KR20210094002A

KR20210094002A - B형 간염 표면 항원 억제제의 결정형

Info

Publication number: KR20210094002A
Application number: KR1020217019055A
Authority: KR
Inventors: 옌빈 후; 페이 순; 션이 쉬; 옌시아오 수; 찰스 지 딩
Original assignee: 푸젠 코선터 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2021-07-28
Also published as: AU2019382521A1; BR112021009770A2; EP3885349A1; EP3885349A4; TWI726497B; KR102606946B1; AU2019382521B2; JP2022513119A; CA3120532A1; TW202019938A; CA3120532C; JP7138246B2; US20220017536A1; CN112368288A; EP3885349B1; CN112368288B; ES2961520T3; WO2020103924A1; ZA202103974B

Abstract

본 발명은 B형 간염 표면 항원 억제제의 결정형 및 이의 제조 방법에 관한 것이고, 또한 B형 간염 표면 항원 억제제를 제조하기 위한 상기 결정형의 용도에 관한 것이다:

Description

B형 간염 표면 항원 억제제의 결정형

본 발명은 B형 간염 표면 항원 억제제의 결정형 및 이의 제조 방법에 관한 것이고, B형 간염 표면 항원 억제제를 제조하기 위한 상기 결정형의 용도를 더 포함한다.

관련된 출원의 상호참조

본원은 2018년 11월 22일자 출원된 중국 특허 출원 CN 201811399514.3을 우선권 주장한다. 본원 발명은 이 중국 특허 출원의 전체 문장을 인용한다.

B형 간염이라고 약칭하는 B형 바이러스성 간염은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV라고 약칭함)에 의해 유기체를 감염시킨 후 일으키는 질환이다. B형 간염 바이러스는 주로 간세포에 존재하고 간세포를 손상시켜 간세포 염증, 괴사, 섬유화를 일으키는 간친화성 바이러스이다. B형 바이러스성 간염은 급성 및 만성 두 가지 유형이 있다. 급성 B형 간염은 대부분의 성인에서 자체 면역 메커니즘을 통해 스스로 치유될 수 있다. 그러나 만성 B형 간염(CHB)은 이미 전세계 건강 보건이 직면한 큰 도전이 되었고, 동시에 만성 간질환, 간경변(cirrhosis) 및 간암(HCC)을 일으키는 주요 원인이기도 하다. 전세계에는 20억명의 사람들이 만성 B형 간염 바이러스에 감염되었고, 3억 5천만명이 B형 간염으로 발전하였고, 매년 거의 60만명이 만성 B형 간염의 합병증으로 사망하는 것으로 추정된다. 중국은 B형 간염 발병률이 높은 지역이고, B형 간염 누적 환자가 많으며, 피해가 심각하다. 자료에 따르면, 중국에는 B형 간염 바이러스 감염자가 약 9300만인데, 여기서 약 2000만 환자가 만성 B형 간염으로 진단을 받았고, 그 중 10% 내지 20%는 간경변으로 발전할 수 있으며, 1% 내지 5%는 간암으로 발전할 수 있다.

B형 간염의 기능성 치유의 핵심은 HBsAg(B형 간염 바이러스 표면 항원)를 제거하고, 표면 항체를 생성하는 것이다. HBsAg 정량화는 매우 중요한 생물학적 지표이다. 만성 감염 환자에서, HBsAg의 감소와 혈청 전환은 거의 관찰되지 않고, 이는 현재 치료의 종점이다.

