ES2954467T3 - Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente - Google Patents
Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente Download PDFInfo
- Publication number
- ES2954467T3 ES2954467T3 ES19196007T ES19196007T ES2954467T3 ES 2954467 T3 ES2954467 T3 ES 2954467T3 ES 19196007 T ES19196007 T ES 19196007T ES 19196007 T ES19196007 T ES 19196007T ES 2954467 T3 ES2954467 T3 ES 2954467T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- linker
- nucleic acid
- ligand
- microparticle
- domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000012216 screening Methods 0.000 title abstract description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 206
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims abstract description 198
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 148
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 148
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 145
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 84
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 54
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 43
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 29
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 29
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 17
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 17
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 12
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 claims description 7
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 claims description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 abstract description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003491 array Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 abstract 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 abstract 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 136
- -1 (cyclohexyl)methyl Chemical group 0.000 description 84
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 62
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 48
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 45
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 44
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 44
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 43
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 43
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 43
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 42
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 41
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 40
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 description 39
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 description 38
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 33
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 31
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 30
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 29
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 27
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 25
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 24
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 23
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 23
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 19
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 16
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 125000004474 heteroalkylene group Chemical group 0.000 description 11
- 125000005549 heteroarylene group Chemical group 0.000 description 11
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 10
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 10
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 9
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 9
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 8
- 125000006588 heterocycloalkylene group Chemical group 0.000 description 8
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical group CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 125000000732 arylene group Chemical group 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000007771 core particle Substances 0.000 description 7
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- PPXUUPXQWDQNGO-UHFFFAOYSA-N 2-azidoacetic acid Chemical group OC(=O)CN=[N+]=[N-] PPXUUPXQWDQNGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 6
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 6
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 6
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 6
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- 125000002993 cycloalkylene group Chemical group 0.000 description 5
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical compound [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 4
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 4
- 229920002560 Polyethylene Glycol 3000 Polymers 0.000 description 4
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 4
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 4
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- ZJAOAACCNHFJAH-UHFFFAOYSA-N phosphonoformic acid Chemical class OC(=O)P(O)(O)=O ZJAOAACCNHFJAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 4
- 229940113125 polyethylene glycol 3000 Drugs 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 3
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 3
- 125000006552 (C3-C8) cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- PFNHSEQQEPMLNI-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-pentanol Chemical compound CCCC(C)CO PFNHSEQQEPMLNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WFRBDWRZVBPBDO-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-pentanol Chemical compound CCCC(C)(C)O WFRBDWRZVBPBDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRDAATYAJDYRNW-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-3-pentanol Chemical compound CCC(C)(O)CC FRDAATYAJDYRNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IWTBVKIGCDZRPL-UHFFFAOYSA-N 3-methylpentanol Chemical compound CCC(C)CCO IWTBVKIGCDZRPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- JBRZTFJDHDCESZ-UHFFFAOYSA-N AsGa Chemical compound [As]#[Ga] JBRZTFJDHDCESZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001218 Gallium arsenide Inorganic materials 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920006397 acrylic thermoplastic Polymers 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001266 acyl halides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000004196 benzothienyl group Chemical group S1C(=CC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Chemical compound BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 2
- QNVRIHYSUZMSGM-UHFFFAOYSA-N hexan-2-ol Chemical compound CCCCC(C)O QNVRIHYSUZMSGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZOCHHNOQQHDWHG-UHFFFAOYSA-N hexan-3-ol Chemical compound CCCC(O)CC ZOCHHNOQQHDWHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- XUYJLQHKOGNDPB-UHFFFAOYSA-N phosphonoacetic acid Chemical compound OC(=O)CP(O)(O)=O XUYJLQHKOGNDPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005642 phosphothioate group Chemical group 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 2
- 125000003373 pyrazinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000007841 sequencing by ligation Methods 0.000 description 2
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 125000005717 substituted cycloalkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl prop-2-enoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)C=C ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 125000004417 unsaturated alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001618 (3R)-3-methylpentan-1-ol Substances 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004769 (C1-C4) alkylsulfonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical class C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001637 1-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(*)=C([H])C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004214 1-pyrrolidinyl group Chemical group [H]C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001462 1-pyrrolyl group Chemical group [*]N1C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004206 2,2,2-trifluoroethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C(F)(F)F 0.000 description 1
- XRMVWAKMXZNZIL-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethyl-1-butanol Chemical compound CCC(C)(C)CO XRMVWAKMXZNZIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXSWMAUXEHKFGX-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbutan-1-ol Chemical compound CC(C)C(C)CO SXSWMAUXEHKFGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IKECULIHBUCAKR-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbutan-2-ol Chemical compound CC(C)C(C)(C)O IKECULIHBUCAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNVRIHYSUZMSGM-LURJTMIESA-N 2-Hexanol Natural products CCCC[C@H](C)O QNVRIHYSUZMSGM-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VRPJIFMKZZEXLR-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]acetic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCC(O)=O VRPJIFMKZZEXLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004174 2-benzimidazolyl group Chemical group [H]N1C(*)=NC2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- TZYRSLHNPKPEFV-UHFFFAOYSA-N 2-ethyl-1-butanol Chemical compound CCC(CC)CO TZYRSLHNPKPEFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002941 2-furyl group Chemical group O1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- ASUDFOJKTJLAIK-UHFFFAOYSA-N 2-methoxyethanamine Chemical compound COCCN ASUDFOJKTJLAIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISTJMQSHILQAEC-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-3-pentanol Chemical compound CCC(O)C(C)C ISTJMQSHILQAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001622 2-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C(*)C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000389 2-pyrrolyl group Chemical group [H]N1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000175 2-thienyl group Chemical group S1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- DUXCSEISVMREAX-UHFFFAOYSA-N 3,3-dimethylbutan-1-ol Chemical compound CC(C)(C)CCO DUXCSEISVMREAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VAKXPQHQQNOUEZ-UHFFFAOYSA-N 3-[4-[[bis[[1-(3-hydroxypropyl)triazol-4-yl]methyl]amino]methyl]triazol-1-yl]propan-1-ol Chemical compound N1=NN(CCCO)C=C1CN(CC=1N=NN(CCCO)C=1)CC1=CN(CCCO)N=N1 VAKXPQHQQNOUEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000474 3-butynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000003682 3-furyl group Chemical group O1C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- ZXNBBWHRUSXUFZ-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-pentanol Chemical compound CCC(C)C(C)O ZXNBBWHRUSXUFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003349 3-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000001397 3-pyrrolyl group Chemical group [H]N1C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000001541 3-thienyl group Chemical group S1C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- IBOFVQJTBBUKMU-UHFFFAOYSA-N 4,4'-methylene-bis-(2-chloroaniline) Chemical compound C1=C(Cl)C(N)=CC=C1CC1=CC=C(N)C(Cl)=C1 IBOFVQJTBBUKMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WJOZIICADCDCCS-UHFFFAOYSA-N 4-[bis(4-hydroxybutyl)amino]butan-1-ol Chemical compound OCCCCN(CCCCO)CCCCO WJOZIICADCDCCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GAMYYCRTACQSBR-UHFFFAOYSA-N 4-azabenzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC=NC2=N1 GAMYYCRTACQSBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WROTXLSEMHAZEA-UHFFFAOYSA-N 4-diaminophosphoryloxymorpholine Chemical compound NP(N)(=O)ON1CCOCC1 WROTXLSEMHAZEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WVYWICLMDOOCFB-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-pentanol Chemical compound CC(C)CC(C)O WVYWICLMDOOCFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCWGTDULNUVNBN-UHFFFAOYSA-N 4-methylpentan-1-ol Chemical compound CC(C)CCCO PCWGTDULNUVNBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000339 4-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- KDDQRKBRJSGMQE-UHFFFAOYSA-N 4-thiazolyl Chemical group [C]1=CSC=N1 KDDQRKBRJSGMQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWDWFSXUQODZGW-UHFFFAOYSA-N 5-thiazolyl Chemical group [C]1=CN=CS1 CWDWFSXUQODZGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical group [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 125000004406 C3-C8 cycloalkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001313 C5-C10 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 101100038180 Caenorhabditis briggsae rpb-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 229910004613 CdTe Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N Chlorine Chemical compound ClCl KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 238000006736 Huisgen cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 229910000673 Indium arsenide Inorganic materials 0.000 description 1
- GPXJNWSHGFTCBW-UHFFFAOYSA-N Indium phosphide Chemical compound [In]#P GPXJNWSHGFTCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006957 Michael reaction Methods 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 229910003849 O-Si Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910003872 O—Si Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 102100021923 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710202113 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Natural products C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- PDKXJKWLFFZPPF-UHFFFAOYSA-N [dimethylamino-(3-oxidotriazolo[4,5-b]pyridin-3-ium-1-yl)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(C(N(C)C)=[N+](C)C)N=[N+]([O-])C2=N1 PDKXJKWLFFZPPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose 5-phosphate Chemical group OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 125000004450 alkenylene group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000004390 alkyl sulfonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005237 alkyleneamino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005263 alkylenediamine group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005530 alkylenedioxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005529 alkyleneoxy group Chemical group 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002029 aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 125000003785 benzimidazolyl group Chemical group N1=C(NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000002047 benzodioxolyl group Chemical group O1OC(C2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000000499 benzofuranyl group Chemical group O1C(=CC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000005874 benzothiadiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001164 benzothiazolyl group Chemical group S1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000003354 benzotriazolyl group Chemical group N1N=NC2=C1C=CC=C2* 0.000 description 1
- 125000004541 benzoxazolyl group Chemical group O1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000005312 bioglass Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 125000000319 biphenyl-4-yl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C1=C([H])C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+);selenium(2-) Chemical compound [Se-2].[Cd+2] UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CREMABGTGYGIQB-UHFFFAOYSA-N carbon carbon Chemical compound C.C CREMABGTGYGIQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009614 chemical analysis method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- PMHQVHHXPFUNSP-UHFFFAOYSA-M copper(1+);methylsulfanylmethane;bromide Chemical compound Br[Cu].CSC PMHQVHHXPFUNSP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000392 cycloalkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000582 cycloheptyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007257 deesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005661 deetherification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- ANCLJVISBRWUTR-UHFFFAOYSA-N diaminophosphinic acid Chemical compound NP(N)(O)=O ANCLJVISBRWUTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002720 diazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001028 difluoromethyl group Chemical group [H]C(F)(F)* 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 238000007336 electrophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002081 enamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005669 field effect Effects 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 125000004216 fluoromethyl group Chemical group [H]C([H])(F)* 0.000 description 1
- 229960005102 foscarnet Drugs 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229910052732 germanium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNPVGFCGXDBREM-UHFFFAOYSA-N germanium atom Chemical compound [Ge] GNPVGFCGXDBREM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004366 heterocycloalkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 229920000587 hyperbranched polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 125000003453 indazolyl group Chemical group N1N=C(C2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- RPQDHPTXJYYUPQ-UHFFFAOYSA-N indium arsenide Chemical compound [In]#[As] RPQDHPTXJYYUPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005956 isoquinolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001786 isothiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000842 isoxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000005067 joint tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005710 macrocyclization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O methylsulfide anion Chemical compound [SH2+]C LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 125000006682 monohaloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004572 morpholin-3-yl group Chemical group N1C(COCC1)* 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- QQZOPKMRPOGIEB-UHFFFAOYSA-N n-butyl methyl ketone Natural products CCCCC(C)=O QQZOPKMRPOGIEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003136 n-heptyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000003499 nucleic acid array Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 125000001715 oxadiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003003 phosphines Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 125000002743 phosphorus functional group Chemical group 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- DFOXKPDFWGNLJU-UHFFFAOYSA-N pinacolyl alcohol Chemical compound CC(O)C(C)(C)C DFOXKPDFWGNLJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000587 piperidin-1-yl group Chemical group [H]C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004483 piperidin-3-yl group Chemical group N1CC(CCC1)* 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001748 polybutylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 125000006684 polyhaloalkyl group Polymers 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 125000003226 pyrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 125000002943 quinolinyl group Chemical group N1=C(C=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 125000005493 quinolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001567 quinoxalinyl group Chemical group N1=C(C=NC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000002094 self assembled monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000013545 self-assembled monolayer Substances 0.000 description 1
- 150000007659 semicarbazones Chemical class 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003376 silicon Chemical class 0.000 description 1
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 125000002128 sulfonyl halide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000005222 synovial tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000004192 tetrahydrofuran-2-yl group Chemical group [H]C1([H])OC([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 125000001113 thiadiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000005309 thioalkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- PPDADIYYMSXQJK-UHFFFAOYSA-N trichlorosilicon Chemical group Cl[Si](Cl)Cl PPDADIYYMSXQJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
- C40B50/16—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support involving encoding steps
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Structural Engineering (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Signal Processing For Digital Recording And Reproducing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
En el presente documento se proporcionan bibliotecas de agrupaciones divididas codificadas útiles, entre otras cosas, para formar matrices densas y muy diversas para el rastreo y la detección de una variedad de moléculas. Se divulga un método para inmovilizar una micropartícula a un soporte sólido, en el que la micropartícula se une covalentemente mediante un primer y segundo conector a un dominio de ligando (por ejemplo, péptido, proteína, molécula pequeña) y un ácido nucleico y se realiza un procedimiento de decodificación en el ácido nucleico. dominio, identificando así la composición del dominio ligando y su ubicación en dicho soporte sólido. El segundo conector es escindible selectivamente bajo la condición de que dicho primer conector no sea escindible. La decodificación puede implicar hibridación o secuenciación. El segundo conector es, por ejemplo, un conector fotoescindible o comprende -S(O)2NH- -NHS(O)2- -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NH-, -NHC(O)-. El dominio del ligando puede unirse a un aglutinante de ligando (que puede marcarse con fluorescencia) a menos que esté protegido por un grupo protector, que puede eliminarse. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente
Antecedentes de la invención
El número de moléculas mostradas por las matrices utilizadas para los métodos de cribado y detección está restringido por el método sintético de la matriz. En teoría, la síntesis de grupo dividido puede generar bibliotecas enormes, limitadas solo por el número de etapas químicas y el número de bloques de construcción únicos utilizados por etapa (es decir, una biblioteca de 5 etapas que utilice 100 bloques de construcción únicos por etapa produciría en teoría biblioteca química de 1005 o 10 mil millones de miembros). Sin embargo, en la práctica, las estrategias de grupo dividido codificadas se enfrentan a numerosas limitaciones prácticas. Las bibliotecas que son decodificables pero no cribables o viceversa no son útiles. La estrategia de codificación puede estar prácticamente limitada en el número y tipo de etapas químicas o bloques de construcción usados. Una plataforma de biblioteca de grupo dividido codificada que requiere partículas grandes para la decodificación (por ejemplo, mediante etiquetas de radiofrecuencia o espectrometría de masas) normalmente necesitará contener menos miembros de biblioteca que una biblioteca similar que se puede crear en partículas más pequeñas. Si los ensayos se van a realizar en una partícula, la densidad del ligando en cada partícula y el entorno químico de la superficie alrededor de cada ligando no deberían interferir con el ensayo. La naturaleza en serie de las estrategias de decodificación informadas también limita el número de "aciertos" que pueden identificarse de manera rentable en un cribado dado y, por lo tanto, pueden limitar el tamaño de una biblioteca que se criba. La presente invención aborda estos y otros problemas de la técnica.
El documento WO 95/12608A1 se refiere a un dispositivo y un método para sintetizar eficazmente diversos productos moleculares sobre sustratos.
El documento WO 2011/143583 divulga composiciones y métodos para analizar la presencia de un analito objetivo en una muestra usando un soporte sólido.
El documento US 8,039,271 divulga un método y aparato para la manipulación de partículas coloidales y biomoléculas en la interfaz entre un electrodo aislante tal como óxido de silicio y una solución electrolítica.
El documento WO 98/20019 divulga composiciones que contienen al menos una perla conjugada con un soporte sólido y además conjugada con al menos una macromolécula, tal como un ácido nucleico y métodos para preparar las composiciones.
El documento US 2006/040286 divulga métodos de cribado, composiciones y kits para detectar la presencia o ausencia de uno o más analitos objetivo, por ejemplo biomoléculas, en una muestra.
El documento WO 2014/026283 se refiere a dendrímeros conjugados con múltiples péptidos dirigidos y uno o más agentes terapéuticos, de diagnóstico o de formación de imágenes para la administración de dichos agentes a través de la barrera hematoencefálica y en ciertos tipos de células, incluidas las células que expresan el receptor LRP-1.
El documento WO 2007/084192 divulga un método para detectar un analito de interés a través de un ensayo de código de barras biológico y un método de código de barras biológico colorimétrico que es capaz de detectar concentraciones mínimas de un analito basándose en partículas porosas.
El documento EP 1239286 divulga un sensor bioquímico con sondas fijadas uniformemente en secciones. Las sondas utilizadas para detectar una sustancia de interés se captan previamente en partículas, y las partículas se fijan en cada una de las secciones dispuestas en forma de retícula utilizando un método de modelado químico sobre la superficie de una placa base.
El documento WO 00/71995 proporciona ensayos y componentes para codificar y decodificar microesferas, cada uno de los cuales utiliza al menos una microesfera.
El documento US 4,672,040 divulga métodos para el uso de partículas magnéticamente sensibles en sistemas en los que es deseable la separación de ciertas moléculas, macromoléculas y células del medio circundante.
Breve resumen de la invención
[0002] En un aspecto, se proporciona un método que comprende las etapas de:
(i) unir una micropartícula a un soporte sólido, formando así una micropartícula inmovilizada, donde dicha micropartícula inmovilizada se une covalentemente a: (a) un dominio de ligando a través de un primer enlazador; y (b) una etiqueta de codificación a través de un segundo enlazador; donde dicho dominio de ligando es un péptido, una proteína, un péptido macrocíclico, un peptidomimético, una poliamida o una macrolactama; en el que dicha etiqueta codificante es una secuencia de ácido nucleico que identifica dicho dominio de ligando; en el que dicho segundo enlazador es escindible y dicho primer enlazador no es escindible bajo la condición de que dicho segundo enlazador sea escindible; en el que dicho primer enlazador comprende -C(O)NH- o -NHC(O)-, y dicho segundo enlazador comprende -C(O)O- o -OC(O)-; y
(ii) realizar un procedimiento de decodificación en la etiqueta de codificación, identificando así la composición del dominio del ligando y su ubicación en dicho soporte sólido; y
(iii) escindir dicho segundo enlazador de dicha micropartícula, formando así una micropartícula escindida.
Breve descripción de los dibujos
FIGURA 1: Esquema que ilustra la estructura general de las micropartículas utilizadas para crear una biblioteca. La variación en las proporciones de A, B y C se logra mediante una o más transformaciones sintéticas aplicadas al material de partida, partículas de ProMag 1 COOH Series. Las proporciones diana iniciales se establecen mediante proporciones relativas de mezclas de bloques de construcción utilizados para ensamblar la superficie de la partícula. Las relaciones finales logradas se miden mediante una combinación de TGA, LC/MS o análisis en gel de productos escindidos y ensayos en fase sólida basados en fluorescencia o colorimétricos. Intervalos preferidos: X tiene una concentración de 0.1 a 100 nanomoles/mg; 1% de X < A < 20% de X; 40% de X < B < 99% de X; 0% de X < C < 50% de X; en el que X es A (punto de unión de la molécula de biblioteca), B (punto de unión de la etiqueta codificante) o C (punto de inmovilización central).
