ES2961520T3 - Forma cristalina de un inhibidor del antígeno de superficie de la hepatitis B - Google Patents
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Abstract
La presente invención describe una forma cristalina de un inhibidor del antígeno de superficie de la hepatitis B y un método de preparación para la misma, y también comprende el uso de la forma cristalina para preparar el inhibidor del antígeno de superficie de la hepatitis B. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Forma cristalina de un inhibidor del antígeno de superficie de la hepatitis B
La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente china n.° CN2018113995143 presentada el 22 de noviembre de 2018.
Campo técnico
La presente descripción se refiere a una forma cristalina de un inhibidor del antígeno de superficie de la hepatitis B y a un método de preparación para la misma, y también comprende el uso de la forma cristalina para preparar el inhibidor del antígeno de superficie de la hepatitis B.
Antecedentes
La hepatitis B vírica, hepatitis B para abreviar, es una enfermedad causada por la infección por el virus de la hepatitis B (VHB para abreviar) en el cuerpo. El virus de la hepatitis B es un virus hepatotrópico que existe principalmente en los hepatocitos y causa daños a los hepatocitos, lo que resulta en inflamación, necrosis y fibrosis de los hepatocitos. La hepatitis B vírica se divide en dos tipos, hepatitis B aguda y hepatitis B crónica. La hepatitis B aguda puede curarse por sí sola en adultos a través de su mecanismo inmunológico inherente. Sin embargo, la hepatitis B crónica (HBC) se ha convertido en un desafío importante para la sanidad mundial y en una de las principales causas de enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC). Se estima que 2 mil millones de personas en todo el mundo están infectadas con el virus de la hepatitis B crónica y más de 350 millones de personas han desarrollado hepatitis B. Cada año, aproximadamente 600000 personas mueren por las complicaciones de la hepatitis B crónica. China es una zona de alta prevalencia de hepatitis B, con muchos pacientes acumulados con hepatitis B, lo cual es un peligro grave. Según los datos, hay alrededor de 93 millones de personas infectadas con el virus de la hepatitis B en China, y alrededor de 20 millones de ellas están diagnosticadas de hepatitis B, de las cuales entre el 10% y el 20% pueden desarrollar cirrosis, y de las cuales entre el 1% y el 5% pueden convertirse en carcinoma hepatocelular.
La clave para una cura funcional de la hepatitis B es la eliminación del HBsAg (antígeno de superficie del virus de la hepatitis B) y la producción de anticuerpos de superficie. La cuantificación del HBsAg es un indicador biológico muy importante. Rara vez se observa una reducción y seroconversión del HBsAg en los pacientes con infección crónica, que es el criterio de valoración de las terapias actuales.
La proteína del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (VHB) desempeña un papel muy importante en la invasión del VHB en los hepatocitos y es de gran importancia para la profilaxis y el tratamiento de la infección por VHB. Las proteínas del antígeno de superficie incluyen las proteínas del antígeno de superficie grandes (L), medianas (M) y pequeñas (S) que comparten una región S C-terminal común. Se expresan mediante un mismo marco de lectura abierto y sus diferentes longitudes están determinadas por los tres codones de inicio AUG del marco de lectura. Estas tres proteínas del antígeno de superficie incluyen los dominios pre-S1/pre-S2/S, pre-S2/S y S. Las proteínas del antígeno de superficie del VHB se integran en la membrana del retículo endoplásmico (RE), que se inicia mediante la secuencia señal N-terminal. No solo constituyen la estructura básica de los viriones, sino que también forman partículas subvirales globulares y filamentosas (SVP, HBsAg) que se acumulan en el RE, el Re del huésped y el aparato pre-Golgi, y la SVP contiene la mayoría de las proteínas del antígeno de superficie S. La proteína L es fundamental en la morfogénesis del virus y la interacción de la nucleocápside, pero no es necesaria para la formación de las SVP. Debido a la ausencia de nucleocápsides, las SVP descritas anteriormente no son infecciosas. Las SVP participan en gran medida en la progresión de la enfermedad, especialmente en la respuesta inmunitaria al virus de la hepatitis B. En la sangre de las personas infectadas, la cantidad de SVP es al menos 10000 veces la cantidad del virus, atrapando al sistema inmunológico y debilitando así la respuesta inmunitaria del cuerpo al virus de la hepatitis B. El HBsAg también inhibe la inmunidad innata humana con su capacidad de inhibir la producción de citocinas inducidas por polisacáridos (LPS) e IL-2, la función de las células dendríticas (DC) y la actividad de inducción de ERK-1/2 y quinasa-1/2 del extremo N-terminal de c-Jun en los monocitos afectados por los LPS. Vale la pena señalar que la progresión de la enfermedad a cirrosis y carcinoma hepatocelular también se asocia en gran medida con la secreción persistente de HBsAg. Estos hallazgos sugieren que el HBsAg desempeña un papel importante en el desarrollo de la hepatitis B crónica.
