间皮素的ADC药物(BAY 94-9343)由间皮素抗体Anetumab ravtansine和有效载荷DM4构成，在I期临床研究中展现出耐受性良好、不良反应可控、药代动力学良好等特点，并且在晚期实体瘤患者中展现了令人鼓舞的初步临床活性。

长期以来，针对特定抗原或靶点，筛选制备其单克隆抗体，是最常用也是最成功的制备靶向结合蛋白的策略。然而，目前靶向间皮素的抗体药物存在分子量大、肿瘤穿透性差、免疫原性强、制备工艺复杂，生产成本高等局限性，因而，在维持高亲和力的基础上，进一步研发分子量低、肿瘤穿透性高、肿瘤靶向性好的间皮素靶向结合蛋白具有十分重要的临床价值。

发明内容

本发明的目的是提供间皮素靶向结合蛋白、其编码核酸以及用途，本发明所提供的间皮素靶向结合蛋白可特异性地在分子蛋白水平、体外细胞与组织水平以及体内实验动物水平与间皮素蛋白、间皮素阳性肿瘤细胞或肿瘤组织特异性结合，为以间皮素为靶点的肿瘤靶向治疗策略提供了一个亲和力高、特异性好的肿瘤靶向递送载体。

为实现上述目的，本发明提供一种间皮素靶向结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4之一所示，所述的间皮素靶向结合蛋白能够特异性地结合于肿瘤分子标记物间皮素。

本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的间皮素靶向结合蛋白。

本发明还提供一种核素探针，为采用本发明提供的间皮素靶向结合蛋白制备的放射性核素标记探针。

本发明还提供一种荧光探针，为采用本发明提供的间皮素靶向结合蛋白与荧光染料通过共价偶联反应得到的荧光探针。

本发明还提供一种蛋白药物偶联物，由本发明提供的间皮素靶向结合蛋白和能与人血清白蛋白结合的白蛋白结合域构成融合蛋白，并通过半胱氨酸残基定点偶联4个MMAE毒素分子，形成间皮素靶向蛋白药物偶联物；其氨基酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10之一所示。

其中，所述的白蛋白结合域为来自链球菌蛋白G的N-端区域的天然蛋白。

本发明还提供一种试剂盒，含有本发明提供的间皮素靶向结合蛋白的肿瘤诊断试剂盒。

本发明还提供上述的间皮素靶向结合蛋白在制备肿瘤靶向药物中的应用。

所述的肿瘤靶向药物为免疫细胞治疗药物。

所述的肿瘤靶向药物为肿瘤靶向细胞因子治疗药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所提供的间皮素靶向结合蛋白可特异性地在分子蛋白水平、体外细胞与组织水平以及体内实验动物水平与间皮素蛋白、间皮素阳性肿瘤细胞或肿瘤组织特异性结合；利用荧光示踪剂标记该靶向结合蛋白构建间皮素特异性荧光探针，在体内外实验中可以高效靶向间皮素表达阳性的胃癌细胞；基于该靶向结合蛋白制备的间皮素靶向蛋白药物偶联物，可以有效杀伤间皮素表达阳性细胞。

与现有的抗人间皮素抗体相比，本发明提供的间皮素靶向结合蛋白，其特点包括分子量小，仅18kDa左右，约为抗体分子的十分之一；体积小，具有较强的组织穿透性；免疫原性较低；具有更好调控的药代动力学表现；生产工艺简单、产量高及生产成本低等特点。

本发明的靶向结合蛋白对间皮素表达阳性的肿瘤细胞具有良好的靶向性，可与现有的抗肿瘤药物、载药系统及分子显像剂等连接或联合使用，用于肿瘤靶向治疗、肿瘤靶向药物递送以及肿瘤活体显像示踪，为肿瘤诊疗提供新思路、新方法。

附图说明

图1是间皮素靶向结合蛋白与间皮素分子的结合情况；靶向结合蛋白1、2、3与间皮素有显著结合，其中靶向结合蛋白1、3与间皮素的结合最强，为优势间皮素靶向结合蛋白，而对照组无靶向性的靶向结合蛋白4则无显著结合。

图2是优势间皮素靶向结合蛋白(间皮素靶向结合蛋白1)经过原核表达及蛋白纯化后的SDS-PAGE和Western Bolt检测结果；间皮素靶向结合蛋白分子量约18kDa，经过纯化后所获取的靶向结合蛋白纯度大于90％。

图3是优势间皮素靶向结合蛋白(间皮素靶向结合蛋白1)在N87和Huh7细胞表面的结合情况。N87是间皮素表达阳性细胞系，Huh7是间皮素表达阴性细胞系，MBP指优势间皮素靶向结合蛋白；MBP与间皮素表达阳性的N87细胞有明显结合，而与间皮素表达阴性的Huh7细胞不结合。