B형 간염 바이러스(HBV)의 표면 항원 단백질은 HBV가 간세포를 침입하는 과정에서 매우 중요한 역할을 하고, HBV 감염의 예방 및 치료에 매우 중요한 의미가 있다. 표면 항원 단백질은 대형(L), 중형(M) 및 소형(S) 표면 항원 단백질을 포함하고, 공통한 C 단 S 영역을 공유한다. 이들은 오픈 리딩 프레임에서 발현되고, 이의 상이한 길이는 리딩 프레임의 세 개의 AUG 시작 코돈에 의해 결정된다. 이 세 개의 표면 항원 단백질은 프론트 S1/프론트 S2/S, 프론트 S2/S 및 S 도메인을 포함한다. HBV 표면 항원 단백질은 소포체(ER) 막에 통합되고, N 말단 신호 서열에 의해 시작된다. 이들은 바이로좀의 기본 구조를 구성할 뿐만 아니라, 구형 및 필라멘트 서브 바이러스 입자(SVPs, HBsAg)를 형성하고, ER, 숙주 ER 및 프론트골지장치에 모이며, SVP는 대부분의 S 표면 항원 단백질을 포함한다. L 단백질은 바이러스의 형태 형성과 뉴클레오캡시드의 상호 작용 면에서 아주 중요한 것이지만, SVP의 형성에는 필요하지 않는다. 이들은 뉴클레오캡시드가 부족하기 때문에, 상기 SVP는 비감염성인 것이다. SVP는 질환 진행, 특히 B형 간염 바이러스의 면역 응답에 크게 참여하고, 감염자의 혈액에서, SVP의 양은 적어도 바이러스 수의 10,000배이며, 면역 체계를 가두어, B형 간염 바이러스에 대한 인체의 면역 반응을 약화시킨다. HBsAg는 또한 인간의 타고난 면역을 억제할 수 있고, 다당류(LPS) 및 IL-2에 의해 유도된 사이토카인의 생성을 억제할 수 있으며, 수지상 세포 DC 기능 및 LPS가 ERK-1/2 및 c-Jun N 말단에 대한 간섭 키나아제-1/2이 단핵 세포에서의 유도 활성을 억제한다. 간경변 및 간세포암의 질환 진행이 HBsAg의 지속적인 분비와 크게 관련되어 있다는 점을 유의해야 한다. 이러한 연구 결과는 HBsAg가 만성 간염의 진행에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

현재 승인된 항 HBV 약물은 주로 면역 조절제(인터페론-α 및 페그인터페론-α-2α) 및 항 바이러스 치료 약물(라미부딘, 아데포비르디피복실, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르, 클레부딘 등)이다. 여기서, 항 바이러스 치료 약물은 뉴클레오티드 약물이고, 이의 작용 메커니즘은 HBV DNA의 합성을 억제하는 것이며, HBsAg 수준을 직접 감소시킬 수 없다. 치료 연장과 마찬가지로, 뉴클레오티드 약물은 HBsAg 제거 속도가 자연 관찰 결과와 유사한 것을 나타낸다.

기존 임상 치료법은 HBsAg를 감소시키는 효과가 좋지 않으므로, HBsAg를 효과적으로 감소시킬 수 있는 소분자 경구 억제제의 개발이 현재 임상 약물 치료에 절실히 필요하다.

Roche 회사는 B형 간염 치료에 사용되는 RG7834라는 표면 항원 억제제를 개발하였고, 이 화합물이 우드척 B형 간염 모델에서의 약물 효과를 보도하였다. RG7834를 단일 약물로 사용하면 2.57개의 Log의 표면 항원을 감소시킬 수 있고, 1.7개의 Log의 0HBV-DNA를 감소시킬 수 있다. 이 화합물의 활성은 우수하지만, 분자 합성 과정에서, 이성질체를 분해해야 하기에, 수율을 감소시키고, 비용을 증가한다.

WO 2017013046A1은 B형 간염 바이러스 감염을 치료하거나 예방하기 위한 일련의 2-옥소-7,8-디히드로-6H-피리도[2,1,a][2]벤조아제핀-3-카르복실산 유도체를 개시하였다. 이 일련의 축합 고리 화합물의 최고 활성 실시예 3의 IC₅₀은 419nM이고, 활성은 큰 향상 공간이 존재한다. 이 일련의 화합물에 포함된 키랄 중심은 비대칭으로 합성하기가 어렵다. 일반적으로 7원 탄소 고리의 수용성은 좋지 않고 산화 대사가 발생하기 용이하다.

기술적 과제

본 발명은 식 (I)의 화합물의 A 결정형을 제공하는데, 이의 X-선 분말 회절 패턴은 8.04°±0.2°, 16.52°±0.2°, 19.52°±0.2°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는다.

본 발명의 일부 방안에서, 상기 A 결정형의 X-선 분말 회절 패턴은 8.04°±0.2°, 10.47°±0.2°, 11.90°±0.2°, 16.52°±0.2°, 18.06°±0.2°, 19.52°±0.2°, 22.02°±0.2°, 25.28°±0.2와 같은 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 갖는다.