FIGURA 2: Esquema general de cómo se puede realizar la síntesis de agrupación dividida codificada; enfatizando el aumento exponencial en la diversidad química observado con un aumento lineal en el número de etapas químicas y bloques de construcción. Para una revisión general, véase: Czarnik, A. W. "Encoding methods for combinatory chemistry", Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1,60-66. Ejemplo: 100 bloques de construcción, 6 rondas de grupo dividido, 1 x 1 0 12 miembros únicos, 600 reacciones químicas. n es el número de rondas de grupo dividido, x es el número de bloques de construcción, miembros de biblioteca únicos = Xn, reacciones químicas = nX
FIGURA 3: Una ilustración de los enlaces químicos que se forman y rompen durante una ronda de una etapa de síntesis codificada utilizando síntesis de péptidos como la química que se codifica. En la etapa 1, un aminoácido protegido con Fmoc se acopla a la amina libre en la micropartícula a través de un acoplamiento de amida. En la etapa 2, una etiqueta de ácido nucleico que porta un alquino y una amina primaria libre se acopla al grupo azida en la micropartícula a través de una cicloadición de Huisgen catalizada por cobre. En la etapa 3, se acopla un grupo azida a la amina primaria en el ácido nucleico mediante un acoplamiento de amida. En la etapa 4 se elimina el grupo Fmoc que protege el grupo amina del aminoácido incorporado. El producto que sigue a la etapa 4 muestra las mismas fracciones reactivas que el material de partida (antes de la etapa 1), pero contiene una etiqueta de ácido nucleico adicional y un aminoácido adicional. Véase materiales y métodos para conocer los detalles de la reacción. Véase los materiales y métodos para obtener un ejemplo detallado de cómo se preparan las micropartículas iniciales para la síntesis ortogonal.
FIGURA 4: Esquema que ilustra la conectividad de las etiquetas de ácido nucleico en uno de los enfoques de etiquetado potenciales. En esta variante, durante cada etapa de etiquetado, se consumen todos los puntos de unión de la etiqueta en las micropartículas, y luego se crea una cantidad equivalente de nuevos puntos de unión de la etiqueta en los extremos de las etiquetas de ácido nucleico recién unidas. Dos etapas de etiquetado en este ejemplo conducirían a la generación de predominantemente una única población de oligómeros que contienen ácido nucleico en cada perla que consiste en la etiqueta 1 unida a la etiqueta 2. Téngase en cuenta que, por diseño, cada población de etiquetas se puede decodificar de forma independiente, de modo que la decodificación solo depende de la presencia de cada etiqueta individual, es decir, la decodificabilidad de la etiqueta 2 no depende de que esté directamente unida a la etiqueta 1 y viceversa, de modo que los subconjuntos de perlas que pueden no haber pasado a la conversión completa en cualquiera de las etapas de etiquetado siguen siendo decodificables, siempre que haya cantidades suficientes de cada etiqueta para decodificación.
FIGURA 5: Esquema que ilustra la conectividad de las etiquetas de ácido nucleico en uno de los enfoques de etiquetado potenciales. En esta variante, durante cada etapa de etiquetado, solo se consume una fracción de los puntos de unión de la etiqueta en la micropartícula para las etiquetas. Como se muestra, dos etapas de etiquetado en este ejemplo conducirían a la generación de dos poblaciones de oligómeros que contienen ácido nucleico en cada población de perlas una que consta de la etiqueta 1 y una población que consta de la etiqueta 2. Para cuatro etapas de etiquetado, se generarían cuatro poblaciones únicas por perla.
FIGURA 6: Esquema que ilustra la conectividad de las etiquetas de ácido nucleico en uno de los enfoques de etiquetado potenciales. En esta variante, durante cada etapa de etiquetado, se consume una fracción de los puntos de unión de la etiqueta en las micropartículas, y luego se crea una cantidad equivalente de nuevos puntos de unión de la etiqueta en los extremos de las etiquetas de ácido nucleico recién unidas. Dos etapas de etiquetado en este ejemplo conducirían a la generación de tres poblaciones de oligómeros que contienen ácido nucleico en cada perla, etiqueta 1, etiqueta 2 y un oligómero que consiste en la etiqueta 1 unida a la etiqueta 2. Téngase en cuenta que, por diseño, cada población de etiquetas se puede decodificar de forma independiente, de modo que la decodificación de cada etiqueta solo depende de la presencia de cada etiqueta individual, es decir, la decodificación de la etiqueta 2 no depende de que esté directamente unida a la etiqueta 1 y viceversa.
FIGURA 7: Trazas de LC de los diferentes compuestos intermedios de la etiqueta durante una ronda de etiquetado y la adición de un nuevo elemento de enlace a la etiqueta. Como lo demuestran los cambios en el tiempo de retención
y los espectros de masas, la química de cicloadición en fase sólida produce predominantemente el producto deseado. Después del acoplamiento de amida en fase sólida de un nuevo elemento de enlace de etiqueta, el análisis LC/MS indica la conversión al producto deseado. Véase materiales y métodos para conocer las condiciones de cicloadición, las condiciones de acoplamiento de amidas y las condiciones de escisión.
FIGURA 8: Una porción de las micropartículas modificadas con PEG se funcionalizó con un enlazador lábil a los ácidos y se sometió a una síntesis de péptidos en fase sólida de siete etapas. El producto se separó de las micropartículas usando TFA. Se eliminó el TFA y el residuo se analizó mediante espectrometría de masas, lo que demostró una síntesis exitosa del péptido deseado.
FIGURAS 9A-9B: Demostración de dos modos diferentes de inmovilización de bibliotecas. En la Figura 9A, una imagen de campo claro de una porción de micropartículas de los solicitantes inmovilizadas covalentemente a un portaobjetos recubierto con carboximetildextrano activado a través de la formación de un enlace amida. En la Figura 9B a la derecha, una imagen de SEM de una parte de las micropartículas de los solicitantes inmovilizadas no covalentemente dentro de una oblea de silicio microfabricada personalizada.
FIGURA 10: Las micropartículas que experimentan cuatro rondas de etapas de codificación/etiquetado (como se describe en el esquema de codificación de la Figura 6 se pueden decodificar correctamente. Se sometieron dos porciones diferentes de micropartículas en paralelo a cuatro rondas de etiquetado como se ilustra en la Figura 6. Cada porción de micropartículas se etiquetó con 18 mer únicas en cada etapa de etiquetado. Después de las cuatro rondas de codificación, cada porción se expuso a una serie de soluciones de hibridación que contenían una mezcla 1:1 de dos sondas diferentes de oligonucleótidos marcadas en forma fluorescente. Se muestran ocho imágenes fluorescentes de dos canales diferentes de alícuotas de las micropartículas etiquetadas después de la hibridación. En la columna 1, las dos muestras de micropartículas se hibridaron con una mezcla 1:1 de oligonucleótido etiquetado con Cy3 complementario de A0, y un oligonucleótido etiquetado con FITC complementario de A1. Como se esperaba, las partículas codificadas con la etiqueta A0 emitieron fluorescencia en el canal rojo (Cy3) (imagen superior, columna 1) y las partículas codificadas con la etiqueta A1 emitieron fluorescencia en el canal verde (FITC) (imagen inferior, columna 2). La tendencia es cierta para todas las demás condiciones de hibridación, en las que las partículas fluorescen selectivamente en la longitud de onda correspondiente a la etiqueta fluorescente unida a la etiqueta de secuencia de ADN complementaria, en lugar de una etiqueta no coincidente.
FIGURA 11: Las micropartículas que se someten a cuatro rondas de etapas de codificación/etiquetado (como se describe en la Figura 5 se pueden decodificar correctamente. Se sometieron dos porciones diferentes de micropartículas en paralelo a cuatro rondas de etiquetado como se ilustra en la Figura 5. Cada porción de micropartículas se etiquetó con un 18 mer único en cada etapa de etiquetado. Después de las cuatro rondas de codificación, cada porción se expuso a una serie de soluciones de hibridación que contenían una mezcla 1:1 de dos sondas diferentes de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia. Se muestran ocho imágenes fluorescentes de dos canales diferentes de alícuotas de las micropartículas etiquetadas después de hibridación. En la columna 1, las dos muestras de micropartículas se hibridaron con una mezcla 1:1 de oligonucleótidos etiquetados con Cy3 complementario a A0, y un oligonucleótido etiquetado con FITC complementario a A1. Como se esperaba, las partículas codificadas con la etiqueta A0 emitieron fluorescencia en el canal rojo (Cy3) (imagen superior, columna 1) y las partículas codificadas con la etiqueta A1 emitieron fluorescencia en el canal verde (FITC) (imagen inferior, columna 2). La tendencia es válida para todas las demás condiciones de hibridación, en las que las partículas emiten fluorescencia selectiva en la longitud de onda correspondiente a la etiqueta fluorescente adherida a la etiqueta de secuencia de ADN complementaria, en lugar de una etiqueta no coincidente.
FIGURA 12: Para demostrar que la síntesis de péptidos es compatible con la química de codificación de los solicitantes, se sintetizaron dos péptidos (HA y Myc, dos epítopos de anticuerpos comunes) en paralelo en las micropartículas en las que cuatro de las etapas de síntesis se codificaron con etiquetas de ADN. Las partículas se incubaron con un anticuerpo etiquetado con Cy5 específico del epítopo HA en varias etapas de la síntesis. Las micropartículas que mostraban etiquetas de ADN y péptido HA completamente protegido (en el que las fracciones protectoras de la cadena lateral no se han eliminado) no se unieron al anticuerpo etiquetado (imágenes de la fila superior). Después de la escisión de las etiquetas de ADN, las micropartículas que muestran el péptido HA protegido en la cadena lateral no se unen al anticuerpo etiquetado (imágenes de la segunda fila). Después de la desprotección de las fracciones protectores de la cadena lateral (tratamiento con TFA), las micropartículas que muestran HA se unen ahora al anticuerpo etiquetado (imágenes de la tercera fila). Las micropartículas que muestran el péptido Myc completamente desprotegido no se unen al anticuerpo etiquetado (imágenes de la cuarta fila)
FIGURA 13: Para demostrar que la síntesis de péptidos es compatible con la química de codificación de los solicitantes, se sintetizaron dos péptidos (HA y Myc, dos epítopos de anticuerpos comunes) en paralelo en micropartículas en las que cuatro de las etapas de síntesis se codificaron con etiquetas de ADN. Las partículas se incubaron con un anticuerpo etiquetado con Alexa Fluor 488 específico para el epítopo Myc en diferentes etapas de la síntesis. Las micropartículas que mostraban etiquetas de ADN y péptido Myc completamente protegido (en el que no se han eliminado las fracciones protectores de la cadena lateral) no se unieron al anticuerpo etiquetado (imágenes de la fila superior). Después de la escisión de las etiquetas de ADN, las micropartículas que muestran el péptido Myc protegido de la cadena lateral no se unen al anticuerpo etiquetado (imágenes de la segunda fila). Después de la desprotección de las fracciones protectores de la cadena lateral (tratamiento con TFA), las micropartículas que
muestran Myc ahora se unen al anticuerpo etiquetado (imágenes de la tercera fila). Las micropartículas que muestran el péptido HA completamente desprotegido no se unen al anticuerpo etiquetado (imágenes de la cuarta fila).
FIGURA 14: La mezcla de perlas y tintes demuestra la capacidad de diferenciar la unión. Se mezclaron perlas sin etiqueta que portaban péptido HA o péptido Myc completamente desprotegido y se tiñeron con una mezcla de anti-HA-Cy5 y anti-Myc-Alexa 488. Las imágenes de fluorescencia indican dos poblaciones de perlas distintas.
FIGURA 15A-FIGURA 15H: La Figura 15A muestra SEM de las partículas ProMag de 0.88 μm. La Figura 15B muestra un chip de silicio con un espaciado de pozos de centro a centro de 1.3 μm en un patrón hexagonal. La Figura 15C muestra un chip de silicio con un espaciado de centro a centro de 1.3 μm de pozos en un patrón cuadrado. La Figura 15D muestra un chip de silicio con un espaciado de centro a centro de 1.3 μm de pozos en un patrón cuadrado, parcialmente lleno de microesferas. La Figura 15E muestra un chip de silicio con un espaciado de centro a centro de 1.3 μm de pozos en un patrón hexagonal, lleno de microesferas. La Figura 15F muestra un chip de silicio con un espaciado de centro a centro de 1.3 μm de pozos en un patrón hexagonal, lleno de microesferas inclinadas. La Figura 15G muestra una imagen fluorescente de microesferas marcadas con Alexa Fluor 488 inmovilizadas en un chip de silicio parcialmente lleno con un espaciado de centro a centro de 1.3 μm de los pocillos en un patrón hexagonal. La Figura 15H muestra una imagen de campo brillante de microesferas inmovilizadas en un chip de cuarzo parcialmente lleno con un espaciado de centro a centro de 1.3 μm de pozos en un patrón hexagonal.
FIGURA 16A-FIGURA 16D: La Figura 16A muestra la autofluorescencia de microesferas inmovilizadas en un chip de cuarzo parcialmente lleno con una separación de centro a centro de 1.3 μm de los pocillos en un patrón hexagonal. La Figura 16B muestra un chip de silicio con una separación de centro a centro de los pocillos de 2.4 μm en un patrón hexagonal. La Figura 16C muestra un chip de silicio con una separación de centro a centro de los pocillos de 2.4 μm en un patrón hexagonal, parcialmente lleno de microesferas. La Figura 16D muestra una imagen fluorescente de microesferas marcadas con ADN hibridadas con complementos de ADN etiquetados con fluorescencia inmovilizados en un chip de silicio. El chip está parcialmente lleno y tiene una separación de centro a centro de los pozos de 2.4 μm en un patrón hexagonal.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Los títulos de las secciones que se utilizan en este documento son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito.
Las abreviaturas utilizadas en este documento tienen su significado convencional dentro de las técnicas química y biológica. Las estructuras químicas y fórmulas establecidas en este documento se construyen de acuerdo con las reglas estándar de valencia química conocidas en las técnicas químicas.
Cuando los grupos sustituyentes se especifican mediante sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes químicamente idénticos que resultarían de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, -CH2O- es equivalente a -OCH2-.
El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena carbonada (o carbono) lineal (es decir, no ramificada) o no cíclica ramificada, o una combinación de las mismas, que puede estar completamente saturada, monoinsaturada o poliinsaturada y puede incluir radicales di y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designado (es decir, C1-C10 significa de uno a diez carbonos). Los ejemplos de radicales hidrocarbonados saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, (ciclohexil)metilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, entre otros, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1 y 3-propinilo, 3-butinilo y los homólogos e isómeros superiores. Un alcoxi es un alquilo unido al resto de la molécula a través de un enlazador de oxígeno (-O-). Una fracción alquilo puede ser una fracción alquenilo. Una fracción alquilo puede ser una fracción alquinilo. Una fracción alquilo puede estar completamente saturada.
El término "alquileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical divalente derivado de un alquilo, como se ejemplifica, pero no se limita a, -CH2CH2CH2CH2-. Normalmente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, prefiriéndose en la presente invención aquellos grupos que tengan 10 o menos átomos de carbono. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que generalmente tiene ocho o menos átomos de carbono. El término "alquenileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical divalente derivado de un alqueno.
El término "heteroalquilo", por sí mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena lineal o ramificada no cíclica estable, o combinaciones de las mismas, que incluyen al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consta de O, N, P, Si y S, y en el que los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar
opcionalmente cuaternizado. El heteroátomo o heteroátomos O, N, P, S y Si se pueden colocar en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la que el grupo alquilo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3 , -CH2-CH2 , -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3 , -O-CH3, -O-CH2-CH3, y -CN. Hasta dos o tres heteroátomos pueden ser consecutivos, como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. Una fracción heteroalquilo puede incluir un heteroátomo (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heteroalquilo puede incluir dos heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heteroalquilo puede incluir tres heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heteroalquilo puede incluir cuatro heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heteroalquilo puede incluir cinco heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heteroalquilo puede incluir hasta 8 heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P).
De manera similar, el término "heteroalquileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no se limita a, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar uno o ambos extremos de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilenodioxi, alquilenamino, alquilendiamino y similares). Además, para los grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, no está implícita la orientación del grupo de enlace por la dirección en la cual se escribe la fórmula del grupo de enlace. Por ejemplo, la fórmula -C(O)2R'- representa ambos -C(O)2R'- y -R'C(O)2-. Como se describió anteriormente, los grupos heteroalquilo, como se usan en este documento, incluyen aquellos grupos que están unidos al resto de la molécula a través de un heteroátomo, tales como -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R" , -OR', -SR' y/o -SO2R'. Cuando se menciona "heteroalquilo", seguido por la mención de grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares, se entenderá que los términos heteroalquilo y -NR'R" no son redundantes ni mutuamente excluyentes. Por el contrario, los grupos heteroalquilo específicos se enumeran para añadir claridad. Por lo tanto, el término "heteroalquilo" no debe interpretarse en el presente documento como que excluye grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares.
Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por sí mismos o en combinación con otros términos, significan, a menos que se indique lo contrario, versiones cíclicas no aromáticas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente, en las que los carbonos que forman el anillo o anillos no necesariamente necesitan estar unidos a un hidrógeno debido a que todas las valencias de carbono participan en enlaces con átomos que no son de hidrógeno. Además, para el heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la que el heterociclo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo, 3-hidroxiciclobut-3-enil-1,2-diona, 1H-1,2,4-triazolil-5(4H)-ona, 4H-1,2,4-triazolilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo y similares. Un "cicloalquileno" y un "heterocicloalquileno", solos o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de un cicloalquilo y heterocicloalquilo, respectivamente. Una fracción heterocicloalquilo puede incluir un heteroátomo de anillo (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heterocicloalquilo puede incluir dos heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heterocicloalquilo puede incluir tres heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heterocicloalquilo puede incluir cuatro heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heterocicloalquilo puede incluir cinco heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heterocicloalquilo puede incluir hasta 8 heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P).
Los términos "halo" o "halógeno", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Además, se pretende que términos como "haloalquilo" incluyan monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "halo alquilo(C1-C4)" incluye, pero no se limita a, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo y similares.
El término "acilo" significa, a menos que se indique lo contrario, -C(O)R en el que R es un alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido.
