ES2956785T3 - Método de determinación de la cebolla - Google Patents

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Abstract

Se proporciona un medio para determinar, con alta precisión, si una cebolla tiene o no un sabor picante y/o una propiedad lacrimógena. La presente invención se refiere a un método para determinar las características de una cebolla, caracterizándose el método por comprender: una primera etapa de detección para detectar una secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 correspondiente a un gen de aliinasa 1 en un ácido nucleico derivado de la cebolla; y una segunda etapa de detección para detectar una secuencia de bases de SEQ ID NO: 2 correspondiente a un gen de aliinasa 2 en el ácido nucleico derivado de la cebolla, en donde, si la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 no se detecta en la primera detección etapa y se detecta la secuencia de bases de SEQ ID NO: 2 en la segunda etapa de detección, se determina que la cebolla es una cebolla que no tiene sabor picante y/o propiedad lacrimógena. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método de determinación de la cebolla
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método de discriminación de si una cebolla es una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena, un conjunto de cebadores y un kit usado para el método.
Antecedentes de la técnica
La Literatura de Patente 1 divulga que en una cebolla se expresan 29 tipos de aliinasas, que son enzimas implicadas en la producción del factor lacrimógeno (LF), un componente que causa un sabor punzante; que, entre ellos, una aliinasa específica que consiste en una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:5 en la Literatura de Patente 1 es la aliinasa primaria asociada con un sabor punzante y una propiedad lacrimógena de una cebolla; y que se produjeron dos líneas de cebollas no lacrimógenas y no punzantes en las que se suprimió la actividad de la aliinasa específica.
La Literatura No de Patente 1 también divulga que se produjeron cebollas no lacrimógenas y no punzantes en las que la actividad de la aliinasa fue suprimida, como en la Literatura de Patente 1.
La Literatura No de Patente 2 divulga una secuencia de aminoácidos de una aliinasa que tiene una alta identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la aliinasa específica descrita en la Literatura de Patente 1. Sin embargo, la Literatura No de Patente 2 no muestra la magnitud de la contribución de esta aliinasa a un sabor punzante o una propiedad lacrimógena o no sugiere la presencia de otras aliinasas.
Las Literaturas No de Patente 3 a 6 sugieren la presencia de aliinasas de cebolla distintas de la aliinasa específica divulgada en la Literatura No de Patente 2. Sin embargo, estas publicaciones no divulgan información sobre la secuencia de estas otras aliinasas ni explicación de si están asociadas con un sabor punzante y una propiedad lacrimógena.
Lista de referencias
Literatura de Patentes
Literatura de Patente 1: Patente JP No. 5671657
Literatura No de Patente
Literatura No de Patente 1: Kato et al. "Production and characterization of tearless and non-pungent onion" DOI: 10.1038/srep23779
Literatura No de Patente 2: No. de acceso GenBank AAA32639.1
Literatura No de Patente 3: King et al. "A low-density genetic map of onion reveals a role for tandem duplication in the evolution of an extremely large diploid genome". Theor Appl Genet 96, 52-62 (1998)
Literatura No de Patente 4: Van Heusden, A. W., Shigyo, M., Tashiro, Y., Vrielink-van Ginkel, R. & Kik, C. AFLP linkage group assignment to the chromosomes of Allium cepa L. via monosomic addition lines. Theor Appl Genet 100, 480­ 486 (2000)
Literatura No de Patente 5: Martin, W. J. et al. Genetic mapping of expressed sequences in onion and in silico comparisons with rice show scant colinearity. Mol Genet Genom 274, 197-204 (2005)
Literatura No de Patente 6: Khrustaleva, L. et al. The chromosome organization of genes and some types of extragenic DNA in Allium. Acta Hort 969, 43-52 (2012)
Resumen de la invención
Problema técnico
La cebolla con expresión suprimida de la aliinasa específica que consiste en la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:5 en la Literatura de Patente 1, que se divulga en la Literatura de Patente 1, no tiene un sabor punzante ni una propiedad lacrimógena. Sin embargo, la Literatura de Patente 1 no divulga la secuencia genética de la aliinasa específica ni la causa de que no se exprese (por ejemplo, destrucción de la región reguladora, el factor de transcripción o el gen mismo). Adicionalmente, la Literatura de Patente 1 no divulga información sobre el gen de la aliinasa que no se expresó. La Literatura No de Patente 1 también divulga que se produjeron cebollas no lacrimógenas y no punzantes en las que se suprimió la actividad de la aliinasa, como en la Literatura de Patente 1, pero no divulga la secuencia completa de la aliinasa con expresión suprimida o la causa de la expresión suprimida.
El gen de la aliinasa de cebolla es un gen multicopia. Como se divulga en la Literatura de Patente 1, hay 29 genes de aliinasa que se expresan, e incluso más genes de aliinasa están presentes en una cebolla si se incluyen genes que no se expresan. Adicionalmente, las Literaturas No de Patente 2 a 6 también indican la presencia de genes de aliinasa distintos de los genes de aliinasa específicos divulgados en la Literatura de Patente 1. De este modo, podrían detectarse por error otros genes de aliinasa y, por lo tanto, fue difícil discriminar si la cebolla es una cebolla sin sabor punzante determinando la presencia o ausencia del gen que codifica la aliinasa específica descrita en la Literatura de Patente 1.
La presente invención proporciona un medio para discriminar si una cebolla es una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena determinando específicamente la presencia de un gen de aliinasa asociado con un sabor punzante y una propiedad lacrimógena en el cebolla a diferencia de otros genes.
Solución al problema
La presente invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos.
Efectos ventajosos de la invención
Según el método de discriminación de cebollas de la presente invención, una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena, que no se puede discriminar en apariencia, se puede discriminar con precisión.
Según el método de cultivo de la presente divulgación, una cebolla diana sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena se puede seleccionar con precisión en un entorno de cultivo de una nueva variedad usando una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena como uno de los materiales.
Los cebadores, los conjuntos de cebadores y el kit de la presente divulgación se pueden usar para amplificar específicamente el gen de la aliinasa 1 o el gen de la aliinasa 2.
El gen marcador de la presente divulgación se puede usar para detectar un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena de una cebolla.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1-1] La figura 1-1 muestra los resultados de alineación para la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y la secuencia de nucleótidos del gen de la aliinasa del No. de acceso de GenBank AAA32639.1 y la posición de cada cebador.
[Figura 1-2] Continuación de la figura 1-1
[Figura 1-3] Continuación de la figura 1-1
[Figura 1-4] Continuación de la figura 1-1
[Figura 2] La figura 2 muestra los resultados de la detección de productos de amplificación de PCR en los ADN genómicos de la cebolla #6 sin sabor punzante y una variedad de control como moldes usando un conjunto de cebadores de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOS: 3 y 4.
[Figura 3-1] La figura 3-1 muestra los resultados de la detección del gen 1 de la aliinasa y el gen 2 de la aliinasa en productos de amplificación de PCR en los ADN genómicos de la cebolla #6 sin sabor punzante y una variedad de control como moldes usando diversos conjuntos de cebadores.
[Figura 3-2] Continuación de la figura 3-1
[Figura 4] La figura 4 muestra los resultados de la detección del gen 1 de la aliinasa y el gen 2 de la aliinasa en productos de amplificación de PCR en los ADN genómicos de 14 variedades de cebollas disponibles comercialmente, una variedad de control y la cebolla #6 como moldes usando diversos conjuntos de cebadores.
[Figura 5] La figura 5 muestra los resultados de la detección del gen 1 de la aliinasa en productos de amplificación de PCR en los ADN genómicos de hojas de una pluralidad de cebollas F2 derivadas de la cebolla #6 sin sabor punzante como moldes usando SF2-SR1 como conjunto de cebadores.
[Figura 6] La figura 6 muestra los resultados de la medición de la cantidad de ácido pirúvico producido en bulbos de cebolla en los que se detectó el gen 1 de la aliinasa en el ADN genómico (bulbos seleccionados) y en bulbos de cebolla en los que no se detectó el gen 1 de la aliinasa (bulbos no seleccionados), entre las cebollas F2 derivadas de la cebolla #6 sin sabor punzante.
[Figura 7-1] La figura 7-1 muestra las posiciones de los cebadores en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
[Figura 7-2] Continuación de la figura 7-1
[Figura 8-1] La figura 8-1 muestra las posiciones de los cebadores en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
[Figura 8-2] Continuación de la figura 8-1.
Descripción de las realizaciones
<1. Términos>
En la memoria descriptiva, "gen 1" se refiere a un gen que codifica una aliinasa comprendida en el ADN genómico que se transcribe a un ARNm correspondiente a un ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
Adicionalmente, en la memoria descriptiva, "gen 2" se refiere a un gen que codifica una aliinasa, cuya secuencia de nucleótidos del ADN genómico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
El "gen para el cual la secuencia de nucleótidos del ADNc comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1" como se usa en este documento se refiere a un gen para el cual la secuencia de nucleótidos del ADNc correspondiente al ARNm transcrito a partir del gen comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
El ARN mensajero (ARNm), como se usa en este documento, se refiere a un ARNm maduro que consiste en regiones de exón ligadas mediante corte y empalme de un ARNm precursor biosintetizado por la ARN polimerasa a partir del ADN genómico como molde en la célula de una cebolla. El procedimiento de producción de ARNm (ARNm maduro) a partir de ADN genómico es la "transcripción".