본 발명의 일부 방안에서, 상기 A 결정형의 X-선 분말 회절 패턴은 도 1에 도시된 바와 같다.

본 발명의 일부 방안에서, 상기 A 결정형의 XRPD 패턴 분석 데이터는 표 1에 표시된 바와 같다.

[표 1]

식 (I)의 화합물의 A 결정형의 XRPD 패턴 분석 데이터

본 발명의 일부 방안에서, 상기 A 결정형의 시차 주사 열량계 곡선은 139.64±5℃에서 흡열 피크의 시작점을 갖는다.

본 발명의 일부 방안에서, 상기 A 결정형의 시차 주사 열량계 곡선 패턴은 도 2에 도시된 바와 같다.

본 발명의 일부 방안에서, 상기 A 결정형의 열 중량 분석 곡선은 125.23±3℃에서 0.4757%의 중량 손실을 갖는다.

본 발명의 일부 방안에서, 상기 A 결정형의 열 중량 분석 곡선 패턴은 도 3에 도시된 바와 같다.

본 발명은 B형 간염을 치료하는 약물을 제조하기 위한 상기 A 결정형의 용도를 더 제공한다.

발명의 효과

본 발명의 화합물은 현저한 항 B형 간염 바이러스 활성을 갖는다. 본 발명의 화합물은 중간 정도의 혈장 단백질 결합률을 갖고, 시토크롬 P450 동종 효소에 대한 억제가 없으며, 약물-약물 상호 작용 위험이 낮고; 래트, 인간 및 마우스 등 세 가지 종속에서의 간 마이크로솜의 안정성이 우수하며, 화합물이 쉽게 대사되지 않고; 우수한 노출량 및 생체 이용률을 가지며; 단일 투여의 신경 독성 연구에서 내성이 우수하다. 본 발명의 화합물의 합성 공정은 간단하고 경제적이다.

본 발명의 결정형은 용해성이 우수하고, 획득하기 용이하며, 물리적 안정성 및 화학적 안정성이 모두 우수하다.

정의 및 설명

달리 설명되지 않는 한, 본문에서 사용되는 다음 용어 및 문구는 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다. 하나의 특정된 문구 또는 용어는 특별한 정의가 없는 경우에 불확실하거나 불명확한 것으로 간주되어서는 아니되고, 일반적인 의미로 이해되어야 한다. 본문에서 상품명이 나타날 경우, 이의 대응되는 상품 또는 이의 활성 성분을 지칭하려는 것으로 의도된다.

본 발명의 중간체 화합물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 다양한 합성 방법을 통해 제조될 수 있고, 하기 열거된 구체적인 실시형태, 이를 다른 화학 합성 방법과 결부시켜 형성된 실시형태 및 본 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 동등한 대체 방식을 포함하며, 바람직한 실시형태는 본 발명의 실시예를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시형태의 화학 반응은 적절한 용매에서 완성되고, 상기 용매는 본 발명의 화학적 변화 및 이에 필요한 시약 및 재료에 적합해야 한다. 본 발명의 화합물을 획득하기 위하여, 때로는 본 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기존의 실시형태의 기초 상에서 합성 단계 또는 반응 흐름을 수정하거나 선택하는 것이 필요하다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 구체적으로 설명하고, 이러한 실시예는 본 발명을 어떠한 방식으로 제한하려는 의도가 아니다.

본 발명에서 사용되는 모든 용매는 시판되는 것이고, 더 정제할 필요가 없이 사용할 수 있다.

화합물은 수동으로 또는 ChemDraw® 소프트웨어에 의해 명명되고, 시판 화합물은 공급 업체 목록 명칭을 사용한다.

본 발명의 X-선 분말 회절(X-ray powder diffractometer, XRPD) 방법

기기 모델: 단동 호원 DX-2700BH X-선 회절계.

테스트 방법: XRPD 검출에 약 10~20mg의 샘플을 사용한다.

상세한 XRPD 파라미터는 다음과 같다.

광 파이프: Cu, kα,

광관 전압: 40 kV, 광관 전류: 30 mA.

발산 슬롯: 1 mm.

