具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细描述,但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明,其中也公开了其具体实施例方式,对本领域的技术人员而言,在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
实施例1
步骤A:将1-1(200.00克,1.19摩尔)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(1000.00毫升),加入碳酸钾(164.39克,1.19摩尔),然后在90摄氏度经过一个小时滴加1-溴-3-甲氧基-丙烷(182.01克,1.19摩尔)。混合物在90摄氏度搅拌15小时。反应液加入乙酸乙酯3升(1升×3),合并的有机相,用水15.00升(3.00升×5),和饱和食盐水3.00升(1.00升×3)洗涤,通过无水硫酸钠干燥,并减压浓缩得到粗产品。再经硅胶柱层析纯化(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯=1/0)得到化合物1-2。
步骤B:将1-2(80.00克,332.98毫摩尔)溶解在乙腈中(800.00毫升),然后加入氯代丁二酰亚胺(44.46克,332.98毫摩尔)混合物在90摄氏度搅拌三小时。先旋出一半体积的乙腈,然后加入水200.00毫升和乙酸乙酯300.00毫升。分离出的有机相用氯化铵溶液(100.00毫升)洗涤。然后通过无水硫酸钠干燥,并减压浓缩得到黄色油状化合物,化合物用甲醇溶液打浆,得到1-3。
步骤C:向1-3(76.00克,276.67毫摩尔),溴化苄(52.05克,304.34毫摩尔,36.15毫升)的N,N-二甲基甲酰胺(800.00毫升)溶液中加入碳酸钾(76.48克,553.34毫摩尔)。混合溶液在25摄氏度下搅拌16小时。乙酸乙酯(900.00毫升)和水(1000.00毫升)加入溶液中,分离有机相并经过水(1000.00毫升×2)洗饱和食盐水(300.00毫升×2)洗涤,然后通过无水硫酸钠干燥,并经减压浓缩得到化合物1-4。
步骤D:将1-4(92.00克,252.18毫摩尔)溶于甲醇溶液(500.00毫升),然后加入氢氧化钾溶液(6M,239.99毫升)。混合液在45摄氏度搅拌2小时。反应液用6摩尔每升的盐酸调至酸碱度值为3,有白色固体析出。过滤得到固体。将固体溶解于二氯甲烷(800.00毫升)中,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩得化合物1-5。
步骤E:将1-5(76.58克,218.31毫摩尔)溶解在二氯甲烷中(500.00毫升)加入草酰氯(41.56克,327.46毫摩尔,28.66毫升)和N,N-二甲基甲酰胺(159.56毫克,2.18毫摩尔,167.96微升)。混合物在25摄氏度搅拌3小时。反应完后,减压浓缩得到化合物1-6。
步骤F:将1-6(63.00克,170.62毫摩尔)和乙基-2-(二甲胺基甲叉)-3-氧-丁酸甲酯(44.24克,238.87毫摩尔)溶解于四氢呋喃溶液(600.00毫升),在零下70摄氏度到零下60摄氏度时滴加到六甲基二硅基氨基锂的四氢呋喃溶液中(1.00摩尔,409.49毫升)。滴加完成后,将干冰丙酮浴撤掉,一次性加入盐酸溶液(3.00摩尔,832.06毫升)。反应液在20摄氏度搅拌一个小时。混合液过滤得固体。固体溶于二氯甲烷,无水硫酸钠干燥,减压浓缩得到固体。固体加甲基叔丁基醚(60.00毫升),搅拌30分钟,过滤,得到化合物1-7。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ8.55(s,1H),7.73-7.79(m,1H),7.34-7.43(m,4H),7.20(s,1H),6.63(s,1H),5.24(s,2H),4.39(q,J=7.15Hz,2H),4.11(t,J=6.21Hz,2H),3.59(t,J=5.90Hz,2H),3.38(s,3H),2.05-2.12(m,2H),1.40(t,J=7.15Hz,3H)。
步骤G:将1-7(2.00克,4.23毫摩尔)溶于乙醇溶液(30.00毫升)加入醋酸(10.00毫升)和(R)-(-)-2-氨基-1-丁醇(565.59毫克,6.35毫摩尔,595.36微升)。反应液在80摄氏度搅拌16小时。反应液减压浓缩,然后加入水50.00毫升和乙酸乙酯60.00毫升(20.00毫升×3)萃取。合并的有机相用饱和碳酸氢钠20.00毫升(10.00毫升×2)洗涤,无水硫酸钠干燥,减压浓缩得到粗产品。粗产品通过柱层析纯化,洗脱剂为(二氧化硅,石油醚/乙酸乙酯=10/1到1/1)。得到化合物1-8。
步骤H:将1-8(1.80克,3.31毫摩尔)溶解于二氯甲烷(20.00毫升),加入三乙胺(502.41毫克,4.97毫摩尔,688.23微升),在0摄氏度加入甲烷磺酰氯(454.99毫克,3.97毫摩尔,307.43微升)。反应液在25摄氏度搅拌2小时。反应液在25摄氏度加入30.00毫升水淬灭,然后加入二氯甲烷100.00毫升(50毫升×2)萃取。合并收集的有机相用饱和食盐水60.00毫升(30.00毫升×2)洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤减压浓缩得到化合物1-9。
步骤I:将1-9(2.00克,3.21毫摩尔)溶解于四氢呋喃(100.00毫升)氮气保护下加入钯碳(300.00毫克,纯度10%)。悬浊液用氢气置换三次。反应液在氢气(15Psi)环境下,25摄氏度搅拌2小时。将反应液过滤,减压浓缩得到化合物1-10。
步骤J:将1-10(1.70克,3.20毫摩尔)溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶液(20.00毫升)加入碳酸钾(884.54毫克,6.40毫摩尔)和碘化钾(5.31毫克,32.00微摩尔).反应液在100摄氏度搅拌16小时。反应液用乙酸乙酯100.00毫升(50.00毫升×2)。合并的有机相用饱和食盐水100.00毫升(50.00毫升×2),无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩得到化合物1-11。
步骤K:将1-11(1.00克,2.29毫摩尔)溶于甲醇(47.40毫升)加入氢氧化钠溶液(4摩尔每升,10.32毫升).反应液在25摄氏度搅拌20分钟。反应液用盐酸(1摩尔)淬灭,把酸碱度值调至3,有固体析出。然后用乙酸乙酯40.00毫升(20.00毫升×2)萃取。合并的有机相用饱和碳酸氢钠水溶液30.00毫升(15.00毫升×2)洗涤,再用饱和食盐水30.00毫升(15.00毫升×2)洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩到粗产品。粗产品通过制备薄层色谱(二氧化硅,石油醚:乙酸乙酯=0:1)。得到化合物实施例1。
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiralcel OD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ15.67(s,1H),8.50(br s,1H),7.43(s,1H),6.71(s,1H),6.67(s,1H),4.19-4.40(m,2H),4.10(br t,J=6.11Hz,2H),3.46-3.63(m,2H),3.42(s,1H),3.30(s,3H),2.07(quin,J=6.02Hz,2H),1.77-1.98(m,2H),0.96(br s,3H)。
实施例2至5均可参照实施例1的制备方法制得:
实施例2
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ15.77(br s,1H),8.49(s,1H),7.52(s,1H),6.87(s,1H),6.68(s,1H),4.49-4.72(m,2H),4.12-4.28(m,2H),3.92(br d,J=6.40Hz,1H),3.63(t,J=5.90Hz,2H),3.39(s,3H),2.06-2.24(m,3H),1.10(d,J=6.53Hz,3H),0.89(d,J=6.53Hz,3H)。
实施例3
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ15.81(s,1H),8.88-9.18(m,1H),7.47(s,1H),6.78(s,1H),6.76(s,1H),4.48-4.59(m,2H),4.19(dt,J=2.07,6.12Hz,2H),3.59-3.67(m,2H),3.45-3.52(m,1H),3.39(s,3H),2.15(quin,J=6.05Hz,2H),1.14-1.31(m,2H),0.29-0.55(m,2H),0.09(s,1H)。
实施例4
ee值(对映体过量):97%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ15.74(s,1H),8.61(br s,1H),7.52(s,1H),6.79(s,1H),6.74(s,1H),4.46(br s,2H),4.20(t,J=6.15Hz,2H),4.04(br s,1H),3.63(dt,J=2.20,5.87Hz,2H),3.39(s,3H),2.38(br s,1H),2.16(quin,J=5.96Hz,2H),1.60-2.00(m,6H),1.09-1.25(m,2H)。
实施例5
ee值(对映体过量):89%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ=15.73(br s,1H),8.42(s,1H),7.43(s,1H),6.78(s,1H),6.57(s,1H),4.64-4.45(m,2H),4.13-4.05(m,2H),3.97(ddd,J=2.4,5.6,10.9Hz,1H),3.53(t,J=6.0Hz,2H),3.30(s,3H),2.06(quin,J=6.1Hz,2H),1.64-1.52(m,1H),1.42-1.01(m,2H),0.85(t,J=7.4Hz,3H),0.74(d,J=6.6Hz,3H)
实施例6
步骤A:保持0摄氏度下,向6-1(100.00克,762.36毫摩尔,1.00当量)的四氢呋喃(400.00毫升)溶液中加入四氢锂铝(80.00克,2.11摩尔,2.77当量)。溶液在10摄氏度下搅拌10小时。然后在搅拌下向反应液中加入80.00毫升水,并加入240.00毫升15%氢氧化钠水溶液,再加入80.00毫升水。得到的悬浮液在10摄氏度下搅拌20分钟,过滤得到无色清液。减压浓缩得到化合物6-2。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ=3.72(dd,J=3.9,10.2Hz,1H),3.21(t,J=10.2Hz,1H),2.51(dd,J=3.9,10.2Hz,1H),0.91(s,9H)
步骤B:将6-2(50.00克,426.66毫摩尔)和三乙胺(59.39毫升,426.66毫摩尔)溶解在二氯甲烷(500.00毫升)中,二碳酸二叔丁酯(92.19克,422.40毫摩尔)溶解在二氯甲烷(100.00毫升)中,在0摄氏度下逐滴加入到上一反应液中。然后反应液在25摄氏度下搅拌12小时。反应液用饱和食盐水(600.00毫升)洗涤,无水硫酸钠干燥,有机相减压浓缩旋干,然后用甲基叔丁基醚/石油醚(50.00/100.00)重结晶,得到化合物6-3。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ4.64(br s,1H),3.80-3.92(m,1H),3.51(br d,J=7.09Hz,2H),2.17(br s,1H),1.48(s,9H),0.96(s,9H)。
