ES2904997T3 - Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente - Google Patents
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Abstract
Una micropartícula inmovilizada sobre un soporte sólido, en el que dicha micropartícula se une además covalentemente a: (i) un dominio del ligando a través de un primer enlazador; y (ii) un dominio de ácido nucleico a través de un segundo enlazador; en el que dicho dominio de ácido nucleico es una etiqueta codificante que identifica dicho dominio del ligando; en el que dicho segundo enlazador es escindible y dicho primer enlazador no es escindible bajo una condición de que dicho segundo enlazador sea escindible; y dicho primer enlazador comprende -C(O)NH- o -NHC(O)-, y dicho segundo enlazador comprende -C(O)O- u -OC(O)-.
Description
DESCRIPCIÓN
Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente
Antecedentes de la invención
El número de moléculas mostradas por las matrices utilizadas para los métodos de cribado y detección está restringido por el método sintético de la matriz. En teoría, la síntesis de grupo dividido puede generar bibliotecas enormes, limitadas solo por el número de etapas químicas y el número de bloques de construcción únicos utilizados por etapa (es decir, una biblioteca de 5 etapas que utilice 100 bloques de construcción únicos por etapa produciría en teoría biblioteca química de 1005 o 10 mil millones de miembros). Sin embargo, en la práctica, las estrategias de grupo dividido codificadas se enfrentan a numerosas limitaciones prácticas. Las bibliotecas que son decodificables pero no cribables o viceversa no son útiles. La estrategia de codificación puede estar prácticamente limitada en el número y tipo de etapas químicas o bloques de construcción usados. Una plataforma de biblioteca de grupo dividido codificada que requiere partículas grandes para la decodificación (por ejemplo, mediante etiquetas de radiofrecuencia o espectrometría de masas) normalmente necesitará contener menos miembros de biblioteca que una biblioteca similar que se puede crear en partículas más pequeñas. Si los ensayos se van a realizar en una partícula, la densidad del ligando en cada partícula y el entorno químico de la superficie alrededor de cada ligando no deberían interferir con el ensayo. La naturaleza en serie de las estrategias de decodificación informadas también limita el número de "aciertos" que pueden identificarse de manera rentable en un cribado dado y, por lo tanto, pueden limitar el tamaño de una biblioteca que se criba. La presente invención aborda estos y otros problemas de la técnica.
La patente de los Estados Unidos 2006/0040286 se refiere a métodos de selección, composiciones y kits para detectar la presencia o ausencia de uno o más analitos diana, por ejemplo, biomoléculas, en una muestra.
El documento WO 2011/143583 se refiere a composiciones y métodos para analizar la presencia de un analito diana en una muestra utilizando un soporte sólido.
Breve resumen de la invención
En un aspecto, se proporciona una micropartícula inmovilizada sobre un soporte sólido, en el que dicha micropartícula se une además covalentemente a: (i) un dominio del ligando a través de un primer enlazador; y (ii) un dominio de ácido nucleico a través de un segundo enlazador; en el que dicho dominio de ácido nucleico es una etiqueta codificante que identifica dicho dominio del ligando; en el que dicho segundo enlazador es escindible y dicho primer enlazador no es escindible bajo la condición de que dicho segundo enlazador sea escindible; y dicho primer enlazador comprende -C(O)NH- o -NHC(O)-, y dicho segundo enlazador comprende -C(O)O- o - OC(O)-.
En otro aspecto, se proporciona un soporte sólido que comprende una pluralidad de pocillos, en el que cada uno de dicha pluralidad de pocillos comprende una micropartícula capturada, en el que dicha micropartícula está unida covalentemente a: (i) un dominio del ligando a través de un primer enlazador; y (ii) un dominio de ácido nucleico a través de un segundo enlazador; en el que dicho dominio de ácido nucleico, es una etiqueta codificante que identifica dicho dominio del ligando; en el que dicho segundo enlazador es escindible y dicho primer enlazador no es escindible bajo la condición de que dicho segundo enlazador sea escindible; y dicho primer enlazador comprende -C(O)NH- o -NHC(O)-, y dicho segundo enlazador comprende -C(O)O- u -OC(O)-; y en el que dicho dominio del ligando es capaz de unirse a un enlazador de ligando seleccionado de una proteína, una mezcla de proteínas, una molécula pequeña, una mezcla de moléculas pequeñas, un elemento, una mezcla de elementos, un polímero sintético, una mezcla de polímeros sintéticos, o un lisado celular.
Breve descripción de los dibujos
FIGURA 1: Esquema que ilustra la estructura general de las micropartículas utilizadas para crear una biblioteca. La variación en las proporciones de A, B y C se logra mediante una o más transformaciones sintéticas aplicadas al material de partida, partículas de ProMag 1 COOH Series. Las proporciones diana iniciales se establecen mediante proporciones relativas de mezclas de bloques de construcción utilizados para ensamblar la superficie de la partícula. Las relaciones finales logradas se miden mediante una combinación de TGA, LC/MS o análisis en gel de productos escindidos y ensayos en fase sólida basados en fluorescencia o colorimétricos. Intervalos preferidos: X tiene una concentración de 0.1 a 100 nanomoles/mg; 1% de X < A < 20% de X; 40% de X < B < 99% de X; 0% de X < C < 50% de X; en el que X es A (punto de unión de la molécula de biblioteca), B (punto de unión de la etiqueta codificante) o C (punto de inmovilización central).