El ADN complementario (ADNc) como se usa en este documento se refiere a un ADN bicatenario que consiste en un primer ADN complementario al ARNm, que se sintetiza mediante transcriptasa inversa usando ARNm como molde, y un segundo ADN complementario al primer ADN (es decir,, que consiste en una secuencia de nucleótidos obtenida sustituyendo u por t en la secuencia de nucleótidos del ARNm), el primer ADN monocatenario o el segundo ADN monocatenario. La "secuencia de nucleótidos del ADNc correspondiente al ADNm" como se usa en este documento se refiere a la secuencia de nucleótidos del segundo ADN.
En la presente invención, "polinucleótido" se refiere a un ácido desoxirribonucleico (ADN) o un ácido ribonucleico (ARN), por lo general un ADN. En el ARN, la timina (T) se puede sustituir por uracilo (U). También se puede usar como ADN un ADN que comprende U, que se sintetiza sustituyendo T por U en una o más posiciones. El polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como inosina (I), como parte del mismo.
El polinucleótido puede estar presente como una cadena monocatenaria o una cadena bicatenaria. Si el polinucleótido está presente como una cadena bicatenaria, es suficiente que al menos una cadena sea un polinucleótido que tenga características detalladas en esta memoria descriptiva.
El método de fabricación de un polinucleótido no está particularmente limitado y el polinucleótido se puede fabricar usando un sintetizador de polinucleótidos.
En la presente invención, el "ácido nucleico derivado de una cebolla" se refiere a un ADN genómico, un ARNm o un ADNc derivado de una cebolla cuyos rasgos se van a discriminar (cebolla diana). El ADN genómico, el ARNm y el ADNc también incluyen fragmentos amplificados del ADN genómico, fragmentos amplificados del ARNm y fragmentos amplificados del ADNc, respectivamente.
En la presente invención, la expresión "una secuencia de nucleótidos Y homóloga a una secuencia de nucleótidos X" o "una secuencia de nucleótidos X y una secuencia de nucleótidos Y son homólogas entre sí" se refiere a una combinación de una cadena de ADN que consiste en secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos X y una cadena de ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos Y que puede formar enlaces de hidrógeno suficientes para hibridar estas cadenas de ADN bajo la condición de hibridación de una reacción de amplificación del ácido nucleico para formar una cadena bicatenaria estable, y la secuencias de nucleótidos X e Y pueden ser parcialmente diferentes. Por ejemplo, un polinucleótido que consiste en la secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos X y un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos Y puede comprender algunos errores de coincidencia, tales como un error de coincidencia en 10 nucleótidos, un error de coincidencia en 20 nucleótidos o un error de coincidencia en 30 nucleótidos. Por lo general, la expresión una secuencia de nucleótidos Y "homóloga" a una secuencia de nucleótidos X significa que las secuencias de nucleótidos X e Y satisfacen cualquiera de las siguientes relaciones:
(A) la secuencia de nucleótidos Y es una secuencia de nucleótidos obtenida suprimiendo, sustituyendo, agregando y/o insertando uno o varios nucleótidos en la secuencia de nucleótidos X;
(B) la secuencia de nucleótidos Y es una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad del 90 % o superior con la secuencia de nucleótidos X;
(C) un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos Y puede hibridarse con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO:X en condiciones estrictas; y
(D) la timina (T) en una posición arbitraria en ya sea la secuencia de nucleótidos X o en la secuencia de nucleótidos Y se sustituye por uracilo (D) en la otra secuencia de nucleótidos.
En (A), "uno o varios" significa preferiblemente uno o dos, y lo más preferiblemente uno.
En (B), el valor de identidad indica un valor obtenido usando un software para calcular la identidad entre una pluralidad de secuencias de nucleótidos (por ejemplo, FASTA, DNASIS y BLAST) bajo la configuración predeterminada. El valor de la identidad de la secuencia de nucleótidos se obtiene contando el número de nucleótidos coincidentes cuando un par de secuencias de nucleótidos están alineadas en el grado máximo de coincidencia y calculando la proporción del número de nucleótidos coincidentes con el número total de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos comparada. Para detalles del método para determinar la identidad, consulte, por ejemplo Altschul et al., Nuc Acids. Res. 25, 3389­ 3402, 1977 and Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990.
En (B), la identidad es más preferiblemente 95 % o más, más preferiblemente 96 % o más, más preferiblemente 97 % o más, más preferiblemente 98 % o más, y más preferiblemente 99 % o más.
En (C), el término "condiciones estrictas" significa condiciones bajo las cuales se forma un llamado híbrido específico y no se forma un híbrido no específico. Por ejemplo, las condiciones rigurosas se pueden determinar apropiadamente con referencia a Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed. (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Específicamente, se pueden establecer condiciones estrictas para la temperatura y la concentración de sal en una solución para la hibridación Southern y la temperatura y la concentración de sal en una solución para el procedimiento de lavado en la hibridación Southern.
<2. Primer método de discriminación de la presente invención>
En primer lugar, el método de discriminación de rasgos de una cebolla de la presente invención es un método que comprende
una primera etapa de determinación para determinar la presencia de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en un ácido nucleico derivado de la cebolla, comprendiendo la primera etapa de determinación determinar la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados de timina (T) en la posición 94, timina (T) en la posición 130, guanina (G) en la posición 1312, timina (T) en la posición 1348, adenina (A) en la posición 187, adenina (A) en la posición 358, citosina (C) en la posición 791 y timina (T) en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en el ácido nucleico derivado de la cebolla,
en el que la cebolla se discrimina para que sea una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena si la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados entre T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 no se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la primera etapa de determinación, y
en el que la cebolla se discrimina como una cebolla con un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena si la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados de T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la primera etapa de determinación.
En una realización preferida de la presente invención, el método comprende además
una segunda etapa de determinación para determinar la presencia de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en el ácido nucleico derivado de la cebolla, en el que
la segunda etapa de determinación comprende determinar la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados de adenina (A) en la posición 34, citosina (C) en la posición 70, adenina (A) en la posición 1667, citosina (C) en la posición 1703, guanina (G) en la posición 127, timina (T) en la posición 409, adenina (A) en la posición 943 y citosina (C) en la posición 1822 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en el ácido nucleico derivado de la cebolla,
en el que la cebolla se discrimina para que sea una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena si la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados entre T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 no se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la primera etapa de determinación y la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados de A en la posición 34, C en la posición 70, A en la posición 1667, C en la posición 1703, G en la posición 127, T en la posición 409, A en la posición 943 y C en la posición 1822 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la segunda etapa de determinación, y
en el que la cebolla se discrimina para que sea una cebolla con un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena si la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados entre T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la primera etapa de determinación, y la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados de A en la posición 34, C en la posición 70, A en la posición 1667, C en la posición 1703, G en la posición 127, T en la posición 409, A en la posición 943 y C en la posición 1822 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la segunda etapa de determinación. Este método es el "primer método de discriminación" de la presente invención.
Los presentes inventores encontraron que, como secuencia de nucleótidos del gen que codifica la aliinasa, tanto la secuencia de nucleótidos del gen 1 como la secuencia de nucleótidos del gen 2 estaban presentes en el ADN genómico de una cebolla habitual, mientras que la secuencia de nucleótidos del gen 2 estaba presente pero la secuencia de nucleótidos del gen 1 no estaba presente en el ADN genómico de una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena. La aliinasa codificada por la secuencia de nucleótidos del gen 1 es una aliinasa específica que consiste en la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:5 divulgada en la Literatura de Patente 1. Aunque la Literatura de Patente 1 divulga que una cebolla con expresión suprimida de la aliinasa específica no tiene un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena, no se divulga la causa de que no se exprese (por ejemplo, región reguladora, factor de transcripción, destrucción del propio gen). Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que la secuencia de nucleótidos del gen 1 que codifica la aliinasa específica estaba presente en el ADN genómico de una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena, y que la secuencia de nucleótidos del gen 2 con una alta homología con la secuencia de nucleótidos del gen 1, que no está asociada con un sabor punzante, estaba presente en el ADN genómico estaba presente. Aquí, ejemplos representativos de la "cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena" incluyen, pero no se limitan a, una cebolla cuya semilla ha sido depositada en una Autoridad Internacional de Depósito con el número de acceso NCIMB 42219, sus progenies, y cebollas sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena obtenidas usando estas cebollas como uno de los materiales.
La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos de ADNc del gen de aliinasa 1, y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos de ADN genómico del gen de aliinasa 2.
La "presencia determinante de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1" y "la presencia determinante del primer sitio de mutación (en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1)" en la primera etapa de determinación significa "determinar la presencia de una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1" y "determinar la presencia de una secuencia de nucleótidos correspondiente al primer sitio de mutación (en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1)", respectivamente. De manera similar, "determinar la presencia de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2" y "determinar la presencia del segundo sitio de mutación (en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2)" en la segunda etapa de determinación significan "determinar la presencia de un secuencia correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2" y "determinar la presencia de una secuencia de nucleótidos correspondiente al segundo sitio de mutación (en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2)", respectivamente.
La "secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1" se refiere a la secuencia de nucleótidos del ADN genómico de un gen de aliinasa para el cual la secuencia de nucleótidos de ADNc es la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos complementaria de la misma si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ADN genómico; una secuencia de nucleótidos derivada de SEQ ID NO: 1 mediante sustitución de T por U si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ARNm; o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos complementaria de la misma si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ADNc.
La "secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2" se refiere a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o la secuencia de nucleótidos complementaria a la misma si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ADN genómico; una secuencia de nucleótidos derivada de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 mediante deleción de las regiones intrón y sustitución de T por U si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ARNm; o una secuencia de nucleótidos en la que las regiones intrón se eliminan de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o la secuencia de nucleótidos complementaria de la misma si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ADNc.