El término "arilo" significa, a menos que se indique lo contrario, un sustituyente de hidrocarburo aromático poliinsaturado, que puede ser un solo anillo o múltiples anillos (preferiblemente de 1 a 3 anillos) que están fusionados entre sí (es decir, un arilo de anillo fusionado) o enlazados covalentemente. Un arilo de anillo fusionado se refiere a múltiples anillos fusionados entre sí en los que al menos uno de los anillos fusionados es un anillo arilo. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen al menos un heteroátomo tal como N, O o S, en el que los átomos de nitrógeno y azufre están opcionalmente oxidados y el átomo o átomos de nitrógeno están opcionalmente cuaternizados. Por lo tanto, el término "heteroarilo" incluye grupos heteroarilo de anillo fusionado (es decir, múltiples anillos fusionados entre sí en los que al menos uno de los anillos fusionados es un anillo heteroaromático). Un heteroarileno de anillo fusionado 5,6 se refiere a dos anillos fusionados entre sí, en el que un anillo tiene 5 miembros y el otro anillo tiene 6 miembros, y en el que al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Asimismo, un heteroarileno de anillo fusionado 6,6 se refiere a dos anillos fusionados entre sí, en el que un anillo tiene 6 miembros y el otro anillo
tiene 6 miembros, y en el que al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Y un heteroarileno de anillo fusionado 6,5 se refiere a dos anillos fusionados entre sí, en el que un anillo tiene 6 miembros y el otro anillo tiene 5 miembros, y en el que al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Se puede unir un grupo heteroarilo al resto de la molécula a través de un carbono o heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillos de arilo y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables que se describen a continuación. Un "arileno" y un "heteroarileno", solos o como parte de otro sustituyente, significan un radical divalente derivado de un arilo y heteroarilo, respectivamente. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen piridinilo, pirimidinilo, tiofenilo, tienilo, furanilo, indolilo, benzoxadiazolilo, benzodioxolilo, benzodioxanilo, tianaftanilo, pirrolopiridinilo, indazolilo, quinolinilo, quinoxalinilo, piridopirazinilo, quinaxolinonilo, benzoisoxazolilo, imidazopiridinilo, benzofuranilo, benzotienilo, benzotiofenilo, fenilo, naftilo, bifenilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, pirazinilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, furiltienilo, piridilo, pirimidilo, benzotiazolilo, purinilo, bencimidazolilo, isoquinolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, pirrolilo, diazolilo, triazolilo tetrazolilo, benzotiadiazolilo, isotiazolilo, pirazolopirimidinilo, pirrolopirimidinilo, benzotriazolilo, benzoxazolilo o quinolilo. Los ejemplos anteriores pueden estar sustituidos o no sustituidos y los radicales divalentes de cada ejemplo de heteroarilo anterior son ejemplos no limitantes de heteroarileno. Una fracción heteroarilo puede incluir un heteroátomo de anillo (por ejemplo, O, N o S). Una fracción heteroarilo puede incluir dos heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N o S). Una fracción heteroarilo puede incluir tres heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N o S). Una fracción heteroarilo puede incluir cuatro heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N o S). Una fracción heteroarilo puede incluir cinco heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N o S). Una fracción arilo puede tener un solo anillo. Una fracción arilo puede tener dos anillos opcionalmente diferentes. Una fracción arilo puede tener tres anillos opcionalmente diferentes. Una fracción arilo puede tener cuatro anillos opcionalmente diferentes. Una fracción heteroarilo puede tener un anillo. Una fracción heteroarilo puede tener dos anillos opcionalmente diferentes. Una fracción heteroarilo puede tener tres anillos opcionalmente diferentes. Una fracción heteroarilo puede tener cuatro anillos opcionalmente diferentes. Una fracción heteroarilo puede tener cinco anillos opcionalmente diferentes.
Un heterocicloalquil-arilo de anillo fusionado es un arilo fusionado a un heterocicloalquilo. Un heterocicloalquilheteroarilo de anillo fusionado es un heteroarilo fusionado a un heterocicloalquilo. Un heterocicloalquil-cicloalquilo de anillo fusionado es un heterocicloalquilo fusionado a un cicloalquilo. Un heterocicloalquil-heterocicloalquilo de anillo fusionado es un heterocicloalquilo fusionado a otro heterocicloalquilo. Un heterocicloalquil-arilo de anillo fusionado, heterocicloalquil-heteroarilo de anillo fusionado, heterocicloalquil-cicloalquilo de anillo fusionado o heterocicloalquilheterocicloalquilo de anillo fusionado pueden estar cada uno independientemente no sustituido o sustituido con uno o más de los sustituyentes descritos en el presente documento.
El término "oxo", como se usa en este documento, significa un oxígeno que está doblemente unido a un átomo de carbono.
El término "alquilsulfonilo", como se usa en este documento, significa una fracción que tiene la fórmula -S(O2)-R', en la que R' es un grupo alquilo sustituido o no sustituido como se definió anteriormente. R' puede tener un número específico de carbonos (por ejemplo, "alquilsulfonilo C1-C4").
Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "cicloalquilo", "heterocicloalquilo", "arilo" y "heteroarilo") incluye formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan a continuación.
Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluidos los grupos a menudo denominados alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados, pero no limitados a, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R")=NRm, -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2N(R)("R"-NRSO2R'), -CN y -NO2 en un número que va desde cero a (2m'+1), en el que m' es el número total de átomos de carbono en dicho radical. R', R", R"' y R"" cada uno preferiblemente se refiere independientemente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos), grupos alquilo, alcoxi o tioalcoxi sustituidos o no sustituidos, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto utilizado en la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente al igual que cada grupo R', R", Rm y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos. Cuando R' y R" están unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 4, 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" incluye, pero no se limita a, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la discusión anterior de sustituyentes, un experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" pretende incluir grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos distintos de los grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, y similares).
De manera similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo son variados y se seleccionan entre, por ejemplo: -OR', -NR'R", -SR', -halógeno, - SiR'R"Rm, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"Rm, NR"C(O)2R', NRC(NR'R")=NRm, S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2N(R')(R", -NRSO2R'), -CN, -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, flúoroalcoxi-(Ci-C4) y fluoroalquilo-(Ci-C4), en un número que va desde cero hasta el número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y en el que R', R", Rm y R"" se seleccionan preferiblemente independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto utilizado en la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente al igual que cada grupo R', R", Rm y R"" cuando más de uno de estos grupos está presente.
Cuando una fracción está sustituida con un sustituyente R, el grupo puede denominarse "sustituido con R". Cuando una fracción está sustituida con R, la fracción está sustituida con al menos un sustituyente R y cada sustituyente R es opcionalmente diferente. Por ejemplo, cuando una fracción en este documento es alquilo sustituido o no sustituido con R1A, una pluralidad de sustituyentes R1A pueden estar unidos a la fracción alquilo en la que cada sustituyente R1A es opcionalmente diferente. Cuando una fracción sustituido con R está sustituida con una pluralidad de sustituyentes R, cada uno de los sustituyentes R se puede diferenciar en el presente documento usando un símbolo prima (') tal como R', R", etc. Por ejemplo, cuando una fracción es alquilo sustituido o no sustituido con R1A, y la fracción está sustituida con una pluralidad de sustituyentes R1A, la pluralidad de los sustituyentes R1A se pueden diferenciar como R1A', R1A", R1Am, etc. En algunas realizaciones, la pluralidad de los sustituyentes R es 3. En algunas realizaciones, la pluralidad de los sustituyentes R es 2.
En realizaciones, un compuesto como se describe en el presente documento puede incluir múltiples instancias de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R6A, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23y/u otros sustituyentes y variables. En tales realizaciones, cada variable puede ser opcionalmente diferente y etiquetarse apropiadamente para distinguir cada grupo para mayor claridad. Por ejemplo, cuando cada R6A es diferente, pueden denominarse, por ejemplo, como R6A1, R6A2, R6A3o R6A4, respectivamente, en las que la definición de R6A es asumido por R6A1, R6A2, R6A3, y/o R6A4. Las variables utilizadas dentro de una definición de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R6A, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23, y/u otras variables que aparecen en múltiples instancias y son diferentes de manera similar pueden etiquetarse apropiadamente de manera similar para distinguir cada grupo para mayor claridad.
Se pueden unir opcionalmente dos o más sustituyentes para formar grupos arilo, heteroarilo, cicloalquilo o heterocicloalquilo. Dichos sustituyentes denominados formadores de anillos se encuentran típicamente, aunque no necesariamente, unidos a una estructura de base cíclica. En una realización, los sustituyentes formadores de anillos se unen a miembros adyacentes de la estructura base. Por ejemplo, dos sustituyentes formadores de anillos unidos a miembros adyacentes de una estructura base cíclica crean una estructura de anillo fusionado. En otra realización, los sustituyentes formadores de anillos se unen a un solo miembro de la estructura base. Por ejemplo, dos sustituyentes formadores de anillos unidos a un solo miembro de una estructura base cíclica crean una estructura espirocíclica. En otra realización más, los sustituyentes formadores de anillos están unidos a miembros no adyacentes de la estructura base.
Dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden formar opcionalmente un anillo de fórmula -TC(O)-(CRR')q-U-, en la que T y U son independientemente -NR-, -O-, -CRR'-, o un enlace sencillo, y q es un número entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo se pueden reemplazar opcionalmente con un sustituyente de fórmula -A-(CH2)r-B-, en la que A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'-, o un enlace sencillo, y r es un número entero de 1 a 4. Uno de los enlaces sencillos del nuevo anillo así formado puede reemplazarse opcionalmente por un enlace doble. Alternativamente, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden opcionalmente reemplazarse con un sustituyente de fórmula -(CRR%-X'-(C"R"Rm)d-, cuando las variables s y d son independientemente enteros de 0 a 3, y X' es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, o S(O)2NR'-. Los sustituyentes R, R', R" y R'" se seleccionan preferiblemente independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido.
Como se usa en este documento, los términos "heteroátomo" o "heteroátomo de anillo" pretenden incluir oxígeno (O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P) y silicio (Si).
Un "grupo sustituyente", como se usa en este documento, significa un grupo seleccionado de las siguientes fracciones:
(A) oxo, halógeno, -CF3 , -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2 , -NO2, -SH, -SO2C -SO3H, -SO4H, -SO2NH2 , -NHNH2, -ONH2 , -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O)NH2 , -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3 , -OCHF2, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y
(B) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado entre:
(i) oxo, halógeno, -CF3 , -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2 , -SH, -SO2CI, -SO3H, - SO4H, -SO2NH2, -NHNH2 , -ONH2 , -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O)NH2 , -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3 , -OCHF2, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y
(ii) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado entre:
(a) oxo, halógeno, -CF3, -CN, -OH, -NH2 , -COOH, -CONH2 , -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2 , -ONH2 , -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O)NH2 , -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3 , -OCHF2, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y
(b) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado entre: oxo, halógeno, -CF3 , -CN, -OH, -NH2 , -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2 , -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2 , -NHC=(O)NH2 , -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3 , -OCHF2 , alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido.
Un "sustituyente de tamaño limitado" o "grupo sustituyente de tamaño limitado", como se usa en el presente documento, significa un grupo seleccionado de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en el que cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada arilo sustituido o no sustituido es un arilo C6-C10 sustituido o no sustituido, y cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido o no sustituido.
Un "sustituyente inferior" o "grupo sustituyente inferior", como se usa en este documento, significa un grupo seleccionado de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en el que cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C3-C7 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros sustituido o no sustituido, cada arilo sustituido o no sustituido es un arilo C6-C10 sustituido o no sustituido, y cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo de 5 a 9 miembros sustituido o no sustituido.
En algunas realizaciones, cada grupo sustituido descrito en los compuestos de este documento está sustituido con al menos un grupo sustituyente. Más específicamente, en algunas realizaciones, cada alquilo sustituido, heteroalquilo sustituido, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo sustituido, arilo sustituido, heteroarilo sustituido, alquileno sustituido, heteroalquileno sustituido, cicloalquileno sustituido, heterocicloalquileno sustituido, arileno sustituido y/o heteroarileno sustituido descritos en los compuestos en este documento están sustituidos con al menos un grupo sustituyente. En otras realizaciones, al menos uno o todos estos grupos están sustituidos con al menos un grupo sustituyente de tamaño limitado. En otras realizaciones, al menos uno o todos estos grupos están sustituidos con al menos un grupo sustituyente inferior.
En otras realizaciones de los compuestos del presente documento, cada alquilo sustituido o no sustituido puede ser un alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada arilo sustituido o no sustituido es un arilo C6-C10 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones de los compuestos del presente documento, cada alquileno sustituido o no sustituido es un alquileno C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquileno sustituido o no sustituido es un heteroalquileno de 2 a 20 sustituido o no sustituido miembros, cada cicloalquileno sustituido o no sustituido es un cicloalquileno C3-C8 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquileno sustituido o no sustituido es un heterocicloalquileno de 3 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada arileno sustituido o no sustituido es un arileno C6-C10 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarileno sustituido o no sustituido es un heteroarileno de 5 a 10 miembros sustituido o no sustituido.
En algunas realizaciones, cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido o, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C3-C7 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros sustituido o no sustituido, cada arilo sustituido o no sustituido es un arilo C6-C10 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo de 5 a 9 miembros sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, cada alquileno sustituido o no sustituido es un alquileno C1-C8 sustituido o no sustituido, cada heteroalquileno sustituido o no sustituido es un heteroalquileno de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquileno sustituido o no sustituido es un cicloalquileno C3-C7 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquileno sustituido o no sustituido es un heterocicloalquileno de 3 a 7 miembros sustituido o no sustituido, cada arileno sustituido o no sustituido es un arileno C6-C10 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarileno sustituido o no sustituido es un heteroarileno de 5 a 9 miembros sustituido o no sustituido. En
algunas realizaciones, el compuesto es una especie química expuesta en la sección de Ejemplos, figuras o tablas a continuación.
Los términos "un" o "uno, una", como se usan en este documento, significan uno o más. Además, la frase "sustituido con uno, una", como se usa en este documento, significa que el grupo especificado puede estar sustituido con uno o más de cualquiera o todos los sustituyentes mencionados. Por ejemplo, cuando un grupo, tal como un grupo alquilo o heteroarilo, está "sustituido con un alquilo C1-C2 0 no sustituido, o heteroalquilo de 2 a 20 miembros no sustituido", el grupo puede contener uno o más alquilos C1-C20 no sustituidos y/o uno o más heteroalquilos de 2 a 20 miembros no sustituidos. Además, cuando una fracción está sustituida con un sustituyente R, el grupo puede denominarse "sustituido con R". Cuando una fracción está sustituida con R, la fracción está sustituida con al menos un sustituyente R y cada sustituyente R es opcionalmente diferente.
El símbolo " <svw "' denota el punto de unión de una fracción química al resto de una molécula o fórmula química.
Las descripciones de los compuestos utilizados en la presente invención están limitadas por los principios de enlace químico conocidos por los expertos en la técnica. En consecuencia, cuando un grupo puede estar sustituido por uno o más de varios sustituyentes, dichas sustituciones se seleccionan para cumplir con los principios de enlace químico y producir compuestos que no son inherentemente inestables y/o que serían conocidos por alguien capacitado en la técnica probablemente sean inestables en condiciones ambientales, tales como condiciones acuosa, neutra y varias condiciones fisiológicas conocidas. Por ejemplo, un heterocicloalquilo o heteroarilo se une al resto de la molécula a través de un heteroátomo de anillo de acuerdo con los principios de enlace químico conocidos por los expertos en la técnica, evitando así compuestos inherentemente inestables.
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia. Vease, por ejemplo, Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989).
Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos utilizados con frecuencia en el presente documento y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación.
"Ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria, bicatenaria o múlticatenaria, o complementos de los mismos. El término "polinucleótido" se refiere a una secuencia lineal de nucleótidos. El término "nucleótido" se refiere típicamente a una sola unidad de un polinucleótido, es decir , un monómero. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o versiones modificadas de los mismos. Los ejemplos de polinucleótidos contemplados en este documento incluyen ADN monocatenario y bicatenario, ARN monocatenario y bicatenario (incluido ARNip) y moléculas híbridas que tienen mezclas de ADN y ARN monocatenario y bicatenario. Los ácidos nucleicos pueden ser lineales o ramificados. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser una cadena lineal de nucleótidos o los ácidos nucleicos pueden estar ramificados, por ejemplo, de manera que los ácidos nucleicos comprendan uno o más brazos o ramas de nucleótidos. Opcionalmente, los ácidos nucleicos ramificados se ramifican repetidamente para formar estructuras de orden superior tales como dendrímeros y similares.
Los ácidos nucleicos, incluidos los ácidos nucleicos con una cadena principal de fosfotioato, pueden incluir una o más fracciones reactivas. Como se usa en este documento, el término fracción reactiva incluye cualquier grupo capaz de reaccionar con otra molécula, por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido a través de interacciones covalentes, no covalentes u otras. A modo de ejemplo, el ácido nucleico puede incluir una fracción reactiva de aminoácidos que reacciona con un aminoácido en una proteína o polipéptido a través de una interacción covalente, no covalente o de otro tipo.
Los términos también abarcan ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de la estructura modificada, que son sintéticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, derivados de fosfodiéster que incluyen, por ejemplo, fosforamidato, fosforodiamidato, fosforotioato (también conocido como fosfotioato), fosforoditioato, ácidos fosfonocarboxílicos, fosfonocarboxilatos, ácido fosfonoacético, ácido fosfonofórmico, metilfosfonato, borofosfonato, o enlaces O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press); y cadenas principales y enlaces peptídicos de ácidos nucleicos. Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con cadenas principales positivas; cadenas principales no iónicas, azúcares modificados y cadenas principales no ribosa (por ejemplo, oligos morfolino fosforodiamidato o ácidos nucleicos bloqueados (LNA)), incluidos los descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,235,033 y 5,034,506, y los Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se incluyen dentro de una definición de ácidos nucleicos. Las modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato se pueden realizar por una variedad de razones, por ejemplo, para aumentar la estabilidad y la vida media de dichas moléculas en entornos fisiológicos o como sondas en un biochip. Se pueden preparar mezclas de ácidos nucleicos y análogos de origen natural; alternativamente, pueden prepararse mezclas de
diferentes análogos de ácidos nucleicos y mezclas de ácidos nucleicos y análogos de origen natural. En realizaciones, los enlaces intemucleotídicos en el ADN son fosfodiéster, derivados de fosfodiéster o una combinación de ambos.
Los ácidos nucleicos pueden incluir secuencias no específicas. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia no específica" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene una serie de residuos que no están diseñados para ser complementarios o son solo parcialmente complementarios a cualquier otra secuencia de ácido nucleico. A modo de ejemplo, una secuencia de ácido nucleico no específica es una secuencia de residuos de ácido nucleico que no funciona como un ácido nucleico inhibidor cuando entra en contacto con una célula u organismo. Un "ácido nucleico inhibidor" es un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, polímero de análogos de nucleótidos) que es capaz de unirse a un ácido nucleico diana (por ejemplo, un ARNm traducible a una proteína) y reducir la transcripción del ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm de ADN) o reducir la traducción del ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm) o alterar el empalme del transcrito (por ejemplo, oligo de morfolino monocatenario).
Un "ácido nucleico u oligonucleótido etiquetado" es uno que está unido, ya sea covalentemente, a través de un enlazador o enlace químico, o no covalentemente, a través de enlaces iónicos, van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a una etiqueta de manera que la presencia del ácido nucleico puede detectarse detectando la presencia de la etiqueta detectable unida al ácido nucleico. Alternativamente, un método que usa interacciones de alta afinidad puede lograr los mismos resultados cuando uno de un par de compañeros de unión se une al otro, por ejemplo, biotina, estreptavidina. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye una etiqueta detectable, como se describe en el presente documento y se conoce generalmente en la técnica.