FIGURA 2: Esquema general de cómo se puede realizar la síntesis de agrupación dividida codificada; enfatizando el aumento exponencial en la diversidad química observado con un aumento lineal en el número de etapas químicas y bloques de construcción. Para una revisión general, véase: Czarnik, A. W. "Encoding methods for combinatory chemistry", Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1,60-66. Ejemplo: 100 bloques de construcción, 6 rondas de grupo dividido, 1 x 1012 miembros únicos, 600 reacciones químicas. n es el número de rondas de grupo dividido, x es el número de bloques de construcción, miembros de biblioteca únicos = Xn, reacciones químicas = nX
FIGURA 3: Una ilustración de los enlaces químicos que se forman y rompen durante una ronda de una etapa de síntesis codificada utilizando síntesis de péptidos como la química que se codifica. En la etapa 1, un aminoácido protegido con Fmoc se acopla a la amina libre en la micropartícula a través de un acoplamiento de amida. En la etapa 2, una etiqueta de ácido nucleico que porta un alquino y una amina primaria libre se acopla al grupo azida en la micropartícula a través de una cicloadición de Huisgen catalizada por cobre. En la etapa 3, se acopla un grupo azida a la amina primaria en el ácido nucleico mediante un acoplamiento de amida. En la etapa 4 se elimina el grupo Fmoc que protege el grupo amina del aminoácido incorporado. El producto que sigue a la etapa 4 muestra las mismas fracciones reactivas que el material de partida (antes de la etapa 1), pero contiene una etiqueta de ácido nucleico adicional y un aminoácido adicional. Véase materiales y métodos para conocer los detalles de la reacción. Véase los materiales y métodos para obtener un ejemplo detallado de cómo se preparan las micropartículas iniciales para la síntesis ortogonal.
FIGURA 4: Esquema que ilustra la conectividad de las etiquetas de ácido nucleico en uno de los enfoques de etiquetado potenciales. En esta variante, durante cada etapa de etiquetado, se consumen todos los puntos de unión de la etiqueta en las micropartículas, y luego se crea una cantidad equivalente de nuevos puntos de unión de la etiqueta en los extremos de las etiquetas de ácido nucleico recién unidas. Dos etapas de etiquetado en este ejemplo conducirían a la generación de predominantemente una única población de oligómeros que contienen ácido nucleico en cada perla que consiste en la etiqueta 1 unida a la etiqueta 2. Téngase en cuenta que, por diseño, cada población de etiquetas se puede decodificar de forma independiente, de modo que la decodificación solo depende de la presencia de cada etiqueta individual, es decir, la decodificabilidad de la etiqueta 2 no depende de que esté directamente unida a la etiqueta 1 y viceversa, de modo que los subconjuntos de perlas que pueden no haber pasado a la conversión completa en cualquiera de las etapas de etiquetado siguen siendo decodificables, siempre que haya cantidades suficientes de cada etiqueta para decodificación.
FIGURA 5: Esquema que ilustra la conectividad de las etiquetas de ácido nucleico en uno de los enfoques de etiquetado potenciales. En esta variante, durante cada etapa de etiquetado, solo se consume una fracción de los puntos de unión de la etiqueta en la micropartícula para las etiquetas. Como se muestra, dos etapas de etiquetado en este ejemplo conducirían a la generación de dos poblaciones de oligómeros que contienen ácido nucleico en cada población de perlas una que consta de la etiqueta 1 y una población que consta de la etiqueta 2. Para cuatro etapas de etiquetado, se generarían cuatro poblaciones únicas por perla.
FIGURA 6: Esquema que ilustra la conectividad de las etiquetas de ácido nucleico en uno de los enfoques de etiquetado potenciales. En esta variante, durante cada etapa de etiquetado, se consume una fracción de los puntos de unión de la etiqueta en las micropartículas, y luego se crea una cantidad equivalente de nuevos puntos de unión de la etiqueta en los extremos de las etiquetas de ácido nucleico recién unidas. Dos etapas de etiquetado en este ejemplo conducirían a la generación de tres poblaciones de oligómeros que contienen ácido nucleico en cada perla, etiqueta 1, etiqueta 2 y un oligómero que consiste en la etiqueta 1 unida a la etiqueta 2. Téngase en cuenta que, por diseño, cada población de etiquetas se puede decodificar de forma independiente, de modo que la decodificación de cada etiqueta solo depende de la presencia de cada etiqueta individual, es decir, la decodificación de la etiqueta 2 no depende de que esté directamente unida a la etiqueta 1 y viceversa.