Los fármacos anti-VHB aprobados para la comercialización hasta el momento son principalmente inmunomoduladores (interferón-a y peg-interferón-a-2a) y fármacos terapéuticos antivirales (Lamivudina, Adeforvir, Dipivoxil, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir, Clevudina, etc.). Entre ellos, los fármacos terapéuticos antivirales pertenecen a los fármacos de nucleótidos, cuyo mecanismo de acción es inhibir la síntesis del ADN del VHB y no son capaces de reducir directamente el nivel de HBsAg. Al igual que con la terapia prolongada, los fármacos de nucleótidos muestran la eliminación del HBsAg a un ritmo similar a las observaciones naturales.
Las terapias clínicamente disponibles muestran una eficacia deficiente para reducir el HBsAg. Por lo tanto, en la actualidad se necesita urgentemente el desarrollo de inhibidores orales de moléculas pequeñas que puedan reducir eficazmente el HBsAg para el uso clínico.
Roche ha desarrollado un inhibidor del antígeno de superficie llamado RG7834 para el tratamiento de la hepatitis B e informó de la eficacia de este compuesto en el modelo de marmota contra la hepatitis B: RG7834 puede reducir los antígenos de superficie en 2,57 unidades logarítmicas y el ADN del VHB en 1,7 unidades logarítmicas cuando se utilizó como fármaco único. El compuesto muestra buena actividad, pero es necesario separar los isómeros en el proceso de síntesis molecular, lo que reduce el rendimiento y aumenta el coste.
El documento WO2017013046A1 describe una serie de derivados del ácido 2-oxo-7,8-dihidro-6H-pirido[2,1,a][2]benzazepin-3-carboxílico para el tratamiento o la profilaxis de la infección por el virus de la hepatitis B. La actividad más alta entre esta serie de compuestos de anillos fusionados en la Realización 3 tiene una CI<50>de 419 nM, cuya actividad puede mejorarse aún más. Esta serie de compuestos contienen centros quirales, que son difíciles de sintetizar de forma asimétrica. Generalmente, el anillo de carbono de 7 miembros tiene poca solubilidad acuosa y es susceptible de ser metabolizado mediante oxidación.
El documento WO2018022282A1 describe un compuesto de fórmula , que incluye
, para el tratamiento de la infección por VHB.
Contenido de la presente invención
La presente descripción proporciona una forma cristalina A de un compuesto de fórmula (I) que tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende picos de difracción característicos con los siguientes ángulos 20: 8,04°±0,2°, 16,52°±0,2° y 19,52°±0,2°.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el patrón de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina A como se definió anteriormente comprende picos de difracción característicos con los siguientes ángulos 20: 8,04°±0,2°, 10,47°±0,2°, 11,90°±0,2°, 16,52°±0,2°, 18,06°±0,2°, 19,52°±0,2°, 22,02°±0,2° y 25,28°±0,2°.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el patrón de difracción de rayos X en polvo de la forma cristalina A como se definió anteriormente se muestra en la Figura 1.