검출기 슬롯: 0.3 mm.

비산 방지 슬롯: 1 mm.

스캐닝 범위: 3 내지 40 °.

스텝 직경: 0.02 °.

스텝 크기: 0.5 초

본 발명의 시차 주사 열량 분석(Differential Scanning Calorimeter, DSC) 방법

기기 모델: METTLER TOLEDO DSC1 시차 주사 열량계.

테스트 방법: 샘플(2 내지 6mg)을 취하여 30 UL의 DSC 금도금 오토클레이브에 넣고 테스트하며, 10℃/분의 승온 속도로 샘플을 40℃에서 350℃로 가열한다.

본 발명의 열 중량 분석(Thermal Gravimetric Analyzer, TGA) 방법

기기 모델: TA TGA550 열 중량 분석기.

테스트 방법: 샘플(2 내지 10mg)을 취하여 알루미늄 도가니에 넣은 후, 백금 행잉 바스켓에 넣어 테스트하고, 질소 가스(N₂) 조건 하에서, 40 mL/분의 가스 유속, 10℃/분의 승온 속도로 샘플을 40℃에서 500℃로 가열한다.

도 1은 식 (I)의 화합물의 A 결정형의 Cu-Kα 방사선의 XRPD 스펙트럼이다.
도 2는 식 (I)의 화합물의 A 결정형의 DSC 스펙트럼이다.
도 3은 식 (I)의 화합물의 A 결정형의 TGA 스펙트럼이다.
도 4는 마우스에 투여 후 상이한 날짜의 HBsAg 함량(IU/mL)이다.
도 5는 마우스에 투여 후 상이한 날짜의 체중 변화이다.

본 발명의 내용을 보다 잘 이해하기 위하여, 이하 구체적인 실시예를 결부하여 더 설명하지만 구체적인 실시형태는 본 발명의 내용을 제한하는 것이 아니다.

실시예 1

식 (I)의 화합물의 제조

단계 A: 0℃를 유지하는 전제하에, 화합물 1(100.00g, 762.36mmol, 1.00당량)의 테트라히드로푸란(400.00ml) 용액에 테트라히드로리튬알루미늄(80.00g, 2.11mol, 2.77당량)을 넣는다. 용액을 10℃ 하에서 10시간 동안 교반하였다. 다음 교반하는 전제하에 반응액에 80.00ml의 물을 넣고 240.00ml의 15% 수산화나트륨 수용액을 넣으며 80.00ml의 물을 넣는다. 얻은 현탁액을 10℃에서 20분 동안 교반하고 여과하여 무색 투명한 액체를 얻었다. 감압 농축하여 화합물 2를 얻었다.

단계 B: 화합물 2(50.00g, 426.66mmol) 및 트리에틸아민(59.39ml, 426.66mmol)을 디클로로메탄(500.00ml)에 용해시키고 디-tert-부틸디카보네이트(92.19g, 422.40mmol)를 디클로로메탄(100.00ml)에 용해시키며 0℃에서 이전 반응액에 천천히 적가하였다. 다음 반응액을 25℃에서 12시간 교반하였다. 반응액을 포화 식염수(600.00ml)로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키며 유기상을 감압 농축 및 스핀 건조시킨 후, 메틸 tert-부틸에테르/석유 에테르(50.00/100.00)로 재결정하여 화합물 3을 얻었다.

단계 C: 염화티오닐(100.98ml, 1.39 mmol)을 아세토니트릴(707.50ml)에 용해시키고 화합물 3(121.00g, 556.82mmol)을 아세토니트릴(282.90ml)에 용해시키며 -40℃에서 이전 반응액에 적가하고 적가 완료 후, 피리딘(224.72ml, 2.78mol)을 반응액에 한꺼번에 넣는다. 얼음 욕을 제거하고 반응액을 5 내지 10℃ 하에서 1시간 동안 교반하였다. 감압 스핀하여 건조시킨 후, 에틸아세테이트(800.00ml)를 넣고 고체가 석출되며 여과하고 여액을 감압 농축하였다. 단계 2: 얻은 오일 및 삼염화루테늄 수화물(12.55g, 55.68mmol)을 아세토니트릴(153.80ml)에 용해시키고 과요오드산 나트륨(142.92g, 668.19mmol)을 물(153.80ml)에 현탁시키며 상기 반응액에 천천히 넣고 최종 반응 혼합액을 5 내지 10℃ 하에서 0.15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 여과하여 여액을 얻고 에틸아세테이트(800.00mlХ2)로 추출하며 유기상을 포화 식염수(800.00ml)로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키며 여과하고 감압 농축 및 스핀 건조시켰다. 컬럼(실리카, 석유 에테르/에틸아세테이트=50/1 내지 20/1)으로 정제하여 화합물4를 얻었다.