FIGURA 7: Trazas de LC de los diferentes compuestos intermedios de la etiqueta durante una ronda de etiquetado y la adición de un nuevo elemento de enlace a la etiqueta. Como lo demuestran los cambios en el tiempo de retención y los espectros de masas, la química de cicloadición en fase sólida produce predominantemente el producto deseado. Después del acoplamiento de amida en fase sólida de un nuevo elemento de enlace de etiqueta, el análisis LC/MS indica la conversión al producto deseado. Véase materiales y métodos para conocer las condiciones de cicloadición, las condiciones de acoplamiento de amidas y las condiciones de escisión.
FIGURA 8: Una porción de las micropartículas modificadas con PEG se funcionalizó con un enlazador lábil a los ácidos y se sometió a una síntesis de péptidos en fase sólida de siete etapas. El producto se separó de las micropartículas usando TFA. Se eliminó el TFA y el residuo se analizó mediante espectrometría de masas, lo que demostró una síntesis exitosa del péptido deseado.
FIGURAS 9A-9B: Demostración de dos modos diferentes de inmovilización de bibliotecas. En la Figura 9A, una imagen de campo claro de una porción de micropartículas de los solicitantes inmovilizadas covalentemente a un portaobjetos recubierto con carboximetildextrano activado a través de la formación de un enlace amida. En la Figura 9B a la derecha, una imagen de SEM de una parte de las micropartículas de los solicitantes inmovilizadas no covalentemente dentro de una oblea de silicio microfabricada personalizada.
FIGURA 10: Las micropartículas que experimentan cuatro rondas de etapas de codificación/etiquetado (como se describe en el esquema de codificación de la Figura 6 se pueden decodificar correctamente. Se sometieron dos porciones diferentes de micropartículas en paralelo a cuatro rondas de etiquetado como se ilustra en la Figura 6. Cada porción de micropartículas se etiquetó con 18 mer únicas en cada etapa de etiquetado. Después de las cuatro rondas de codificación, cada porción se expuso a una serie de soluciones de hibridación que contenían una mezcla 1:1 de dos sondas diferentes de oligonucleótidos marcadas en forma fluorescente. Se muestran ocho imágenes fluorescentes de dos canales diferentes de alícuotas de las micropartículas etiquetadas después de la hibridación. En la columna 1, las dos muestras de micropartículas se hibridaron con una mezcla 1:1 de oligonucleótido etiquetado con Cy3
complementario de A0, y un oligonucleótido etiquetado con FITC complementario de A1. Como se esperaba, las partículas codificadas con la etiqueta A0 emitieron fluorescencia en el canal rojo (Cy3) (imagen superior, columna 1) y las partículas codificadas con la etiqueta A1 emitieron fluorescencia en el canal verde (FITC) (imagen inferior, columna 2). La tendencia es cierta para todas las demás condiciones de hibridación, en las que las partículas fluorescen selectivamente en la longitud de onda correspondiente a la etiqueta fluorescente unida a la etiqueta de secuencia de ADN complementaria, en lugar de una etiqueta no coincidente.
FIGURA 11: Las micropartículas que se someten a cuatro rondas de etapas de codificación/etiquetado (como se describe en la Figura 5 se pueden decodificar correctamente. Se sometieron dos porciones diferentes de micropartículas en paralelo a cuatro rondas de etiquetado como se ilustra en la Figura 5. Cada porción de micropartículas se etiquetó con un 18 mer único en cada etapa de etiquetado. Después de las cuatro rondas de codificación, cada porción se expuso a una serie de soluciones de hibridación que contenían una mezcla 1:1 de dos sondas diferentes de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia. Se muestran ocho imágenes fluorescentes de dos canales diferentes de alícuotas de las micropartículas etiquetadas después de hibridación. En la columna 1, las dos muestras de micropartículas se hibridaron con una mezcla 1:1 de oligonucleótidos etiquetados con Cy3 complementario a A0, y un oligonucleótido etiquetado con FITC complementario a A1. Como se esperaba, las partículas codificadas con la etiqueta A0 emitieron fluorescencia en el canal rojo (Cy3) (imagen superior, columna 1) y las partículas codificadas con la etiqueta A1 emitieron fluorescencia en el canal verde (FITC) (imagen inferior, columna 2). La tendencia es válida para todas las demás condiciones de hibridación, en las que las partículas emiten fluorescencia selectiva en la longitud de onda correspondiente a la etiqueta fluorescente adherida a la etiqueta de secuencia de ADN complementaria, en lugar de una etiqueta no coincidente.