En algunas realizaciones de la presente descripción, los datos de análisis del patrón de XRPD de la forma cristalina A como se definió anteriormente se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Datos analíticos del patrón de XRPD de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I)
En algunas realizaciones de la presente descripción, la forma cristalina A como se definió anteriormente tiene una curva de calorimetría de barrido diferencial con un inicio del pico endotérmico a 139,64 ± 5 °C.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el patrón de la curva de calorimetría diferencial de barrido de la forma cristalina A como se definió anteriormente se muestra en la Figura 2.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la forma cristalina A como se definió anteriormente tiene una curva de análisis termogravimétrico con una pérdida de peso del 0,4757% a 125,23 ± 3 °C.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el patrón de la curva de análisis termogravimétrico de la forma cristalina A como se definió anteriormente se muestra en la Figura 3.
La presente descripción también proporciona la forma cristalina A como se definió anteriormente para su uso como medicamento para tratar la hepatitis B.
Efectos técnicos
Los compuestos de la presente descripción tienen una actividad significativa contra el virus de la hepatitis B. Los compuestos de la presente descripción tienen una tasa de unión a proteínas plasmáticas moderada sin inhibir la isoenzima citocromo P450, exhibiendo así un bajo riesgo de interacción fármaco-fármaco; exhiben una excelente estabilidad en los microsomas del hígado en tres especies, ratas, humanos y ratones, lo que indica que los compuestos no se metabolizan fácilmente; tienen una buena exposición y biodisponibilidad; exhiben una buena tolerancia en la prueba de neurotoxicidad de dosis única. El proceso sintético de los compuestos de la presente descripción es simple y económico.
La forma cristalina de la presente descripción tiene una buena solubilidad en forma cristalina y es fácil de preparar, con una buena estabilidad física y química.
Definiciones y explicaciones
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y frases utilizados en la presente memoria tienen los siguientes significados. Un término o frase específico no debe considerarse indefinido o poco claro en ausencia de una definición particular, sino que debe entenderse en el sentido convencional. Cuando un nombre comercial aparece en la presente memoria, se pretende hacer referencia a su correspondiente producto o ingrediente activo del mismo. Los compuestos intermedios de la presente descripción se pueden preparar mediante diversos métodos sintéticos conocidos por los expertos en la técnica, incluidas las realizaciones específicas que se describen a continuación, las realizaciones formadas combinando las realizaciones que se describen a continuación con otros métodos de síntesis química, y alternativas equivalentes bien conocidas para los expertos en la técnica.
Las reacciones químicas en las realizaciones de la presente descripción se llevan a cabo en un disolvente apropiado, que es adecuado para el cambio químico y los reactivos y materiales requeridos de la presente descripción. Para obtener los compuestos de la presente descripción, a veces es necesario que los expertos en la técnica modifiquen o seleccionen las etapas sintéticas o los procesos de reacción basándose en las realizaciones existentes.
Todos los disolventes utilizados en la presente descripción están disponibles comercialmente y pueden usarse sin purificación adicional.
Los compuestos se nombran manualmente o mediante el programa informático ChemDraw® y los compuestos disponibles comercialmente se nombran utilizando los nombres de los directorios de sus proveedores.
Método de difractómetro de rayos X en polvo (XRPD) de la presente descripción
Modelo: Difractómetro de rayos X DX-2700BH (Haoyuan Instrument Co., Ltd.)
Método de ensayo: Se utilizaron alrededor de 10 a 20 mg de muestra para la detección de XRPD.
Los parámetros detallados de XRPD son los siguientes:
Tubo de rayos X: Cu, ka, (A = 1,54184 Á).