단계 D: 화합물 5(100.00g, 657.26mmol)를 아세토니트릴(1300.00ml)에 용해시키고 탄산칼륨(227.10g, 1.64mol) 및 1-브로모-3-메톡시프로판(110.63g, 722.99mmol)을 넣었다. 반응액을 85℃에서 6시간 동안 교반하였다. 반응액을 600.00ml(200.00mlХ3)의 에틸아세테이트로 추출하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 여과하며 감압 농축하여 화합물 6을 얻었다.

단계 E: 화합물 6(70.00g, 312.15 mmol)을 디클로로메탄에 용해시키고 m-클로로퍼옥시벤조산(94.27g, 437.01mmol)에 넣으며 반응물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응액을 냉각시킨 후, 여과하고 여액을 디클로로메탄으로 추출하며 유기상을 2000.00ml(400.00mlХ5)의 포화 탄산수소나트륨 용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키며 감압 농축하였다. 얻은 갈색 오일 형태 물질을 가능한 적은 메탄올로 용해시킨 후, 2mol/L의 수산화칼륨(350.00ml) 용액(발열성)을 넣었다. 짙은 반응액을 실온에서 20분 동안 교반하고 37%의 염산으로 반응액의 pH를 5로 조절하였다. 400.00ml(200.00mlХ2)의 에틸아세테이트로 추출하고 유기상을 200.00ml(100.00mlХ2)의 포화 식염수로 세척하며 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 농축하여 화합물 7을 얻었다.

단계 F: 화합물 7(33.00g, 155.48 mmol)을 테트라히드로푸란(330.00ml)에 용해시키고 파라포름알데히드(42.02g, 466.45mmol), 염화마그네슘(29.61g, 310.97mmol), 트리에틸아민(47.20g, 466.45mmol, 64.92ml)을 넣었다. 반응액을 80℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 25℃에서 2mol의 염산 용액(200.00ml)으로 퀀칭시킨 후, 600.00ml(200.00mlХ3)의 에틸아세테이트로 추출하고 유기상을 400.00ml(200.00mlХ2)의 포화 식염수로 세척하며 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하며 감압 농축하여 찌꺼기를 얻었다. 찌꺼기를 에탄올(30.00ml)로 세척하고 여과하여 필터 케이크를 얻었다. 따라서 화합물 8을 수득하였다.

단계 G: 화합물 8(8.70g, 36.21mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(80.00ml)에 용해시키고 탄산칼륨(10.01g, 72.42mmol) 및 화합물 4(11.13g, 39.83mmol)를 넣으며 반응액을 50℃ 하에서 2시간 동안 교반하였다. 반응액을 1.00mol/L 염산 수용액(200.00ml)으로 퀀칭시키고 에틸아세테이트(150.00mlХ2)로 추출하였다. 병합된 유기상을 물(150.00mlХ3)로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키며 여과하고 감압 농축하여 화합물 9를 얻었다.

단계 H: 화합물 9(15.80g, 35.95mmol)를 디클로로메탄(150.00ml)에 용해시키고 트리플루오로아세트산(43.91ml, 593.12mmol)을 넣었다. 반응액을 10℃ 하에서 3시간 동안 교반하였다. 반응액을 감압 농축 및 스핀 건조시키고, 탄산수소나트륨 수용액(100.00ml)을 넣으며 디클로로메탄(100.00ml)으로 추출하였다. 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하며 감압 농축하여 화합물 10을 얻었다.