FIGURA 12: Para demostrar que la síntesis de péptidos es compatible con la química de codificación de los solicitantes, se sintetizaron dos péptidos (HA y Myc, dos epítopos de anticuerpos comunes) en paralelo en las micropartículas en las que cuatro de las etapas de síntesis se codificaron con etiquetas de ADN. Las partículas se incubaron con un anticuerpo etiquetado con Cy5 específico del epítopo HA en varias etapas de la síntesis. Las micropartículas que mostraban etiquetas de ADN y péptido HA completamente protegido (en el que las fracciones protectoras de la cadena lateral no se han eliminado) no se unieron al anticuerpo etiquetado (imágenes de la fila superior). Después de la escisión de las etiquetas de ADN, las micropartículas que muestran el péptido HA protegido en la cadena lateral no se unen al anticuerpo etiquetado (imágenes de la segunda fila). Después de la desprotección de las fracciones protectores de la cadena lateral (tratamiento con TFA), las micropartículas que muestran HA se unen ahora al anticuerpo etiquetado (imágenes de la tercera fila). Las micropartículas que muestran el péptido Myc completamente desprotegido no se unen al anticuerpo etiquetado (imágenes de la cuarta fila)
FIGURA 13: Para demostrar que la síntesis de péptidos es compatible con la química de codificación de los solicitantes, se sintetizaron dos péptidos (HA y Myc, dos epítopos de anticuerpos comunes) en paralelo en micropartículas en las que cuatro de las etapas de síntesis se codificaron con etiquetas de ADN. Las partículas se incubaron con un anticuerpo etiquetado con Alexa Fluor 488 específico para el epítopo Myc en diferentes etapas de la síntesis. Las micropartículas que mostraban etiquetas de ADN y péptido Myc completamente protegido (en el que no se han eliminado las fracciones protectores de la cadena lateral) no se unieron al anticuerpo etiquetado (imágenes de la fila superior). Después de la escisión de las etiquetas de ADN, las micropartículas que muestran el péptido Myc protegido de la cadena lateral no se unen al anticuerpo etiquetado (imágenes de la segunda fila). Después de la desprotección de las fracciones protectores de la cadena lateral (tratamiento con TFA), las micropartículas que muestran Myc ahora se unen al anticuerpo etiquetado (imágenes de la tercera fila). Las micropartículas que muestran el péptido HA completamente desprotegido no se unen al anticuerpo etiquetado (imágenes de la cuarta fila).
FIGURA 14: La mezcla de perlas y tintes demuestra la capacidad de diferenciar la unión. Se mezclaron perlas sin etiqueta que portaban péptido HA o péptido Myc completamente desprotegido y se tiñeron con una mezcla de anti-HA-Cy5 y anti-Myc-Alexa 488. Las imágenes de fluorescencia indican dos poblaciones de perlas distintas.
FIGURA 15A-FIGURA 15H: La Figura 15A muestra SEM de las partículas ProMag de 0.88 pm. La Figura 15B muestra un chip de silicio con un espaciado de pozos de centro a centro de 1.3 pm en un patrón hexagonal. La Figura 15C muestra un chip de silicio con un espaciado de centro a centro de 1.3 pm de pozos en un patrón cuadrado. La Figura
15D muestra un chip de silicio con un espaciado de centro a centro de 1.3 pm de pozos en un patrón cuadrado, parcialmente lleno de microesferas. La Figura 15E muestra un chip de silicio con un espaciado de centro a centro de
1.3 pm de pozos en un patrón hexagonal, lleno de microesferas. La Figura 15F muestra un chip de silicio con un espaciado de centro a centro de 1.3 pm de pozos en un patrón hexagonal, lleno de microesferas inclinadas. La Figura
15G muestra una imagen fluorescente de microesferas marcadas con Alexa Fluor 488 inmovilizadas en un chip de silicio parcialmente lleno con un espaciado de centro a centro de 1.3 pm de los pocillos en un patrón hexagonal. La Figura 15H muestra una imagen de campo brillante de microesferas inmovilizadas en un chip de cuarzo parcialmente lleno con un espaciado de centro a centro de 1.3 pm de pozos en un patrón hexagonal.
FIGURA 16A-FIGURA 16D: La Figura 16A muestra la autofluorescencia de microesferas inmovilizadas en un chip de cuarzo parcialmente lleno con una separación de centro a centro de 1.3 pm de los pocillos en un patrón hexagonal.
La Figura 16B muestra un chip de silicio con una separación de centro a centro de los pocillos de 2.4 pm en un patrón hexagonal. La Figura 16C muestra un chip de silicio con una separación de centro a centro de los pocillos de 2.4 pm en un patrón hexagonal, parcialmente lleno de microesferas. La Figura 16D muestra una imagen fluorescente de
microesferas marcadas con ADN hibridadas con complementos de ADN etiquetados con fluorescencia inmovilizados en un chip de silicio. El chip está parcialmente lleno y tiene una separación de centro a centro de los pozos de 2.4 |jm en un patrón hexagonal.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Los títulos de las secciones que se utilizan en este documento son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito.
Las abreviaturas utilizadas en este documento tienen su significado convencional dentro de las técnicas química y biológica. Las estructuras químicas y fórmulas establecidas en este documento se construyen de acuerdo con las reglas estándar de valencia química conocidas en las técnicas químicas.
Cuando los grupos sustituyentes se especifican mediante sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes químicamente idénticos que resultarían de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, -CH2O- es equivalente a -OCH2-.
El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena carbonada (o carbono) lineal (es decir, no ramificada) o no cíclica ramificada, o una combinación de las mismas, que puede estar completamente saturada, monoinsaturada o poliinsaturada y puede incluir radicales di y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designado (es decir, C1-C10 significa de uno a diez carbonos). Los ejemplos de radicales hidrocarbonados saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, (ciclohexil)metilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, entre otros, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1 y 3-propinilo, 3-butinilo y los homólogos e isómeros superiores. Un alcoxi es un alquilo unido al resto de la molécula a través de un enlazador de oxígeno (-O-). Una fracción alquilo puede ser una fracción alquenilo. Una fracción alquilo puede ser una fracción alquinilo. Una fracción alquilo puede estar completamente saturada.