El término "sonda" o "cebador", como se usa en este documento, se define como uno o más fragmentos de ácido nucleico cuya hibridación específica con una muestra puede detectarse. Una sonda o cebador puede tener cualquier longitud dependiendo de la técnica particular para la que se utilizará. Por ejemplo, los cebadores de PCR generalmente tienen entre 10 y 40 nucleótidos de longitud, mientras que las sondas de ácido nucleico para, por ejemplo, una transferencia Southern, pueden tener una longitud de más de cien nucleótidos. La sonda puede no estar etiquetada o etiquetada como se describe a continuación para que se pueda detectar su unión a la diana o muestra. La sonda se puede producir a partir de una fuente de ácidos nucleicos a partir de una o más porciones particulares (preseleccionadas) de un cromosoma, por ejemplo, uno o más clones, un cromosoma completo aislado o un fragmento de cromosoma, o una colección de productos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La longitud y complejidad del ácido nucleico fijado sobre el elemento diana no es crítica para la invención. Un experto en la materia puede ajustar estos factores para proporcionar una hibridación y una producción de señales óptimas para un procedimiento de hibridación dado, y para proporcionar la resolución requerida entre diferentes genes o ubicaciones genómicas.
La sonda también puede ser ácidos nucleicos aislados inmovilizados sobre una superficie sólida (por ejemplo, nitrocelulosa, vidrio, cuarzo, portaobjetos de sílice fundida), como en una matriz. En algunas realizaciones, la sonda puede ser miembro de una matriz de ácidos nucleicos como se describe, por ejemplo, en el documento WO 96/17958. También se pueden utilizar para este propósito técnicas capaces de producir matrices de alta densidad (véase, por ejemplo, Fodor (1991) Science 767-773; Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; patente de los Estados Unidos No. 5,143,854).
Las palabras "complementario" o "complementariedad" se refieren a la capacidad de un ácido nucleico en un polinucleótido para formar un par de bases con otro ácido nucleico en un segundo polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia A-G-T es complementaria a la secuencia T-C-A. La complementariedad puede ser parcial, en la que solo algunos de los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases, o completa, cuando todos los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases.
El ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o líder secretor está operativamente unido al ADN de un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen están próximas entre sí y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
El término "gen" significa el segmento de ADN involucrado en la producción de una proteína; incluye regiones que preceden y siguen a la región codificante (líder y cola) así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones). El líder, la cola y los intrones incluyen elementos reguladores que son necesarios durante la transcripción y traducción de un gen. Además, un "producto génico de proteína" es una proteína expresada a partir de un gen particular.
La palabra "expresión" o "expresado" como se usa en este documento en referencia a un gen significa el producto transcripcional y/o traduccional de ese gen. El nivel de expresión de una molécula de ADN en una célula puede
determinarse basándose en la cantidad de ARNm correspondiente que está presente dentro de la célula o en la cantidad de proteína codificada por ese ADN producido por la célula. El nivel de expresión de moléculas de ácido nucleico no codificantes (por ejemplo, ARNip) puede detectarse mediante métodos estándar de PCR o transferencia Northern bien conocidos en la técnica. Véase, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1 18.88.
El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heteróloga o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, subexpresan o no expresan en absoluto. Las células y plantas transgénicas son aquellas que expresan un gen o secuencia codificante heteróloga, típicamente como resultado de métodos recombinantes.
El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestos para producir un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una fusión).
El término "exógeno" se refiere a una molécula o sustancia (por ejemplo, un compuesto, ácido nucleico o proteína) que se origina fuera de una determinada célula u organismo. Por ejemplo, un "promotor exógeno" como se denomina en este documento es un promotor que no se origina en la planta por la que se expresa. Por el contrario, el término "endógeno" o "promotor endógeno" se refiere a una molécula o sustancia que es nativa o se origina dentro de una célula u organismo dado.
El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, indica que el ácido nucleico o proteína está esencialmente libre de otros componentes celulares con los que está asociado en el estado natural. Puede estar, por ejemplo, en un estado homogéneo y puede estar en una solución seca o acuosa. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada.
El término "purificado" indica que un ácido nucleico o una proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. En algunas realizaciones, el ácido nucleico o proteína es al menos 50% puro, opcionalmente al menos 65% puro, opcionalmente al menos 75% puro, opcionalmente al menos 85% puro, opcionalmente al menos 95% puro y opcionalmente al menos 99% puro.
El término "aislado" también puede referirse a una célula o células de muestra. Una célula aislada o células de muestra son un solo tipo de célula que está sustancialmente libre de muchos de los componentes que normalmente acompañan a las células cuando se encuentran en su estado nativo o cuando se retiran inicialmente de su estado nativo. En ciertas realizaciones, una muestra de célula aislada retiene aquellos componentes de su estado natural que se requieren para mantener la célula en un estado deseado. En algunas realizaciones, una célula aislada (por ejemplo purificada, separada) o células aisladas, son células que son sustancialmente el único tipo de célula en una muestra. Una muestra de células purificadas puede contener al menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de un tipo de célula. Una muestra de células aisladas puede obtenerse mediante el uso de un marcador e celular o una combinación de marcadores celulares, cualquiera de los cuales es exclusivo de un tipo de célula en una muestra de células sin purificar. En algunas realizaciones, las células se aíslan mediante el uso de un clasificador de células. En algunas realizaciones, se utilizan anticuerpos contra proteínas celulares para aislar células.
Como se usa en este documento, el término "conjugado" se refiere a la asociación entre átomos o moléculas. La asociación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, un conjugado entre un ácido nucleico y una proteína puede ser directo, por ejemplo, por enlace covalente, o indirecto, por ejemplo, por enlace no covalente (por ejemplo, interacciones electrostáticas (por ejemplo, enlace iónico, enlace de hidrógeno, enlace de halógeno), interacciones de van der Waals (por ejemplo, dipolo-dipolo, dipolo inducido por dipolo, dispersión de London), apilamiento de anillos (efectos pi), interacciones hidrófobas y similares). En realizaciones, los conjugados se forman usando química de conjugados que incluyen, pero no se limitan a, sustituciones nucleofílicas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, ésteres activos), sustituciones electrofílicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a carbonocarbono y enlaces múltiples carbono-heteroátomo (por ejemplo, reacción de Michael, adición de Diels-Alder). Estas y otras reacciones útiles se analizan, por ejemplo, en March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3a Ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, DC, 1982. En realizaciones, la micropartícula se une de forma no covalente a un soporte sólido mediante una reacción química no covalente entre un componente de la micropartícula y un componente del soporte sólido. En otras realizaciones, la micropartícula incluye una o más fracciones reactivas, por ejemplo, una fracción reactiva
covalente, como se describe en el presente documento (por ejemplo, una fracción reactiva amina). En otras realizaciones, la micropartícula incluye un enlazador con una o más fracciones reactivas, por ejemplo, una fracción reactiva covalente, como se describe en el presente documento (por ejemplo, una fracción reactiva amina).
Las fracciones reactivas útiles o los grupos funcionales reactivos usados para las químicas conjugadas en este documento incluyen, por ejemplo:
(a) grupos carboxilo y diversos derivados de los mismos, incluidos, entre otros, ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxibenzotriazol, haluros de ácido, acilimidazoles, tioésteres, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de alquilo, alquenilo, alquinilo y aromáticos;
(b) grupos hidroxilo que se pueden convertir en ésteres, éteres, aldehídos, etc.
(c) grupos haloalquilo en los que el haluro se puede desplazar posteriormente con un grupo nucleofílico tal como, por ejemplo, una amina, un anión carboxilato, un anión tiol, un carbanión o un ion alcóxido, lo que da como resultado la unión covalente de un nuevo grupo en el sitio del átomo de halógeno;
(d) grupos dienófilos que son capaces de participar en reacciones de Diels-Alder tales como, por ejemplo, grupos maleimido;
(e) grupos aldehído o cetona de manera que la posterior derivatización sea posible mediante la formación de derivados de carbonilo tales como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas, o mediante mecanismos tales como la adición de Grignard o la adición de alquil-litio;
(f) grupos haluro de sulfonilo para la posterior reacción con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas;
(g) grupos tiol, que pueden convertirse en disulfuros, reaccionar con haluros de acilo o unirse a metales tales como el oro;
(h) grupos amina o sulfhidrilo, que pueden estar, por ejemplo, acilados, alquilados u oxidados;
(i) alquenos, que pueden sufrir, por ejemplo, cicloadiciones, acilación, adición de Michael, etc.;
(j) epóxidos, que pueden reaccionar con, por ejemplo, aminas y compuestos hidroxilo;
(k) fosforamiditas y otras fracciones de reactivos estándar útiles en la síntesis de ácidos nucleicos;
(l) unión de óxido de silicio metálico;
(m) unión de metales a grupos de fósforo reactivos (por ejemplo, fosfinas) para formar, por ejemplo, enlaces diéster de fosfato; y
(n) sulfonas, por ejemplo, vinilsulfona.
Las fracciones reactivas se pueden elegir de tal manera que no participen en, o interfieran con, la estabilidad química de las proteínas o ácidos nucleicos descritos en este documento. A modo de ejemplo, los ácidos nucleicos pueden incluir una vinilsulfona u otra fracción reactiva (por ejemplo, maleimida). Opcionalmente, los ácidos nucleicos pueden incluir una fracción reactiva que tiene la fórmula S-S-R. R puede ser, por ejemplo, una fracción protectora. Opcionalmente, R es hexanol. Como se usa en este documento, el término hexanol incluye compuestos con la fórmula C6H13OH e incluye, 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol, 2-metil-1-pentanol, 3-metil-1-pentanol, 4-metil-1-pentanol, 2-metil-2-pentanol, 3-metil-2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-metil-3-pentanol, 3-metil-3-pentanol, 2,2-dimetil-1-butanol, 2,3-dimetil-1-butanol, 3,3-dimetil-1-butanol, 2,3-dimetil-2-butanol, 3,3-dimetil-2-butanol y 2-etil-1-butanol. Opcionalmente, R es 1-hexanol.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" significa un intervalo de valores que incluye el valor especificado, que una persona con experiencia normal en la técnica consideraría razonablemente similar al valor especificado. En realizaciones, el término "aproximadamente" significa dentro de una desviación estándar usando medidas generalmente aceptables en la técnica. En realizaciones, aproximadamente significa un intervalo que se extiende hasta /-10% del valor especificado. En realizaciones, aproximadamente significa el valor especificado.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos, en el que el polímero puede conjugarse con una fracción que no consta de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. Los términos se aplican a péptidos macrocíclicos, péptidos que han sido modificados con funcionalidad no peptídica, peptidomiméticos, poliamidas y macrolactamas. Una "proteína de fusión" se refiere a una proteína quimérica que codifica dos o más secuencias de proteínas separadas que se expresan de forma recombinante como una fracción única.
El término "peptidilo" y "fracción peptidilo" significa un péptido monovalente.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos sintéticos y de origen natural, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos naturales son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que posteriormente se modifican, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales de péptidos modificados, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido natural. Los términos "aminoácido de origen no natural" y "aminoácido no natural" se refieren a análogos de aminoácidos, aminoácidos sintéticos y miméticos de aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza.
Se puede hacer referencia a los aminoácidos en el presente documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Asimismo, se puede hacer referencia a los nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
Las "variantes modificadas de forma conservadora" se aplican tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que se especifica una alanina mediante un codón, el codón se puede alterar en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en este documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a las secuencias de sonda reales.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, agrega o elimina un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora" en la que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas de forma conservadora son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la divulgación.
Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).
El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntico o el residuo de aminoácido en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad sobre una región específica, por ejemplo, de las secuencias polipeptídicas completas según se divulgan o dominios individuales de los polipéptidos tal como se divulgan), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineación manual e inspección visual. Entonces se dice que tales secuencias son "sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que tiene al
menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, o más preferiblemente sobre una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos de longitud.
Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se ingresan en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Se pueden utilizar parámetros de programa predeterminados o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación", como se usa en este documento, incluye referencia a un segmento de cualquiera de las posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en, por ejemplo, una secuencia de longitud completa o de 20 a 600, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 aminoácidos o nucleótidos en los que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alineen de manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Se puede realizar una alineación óptima de secuencias para la comparación, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Apl. Maths. 2: 482c, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85: 2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen una puntuación umbral T con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., citado anteriormente). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N(puntuación de penalización por residuos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada cae en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN(para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como predeterminada una longitud de palabra de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. u U. 89: 10915) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90: 5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0.2, más preferiblemente menos de aproximadamente 0.01 y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 0.001.
Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo de forma cruzada con los anticuerpos producidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por lo tanto, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe a continuación. Otra indicación más de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que se pueden usar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.
"Poner en contacto" se usa de acuerdo con su significado ordinario y se refiere al proceso de permitir que al menos dos especies distintas (por ejemplo, compuestos químicos que incluyen biomoléculas o células) se vuelvan lo suficientemente proximales para reaccionar, interactuar o tocarse físicamente. Debe apreciarse, sin embargo, el producto de reacción resultante se puede producir directamente a partir de una reacción entre los reactivos añadidos o de un compuesto intermedio de uno o más de los reactivos añadidos que se pueden producir en la mezcla de reacción.
El término "poner en contacto" puede incluir permitir que dos especies reaccionen, interactúen o se toquen físicamente, en el que las dos especies pueden ser, por ejemplo, un dominio del ligando como se describe en el presente documento y un enlazador del ligando. En realizaciones, el contacto incluye, por ejemplo, permitir que un dominio del ligando como se describe en el presente documento interaccione con un enlazador del ligando.
Una muestra o valor de "control" se refiere a una muestra que sirve como referencia, generalmente una referencia conocida, para compararla con una muestra de prueba. Por ejemplo, se puede tomar una muestra de prueba de una condición de prueba, por ejemplo, en presencia de un compuesto de prueba, y en comparación con muestras de condiciones conocidas, por ejemplo, en ausencia del compuesto de prueba (control negativo), o en presencia de un compuesto conocido (control positivo). Un control también puede representar un valor promedio obtenido de una serie de pruebas o resultados. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden diseñar controles para la evaluación de cualquier número de parámetros. Por ejemplo, se puede diseñar un control para comparar el beneficio terapéutico basado en datos farmacológicos (por ejemplo, vida media) o medidas terapéuticas (por ejemplo, comparación de efectos secundarios). Un experto en la técnica comprenderá qué controles estándar son los más apropiados en una situación dada y podrá analizar los datos basándose en comparaciones con los valores de control estándar. Los controles estándar también son valiosos para determinar la significancia (por ejemplo, significancia estadística) de los datos. Por ejemplo, si los valores de un parámetro dado varían ampliamente en los controles estándar, la variación en las muestras de prueba no se considerará significativa.
Una "etiqueta" o una "fracción detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Por ejemplo, las etiquetas útiles incluyen 32P, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas u otras entidades que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando una radioetiqueta en un péptido o anticuerpo específicamente reactivo con un péptido diana. Puede emplearse cualquier método apropiado conocido en la técnica para conjugar un anticuerpo con la etiqueta, por ejemplo, usando los métodos descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.
Una "proteína o polipéptido etiquetado" es uno que está unido, ya sea covalentemente, a través de un enlazador o un enlace químico, o no covalentemente, a través de enlaces iónicos, de van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a una etiqueta de modo que la presencia de la proteína o el polipéptido etiquetados pueden detectarse detectando la presencia de la etiqueta unida a la proteína o polipéptido etiquetado. Alternativamente, los métodos que utilizan interacciones de alta afinidad pueden lograr los mismos resultados cuando uno de un par de compañeros de unión se une al otro por ejemplo, biotina, estreptavidina.
"Muestra biológica" o "muestra" se refiere a materiales obtenidos o derivados de un sujeto o paciente. Una muestra biológica incluye secciones de tejidos, tales como muestras de biopsia y autopsia, y secciones congeladas tomadas con fines histológicos. Tales muestras incluyen fluidos corporales tales como sangre y fracciones o productos sanguíneos (por ejemplo, suero, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y similares), esputo, tejido, células cultivadas (por ejemplo, cultivos primarios, explantes y células transformadas) heces, orina, líquido sinovial, tejido articular, tejido sinovial, sinoviocitos, sinoviocitos similares a fibroblastos, sinoviocitos similares a macrófagos, células inmunes, células hematopoyéticas, fibroblastos, macrófagos, células T, etc. Una muestra biológica se obtiene típicamente de un organismo eucariota, tal como un mamífero tal como un primate, por ejemplo, un chimpancé o un ser humano; vaca; perro; gato; un roedor, por ejemplo, cobaya, rata, ratón; conejo; o un ave; reptil; o pez.
Una "célula", como se usa en este documento, se refiere a una célula que lleva a cabo una función metabólica o de otro tipo suficiente para preservar o replicar su ADN genómico. Una célula puede identificarse mediante métodos bien conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, la presencia de una membrana intacta, la tinción con un tinte particular, la capacidad de producir progenie o, en el caso de un gameto, la capacidad de combinarse con un segundo gameto para producir una descendencia viable. Las células pueden incluir células procariotas y eucariotas. Las células procariotas incluyen, pero no se limitan a, bacterias. Las células eucariotas incluyen, pero no se limitan a, células de levadura y células derivadas de plantas y animales, por ejemplo, mamíferos, insectos (por ejemplo, spodoptera) y células humanas.
El término "anticuerpo" se usa de acuerdo con su significado comúnmente conocido en la técnica. Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a Vh-Ch1 por un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de bisagra, convirtiendo así el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente
Fab con parte de la región de bisagra (véase Fundamental Immunology (Paul ed., 3a ed. 1993). Si bien varios fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que dichos fragmentos se pueden sintetizar de nuevo ya sea químicamente o usando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, como se usa en este documento, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación de anticuerpos completos, o aquellos sintetizados de nuevo usando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de cadena sencilla) o aquellos identificados usando bibliotecas de presentación de fagos (vease, por ejemplo , McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)).
Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, se puede utilizar cualquier técnica conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., páginas 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Los anticuerpos "monoclonales" (mAb) se refieren a anticuerpos derivados de un solo clon. Técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de los Estados Unidos No. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos contra polipéptidos usados en esta invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos tales como otros mamíferos para expresar anticuerpos humanizados. Alternativamente, la tecnología de presentación de fagos se puede utilizar para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10: 779-783 (1992)).
Un "soporte sólido" como se proporciona en este documento se refiere a cualquier material que pueda modificarse para contener sitios individuales discretos apropiados para la unión o asociación de una micropartícula como se proporciona en este documento, incluidas las realizaciones del mismo, y es susceptible de los métodos proporcionados en el presente documento, incluidas las realizaciones del mismo. Los ejemplos de soportes sólidos incluyen, sin limitación, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado (por ejemplo, vidrio funcionalizado con carboximetildextrano), plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, TeflonMR, etc.), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, materiales compuestos, cerámicas y resinas plásticas, sílice o materiales a base de sílice, incluidos el silicio y el silicio modificado (por ejemplo, silicio modelado), carbono, metales, cuarzo (por ejemplo, cuarzo modelado), vidrios inorgánicos, plásticos, haces de fibras ópticas y una variedad de otros polímeros. En general, los sustratos permiten la detección óptica y no fluorescen de manera apreciable.