La "secuencia de nucleótidos correspondiente al primer sitio de mutación (en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1)" se refiere a la secuencia de nucleótidos de un sitio correspondiente al primer sitio de mutación en la secuencia de nucleótidos del ADN genómico de un gen de aliinasa para el cual la secuencia de nucleótidos del ADNc es la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos complementaria de la misma si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ADN genómico; la secuencia de nucleótidos de un sitio correspondiente al primer sitio de mutación en una secuencia de nucleótidos derivada de SEQ ID NO: 1 mediante sustitución de T por U si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ARNm; o el primer sitio de mutación en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos complementaria del mismo si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ADNc.
La "secuencia de nucleótidos correspondiente al segundo sitio de mutación (en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2)" se refiere al segundo sitio de mutación en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o la secuencia de nucleótidos complementaria del mismo si la el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ADN genómico; la secuencia de nucleótidos de un sitio correspondiente al segundo sitio de mutación en una secuencia de nucleótidos derivada de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 mediante la deleción de las regiones intrones y la sustitución de T por U si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ARNm; o la secuencia de nucleótidos de un sitio correspondiente al segundo sitio de mutación en la secuencia de nucleótidos derivada de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 mediante deleción de las regiones intrón, o la secuencia de nucleótidos complementaria de la misma si el ácido nucleico derivado de una cebolla es un ADNc.
Es preferible analizar un ADN genómico como un ácido nucleico derivado de una cebolla porque la cantidad no cambia dependiendo de la fase de crecimiento de la cebolla diana o del sitio de la misma. Adicionalmente, es preferible un ADN genómico porque se puede confirmar si un análisis se está realizando en condiciones apropiadas confirmando no únicamente la presencia o ausencia de la secuencia de nucleótidos del gen 1, sino también la presencia de la secuencia de nucleótidos del gen 2, que es presente independientemente de la presencia de un sabor punzante de una cebolla en el primer método de discriminación de la presente invención.
La "primera etapa de determinación" se explicará en detalle a continuación.
La primera etapa de determinación es una etapa para determinar la presencia de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en un ácido nucleico derivado de una cebolla. En la etapa, preferiblemente, una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una secuencia de nucleótidos parcial de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o de una secuencia de nucleótidos derivada de SEQ ID NO: 1 mediante sustitución de T por U o la secuencia de nucleótidos complementaria para la secuencia parcial de nucleótidos se detecta en el ácido nucleico derivado de la cebolla.
Cuando la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, que es la secuencia de nucleótidos de ADNc del gen 1, y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, que es la secuencia de nucleótidos de ADN genómico del gen 2, se alinearon para obtener la coincidencia máxima, se encontraron algunos nucleótidos que no coincidían en regiones con una alta homología, como se muestra en las figuras 1-1, 1-2, 1-3 y 1-4. Específicamente, las posiciones 94, 130, 1312, 1348, 187, 358, 791 y 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y las posiciones 34, 70, 1667, 1703, 127, 409, 943 y 1822 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 son nucleótidos que no coinciden comprendidos en las regiones con una alta homología.
Según la presente invención, en la primera etapa de determinación, se puede determinar la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados entre timina (T) en la posición 94, timina (T) en la posición 130, guanina (G) en la posición 1312, timina (T) en la posición 1348, adenina (A) en la posición 187, adenina (A) en la posición 358, citosina (C) en la posición 791 y timina (T) en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en el ácido nucleico derivado de la cebolla. Esto permite detectar específicamente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 comprendida en un ácido nucleico derivado de una cebolla, sin detectar por error la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
Como medio específico para determinar la presencia del primer sitio de mutación en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en el ácido nucleico derivado de la cebolla, es preferible realizar una primera reacción de amplificación del ácido nucleico usando el siguiente primer conjunto de cebadores y un ácido nucleico derivado de una cebolla, en particular, un ADN genómico o un ADNc como molde y para confirmar un producto de amplificación de la primera reacción de amplificación del ácido nucleico.
Según la presente divulgación, un primer conjunto de cebadores comprende preferiblemente al menos ya sea uno de
un primer cebador que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica u homóloga a una secuencia de nucleótidos parcial que comprende el primer sitio de mutación en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, y
un segundo cebador que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica u homóloga a la secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos parcial que comprende el primer sitio de mutación en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, y en particular preferiblemente tanto el primer como el segundo cebadores .
Los ejemplos de una realización preferida del primer cebador según la presente invención incluyen un primer cebador que comprende un primer polinucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la primera secuencia de nucleótidos es idéntica a una primera secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, comprendiendo la primera secuencia de nucleótidos parcial uno o más primeros nucleótidos seleccionados de T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3'.
Los ejemplos de una realización preferida del segundo cebador según la presente invención incluyen un segundo cebador que comprende un segundo polinucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la segunda secuencia de nucleótidos es idéntica a una segunda secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendidos en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, comprendiendo la segunda secuencia de nucleótidos parcial uno o más nucleótidos complementarios a uno o más segundos nucleótidos seleccionados de T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3'.
La realización preferida del primer cebador según la presente invención se explicará a continuación.
La primera secuencia de nucleótidos parcial descrita en asociación con el primer cebador es una secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 20 o más nucleótidos consecutivos, y más preferiblemente 23 o más nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Es de destacar que para evitar la formación de un híbrido no específico entre el cebador y una región distinta de la región final del ácido nucleico diana que se va a amplificar, es bien conocido que diseñar un cebador con el número de nucleótidos del cebador dentro de los intervalos descritos anteriormente, en particular 17 o más nucleótidos, es deseable (por ejemplo, consulte http://www.takara-bio.co.jp/prt/pdfs/prt3-1.pdf). El límite superior del número de nucleótidos en la primera secuencia parcial de nucleótidos no está particularmente limitado y es preferiblemente 50 o menos nucleótidos, más preferiblemente 40 o menos nucleótidos, más preferiblemente 35 o menos nucleótidos y más preferiblemente 30 o menos nucleótidos. Cuando la primera secuencia parcial de nucleótidos comprende el primer nucleótido como un nucleótido dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3', preferiblemente como un nucleótido en el extremo 3', una región en el lado del extremo 3' de un nucleótido correspondiente al primer nucleótido en la secuencia de nucleótidos en la cadena sentido del gen 1 en el ácido nucleico molde se alarga específicamente desde el extremo 3' del primer cebador en la primera reacción de amplificación del ácido nucleico.
El primer polinucleótido comprende la primera secuencia de nucleótidos que es idéntica a la primera secuencia de nucleótidos parcial en el extremo 3'. Según la presente divulgación, la primera secuencia parcial de nucleótidos y la primera secuencia de nucleótidos pueden ser idénticas entre sí preferiblemente en una región de 3 nucleótidos en el extremo 3', más preferiblemente en una región de 5 nucleótidos en el extremo 3', más preferiblemente en una región de 5 nucleótidos en el extremo 3', más preferiblemente una región de 8 nucleótidos en el extremo 3', y más preferiblemente en una región de 10 nucleótidos en el extremo 3' (además preferiblemente en una región de 15 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la primera secuencia de nucleótidos parcial es 15 o más nucleótidos, más preferentemente en una región de 17 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la primera secuencia de nucleótidos parcial es de 17 o más nucleótidos, y más preferentemente en una región de 20 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la primera secuencia parcial de nucleótidos es de 20 o más nucleótidos) y son homólogos entre sí en la región restante en el lado del extremo 5'. Los ejemplos específicos de la primera secuencia de nucleótidos incluyen la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 5, 6, 7 u 8 y una secuencia de nucleótidos parcial que comprende preferiblemente 15 o más nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 17 o más nucleótidos consecutivos, y más preferiblemente 20 o más nucleótidos consecutivos del extremo 3' de la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 5, 6, 7 u 8. La expresión de que el primer polinucleótido "comprende la primera secuencia de nucleótidos en el extremo 3'" abarca tanto un caso donde toda la secuencia de nucleótidos del primer polinucleótido consiste únicamente en la primera secuencia de nucleótidos como un caso donde el primer polinucleótido comprende la primera secuencia de nucleótidos y una secuencia de nucleótidos adicional unida a la primera secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la misma. Es suficiente que la secuencia de nucleótidos adicional no inhiba sustancialmente la primera reacción de amplificación del ácido nucleico, y el número de nucleótidos de la misma sea, por ejemplo, 20 o menos nucleótidos, preferiblemente 10 o menos nucleótidos, más preferiblemente 5 o menos nucleótidos, y más preferiblemente 1 o 2 nucleótidos.
En la memoria descriptiva, los primeros cebadores que comprenden el primer polinucleótido que consiste en las secuencias de nucleótidos de s Eq ID NOS: 5, 6, 7 y 8 se denominan SF1, SF2, SF3 y SF4, respectivamente, y sus posiciones en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 se muestran en las figuras 7-1 y 7-2.
El primer cebador puede consistir en el primer polinucleótido o puede comprender el primer polinucleótido y estructuras químicas útiles tales como una etiqueta marcadora, una sustancia marcadora y una etiqueta de inmovilización agregadas al primer polinucleótido. Tales estructuras químicas útiles pueden detectarse.
Si el primer conjunto de cebadores comprende el primer cebador, el otro cebador es preferiblemente un cebador que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos en el extremo 3' que es idéntica u homóloga a una secuencia de nucleótidos parcial de 10 a 50 nucleótidos consecutivos, preferiblemente De 15 a 30 nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, que es complementaria a una región ubicada más cerca del extremo 3' que el primer nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, y más preferiblemente el segundo cebador.