El término "alquileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical divalente derivado de un alquilo, como se ejemplifica, pero no se limita a, -CH2CH2CH2CH2-. Normalmente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, prefiriéndose en la presente invención aquellos grupos que tengan 10 o menos átomos de carbono. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que generalmente tiene ocho o menos átomos de carbono. El término "alquenileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical divalente derivado de un alqueno.
El término "heteroalquilo", por sí mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena lineal o ramificada no cíclica estable, o combinaciones de las mismas, que incluyen al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consta de O, N, P, Si y S, y en el que los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. El heteroátomo o heteroátomos O, N, P, S y Si se pueden colocar en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la que el grupo alquilo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3 , -CH2-CH2 , -S(O)-CH3 , -CH2-CH2-S(O)2-CH3 , -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3 , -CH2-CH=N-OCH3 , -CH=CH-N(CH3)-CH3 , -O-CH3, -O-CH2-CH3, y -CN. Hasta dos o tres heteroátomos pueden ser consecutivos, como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. Una fracción heteroalquilo puede incluir un heteroátomo (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heteroalquilo puede incluir dos heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heteroalquilo puede incluir tres heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heteroalquilo puede incluir cuatro heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heteroalquilo puede incluir cinco heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heteroalquilo puede incluir hasta 8 heteroátomos opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P).
De manera similar, el término "heteroalquileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no se limita a, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar uno o ambos extremos de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilenodioxi, alquilenamino, alquilendiamino y similares). Además, para los grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, no está implícita la orientación del grupo de enlace por la dirección en la cual se escribe la fórmula del grupo de enlace. Por ejemplo, la fórmula -C(O)2R'- representa ambos -C(O)2R'- y -R'C(O)2-. Como se describió anteriormente, los grupos heteroalquilo, como se usan en este documento, incluyen aquellos grupos que están unidos al resto de la molécula a través de un heteroátomo, tales como -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R" , -OR', -SR' y/o -SO2R'. Cuando se menciona "heteroalquilo", seguido por la mención de grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares, se entenderá que los términos heteroalquilo y -NR'R" no son redundantes ni mutuamente excluyentes. Por el contrario, los grupos
heteroalquilo específicos se enumeran para añadir claridad. Por lo tanto, el término "heteroalquilo" no debe interpretarse en el presente documento como que excluye grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares.
Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por sí mismos o en combinación con otros términos, significan, a menos que se indique lo contrario, versiones cíclicas no aromáticas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente, en las que los carbonos que forman el anillo o anillos no necesariamente necesitan estar unidos a un hidrógeno debido a que todas las valencias de carbono participan en enlaces con átomos que no son de hidrógeno. Además, para el heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la que el heterociclo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo, 3-hidroxiciclobut-3-enil-1,2-diona, 1H-1,2,4-triazolil-5(4H)-ona, 4H-1,2,4-triazolilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1-piperidiniío, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo y similares. Un "cicloalquileno" y un "heterocicloalquileno", solos o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de un cicloalquilo y heterocicloalquilo, respectivamente. Una fracción heterocicloalquilo puede incluir un heteroátomo de anillo (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heterocicloalquilo puede incluir dos heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heterocicloalquilo puede incluir tres heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heterocicloalquilo puede incluir cuatro heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heterocicloalquilo puede incluir cinco heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P). Una fracción heterocicloalquilo puede incluir hasta 8 heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N, S, Si o P).
Los términos "halo" o "halógeno", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Además, se pretende que términos como "haloalquilo" incluyan monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "halo alquilo(Ci-C4)" incluye, pero no se limita a, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo y similares.
El término "acilo" significa, a menos que se indique lo contrario, -C(O)R en el que R es un alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido.