Tensión del tubo de rayos X: 40 kV, corriente del tubo de rayos X: 30 mA
Ranura de divergencia: 1 mm
Ranura del detector: 0,3 mm
Ranura antidispersión: 1 mm
Intervalo de escaneo: 3-40 grados
Tamaño del paso: 0,02 grados
Tiempo de paso: 0,5 segundos
Método de calorímetro diferencial de barrido (DSC) de la presente descripción
Modelo: Calorímetro de barrido diferencial METTLER TOLEDO DSC1
Método de ensayo: Se colocaron 2-6 mg de muestra en un crisol de alta presión chapado en oro para DSC de 30 gl para realizar los ensayos, aumentando la temperatura de la muestra de 40 °C a 350 °C a una velocidad de 10 °C/min. Método del analizador termogravimétrico (TGA) de la presente descripción
Modelo: Analizador termogravimétrico TA TGA550
Método de ensayo: Se colocaron de 2 a 10 mg de muestra en el crisol de aluminio, luego se colocaron en la bandeja colgante de platino para realizar la prueba y se calentaron a una velocidad de 10 °C/min con 40 ml/min de flujo de gas bajo N<2>para aumentar la temperatura de la muestra de 40 °C a 500 °C.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es el patrón de XRPD de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I) usando radiación Cu-Ka.
La Fig. 2 es el patrón de DSC de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I).
La Fig. 3 es el patrón de TGA de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I).
La Fig. 4 es el contenido de HBsAg (UI/ml) de ratones en diferentes fechas después de la administración.
La Fig. 5 son los cambios en el peso corporal de ratones en diferentes fechas después de la administración.
Descripción detallada de la realización
Ejemplo 1 Preparación del compuesto de fórmula (I)
Etapa A: Se añadió hidruro de litio y aluminio (80,00 g, 2,11 mol, 2,77 eq.) a la disolución en tetrahidrofurano (400,00 ml) que contenía el compuesto 1 (100,00 g, 762,36 mmol, 1,00 eq.) a 0 °C. La mezcla se agitó durante 10 horas a 10 °C. Luego, primero se añadieron 80,00 ml de agua a la disolución de reacción mientras se agitaba, seguido de 240,00 ml de disolución de NaOH al 15% y 80,00 ml de agua. La suspensión resultante se agitó durante 20 min a 10 °C y se obtuvo una disolución transparente incolora mediante filtración. El compuesto 2 se obtuvo después de concentrarla al vacío.
Etapa B: Se disolvieron el compuesto 2 (50,00 g, 426,66 mmol) y trietilamina (59,39 ml, 426,66 mmol) en diclorometano (500,00 ml). Luego se añadió gota a gota la disolución de dicarbonato de di-ferf-butilo (92,19 g, 422,40 mmol) en diclorometano (100,00 ml) a la disolución de reacción anterior. Luego la mezcla de reacción se agitó durante 12 horas a 25 °C. Después, la disolución de reacción se lavó con salmuera (600,00 ml) y se secó con sulfato de sodio anhidro. La fase orgánica se concentró al vacío y se secó por centrifugación, seguido de recristalización con metil terc-butil éter/éter de petróleo (50,00/100,00) para proporcionar el Compuesto 3.
Etapa C: Se disolvió cloruro de tionilo (100,98 ml, 1,39 mmol) en acetonitrilo (707,50 ml), luego se añadió gota a gota la disolución del Compuesto 3 (121,00 g, 556,82 mmol) en acetonitrilo (282,90 ml) a la disolución de reacción anterior a -40 °C. Después de la adición, se añadió piridina (224,72 ml, 2,78 mol) a la disolución de reacción de una vez. A continuación, se retiró el baño de hielo y la disolución de reacción se agitó durante 1 hora a 5-10 °C. Después de concentrar el disolvente al vacío, se añadió acetato de etilo (800,00 ml) para permitir que el sólido precipitara, seguido de filtración, y el filtrado se concentró al vacío. Segunda etapa: se disolvieron el aceite resultante, agua y tricloruro de rutenio (12,55 g, 55,68 mmol) en acetonitrilo (153,80 ml). Se añadió lentamente la suspensión de peryodato de sodio (142,92 g, 668,19 mmol) en agua (153,80 ml) a la disolución de reacción descrita anteriormente. La mezcla de reacción final se agitó durante 0,15 h a 5-10 °C. La mezcla de reacción se filtró y se obtuvo el filtrado. El filtrado se extrajo con acetato de etilo (800,00 ml x 2) y la fase orgánica se lavó con salmuera (800,00 ml), se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El compuesto 4 se obtuvo a partir de la purificación mediante cromatografía en columna (SiÜ<2>, éter de petróleo/acetato de etilo = 50/1-20/1).