La realización preferida del segundo cebador según la presente invención se explicará a continuación.
La segunda secuencia de nucleótidos parcial descrita en asociación con el segundo cebador es una secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 20 o más nucleótidos consecutivos, y más preferiblemente 23 o más nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos complementaria para la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. El límite superior del número de nucleótidos en la segunda secuencia de nucleótidos parcial no está particularmente limitado, y es preferiblemente 50 o menos nucleótidos, más preferiblemente 40 o menos nucleótidos, más preferiblemente 35 o menos nucleótidos. y más preferiblemente 30 o menos nucleótidos. Cuando la segunda secuencia parcial de nucleótidos comprende el nucleótido complementario del segundo nucleótido como un nucleótido dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3', preferiblemente como un nucleótido en el extremo 3', una región en el lado del extremo 3' de un nucleótido correspondiente al El nucleótido complementario del segundo nucleótido en la secuencia de nucleótidos en la cadena antisentido del gen 1 en el ácido nucleico molde se alarga específicamente desde el extremo 3' del segundo cebador en la primera reacción de amplificación del ácido nucleico.
El segundo polinucleótido comprende la segunda secuencia de nucleótidos que es idéntica a la segunda secuencia de nucleótidos parcial en el extremo 3'. Según la presente divulgación, la segunda secuencia parcial de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos pueden ser idénticas entre sí, preferiblemente en una región de 3 nucleótidos en el extremo 3', más preferiblemente en una región de 5 nucleótidos en el extremo 3'. más preferiblemente en una región de 8 nucleótidos en el extremo 3', y más preferiblemente en una región de 10 nucleótidos en el extremo 3' (más preferiblemente en una región de 15 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la segunda secuencia de nucleótidos parcial tiene 15 o más nucleótidos, más preferiblemente en una región de 17 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la segunda secuencia parcial de nucleótidos es de 17 o más nucleótidos, y más preferiblemente en una región de 20 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la segunda secuencia parcial de nucleótidos es de 20 o más nucleótidos) y son homólogos entre sí en la región restante en el lado del extremo 5'. Los ejemplos específicos de la segunda secuencia de nucleótidos incluyen la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 9, 10, 11 o 12 y una secuencia de nucleótidos parcial que comprende preferiblemente 15 o más nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 17 o más nucleótidos consecutivos, y más preferiblemente 20 o más nucleótidos consecutivos del extremo 3' de la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 9, 10, 11 o 12. La expresión de que el segundo polinucleótido "comprende la segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 3'" abarca tanto un caso en el que toda la secuencia de nucleótidos del segundo polinucleótido consiste únicamente en la segunda secuencia de nucleótidos como un caso en el que el segundo polinucleótido comprende la segunda secuencia de nucleótidos y una secuencia de nucleótidos adicional unida a la segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la misma. Es suficiente que la secuencia de nucleótidos adicional no inhiba sustancialmente la primera reacción de amplificación del ácido nucleico, y el número de nucleótidos de la misma sea, por ejemplo, 20 o menos nucleótidos, preferiblemente 10 o menos nucleótidos, más preferiblemente 5 o menos nucleótidos, y más preferiblemente 1 o 2 nucleótidos.
En la memoria descriptiva, los segundos cebadores que comprenden los segundos polinucleótidos que consisten en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOS: 9, 10, 11 y 12 se denominan SR1, s R2, SR3 y SR4, respectivamente, y sus posiciones en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 se muestran en las figuras 7-1 y 7-2.
El segundo cebador puede consistir en el segundo polinucleótido o puede comprender el segundo polinucleótido y estructuras químicas útiles tales como una etiqueta marcadora, una sustancia marcadora y una etiqueta de inmovilización agregadas al segundo polinucleótido. Tales estructuras químicas útiles pueden detectarse.
Si el primer conjunto de cebadores comprende el segundo cebador, el otro cebador es preferiblemente un cebador que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos en el extremo 3' que es idéntica u homóloga a una secuencia de nucleótidos parcial de 10 a 50 nucleótidos consecutivos, preferiblemente de 15 a 30 nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, que es una región ubicada más cerca del extremo 5' que el segundo nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, y más preferiblemente el primer cebador.
Si el primer conjunto de cebadores es una combinación del primer cebador y el segundo cebador, es suficiente que el primer cebador y el segundo cebador se seleccionen de modo que el primer nucleótido y el segundo nucleótido sean idénticos entre sí, o el primer nucleótido está situado más cerca del extremo 5' que el segundo nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En una realización preferida en la que el primer conjunto de cebadores es una combinación del primer cebador y el segundo cebador, el primer nucleótido del primer cebador está en la posición 94, 130, 1312 o 1348 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, y el segundo nucleótido para el segundo cebador está en la posición 187, 358, 791 o 1467 en SEQ ID NO: 1, siempre que el primer nucleótido sea idéntico al segundo nucleótido o esté ubicado más cerca del extremo 5' que el segundo nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
La "segunda etapa de determinación" se explicará en detalle a continuación.
La segunda etapa de determinación es una etapa para determinar la presencia de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en un ácido nucleico derivado de una cebolla. En la etapa, preferiblemente, se detecta una secuencia de nucleótidos que comprende al menos una secuencia de nucleótidos parcial de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o de una secuencia de nucleótidos derivada de la sustitución de SEQ ID NO: 2 de T por U o la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia parcial de nucleótidos en el ácido nucleico derivado de la cebolla.
En la segunda etapa de determinación, es preferible determinar la presencia de un segundo sitio de mutación que comprende uno o más nucleótidos seleccionados de nucleótidos en las posiciones 34, 70, 1667, 1703, 127, 409, 943 y 1822 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. Esto permite detectar específicamente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 comprendida en un ácido nucleico derivado de una cebolla, sin detectar por error la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
Como medio específico para determinar la presencia del segundo sitio de mutación en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en el ácido nucleico derivado de la cebolla, es preferible realizar una segunda reacción de amplificación del ácido nucleico usando el siguiente segundo conjunto de cebadores y un ácido nucleico derivado de una cebolla, en particular, un ADN genómico como molde y para confirmar un producto de amplificación de la segunda reacción de amplificación del ácido nucleico.
Según la presente divulgación, un segundo conjunto de cebadores comprende preferiblemente al menos uno de
un tercer cebador que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica u homóloga a una secuencia de nucleótidos parcial que comprende el segundo sitio de mutación en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y
un cuarto cebador que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica u homóloga a la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos parcial que comprende el segundo sitio de mutación en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y en particular preferiblemente tanto el tercer como el cuarto cebadores.
Los ejemplos de una realización preferida del tercer cebador según la presente divulgación incluyen un tercer cebador que comprende un tercer polinucleótido que comprende una tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 3' que es idéntica a una tercera secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 que comprende un tercer nucleótido seleccionado de A en la posición 34, C en la posición 70, A en la posición 1667, C en la posición 1703, G en la posición 127, T en la posición 409, A en la posición 943, y C en la posición 1822 en la secuencia de nucleótidos de s Eq ID NO: 2 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3'.
Los ejemplos de una realización preferida del cuarto cebador según la presente divulgación incluyen un cuarto cebador que comprende un cuarto polinucleótido que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos en el extremo 3' que es idéntica a una cuarta secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 que comprende un nucleótido complementario a un cuarto nucleótido seleccionado entre A en la posición 34, C en la posición 70, A en la posición 1667, C en la posición 1703, G en la posición 127, T en la posición 409, A en la posición 943 y C en la posición 1822 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3'.
La realización preferida del tercer cebador según la presente divulgación se explicará a continuación.
La tercera secuencia de nucleótidos parcial descrita en asociación con el tercer cebador es una secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 20 o más nucleótidos consecutivos, y más preferiblemente 23 o más nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. El límite superior del número de nucleótidos en la tercera secuencia parcial de nucleótidos no está particularmente limitado y es preferiblemente 50 o menos nucleótidos, más preferiblemente 40 o menos nucleótidos, más preferiblemente 35 o menos nucleótidos y más preferiblemente 30 o menos nucleótidos. Cuando la tercera secuencia parcial de nucleótidos comprende el tercer nucleótido como un nucleótido dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3', preferiblemente como un nucleótido en el extremo 3', una región en el lado del extremo 3' de un nucleótido correspondiente al tercer nucleótido en la secuencia de nucleótidos en la cadena sentido del gen 2 en el ácido nucleico molde se alarga específicamente desde el extremo 3' del tercer cebador en la segunda reacción de amplificación del ácido nucleico.