단계 I: 화합물 10(5.00g, 15.56mmol)을 톨루엔(20.00ml)에 용해시키고 화합물 11(8.04g, 31.11mmol)의 반응액을 넣으며 질소 가스 보호 하에 120℃에서 12시간 교반하였다. 반응액을 물(100.00ml)로 퀀칭시키고 에틸아세테이트(100.00mlХ2)로 추출하며 병합된 유기상을 물(80.00mlХ2)로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시키며 여과하고 감압 농축하였다. 찌꺼기를 역상 컬럼으로 정제하였다. 다시 고성능 액체 제조 크로마토그래피(컬럼: Phenomenex luna C18 250Х50mmХ10μm; 이동상: [물(0.225% 포름산)-아세토니트릴]로 정제하고; 용출 구배: 35% 내지 70%, 25분)로 정제하여 화합물 12를 얻었다.

단계 J: 화합물 12(875.00mg, 1.90mmol)를 톨루엔(20.00ml) 및 에틸렌글리콜디메틸에테르(20.00ml)에 용해시키고 테트라클로로벤조퀴논(1.40g, 5.69mmol)을 넣었다. 반응액을 120℃ 하에서 12시간 교반하였다. 반응액을 실온으로 냉각시키고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(50.00ml) 및 에틸아세테이트(60.00ml)를 넣었다. 혼합액을 10 내지 15℃ 하에서 20분 동안 교반하고 분액하여 유기상을 얻었다. 유기상을 2.00mol/L의 염산 수용액(60.00ml)에 넣고 10 내지 15℃ 하에서 20분 동안 교반하며 분액하고 유기상을 다시 2mol/L의 염산 수용액(60.00mlХ2)으로 세척하며 분액하고 수상에 2mol/L의 수산화나트륨 수용액(200.00ml) 및 디클로로메탄(200.00ml)을 넣었다. 분액하고 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키며, 여과하고 감압 농축하여 화합물 13을 얻었다.

단계 K: 화합물 13(600.00mg, 1.31mmol)을 메탄올(6.00ml)에 용해시키고 4.00mol/L의 수산화나트륨 수용액(2.00ml, 6.39당량)에 넣었다. 반응액을 15℃ 하에서 0.25시간 동안 교반하였다. 반응액을 1.00mol/L의 염산 수용액으로 pH 3 내지 4로 조절한 후, 디클로로메탄(50.00mlХ3)으로 추출하고 유기상을 병합하며 포화 식염수로 세척(50.00ml)하고 무수 황산나트륨으로 건조시키며 여과하고 감압 농축하여 식 (I)의 화합물을 얻었다. ee 값(거울상 이성질체 과량): 100%.

SFC(초임계 유체 크로마토그래피)방법:

컬럼: Chiralcel OD-3 100mmХ4.6mm, 3μm.

이동상: 이산화탄소 중 메탄올(0.05%의 디에틸아민), 5%~40%.

유속: 분당 3ml.

파장: 220nm.

실시예 2

식 (I)의 화합물의 A 결정형의 제조

단계 A: 식 (I)의 화합물(1.89 Kg)을 에탄올(9.5 L)에 넣은 후, 용해될 때까지 가열 환류시키고 점차적으로 온도를 낮추며 반응 시스템의 온도를 25℃ 정도로 하강시킬 경우, 다량의 고체가 석출되고 여과하여 고체를 얻었다.

단계 B: 단계 A에서 얻은 고체를 물(9.5 L)에 넣고 실온에서 3 내지 5시간 동안 교반한 후, 여과하여 고체를 얻었다.

단계 C: 단계 B에서 얻은 고체를 45 내지 50℃의 오븐에서 48 내지 72시간 동안 베이킹하여 식 (I)의 화합물의 A 결정형을 얻었다. 질량 스펙트럼: [M+H]+ = 432.2. ¹H NMR (400 MHz, 중수소화 클로로포름) δ 15.72 (br s, 1H), 8.32-8.93 (m, 1H), 6.60-6.93 (m, 2H), 6.51 (br s, 1H), 4.38-4.63 (m, 2H), 4.11 (br dd, J=4.52, 12.23 Hz, 3H), 3.79-3.87 (m, 3H), 3.46-3.54 (m, 2H), 3.29 (s, 3H), 2.07 (quin, J=6.24 Hz, 2H), 0.77-1.21 (m, 9H).