步骤C:将氯化亚砜(100.98毫升,1.39毫摩尔)溶解在乙腈(707.50毫升),6-3(121.00克,556.82毫摩尔)溶解在乙腈(282.90毫升)中,与零下40摄氏度下滴加到上一反应液,滴加完后,吡啶(224.72毫升,2.78摩尔)一次性加入反应液中。移去冰浴,反应液在5-10摄氏度下搅拌1小时。减压旋干溶剂后,加入乙酸乙酯(800.00毫升),有固体析出,过滤,减压浓缩滤液。第二步:得到的油和水和三氯化钌(12.55克,55.68毫摩尔)溶解在乙腈(153.80毫升)中,将高碘酸钠(142.92克,668.19毫摩尔)悬浮在水(153.80毫升)中,缓慢加入上述反应液中,最终的反应混合液在5-10摄氏度下搅拌0.15小时。过滤反应混合液,得到滤液,用乙酸乙酯(800.00毫升×2)萃取,有机相用饱和食盐水(800.00毫升)洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤并减压浓缩旋干。过柱纯化(二氧化硅,石油醚/乙酸乙酯=50/1至20/1)得到化合物6-4。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ4.49-4.55(m,1H),4.40-4.44(m,1H),4.10(d,J=6.15Hz,1H),1.49(s,9H),0.94(s,9H)。
步骤D:将6-5(100.00克,657.26毫摩尔)溶解在乙腈(1300.00毫升)中,加入碳酸钾(227.10克,1.64摩尔)和1-溴-3-甲氧基丙烷(110.63克,722.99毫摩尔)。反应液在85摄氏度搅拌6小时。反应液用乙酸乙酯600.00毫升(200.00毫升×3)萃取,用无水硫酸钠进行干燥,然后过滤,减压浓缩,得到化合物6-6。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ9.76-9.94(m,1H),7.42-7.48(m,2H),6.98(d,J=8.03Hz,1H),4.18(t,J=6.53Hz,2H),3.95(s,3H),3.57(t,J=6.09Hz,2H),3.33-3.39(m,3H),2.13(quin,J=6.34Hz,2H)。
步骤E:将6-6(70.00克,312.15毫摩尔)溶解在二氯甲烷中,加入间氯过氧苯甲酸(94.27克,437.01毫摩尔),反应物在50摄氏度搅拌2小时。待冷却反应液后,过滤,滤液用二氯甲烷进行萃取,有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2000.00毫升(400.00毫升×5),无水硫酸钠干燥,减压浓缩。得到棕色的油状物,用尽量少的甲醇溶解后,缓慢加入2摩尔每升的氢氧化钾(350.00毫升)溶液(会放热)。深色的反应液在室温搅拌20分钟,用37%的盐酸将反应液调酸碱度至5。用乙酸乙酯400.00毫升(200.00毫升×2)进行萃取,有机相用饱和食盐水200.00毫升(100.00毫升×2)进行洗涤,无水硫酸钠干燥,减压浓缩得到化合物6-7。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ6.75(d,J=8.53Hz,1H),6.49(d,J=2.89Hz,1H),6.36(dd,J=2.82,8.60Hz,1H),4.07(t,J=6.40Hz,2H),3.82(s,3H),3.60(t,J=6.15Hz,2H),3.38(s,3H),2.06-2.14(m,2H)。
步骤F:将6-7(33.00克,155.48毫摩尔)溶于四氢呋喃中(330.00毫升),加入多聚甲醛(42.02克,466.45毫摩尔),氯化镁(29.61克,310.97毫摩尔),三乙胺(47.20克,466.45毫摩尔,64.92毫升)。反应液在80摄氏度搅拌8小时。反应完后,在25摄氏度用2摩尔盐酸溶液(200.00毫升)淬灭,然后用乙酸乙酯600.00毫升(200.00毫升×3)萃取,有机相用饱和食盐水400.00毫升(200.00毫升×2)洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤减压浓缩得残渣。残渣用乙醇(30.00毫升)洗涤,过滤,得滤饼。从而获得化合物6-8。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ11.29(s,1H),9.55-9.67(m,1H),6.83(s,1H),6.42(s,1H),4.10(t,J=6.48Hz,2H),3.79(s,3H),3.49(t,J=6.05Hz,2H),3.28(s,3H),2.06(quin,J=6.27Hz,2H)
步骤G:将6-8(8.70克,36.21毫摩尔)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(80.00毫升)中,加入碳酸钾(10.01克,72.42毫摩尔)和6-4(11.13克,39.83毫摩尔),反应液在50摄氏度下搅拌2小时。反应液用1.00摩尔/升盐酸水溶液(200.00毫升)淬灭,乙酸乙酯(150.00毫升×2)萃取。合并有机相用水(150.00毫升×3)洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤减压浓缩,得到化合物6-9。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ10.31(s,1H),7.34(s,1H),6.57(s,1H),4.18-4.26(m,3H),4.07(dd,J=5.33,9.60Hz,1H),3.88(s,4H),3.60(t,J=5.96Hz,2H),3.39(s,3H),2.17(quin,J=6.21Hz,2H),1.47(s,9H),1.06(s,9H)。
步骤H:将6-9(15.80克,35.95毫摩尔)溶解在二氯甲烷(150.00毫升)中,加入三氟乙酸(43.91毫升,593.12毫摩尔)。反应液在10摄氏度下搅拌3小时。反应液减压浓缩旋干,加入碳酸氢钠水溶液(100.00毫升),二氯甲烷(100.00毫升)萃取。有机相用无水硫酸钠干燥,过滤减压浓缩,得到化合物6-10。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ8.40(s,1H),6.80(s,1H),6.51(s,1H),4.30(br d,J=12.35Hz,1H),4.04-4.11(m,3H),3.79(s,3H),3.49(t,J=5.99Hz,2H),3.36(br d,J=2.93Hz,1H),3.28(s,3H),2.06(quin,J=6.24Hz,2H),1.02(s,9H)。
步骤I:将6-10(5.00克,15.56毫摩尔)溶解在甲苯(20.00毫升)中加入6-11(8.04克,31.11毫摩尔)反应液在氮气保护下于120摄氏度下搅拌12小时。反应液用水(100.00毫升)淬灭,乙酸乙酯(100.00毫升×2)萃取,合并有机相用水(80.00毫升×2)洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤减压浓缩。残渣通过反相柱纯化。再经高效液相制备色谱法纯化(柱子:Phenomenex luna C18 250*50毫米*10微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:35%-70%,25分钟)得到化合物6-12。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ7.95(s,1H),6.59(s,1H),6.40(s,1H),5.15-5.23(m,1H),4.35-4.41(m,2H),4.08-4.19(m,2H),3.94-4.00(m,2H),3.72(s,3H),3.61-3.67(m,1H),3.46(dt,J=1.96,5.99Hz,2H),3.27(s,3H),3.01-3.08(m,1H),2.85-2.94(m,1H),1.97-2.01(m,2H),1.18-1.22(m,3H),1.04(s,9H)。
步骤J:将6-12(875.00毫克,1.90毫摩尔)溶解在甲苯(20.00毫升)和乙二醇二甲醚(20.00毫升)中,加入四氯苯醌(1.40克,5.69毫摩尔)。反应液在120摄氏度下搅拌12小时。反应液冷却到室温,加入饱和碳酸钠水溶液(50.00毫升)和乙酸乙酯(60.00毫升)。将混合液在10-15摄氏度下搅拌20分钟,分液得到有机相。有机相加入2.00摩尔/升盐酸水溶液(60.00毫升),在10-15摄氏度下搅拌20分钟,分液,有机相再用2摩尔/升盐酸水溶液(60.00毫升×2)洗涤,分液,水相中加入2摩尔/升氢氧化钠水溶液(200.00毫升)和二氯甲烷(200.00毫升)。分液,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤减压浓缩,得到化合物6-13。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ7.98-8.78(m,1H),6.86(s,1H),6.43-6.73(m,2H),4.41-4.48(m,1H),4.28-4.38(m,2H),4.03-4.11(m,2H),3.93(br s,1H),3.80(s,3H),3.47-3.52(m,3H),3.29(s,3H),2.06(quin,J=6.24Hz,2H),1.33(t,J=7.15Hz,2H),0.70-1.25(m,10H)。
步骤K:将6-13(600.00毫克,1.31毫摩尔)溶解在甲醇(6.00毫升),加入4.00摩尔/升的氢氧化钠水溶液(2.00毫升,6.39当量)。反应液在15摄氏度下搅拌0.25小时。将反应液用1.00摩尔/升的盐酸水溶液调节pH=3-4,然后用二氯甲烷(50.00毫升×3)萃取,合并有机相,用饱和食盐水洗涤(50.00毫升),无水硫酸钠干燥,过滤减压浓缩,得到实施例6。
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiralcel OD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%流速:3毫升每分钟波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ15.72(br s,1H),8.32-8.93(m,1H),6.60-6.93(m,2H),6.51(br s,1H),4.38-4.63(m,2H),4.11(br dd,J=4.52,12.23Hz,3H),3.79-3.87(m,3H),3.46-3.54(m,2H),3.29(s,3H),2.07(quin,J=6.24Hz,2H),0.77-1.21(m,9H)。
实施例7
步骤A:7-1(50.00克,274.47毫摩尔,1.00当量)溶解于乙腈(500.00毫升)并冷却至0摄氏度,然后向其中加入氯代丁二酰亚胺(37.75克,282.70毫摩尔,1.03当量)。将混合物加热至25摄氏度并搅拌10小时。然后将反应液减压浓缩并得到无色液体,再将500毫升乙酸乙酯加入液体中,并将溶液经过水洗(100.00毫升*3次)和饱和食盐水洗涤(100.00毫升*3次)。然后得到有机相经过无水硫酸钠干燥,然后减压浓缩得到无色液体。无色液体用硅胶柱纯化,得到7-2。