El tercer polinucleótido comprende la tercera secuencia de nucleótidos que es idéntica a la tercera secuencia de nucleótidos parcial en el extremo 3'. Según la presente divulgación, la tercera secuencia parcial de nucleótidos y la tercera secuencia de nucleótidos pueden ser idénticas entre sí, preferiblemente en una región de 3 nucleótidos en el extremo 3', más preferiblemente en una región de 5 nucleótidos en el extremo 3', más preferiblemente en una región de 8 nucleótidos en el extremo 3', y más preferiblemente en una región de 10 nucleótidos en el extremo 3' (más preferiblemente en una región de 15 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la tercera secuencia de nucleótidos parcial es de 15 o más nucleótidos, más preferiblemente en una región de 17 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la tercera secuencia parcial de nucleótidos es de 17 o más nucleótidos, y más preferiblemente en una región de 20 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la tercera secuencia parcial de nucleótidos es de 20 o más nucleótidos) y son homólogos entre sí en la región restante en el lado del extremo 5'. Los ejemplos específicos de la tercera secuencia de nucleótidos incluyen la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 13, 14, 15 o 16 y una secuencia de nucleótidos parcial que comprende preferiblemente 15 o más nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 17 o más nucleótidos consecutivos, y más preferiblemente 20 o más nucleótidos consecutivos del extremo 3' de la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 13, 14, 15 o 16. La expresión de que el tercer polinucleótido "comprende la tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 3'" abarca tanto un caso donde toda la secuencia de nucleótidos del tercer polinucleótido consiste únicamente en la tercera secuencia de nucleótidos como un caso donde el tercer polinucleótido comprende la tercera secuencia de nucleótidos y una secuencia de nucleótidos adicional unida a la tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la misma. Es suficiente que la secuencia de nucleótidos adicional no inhiba sustancialmente la segunda reacción de amplificación del ácido nucleico, y el número de nucleótidos de la misma sea, por ejemplo, 20 o menos nucleótidos, preferiblemente 10 o menos nucleótidos, más preferiblemente 5 o menos nucleótidos, y más preferiblemente 1 o 2 nucleótidos.
En la memoria descriptiva, los terceros cebadores que comprenden el tercer polinucleótido que consiste en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOS: 13, 14, 15 y 16 se denominan UF1, UF2, UF3 y UF4, respectivamente, y sus posiciones en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 se muestran en las figuras 8-1 y 8-2.
El tercer cebador puede consistir en el tercer polinucleótido o puede comprender el tercer polinucleótido y estructuras químicas útiles tales como una etiqueta marcadora, una sustancia marcadora y una etiqueta de inmovilización agregadas al tercer polinucleótido. Tales estructuras químicas útiles pueden detectarse.
Si el segundo conjunto de cebadores comprende el tercer cebador, el otro cebador es preferiblemente un cebador que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos en el extremo 3' que es idéntica u homóloga a una secuencia de nucleótidos parcial de 10 a 50 nucleótidos consecutivos, preferiblemente de 15 a 30 nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 que es complementaria a una región posicionada más cerca del extremo 3' que el tercer nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y más preferentemente el cuarto cebador.
La realización preferida del cuarto cebador según la presente divulgación se explicará a continuación.
La cuarta secuencia de nucleótidos parcial descrita en asociación con el cuarto cebador es una secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 20 o más nucleótidos consecutivos, y más preferiblemente 23 o más nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos complementaria para la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. El límite superior del número de nucleótidos en la cuarta secuencia de nucleótidos parcial no está particularmente limitado y es preferiblemente 50 o menos nucleótidos, más preferiblemente 40 o menos nucleótidos, más preferiblemente 35 o menos nucleótidos y más preferiblemente 30 o menos nucleótidos. Cuando la cuarta secuencia de nucleótidos parcial comprende el nucleótido complementario del cuarto nucleótido como un nucleótido dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3', preferiblemente como un nucleótido en el extremo 3', y una región en el lado del extremo 3' de un nucleótido correspondiente al nucleótido complementario del cuarto nucleótido en la secuencia de nucleótidos en la cadena antisentido del gen 2 en el ácido nucleico molde está específicamente alargada desde el extremo 3' del cuarto cebador en la segunda reacción de amplificación del ácido nucleico.
El cuarto polinucleótido comprende la cuarta secuencia de nucleótidos que es idéntica a la cuarta secuencia de nucleótidos parcial en el extremo 3'. Según la presente divulgación, la cuarta secuencia de nucleótidos parcial y la cuarta secuencia de nucleótidos pueden ser idénticas entre sí, preferiblemente en una región de 3 nucleótidos en el extremo 3', más preferiblemente en una región de 5 nucleótidos en el extremo 3', más preferiblemente en una región de 8 nucleótidos en el extremo 3', y más preferiblemente en una región de 10 nucleótidos en el extremo 3' (más preferiblemente en una región de 15 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud del cuarto secuencia de nucleótidos parcial es de 15 o más nucleótidos, más preferiblemente en una región de 17 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la cuarta secuencia de nucleótidos parcial es de 17 o más nucleótidos, y más preferiblemente en una región de 20 nucleótidos en el extremo 3' si la longitud de la cuarta secuencia de nucleótidos parcial es de 20 o más nucleótidos) y son homólogos entre sí en la región restante en el lado del extremo 5'. Los ejemplos específicos de la cuarta secuencia de nucleótidos incluyen la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 17, 18, 19 o 20 y una secuencia de nucleótidos parcial que comprende preferiblemente 15 o más nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 17 o más nucleótidos consecutivos, y más preferiblemente 20 o más nucleótidos consecutivos del extremo 3' de la secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 17, 18, 19 o 20. La expresión de que el cuarto polinucleótido "comprende la cuarta secuencia de nucleótidos en el extremo 3'" abarca tanto un caso en el que toda la secuencia de nucleótidos del cuarto polinucleótido consiste únicamente en la cuarta secuencia de nucleótidos como un caso en el que el cuarto polinucleótido comprende la cuarta secuencia de nucleótidos y una secuencia de nucleótidos adicional unida a la cuarta secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la misma. Es suficiente que la secuencia de nucleótidos adicional no inhiba sustancialmente la segunda reacción de amplificación del ácido nucleico, y el número de nucleótidos de la misma sea, por ejemplo, 20 o menos nucleótidos, preferiblemente 10 o menos nucleótidos, más preferiblemente 5 o menos nucleótidos, y más preferiblemente 1 o 2 nucleótidos.
En la memoria descriptiva, los cuartos cebadores que comprenden el cuarto polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOS: 17, 18, 19 y 20 se denominan UR1, UR2, UR3 y UR4, respectivamente, y sus posiciones en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 se muestran en las figuras 8-1 y 8-2.
El cuarto cebador puede consistir en el cuarto polinucleótido o puede comprender el cuarto polinucleótido y estructuras químicas útiles tales como una etiqueta marcadora, una sustancia marcadora y una etiqueta de inmovilización agregadas al cuarto polinucleótido. Tales estructuras químicas útiles pueden detectarse.
Si el segundo conjunto de cebadores comprende el cuarto cebador, el otro cebador es preferiblemente un cebador que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos en el extremo 3' que es idéntica u homóloga a una secuencia de nucleótidos parcial de 10 a 50 nucleótidos consecutivos, preferiblemente de 15 a 30 nucleótidos consecutivos comprendidos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, que es una región ubicada más cerca del extremo 5' que el cuarto nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y más preferiblemente el tercer cebador.
Si el segundo conjunto de cebadores es una combinación del tercer cebador y el cuarto cebador, es suficiente que el tercer cebador y el cuarto cebador se seleccionen de modo que el tercer nucleótido y el cuarto nucleótido sean idénticos entre sí, o el tercer nucleótido esté situado más cerca del extremo 5' que el cuarto nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. En una realización preferida en la que el segundo conjunto de cebadores es una combinación del tercer cebador y el cuarto cebador, el tercer nucleótido para el tercer cebador está en la posición 34, 70, 1667 o 1703 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y el cuarto nucleótido para el cuarto cebador está en la posición 127, 409, 943 o 1822 en SEQ ID NO: 2, siempre que el tercer nucleótido sea idéntico al cuarto nucleótido o esté ubicado más cerca del extremo 5' que el cuarto nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
En la presente invención, tanto la primera reacción de amplificación del ácido nucleico como la segunda reacción de amplificación del ácido nucleico (en lo sucesivo denominadas colectivamente "reacción de amplificación del ácido nucleico") se pueden realizar según un método habitual de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Un ácido nucleico, tal como un ADN genómico o un ADNc, usado como molde, se puede preparar a partir de una cebolla según un método habitual.
Es suficiente que una ADN polimerasa usada para la PCR sea una ADN polimerasa termoestable, y las ADN polimerasas no están particularmente limitadas. En la presente invención, se pueden usar ADN polimerasas disponibles comercialmente. Adicionalmente, la concentración del cebador, el número de ciclos, la temperatura, el tiempo, las composiciones de las soluciones reguladoras y otras condiciones se pueden seleccionar apropiadamente dependiendo de la ADN polimerasa usada, la concentración de cada cebador y otras condiciones.
En la reacción de amplificación del ácido nucleico, un fragmento de polinucleótido que comprende una región diana predeterminada se produce como un producto de amplificación cuando el ácido nucleico derivado de la cebolla diana contiene una secuencia de nucleótidos que se va a detectar.
El método para confirmar el producto de amplificación de la reacción de amplificación del ácido nucleico no está particularmente limitado, y los ejemplos del mismo incluyen un método en el que, después de completar la reacción de amplificación del ácido nucleico, se fracciona la mezcla de reacción de la reacción de amplificación del ácido nucleico mediante electroforesis en gel, y la presencia de una banda del tamaño correspondiente al fragmento de polinucleótido que comprende la región diana predeterminada se confirma y un método en el que se marca y detecta el producto de amplificación. Adicionalmente, el producto de amplificación también se puede detectar mediante un método de PCR en tiempo real mientras se realiza la reacción de amplificación del ácido nucleico.
<3. Segundo método de discriminación de la presente divulgación>
En segundo lugar, el método de discriminación de rasgos de una cebolla de la presente divulgación es un método que comprende
una primera etapa de determinación para determinar la presencia de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en un ácido nucleico derivado de la cebolla,
la primera etapa de determinación que comprende determinar la presencia de un primer sitio de mutación que comprende uno o más nucleótidos seleccionados de nucleótidos en las posiciones 94, 130, 1312, 1348, 187, 358, 791 y 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en el ácido nucleico, en el que
la cebolla se discrimina para que sea una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena si la presencia de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 no se determina en la primera etapa de determinación; y
la cebolla se discrimina para que sea una cebolla con un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena si la presencia de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 se determina en la primera etapa de determinación. Este método es el "segundo método de discriminación" de la presente divulgación.