실시예 3

식 (I)의 화합물의 HBV 체외 활성 테스트

실험 재료:

1. 세포주: HepG2.2.15 세포

HepG2.2.15 세포 배지(DMEM/F12, Invitrogen-11330032; 10% 혈청, Invitrogen-10099141; 1ml당 100단위의 페니실린 및 100μg/mL의 스트렙토마이신, Hyclone-SV30010; 1%의 비필수아미노산, Invitrogen-11140050; 2mm L-GLUTAMINE, Invitrogen-25030081; 300μg/mL Geneticin, Invitrogen-10131027)

2. 시약:

트립신(Invitrogen-25300062)

DPBS(Corning-21031CVR)

디메틸설폭사이드(Sigma-D2650-100ML)

고처리량 DNA 정제 키트(QIAamp 96 DNA Blood Kit, Qiagen-51162)

정량 신속 시작 범용 프로브 시약(FastStart Universal Probe Master, Roche-04914058001)

B형 간염 표면 항원 정량 검출 키트(오토 바이오(autobio), CL 0310)

3. 소모품 및 기기:

96웰 세포 배양 플레이트(Corning-3599)

CO₂ 인큐베이터(HERA-CELL-240)

광학 밀봉 필름(ABI-4311971)

정량 PCR 96웰 플레이트(Applied Biosystems-4306737)

형광 정량 PCR기(Applied Biosystems-7500 real time PCR system)

실험 방법:

1. HepG2.2.15 세포(4Х10⁴ 세포/웰)를 96웰 플레이트에 접종시키고 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤 배양하였다.

2. 2일째, 화합물을 희석하고 총 8개의 농도, 3배의 구배로 희석하였다. 상이한 농도의 화합물을 배양 웰에 넣고, 이중 반복 웰로 하여 배양시켰다. 배양액에서 디메틸설폭사이드의 최종 농도는 0.5%이었다. 10μm의 ETV(엔테카비르)를 100% 억제 대조군으로 사용하고; 0.5%의 디메틸설폭사이드를 0% 억제 대조군으로 사용한다.

3. 5일째, 화합물을 함유하는 신선한 배양액을 교체하였다.

4. 8일째에 배양 웰의 배양액을 수집하고, 일부 샘플을 취하여 B형 간염 바이러스 S 항원의 함량을 ELISA 측정하며; 일부 샘플을 취하여 고처리량 DNA 정제 키트(Qiagen-51162)를 사용하여 DNA를 추출하였다.

5. PCR 반응액의 조제는 표 1에 표시된 바와 같다.

[표 2]

PCR 반응액의 조제

정방향 프라이머 서열: GTGTCTGCGGCGTTTTATCA (서열번호 1)

역방향 프라이머 서열: GACAAACGGGCAACATACCTT (서열번호 2)

프로브 서열: 5'+FAM+CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC (서열번호 3)+ TAMRA-3'

6. 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 15μL의 반응 혼합액을 넣은 후, 각 웰에 10μL의 샘플 DNA 또는 HBV DNA의 표준품을 넣었다.

7. PCR의 반응 조건은 다음과 같다. 95℃에서 10분 동안 가열한 후, 95℃에서 15초 동안 변성시키고 60℃에서 1분 동안 연장하되, 모두 40개의 사이클이었다.

8. B형 간염 바이러스 S 항원의 함량을 ELISA 측정하였다.

50μL의 샘플 및 표준품을 반응 플레이트에 각각 넣고 각 웰에 50μL의 효소 접합체를 각각 넣어 진탕하여 균일하게 혼합하고 37℃에서 60분 동안 온수 욕을 진행한 후, 세척액으로 플레이트를 5번 세척한 다음 각 웰에 50μL의 발광 기질을 넣고 균일하게 혼합하며 실온에서 차광하여 10분 동안 반응시키고, 마지막으로 마이크로 플레이트 리더로 화학 발광 강도를 검출하였다.

9. 데이터 분석:

억제 백분율 계산: % Inh.=(1-샘플의 값/디메틸설폭사이드 대조값)Х100.

EC₅₀계산: GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 HBV에 대한 화합물의 50% 억제 농도(EC₅₀) 값을 계산하였다.

실험 결과: HBV-DNA 및 HBsAg에 작용하는 식 (I)의 화합물의 EC₅₀은 각각 2.55 nM 및 3.88 nM이었다.