步骤B:向7-2(50.00克,230.82毫摩尔,1.00当量)和溴化苄(43.42克,253.90毫摩尔,30.16毫升,1.10当量)的N,N-二甲基甲酰胺(500.00毫升)溶液中一次性加入碳酸钾(70.18克,507.80毫摩尔,2.20当量)。然后混合体系在25摄氏度下搅拌10小时。将乙酸乙酯(700.00毫升*2)和水(200.00毫升)加入溶液中。并且溶液在20摄氏度下搅拌10分钟。分离有机相,水洗(200.00毫升*2),饱和食盐水(200.00毫升*2),无水硫酸钠干燥,减压浓缩得到7-3。
步骤C:向7-3(25.00克,81.50毫摩尔,1.00当量)的水(20.00毫升)和甲醇(60.00毫升)的混合溶液中一次性加入氢氧化钾(6.00摩尔/升,41.57毫升,3.06当量)。溶液在50摄氏度下搅拌两小时。50.00毫升水加入溶液中。将溶液减压浓缩至70.00毫升,并经乙酸乙酯/石油醚(4/1,20.00毫升*2)洗涤。分离水相,通过1.00摩尔/升的稀盐酸调节溶液酸碱度至1~2得到悬浊液。过滤悬浊液得到白色固体。再经水(30.00毫升)打浆后得到7-4。
步骤D:向7-4(20.00克,68.33毫摩尔,1.00当量)的二氯甲烷(200.00毫升)溶液中逐滴加入草酰氯(17.35克,136.65毫摩尔,11.96毫升,2.00当量)。溶液在28摄氏度下搅拌两小时。然后浓缩得到7-5。
步骤E:在零下70摄氏度下,向六甲基二硅基胺基锂(1.00摩尔/升,152.65毫升,2.50当量)的四氢呋喃(10.00毫升)溶液中于5分钟内逐滴加入7-5(19.00克,61.06毫摩尔,1.00当量)和乙基-2-(二甲胺基甲叉)-3-氧-丁酸甲酯(11.88克,64.11毫摩尔,1.05当量)的四氢呋喃(50.00毫升)混合溶液。撤去干冰丙酮浴,并让溶液继续搅拌5分钟,然后向混合物中加入稀盐酸(1.00摩尔/升,125.37毫升,57.44当量)并剧烈搅拌,然后在60摄氏度下旋转蒸发除去绝大部分四氢呋喃。残余物在60~65摄氏度下保持加热1.5小时。再将200.00毫升水加入混合物中,得到悬浊液,搅拌30分钟,过滤得到黄色固体。再将黄色固体分别通过水(40.00毫升)和甲基叔丁基醚(40.00毫升)打浆得到化合物7-6。
步骤F:7-6(10.00克,24.11毫摩尔,1.00当量)和缬氨醇(3.73克,36.17毫摩尔,4.01毫升,1.50当量)的醋酸(30.00毫升)和乙醇(90.00毫升)混合溶液在90摄氏度下搅拌10小时。混合物冷却至20摄氏度下并在40摄氏度下减压浓缩得到黄色液体。黄色液体经硅胶色谱柱(二氧化硅,石油醚/乙酸乙酯=10/1)纯化得到化合物7-7。
步骤G:向7-7(8.00克,15.36毫摩尔,63.71%)的二氯甲烷(10.00毫升)溶液中一次性加入三乙胺(4.86克,48.06毫摩尔,6.66毫升,3.00eq)。然后向其中加入甲烷磺酰氯(3.67克,32.04毫摩尔,2.84毫升,2.00当量)。溶液在20摄氏度下搅拌两小时。溶液减压浓缩得到棕色残余物。残余物经两次硅胶色谱柱(二氧化硅,石油醚/乙醇=100/1到10/1)纯化得到化合物7-8。
步骤H:在氮气保护下向7-8(8.01克,13.86毫摩尔,1.00当量)的四氢呋喃(15.00毫升)溶液中加入钯碳(1.00克,10%)。将悬浊液抽真空后,氢气(2.80克,1.39摩尔,100.00当量,15psi)多次置换。然后混合物在15摄氏度氢气气氛下搅拌两小时。反应混合物过滤并减压浓缩得到黄色胶状物。将其经石油醚(30.00毫升*2)打浆并过滤得到化合物7-9。
步骤I:向7-9(0.79克,1.62毫摩尔,1.00当量)的N,N-二甲基甲酰胺(4.00毫升)溶液中分别加入碳酸钾(0.45克,3.24毫摩尔,2.00当量)和碘化钾(2.69毫克,16.21微摩尔,0.01当量)。得到的混合物在100摄氏度下搅拌10小时。然后将溶液倾倒入10.00毫升水中,并通过乙酸乙酯(30.00毫升*2)萃取。合并有机相,水洗(5.00毫升*3),饱和食盐水洗(5.00毫升*3),无水硫酸钠干燥,减压浓缩得到化合物7-10。
步骤J:零下78摄氏度氮气保护下向7-10(300.00毫克,765.62微摩尔,1.00当量)的二氯甲烷(30.00毫升)溶液中逐滴(约10分钟)加入三溴化硼(1.15克,4.59毫摩尔,442.31微升,6.00当量),在此过程中,反应温度须保持零下78摄氏度下。滴加完毕,溶液在零下78摄氏度至0摄氏度间搅拌10小时。将反应溶液经甲醇萃灭,并减压浓缩得到黄色液体。再向黄色液体中加入二氯甲烷/甲醇(10/1 100.00毫升)溶液,分离有机相,并通过无水硫酸钠干燥。减压浓缩得到化合物7-11。
步骤K:10摄氏度氮气保护下向7-11(202.00毫克,577.52微摩尔,1.00当量)的甲醇(21.18克,661.15毫摩尔,26.81毫升,1144.80当量)的溶液中一次性加入氯化亚砜(687.08毫克,5.78毫摩尔,418.95微升,10.00当量)。混合体系50摄氏度下,搅拌4小时。反应溶液经减压浓缩得到化合物7-12。
步骤L:将7-12(70.00毫克,192.42微摩尔)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(2.00毫升)中,加入碳酸钾(34.57毫克,250.15微摩尔),2-氯乙基乙硫醚(31.18毫克,250.15微摩尔),体系在100摄氏度下搅拌12小时得到7-13。反应液未经纯化直接投下一步。
步骤M:将7-13(86.97毫克,192.43微摩尔)溶解在水(1.00毫升)中,向其中加入碳酸钾(26.59毫克,192.43微摩尔),体系在100摄氏度下搅拌12小时。反应液调节pH=3-4,经高效液相制备色谱法纯化(柱子:Boston Green ODS 150*30 4微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:55%-85%,10.5分钟)纯化得到实施例7。
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.78(s,1H),7.75(s,1H),7.03(s,1H),6.92(s,1H),4.71(br s,2H),4.55(br d,J=9.2Hz,1H),4.34-4.25(m,2H),2.92(t,J=6.3Hz,2H),2.67(q,J=7.3Hz,2H),1.83(br s,1H),1.21(t,J=7.4Hz,3H),0.98(d,J=6.5Hz,3H),0.71(d,J=6.5Hz,3H)。
实施例8可参照实施例7的制备方法制得:
实施例8
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.79(s,1H),7.76(s,1H),7.03(s,1H),6.93(s,1H),4.71(br s,2H),4.55(br d,J=10.7Hz,1H),4.35-4.27(m,2H),2.90(t,J=6.3Hz,2H),2.20(s,3H),2.08(s,1H),0.98(d,J=6.5Hz,3H),0.71(d,J=6.5Hz,3H)。
实施例9
化合物9-5可参照化合物7-12的制备方法制得:
步骤A:将9-1(5.00克,54.25毫摩尔)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(20.00毫升)中,加入二异丙基乙基胺(10.52克,81.38毫摩尔),2-溴乙酸苄酯(12.43克,54.25毫摩尔),体系在15摄氏度下搅拌16小时。反应液过滤得到滤液,向其中加入水(50.00毫升),乙酸乙酯萃取(50.00毫升*2),然后将合并的有机相经饱和食盐水洗涤(30.00毫升),并通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到化合物9-2。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ7.24-7.32(m,5H),5.10(s,2H),3.64(br d,J=3.06Hz,2H),3.21(s,2H),2.66(t,J=7.09Hz,2H),1.70-1.80(m,2H)。
步骤B:将9-2(5.00克,20.81毫摩尔)溶解在二氯甲烷(50.00毫升)中,加入三乙胺(3.16克,31.22毫摩尔),甲烷磺酰氯(2.62克,22.89毫摩尔),体系在10摄氏度下搅拌3小时。反应液未经纯化直接投下一步。反应液用水(50.00毫升)淬灭,二氯甲烷萃取(50.00毫升*2),然后将合并的有机相经水(50.00毫升)和饱和食盐水洗涤(50.00毫升),并通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到化合物9-3。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ7.34-7.42(m,5H),5.20(s,2H),4.31(t,J=6.09Hz,2H),3.29(s,2H),3.02(s,3H),2.76(t,J=7.03Hz,2H),1.99-2.07(m,2H)。
步骤C:将9-3(91.90毫克,288.63微摩尔)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(2.00毫升)中,加入碳酸钾(45.21毫克,327.11微摩尔),,体系在70摄氏度下搅拌12小时得到9-4。反应液未经纯化直接投下一步。
步骤D:将9-4(112.78毫克,192.43微摩尔)溶解在水(2.00毫升)中,向其中加入碳酸钾(26.59毫克,192.43微摩尔),体系在100摄氏度下搅拌12小时。反应液调节pH=3-4,经高效液相制备色谱法纯化(柱子:Boston Green ODS 150*25 10微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:30%-60%,11分钟)纯化得到实施例9。
ee值(对映体过量):81.8%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.78(s,1H),7.75(s,1H),7.02(s,1H),6.90(s,1H),4.70(br s,2H),4.55(br d,J=10.3Hz,1H),4.27-4.11(m,2H),3.27(s,2H),2.76(t,J=7.2Hz,2H),2.07-1.97(m,2H),1.84(br s,1H),0.98(d,J=6.5Hz,3H),0.71(br d,J=6.4Hz,3H)。
实施例10
化合物10-1可参照化合物7-12的制备方法制得:
步骤A:将10-1(700.00毫克,1.92毫摩尔)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(20.00毫升)中,加入碳酸钾(452.09毫克,3.27毫摩尔),3-溴-1-丙醇(401.13毫克,2.89毫摩尔),体系在50摄氏度下搅拌5小时。向其中加入水(45.00毫升),二氯甲烷萃取150.00毫升(50.00毫升*3),然后将合并的有机相通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到粗产物。再将粗产物经高效液相制备色谱法纯化(柱子:Boston Green ODS 250*50毫米,10微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:15%-45%;30分钟)纯化得到化合物10-2。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ8.21(s,1H),7.53(s,1H),6.73(s,1H),6.64(s,1H),4.68-4.46(m,2H),4.28-4.20(m,2H),3.95(s,3H),3.73(ddd,J=2.9,5.3,10.9Hz,1H),2.15(quin,J=5.8Hz,2H),2.10-2.03(m,1H),1.28(s,2H),1.08(d,J=6.5Hz,3H),0.90(d,J=6.5Hz,3H)。