La primera etapa de determinación en el segundo método de discriminación es la misma que la primera etapa de determinación en el primer método de discriminación. Las realizaciones específicas de la primera etapa de determinación en el segundo método de discriminación son las mismas que las realizaciones específicas de la primera etapa de determinación en el primer método de discriminación.
La primera etapa de determinación en el segundo método de discriminación comprende preferiblemente realizar una primera reacción de amplificación del ácido nucleico usando un primer conjunto de cebadores que comprende al menos uno de un primer cebador y un segundo cebador y un ácido nucleico de una cebolla como molde y confirmar un producto de amplificación de la primera reacción de amplificación del ácido nucleico. El primer cebador, el segundo cebador, el primer conjunto de cebadores, la primera reacción de amplificación del ácido nucleico y el método para detectar el producto de amplificación en esta realización del segundo método de discriminación son como se explican para el primer método de discriminación.
<4. Combinación con métodos de discriminación adicionales>
El primer método de discriminación de la presente invención o el segundo método de discriminación de la presente divulgación se pueden usar en combinación con métodos adicionales para discriminar una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena. Usando una pluralidad de métodos de discriminación diferentes en combinación, se puede discriminar con precisión una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena.
Ejemplos de métodos adicionales para discriminar una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena incluyen discriminar si la cebolla es una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena basándose en uno o más de los siguientes rasgos como indicador(es):
a) la producción de ácido pirúvico en la disrupción de las células de la cebolla se reduce en comparación con las variedades convencionales;
b) la cantidad de PRENCSO que queda después de la disrupción de las células de cebolla es mayor en comparación con las variedades convencionales; y
c) la producción de factor lacrimógeno (LF) en la disrupción de las células de la cebolla se reduce en comparación con las variedades convencionales.
Una cebolla que tiene una o más de los rasgos anteriores se puede discriminar como una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena.
<5. Método de cultivo>
La presente divulgación también proporciona
un método de cultivo de una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena, que comprende
discriminar si una cebolla es una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena mediante el primer o segundo método de discriminación, y
usar la cebolla discriminada como una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena para cultivar cebollas.
En un entorno de cultivo de una nueva variedad usando una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena como uno de los materiales, una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena se puede seleccionar con precisión entre las cebollas producidas por cruzamiento, usando el primer método de discriminación de la presente invención o el segundo método de discriminación de la presente divulgación. La cebolla seleccionada, sin sabor punzante y/o con propiedad lacrimógena, se puede usar para su posterior cultivo.
<6. Cebadores, conjuntos de cebadores, kit>
T anto el primer cebador como el segundo cebador son útiles como cebador para amplificar específicamente una parte que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en un ácido nucleico derivado de una cebolla.
El primer conjunto de cebadores que comprende el primer cebador y el segundo cebador en el que el primer nucleótido y el segundo nucleótido son idénticos entre sí, o el primer nucleótido está colocado más cerca del extremo 5' que el segundo nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 es útil como un conjunto de cebadores para amplificar específicamente una parte que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en el ácido nucleico derivado de la cebolla.
Tanto el tercer cebador como el cuarto cebador son útiles como cebador para amplificar específicamente una parte que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en un ácido nucleico derivado de una cebolla.
El segundo conjunto de cebadores que comprende el tercer cebador y el cuarto cebador en el que el tercer nucleótido y el cuarto nucleótido son idénticos entre sí, o el tercer nucleótido está colocado más cerca del extremo 5' que el cuarto nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 es útil como un conjunto de cebadores para amplificar específicamente una parte que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en un ácido nucleico derivado de una cebolla.
Un kit que comprende uno o más de estos cebadores o conjuntos de cebadores es útil como kit para discriminar rasgos de una cebolla. El kit puede comprender además diversos componentes (por ejemplo, ADN polimerasa, diversas soluciones reguladoras, dNTP) usados para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico y confirmar un producto de amplificación.
<7. Gen marcador>
El gen 1 de la aliinasa, para el cual la secuencia de nucleótidos del ADNc comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, no está presente en una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena y está presente en una cebolla habitual con un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena. Por lo tanto, el gen 1 de la aliinasa es útil como gen marcador para detectar un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena de una cebolla. Si se detecta el gen 1 de la aliinasa en un ácido nucleico derivado de una cebolla, se puede discriminar que la cebolla es una cebolla con un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena. Si no se detecta el gen 1 de la aliinasa en un ácido nucleico derivado de una cebolla, se discrimina que la cebolla es una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena. <8. Divulgación adicional>
La divulgación incluye además los siguientes aspectos A a C que no forman parte de la presente invención:
A. Un cuerpo vegetal de una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena discriminada como una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena mediante el primer o segundo método de discriminación de la presente invención, una progenie de la misma, o una parte de la misma.
B. Un método de fabricación de un cuerpo vegetal de una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena, una progenie de la misma, o una parte de la misma, que comprende las siguientes etapas:
(i) una etapa de inducción de una mutación en una semilla de cebolla;
(ii) una etapa de cultivo de la semilla de cebolla con la mutación inducida para obtener un cuerpo vegetal de la cebolla o una parte de la misma, y
(iii) una etapa de discriminación y selección del cuerpo vegetal de una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena o una parte del mismo mediante el primer o segundo método de discriminación de la presente invención a partir de cuerpos vegetales o partes del mismo de las cebollas obtenidas.
C. Un método de fabricación de un cuerpo vegetal de una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena, una progenie de la misma, o una parte de la misma, que comprende cruzar una primera cebolla discriminada como una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena mediante el primer o segundo método de discriminación de la presente invención y una segunda cebolla.
Se puede hacer referencia a la descripción en la Literatura de Patente 1 para aspectos específicos de las invenciones A a C.
Ejemplos
Ejemplo 1: Adquirir la secuencia genética de la aliinasa asociada con un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena de una cebolla.
Tres bulbos de una cebolla #6 no lacrimógena y no punzante divulgada en la Literatura de Patente 1 (la semilla de la cebolla #6 se ha depositado en una Autoridad de Depósito Internacional con el número de acceso NCIMB 42219. En lo sucesivo, la cebolla se denomina "cebolla #6") y tres bulbos de una cebolla que tiene un sabor punzante obtenidos repitiendo el mismo número de veces de autorreproducción de la misma variedad que la cebolla # 6 (en lo sucesivo denominada "variedad de control") los bulbos de control que se congelaron rápidamente con nitrógeno líquido y luego criopreservado a -80 °C. Se peló la piel de cada bulbo de cebolla congelado, se midieron y extrajeron 100 mg de tejido de cebolla y se recogió un ARN total usando el Kit RNeasy Plant Mini (fabricado por Qiagen) según el manual adjunto. Además, el ARN total recolectado se sometió a tratamiento con DNasa usando el Kit RNeasy Mini (fabricado por Qiagen) y el Juego de DNasa libre de RNasa (fabricado por Qiagen). El ARN total tratado se sometió a medición de concentración y confirmación de calidad usando Nanodrop (fabricado por Nanodrop Technologies) y el bioanalizador Agilent 2100 (fabricado por Agilent Technologies). En la confirmación de calidad, se confirmó que las muestras tenían proporciones de absorbancia A260/A280 de 1.8 o superiores y números de integridad de ARN de 8.0 o superiores, y se preparó una biblioteca de secuencias usando el kit de preparación de muestras de ARN TruSeq (fabricado por Illumina) según el manual adjunto. La biblioteca de secuencias preparada se sometió a análisis de secuencia usando un secuenciador HiSeq de próxima generación (fabricado por Illumina) en las siguientes condiciones:
(Condiciones de secuencia)
Método analítico, secuenciación de extremos emparejados; número de especímenes, 6; número de carriles, 3; leer la longitud de los nucleótidos, 100 nucleótidos/lectura
(Procesamiento de datos)
Los datos obtenidos fueron sometidos al siguiente procesamiento de información:
- Los datos con baja pureza de fluorescencia se eliminaron usando una fórmula llamada Castidad. "Castidad" está representada por una fórmula de "I1/(I1 I2)", donde el valor más grande de señales de 4 nucleótidos diferentes es I1 y el segundo valor más grande es I2. En este ejemplo, los datos se seleccionaron bajo una condición de "11/(11 I2) > 0.6".
- Los datos seleccionados se ordenaron por espécimen según la información del índice único del espécimen.
- Se eliminaron las lecturas que comprendían una secuencia adaptadora y se extrajeron adicionalmente los pares de lecturas en los que el valor de calidad era 20 o superior para el 90 % o más de los nucleótidos comprendidos. Se realizó un ensamblaje de novo para los datos de todos los especímenes usando Trinity (URL: http://trinityrnaseq .sourceforge.net/index.html versión 2013-02-25).
- Los datos del ensamblaje (secuencia de transcripción estimada) se anotaron mediante búsqueda BLAST. Se usó BLASTX como programa de anotación, y las secuencias de aminoácidos en RefSeq-Fungi, RefSeq-Microbial, RefSeq-Plant de NCBI y las secuencias de aminoácidos y las secuencias de genes (convertidas en secuencias de aminoácidos) registradas en Allieae en la clasificación NCBI se integraron y usaron como base de datos. El parámetro BLASTX usado fue evalue 1E-5/num_alignments 100/outfmt "6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore qlen slen stitle qcovs qcovhsp"/, y se usaron las condiciones predeterminadas para otros.