Etapa D: Se disolvió el Compuesto 5 (100,00 g, 657,26 mmol) en acetonitrilo (1300,00 ml) y se añadieron K<2>CO<3>(227,10 g, 1,64 mol) y 1-Br-metoxipropano (110,63 g, 722,99 mmol). La disolución de reacción se agitó durante 6 horas a 85 °C. La disolución de reacción se extrajo con 600,00 ml de acetato de etilo (200,00 ml x 3), se secó con sulfato de sodio anhidro, luego se filtró y se concentró al vacío para proporcionar el Compuesto 6.
Etapa E: Se disolvió el Compuesto 6 (70,00 g, 312,15 mmol) en diclorometano y se añadió ácido m-cloroperoxibenzoico (94,27 g, 437,01 mmol). La mezcla se agitó durante 2 horas a 50 °C. Después de enfriar, se filtró la disolución de reacción y el filtrado se extrajo con diclorometano. La fase orgánica se lavó con 2000,00 ml de una disolución saturada de NaHCO<3>(400,00 ml x 5), se secó con sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío. El producto oleoso marrón resultante se disolvió lo menos posible con metanol y luego se añadieron lentamente 2 moles/l de disolución de KOH (350,00 ml) (el proceso es exotérmico). La disolución de reacción negra se agitó durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego se ajustó el pH a 5 con HCl del 37%. La disolución de reacción se extrajo con 400 ml de acetato de etilo (200,00 ml x 2) y la fase orgánica se lavó con 200,00 ml de salmuera (100,00 ml x 2), se secó con sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío para proporcionar el Compuesto 7.
Etapa F: Se disolvió el Compuesto 7 (33,00 g, 155,48 mmol) en THF (330,00 ml), y luego se añadieron paraformaldehído (42,02 g, 466,45 mmol), MgCl<2>(29,61 g, 310,97 mmol) y trietilamina (47,20 g, 466,45 mmol, 64,92 ml). La disolución de reacción se agitó durante 8 horas a 80 °C. Una vez finalizada la reacción, la disolución de reacción se inactivó con una disolución de HCl 2 M (200,00 ml) a 25 °C y después se extrajo con 600,00 ml de acetato de etilo (200,00 ml x 3). La fase orgánica se lavó con 400,00 ml de salmuera (200,00 ml x 2), se secó con sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío para proporcionar el residuo. El residuo se lavó con etanol (30,00 ml), se filtró para proporcionar una torta de filtración como el Compuesto 8.
Etapa G: Se disolvió el Compuesto 8 (8,70 g, 36,21 mmol) en W,W-dimetilformamida (80,00 ml), y luego se añadieron K<2>CO<3>(10,01 g, 72,42 mmol) y el Compuesto 4 (11,13 g, 39,83 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a 50 °C. Después, la disolución de reacción se inactivó con ácido clorhídrico acuoso 1,00 M (200,00 ml) y se extrajo con diclorometano (150,00 ml x 2). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con agua (150,00 ml x 3) y se secaron con sulfato de sodio anhidro, luego se filtraron y se concentraron al vacío para obtener el Compuesto 9.
Etapa H: Se disolvió el compuesto 9 (15,80 g, 35,95 mol) en diclorometano (150,00 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (43,91 ml, 593,12 mmol). La disolución de reacción se agitó durante 3 horas a 10 °C. La disolución de reacción se concentró al vacío para proporcionar un residuo. Al residuo se le añadió una disolución de NaHCO<3>(100,00 ml) y se extrajo con diclorometano (100,00 ml). La fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró al vacío para obtener el Compuesto 10.