El soporte sólido proporcionado en el presente documento, incluidas las realizaciones del mismo, puede formar parte de una micromatriz de transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET). El soporte sólido puede ser plano (por ejemplo, sustratos planos como vidrio, poliestireno y otros plásticos y acrílicos). Aunque un experto en la técnica apreciará que también se pueden usar otras configuraciones de soportes sólidos, por ejemplo, se pueden usar configuraciones tridimensionales. El soporte sólido puede modificarse para contener sitios individuales discretos (también denominados en el presente documento "pocillos") para la unión de micropartículas. Estos sitios generalmente incluyen sitios físicamente alterados, es decir, configuraciones físicas como pocillos o pequeñas depresiones en el sustrato que pueden retener las micropartículas. Los pocillos se pueden formar usando una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, fotolitografía, técnicas de estampación, técnicas de moldeo y técnicas de micrograbado. Un experto en la materia apreciará que la técnica utilizada dependerá de la composición y forma del soporte sólido. En realizaciones, se realizan alteraciones físicas en una superficie del soporte sólido para producir pocillos. La profundidad requerida de los pocillos dependerá del tamaño de la micropartícula que se agregará al pocillo.
Una "micropartícula" como se usa en este documento se refiere a una partícula no plana (por ejemplo, esférica) que tiene un tamaño suficiente para unir moléculas (por ejemplo, se proporciona un primer, segundo o tercer enlazador, un dominio del ligando y un dominio de ácido nucleico), directamente o indirectamente, a través de enlaces covalentes o no covalentes. La micropartícula puede incluir cualquier material que sea capaz de proporcionar soporte físico a las moléculas (por ejemplo, se proporciona un primer, segundo o tercer enlazador, un dominio del ligando y un dominio de ácido nucleico) que están unidas a la superficie. El material generalmente es capaz de soportar condiciones relacionadas con la unión de las moléculas (por ejemplo, se proporciona un primer, segundo o tercer enlazador, un dominio del ligando y un dominio de ácido nucleico) a la superficie y cualquier tratamiento, manipulación o procesamiento posterior encontrado durante la realización de un ensayo. Los materiales pueden ser de origen natural, sintéticos o una modificación de un material de origen natural. Los materiales de micropartículas adecuados pueden incluir silicio, cerámica, plásticos (incluidos polímeros como, por ejemplo, poli(cloruro de vinilo), copolímeros de cicloolefina, agarosa, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno (PTFE o Teflon®), nailon, poli(butirato de vinilo)), germanio, arseniuro de galio, oro o plata, superficies de cobre o aluminio, superficies magnéticas, por ejemplo Fe, Mn, Ni, Co y sus óxidos, puntos cuánticos, por ejemplo, semiconductores III-V (GaN, GaP, GaAs, InP o InAs) o II-VI (ZnO, ZnS, CdS, CdSe o CdTe), o nanocristales de fluoruro dopados con Ln, nanomateriales oxídicos dopados con tierras raras utilizados solos o junto con otros materiales. Se pueden considerar materiales rígidos adicionales, tales como el vidrio, que incluye sílice y además incluye, por ejemplo, vidrio que está disponible como Bioglass. Otros materiales que pueden emplearse incluyen materiales porosos, tales como, por ejemplo, perlas de vidrio de poro controlado, Sepharose® perlada entrecruzada o resinas de agarosa, o copolímeros de bis-acrilamida y azalactona entrecruzadas. Otras perlas incluyen perlas de polímero, perlas de núcleo sólido, perlas paramagnéticas o microperlas. También se contempla cualquier otro material conocido en la técnica que sea capaz de tener una o más fracciones, como
cualquiera de una fracción reactiva de amino, carboxilo, tiol o hidroxilo, por ejemplo, incorporado en su superficie. En realizaciones, la micropartícula es una esfera basada en polímero magnético. En realizaciones, la micropartícula es una microesfera ProMagMR. En realizaciones, la dimensión más larga de la micropartícula es menor de 1000 μm.
Composiciones
Las composiciones proporcionadas en este documento son, entre otras, útiles para el ensamblaje de matrices altamente densas adecuadas para una variedad de métodos de cribado de alto rendimiento. Las micropartículas proporcionadas en este documento incluyen un dominio del ligando unido a través de un primer enlazador y un dominio de ácido nucleico unido a través de un segundo enlazador. Al unirse a un soporte sólido, las micropartículas proporcionadas en este documento, incluidas las realizaciones de las mismas, pueden formar parte de una matriz. El dominio del ligando y el dominio de ácido nucleico se sintetizan en la micropartícula usando métodos de química de agrupación dividida codificada. La química de agrupación dividida codificada es un método bien conocido en la técnica y descrito, entre otros, por las siguientes referencias: Furka, A. et al., en t. J. Pept. Protein Res. 1991, 37, 487-493; Kit Lam et al., Nature, 1991; 354: 82-84; patentes de los Estados Unidos Nos. 6,060,596; 5,770,358; 6,368,874; 5,565,324; 6,936,477 y 5,573,905. Cada etapa de la síntesis del dominio del ligando (por ejemplo, síntesis de péptidos o compuestos químicos) está codificada en el dominio de ácido nucleico por una secuencia de ácido nucleico corta que sirve como código de barras de identificación. Por lo tanto, cada micropartícula incluye un dominio del ligando único y un dominio de ácido nucleico correspondiente que codifica secuencias de ácido nucleico específicas. Las secuencias de ácido nucleico específicas corresponden a los componentes básicos del dominio del ligando y el orden en el que se incorporaron en el dominio del ligando. Tras la hibridación de un ácido nucleico complementario a dicho dominio de ácido nucleico, se puede determinar (decodificar) la composición del dominio ligando y su ubicación en la matriz. Una vez que se ha determinado la identidad del dominio del ligando y su ubicación en la matriz, se elimina el dominio de ácido nucleico, el dominio del ligando puede modificarse adicionalmente y ponerse en contacto con un enlazador del ligando (por ejemplo, biomolécula).
En métodos de la invención, se proporciona una micropartícula. La micropartícula se une covalentemente a un dominio del ligando a través de un primer enlazador; y un dominio de ácido nucleico a través de un segundo enlazador, en el que el segundo enlazador es escindible y el primer enlazador no es escindible bajo la condición de que el segundo enlazador sea escindible.
En realizaciones, la micropartícula es una microperla. Una "microperla", como se denomina en el presente documento, es una micropartícula a base de polímero de forma aproximadamente esférica con un diámetro de aproximadamente 0.5 μm a aproximadamente 500 μm. El término "basado en polímero" o "polimérico" como se proporciona en el presente documento se refiere a una micropartícula o microperla que incluye al menos un compuesto polimérico (por ejemplo, polietilenglicoles, polietilenimidas, polisacáridos, polipéptidos o polinucleótidos). En realizaciones, la microperla es una microesfera ProMagMR. En realizaciones, la microperla es una microperla magnética basada en polímero.
La micropartícula proporcionada en el presente documento, incluidas las realizaciones de la misma, puede ser inferior a 200 μm. Cuando la micropartícula tiene menos de 200 μm, un experto en la técnica reconocerá inmediatamente que la dimensión más larga (por ejemplo, diámetro o longitud) de una micropartícula es menor de 200 μm. En otras realizaciones, la micropartícula tiene aproximadamente 20 nm. En algunas realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 0.02 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 0.05 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 0.1 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 0.5 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 2 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 5 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 15 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 20 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 25 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 30 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 35 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 40 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 45 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 55 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 60 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 65 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 70 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 75 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 80 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 85 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 90 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 95 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 101 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 102 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 105 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 110 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 115 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 120 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 125 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 130 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 135 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 140 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 145 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 150 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 155 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 160 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 165 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 170 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 175 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 180 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 185 μm a aproximadamente 200 μm, de aproximadamente 190 μm a aproximadamente 200 μm, o de aproximadamente 195 μm a aproximadamente 200 μm.
En algunas realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01 |jm a aproximadamente 100 |jm, de aproximadamente 0.02 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 0.05 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 0.1 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 0.5 jm a aproximadamente 100 jm .
jm , de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 2 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 5 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 10 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 15 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 25 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 35 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 45 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 55 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 65 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 75 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 85 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 90 jm a aproximadamente 100 jm , o desde aproximadamente 95 jm a aproximadamente 100 jm .
En algunas realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 0.02 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 0.05 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 0.1 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 0.5 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 2 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 5 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 10 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 15 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 20 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 25 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 30 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 35 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 40 jm a aproximadamente 50 jm , o de aproximadamente 45 jm a aproximadamente 50 jm .
En algunas realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01 jm a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 0.02 jm a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 0.05 jm a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 0.1 jm a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 0.5 jm a aproximadamente 20 jm . jm , de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 2 jm a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 5 jm a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 10 jm a aproximadamente 20 jm , o de aproximadamente 15 jm a aproximadamente 20 jm .
En algunas realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.02 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.05 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.1 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.2 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.3 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.4 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.5 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.6 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.7 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.8 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 0.9 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 2 jm a aproximadamente 10 jm o de aproximadamente 5 jm a aproximadamente 10 jm .
En realizaciones, la micropartícula tiene aproximadamente 0.9 jm . En realizaciones, la micropartícula tiene un diámetro de aproximadamente 0.9 jm . En realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5,6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 o 200 jm . En otras realizaciones, la micropartícula tiene un diámetro de aproximadamente 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 , 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 o 200 jm . Los valores numéricos anteriores representan el tamaño de la micropartícula en jm .
En realizaciones, la micropartícula es una microperla funcionalizada. Cuando la micropartícula es una microperla funcionalizada, la micropartícula puede incluir cualquier fracción reactiva adecuada para las químicas conjugadas descritas en el presente documento. El término "funcionalizado" como se proporciona en este documento se refiere a un compuesto o dominio (por ejemplo, micropartícula, enlazador, dominio del ligando, dominio de ácido nucleico, secuencia de ácido nucleico) que incluye una fracción reactiva o grupos funcionales reactivos usados para químicas conjugadas como se describe en este documento. Por ejemplo, una microperla funcionalizada puede incluir una o más fracciones reactivas, tal como cualquiera de una fracción reactiva de amino, carboxilo, tiol o hidroxilo, incorporada en su superficie. En realizaciones, un primer grupo funcionalizado permite la unión del dominio ligando a través de un primer enlazador. En realizaciones, un segundo grupo funcionalizado permite la unión del dominio de ácido nucleico a través de un segundo enlazador. En realizaciones, el primer y el segundo grupo funcionalizado son independientemente diferentes. Por lo tanto, el dominio del ligando puede unirse a la micropartícula a través de un primer enlazador por conjugación a un grupo funcionalizado diferente al del dominio de ácido nucleico. En realizaciones, un tercer grupo funcionalizado conecta la micropartícula a un soporte sólido. Por lo tanto, en realizaciones, la micropartícula está unida covalentemente a un soporte sólido.
La micropartícula proporcionada en este documento puede incluir un polímero. En tal caso, los polímeros llevarán las fracciones reactivas para ser activadas. El polímero puede seleccionarse de cualquier clase adecuada de compuestos, por ejemplo, polietilenglicoles, polietilenimidas, polisacáridos, polipéptidos o polinucleótidos. En realizaciones, la micropartícula incluye bis-amino polietilenglicol 3000 e hidroxil-polietilenglicol 3000. En realizaciones, la micropartícula incluye una capa de polímero. La unión de los polímeros a la micropartícula puede efectuarse mediante una variedad de métodos que son fácilmente evidentes para una persona experta en la técnica. Por ejemplo, los polímeros que portan grupos triclorosililo o trisalcoxi se pueden hacer reaccionar con grupos hidroxilo en la micropartícula para formar enlaces siloxano. La unión a una micropartícula de oro o plata puede tener lugar a través de grupos tiol en el polímero. Alternativamente, el polímero se puede unir a través de una especie intermedia, tal como una monocapa autoensamblada de alcanotioles. El tipo de polímeros seleccionados y el método seleccionado para unir los polímeros a la micropartícula dependerán, por lo tanto, de que el polímero tenga la reactividad adecuada para unirse a la superficie de la micropartícula y de las propiedades de los polímeros con respecto a la adsorción inespecífica a, especialmente, ADN o péptidos. Las fracciones reactivas pueden estar presentes en el polímero o pueden añadirse al polímero mediante la adición de fracciones reactivas únicas o múltiples. Opcionalmente, se puede usar un brazo espaciador (por ejemplo, un enlazador) para proporcionar flexibilidad a la unión del dominio de ácido nucleico o dominio del ligando, lo que le permite interactuar con su entorno de una manera que minimiza el impedimento estérico con la micropartícula.
En realizaciones, la microperla funcionalizada es una microperla (polimérica) basada en polímero magnético. En realizaciones, la microperla es una microesfera ProMagMR. En realizaciones, la microperla incluye más de un polímero. En realizaciones, la microperla incluye un primer polímero y un segundo polímero, en el que el primer polímero y el segundo polímero son químicamente diferentes. En realizaciones, el primer polímero es bis-amino polietilenglicol 3000 y el segundo polímero es hidroxil-polietilenglicol 3000. En realizaciones, el primer polímero incluye una primer fracción reactiva y el segundo polímero incluye una segunda fracción reactiva. Una fracción reactiva como se menciona en el presente documento incluye cualquiera de las fracciones funcionales útiles para la química de conjugados como se describe en el presente documento. En realizaciones, la primera fracción reactiva es un grupo funcional amino y la segunda fracción reactiva es un grupo funcional hidroxilo. En realizaciones, el grupo funcional hidroxilo se hace reaccionar para formar una fracción azidoacetato. En realizaciones, la primera fracción reactiva (por ejemplo, grupo funcional amino) se hace reaccionar con una fracción reactivo (por ejemplo, Un grupo funcional carboxilo) del primer enlazador. En realizaciones, la fracción azidoacetato se hace reaccionar con una fracción reactiva (por ejemplo, un grupo funcional alquinilo) del segundo enlazador.
En realizaciones, la micropartícula es una microperla polimérica. En realizaciones, la micropartícula es un dendrímero. Un "dendrímero" como se denomina en este documento es una molécula polimérica esférica hecha de dos monómeros (por ejemplo, ácido acrílico y una diamina). Los dendrímeros son estructuras químicas definidas con precisión que consisten en una serie de capas químicas construidas sobre una pequeña molécula nuclear. Cada capa se compone de dos productos químicos, siempre en el mismo orden. En realizaciones, la micropartícula es un polímero ramificado. En realizaciones, la micropartícula es una microperla polimérica magnética. En realizaciones, la micropartícula es una microperla funcionalizada con carboximetildextrano. En realizaciones, la micropartícula es una microperla funcionalizada con polietilenglicol. En realizaciones adicionales, la microperla funcionalizada con polietilenglicol incluye aminas protegidas ortogonalmente. En realizaciones, la micropartícula es una microperla magnética. En realizaciones, la micropartícula es una microperla metálica. En realizaciones, la micropartícula es una microperla de sílice.
Como se muestra en la Figura 1, las micropartículas proporcionadas en el presente documento que incluyen realizaciones de las mismas pueden incluir una pluralidad de puntos de unión para la unión de una pluralidad de un primer, segundo y tercer enlazador. La micropartícula puede incluir una pluralidad de primeros puntos de unión para el primer enlazador que une el dominio del ligando, una pluralidad de segundos puntos de unión para el segundo enlazador que une el dominio de ácido nucleico y una pluralidad de terceros puntos de unión para el tercer enlazador que une la micropartícula a un soporte sólido. El número total de puntos de unión por micropartícula puede ser de aproximadamente 25 a 50 atomoles. Cuando el número total de puntos de unión corresponde al 100%, el número de primeros puntos de unión puede ser más de aproximadamente el 1% y menos de aproximadamente el 20%. Cuando el número total de puntos de unión corresponde al 100%, el número de segundos puntos de unión puede ser más de aproximadamente el 40% y menos de aproximadamente el 90%. Cuando el número total de puntos de unión corresponde al 100%, el número de terceros puntos de unión puede ser más de aproximadamente 0% y menos de aproximadamente 50%.
Un "dominio del ligando" como se proporciona en el presente documento es un dominio capaz de unirse a un enlazador del ligando (por ejemplo, analito, biomolécula). En realizaciones, el dominio del ligando es un péptido. En realizaciones, el dominio del ligando es un polipéptido. En realizaciones, el dominio del ligando incluye una glicoproteína de superficie o fragmentos de la misma. En realizaciones, el dominio del ligando tiene una secuencia de proteína correspondiente a la posición de aminoácidos 98-106 de la proteína hemaglutinina (HA) de influenza humana. En realizaciones, el dominio del ligando incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 17 o la s Eq ID NO: 18.
En realizaciones, el dominio del ligando incluye una fracción protectora unida a una fracción reactiva (por ejemplo, un grupo funcional carboxilo) del dominio del ligando. Como se usa en el presente documento, una fracción protectora es una fracción química unida covalentemente a un dominio del ligando que evita que el dominio del ligando se una a un enlazador del ligando, en el que la fracción de protección puede eliminarse, por ejemplo, por medios químicos cuando
se desee. En realizaciones, la fracción protectora es fluorenilmetiloxicarbonilo. En realizaciones, la fracción protectora es terc-butilo o carboxibencilo. Cuando el dominio del ligando incluye una fracción protectora, el dominio del ligando puede ser una poliamida protegida de cadena lateral. Cuando el dominio del ligando incluye una fracción protectora, también se puede denominar en el presente documento "intermedio sintético" o "precursor sintético". En realizaciones, la fracción protectora incluye una cadena lateral de aminoácidos. En realizaciones, la fracción protectora incluye un extremo amino (por ejemplo, un grupo terminal -NH2) o un extremo carboxi (por ejemplo, un grupo terminal -COOH). En realizaciones, la fracción protectora está unida a una cadena lateral de aminoácidos. En realizaciones, la fracción protectora se une a un extremo amino (por ejemplo, un grupo terminal -NH2) o un extremo carboxi (por ejemplo, un grupo terminal -COOH). En presencia de la fracción protectora, el dominio del ligando no es capaz de unirse a un enlazador del ligando. Por lo tanto, en realizaciones, el dominio del ligando incluye una fracción protectora y no está unida a un enlazador del ligando. Tras la eliminación de la fracción protectora y la reacción de la fracción reactiva se un dominio del ligando capaz de unirse se forma un enlazador del ligando.
El dominio del ligando proporcionado en este documento puede formarse usando cualquier síntesis unida a soporte de múltiples etapas compatible con la composición de la micropartícula y con la química de síntesis del dominio de ácido nucleico proporcionado en este documento. El dominio del ligando y el dominio de ácido nucleico pueden sintetizarse simultáneamente en la micropartícula. Alternativamente, el dominio de ácido nucleico se sintetiza en la micropartícula después de la síntesis del dominio del ligando. En realizaciones, la unión del dominio del ligando a través del primer enlazador se realiza antes de la unión del dominio nucleico a través del segundo enlazador. En realizaciones, la unión del dominio del ligando a través del primer enlazador se realiza simultáneamente con la unión del dominio nucleico a través del segundo enlazador. En realizaciones, el dominio del ligando es un péptido. En realizaciones, el dominio del ligando es una molécula pequeña. En realizaciones, el dominio del ligando es una proteína. En realizaciones, el dominio del ligando se une a un enlazador del ligando. El dominio del ligando puede estar unido a una fracción detectable (por ejemplo, una fracción fluorescente, una fracción luminiscente, una fracción colorimétrica, una fracción fosforescente, una fracción radiactiva o una fracción electroactiva).