图4是间皮素特异性荧光探针在小鼠体内的生物分布情况；尾静脉注射间皮素特异性荧光探针，在给药后8h、24h分别对荷瘤小鼠进行近红外显像拍摄；间皮素特异性荧光探针在给药后8h即在肿瘤组织有明显蓄积，24h后荧光探针完全靶向到肿瘤部位。

具体实施方式

以下通过实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明提供一种间皮素靶向结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4之一所示，所述的间皮素靶向结合蛋白能够特异性地结合于肿瘤分子标记物间皮素。

本发明所提供的间皮素靶向结合蛋白，是通过噬菌体展示文库技术经多轮淘洗及筛选获得的，对结合能力强的多个噬菌体单克隆进行进一步地ELISA筛选，并对单克隆进行核酸序列测定；经过原核表达生产出本发明所述的间皮素靶向结合蛋白，进一步经过ELISA、流式细胞术、细胞免疫荧光等对其进行鉴定。

在本发明的实施方案中，所述靶向结合蛋白的氨基酸序列中，第31位、第33位、第34位、第35位、第36位、第37位、第38位、第44位、第45位、第64位、第66位、第67位、第69位、第77位、第78位、第97位、第99位、第100位、第102位、第110位、第111位的氨基酸残基Xaa分别为任意氨基酸，即四个间皮素靶向结合蛋白序列的骨架序列是一致的，只有上述标注的这些位置的氨基酸不同。

本发明公开的间皮素靶向结合蛋白可以特异性地与表达间皮素的肿瘤细胞结合，本发明的间皮素靶向结合蛋白用于制备核素探针、荧光探针、肿瘤诊断试剂盒；制备肿瘤靶向治疗药物或肿瘤靶向药物递送体系载体，包括但不限于蛋白药物偶联物、多特异性融合蛋白、免疫细胞治疗以及肿瘤靶向细胞因子治疗等，发挥对间皮素阳性肿瘤的预防、影像学及病理学诊断以及治疗作用。

在本发明的实施方案中，间皮素特异性荧光探针用于在体内示踪间皮素表达阳性肿瘤，如胃癌。

本发明的间皮素靶向结合蛋白特异性结合间皮素表达阳性的胃癌组织但不限于胃癌，间皮素靶向结合蛋白及其荧光探针还可特异性结合其他高表达间皮素的卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、间皮瘤等肿瘤组织。

进一步地，本发明公开了一种红色无创示踪荧光探针，将本发明的间皮素靶向结合蛋白与荧光染料CY5-NHS(Cyanine5-NHS)通过共价偶联后形成特异性荧光探针，在体外细胞免疫荧光、体内生物分布实验中，荧光标记抗原靶向蛋白均显示出对间皮素阳性肿瘤及组织的良好靶向性，并在体内富集于肿瘤部位而非正常器官。

本发明公开了间皮素特异性荧光探针在间皮素高表达肿瘤的诊断和疗效评估等方面的用途。

在本发明的实施方案中，间皮素靶向结合蛋白与白蛋白结合域(albumin-bindingdomain，ABD)构成融合蛋白，并通过半胱氨酸残基定点偶联4个MMAE毒素，制备达到DAR值(Drug-to-Antibody Ratio，药物抗体比值)均一的间皮素靶向蛋白药物偶联物。

ABD指来自链球菌蛋白G的N-端区域的天然蛋白，是一个由46个氨基酸构成的蛋白，能够与人、鼠的血清白蛋白结合，从而延长间皮素特异性蛋白药物偶联物的血清循环半衰期。

在本发明的实施方案中，所述间皮素靶向蛋白药物偶联物的靶向模块与半胱氨酸连接子的氨基酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10之一所示。

本发明的实施方案中所涉及的间皮素靶向结合蛋白通过大肠杆菌表达系统合成，合成工艺简便，产量高，成本低廉。

以下结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明：

实施例1：酶联免疫吸附试验(ELISA)检测靶向结合蛋白对间皮素的亲和力

1.合成靶向结合蛋白及纯化：

通过大肠杆菌原核表达体系合成靶向结合蛋白#1、2、3，并表达阴性对照靶向结合蛋白#4，使用镍柱进行蛋白纯化；

靶向结合蛋白#1(N端含有组氨酸标记的SEQ ID No.1)；

靶向结合蛋白#2(N端含有组氨酸标记的SEQ ID No.2)；

靶向结合蛋白#3(N端含有组氨酸标记的SEQ ID No.3)；

靶向结合蛋白#4(N端含有组氨酸标记的SEQ ID No.4)。

2.与间皮素蛋白共孵育：

将间皮素蛋白包被于96孔平底板，1％BSA封闭后与靶向结合蛋白#1、2、3、4分别共孵育2h，使用含有0.5％吐温20的PBS(0.5％ PBST)洗去各组游离的靶向结合蛋白后，加入稀释的anti-His二抗，继续孵育1h；使用0.5％ PBST洗去anti-His二抗后，加入TMB溶液；室温，避光反应30-120s，溶液由无色变为蓝色；加入1M稀盐酸终止反应，溶液由蓝色变为黄色。