El término "arilo" significa, a menos que se indique lo contrario, un sustituyente de hidrocarburo aromático poliinsaturado, que puede ser un solo anillo o múltiples anillos (preferiblemente de 1 a 3 anillos) que están fusionados entre sí (es decir, un arilo de anillo fusionado) o enlazados covalentemente. Un arilo de anillo fusionado se refiere a múltiples anillos fusionados entre sí en los que al menos uno de los anillos fusionados es un anillo arilo. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen al menos un heteroátomo tal como N, O o S, en el que los átomos de nitrógeno y azufre están opcionalmente oxidados y el átomo o átomos de nitrógeno están opcionalmente cuaternizados. Por lo tanto, el término "heteroarilo" incluye grupos heteroarilo de anillo fusionado (es decir, múltiples anillos fusionados entre sí en los que al menos uno de los anillos fusionados es un anillo heteroaromático). Un heteroarileno de anillo fusionado 5,6 se refiere a dos anillos fusionados entre sí, en el que un anillo tiene 5 miembros y el otro anillo tiene 6 miembros, y en el que al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Asimismo, un heteroarileno de anillo fusionado 6,6 se refiere a dos anillos fusionados entre sí, en el que un anillo tiene 6 miembros y el otro anillo tiene 6 miembros, y en el que al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Y un heteroarileno de anillo fusionado 6,5 se refiere a dos anillos fusionados entre sí, en el que un anillo tiene 6 miembros y el otro anillo tiene 5 miembros, y en el que al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Se puede unir un grupo heteroarilo al resto de la molécula a través de un carbono o heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillos de arilo y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables que se describen a continuación. Un "arileno" y un "heteroarileno", solos o como parte de otro sustituyente, significan un radical divalente derivado de un arilo y heteroarilo, respectivamente. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen piridinilo, pirimidinilo, tiofenilo, tienilo, furanilo, indolilo, benzoxadiazolilo, benzodioxolilo, benzodioxanilo, tianaftanilo, pirrolopiridinilo, indazolilo, quinolinilo, quinoxalinilo, piridopirazinilo, quinaxolinonilo, benzoisoxazolilo, imidazopiridinilo, benzofuranilo, benzotienilo, benzotiofenilo, fenilo, naftilo, bifenilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, pirazinilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, furiltienilo, piridilo, pirimidilo, benzotiazolilo, purinilo, bencimidazolilo, isoquinolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, pirrolilo, diazolilo, triazolilo tetrazolilo, benzotiadiazolilo, isotiazolilo, pirazolopirimidinilo, pirrolopirimidinilo, benzotriazolilo, benzoxazolilo o quinolilo. Los ejemplos anteriores pueden estar sustituidos o no sustituidos y los radicales divalentes de cada ejemplo de heteroarilo anterior son ejemplos no limitantes de heteroarileno. Una fracción heteroarilo puede incluir un heteroátomo de anillo (por ejemplo, O, N o S). Una fracción heteroarilo puede incluir dos heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N o S). Una fracción heteroarilo puede incluir tres heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N o S). Una fracción heteroarilo puede incluir cuatro heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes (por ejemplo, O, N o S). Una fracción heteroarilo puede incluir cinco heteroátomos de anillo opcionalmente diferentes
(por ejemplo, O, N o S). Una fracción arilo puede tener un solo anillo. Una fracción arilo puede tener dos anillos opcionalmente diferentes. Una fracción arilo puede tener tres anillos opcionalmente diferentes. Una fracción arilo puede tener cuatro anillos opcionalmente diferentes. Una fracción heteroarilo puede tener un anillo. Una fracción heteroarilo puede tener dos anillos opcionalmente diferentes. Una fracción heteroarilo puede tener tres anillos opcionalmente diferentes. Una fracción heteroarilo puede tener cuatro anillos opcionalmente diferentes. Una fracción heteroarilo puede tener cinco anillos opcionalmente diferentes.
Un heterocicloalquil-arilo de anillo fusionado es un arilo fusionado a un heterocicloalquilo. Un heterocicloalquilheteroarilo de anillo fusionado es un heteroarilo fusionado a un heterocicloalquilo. Un heterocicloalquil-cicloalquilo de anillo fusionado es un heterocicloalquilo fusionado a un cicloalquilo. Un heterocicloalquil-heterocicloalquilo de anillo fusionado es un heterocicloalquilo fusionado a otro heterocicloalquilo. Un heterocicloalquil-arilo de anillo fusionado, heterocicloalquil-heteroarilo de anillo fusionado, heterocicloalquil-cicloalquilo de anillo fusionado o heterocicloalquilheterocicloalquilo de anillo fusionado pueden estar cada uno independientemente no sustituido o sustituido con uno o más de los sustituyentes descritos en el presente documento.
El término "oxo", como se usa en este documento, significa un oxígeno que está doblemente unido a un átomo de carbono.
El término "alquilsulfonilo", como se usa en este documento, significa una fracción que tiene la fórmula -S(O2)-R', en la que R' es un grupo alquilo sustituido o no sustituido como se definió anteriormente. R' puede tener un número específico de carbonos (por ejemplo, "alquilsulfonilo C1-C4").
Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "cicloalquilo", "heterocicloalquilo", "arilo" y "heteroarilo") incluye formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan a continuación.
Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluidos los grupos a menudo denominados alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados, pero no limitados a, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R")=NRm, -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2N(R)("R"-NRSO2R'), -CN y -NO2 en un número que va desde cero a (2m'+1), en el que m' es el número total de átomos de carbono en dicho radical. R', R", R"' y R"" cada uno preferiblemente se refiere independientemente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos), grupos alquilo, alcoxi o tioalcoxi sustituidos o no sustituidos, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente al igual que cada grupo R', R", Rm y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos. Cuando R' y R" están unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 4, 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" incluye, pero no se limita a, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la discusión anterior de sustituyentes, un experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" pretende incluir grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos distintos de los grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH3 , -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, y similares).