Etapa I: Se disolvió el Compuesto 10 (5,00 g, 15,56 mmol) en tolueno (20,00 ml) y se añadió el Compuesto 11 (8,04 g, 31,11 mmol). La disolución de reacción se agitó durante 12 horas a 120 °C en una atmósfera de N<2>. Después, la disolución de reacción se inactivó con agua (100,00 ml) y se extrajo con acetato de etilo (100,00 ml x 2). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con agua (80,00 ml x 2) y se secaron con sulfato de sodio anhidro, luego se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó con una columna de fase inversa y luego se purificó con HPLC (columna: Phenomenex Luna C18 de 250 x 50 mm x 10 gm; fase móvil: [agua (0,225% de ácido fórmico)-acetonitrilo]; gradiente de elución: 35%-70%, 25 min) para proporcionar el Compuesto 12.
Etapa J: Se disolvió el Compuesto 12 (875,00 mg, 1,90 mmol) en tolueno (20,00 ml) y 1,2-dimetoxietano (20,00 ml), y luego se añadió tetraclorobenzoquinona (1,40 g, 5,69 mmol). La disolución de reacción se agitó durante 12 horas a 120 °C. La disolución de reacción se enfrió a temperatura ambiente, y luego se añadió una disolución saturada de Na2CO3 (50,00 ml) y acetato de etilo (60,00 ml). La mezcla se agitó durante 20 min a 10-15 °C y se separó la fase orgánica. A la fase orgánica se le añadió una disolución de HCl 2,00 M (60,00 ml), después se agitó durante 20 min a 10-15 °C y se separó. La fase orgánica separada se lavó nuevamente con una disolución de HCl 2 M (60,00 ml x 2), se separó, luego se añadieron a la fase acuosa una disolución de NaOH 2 M (200,00 ml) y diclorometano (200,00 ml), y luego se separó. La fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró al vacío para proporcionar el Compuesto 13.
Etapa K: Se disolvió el Compuesto 13 (600,00 mg, 1,31 mmol) en metanol (6,00 ml) y se añadió una disolución de NaOH 4,00 M (2,00 ml, 6,39 eq.). La disolución de reacción se agitó durante 0,25 horas a 15 °C. El pH de la disolución de reacción se ajustó a 3-4 con una disolución de HCl 1,00 M y después la disolución de reacción se extrajo con diclorometano (50,00 ml x 3). Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con salmuera (50,00 ml) y se secaron con sulfato de sodio anhidro, luego se filtraron y se concentraron al vacío para proporcionar el compuesto de fórmula (I). Valor deee(exceso enantiomérico): 100%.
Método de SFC (cromatografía de fluidos supercríticos):
Columna: Chiralcel OD-3 de 100 mm x 4,6 mm, D.I., 3 gm.
Fase móvil: 5%-40% de metanol (0,05% de dietilamina) en CO<2>.
Caudal: 3 ml/min.
Longitud de onda: 220 nm.
Ejemplo 2 Preparación de la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I)
Etapa A: El compuesto de fórmula (I) (1,89 kg) se añadió a etanol (9,5 l), luego se calentó a reflujo para disolverlo, seguido de enfriamiento en gradiente. Cuando el sistema de reacción se enfrió hasta aproximadamente 25 °C, precipitó una gran cantidad de sólido, seguido de filtración para obtener el sólido.
Etapa B: El sólido obtenido en la Etapa A se añadió a agua (9,5 l) y se agitó durante 3-5 horas a temperatura ambiente, y luego se filtró para obtener el sólido.