3.使用酶标仪，以OD450测量吸光度：

如图1所示，对比阴性对照，靶向结合蛋白#1、2、3与间皮素蛋白均有明显结合，其中以靶向结合蛋白#1、3结合最强。

实施例2：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与蛋白质免疫印迹(WesternBlot)检测靶向结合蛋白的纯度与分子量

1.电泳：

先配制10％的分离胶，待下层分离胶凝固后配上层浓缩胶，每孔加10ul经原核体系表达纯化后的靶向结合蛋白#1样品或蛋白marker，70V，跑30min，待marker条带跑出后调至120V，60min。

2.染色：

小心撬开夹板，根据marker条带的最下缘切掉边缘，上缘沿浓缩胶和分离胶之间切开，小心取出胶片至染色液中，考马斯亮蓝染色半小时。

3.测定：

将胶片取出放至水中脱色，上机拍摄，分析蛋白纯度及分子量；

4.蛋白质免疫印迹：

同步骤1，用湿转法将SDS-PAGE后的凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，电转条件为350mA，80min；用5％的脱脂奶粉封闭30min后，TBST洗涤3次，每次5min；用1:2000稀释的anti-His的抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤后使用BeyoECL Star显色后使用化学发光图像分析系统进行条带拍摄。

如图2所示，间皮素靶向结合蛋白1分子量约18kDa，经过纯化后所获取的靶向结合蛋白纯度大于90％。

实施例3：优势间皮素靶向结合蛋白在N87和Huh7细胞表面的结合情况

1.与N87和Huh7细胞结合：

将间皮素表达阳性的胃癌细胞株N87以及间皮素表达阴性肝癌细胞株Huh7以合适的密度铺于细胞培养共聚焦小皿中；1％BSA封闭并用4％多聚甲醛固定后与优势间皮素靶向结合蛋白#1(MBP)在4℃孵育12h，洗去未结合的蛋白，加入anti-His荧光二抗，继续孵育1-2h，洗去二抗后使用DAPI染料进行细胞核染色。

2.在共聚焦显微镜下观察细胞的荧光情况：

如图3所示，优势间皮素靶向结合蛋白#1(MBP)与间皮素表达阳性的N87细胞有明显结合，而与间皮素表达阴性的Huh7细胞不结合。

实施例4：间皮素特异性荧光探针在小鼠体内的生物分布

1.制备向结合蛋白荧光探针：

使用原核表达方法获得靶向结合蛋白#1，并与CY5-NHS菁染料室温反应12h，获得靶向结合蛋白荧光探针；

2.制备荷瘤鼠：

将N87细胞培养至贴壁，选取4周龄裸鼠，于裸鼠腹股沟处皮下接种10⁶以上个细胞，并观察数日，直到肿瘤生长成团块状。

3.荷瘤鼠注射间皮素靶向结合蛋白荧光探针：

以尾静脉注射的方式为荷瘤鼠注射间皮素靶向结合蛋白荧光探针。

4.光学成像测定：

在注射后8h、24h麻醉小鼠，将其置于IVIS小动物活体光学成像系统中进行拍摄。

成像如图4所示，可见该靶向结合蛋白荧光探针能够特异性于肿瘤部位有效富集，显示了其作为临床诊疗药物的优秀潜力。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims

1.间皮素靶向结合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4之一所示，所述的间皮素靶向结合蛋白能够特异性地结合于肿瘤分子标记物间皮素。

2.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白。

3.核素探针，其特征在于：采用权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白制备的放射性核素标记探针。

4.荧光探针，其特征在于：采用权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白与荧光染料通过共价偶联反应得到的荧光探针。

5.蛋白药物偶联物，其特征在于：由权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白和能与人血清白蛋白结合的白蛋白结合域构成融合蛋白，并通过半胱氨酸残基定点偶联4个MMAE毒素分子，形成间皮素靶向蛋白药物偶联物；其氨基酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQIDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10之一所示。

6.试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白的肿瘤诊断试剂盒。

7.权利要求1所述的间皮素靶向结合蛋白在制备肿瘤靶向药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤靶向药物为免疫细胞治疗药物。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤靶向药物为肿瘤靶向细胞因子治疗药物。