De manera similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo son variados y se seleccionan entre, por ejemplo: -OR', -NR'R", -SR', -halógeno, - SiR'R"Rm, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"Rm, NR"C(O)2R', NRC(NR'R")=NRm, S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2N(R')(R", -NRSO2R'), -CN, -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, flúoroalcoxi-(C1-C4) y fluoroalquilo-(C1-C4), en un número que va desde cero hasta el número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y en el que R', R", Rm y R"" se seleccionan preferiblemente independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente al igual que cada grupo R', R", Rm y R"" cuando más de uno de estos grupos está presente.
Cuando una fracción está sustituida con un sustituyente R, el grupo puede denominarse "sustituido con R". Cuando una fracción está sustituida con R, la fracción está sustituida con al menos un sustituyente R y cada sustituyente R es opcionalmente diferente. Por ejemplo, cuando una fracción en este documento es alquilo sustituido o no sustituido con R1A, una pluralidad de sustituyentes R1A pueden estar unidos a la fracción alquilo en la que cada sustituyente R1A es opcionalmente diferente. Cuando una fracción sustituido con R está sustituida con una pluralidad de sustituyentes R, cada uno de los sustituyentes R se puede diferenciar en el presente documento usando un símbolo prima (') tal como R', R", etc. Por ejemplo, cuando una fracción es alquilo sustituido o no sustituido con R1A, y la fracción está sustituida con una pluralidad de sustituyentes R1A, la pluralidad de los sustituyentes R1A se pueden diferenciar como R1A', R1A", R1Am, etc. En algunas realizaciones, la pluralidad de los sustituyentes R es 3. En algunas realizaciones, la pluralidad de los sustituyentes R es 2.
En realizaciones, un compuesto como se describe en el presente documento puede incluir múltiples instancias de R1, R2 , R3, R4, R5 , R6 , R6A, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23 y/u otros sustituyentes
y variables. En tales realizaciones, cada variable puede ser opcionalmente diferente y etiquetarse apropiadamente para distinguir cada grupo para mayor claridad. Por ejemplo, cuando cada R6A es diferente, pueden denominarse, por ejemplo, como R6 A 1 , R6 A 2 , R6 A 3 o R6 A 4 , respectivamente, en las que la definición de R6A es asumido por R6 A 1 , R6 A 2 ,
R6 A 3 , y/o R6 A 4. Las variables utilizadas dentro de una definición de R1, R2, R3, R4, R5 , R6 , R6A, R7, R8 , R9 , R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23, y/u otras variables que aparecen en múltiples instancias y son diferentes de manera similar pueden etiquetarse apropiadamente de manera similar para distinguir cada grupo para mayor claridad.
Se pueden unir opcionalmente dos o más sustituyentes para formar grupos arilo, heteroarilo, cicloalquilo o heterocicloalquilo. Dichos sustituyentes denominados formadores de anillos se encuentran típicamente, aunque no necesariamente, unidos a una estructura de base cíclica. En una realización, los sustituyentes formadores de anillos se unen a miembros adyacentes de la estructura base. Por ejemplo, dos sustituyentes formadores de anillos unidos a miembros adyacentes de una estructura base cíclica crean una estructura de anillo fusionado. En otra realización, los sustituyentes formadores de anillos se unen a un solo miembro de la estructura base. Por ejemplo, dos sustituyentes formadores de anillos unidos a un solo miembro de una estructura base cíclica crean una estructura espirocíclica. En otra realización más, los sustituyentes formadores de anillos están unidos a miembros no adyacentes de la estructura base.
Dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden formar opcionalmente un anillo de fórmula -TC(O)-(CRR')q-U-, en la que T y U son independientemente -NR-, -O-, -CRR'-, o un enlace sencillo, y q es un número entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo se pueden reemplazar opcionalmente con un sustituyente de fórmula -A-(CH2)r-B-, en la que A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'-, o un enlace sencillo, y r es un número entero de 1 a 4. Uno de los enlaces sencillos del nuevo anillo así formado puede reemplazarse opcionalmente por un enlace doble. Alternativamente, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden opcionalmente reemplazarse con un sustituyente de fórmula -(CRR%-X'-(C"R"Rm)d-, cuando las variables s y d son independientemente enteros de 0 a 3, y X' es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, o S(O)2NR'-. Los sustituyentes R, R', R" y R'" se seleccionan preferiblemente independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido.
Como se usa en este documento, los términos "heteroátomo" o "heteroátomo de anillo" pretenden incluir oxígeno (O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P) y silicio (Si).
Un "grupo sustituyente", como se usa en este documento, significa un grupo seleccionado de las siguientes fracciones:
(A) oxo, halógeno, -CF3 , -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2 , -NO2, -SH, -SO2C -SO3H, -SO4H, -SO2NH2 , -NHNH2, -ONH2 , -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O)NH2 , -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3 , -OCHF2, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y
(B) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado entre:
(i) oxo, halógeno, -CF3 , -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2 , -SH, -SO2Cl, -SO3H, - SO4H, -SO2NH2, -NHNH2 , -ONH2 , -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O)NH2 , -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3 , -OCHF2, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y
(ii) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado entre:
(a) oxo, halógeno, -CF3, -CN, -OH, -NH2 , -COOH, -CONH2 , -NO2, -SH, -SO2C -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2 , -ONH2 , -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O)NH2 , -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3 , -OCHF2, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y
(b) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado entre: oxo, halógeno, -CF3 , -CN, -OH, -NH2 , -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2 , -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2 , -NHC=(O)NH2 , -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3 , -OCHF2 , alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido.