步骤B:将10-2(100.00毫克,237.04微摩尔)溶解在二氯甲烷(20.00毫升)中,在0摄氏度下向其中加入戴斯-马丁氧化剂(110.59毫克,260.74微摩尔),体系在20摄氏度下搅拌2小时。向其中加入饱和碳酸氢钠(20.00毫升),硫代硫酸钠(20.00毫升),过滤得到滤液,有机相用饱和碳酸氢钠溶液(20.00毫升*3)洗,然后将合并的有机相通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到粗产物。粗产物再经硅胶柱层析纯化(洗脱剂:二氯甲烷/甲醇=10/1)得到化合物10-3。
步骤C:将10-3(40.00毫克,95.27微摩尔),甲氧基胺盐酸盐(9.55毫克,114.33微摩尔)溶解在二氯甲烷(10.00毫升)中,向其中加入吡啶(9.04毫克,114.33微摩尔),体系在15摄氏度下搅拌12小时。旋干溶剂,加水15.00毫升稀释,乙酸乙酯萃取30.00毫升(10.00毫升*3),然后将合并的有机相通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到粗产物。粗产物再经硅胶板纯化(洗脱剂:二氯甲烷/甲醇=10/1)得到化合物10-4。
步骤D:将10-4(30.00毫克,66.30微摩尔)溶解在甲醇(9.00毫升)中,向其中加入氢氧化钠溶液(4.00摩尔,3.00毫升),体系在15摄氏度下搅拌0.5小时。反应液调节酸碱度至3-4,经高效液相制备色谱法纯化(柱子:Boston Green ODS 150*30 4微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:50%-74%,10.5分钟)纯化得到实施例10。
ee值(对映体过量):5.8%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiralcel OD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%流速:3毫升每分钟波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.77(br s,1H),7.74(br s,1H),7.49(t,J=5.8Hz,1H),7.01(br s,1H),6.94-6.86(m,1H),4.69(br s,2H),4.54(br s,1H),4.36-4.20(m,2H),3.83-3.71(m,3H),2.78-2.61(m,2H),1.83(brs,1H),0.98(d,J=6.4Hz,3H),0.71(br d,J=6.4Hz,3H)。
实施例11
化合物11-1可参照化合物7-12的制备方法制得:
步骤A:将11-1(700.00毫克,1.92毫摩尔)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(20.00毫升)中,加入碳酸钾(452.09毫克,3.27毫摩尔),3-溴-1-丙醇(401.13毫克,2.89毫摩尔),体系在50摄氏度下搅拌5小时。向其中加入水(45.00毫升),二氯甲烷萃取150.00毫升(50.00毫升*3),然后将合并的有机相通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到粗产物。再将粗产物经高效液相制备色谱法纯化(柱子:Boston Green ODS 250*50 10微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:15~45%,30分钟)纯化得到化合物11-2。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ8.21(s,1H),7.53(s,1H),6.73(s,1H),6.64(s,1H),4.68-4.46(m,2H),4.28-4.20(m,2H),3.95(s,3H),3.73(ddd,J=2.9,5.3,10.9Hz,1H),2.15(quin,J=5.8Hz,2H),2.10-2.03(m,1H),1.28(s,2H),1.08(d,J=6.5Hz,3H),0.90(d,J=6.5Hz,3H)。
步骤B:将11-2(80.00毫克,189.63毫摩尔),4-二甲氨基吡啶(231.67微克,1.90微摩尔),三乙胺(57.57毫克,568.89微摩尔)溶解在二氯甲烷(20.00毫升)中,加入甲氨基甲酰氯(35.47毫克,379.26微摩尔),体系在15摄氏度下搅拌5小时。向其中加入水(15.00毫升),二氯甲烷萃取45.00毫升(15.00毫升*3),然后将合并的有机相通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到化合物11-3。
步骤C:将11-3(90.00毫克,187.92微摩尔)溶解在甲醇(10.00毫升),四氢呋喃(10.00毫升),水(10.00毫升)中,向其中加入一水氢氧化锂(23.66摩尔,563.77微摩尔),体系在20摄氏度下搅拌12小时。反应液调节酸碱度至3-4,水20.00毫升稀释,二氯甲烷萃取45.00毫升(15.00毫升*3),然后将合并的有机相通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到粗产品。再将粗产品经高效液相制备色谱法纯化(柱子:Boston Green ODS 150*30毫米,4微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:35%-65%,10.5分钟)纯化得到实施例11。
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.79(s,1H),7.76(s,1H),7.11-6.95(m,2H),6.89(s,1H),4.71(br s,2H),4.56(br d,J=7.5Hz,1H),4.23-4.07(m,4H),2.56(d,J=4.5Hz,3H),2.08-2.02(m,2H),1.96-1.71(m,1H),0.98(d,J=6.5Hz,3H),0.71(br d,J=6.5Hz,3H)。
实施例12
化合物12-1可参照化合物7-12的制备方法制得:
步骤A:将12-1(100.00毫克,274.88微摩尔)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(2.00毫升)中,加入碳酸钾(49.39毫克,357.34微摩尔),4-溴丁基叔丁酯(79.73毫克,357.34微摩尔),体系在100摄氏度下搅拌12小时。向其中加入水(30.00毫升),二氯甲烷萃取45.00毫升(15.00毫升*3),然后将合并的有机相通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到粗产物12-2。
步骤B:将12-2(128.00毫克,252.97微摩尔)溶解在二氯甲烷(3.00毫升)中,加入三氟乙酸(4.62毫克,40.52微摩尔),体系在15摄氏度下搅拌1小时。旋干溶剂,得到粗产品12-3。
步骤C:将12-3(80.00毫克,177.83微摩尔)溶解在二氯甲烷(10.00毫升)中,加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(81.14毫克,213.39微摩尔),三乙胺(26.99毫克,266.74微摩尔),体系在25摄氏度下搅拌30分钟,然后加入二乙胺(15.61毫克,213.39微摩尔),体系在25摄氏度下搅拌12小时。向其中加入水(20.00毫升),二氯甲烷萃取45.00毫升(15.00毫升*3),然后将合并的有机相通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到12-4。
步骤D:将12-4(80.00毫克,158.42微摩尔)溶解在甲醇(4.50毫升)中,向其中加入氢氧化钠溶液(4.00摩尔,1.71毫升),体系在20摄氏度下搅拌5分钟。反应液调节pH=2~3,经高效液相制备色谱法纯化(柱子:Boston Green ODS 150*25毫米,10微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:40%-70%,11分钟)纯化得到实施例12。
ee值(对映体过量):99.5%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiralcel OD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%流速:3毫升每分钟波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.77(br s,1H),7.74(s,1H),7.12-6.79(m,2H),4.77-4.48(m,1H),4.80-4.45(m,2H),4.22-4.10(m,2H),3.29(br dd,J=7.0,11.7Hz,4H),2.49-2.45(m,2H),1.98(quin,J=6.6Hz,2H),1.82(br s,1H),1.10(t,J=7.1Hz,3H),1.04-0.96(m,6H),0.71(br d,J=6.4Hz,3H)。
实施例13
化合物13-5可参照化合物7-12的制备方法制得:
步骤A:混合物13-1(13.20克,150.00毫摩尔),2,2,2,-三氟乙醇(10.00克,99.96毫摩尔),三乙胺(10.11克,100.00毫摩尔),四丁基碘化铵(738.24毫克,2.00毫摩尔)置换氮气,体系在100摄氏度下搅拌24小时。反应液蒸馏得到化合物13-2。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ3.91(q,J=8.74Hz,2H),3.72-3.82(m,4H),2.21(brs,1H)。
步骤B:将13-2(1.00克,6.94毫摩尔)溶解在二氯甲烷(15.00毫升)中,加入三乙胺(912.94毫克,9.02毫摩尔),在0摄氏度下滴加甲烷磺酰氯(1.15克,10.04毫摩尔),体系在20摄氏度下搅拌2小时。反应液未经纯化直接投下一步。反应液用饱和碳酸钠(20.00毫升)淬灭,水(10.00毫升)稀释,二氯甲烷萃取60.00毫升(20.00毫升*3),并通过无水硫酸钠干燥,并经过减压蒸馏得到化合物13-3。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ4.43-4.39(m,2H),3.96-3.88(m,4H),3.07(s,3H)。
步骤C:将13-3(85.50毫克,384.84微摩尔)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(2.00毫升)中,加入碳酸钾(53.19毫克,384.84微摩尔),体系在100摄氏度下搅拌12小时得到13-4。反应液未经纯化直接投下一步。