Un "enlazador del ligando" como se usa en el presente documento se refiere a un agente (por ejemplo, átomo, molécula, ión, ión molecular, compuesto o partícula) capaz de unirse a un dominio del ligando proporcionado en el presente documento que incluye realizaciones del mismo. Los enlazadores del ligando incluyen, sin limitación, biomoléculas (por ejemplo, hormonas, citocinas, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, antígenos de la membrana celular y receptores (receptores neurales, hormonales, de nutrientes y de superficie celular o sus ligandos); células completas o lisados de las mismas (por ejemplo, células procariotas (por ejemplo, bacterias patógenas), eucariotas (por ejemplo, células tumorales de mamíferos); virus (por ejemplo, retrovirus, herpesvirus, adenovirus, lentivirus y esporas); productos químicos (por ejemplo, disolventes, polímeros, materiales orgánicos); moléculas terapéuticas (por ejemplo, medicamentos terapéuticos, drogas de abuso, antibióticos) o contaminantes ambientales (por ejemplo, pesticidas, insecticidas, toxinas). El enlazador del ligando puede ser una proteína, una mezcla de proteínas, un ácido nucleico, una mezcla de ácidos nucleicos, una molécula pequeña, una mezcla de moléculas pequeñas, un elemento, una mezcla de elementos, un polímero sintético, una mezcla de polímeros sintéticos, lisado celular. En realizaciones, el enlazador del ligando es una biomolécula. En realizaciones, la biomolécula es un ácido nucleico. En realizaciones, la biomolécula es una proteína (por ejemplo, un anticuerpo). En realizaciones, el enlazador del ligando es un anticuerpo. En realizaciones, el enlazador del ligando es un anticuerpo anti-HA. En realizaciones, el enlazador del ligando es un anticuerpo anti-Myc. En realizaciones, el dominio del ligando se une a un péptido de la SEQ ID NO: 17. En realizaciones, el dominio del ligando se une a un péptido de la SEQ ID NO: 18. En realizaciones, el enlazador del ligando se une a una fracción detectable. En realizaciones, la fracción detectable es una fracción fluorescente. En realizaciones, el enlazador del ligando es una molécula pequeña. En realizaciones, el dominio del ligando no está unido a un enlazador del ligando. Cuando el dominio del ligando no está unido a un enlazador del ligando, el dominio del ligando puede incluir una fracción protectora o cualquier otra modificación aplicable que haga inerte el dominio del ligando. El enlazador del ligando puede unirse a una fracción detectable (por ejemplo, una fracción fluorescente, una fracción luminiscente, una fracción colorimétrica, una fracción fosforescente, una fracción radiactiva o una fracción electroactiva).
Como se describió anteriormente, un "dominio de ácido nucleico" como se proporciona en este documento incluye una secuencia de ácido nucleico correspondiente a los bloques de construcción individuales del dominio del ligando y el orden en el que estos bloques de construcción se incorporan en dicho dominio del ligando. Por tanto, cada micropartícula incluye un dominio del ligando único y un dominio de ácido nucleico correspondiente que codifica secuencias de ácido nucleico específicas correspondientes a los bloques de construcción del dominio del ligando y el orden en el que se incorporaron en el dominio del ligando. Los dominios de ácido nucleico proporcionados en el presente documento también se denominan "etiqueta" o "etiqueta codificante". En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye una secuencia de ácido nucleico. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico tiene una longitud de aproximadamente 18 pares de bases. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico tiene una longitud de aproximadamente 20 pares de bases. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico es de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 79, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 pares de bases de longitud. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico no incluye citosina.
En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico incluye un enlazador covalente. En realizaciones, el enlazador covalente conecta dos secuencias de ácido nucleico dentro de un dominio de ácido nucleico. En realizaciones, el
dominio de ácido nucleico incluye al menos dos secuencias de ácido nucleico conectadas a través de un enlazador covalente. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye al menos cuatro secuencias de ácido nucleico conectadas a través de enlazadores covalentes. Por tanto, en realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye una primera secuencia de ácido nucleico, una segunda secuencia de ácido nucleico, una tercera secuencia de ácido nucleico y una cuarta secuencia de ácido nucleico, en la que la primera secuencia de ácido nucleico está conectada a la segunda secuencia de ácido nucleico a través de un primer enlazador covalente, la segunda secuencia de ácido nucleico está conectada a la tercera secuencia de ácido nucleico a través de un segundo enlazador covalente y la tercera secuencia de ácido nucleico está conectada a la cuarta secuencia de ácido nucleico a través de un tercer enlazador covalente. En realizaciones, el enlazador covalente (por ejemplo, el primer, segundo, tercer enlazador covalente) es un enlace, -S(O)-, -S(O)2NH-, -NHS(O)2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-, -C(O)NH-, -NH-, - NHC(O)-, -O-, -S- , alquileno sustituido o no sustituido, heteroalquileno sustituido o no sustituido, cicloalquileno sustituido o no sustituido, heterocicloalquileno sustituido o no sustituido, arileno sustituido o no sustituido o heteroarileno sustituido o no sustituido. En realizaciones, el enlazador covalente es un enlazador 1,3-triazoleno. En realizaciones, el enlazador covalente tiene la estructura:
(I). En realizaciones, el enlazador covalente incluye la estructura:
(I). En la fórmula (I), el punto de unión marcado por * indica la unión del enlazador covalente a una primera secuencia de ácido nucleico y la unión marcada por ** indica el punto de unión del enlazador covalente a una segunda secuencia de ácido nucleico.
En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye una secuencia de ácido nucleico funcionalizada. Un ácido nucleico funcionalizado como se proporciona en este documento incluye grupos funcionales reactivos usados para químicas conjugadas como se describe en este documento. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye una pluralidad de secuencias de ácido nucleico funcionalizadas. Cuando el dominio de ácido nucleico incluye una pluralidad de secuencias de ácido nucleico funcionalizadas, las secuencias de ácido nucleico funcionalizadas están conectadas a través de una pluralidad de enlazadores covalentes. En realizaciones, cada uno de la pluralidad de enlazadores covalentes es químicamente diferente. Las ilustraciones esquemáticas de la síntesis del dominio nucleico y el dominio ligando en una micropartícula se muestran en las Figuras 4, 5 y 6. Como se muestra en las Figuras 5 y 6, los dominios de ácido nucleico unidos a una micropartícula pueden ser independientemente diferentes dependiendo de la síntesis utilizada y pueden incluir dos o más secuencias de ácido nucleico conectadas a través de un enlazador covalente.
Los dominios de ácido nucleico proporcionados en este documento, incluidas las realizaciones de los mismos, son compatibles con (i) los métodos de síntesis unida a soporte de múltiples etapas aplicados para formar un dominio del ligando como se proporciona en este documento, (ii) la composición de la micropartícula y (iii) los procedimientos de decodificación proporcionados en el presente documento (es decir, identificar la composición del dominio del ligando y su ubicación en una matriz). Los procedimientos de decodificación útiles incluyen, sin limitación, secuenciación mediante hibridación o procedimientos de secuenciación basados en enzimas (por ejemplo, secuenciación por síntesis, secuenciación por ligación). Por lo tanto, en realizaciones, la secuencia de ácido nucleico se une a una secuencia de ácido nucleico complementaria. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico complementaria incluye una fracción detectable. En realizaciones, la fracción detectable es una fracción fluorescente. Tras la hibridación de un ácido nucleico complementario con dicho dominio de ácido nucleico, se puede determinar la composición del dominio del ligando y su ubicación en la matriz. Después de que se haya determinado la identidad del dominio del ligando y su ubicación en la matriz, el dominio de ácido nucleico puede eliminarse (por ejemplo, mediante la escisión del segundo enlazador), el dominio del ligando puede modificarse adicionalmente (por ejemplo, haciendo reaccionar una fracción reactiva del dominio del ligando) y poniendo en contacto con un enlazador del ligando (por ejemplo, biomolécula).
Los enlazadores proporcionados en este documento unen químicamente la micropartícula y el dominio del ligando (primer enlazador), la micropartícula y el dominio de ácido nucleico (segundo enlazador) o la micropartícula y el soporte
sólido (tercer enlazador). Como se describió anteriormente, el dominio de ácido nucleico proporcionado en este documento que incluye realizaciones del mismo puede incluir dos o más secuencias de ácido nucleico conectadas a través de enlazadores covalentes (por ejemplo, un enlazador 1,3-triazoleno). Por tanto, en realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye dos o más enlazadores de 1,3-triazoleno. Los enlazadores proporcionados en el presente documento (por ejemplo, primer enlazador, segundo enlazador, tercer enlazador) pueden unirse covalentemente a los métodos de aplicación de micropartículas bien conocidos en la técnica y compatibles con la composición del enlazador y la micropartícula. Los enlazadores proporcionados en el presente documento pueden incluir el producto conjugado de fracciones reactivas en el punto de unión a la micropartícula, en el punto de unión al dominio del ligando, en el punto de unión al dominio de ácido nucleico o en el punto de unión al soporte sólido. Por tanto, los enlazadores proporcionados en el presente documento pueden ser polivalentes y pueden formarse mediante técnicas de química conjugada.
El primer enlazador comprende -C(O)NH- o -NHC(O)-. El segundo enlazador comprende -C(O)O- u -OC(O)-. En realizaciones, el primer enlazador incluye la estructura -N(H)-C(O)-. Cuando el primer enlazador tiene la estructura -N(H)-C(O)-, el nitrógeno se une al soporte sólido funcionalizado (por ejemplo, funcionalizado con bis-amino PEG 3000) y el carbono se une al dominio del ligando. Como se describió anteriormente, después de que se hayan determinado la identidad del dominio del ligando y su ubicación en la matriz, el dominio de ácido nucleico puede eliminarse mediante la escisión del segundo enlazador. En realizaciones, el segundo enlazador es un enlazador fotoescindible. En realizaciones, el segundo enlazador es un enlazador lábil a los ácidos. En realizaciones, el segundo enlazador es un enlazador lábil a los álcalis. En realizaciones, el segundo enlazador tiene la estructura:
En realizaciones, el segundo enlazador incluye la estructura:
En la fórmula (II), el punto de unión marcado por * indica el punto de unión al soporte sólido funcionalizado (por ejemplo, funcionalizado con hidroxilamina PEG 3000) y el punto de unión marcado por ** indica el punto de unión al dominio de ácido nucleico. En realizaciones, el segundo enlazador tiene la estructura:
el punto de unión marcado por * indica el punto de unión al soporte sólido y el punto de unión marcado por ** indica el punto de unión al dominio de ácido nucleico. En realizaciones, el segundo enlazador tiene la estructura
En la fórmula (IIB), L1 es -C(O)O-, u -OC(O)-. En la fórmula (IIB), el punto de unión marcado por * indica el punto de unión al soporte sólido y el punto de unión marcado por ** indica el punto de unión al dominio de ácido nucleico.
De acuerdo con las realizaciones proporcionadas en este documento, las micropartículas proporcionadas en este documento pueden incluir una pluralidad de dominios de ligando y una pluralidad de dominios de ácido nucleico unidos a través de una pluralidad de primeros enlazadores y una pluralidad de segundos enlazadores, respectivamente
(véanse las Figuras 3, 4 o 5). Por lo tanto, en realizaciones, el dominio del ligando es una pluralidad de dominios de ligando unidos a través de una pluralidad de primeros enlazadores. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico es una pluralidad de dominios de ácido nucleico unidos a través de una pluralidad de segundos enlazadores. En realizaciones, la pluralidad de dominios de ácido nucleico unidos a una única micropartícula puede ser igual o independientemente diferente (vease la Figura 5 o 6).
Las micropartículas proporcionadas en el presente documento, incluidas las realizaciones de las mismas, están unidas a un soporte sólido. En realizaciones, el soporte sólido es un soporte plano. En realizaciones, la micropartícula está conectada a través de un tercer enlazador al soporte sólido. En realizaciones, la micropartícula está unida no covalentemente al soporte sólido (por ejemplo, a través de interacciones electrostáticas (por ejemplo, enlace iónico, enlace de hidrógeno, enlace de halógeno), interacciones de van der Waals (por ejemplo, dipolo-dipolo, dipolo inducido por dipolo, dispersión de London), apilamiento de anillos (efectos pi), interacciones hidrófobas y similares). En realizaciones, la micropartícula se une mecánicamente al soporte sólido. Cuando una micropartícula se une mecánicamente al soporte sólido, se mantiene físicamente en su lugar sobre el soporte mediante medios mecánicos (por ejemplo, un pocillo). En realizaciones, una pluralidad de micropartículas se unen covalentemente al soporte sólido. En realizaciones, la micropartícula se une al soporte sólido a través de un enlazador de amida. Por lo tanto, en realizaciones, el tercer enlazador tiene la estructura -N(H)-C(O)-. En realizaciones, el soporte sólido incluye carboximetildextrano. En realizaciones, el soporte sólido incluye vidrio funcionalizado con carboximetildextrano. En realizaciones, el soporte sólido es una oblea de silicio.
En realizaciones, la pluralidad de micropartículas forma una matriz desordenada. Una "matriz desordenada" como se denomina en este documento es una matriz de micropartículas, en la que las micropartículas se ensamblan aleatoriamente o se unen a un soporte sólido y no forman una estructura ordenada bidimensional o tridimensional. En realizaciones, la pluralidad de micropartículas forman una matriz ordenada. En una matriz ordenada, las micropartículas se ensamblan o se unen a un soporte sólido de acuerdo con un orden bidimensional o tridimensional. Por ejemplo, una matriz hexagonal consta de una pluralidad de micropartículas ensambladas o unidas a un soporte sólido de manera que cada micropartícula forma parte de un hexágono, en el que cada micropartícula ocupa un ángulo del hexágono, y en el que el centro del hexágono está ocupado por una séptima micropartícula. En realizaciones, la pluralidad de micropartículas forma una matriz hexagonal. En realizaciones, la pluralidad de micropartículas forma una matriz empaquetada cuadrada. Una matriz empaquetada cuadrada consta de una pluralidad de micropartículas ensambladas o unidas a un soporte sólido de manera que cada micropartícula forma parte de un cuadrado o rectángulo que consta de al menos cuatro micropartículas. La formación de matrices es un método bien conocido y utilizado en la técnica y se describe, entre otras cosas, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,110.426; 7,615,368; 7,932,213; 6,824,987; 5,143,854; 8,795,967 y Hughes TR et al., (2001) Nat. Biotech. 4, 342-347. En realizaciones, al menos aproximadamente 106 de las micropartículas se unen al soporte sólido. En realizaciones, cada una de las micropartículas es diferente. En realizaciones, aproximadamente 106 a 109 de las micropartículas se unen al soporte sólido. En realizaciones, aproximadamente de 109 de las micropartículas se unen al soporte sólido. En realizaciones, aproximadamente 105, 106, 107, 108, 109, 1010o 1011 de las micropartículas se unen al soporte sólido. En realizaciones, la matriz incluye 106 micropartículas por milímetro cuadrado.
En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 10,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 20,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 30,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 40,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 50,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 60,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 70,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 80,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 90,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 100,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 200,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 300,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 400,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 500,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 600,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 700,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 800,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 900,000 micropartículas por milímetro cuadrado.
En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente 200,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente 789,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente 591,715 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye de aproximadamente 200,000 a aproximadamente 800,000 micropartículas por milímetro cuadrado.
En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente una micropartícula por 4.99 micrómetros cuadrados. En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente una micropartícula por 1.46 micrómetros cuadrados. En
realizaciones, la matriz incluye aproximadamente una micropartícula por 1.69 micrómetros cuadrados. En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente una micropartícula por micrómetro cuadrado.
En realizaciones, el soporte sólido incluye una pluralidad de pocillos, cada uno de los cuales captura una de las micropartículas. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico como se describe en este documento. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico se une a una secuencia de ácido nucleico complementaria. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico complementaria incluye una fracción detectable. En realizaciones, la fracción detectable es una fracción fluorescente.
Métodos
La presente invención, proporciona un método para formar una micropartícula escindida. El método incluye (i) unir una micropartícula como se proporciona en el presente documento, incluidas las realizaciones de la misma, a un soporte sólido, formando así una micropartícula inmovilizada. (ii) Realizar un procedimiento de decodificación sobre la etiqueta codificadora, identificando así la composición del dominio del ligando y su ubicación en dicho soporte sólido. (iii) El segundo enlazador de la micropartícula inmovilizada se escinde, formando así una micropartícula escindida. La micropartícula inmovilizada en la etapa (i) se une covalentemente a (a) un dominio de ligando a través de un primer enlazador; y (b) una etiqueta de codificación a través de un segundo enlazador. El dominio del ligando es un péptido, una proteína, un péptido macrocíclico, un peptidomimético, una poliamida o una macrolactama. La etiqueta codificante es una secuencia de ácido nucleico que identifica dicho dominio de ligando. El segundo enlazador es escindible y dicho primer enlazador no es escindible bajo la condición de que dicho segundo enlazador sea escindible. En realizaciones, la etapa (ii) incluye la unión de una secuencia de ácido nucleico complementaria al dominio de ácido nucleico. En realizaciones, la escisión incluye poner en contacto la micropartícula inmovilizada con un agente de escisión. En realizaciones, el agente de escisión es un ácido. En realizaciones, el agente de escisión es ácido trifluoroacético. En realizaciones, el agente de escisión es un agente alcalino. En realizaciones, el agente de escisión es hidróxido de amonio. En realizaciones, el agente de escisión es amoníaco. En realizaciones, el agente de escisión es metilamina. En las realizaciones, el agente de escisión es una mezcla de hidróxido de amonio y metilamina. En realizaciones, la escisión se realiza a temperatura ambiente. En realizaciones, el agente de escisión es radiación UV. En realizaciones, el agente de escisión es radiación de luz. En realizaciones, la escisión no incluye la escisión del primer enlazador.
En realizaciones, el método incluye después de la escisión de la etapa (ii), un etapa (iii) de hacer reaccionar una fracción reactiva del dominio del ligando, formando así un dominio del ligando reactivo y (iv) unir un enlazador del ligando al dominio del ligando reactivo. En realizaciones, el método incluye después de la escisión de la etapa (ii), un etapa (iii) de unión de un enlazador del ligando al dominio del ligando. En realizaciones, la etapa (ii) de escisión incluye la unión de un enlazador del ligando al dominio del ligando. Por lo tanto, la escisión del segundo enlazador puede ocurrir simultáneamente con la unión de un enlazador de ligando al dominio del ligando. Alternativamente, la unión de un enlazador del ligando al dominio del ligando puede ocurrir después de la escisión del segundo enlazador. En realizaciones, la unión de un enlazador del ligando al dominio del ligando incluye hacer reaccionar una fracción reactiva del dominio del ligando.
Ejemplos
Utilizando la síntesis de bibliotecas de grupos divididos, los solicitantes pudieron aumentar el número de compuestos mostrados en al menos 1,000 veces con respecto a los métodos actuales. Las composiciones proporcionadas en el presente documento son una colección muy diversa de moléculas inmovilizadas en una matriz extremadamente densa sobre un soporte sólido. Para preparar el sistema de los solicitantes, la biblioteca de precursores ensamblada se inmoviliza en una matriz plana. Se decodifica toda la matriz inmovilizada, ya que cada miembro de la biblioteca ocupa ahora un espacio permanente y discreto en una matriz plana, la decodificación convierte lo que era una biblioteca codificada químicamente en una biblioteca direccionada espacialmente. Las unidades de codificación química se eliminan y las transformaciones sintéticas posteriores se realizan a través de la biblioteca inmovilizada, completando la síntesis de la biblioteca. A continuación, la biblioteca se puede cribar para identificar moléculas que demuestren una función útil.