실험적 결론: 본 발명의 식 (I)의 화합물은 HBV-DNA 및 B형 간염 표면 항원(HBsAg)을 효과적으로 억제할 수 있다.

실시예 4

식 (I)의 화합물의 체내 약물 효과 연구

실험 재료:

C57BL/6 마우스, 용매로서 10% HP-β-CD, 참조 화합물 TDF(테노포비르디소프록실푸마레이트), 식 (I)의 화합물, 재조합 바이러스 rAAV8-1.3HBV.

본 프로젝트의 주요 시약은 QIAamp96 DNA 키트 및 TaqMan® Universal PCR Master Mix, B형 간염 바이러스 표면 항원 검출 키트를 포함한다.

기기는 원심 분리기(Beckman Allegra X-15R), 조직 연마기(QIAGEN-Tissue lyser II) 및 분광 광도계(Thermo-NANODROP 1000)를 포함한다.

실험 방법:

a) 모든 마우스는 바이러스 주사 후 28일째에 경구 투여를 시작하고 이 날을 0일로 설정하였다. 투여 전, 모든 마우스의 턱밑에서 채혈하여 혈청을 수집하였다. 매일 한 번 투여하고 연속 4주 동안 투여하였다. 구체적인 투여 방법은 표 3을 참조하였다.

b) 모든 마우스는 일주일에 두 번 턱밑에서 채혈하여 혈청을 수집하되, 매번 채혈량은 약 100μL이었다. 구체적인 채혈 시간은 표 3을 참조한다.

c) 28일째, 모든 마우스를 안락사시키고, 심장에서 채혈하여 혈청을 수집하였다.

d) 모든 혈청 샘플은 검출을 위해 보냈다.

[표 3]

체내 실험 방법

실험 결과: 혈청 내 HBsAg 함량을 검출하여 AAV/HBV 마우스 모델에서의 시험 화합물의 항 HBV 활성을 평가하였다. 결과는 표 4 및 도 4를 참조한다. 마우스 체중 변화는 도 5를 참조한다.

[표 4]

마우스에 투여 후 상이한 날짜의 HBsAg 함량(IU/mL)

실험적 결론: AAV/HBV 마우스 모델 실험에서, 본 발명의 화합물은 HBsAg를 현저히 감소시킬 수 있고 마우스는 우수한 내성을 나타내었다.

SEQUENCE LISTING <110> FUJIAN COSUNTER PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Crystal Form of Hepatitis B Surface Antigen Inhibitor <130> P21413875KR <140> PCT/CN2019/120169 <141> 2019-11-22 <150> CN 201811399514.3 <151> 2018-11-22 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence <400> 1 gtgtctgcgg cgttttatca 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence <400> 2 gacaaacggg caacatacct t 21 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe nucleotide sequence <400> 3 cctctkcatc ctgctgctat gcctcatc 28

Claims

8.04°±0.2°, 16.52°±0.2° 및 19.52°±0.2°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 포함하는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물의 A 결정형:

.
제1항에 있어서,
X-선 분말 회절 패턴이 8.04°±0.2°, 10.47°±0.2°, 11.90°±0.2°, 16.52°±0.2°, 18.06°±0.2°, 19.52°±0.2°, 22.02°±0.2° 및 25.28°±0.2°의 2θ 각도에서 특징적인 회절 피크를 포함하는 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물의 A 결정형.
제2항에 있어서,
X-선 분말 회절 패턴이 도 1에 도시된 바와 같은 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물의 A 결정형.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
139.64±5℃에서 흡열 피크의 시작점을 갖는 시차 주사 열량계 곡선을 갖는 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물의 A 결정형.
제4항에 있어서,
시차 주사 열량계 곡선의 패턴이 도 2에 도시된 바와 같은 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물의 A 결정형.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
125.23±3℃에서 0.4757%의 중량 손실을 갖는 열 중량 분석 곡선을 갖는 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물의 A 결정형.
제6항에 있어서,
열 중량 분석 곡선의 패턴이 도 3에 도시된 바와 같은 것을 특징으로 하는 식 (I)의 화합물의 A 결정형.
B형 간염을 치료하는 약물의 제조에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 A 결정형의 용도.