步骤D:将13-4(94.26毫克,192.42微摩尔)溶解在水(0.50毫升)中,体系在100摄氏度下搅拌12小时。反应液调节酸碱度至3-4,经高效液相制备色谱法纯化(柱子:BostonGreen ODS 150*30 4微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:50%-80%,10.5分钟)纯化得到实施例13。
ee值(对映体过量):83.8%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.76(s,1H),7.75(s,1H),6.99(br s,1H),6.92(s,1H),4.75-4.63(m,2H),4.53(br d,J=9.8Hz,1H),4.36-4.27(m,2H),4.19(q,J=9.3Hz,2H),3.98(t,J=4.2Hz,2H),1.93-1.74(m,1H),0.98(d,J=6.4Hz,3H),0.71(d,J=6.5Hz,3H)。
实施例14-21可参照实施例7的制备方法制得:
实施例14
ee值(对映体过量):67.6%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.78(s,1H),7.75(s,1H),7.02(s,1H),6.89(s,1H),4.71(br d,J=3.4Hz,2H),4.55(br d,J=10.4Hz,1H),3.92(s,3H),1.91-1.71(m,1H),0.99(d,J=6.5Hz,3H),0.71(d,J=6.5Hz,3H)。
实施例15
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.76(br s,1H),7.73(s,1H),7.11-6.75(m,2H),4.73-4.47(m,3H),3.98(dd,J=4.7,6.8Hz,2H),1.99-1.67(m,1H),1.32-1.22(m,1H),0.97(d,J=6.5Hz,3H),0.71(br d,J=6.5Hz,3H),0.60(br dd,J=1.5,7.9Hz,2H),0.37(q,J=4.5Hz,2H)。
实施例16
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.76(s,1H),7.73(s,1H),6.99(br s,1H),6.87(s,1H),4.69(br d,J=2.9Hz,2H),4.53(br d,J=11.3Hz,1H),3.90(dd,J=2.7,6.5Hz,2H),2.10-2.04(m,1H),1.92-1.75(m,1H),1.01(d,J=6.7Hz,6H),0.98(d,J=6.5Hz,3H),0.71(d,J=6.5Hz,3H)。
实施例17
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.76(s,1H),7.73(s,1H),6.98(br s,1H),6.89(s,1H),4.71-4.49(m,3H),4.00(br d,J=5.7Hz,2H),3.91-3.87(m,2H),3.35(br s,2H),2.12-2.01(m,2H),1.73-1.62(m,2H),1.43-1.32(m,2H),0.98(br d,J=6.5Hz,3H),0.71(br d,J=6.5Hz,3H)。
实施例18
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.76(br s,1H),7.74(s,1H),7.16-6.83(m,2H),4.70(br s,2H),4.52(br s,1H),4.31-4.21(m,2H),3.70(t,J=4.4Hz,2H),3.34(s,3H),1.94-1.68(m,1H),0.98(d,J=6.4Hz,3H),0.71(d,J=6.5Hz,3H)。
实施例19
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.78(s,1H),7.74(s,1H),7.01(br s,1H),6.88(s,1H),4.70(br d,J=2.4Hz,2H),4.55(br d,J=8.9Hz,1H),4.21-4.06(m,2H),3.40(brs,2H),3.24(s,3H),1.90-1.72(m,3H),1.71-1.63(m,2H),0.98(d,J=6.5Hz,3H),0.71(brd,J=6.5Hz,3H)。
实施例20
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.78(s,1H),7.76(s,1H),7.03(s,1H),6.88(s,1H),4.70(br d,J=2.8Hz,2H),4.55(br d,J=8.4Hz,1H),4.30-4.23(m,2H),4.21-4.11(m,2H),3.69-3.50(m,2H),3.35-3.33(m,2H),2.00(quin,J=6.4Hz,2H),1.94-1.73(m,1H),0.98(d,J=6.5Hz,3H),0.71(br d,J=6.5Hz,3H)。
实施例21
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代二甲亚砜)δ8.78(s,1H),7.76(s,1H),7.03(s,1H),6.93(s,1H),4.70(br d,J=3.1Hz,2H),4.55(br d,J=10.0Hz,1H),4.29-4.20(m,4H),2.18(quin,J=6.0Hz,2H),1.83(br s,1H),0.98(d,J=6.4Hz,3H),0.71(d,J=6.5Hz,3H)。
实施例22
化合物22-1可参照化合物7-12的制备方法制得
步骤A:向22-1(300.00毫克,824.65微摩尔,1.00当量)和5-溴-2-戊酮(176.92毫克,1.07毫摩尔,1.30当量)的N,N-二甲基甲酰胺(3.00毫升)溶液中一次性加入碳酸钾(182.36毫克,1.32毫摩尔,1.60当量)。溶液110摄氏度下搅拌10小时。再向其中加入1.00摩尔/升稀盐酸(5.00毫升),混合溶液10摄氏度下搅拌10分钟。再将溶液经乙酸乙酯萃取(30.00毫升*3)。收集合并有机相,水洗(10.00毫升*3),饱和食盐水(10.00毫升*3),再经无水硫酸钠干燥,然后减压浓缩得到黄色固体,并经过硅胶色谱板分离(二氯甲烷/甲醇10/1)(两次)得到化合物22-2。
步骤B:向22-2(50.00毫克,111.63微摩尔,1.00当量)的甲醇(3.00毫升)溶液中一次性加入4.00摩尔/升的氢氧化钠水溶液0.50毫升。混合溶液在40摄氏度下搅拌10分钟。向其中加入1.00摩尔/升的稀盐酸水溶液1.00毫升,然后减压浓缩得到黄色固体。所得到黄色固体经高效液相色谱制备(柱子:Phenomenex Gemini 150毫米*25毫米*10微米;流动相:[水(0.05%氨水)-乙腈];洗脱梯度:9%-39%,10分钟)纯化得到实施例22。
ee值(对映体过量):93%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代甲醇)δ=8.43(br s,1H),7.57(br s,1H),6.84-6.67(m,2H),4.75-4.51(m,2H),4.13(br d,J=5.6Hz,3H),2.75(br t,J=6.8Hz,2H),2.20(s,3H),2.13-2.08(m,2H),1.95(br s,1H),1.07(br d,J=6.2Hz,3H),0.82(br d,J=6.0Hz,3H).
实施例23
化合物23-1可参照化合物7-12的制备方法制得
步骤A:向23-1(200.00毫克,549.77微摩尔,1.00当量)的N,N-二甲基甲酰胺(8.00毫升)溶液中加入碳酸钾(121.57毫克,879.63微摩尔,1.60当量)。溶液在110摄氏度下搅拌1小时。向溶液中加入3.00毫升水,过滤悬浊液得到棕色固体。棕色固体经两次制备硅胶板分离(二氯甲烷/甲醇10/1)得到化合物23-2。
步骤B:向23-2(84.00毫克,170.40微摩尔,1.00当量)的二氯甲烷(2.00毫升)溶液中逐滴加入三氟乙酸(950.29毫克,8.33毫摩尔,617.07微升,48.91当量)。得到的溶液在10摄氏度下搅拌三分钟,再减压浓缩得到化合物23-3。
步骤C:在氮气保护下,向0摄氏度下的23-3(80.00毫克,196.63微摩尔,1.00当量)和三乙胺(50.74毫克,501.41微摩尔,69.50微升,2.55当量)的二氯甲烷(2.00毫升)中于5分钟内缓慢滴入氯甲酸甲酯(37.16毫克,393.26微摩尔,30.46微升,2.00当量)。所得到的溶液在0~14摄氏度下搅拌30分钟。然后经高效液相色谱柱分离(柱子:PhenomenexSynergi C18 150毫米*25毫米*10微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:33%-53%,10分钟)得到实施例23。
ee值(对映体过量):100%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ=15.61(br s,1H),8.38(br s,1H),7.45(s,1H),6.78(s,1H),6.56(s,1H),5.08(br s,1H),4.65-4.45(m,2H),4.07(br s,2H),3.79(br s,1H),3.61(s,3H),3.39(br d,J=5.1Hz,2H),2.04(br s,2H),1.18(s,1H),1.02(br d,J=5.9Hz,3H),0.81(br d,J=6.1Hz,3H)
实施例24
化合物24-4可参照化合物6-4的制备方法制得
步骤A:将24-5(100.00克,724.01毫摩尔,1.00当量)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(600.00毫升)中,在冷却至0摄氏度后,向其中加入碳酸钾(100.06克,724.01毫摩尔,1.00当量)。将混合体系加热至90摄氏度后,将1-溴-3-甲氧基-丙烷(110.79克,724.01毫摩尔,1.00当量)的N,N-二甲基甲酰胺(400.00毫升)于一小时内缓慢加入溶液中。混合溶液在90摄氏度下继续搅拌一小时。然后将溶液倒入400.00毫升水中,并通过乙酸乙酯(800.00毫升*3)萃取,合并有机相,水洗(500.00毫升),饱和食盐水洗(200.00毫升*2),减压浓缩得到白色固体,再经过硅胶色谱柱层析纯化(二氧化硅,石油醚/乙酸乙酯=100/1到80/1)得到化合物24-6。
步骤B:将24-6(50.00克,237.84毫摩尔,1.00当量)溶解于乙腈(300.00毫升)中并冷却至0摄氏度,再向其中加入氯代丁二酰亚胺(32.08克,240.22毫摩尔,1.01当量)。混合体系升温至25摄氏度并搅拌10小时。将溶液减压浓缩得到无色液体,再将500.00毫升乙酸乙酯倒入液体中,并水洗(100.00毫升*3),饱和食盐水洗(100.00毫升*3),有机相无水硫酸钠干燥后,减压浓缩得到白色固体。得到的白色固体经过甲醇打浆后得到化合物24-7。
步骤C:向24-7(19.11克,78.10毫摩尔,1.00当量)和24-4(24.00克,85.91毫摩尔,1.10当量)的N,N-二甲基甲酰胺(300.00毫升)溶液中一次性加入碳酸钾(21.59克,156.21毫摩尔,2.00当量)。溶液在50摄氏度下搅拌两小时。将反应液倒入100.00毫升水中,然后溶液经过乙酸乙酯(1000.00毫升)萃取,分离有机相并水洗(100.00毫升)和饱和食盐水洗(100.00毫升),经过无水硫酸钠干燥后,减压浓缩得到化合物24-8。