Etapa C: El sólido obtenido en la Etapa B se secó durante 48-72 horas en el horno a 45-50 °C, para obtener la forma cristalina A del compuesto de fórmula (I). Espectro de masas: [M+H]+=432,2. 1H RMN (400<m>H<z>, CDCh) 5 15,72 (s ancho, 1H), 8,32-8,93 (m, 1H), 6,60-6,93 (m, 2H), 6,51 (s ancho, 1H), 4,38-4,63 (m, 2H), 4,11 (dd ancho, J=4,52, 12,23 Hz, 3H), 3,79-3,87 (m, 3H), 3,46-3,54 (m, 2H), 3,29 (s, 3H), 2,07 (quin, 7=6,24 Hz, 2H), 0,77-1,21 (m, 9H). Ejemplo 3 Ensayoin vitrocon VHB del compuesto de fórmula (I)
Materiales experimentales:
1. Línea celular: células HepG2.2.15
Medio de cultivo celular HepG 2.2.15 (DMEM/F12, Invitrogen-11330032; 10% de suero, Invitrogen-10099141; 100 unidades/ml de penicilina y 100 gg/ml de estreptomicina, Hyclone-SV30010; 1% de aminoácidos no esenciales, Invitrogen 11140050; 2 mm de L-glutamina, Invitrogen-25030081; 300 gg/ml de geneticina, Invitrogen-10131027) 2. Reactivos:
Pancreatina (Invitrogen-25300062)
DPBS (Corning-21031CVR)
DMSO (Sigma-D2650-100 ml)
Kit de purificación de ADN de alto rendimiento (QIAamp 96 DNA Blood Kit, Qiagen-51162)
Reactivo de sonda universal de inicio rápido cuantitativo (FastStart Universal Probe Master, Roche-04914058001) Kit de prueba cuantitativa del antígeno de superficie de la hepatitis B (Autobio, CL0310)
3. Consumibles e instrumentos:
Placa de cultivo celular de 96 pocilios (Corning-3599)
Incubadora con CO<2>(HERA-CELL-240)
Película de sellado óptico (ABI-4311971)
Placa de 96 pocillos para PCR cuantitativa (Applied Biosystems-4306737)
Instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia (sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems-7500) Métodos experimentales:
1. Se sembraron células HepG2.2.15 (4x104 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche a 37 °C, 5% de CO<2>.
2. El día 2, el compuesto se diluyó hasta un total de 8 concentraciones, con un gradiente de dilución de un tercio. Se añadieron diferentes concentraciones de compuestos a los pocillos de cultivo por duplicado. La concentración final de DMSO en el medio de cultivo fue del 0,5%. Se usó ETV (Entecavir) 10 pM como control de inhibición del 100%; se usó DMSO al 0,5% como control de inhibición al 0%.
3. El día 5, el medio de cultivo se reemplazó con medio de cultivo nuevo que contenía el compuesto.
4. El día 8 se recogió el medio de cultivo de los pocillos de cultivo y se tomaron algunas muestras para ELISA para determinar el contenido de antígeno S del virus de la hepatitis B; Se tomaron algunas muestras para la extracción de ADN utilizando el kit de purificación de ADN de alto rendimiento (Qiagen-51162).
5. La preparación de la disolución de reacción de PCR se muestra en la Tabla 2:
Tabla 2: Preparación de la disolución de reacción de PCR
Secuencia del cebador directo: GTGTCTGCGGCGTTTTATCA (SEQ ID N° 1)
Secuencia del cebador inverso: GACAAACGGGCAACATACCTT (SEQ ID N° 2)
Secuencia de la sonda: 5'+FAM+CCCTTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC (SEQ ID N23)+TAMRA-3'
6. Se añadieron 15 pl de la mezcla de reacción a cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos y luego se añadieron a cada pocillo 10 pl de muestra de ADN o patrón de ADN del VHB.
7. Los ajustes de reacción para la PCR son los siguientes: calentamiento a 95 °C durante 10 minutos; seguido de desnaturalización a 95 °C durante 15 segundos y extensión a 60 °C durante 1 minuto, para un total de 40 ciclos. 8. Determinación del contenido del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B mediante ELISA
Se añadieron 50 pl de muestra y patrón a una placa de reacción, respectivamente, seguido de la adición de 50 pl de conjugado enzimático a cada pocillo. La mezcla se agitó para mezclarla bien y luego se colocó en un baño a 37 °C durante 60 min. Luego se lavó la placa 5 veces con la disolución de lavado, seguido de la adición de 50 pl de sustrato iluminador a cada pocillo y se mezcló bien. La reacción se realizó a temperatura ambiente durante 10 min en la oscuridad. Finalmente se determinó la intensidad de la quimioluminiscencia mediante ELISA.