Como resultado, se adquirió una secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica la aliinasa que comprende la "secuencia de aminoácidos 5" divulgada en la Literatura de Patente 1. La secuencia de nucleótidos del ADNc de la "secuencia de aminoácidos 5" que codifica la aliinasa se muestra como SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias.
Ejemplo 2: Adquisición de secuencias de otras aliinasas con una alta homología con la aliinasa codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1
Se prepararon un cebador directo correspondiente a la parte final de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 que codifica la aliinasa que comprende el codón de inicio y un cebador inverso correspondiente a la parte final de la secuencia de nucleótidos que comprende el codón de parada, se recogieron 100 mg de cada una de las muestras tanto de la cebolla #6 como de la variedad de control usada en el ejemplo 1, el ADN genómico se preparó usando el mini kit DNeasy Plant (fabricado por Qiagen) según el manual adjunto y se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el ADN genómico preparado como molde. Los productos de amplificación se analizaron usando el sistema de electroforesis MultiNA (fabricado por Shimadzu Corporation). Las secuencias de nucleótidos de los cebadores se muestran a continuación y las posiciones de los cebadores se muestran en las figuras 1-1, 1-2, 1-3 y 1-4.
Cebador directo 1: 5'-ATGGAGTCTTACCACAAAGTTGGCAGT-3' (SEQ ID NO:3)
Cebador inverso 2: 5'-GTAGCCCATACATGATCACAAACATGAAC-3' (SEQ ID NO:4)
Los resultados del análisis de los productos de amplificación mediante electroforesis se muestran en la figura 2. Se confirmaron productos de amplificación del mismo tamaño tanto para la cebolla #6 como para la variedad de control (Figura 2). El resultado de la secuenciación directa de los productos de amplificación confirmó que el producto de amplificación del ADN genómico de la cebolla #6 como molde tenía la secuencia de nucleótidos del ADN genómico como se establece en SEQ ID NO: 2, exhibiendo una identidad de aproximadamente el 95 % con la secuencia de nucleótidos. de SEQ ID NO: 1 en las partes del exón (Tabla 1). Es de destacar que en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, el primer exón está en las posiciones 50 a 339, el segundo exón está en las posiciones 340 a 651, el tercer exón está en las posiciones 652 a 935, el cuarto exón está en las posiciones 936 a 1235, y el quinto exón está en las posiciones 1236 a 1621. En la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, la parte correspondiente al primer exón en SEQ ID NO: 1 está en las posiciones 1 a 279, la parte correspondiente al el segundo exón en SEQ ID NO: 1 está en las posiciones 391 a 702, la parte correspondiente al tercer exón en SEQ ID NO: 1 está en las posiciones 804 a 1087, la parte correspondiente al cuarto exón en SEQ ID NO: 1 son las posiciones 1188 a 1487, y la parte correspondiente al quinto exón en SEQ ID NO: 1 está en las posiciones 1591 a 1975. Sin embargo, el producto de amplificación del ADN genómico de la variedad de cebolla de control como molde comprendía una mezcla del producto de amplificación que comprende de fragmentos del ADN genómico del gen para el cual la secuencia de nucleótidos de ADNc es la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y el producto de amplificación que comprende fragmentos de ADN genómico que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y no se pudieron obtener resultados claros mediante secuenciación directa. Este resultado indicó que la variedad de cebolla de control tenía, como gen de aliinasa, tanto el gen de aliinasa para el cual la secuencia de nucleótidos de ADNc comprendía la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 (en lo sucesivo denominado "gen de aliinasa 1") como el gen de aliinasa. para el cual la secuencia de nucleótidos del ADN genómico comprendía la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 (en lo sucesivo denominado "gen de aliinasa 2") y que la cebolla #6 tenía el gen de aliinasa 2 pero no tenía el gen de aliinasa 1 como genes de aliinasa. Es de destacar que el gen 2 de la aliinasa parece ser un pseudogén, que no se expresa, porque el ARN correspondiente a este gen no se detectó en el análisis de secuencia de ARN del ejemplo 1.
T l 11
Figure imgf000016_0001
Ejemplo 3: Preparación de cebadores que puedan distinguir una cebolla no lacrimógena y no punzante y una cebolla normal.
Para preparar cebadores para detectar específicamente el gen de aliinasa 1 y el gen de aliinasa 2, se compararon las secuencias de nucleótidos de los genes de aliinasa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y No. de acceso GenBank AAA32639.1, y los cebadores que amplificaron específicamente únicamente uno del gen de aliinasa 1 y el gen de aliinasa 2, en el que uno o más nucleótidos en el extremo 3' de cada cebador son idénticos a únicamente una de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en las posiciones correspondientes. Como cebadores de control, se prepararon cebadores para una parte común a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos de cada cebador se muestra en la tabla 2 y las posiciones de los cebadores se muestran en las figuras 7-1, 7-2, 8-1 y 8-2.
T l 21
Figure imgf000016_0002
(continuación)
Figure imgf000017_0001
Se usó una mezcla de cebadores UF3 (SEQ ID NO: 15) que comprendían T o C en la posición de Y.
Se realizó PCR en los ADN genómicos de la cebolla #6 y la variedad de control preparada en el ejemplo 2 como moldes usando los cebadores preparados, y los productos de amplificación se analizaron usando el sistema de electroforesis MultiNA (fabricado por Shimadzu Corporation). Los resultados se muestran en las figuras 3-1 y 3-2. Las combinaciones del cebador directo y el cebador inverso usados se muestran en las figuras 3-1 y 3-2.
Cuando se usó el ADN genómico de la cebolla #6 como molde, se obtuvieron productos de amplificación correspondientes a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y cuando se usó el a Dn genómico de la variedad control como molde, ambas amplificaciones Se obtuvieron productos correspondientes a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y productos de amplificación correspondientes a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. A partir de estos resultados, se concluyó que se podía discriminar si una cebolla era una cebolla no lacrimógena o una variedad de control en función de si se podía detectar el gen de la aliinasa 1 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, y que se podían preparar cebadores que lograran la discriminación.
Adicionalmente, para confirmar la versatilidad de los cebadores descritos anteriormente, se investigó la eficacia de los cebadores descritos anteriormente usando los ADN genómicos de 14 variedades de cebolla disponibles comercialmente que se muestran en la tabla 2, la variedad de control descrita anteriormente y la cebolla #6 como moldes. Las condiciones para la PCR fueron las mismas que las condiciones descritas anteriormente.
Los resultados se muestran en la figura 4. Los números de carril en la figura 4 corresponden a los números de variedades de cebolla en la tabla 3. Los carriles 1 a 14 muestran los resultados del análisis para las variedades disponibles comercialmente, el carril 15 son los resultados del análisis de las variedades anteriores. variedad de control descrita, y el carril 16 son los resultados del análisis para la cebolla #6. Los resultados mostrados en la figura 4 confirmaron que las 14 variedades disponibles comercialmente y la variedad de control tenían el gen de aliinasa 1 y el gen de aliinasa 2, y que la cebolla #6 tenía el gen de aliinasa 2 pero no tenía el gen de aliinasa 1. Estos resultados respaldan que el método de determinación de la cebolla #6 usando los cebadores descritos anteriormente se puede aplicar ampliamente de forma independiente de la variedad.
[Tabla 31]
Figure imgf000017_0002
(continuación)
Figure imgf000018_0001
Ejemplo 4: Uso del método de discriminación
Los cebadores descritos anteriormente se pueden usar para seleccionar una cebolla no lacrimógena y no punzante a la que se incorporan rasgos útiles de progenies obtenidas cruzando la cebolla no lacrimógena y no punzante #6 y una segunda cebolla que tiene los rasgos útiles mediante un método de cruce común.
Se cruzó una cebolla de día largo que tenía un buen tamaño de bulbo con la cebolla # 6. Específicamente, la cebolla #6 y una cebolla de día largo con esterilidad masculina que tenía el rasgo de un buen tamaño de bulbo (HTA que no es una variedad disponible comercialmente) se cruzaron mediante un método convencional en Hokkaido para obtener las semillas F1. Se sembraron las semillas F1 y se cosecharon bulbos de cebollas F1 (bulbos F1) mediante el método de plantación convencional en Hokkaido. Los bulbos F1 cosechados se autorreprodujeron y se cultivaron para obtener semillas F2. Las semillas F2 obtenidas se cultivaron mediante el método convencional para obtener bulbos de las cebollas F2 (bulbos F2). La selección de cebolla se realizó tomando muestras de hojas de 4249 bulbos en el procedimiento de cultivo de bulbos F2, extracción de ADN genómico y realización de PCR usando los ADN genómicos como moldes y tres conjuntos de cebadores de SF2-SR1, SF1-SR1 y UF2-UR1 entre los cebadores descritos anteriormente. Luego, se seleccionaron bulbos F2 de los cuales se obtuvieron productos de amplificación correspondientes al gen 2 de la aliinasa, y no se obtuvieron productos de amplificación correspondientes al gen 1 de la aliinasa. Los bulbos F2 seleccionados según este criterio se consideran bulbos de cebolla no lacrimógena y no punzante. Como resultado, se seleccionaron 866 bulbos de cebolla de 4249 bulbos. La figura 5 muestra un ejemplo de los resultados de detección de los productos de amplificación de la PCR usando ADN genómico de hojas de una pluralidad de cebollas F2 como moldes y SF2-SR1 como conjunto de cebadores. La columna superior de la figura 5 muestra los nombres de las muestras de cebolla F2.