步骤D:向24-8(33.00克,74.33毫摩尔,1.00当量)的二氯甲烷(30.00毫升)溶液中一次性加入三氟乙酸(68.68克,602.31毫摩尔,44.59毫升,8.10当量)。溶液在10摄氏度下搅拌1小时。然后减压浓缩,得到棕色油状物。向其中加入100.00毫升饱和碳酸氢钠水溶液并在10摄氏度下搅拌1小时再经600.00毫升乙酸乙酯萃取,分离有机相,无水硫酸钠干燥,浓缩得到化合物24-9。
步骤E:向24-11(15.86克,61.38毫摩尔,2.00当量)的甲苯(100.00毫升)溶液中一次性加入24-9(10.00克,30.69毫摩尔,1.00当量)。将悬浮液体系抽真空并氮气置换多次后,升温至120摄氏度,搅拌28小时。将溶液减压浓缩后得到棕色油状物。棕色油状物经过快速硅胶色谱柱层析(
330g
快速硅胶色谱柱,5%三氟乙酸/乙腈作为洗脱液,流速:100毫升每分钟)得到化合物24-10。
步骤F:24-10(4.20克,9.01毫摩尔,1.00当量)和四氯苯醌(5.54克,22.53毫摩尔,2.50当量)的甲苯(60.00毫升)和乙二醇二甲醚(60.00毫升)溶液在120摄氏度下搅拌2小时。将溶液减压浓缩后得到棕色油状物。棕色油状物经过快速硅胶色谱柱层析(
330g
快速硅胶色谱柱,流动相:0~70%乙腈/5%三氟乙酸流速:100毫升每分钟)得到棕色油状物。残余物再经高效液相色谱柱层析(柱子:Phenomenex luna C18 250*50毫米*10微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:38%-68%,30分钟)纯化得到实施例24。
ee值(对映体过量):100%
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ=9.04-8.37(m,1H),7.66-7.51(m,1H),7.07-6.54(m,2H),4.90-4.48(m,2H),4.18(br s,3H),3.62(br s,2H),3.39(s,3H),2.15(quin,J=5.9Hz,2H),1.30-0.91(m,9H)。
实施例25
化合物25-4可参照化合物6-4的制备方法制得
步骤A:将25-1(140.00克,1.01摩尔),碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺(500.00毫升)的混合液于90摄氏度下加热1小时,接着将1-溴-3-甲氧基-丙烷(147.34克,962.93毫摩尔,)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(100.00毫升)于90摄氏度下,滴入上述混合液后,于90摄氏度下搅拌5小时。混合液倒入水(1500.00毫升)中,用乙酸乙酯萃取(1000.00毫升*2),合并有机相,用饱和食盐水洗(1000.00毫升*3),无水硫酸钠干燥,45摄氏度下减压浓缩,所得粗品经经硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯=50/1至10/1)得到化合物25-2。
步骤B:氮气保护下,将溴(33.34克,208.65毫摩尔,10.76毫升)的二氯甲烷溶液(100.00毫升)于0摄氏度滴入25-2(40.00克,189.68毫摩尔)的二氯甲烷(300.00毫升)溶液中,混合液15摄氏度下搅拌1小时后,用饱和的硫代硫酸钠溶液(200.00毫升)淬灭,接着用乙酸乙酯萃取(100.00毫升*2),合并有机相,用饱和食盐水洗(100.00毫升*2),无水硫酸钠干燥,45摄氏度下减压浓缩得化合物25-3。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ=11.43(s,1H),9.78-9.63(m,1H),7.69(s,1H),6.50(s,1H),4.20(t,J=6.1Hz,2H),3.73-3.52(m,2H),3.39(s,3H),2.23-2.08(m,2H)
步骤C:15摄氏度下,向25-3(28.20克,96.84毫摩尔)的二甲基甲酰胺(280.00毫升)的溶液中加入碳酸钾(26.77克,193.69毫摩尔)和25-4。混合液在50摄氏度搅拌2小时。混合液倒入饱和的氯化铵溶液中(300.00毫升),乙酸乙酯萃取(200.300毫升*2),所得有机相用饱和食盐水洗(100.00毫升*2),无水硫酸钠干燥,45摄氏度下减压浓缩得化合物25-5。
步骤D:将三氟乙酸(229.01克,2.01mol,148.71毫升)于0摄氏度下加入25-5的(45.00克,91.34毫摩尔)二氯甲烷溶液中(150.00毫升)。混合液搅拌20小时。45摄氏度下减压除去溶剂,所得粗品溶于饱和碳酸氢钠溶液中(400.00毫升),乙酸乙酯萃取(200.00毫升*4),合并有机相饱和食盐水洗(200.00毫升*3),无水硫酸钠干燥,45摄氏度下减压浓缩得化合物25-6。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ=8.91(s,1H),7.80(s,1H),6.59(s,1H),4.69(br d,J=10.6Hz,1H),4.16(dt,J=1.3,6.2Hz,2H),4.04-3.98(m,1H),3.85(br d,J=2.7Hz,1H),3.53(t,J=5.9Hz,2H),3.29(s,3H),2.13-2.02(m,2H),1.05(s,9H)。
步骤E:将25-7(34.73克,134.40毫摩尔)于15摄氏度下加入25-6的甲苯溶液中(120.00毫升)。混合液于120摄氏度搅拌12小时后,补加25-7(9.98克,38.64毫摩尔),继续于120摄氏度搅拌20小时。接着向反应体系中加入三氟乙酸(76.62克,672.00毫摩尔,49.76毫升),40摄氏度搅拌3小时。反应液于45摄氏度减压浓缩,用饱和碳酸钠溶液(300.00毫升)调pH值9到10,用乙酸乙酯萃取(200.00毫升*2),合并有机层,饱和食盐水洗(200.00毫升*1),无水硫酸钠干燥,过滤,45摄氏度下减压浓缩,粗品经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯=10/1至1/1)得化合物25-8。
步骤F:将25-8(3.88克,7.37毫摩尔)和2,3,5,6-四氯-1,4-苯醌(2.18克,8.85毫摩尔)的甲苯(20.00毫升)和乙二醇二甲醚(20.00毫升)加入至70摄氏度搅拌3小时。混合液45摄氏度减压蒸干去除溶剂,加入饱和碳酸钠溶液(300.00毫升),乙酸乙酯萃取(100.00毫升*3)除去酸性杂质,合并有机层,加入2.00摩尔每升的稀盐酸(200.00毫升)搅拌1小时,分离水相后,用2.00摩尔每升的氢氧化钠溶液调pH值10,接着用二氯甲烷萃取(100.00毫升*3),有机层用水(150.00毫升*1)和饱和食盐水(150.00毫升*2)洗,无水硫酸钠干燥,45摄氏度下减压浓缩得化合物25-9。
步骤克G:15摄氏度下,向25-9(60.00毫克,116.74微摩尔)的甲醇溶液(1.00毫升)中加入4.00摩尔每升的氢氧化钠(494.58微升)溶液中,混合液15摄氏度搅拌0.5小时。溶剂45摄氏度减压浓缩,粗品用1.00摩尔每升的盐酸溶液调pH值6到7,45摄氏度减压浓缩后,所得粗品用高效液相色谱纯化(盐酸条件;柱子:Phenomenex Synergi C18 150*25*10微米;流动相:[水(0.225%甲酸)-乙腈];洗脱梯度:40%-70%,10分钟)得化合物实施例25.
ee值:96.654%。
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代甲醇)δ=8.63(br s,1H),8.44(s,1H),7.86(br s,1H),6.73(br s,1H),4.62(br s,3H),4.20(br s,2H),3.64(t,J=6.1Hz,2H),3.38(s,3H),2.17-2.04(m,2H),1.38-0.85(m,9H)
实施例26
化合物26-1可参照化合物25-9的制备方法制得:
步骤A:10摄氏度下,将氰化亚铜(27.88毫克,311.30微摩尔,68.00微升,2.00当量)加入26-1(80毫克,155.65微摩尔,1.00当量)的N,N-二甲基甲酰胺(2.00mL)溶液中混合液140摄氏度搅拌12小时。混合液用乙酸乙酯(20.00毫升),用15%的稀氨水(20.00毫升*3)洗,有机相层45摄氏度减压浓缩。所得粗品用高效液相色谱纯化(盐酸条件;柱子:Phenomenex Synergi C18 150*25*10微米;流动相:[水(0.05%盐酸)-乙腈];洗脱梯度:45%-65%,7.8分钟)得化合物实施例26
ee值:100%
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代氯仿)δ=9.07-8.18(m,1H),7.74(br s,1H),7.06-6.32(m,2H),5.01-4.41(m,2H),4.14(br s,3H),3.53(br s,2H),3.30(s,3H),2.07(br s,2H),1.30-0.76(m,9H)。
实施例27
化合物27-1可参照化合物25-9的制备方法制得:
步骤A:将27-1(100.00毫克,194.56微摩尔),甲基硼酸(13.98毫克,233.47微摩尔),碳酸钠(20.62毫克,194.56微摩尔),及二茂铁二苯基磷二氯化钯二氯甲烷配合物(31.78毫克,38.91微摩尔)的二氧六环(1.00毫升)和水(0.20毫升)的混悬液氮气保护下80摄氏度搅拌12小时。混合液过滤,滤液用乙酸乙酯萃取(10.00毫升*3)。有机层用饱和食盐水洗(20.00毫升*1)45摄氏度减压浓缩,粗品用制备薄层色谱纯化(硅胶,二氯甲烷:甲醇=15:1)得27-2。
步骤B:15摄氏度下将4.00摩尔每升的氢氧化钠(4.00M,443.78微升)溶液加入27-2的(55.00毫克,110.06微摩尔)甲醇溶液中(2.00毫升),混合液15摄氏度下搅拌0.5小时。溶剂45摄氏度减压浓缩,粗品用1摩尔每升的盐酸溶液调pH值6到7,45摄氏度减压浓缩后,所得粗品用高效液相色谱纯化(甲酸条件;柱子:Phenomenex Synergi C18 150*25*10微米;流动相:[水(0.225%盐酸)-乙腈];洗脱梯度:40%-70%,10分钟)得化合物实施例27。
ee值:96.852%
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代甲醇)δ=8.73(br s,1H),7.48(s,1H),7.20(s,1H),6.63(s,1H),4.82(br s,1H),4.70-4.54(m,2H),4.15(br s,2H),3.62(t,J=6.1Hz,2H),3.38(s,3H),2.23(s,3H),2.10(quin,J=6.1Hz,2H),1.22-0.83(m,9H)
实施例28
化合物28-1可参照化合物25-9的制备方法制得:
步骤A:将28-1(100.00毫克,194.56微摩尔),环丙基硼酸(33.42毫克,389.12微摩尔),磷酸钾(123.90毫克,583.68微摩尔),醋酸钯(218.40微克,9.73e-1微摩尔)及双(1-金刚烷基)-丁基-磷(697.58微克,1.95微摩尔)的甲苯(2.50毫升)和水(1.00毫升)的混悬液氮气保护下90摄氏度搅拌12小时。混合液用乙酸乙酯稀释(20.00毫升)过滤,硅藻土过滤后加入20.00毫升水,分离有机层45摄氏度减压浓缩,粗品用制备薄层色谱纯化(硅胶,二氯甲烷:甲醇=20:1)得28-2.