9. Análisis de los datos:
Cálculo del porcentaje de inhibición: % de inh. = (1 - valor de la muestra/valor del control de DMSO) x 100.
Cálculo de la CE<50>: la concentración inhibidora del 50% (CE<50>) del compuesto contra el VHB se calculó mediante el programa informático GraphPad Prism.
Resultados del experimento: la CE<50>del compuesto de fórmula (I) contra el ADN del VHB y el HBsAg fueron 2,55 nM y 3,88 nM, respectivamente.
Conclusiones del experimento: el compuesto de fórmula (I) de la presente descripción puede inhibir eficazmente el ADN del VHB y el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg).
Ejemplo 4 Estudio de la eficaciain vivodel compuesto de fórmula (I)
Materiales experimentales:
Ratones C57BL/6, HP-p-CD al 10% como vehículo, TDF (Tenofovir dipivoxil) como compuesto de referencia, el compuesto de fórmula (I) y virus recombinante rAAV8-1.3HBV.
Los reactivos del presente proyecto incluyeron principalmente el kit de ADN QIAamp96 y TaqMan<®>Universal PCR Master Mix, el kit de ensayo del antígeno de superficie de la hepatitis B.
El instrumento incluía una centrífuga (Beckman Allegra X-15R), un triturador de tejidos (QIAGEN-Tissue lyser II) y un espectrofotómetro (Thermo-NANODROP 1000).
Métodos experimentales:
a) A todos los ratones se les administró por vía oral el día 28 después de haberles inyectado el virus, y el día de la administración se designó como día 0. Antes de la administración, se recogió suero mediante extracción de sangre submandibular en todos los ratones. Los ratones recibieron la administración una vez al día durante cuatro semanas. El régimen de dosificación detallado se muestra en la Tabla 3.
b) Se recogió suero mediante extracción de sangre submandibular en todos los ratones dos veces por semana, y cada volumen de muestra fue de aproximadamente 100 gl. El tiempo detallado de extracción de sangre se muestra en la Tabla 3.
c) El día 28, se sacrificaron todos los ratones y se extrajo sangre del corazón para la recolección de suero.
d) Todas las muestras de suero se enviaron para su análisis.
Tabla 3 Protocolo experimentalin vivo
Resultados del experimento:
La actividad anti-VHB del compuesto de ensayo en el modelo de ratones AAV/VHB se evaluó determinando el contenido de HBsAg en el suero de los ratones. Los resultados se muestran en la Tabla 4 y la Figura 4. Los cambios en el peso corporal de los ratones se muestran en la Figura 5.
Tabla 4 Contenido de HBsAg en los ratones en diferentes fechas tras la administración (UI/mL)
Conclusiones del experimento:
En el modelo de ratones AAV/VHB, el compuesto de la presente descripción fue capaz de reducir significativamente el HBsAg y los ratones tuvieron una buena tolerancia.
Claims (5)
- REIVINDICACIONES 1. Una forma cristalina A de un compuesto de fórmula (I), en donde la forma cristalina A tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo que comprende los picos de difracción característicos con los siguientes ángulos 20: 8,04°±0,2°, 16,52°±0,2° y 19,52°±0,2°, medido utilizando radiación Cu-Ka.
- 2. La forma cristalina A de la reivindicación 1, en la que el patrón de difracción de rayos X en polvo comprende los picos de difracción característicos con los siguientes ángulos 20: 8,04°±0,2°, 10,47°±0,2°, 11,90°±0,2°, 16,52°±0,2°, 18,06°±0,2°, 19,52°±0,2°, 22,02°±0,2° y 25,28°±0,2°.
- 3. La forma cristalina A de cualquiera de las reivindicaciones 1 -2 que tiene una curva de calorimetría diferencial de barrido con un inicio del pico endotérmico a 139,64 ± 5 °C, con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min.
- 4. La forma cristalina A de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que tiene una curva de análisis termogravimétrico con una pérdida de peso del 0,4757% a 125,23 °C ± 3 °C, con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min.
- 5. La forma cristalina A de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4 para el uso como un medicamento para tratar la hepatitis B.
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