Para confirmar la identidad entre los resultados de la selección por PCR y los fenotipos, se realizó una evaluación sensorial y se midió la cantidad de ácido pirúvico, que es un indicador de una propiedad lacrimógena y un sabor punzante, para 94 bulbos F2 de las cebollas F2 para las cuales se obtuvo el producto de amplificación del gen 2 de la aliinasa en la detección descrita anteriormente, y no se obtuvo el producto de amplificación del gen 1 de la aliinasa (denominados "bulbos seleccionados") y para 30 bulbos F2 de las cebollas F2 para las que se obtuvieron ambos productos de amplificación (denominados "bulbos no seleccionados"). La cantidad de ácido pirúvico producida se midió usando el método divulgado en la Literatura de Patente 1. Los resultados de la medición de la cantidad de ácido pirúvico producido se muestran en la figura 6. Los resultados de la evaluación sensorial mostraron que se tenían una propiedad lacrimógena y un sabor punzante no se detectan en ninguna de los bulbos seleccionados. Adicionalmente, la cantidad de ácido pirúvico producida en los bulbos seleccionados fue de aproximadamente 1 mmol/g, que era comparable con la cantidad de ácido pirúvico producida en la cebolla no lacrimógena y no punzante divulgada en la Patente JP No. 5671657. Sin embargo, en los bulbos no seleccionados se detectaron una propiedad lacrimógena y un sabor punzante en la evaluación sensorial, y la cantidad de ácido pirúvico producida fue superior a 6 pmol/g.
Los resultados anteriores respaldan que el método de discriminación de la presente invención puede seleccionar con precisión los rasgos de no ser lacrimógenos y no tener un sabor punzante.
Aplicabilidad industrial
La presente invención se puede usar para discriminar una cebolla sin sabor punzante en campos tales como la agricultura y la fabricación de alimentos.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método de discriminación de rasgos de una cebolla, que comprende:
una primera etapa de determinación para determinar la presencia de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en un ácido nucleico derivado de la cebolla;
la primera etapa de determinación comprende determinar la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados de timina (T) en la posición 94, timina (T) en la posición 130, guanina (G) en la posición 1312, timina (T) en la posición 1348, adenina (A) en la posición 187, adenina (A) en la posición 358, citosina (C) en la posición 791 y timina (T) en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en el ácido nucleico derivado de la cebolla,
en el que la cebolla se discrimina para que sea una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena si la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados entre T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 no se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la primera etapa de determinación, y
en el que la cebolla se discrimina para que sea una cebolla con un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena si la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados entre T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la primera etapa de determinación.
2. El método según la reivindicación 1, en el que la primera etapa de determinación comprende:
realizar una primera reacción de amplificación del ácido nucleico en un ADN genómico o un ADNc de la cebolla como molde usando un primer conjunto de cebadores que comprende: un primer cebador que comprende un polinucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la primera secuencia de nucleótidos es idéntica a una primera secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendida en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, comprendiendo la primera secuencia de nucleótidos parcial uno o más primeros nucleótidos seleccionados de T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3'; y/o un segundo cebador que comprende un polinucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la segunda secuencia de nucleótidos es idéntica a una segunda secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendida en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, la segunda secuencia de nucleótidos parcial que comprende uno o más nucleótidos complementarios a uno o más segundos nucleótidos seleccionados de T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3'; y
confirmar un producto de amplificación de la primera reacción de amplificación del ácido nucleico.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, que comprende además una segunda etapa de determinación para determinar la presencia de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en el ácido nucleico derivado de la cebolla.
en el que la segunda etapa de determinación comprende determinar la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados de adenina (A) en la posición 34, citosina (C) en la posición 70, adenina (A) en la posición 1667, citosina (C) en la posición 1703, guanina (G) en la posición 127, timina (T) en la posición 409, adenina (A) en la posición 943 y citosina (C) en la posición 1822 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en el ácido nucleico derivado de la cebolla,
en el que la cebolla se discrimina para que sea una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena si la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados entre T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 no se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la primera etapa de determinación y la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados de A en la posición 34, C en la posición 70, A en la posición 1667, C en la posición 1703, G en la posición 127, T en la posición 409, A en la posición 943 y C en la posición 1822 en la secuencia de nucleótidos. de SEQ ID NO: 2 se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la segunda etapa de determinación, y
en el que la cebolla se discrimina para que sea una cebolla con un sabor punzante y/o una propiedad lacrimógena si la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados entre T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la primera etapa de determinación, y la presencia de uno o más nucleótidos seleccionados de A en la posición 34, C en la posición 70, A en la posición 1667, C en la posición 1703, G en la posición 127, T en la posición 409, A en la posición 943 y C en la posición 1822 en las secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 se determina en el ácido nucleico derivado de la cebolla en la segunda etapa de determinación.
4. El método según la reivindicación 3, en el que la segunda etapa de determinación comprende:
realizar una segunda reacción de amplificación del ácido nucleico en un ADN genómico de la cebolla como molde usando un segundo conjunto de cebadores que comprende: un tercer cebador que comprende un polinucleótido que comprende una tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la tercera secuencia de nucleótidos es idéntica a una tercera secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendida en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, comprendiendo la tercera secuencia de nucleótidos parcial uno o más terceros nucleótidos seleccionados de A en la posición 34, C en la posición 70, A en la posición 1667, C en la posición 1703, G en la posición 127, T en la posición 409, A en la posición 943 y C en la posición 1822 a 2 nucleótidos del extremo 3'; y/o un cuarto cebador que comprende un polinucleótido que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la cuarta secuencia de nucleótidos es idéntica a una cuarta secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendidos en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, la cuarta secuencia de nucleótidos parcial que comprende uno o más nucleótidos complementarios a uno o más cuartos nucleótidos seleccionados de A en la posición 34, C en la posición 70, A en la posición 1667, C en la posición 1703, G en la posición 127, T en la posición 409, A en la posición 943 y C en la posición 1822 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3'; y
confirmar un producto de amplificación de la segunda reacción de amplificación del ácido nucleico.
5. Un método de discriminación de rasgos de una cebolla, que comprende:
discriminar si la cebolla es una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y
discriminar además si la cebolla es una cebolla sin sabor punzante y/o propiedad lacrimógena basándose en uno o más de los siguientes rasgos como indicador(es):
a) la producción de ácido pirúvico en la disrupción de las células de la cebolla se reduce en comparación con las variedades convencionales;
b) la cantidad de PRENCSO que queda después de la disrupción de las células de cebolla es mayor en comparación con las variedades convencionales; y
c) la producción del factor lacrimógeno (LF) en la disrupción de las células de la cebolla se reduce en comparación con las variedades convencionales.
6. Un conjunto de cebadores que comprende:
un cebador que comprende un primer polinucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la primera secuencia de nucleótidos es idéntica a una primera secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendida en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, la primera secuencia de nucleótidos parcial que comprende un primer nucleótido seleccionado de T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3'; y
un cebador que comprende un segundo polinucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la segunda secuencia de nucleótidos es idéntica a una segunda secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendida en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, la segunda secuencia de nucleótidos parcial que comprende un nucleótido complementario a un segundo nucleótido seleccionado entre T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791, y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de s Eq ID NO: 1 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3', en la que
el primer nucleótido está colocado más cerca del extremo 5' que el segundo nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
7. Un kit para discriminar rasgos de una cebolla que comprende:
(a) uno seleccionado de
un cebador que comprende un primer polinucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la primera secuencia de nucleótidos es idéntica a una primera secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendida en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, la primera secuencia de nucleótidos que comprende un primer nucleótido seleccionado entre T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791 y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3',
un cebador que comprende un segundo polinucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la segunda secuencia de nucleótidos es idéntica a una segunda secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendida en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, la segunda secuencia de nucleótidos parcial que comprende un nucleótido complementario a un segundo nucleótido seleccionado entre T en la posición 94, T en la posición 130, G en la posición 1312, T en la posición 1348, A en la posición 187, A en la posición 358, C en la posición 791, y T en la posición 1467 en la secuencia de nucleótidos de s Eq ID NO: 1 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3', y
el conjunto de cebadores según la reivindicación 6; y (b) uno seleccionado de
un cebador que comprende un tercer polinucleótido que comprende una tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la tercera secuencia de nucleótidos es idéntica a una tercera secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendida en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, la tercera secuencia de nucleótidos parcial que comprende un tercer nucleótido seleccionado entre A en la posición 34, C en la posición 70, A en la posición 1667, C en la posición 1703, G en la posición 127, T en la posición 409, A en la posición 943 y C en la posición 1822 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3',
un cebador que comprende un cuarto polinucleótido que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que la cuarta secuencia de nucleótidos es idéntica a una cuarta secuencia de nucleótidos parcial de 17 o más nucleótidos consecutivos comprendidos en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, la cuarta secuencia de nucleótidos parcial que comprende un nucleótido complementario a un cuarto nucleótido seleccionado de A en la posición 34, C en la posición 70, A en la posición 1667, C en la posición 1703, G en la posición 127, T en la posición 409, A en la posición 943, y C en la posición 1822 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 dentro de 2 nucleótidos desde el extremo 3', y
un conjunto de cebadores que comprende: el cebador que comprende el tercer polinucleótido que comprende la tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 3', y el cebador que comprende el cuarto polinucleótido que comprende una cuarta secuencia de nucleótidos en el extremo 3', en el que el tercer nucleótido está posicionado más cerca del extremo 5' que el cuarto nucleótido en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
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