步骤B:15摄氏度下将4.00摩尔每升的氢氧化钠(4.00M,516.43微升)溶液加入28-2的(55.00毫克,103.29微摩尔)甲醇溶液(2.00毫升)中,混合液15摄氏度下搅拌0.5小时。混合液用1.00摩尔每升的盐酸溶液调pH值6到7,45摄氏度减压浓缩后,所得粗品用反相色谱柱纯化(甲酸条件;5%乙腈/水to 40%乙腈/水)得化合物实施例28.
ee值:99.202%
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代甲醇)δ=8.72-8.49(m,1H),7.15(s,1H),7.00(br s,1H),6.89-6.47(m,1H),4.62(s,3H),4.16(br s,2H),3.65(t,J=6.2Hz,2H),3.38(s,3H),2.16-2.00(m,2H),1.33-1.18(m,2H),1.01-0.88(m,9H),0.77-0.62(m,2H)
实施例29
化合物29-1可参照化合物25-9的制备方法制得:
步骤A:将29-1(200.00毫克,389.12微摩尔),三丁基(1-乙氧乙烯基)锡烷(0.29克,802.99微摩尔,271.03微升)及二(三苯基磷)二氯化钯(10.92毫克,15.56微摩尔)的二氧六环(2.00毫升))混合液用氮气置换三次后,90摄氏度搅拌12小时混合液45摄氏度减压浓缩得粗品,粗品先用反相色谱柱纯化(盐酸条件,5%乙腈/水(0.05%盐酸)=5%至60%)再采用高效液相色谱(碱性条件;柱子:Phenomenex Gemini 150*25毫米*10微米;流动相:[水(0.05%氨水)-乙腈];洗脱梯度:11%-38%,12分钟)纯化得实施例29。
ee值:92.56%
SFC(超临界流体色谱)方法:柱子:Chiral pak AD-3 100毫米×4.6毫米I.D.,3微米。流动相:甲醇(0.05%二乙胺)在二氧化碳中从5%到40%。流速:3毫升每分钟。波长:220纳米。
1H NMR(400MHz,氘代甲醇)δ=8.59(br s,1H),8.16(s,1H),7.14(br s,1H),6.77(s,1H),5.04-4.95(m,1H),4.76-4.51(m,2H),4.35-4.22(m,2H),3.63(t,J=6.1Hz,2H),3.38(s,3H),2.64(s,3H),2.17(quin,J=6.1Hz,2H),1.02(s,9H)
效果实施例
实验例1:HBV体外测试
1.实验目的:
通过实时定量qPCR试验(real time-qPCR)检测HepG2.2.15细胞培养上清的HBVDNA含量,及酶联免疫吸附测定(ELISA)检测HBV表面抗原含量,以化合物的EC50值为指标,来评价化合物对HBV的抑制作用。
2.实验材料:
2.1.细胞系:HepG2.2.15细胞
HepG2.2.15细胞培养基(DMEM/F12,Invitrogen-11330032;10%血清,Invitrogen-10099141;100units/ml青霉素和100μg/ml链霉素,Hyclone-SV30010;1%非必需氨基酸,Invitrogen-11140050;2毫米L-GLUTAMINE,Invitrogen-25030081;300μg/mlGeneticin,Invitrogen-10131027
2.2.试剂:
胰酶(Invitrogen-25300062)
DPBS(Corning-21031CVR)
DMSO(Sigma-D2650-100ML)
高通量DNA纯化试剂盒(QIAamp 96 DNA Blood Kit,Qiagen-51162)
定量快速启动通用探针试剂(FastStart Universal Probe Master,Roche-04914058001)
乙型肝炎表面抗原定量检测试剂盒(安图生物,CL 0310)
2.3.耗材与仪器:
96孔细胞培养板(Corning-3599)
CO2培养箱(HERA-CELL-240)
光学封板膜(ABI-4311971)
定量PCR 96孔板(Applied Biosystems-4306737)
荧光定量PCR仪(Applied Biosystems-7500real time PCR system)
3.实验步骤和方法:
3.1种HepG2.2.15细胞(4x104细胞/孔)到96孔板,在37℃,5%CO2培养过夜。
3.2第二天,稀释化合物,共8个浓度,3倍梯度稀释。加不同浓度化合物到培养孔中,双复孔。培养液中DMSO的终浓度为0.5%。10μM ETV作为100%inhibition对照;0.5%的DMSO作为0%inhibition对照。
3.3第五天,更换含有化合物的新鲜培养液。
3.4第八天收取培养孔中的培养液,取部分样品ELISA测定乙肝病毒S抗原的含量;取部分样品使用高通量DNA纯化试剂盒(Qiagen-51162)提取DNA。
3.5 PCR反应液的配制如表1所示:
表1 PCR反应液的配制
前引物序列:GTGTCTGCGGCGTTTTATCA
后引物序列:GACAAACGGGCAACATACCTT
探针序列:5'+FAM+CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC+TAMRA-3'
3.6在96孔PCR板中每孔加入15μl的反应混合液,然后每孔加入10μl的样品DNA或HBV DNA的标准品。
3.7PCR的反应条件为:95℃加热10分钟,然后95℃变性15秒,60℃延伸1分钟,共40个循环。
3.8ELISA测定乙肝病毒S抗原的含量
取50μl样品和标准品分别加入到反应板中,再每孔分别加入50μl酶结合物,震荡混匀,37℃温浴60分钟,然后用洗液洗板5次,再每孔加入50μl发光底物,混匀,室温避光反应10分钟,最后用酶标仪检测化学发光强度。
3.9数据分析:
计算抑制百分比:%Inh.=(1-样品中的值/DMSO对照值)x100。
计算EC50:使用GraphPad Prism软件计算化合物对HBV的50%抑制浓度(EC50)值。
4.实验结果:见表2和表3。
表2 HBV-DNA实验结果
结论:本发明代表性化合物体外能有效抑制HBV-DNA。
表3 HBsAg实验结果
结论:本发明代表性化合物能有效抑制乙肝表面抗原(HBsAg)。
实验例2:血浆蛋白结合率研究
测定实施例6在人、CD-1小鼠和SD大鼠血浆中的蛋白结合率。取人,CD-1小鼠和SD大鼠的空白血浆796μL,加入4μL受试化合物工作溶液(400μM)或华法林工作溶液(400μM),使血浆样品中受试化合物与华法林终浓度均为2μM。将样品充分混合。有机相DMSO的终浓度为0.5%;移取50μL受试化合物和华法林血浆样品到样品接收板中(三个平行),立即加入相应体积的对应空白血浆或缓冲液,使得每个样品孔的终体积为100μL,血浆:透析缓冲液的体积比为1:1,然后向这些样品中加入400μL终止液,此样品将作为T0样品用于回收率及稳定性测定。将T0样品存储于2-8℃,等待与其它透析完的样品一起进行后续处理;将150μL受试化合物和华法林血浆样品加入到每个透析孔的给药端,在透析孔对应的接收端中加入150μL空白透析缓冲液。然后将透析板封上透气膜后置于湿润的、5%CO2的培养箱中,在37℃下、约100rpm振荡孵育4-hr。透析结束后,移取50μL透析后的缓冲液样品和透析后的血浆样品到新的样品接收板。在样品中加入相应体积的对应空白血浆或缓冲液,使得每个样品孔的终体积为100μL,血浆:透析缓冲液的体积比为1:1。所有样品经过蛋白沉淀后进行LC/MS/MS分析,并通过公式:蛋白未结合率(%)=100*通过透析膜的药物浓度/未通过透析液的药物浓度,蛋白结合率(%)=100-%蛋白未结合率,%回收率=100*(通过透析膜的药物浓度+未通过透析液的药物浓度)/未透析前的总药物浓度。计算蛋白结合率以及回收率。
实验结果:
实施例6在人、CD-1小鼠和SD大鼠血浆中的蛋白结合率分别为55.7%,50.2%及59.4%。
实验结论:本发明化合物具有适中的血浆蛋白结合率,药物与蛋白未结合的比例较多,从而产生更高的血浆暴露量。
实验例3:细胞色素P450同工酶抑制性研究
测定受试化合物对人细胞色素P450同工酶不同亚型的抑制性。准备受试化合物、标准抑制剂(100×最终浓度)和混合底物工作溶液;将冷冻于–80℃冰箱的微粒体拿出解冻。将2μL的待测化合物和标准抑制剂溶液加至相应孔位,同时将2μL相应的溶剂加至无抑制剂对照孔位(NIC)和空白对照孔位(Blank)孔位;其次将20μL混合底物溶液加至相应孔位,Blank孔位除外(将20μL PB加至Blank孔位);准备人肝微粒体溶液(使用后标记日期立刻放回冰箱),随即将158μL人肝微粒体溶液加至所有孔位;将上述样品板放入37℃水浴预孵育,随即准备辅酶因子(NADPH)溶液;10分钟后,添加20μL NADPH溶液到所有孔位,样品板摇匀后,放入37℃水浴孵育10分钟;在相应时间点,加入400μL冷的乙腈溶液(内标为200ng/mL甲苯磺丁脲和拉贝洛尔)终止反应;样品板混合均匀后,4,000rpm离心20分钟,沉淀蛋白质;取200μL上清加至100μL水中,摇匀后送LC/MS/MS检测。