Cuando la síntesis de agrupación dividida codificada se combina con métodos establecidos de inmovilización de perlas de alta densidad y secuenciación de oligonucleótidos, el sistema permite cribados de bibliotecas de agrupación dividida completamente decodificadas en una escala que antes no era posible. Por analogía con la tecnología de secuenciación de próxima generación, deberían lograrse conjuntos de cribado completamente decodificados de hasta 108 a 1010 en un formato de microarreglos. En el presente documento se proporcionan bibliotecas "sin etiquetas" para química adicional. Al decodificar antes del cribado, las etiquetas de oligonucleótidos se pueden eliminar, lo que logra dos cosas: (i) se puede realizar una química adicional que sería incompatible con la etiqueta de oligonucleótidos en la biblioteca inmovilizada (la incompatibilidad química es uno de los desafíos establecidos de la química combinatoria codificada); (ii) la eliminación de las etiquetas elimina la posibilidad de que las etiquetas interfieran con los ensayos de interés. La química de codificación permite a los solicitantes aprovechar el poder de la síntesis de grupo dividido para la generación de bibliotecas químicas, pero permite que las bibliotecas se evalúen en cribados relativamente ricos en información, en lugar de selecciones. Se evalúa el rendimiento relativo de todos los miembros de la biblioteca en un ensayo determinado, no solo los "aciertos" seleccionados. Los compuestos que resultan problemáticos en uno o más
ensayos se pueden identificar y marcar fácilmente, lo que reduce el número de posibles falsos positivos en los cribados posteriores. Esto facilita el desarrollo de relaciones estructura-actividad.
Los compuestos bioactivos finales que se criban para determinar su actividad se forman después de la decodificación y eliminación de las etiquetas. Lo que está inmovilizado y decodificado son productos intermedios sintéticos protegidos. Para la invención proporcionada en el presente documento, se realiza al menos un etapa química adicional después de decodificar y eliminar el dominio de ácido nucleico para terminar de preparar los "agentes bioactivos" (esto podría incluir: desprotección, macrociclización, etc.).
Los beneficios potenciales de codificar la síntesis de una biblioteca de grupo dividido utilizando ácidos nucleicos son bien conocidos, al igual que los desafíos sintéticos. La estrategia de codificación específica de los solicitantes permite la creación de bibliotecas codificadas de ADN cribables en menos transformaciones químicas lineales por etapa que las demostradas anteriormente, siendo cada etapa de codificación decodificable de forma independiente.
La micropartícula también denominada en el presente documento "núcleo" podría ser un dendrímero, un polímero hiperramificado, una partícula de sílice funcionalizada, una partícula de polímero funcionalizada. El núcleo puede ser magnético. El núcleo podría variar en tamaño desde 20 nm hasta 200 micrómetros de diámetro. El núcleo está funcionalizado con una fracción reactivo que permite la unión de bloques de construcción para elaborar las moléculas de la biblioteca, una fracción reactiva diferente que permite la unión de etiquetas de ADN para codificar y, en algunos casos, una tercera fracción reactiva diferente que ayuda en la inmovilización covalente del núcleo a una superficie.
El núcleo multidentado puede ser una perla polimérica magnética de 0.9 micras funcionalizada con una superficie de polietilenglicol terminada con aminas protegidas ortogonalmente.
El precursor sintético (dominio del ligando que incluye una fracción protectora) podría ser cualquier producto de síntesis unida al soporte de múltiples etapas, con la restricción de que cualquier transformación sintética utilizada para crear el precursor sintético, una vez unida a la partícula del núcleo, debe ser compatible con la estructura química del núcleo y son ortogonales/compatibles con la química de codificación descrita o se realizan antes de la incorporación de las primeras etiquetas de codificación. Los precursores sintéticos pueden ser poliamidas protegidas de cadena lateral.
Las etiquetas de codificación (dominios de ácido nucleico) consisten en derivados de ácido nucleico funcionalizados, pre-sintetizados y únicos unidos covalentemente directamente a la partícula del núcleo a través de un enlazador escindible o indirectamente a través de otras etiquetas de codificación. Las secuencias de etiquetas tienen una longitud y composición suficientes y codifican la biblioteca completa. Para habilitar la decodificación de etapas de síntesis codificadas específicas, independientemente de otros etapas de síntesis codificadas. Por ejemplo: la decodificación de las etiquetas utilizadas para codificar la segunda etapa de una síntesis debe ser completamente independiente de la capacidad de decodificar las etiquetas utilizadas para codificar la primer o tercera etapa de una síntesis. La incorporación fallida de etiquetas en la etapa uno tiene un impacto adverso en la incorporación de etiquetas en la etapa dos. La incapacidad de "decodificar" la etapa uno afectará la capacidad de "decodificar" la etapa dos para un miembro de biblioteca codificado dado. El enfoque de los solicitantes puede requerir secuencias de ácido nucleico más largas pero proporciona un proceso de codificación/decodificación más robusto. Las etiquetas son compatibles con el método elegido de decodificación o secuenciación. Por ejemplo, si la secuenciación de etiquetas se va a realizar mediante un proceso de hibridaciones secuenciales, las etiquetas deberían ser relativamente isotérmicas entre sí y contener suficientes diferencias de secuencia de modo que se minimice la hibridación cruzada no deseada. Si la secuenciación de etiquetas se va a realizar a través de cualquiera de las secuencias basadas en enzimas mediante síntesis o secuenciación mediante enfoques de ligación, las etiquetas pueden requerir sitios de unión de cebadores comunes.
Etiquetar estructuras químicas: (i) estables y no reactivas a las transformaciones sintéticas utilizadas para construir la biblioteca precursora; (ii) extraíble de la partícula del núcleo después de secuenciarla; (iii) compatible con el método de decodificación/secuenciación. Por ejemplo, la secuenciación por hibridación podría realizarse con ADN, PNA, LNA, ARN, ARN modificado, análogos de ADN modificado o algunas combinaciones de los mismos. Para cualquier enfoque de secuenciación basado en enzimas, se prefiere el ADN. Las estructuras de oligonucleótidos protegidas podrían usarse para mejorar la ortogonalidad química, en las que las fracciones protectoras de la etiqueta se eliminan antes de la decodificación (por ejemplo, las aminas exocíclicas de las nucleobases pueden protegerse antes o inmediatamente después de la incorporación de la etiqueta).
Etiquetar estructuras de sitios de escisión: (i) las etiquetas se pueden unir directamente a la partícula del núcleo o indirectamente al núcleo a través de otras etiquetas, todos los puntos de unión de las partículas del núcleo para las etiquetas contienen en última instancia un sitio de escisión. (ii) las estructuras escindibles preferidas, después de la escisión, dejan la superficie de la partícula del núcleo libre de fracciones reactivas que puedan interferir con la química o los ensayos posteriores (por ejemplo, el sitio de escisión del éster que deja un alcohol libre; el sitio de escisión del éter trietílico que deja un alcohol libre).
Estructuras de enlace de etiquetas: las etiquetas codificantes pueden ser oligonucleótidos basados en ADN de 20 mer con contenido de C cero y contenido de G del 25%. Las etiquetas se diferencian entre sí por al menos un desajuste de seis pares de bases. Las etiquetas están unidas al soporte y/o entre sí a través de enlaces 1,3-triazol, todas
finalmente conectadas a la partícula del núcleo a través de un enlace éster escindible. Cualquier método de unión y cualquier superficie utilizada debe ser compatible con las condiciones de decodificación y las condiciones del ensayo de micromatrices, así como las condiciones de eliminación de etiquetas y cualquier condición de reacción sintética aplicada a la matriz. Los solicitantes han demostrado inmovilización sobre cuarzo modelado, silicio modelado y vidrio funcionalizado con carboximetildextrano.
Eliminación de etiquetas de ADN: Las condiciones dependen de la estructura en el sitio de escisión de la etiqueta. Con enlace éster, los solicitantes han utilizado hidróxido de amonio y metilamina. Desprotección de ligandos y modificaciones sintéticas adicionales. Los solicitantes han eliminado todos las fracciones protectores de la cadena lateral de las estructuras de poliamida. Se realizará una desprotección selectiva de la cadena lateral seguida de macrolactamización. Se llevará a cabo la incorporación de pares inactivadores de fluoróforo o fracciones solvatocrómicas. Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden ser útiles, entre otras cosas, para cribado de micromatrices, ensayos de unión a lecturas de fluorescencia, colorimétricas o electroquímicas, en los que se incuban proteínas de interés marcadas con fluorescencia sobre la matriz para identificar los enlazadores.
En realizaciones, los chips prototipo están a un espaciado C-C (centro a centro) de 2,4 micrómetros en una matriz hexagonal. Eso da como resultado 4.99 micrómetros cuadrados por perla (menos de 5.76 micrómetros cuadrados por perla esperados porque las perlas están empaquetadas de forma hexagonal), o 2 0 millones de perlas por centímetro cuadrado, o 200,000 perlas por milímetro cuadrado, o ~ 376 millones de partículas dentro del área equivalente de un portaobjetos de microscopio estándar de 25 mm por 75 mm.
En realizaciones, las partículas se han inmovilizado en una matriz hexagonal con espaciamiento C-C de 1.3 micrómetros. Eso da como resultado 1.46 micrómetros cuadrados por perla, o 78.9 millones de perlas por centímetro cuadrado, o 789,000 perlas por milímetro cuadrado, o 1.28 mil millones de perlas dentro del área equivalente a un portaobjetos de microscopio de 25 mm por 75 mm.
En realizaciones, las partículas se han inmovilizado en una matriz empaquetada cuadrada con espaciamiento C-C de 1.3 micrómetros. Eso da como resultado 1.69 micrómetros cuadrados por perla, o 59 millones de perlas por centímetro cuadrado, o 591,715 perlas por milímetro cuadrado, o 1.11 mil millones de perlas dentro del área equivalente a un portaobjetos de microscopio de 25 mm por 75 mm.
En realizaciones, una matriz se empaqueta de forma hexagonal con una densidad de 1 perla por micra cuadrada (espaciamiento de C-C de ~ 1.075 micrómetros).
Materiales y métodos
Reactivos
Trietilamina (TEA), diisopropiletilamina (DIPEA), diisopropilcarbodiimida (DIC), dimetilaminopiridina (DMAP), dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (Dm SO), Triton X-100 (TX100), ácido azidoacético (Aza), hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido (HATU), hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PYAOP), Tris(3-hidroxipropilmetil)amina (THPTA), complejo de dimetilsulfuro de bromuro de cobre (I) (CuBrDMS), Boc-Glicina y Fmoc-Glicina se adquirieron de Sigma-Aldrich y se utilizaron tal como se recibieron. Todos los demás aminoácidos protegidos con Fmoc se adquirieron a través de Novabiochem o Advanced Chemtech. El agua utilizada en todos los lavados y tampones de reacción se obtuvieron a través de un sistema de purificación Millipore MilliQ. Los reactivos Peg usados para la funcionalización inicial de micropartículas se adquirieron a través de Rapp Polymere o Quanta Biodesign. Las perlas ProMag son proporcionadas por Bangs Laboratories como una solución al 2.6% p/v en agua y tienen las siguientes características: 880 nm de diámetro promedio. Compuesto por óxido de hierro incrustado en una matriz de polímero altamente entrecruzada. La superficie de las partículas muestra fracciones reactivas de ácido carboxílico libre a razón de 440 nmoles equivalentes por miligramo. Aproximadamente 2 mil millones de micropartículas están contenidas dentro de un miligramo de partículas patrón. Todas las etiquetas de ácido nucleico y las secuencias del complemento marcadas con fluorescencia se adquirieron a través de IDT.
Tabla 1.
Secuencias del dominio del ligando
SEQ ID NO: 17: YPYDVPDYA. (etiqueta de HA)
SEQ ID NO: 18: EQKLISEEDL (etiqueta de Myc)
Abreviaturas de reactivos adicionales
DITx agua MilliQ que contiene Triton X-100 al 1%
DMSOTx DMSO que contiene Triton X-100 al 1%
PBT tampón de fosfato 100 mM, pH 7,0 que contiene Triton X-100 al 1%
AMA 1:1 mezcla de hidróxido de amonio y metilamina al 30% en etanol
Procedimientos generales de manipulación de micropartículas
De manera similar a la mayoría de los procedimientos de síntesis en fase sólida, una reacción típica implica 1) dispersar las micropartículas en una solución de reacción, 2) agregar solventes o reactivos adicionales según sea necesario para la reacción, 3) proporcionar agitación ocasional o constante a una temperatura de reacción específica durante un período de tiempo y 4) después de la reacción, los reactivos y los subproductos solubles de la reacción se separan de las micropartículas mediante una serie de lavados. Las etapas de separación y lavado de las micropartículas de los solicitantes consisten en múltiples rondas de 1) sedimentación asistida magnéticamente de las micropartículas y aspiración del sobrenadante seguido de 2) resuspensión del sedimento de micropartículas en una solución de lavado adecuada.
Funcionalización de micropartículas ProMag
PEGilación inicial:
9 partes H2N -PEG -O H (3000 PM)
1 parte H2N -P E G -N H 2 3000 PM
para proteger grupos
carboxilo sin reaccionar
Se realiza una funcionalización a gran escala para crear perlas pegiladas (con una relación de grupos hidroxilo a grupos amina de 4.5:1) con el fin de eliminar cualquier variación de un lote a otro. Se lavan 250 μl de perlas ProMag patrón con DMFTx (1 ml, x3) y se suspenden en 150 μl de DMFTx. Se pesan amino hidroxi PEG 3000 (270 mg) y bis amina PEG 3000 (30 mg) en un tubo cónico de 1,5 ml y se funden en un baño de aceite a 65 °C. Las perlas se añaden al PEG fundido y se mezclan completamente/calientan. Se añaden 55 μl de DIPEA a la mezcla de reacción y se someten a agitación tipo vórtice seguido de la adición de PyAOP sólido (160 mg). La reacción se desarrolló a 65 °C durante 45 minutos mientras se calentaba en un baño de aceite. Las concentraciones finales en la reacción terminan siendo (PEG 200 mM, PyAOP 600 mM, DIPEA 600 mM). Después de 45 minutos, los ácidos carboxílicos restantes en la superficie se protegen con 2-metoxietil amina (250 μl), se dejan incubar a la misma temperatura durante 10 minutos, luego se lavan las perlas con DMFTx (1 ml, x3), luego se resuspenden con 250 μl de DMFTx. Se extrajo una
alícuota de 50 |jl y se lavó con agua MilliQ (400 jl, x3) y se cargó en la bandeja limpia/tarada calcinada, se coloca en el horno a 95 °C y se lleva a cabo el siguiente método. Salto a 95 °C, isoterma durante 10 min, rampa de 20 °C/min hasta 500 °C, isoterma durante 30 minutos [masa inicial: 1.5940 mg. A 100 °C 98.86%. A 500 °C 31.30%]. Esto corresponde a un 25.4% de funcionalidad añadida, en comparación con el último lote grande que tenía un 24.3% de funcionalización añadida (1.704 mg, 99.81% a 100 °C y 32.08% a 500 °C) en comparación con los dos primeros lotes grandes preparados por el mismo protocolo que tuvo una función añadida del 25.6%.
Protección con BOC (x2)
El resto de las perlas se protegen con Boc mediante lavado en DMSOTx (1 ml, x3), suspendido en 170 j l de DMFTx, añadiendo 14 mg de Boc-Gly OH, seguido de 22.3 j l de TEA y 30.4 mg de HATU, en ese orden. La reacción se desarrolló a 65 °C durante 30 min en un baño de aceite, después de lo cual las perlas se lavaron con DMFTx (500 ml, x3) y se sometieron a las mismas condiciones una vez más. A continuación, las perlas se sometieron a AMA (200 jl, 65 °C, 5 min) y luego se lavaron en DMFTx a una concentración patrón.
DIC/DMAP con azida de cadena larga (x3)
Las perlas se resuspenden en 400 j l de DMFTx, a esto se añaden 80 j l de ácido azido de cadena larga 500 mM (11.66 mg/l00 jl), seguido de 6.7 j l de DIC, luego 10 j l de DMAP (80 mg/ml de patrón en DMF). Estas condiciones de acoplamiento se repitieron un total de tres veces, lavando con DMFTx (200 jl, x3) entre cada uno. A continuación, se elimina el grupo Boc mediante tratamiento con TFA durante 15 minutos. A continuación, este lote grande se lava en PBT (400 jl, x3) y se suspende en 400 j l (dilución x4 del patrón). El protocolo para unir ácido azidoacético en una forma escindible con álcali (conectado a la micropartícula a través de un enlace éster) se realiza de manera similar.
Condiciones de acoplamiento estándar de aminoácidos con HATU
HATU 400 mM, aminoácido con FMOC 400 mM, TEA 800 mM en 10% de DITx, 90% de DMSOTx, 65 °C, 30 minutos.
Las perlas se lavan en DITx (100 jl, x3) y se suspenden en 10 j l de DITx. A esto se le agrega el aminoácido con FMOC en 80 j l de DMSOTx (400 mM para un volumen de reacción de 200 jl), seguido de TEA (10 jl, 101.19 g/mol, 0.726 g/ml), y finalmente se añade HATU (15 mg, 380.23 g/mol) como un sólido y el tubo se coloca en el bloque de calentamiento rojo a 65 °C durante 30 minutos. Se realizan acoplamientos dobles (sin lavar entre ellos) con todos los aminoácidos para asegurar una conversión del 100%.
Acoplamiento estándar con HATU de azida a la fracción reactiva de amina en las etiquetas de ácido nucleico HATU 400 mM, ácido 2-azidoacético 400 mM, TEA 800 mM en 10% de DITx, 90% de DMSOTx, 65 °C, 30 minutos.
Las perlas se lavan en PBT (100 jl, x3) y se suspenden en 10 j l de DITx. A esto se le agrega DMSOTx (80 jl), seguido de ácido 2-azidoacético (3 j l, 101.06 g/mol, 1.35 g/ml), seguido de TEA (22.3 jl, 101.19 g/mol, 0.726 g/ml) y finalmente se añade HATU (15 mg, 380.23 g/mol) como un sólido y el tubo se coloca en el bloque de calentamiento rojo fijado a 65 °C durante 30 minutos. Se realizan acoplamientos dobles (sin lavar entre ellos) con todos los ácidos para asegurar una conversión del 100%.
Condiciones de cicloadición de alquino azida catalizada por cobre (Huisgen) (etapa de codificación)
Preparación de la solución patrón de catalizador: previamente se había pesado DMS con Cu(I)Br (205.58 g/mol) en la caja de guantes en viales de centelleo de 20 ml. Se agrega DMSO (que se mantiene en la caja de guantes) al vial de manera que se logre una concentración de 4.5 mg/ml (22 mM). Se pesa THPTA (tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina) (434.5 g/mol) fuera de la campana y se disuelve a una concentración de 2.8 mg/l25 μl (52 mM). Las soluciones de Cu (I) y ligando se combinan en una relación 1:2 v:v de Cu(I) a ligando, produciendo las siguientes concentraciones: THPTA 35 mM y DMS Cu(I)Br 7.3 mM en 50% de DMSO y agua 50% de MilliQ.