实验结果:见表4。
结论:本发明化合物对CYP酶无抑制作用。
表4细胞色素P450同工酶抑制实验结果
实验例4:微粒体代谢稳定性
实验目的:测试受试化合物(实施例6)在三个种属中的肝微粒体代谢稳定性。
实验方法:在37℃条件下,1μM受试化合物和微粒体(0.5mg/mL)辅以NADPH再生体系孵育;阳性对照分别是睾酮(3A4底物),丙胺苯丙酮(2D6底物)和双氯芬酸(2C9底物),同样的在37℃,阳性对照和微粒体(0.5mg/mL)辅以NADPH再生体系孵育;不同时间点(0、5、10、20、30和60分钟)样品与包含内标的冷乙腈直接混合终止反应;化合物和微粒体在不含有NADPH再生体系的条件下孵育60分钟;每个时间点一个平行(n=1);样品采用LC/MS/MS分析;化合物的浓度根据分析物峰面积与内标峰面积比率进行表征。
实验结果:本发明化合物在大鼠、人和小鼠肝微粒体中在T=60min时剩余比例分别为:113.0%、109.1%和102.5%。
实验结论:本发明化合物在大鼠、人和小鼠这三个种属中均具有较好的稳定性。
实验例5:大/小鼠单次给药药代研究
实验目的:以雄性C57BL/6小鼠或SD大鼠为受试动物,单次给药后测定化合物血浆,肝脏和脑脊液的药物浓度并评估药代动力学行为。
实验方法:选择健康成年雄性C57BL/6小鼠或SD大鼠灌胃给药。候选化合物与适量5%DMSO/95%(10%羟丙基-β-环糊精)混合,涡旋并超声,制备得到0.2mg/mL澄清溶液备用。小鼠2mg/kg口服给药后,收集一定时间的全血,制备得到血浆,并采集肝脏和脑脊液,样品前处理后以LC-MS/MS方法分析药物浓度,并用Phoenix WinNonlin软件计算药代参数。
实验结果:表5。
实验结论:受试化合物实施例5在小鼠和大鼠这两个种属中具有较好的AUC0-last和生物利用度。
表5受试化合物在小鼠和大鼠中的药代动力学实验结果
实验例6:尾静脉高压注射小鼠HBV模型(HDI-HBV)体内药效实验
实验目的:通过HDI小鼠模型评价实施例化合物体内抗乙肝病毒活性
实验材料:Balb/c小鼠、10%HP-β-CD作为溶媒、受试化合物、RG7834、ETV(恩替卡韦)、pAAV2-HBV1.3mer质粒(使用Qiagen EndoFree Plasmid Giga试剂盒提取)、主要试剂包括QIAamp96DNA试剂盒和FasStart Universal Probe Mast(ROX)。本项目所用主要仪器包括离心机(Beckman Allegra X-15R),组织研磨机(QIAGEN-Tissue lyser II)和分光光度仪(Thermo-NANODROP 1000)。
实验方法:
a)实验设计如下表6:
表6体内实验设计
b)第0天,所有小鼠经尾静脉高压注射HBV质粒DNA溶液。质粒DNA在注射前预先用无菌生理盐水配置好,于4℃保存直至使用。5秒内从尾静脉注射小鼠体重8%的质粒DNA溶液。
c)第1-7天,小鼠用化合物或溶剂连续口腔灌胃7天,具体给药方式见表15-16。
d)第1,3和5天小鼠经颌下静脉采血,用肝素钠做为抗凝剂,7,000×g,4度离心,制备血浆,用于测定HBV DNA。
e)第7天,所有小鼠经CO2安乐死后,心脏采血制备血浆,并收集肝组织,分离两份肝左叶,大小为70-100mg,收集后立即液氮速冻,其中一份用于HBV DNA检测,另一份作为备用。
f)所有血浆和肝脏样品在送检前置于-80℃冰箱保存。
样品处理:ELISA(酶联免疫吸附测定)检测小鼠血清中HBsAg的含量:实验步骤参照HBsAg ELISA试剂盒说明书。
实验结果:受试化合物在小鼠HDI模型中对HBV复制的抑制活性通过检测小鼠血浆中HBsAg含量而确定,表7和图1展示了不同给药时间小鼠血浆中HBsAg的含量。
表7.小鼠给药后不同天数血浆中HBsAg含量
结论:
在同等的给药剂量下,从第5天降低HBsAg的数据来看,实施例6化合物的降低表面抗原的能力要优于RG7834和恩替卡韦,具有更好的药效。
实验例7:重组8型腺相关病毒载体介导的乙型肝炎病毒小鼠模型(AAV-HBV)中抗乙肝病毒活性研究
实验目的:
AAV载体介导的HBV转染小鼠模型是一种快速、高效的HBV模型。利用AAV8载体的高度嗜肝性,用携带1.3拷贝HBV基因组的重组8型腺相关病毒(rAAV8-1.3HBV)经小鼠尾静脉注射,可将所携带的1.3拷贝HBV基因组高效导入肝细胞。由于AAV病毒载体的特性,其介导的载体可以持续表达很长时间,应用AAV/HBV模型可以在小鼠肝脏内持续复制HBVDNA并表达HBsAg和HBeAg。
通过运用AAV/HBV小鼠模型,检测受试化合物治疗后的小鼠血清中HBsAg,以评价其体内抗HBV效果。
实验材料:
C57BL/6小鼠、10%HP-β-CD作为溶媒、参考化合物TDF(替诺福韦酯)、受试化合物、重组病毒rAAV8-1.3HBV、本项目主要试剂包括QIAamp96 DNA试剂盒和
Universal PCR Master Mix,乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒。仪器包括:离心机(Beckman Allegra X-15R),组织研磨机(QIAGEN-Tissue lyser II)和分光光度仪(Thermo-NANODROP 1000)。
实验方法:
a)所有小鼠在病毒注射后第28天开始口服给药,将该天设为第0天。给药前所有小鼠颌下采血收集血清。每天给一次药,连续给四周。具体给药方案见表8。
b)所有小鼠每周进行两次颌下采血用于收集血清,每次采血量为约100μL。具体采血时间见表8。
c)第28天,将所有小鼠安乐死,心脏采血收集血清。
d)所有血清样品送至检测。
表8体内实验方案
样品分析:
ELISA检测小鼠血清中HBsAg的含量:实验步骤参照HBsAg ELISA试剂盒说明书。
实验结果:
a)检测血清中HBsAg含量评价受试化合物在AAV/HBV小鼠模型中抗HBV活性。结果见表9和图2.
表9小鼠给药后不同日期的HBsAg含量(IU/mL)
b)小鼠体重变化见图3。
实验结论:
在本实验中,受试化合物实施例6在AAV/HBV小鼠模型实验中,能够极显著降低HBsAg,同时具有一定的量效关系。实施例6治疗过程中,小鼠表现出良好的耐受性,体重变化优于RG7834。
实验例8:大鼠14天预毒理耐受性实验
本试验通过对大鼠每天一次连续14天灌胃给予供试品RG7834和实施例6来检测其潜在的毒性。试验设计见表10。
表10试验设计分组和给药剂量
本试验共有21只动物随机分为7组,每天一次,连续14天经口灌胃给予供试品并检测其毒性。动物的剖检和组织将从固定液中移出、修取、脱水、包埋、切片、染色和镜检。这些组织包括所有动物的肝脏、心脏、肺脏和部分动物的脾脏、胃、十二指肠、空肠、回肠和肾脏。
实验结果:
RG7834:中低剂量组仅检查心脏、肝脏和肺脏,未见供试品相关的组织病理学变化。高剂量组显示供试品相关组织病理学变化表现为心脏轻微心肌变性、肝脏轻微小叶中央肝细胞变性、脾脏轻度白髓淋巴细胞减少、十二指肠中度黏膜急性炎症。
实施例6:中低剂量组仅检查心脏、肝脏和肺脏,未见供试品相关的组织病理学变化。高剂量组显示供试品相关组织病理学变化表现为脾脏轻微或轻度白髓淋巴细胞减少。
实验结论:从实验结果可以看出,相对于RG7834而言,实施例6具有较高的安全性。
实验例9:大鼠单次给药的神经毒性实验
实验目的:本试验通过对SD大鼠单次经口灌胃给予RG7834,实施例6,使用功能性观察组合测试(FOB)评估其对SD大鼠的潜在神经行为学毒性。
实验材料和方法:本试验共25只SD雄性大鼠。给药开始时动物年龄约7到8周,雄性体重225.50到285.70g,雌性体重177.68到219.89g。供试品给药组动物分别单次灌胃给予溶解于溶媒[0.5%(w/v)羟丙基甲基纤维素/0.2%(v/v)吐温80纯化水溶液,(pH 8.0-9.0)]的RG7834,300或1000mg/kg及实施例6的300或1000mg/kg,对照组动物仅给予溶媒。所有动物的给药体积均为10mL/kg。动物进行FOB检测。
实验结果:单次经口灌胃给予SD大鼠剂量0、300、1000mg/kg的RG7834,实施例6,观察至24小时,1000mg/kg和300mg/kg的RG7834给药后雄性动物出现供试品相关的瞳孔的放大。1000mg/kg和300mg/kg的实施例6给药后雄性动物未出现供试品相关的瞳孔的放大。
实验结论:RG7834在高剂量下有一定的神经毒性作用,与之相比,本发明化合物具有更加优良的安全性。