Las perlas se lavan en PBT (100 μl, x3) y se suspenden en 13 μl de PBT. A esto se le añaden 10 μl de etiqueta de oligo (de una solución patrón de 500 μM). Esto se transfiere a la caja de guantes con un mínimo de 4 ciclos de bombeo/purga. Se agregan 2 μl de la solución patrón de catalizador y el tubo de PCR se coloca en el bloque de PCR a 60 °C durante 30 minutos, después de lo cual la reacción se inactiva con EDTA 500 mM (fuera de la caja de guantes) agregando 100 μl de EDTA e incubando durante 3 minutos antes de lavar con PBT (200 μl, x5).
Condiciones estándar de desprotección con FMOC
100 μl de piperidina al 20% en DMFTx durante 10 minutos a ta (x3).
Condiciones de hibridación competitivas, ejemplo usado para distinguir entre etiquetas A0 y A1.
Se adquirieron anti-A0-Cy3 y anti-A1-FITC a través de IDT y se diluyeron con patrones de 500 μM en agua MilliQ. Se prepara una solución de hibridación que se aplicará a las muestras de perlas como sigue. Se mezclan 40 μl de formamida, 20 μl de tampón SSPE 20X (Sigma), 10 μl de DITx, 20 μl de Di, 5 μl de patrón de anti-A0-Cy3 y 5 μl de patrón de anti-Al-FITC en un único tubo de PCR y se almacena en la oscuridad hasta su uso.
Se colocaron muestras de perlas (1,6 μg) que mostraban A0 o A1 en sus respectivas superficies en un tubo de PCR separado, se sedimentaron y el sobrenadante se eliminó mediante aspiración al vacío. Cada sedimento de perlas se suspendió inmediatamente en 25 μl de solución de hibridación. Se permitió que las mezclas de suspensión de perlas se hibridaran durante los siguientes 15 minutos a temperatura ambiente, lejos de la luz. Después del período de tiempo indicado, las muestras de perlas se sedimentaron y la solución de hibridación se eliminó mediante aspiración al vacío. A continuación, las perlas se lavaron 3X con 25 μL de PBT y finalmente se suspendieron en 25 μL de PBT pf. Se extraen 5 μl de esta muestra de microesferas, se colocan en una placa de 1356 pocillos y se obtienen imágenes en el centro del microscopio utilizando un Zeiss Observer, objetivo de agua 63X, 1.6 optovar en los canales de campo claro, DsRed y EGFP. Se cargó una muestra adicional de 5 μL de cada tipo de perla en un pocillo separado de la placa y se usó para establecer los tiempos de exposición para DsRed y EGFP mediante el software Zeiss ZenBlue 2014. La muestra A0 adicional se usó para configurar el DsRed y la muestra A1 adicional se usó para configurar el EGFP. Después de establecer el tiempo de exposición, se tomaron imágenes de las muestras A0 y A1 no expuestas utilizando los mismos tiempos de exposición fijos.
Claims (14)
1. Un método que comprende las etapas de:
(i) unir una micropartícula a un soporte sólido, formando así una micropartícula inmovilizada, en la que dicha micropartícula inmovilizada se une covalentemente a:
(a) un dominio de ligando a través de un primer enlazador; y
(b) una etiqueta de codificación a través de un segundo enlazador;
en el que dicho dominio de ligando es un péptido, una proteína, un péptido macrocíclico, un peptidomimético, una poliamida o una macrolactama;
en el que dicha etiqueta codificante es una secuencia de ácido nucleico que identifica dicho dominio de ligando; en el que dicho segundo enlazador es escindible y dicho primer enlazador no es escindible bajo la condición de que dicho segundo enlazador sea escindible;
en el que dicho primer enlazador comprende -C(O)NH- o -NHC(O)-, y dicho segundo enlazador comprende -C(O)O-o -OC(O)-; y
(ii) realizar un procedimiento de decodificación en la etiqueta de codificación, identificando así la composición del dominio del ligando y su ubicación en dicho soporte sólido; y
(iii) escindir dicho segundo enlazador de dicha micropartícula, formando así una micropartícula escindida.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el procedimiento de decodificación comprende secuenciar dicha etiqueta de codificación mediante procedimientos de secuenciación basados en hibridación o enzimáticos.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el procedimiento de decodificación comprende la unión de una secuencia de ácido nucleico complementaria a dicha etiqueta de codificación, y en el que dicha secuencia de ácido nucleico complementaria incluye una fracción detectable.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho dominio de ligando comprende una fracción protectora unida covalentemente a una fracción reactiva, en el que dicha fracción protectora evita que el dominio del ligando se una a un enlazador del ligando, en el que dicha fracción protectora puede eliminarse; opcionalmente en el que dicha fracción reactiva se selecciona del grupo que consiste en un ácido carboxílico, una amina, un tiol o un alcohol.
5. El método de la reivindicación 4, que comprende además eliminar químicamente dicha fracción protectora eliminable.
6. El método de la reivindicación 5, que comprende además hacer reaccionar la fracción reactiva con un dominio capaz de unirse a un enlazador del ligando, formando así un dominio de ligando capaz de unirse a un enlazador del ligando.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5 y 6, que comprende además unir un enlazador del ligando al dominio de ligando de dicha micropartícula escindida, formando así un enlazador del ligando unido.
8. El método de la reivindicación 7, que comprende además identificar una ubicación de dicho enlazador del ligando unido en dicho soporte sólido, detectando así dicho enlazador del ligando.
9. El método de las reivindicaciones 7 u 8, en el que dicho enlazador del ligando comprende una fracción detectable.
10. El método de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que dicho enlazador del ligando es una proteína o un ácido nucleico.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que escindir dicho segundo enlazador comprende poner en contacto dicha micropartícula inmovilizada con un agente de escisión, en el que dicho agente de escisión es un ácido o un agente alcalino.
12. El método de la reivindicación 11, en el que dicho ácido es ácido trifluoroacético.
13. El método de la reivindicación 11, en el que dicho agente alcalino se selecciona del grupo que consiste en hidróxido de amonio, amoníaco, metilamina y una mezcla de hidróxido de amonio y metilamina.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que dicho péptido comprende además una funcionalidad no peptídica.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562120262P | 2015-02-24 | 2015-02-24 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2954467T3 true ES2954467T3 (es) | 2023-11-22 |
Family
ID=56789474
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES16756316T Active ES2904997T3 (es) | 2015-02-24 | 2016-02-24 | Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente |
ES19196019T Active ES2965764T3 (es) | 2015-02-24 | 2016-02-24 | Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente |
ES19196007T Active ES2954467T3 (es) | 2015-02-24 | 2016-02-24 | Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES16756316T Active ES2904997T3 (es) | 2015-02-24 | 2016-02-24 | Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente |
ES19196019T Active ES2965764T3 (es) | 2015-02-24 | 2016-02-24 | Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US10760181B2 (es) |
EP (4) | EP3650459B1 (es) |
JP (2) | JP6872501B2 (es) |
AU (2) | AU2016222755B2 (es) |
CA (1) | CA2976946C (es) |
CY (1) | CY1124954T1 (es) |
DK (3) | DK3650458T3 (es) |
ES (3) | ES2904997T3 (es) |
FI (2) | FI3650458T3 (es) |
HR (3) | HRP20230928T1 (es) |
HU (3) | HUE064689T2 (es) |
LT (3) | LT3650459T (es) |
NZ (1) | NZ734644A (es) |
PL (3) | PL3650459T3 (es) |
PT (3) | PT3262059T (es) |
RS (3) | RS64899B1 (es) |
SI (3) | SI3650459T1 (es) |
WO (1) | WO2016138184A1 (es) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009069203A1 (ja) * | 2007-11-28 | 2009-06-04 | Glory Ltd. | チケット処理装置、チケット処理システム及びチケット処理方法 |
HRP20230928T1 (hr) | 2015-02-24 | 2023-11-24 | City Of Hope | Platforme za skrining kemijski kodiranih prostorno adresiranih biblioteka |
CN106048736B (zh) * | 2015-04-14 | 2019-09-03 | 成都先导药物开发股份有限公司 | 一种固相合成dna编码化合物库的方法 |
EP3538653B1 (en) * | 2016-11-08 | 2021-07-28 | Nanna Therapeutics Limited | Tagless encoded chemical library |
CA3076747A1 (en) | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Plexium, Inc. | Oligonucleotide encoded chemical libraries |
EP3704246A4 (en) * | 2017-10-31 | 2021-08-11 | Encodia, Inc. | PROCEDURES AND KITS USING NUCLEIC ACID ENCODING AND / OR MARKING |
GB2604481A (en) | 2019-10-10 | 2022-09-07 | 1859 Inc | Methods and systems for microfluidic screening |
WO2022170034A1 (en) * | 2021-02-05 | 2022-08-11 | Affinergy, Llc | Rapid assay for apol1 g0 protein |
TW202337974A (zh) * | 2021-08-27 | 2023-10-01 | 國立大學法人神戶大學 | 用於於基材上產率良好地形成空孔之技術之核殼模板分子、粒子 |
Family Cites Families (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4672040A (en) * | 1983-05-12 | 1987-06-09 | Advanced Magnetics, Inc. | Magnetic particles for use in separations |
US5235033A (en) | 1985-03-15 | 1993-08-10 | Anti-Gene Development Group | Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
EP0773227A1 (en) | 1991-09-18 | 1997-05-14 | Affymax Technologies N.V. | Diverse collections of oligomers in use to prepare drugs, diagnostic reagents, pesticides or herbicides |
US5573905A (en) | 1992-03-30 | 1996-11-12 | The Scripps Research Institute | Encoded combinatorial chemical libraries |
US5565324A (en) | 1992-10-01 | 1996-10-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags |
AU5827294A (en) | 1992-12-11 | 1994-07-04 | Chiron Corporation | Synthesis of encoded polymers |
WO1994028028A1 (en) * | 1993-05-27 | 1994-12-08 | Selectide Corporation | Topologically segregated, encoded solid phase libraries |
ATE210993T1 (de) * | 1993-06-21 | 2002-01-15 | Selectide Corp | Selektiv spaltbare verbindungen, die auf iminodiessigsäure-ester-bindungen basieren |
US6087186A (en) * | 1993-07-16 | 2000-07-11 | Irori | Methods and apparatus for synthesizing labeled combinatorial chemistry libraries |
AU703472B2 (en) * | 1993-11-02 | 1999-03-25 | Affymax Technologies N.V. | Synthesizing and screening molecular diversity |
US6936477B2 (en) | 1994-04-13 | 2005-08-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags |
US7615368B1 (en) | 1994-06-17 | 2009-11-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Microarrays of polypeptides |
US5807522A (en) | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
US5830645A (en) | 1994-12-09 | 1998-11-03 | The Regents Of The University Of California | Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays |
US5846839A (en) | 1995-12-22 | 1998-12-08 | Glaxo Group Limited | Methods for hard-tagging an encoded synthetic library |
WO1997040385A1 (en) | 1996-04-25 | 1997-10-30 | Bioarray Solutions, Llc | Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces |
EP0918845A4 (en) * | 1996-07-08 | 2000-08-30 | Burstein Lab Inc | METHOD AND APPARATUS WITH CLIVABLE SIGNAL ELEMENT |
WO1998020019A1 (en) * | 1996-11-06 | 1998-05-14 | Sequenom, Inc. | Compositions and methods for immobilizing nucleic acids to solid supports |
CA2335951C (en) | 1998-06-24 | 2013-07-30 | Mark S. Chee | Decoding of array sensors with microspheres |
US6429027B1 (en) * | 1998-12-28 | 2002-08-06 | Illumina, Inc. | Composite arrays utilizing microspheres |
US20020150909A1 (en) * | 1999-02-09 | 2002-10-17 | Stuelpnagel John R. | Automated information processing in randomly ordered arrays |
US7932213B2 (en) | 1999-05-11 | 2011-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Small molecule printing |
US6824987B1 (en) | 1999-05-11 | 2004-11-30 | President And Fellows Of Harvard College | Small molecule printing |
US6544732B1 (en) | 1999-05-20 | 2003-04-08 | Illumina, Inc. | Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals |
US7160735B2 (en) | 2000-04-28 | 2007-01-09 | Monogram Biosciences, Inc. | Tagged microparticle compositions and methods |
JP3899831B2 (ja) | 2001-03-02 | 2007-03-28 | 株式会社日立製作所 | 生化学センサ及びこれを用いた生化学検査装置 |
US20060040286A1 (en) * | 2001-03-28 | 2006-02-23 | Nanosphere, Inc. | Bio-barcode based detection of target analytes |
US20030027221A1 (en) | 2001-04-06 | 2003-02-06 | Scott Melissa E. | High-throughput screening assays by encapsulation |
US20030228619A1 (en) | 2002-06-10 | 2003-12-11 | Xenoport, Inc. | Peptide nucleic acids as tags in encoded libraries |
EP1774033A4 (en) * | 2004-06-10 | 2008-04-23 | Perkinelmer Las Inc | MULTIPLEX ASSAYS FOR DETECTION OF ANALYTES |
US20060134697A1 (en) * | 2004-10-28 | 2006-06-22 | The Regents Of The University Of California | Method of preparing coded compound libraries |
AU2006336290A1 (en) * | 2005-09-16 | 2007-07-26 | The Regents Of The University Of California | A colorimetric bio-barcode amplification assay for analyte detection |
US8202974B2 (en) | 2009-02-10 | 2012-06-19 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Synthetic RNA-based agonists of TLR7 |
US9172561B2 (en) | 2009-07-29 | 2015-10-27 | Qualcomm Incorporated | Adaptive transmissions in coordinated multiple point communications |
JP2013500725A (ja) | 2009-07-31 | 2013-01-10 | プログノシス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | アッセイツールおよびその使用方法 |
US20130059741A1 (en) * | 2010-05-13 | 2013-03-07 | Illumina, Inc. | Binding assays for markers |
EP2885318A4 (en) * | 2012-08-14 | 2016-03-30 | Angiochem Inc | PEPTIDE-DENDRIMER CONJUGATES AND USES THEREOF |
CA2880765C (en) * | 2012-08-23 | 2023-01-10 | Stemcell Technologies Inc. | Compositions and methods for rapid and reversible biomolecular labeling |
HRP20230928T1 (hr) * | 2015-02-24 | 2023-11-24 | City Of Hope | Platforme za skrining kemijski kodiranih prostorno adresiranih biblioteka |
-
2016
- 2016-02-24 HR HRP20230928TT patent/HRP20230928T1/hr unknown
- 2016-02-24 US US15/553,140 patent/US10760181B2/en active Active
- 2016-02-24 PL PL19196019.4T patent/PL3650459T3/pl unknown
- 2016-02-24 JP JP2017562972A patent/JP6872501B2/ja active Active
- 2016-02-24 NZ NZ734644A patent/NZ734644A/en unknown
- 2016-02-24 AU AU2016222755A patent/AU2016222755B2/en active Active
- 2016-02-24 DK DK19196007.9T patent/DK3650458T3/da active
- 2016-02-24 CA CA2976946A patent/CA2976946C/en active Active
- 2016-02-24 FI FIEP19196007.9T patent/FI3650458T3/fi active
- 2016-02-24 ES ES16756316T patent/ES2904997T3/es active Active
- 2016-02-24 PL PL19196007.9T patent/PL3650458T3/pl unknown
- 2016-02-24 DK DK16756316.2T patent/DK3262059T3/da active
- 2016-02-24 PL PL16756316T patent/PL3262059T3/pl unknown
- 2016-02-24 PT PT167563162T patent/PT3262059T/pt unknown
- 2016-02-24 EP EP19196019.4A patent/EP3650459B1/en active Active
- 2016-02-24 HU HUE19196019A patent/HUE064689T2/hu unknown
- 2016-02-24 HU HUE19196007A patent/HUE063406T2/hu unknown
- 2016-02-24 ES ES19196019T patent/ES2965764T3/es active Active
- 2016-02-24 SI SI201631770T patent/SI3650459T1/sl unknown
- 2016-02-24 EP EP19196007.9A patent/EP3650458B1/en active Active
- 2016-02-24 LT LTEP19196019.4T patent/LT3650459T/lt unknown
- 2016-02-24 FI FIEP19196019.4T patent/FI3650459T3/fi active
- 2016-02-24 SI SI201631737T patent/SI3650458T1/sl unknown
- 2016-02-24 HR HRP20220093TT patent/HRP20220093T1/hr unknown
- 2016-02-24 DK DK19196019.4T patent/DK3650459T3/da active
- 2016-02-24 RS RS20231135A patent/RS64899B1/sr unknown
- 2016-02-24 PT PT191960194T patent/PT3650459T/pt unknown
- 2016-02-24 EP EP16756316.2A patent/EP3262059B1/en active Active
- 2016-02-24 WO PCT/US2016/019426 patent/WO2016138184A1/en active Application Filing
- 2016-02-24 HU HUE16756316A patent/HUE058813T2/hu unknown
- 2016-02-24 SI SI201631454T patent/SI3262059T1/sl unknown
- 2016-02-24 EP EP23195322.5A patent/EP4276059A3/en active Pending
- 2016-02-24 HR HRP20231536TT patent/HRP20231536T1/hr unknown
- 2016-02-24 ES ES19196007T patent/ES2954467T3/es active Active
- 2016-02-24 RS RS20220051A patent/RS62847B1/sr unknown
- 2016-02-24 RS RS20230660A patent/RS64567B1/sr unknown
- 2016-02-24 LT LTEPPCT/US2016/019426T patent/LT3262059T/lt unknown
- 2016-02-24 PT PT191960079T patent/PT3650458T/pt unknown
- 2016-02-24 LT LTEP19196007.9T patent/LT3650458T/lt unknown
-
2019
- 2019-08-29 US US16/555,531 patent/US10767278B2/en active Active
-
2020
- 2020-07-28 US US16/940,499 patent/US11015265B2/en active Active
- 2020-07-30 US US16/943,630 patent/US11015266B2/en active Active
-
2021
- 2021-01-21 AU AU2021200399A patent/AU2021200399B2/en active Active
- 2021-04-15 JP JP2021068860A patent/JP7109618B6/ja active Active
- 2021-04-22 US US17/238,150 patent/US20210324538A1/en active Pending
-
2022
- 2022-01-21 CY CY20221100054T patent/CY1124954T1/el unknown
- 2022-06-21 US US17/845,949 patent/US20220341059A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2954467T3 (es) | Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente | |
US10544449B2 (en) | Bis-biotinylation tags | |
US11993807B2 (en) | Affinity reagents having enhanced binding and detection characteristics | |
US20230212322A1 (en) | Systems and methods for biomolecule preparation | |
EP4231174A2 (en) | Methods and systems for computational decoding of biological, chemical, and physical entities | |
EP4127157A1 (en) | Modified dipeptide cleavases, uses thereof and related kits | |
US20210262014A1 (en) | Nanostructure, a biosensor including the nanostructure, and a screening method | |
WO2024107755A1 (en) | Single-molecule peptide sequencing using dithioester and thiocarbamoyl amino acid reactive groups | |
WO2024040236A2 (en) | Determination of protein information by recoding amino acid polymers into dna polymers | |
WO2024015875A2 (en) | Determination of protein information by recoding amino acid polymers into dna polymers |