Un "sustituyente de tamaño limitado" o "grupo sustituyente de tamaño limitado", como se usa en el presente documento, significa un grupo seleccionado de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en el que cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada arilo sustituido o
no sustituido es un arilo C6-C10 sustituido o no sustituido, y cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido o no sustituido.
Un "sustituyente inferior" o "grupo sustituyente inferior", como se usa en este documento, significa un grupo seleccionado de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en el que cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C3-C7 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros sustituido o no sustituido, cada arilo sustituido o no sustituido es un arilo C6-C10 sustituido o no sustituido, y cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo de 5 a 9 miembros sustituido o no sustituido.
En algunas realizaciones, cada grupo sustituido descrito en los compuestos de este documento está sustituido con al menos un grupo sustituyente. Más específicamente, en algunas realizaciones, cada alquilo sustituido, heteroalquilo sustituido, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo sustituido, arilo sustituido, heteroarilo sustituido, alquileno sustituido, heteroalquileno sustituido, cicloalquileno sustituido, heterocicloalquileno sustituido, arileno sustituido y/o heteroarileno sustituido descritos en los compuestos en este documento están sustituidos con al menos un grupo sustituyente. En otras realizaciones, al menos uno o todos estos grupos están sustituidos con al menos un grupo sustituyente de tamaño limitado. En otras realizaciones, al menos uno o todos estos grupos están sustituidos con al menos un grupo sustituyente inferior.
En otras realizaciones de los compuestos del presente documento, cada alquilo sustituido o no sustituido puede ser un alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C3-C8 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada arilo sustituido o no sustituido es un arilo C6-C10 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones de los compuestos del presente documento, cada alquileno sustituido o no sustituido es un alquileno C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquileno sustituido o no sustituido es un heteroalquileno de 2 a 20 sustituido o no sustituido miembros, cada cicloalquileno sustituido o no sustituido es un cicloalquileno C3-C8 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquileno sustituido o no sustituido es un heterocicloalquileno de 3 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada arileno sustituido o no sustituido es un arileno C6-C10 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarileno sustituido o no sustituido es un heteroarileno de 5 a 10 miembros sustituido o no sustituido.
En algunas realizaciones, cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido o, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C3-C7 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros sustituido o no sustituido, cada arilo sustituido o no sustituido es un arilo C6-C10 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarilo sustituido o no sustituido es un heteroarilo de 5 a 9 miembros sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, cada alquileno sustituido o no sustituido es un alquileno C1-C8 sustituido o no sustituido, cada heteroalquileno sustituido o no sustituido es un heteroalquileno de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquileno sustituido o no sustituido es un cicloalquileno C3-C7 sustituido o no sustituido, cada heterocicloalquileno sustituido o no sustituido es un heterocicloalquileno de 3 a 7 miembros sustituido o no sustituido, cada arileno sustituido o no sustituido es un arileno C6-C10 sustituido o no sustituido, y/o cada heteroarileno sustituido o no sustituido es un heteroarileno de 5 a 9 miembros sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, el compuesto es una especie química expuesta en la sección de Ejemplos, figuras o tablas a continuación.
Los términos "un" o "uno, una", como se usan en este documento, significan uno o más. Además, la frase "sustituido con uno, una", como se usa en este documento, significa que el grupo especificado puede estar sustituido con uno o más de cualquiera o todos los sustituyentes mencionados. Por ejemplo, cuando un grupo, tal como un grupo alquilo o heteroarilo, está "sustituido con un alquilo C1-C2 0 no sustituido, o heteroalquilo de 2 a 20 miembros no sustituido", el grupo puede contener uno o más alquilos C1-C20 no sustituidos y/o uno o más heteroalquilos de 2 a 20 miembros no sustituidos. Además, cuando una fracción está sustituida con un sustituyente R, el grupo puede denominarse "sustituido con R". Cuando una fracción está sustituida con R, la fracción está sustituida con al menos un sustituyente R y cada sustituyente R es opcionalmente diferente.
El símbolo " xrtruxo" denota el punto de unión de una fracción química al resto de una molécula o fórmula química.
Las descripciones de los compuestos de la presente invención están limitadas por los principios de enlace químico conocidos por los expertos en la técnica. En consecuencia, cuando un grupo puede estar sustituido por uno o más de varios sustituyentes, dichas sustituciones se seleccionan para cumplir con los principios de enlace químico y producir compuestos que no son inherentemente inestables y/o que serían conocidos por alguien capacitado en la técnica probablemente sean inestables en condiciones ambientales, tales como condiciones acuosa, neutra y varias condiciones fisiológicas conocidas. Por ejemplo, un heterocicloalquilo o heteroarilo se une al resto de la molécula a través de un heteroátomo de anillo de acuerdo con los principios de enlace químico conocidos por los expertos en la técnica, evitando así compuestos inherentemente inestables.
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia. Vease, por ejemplo, Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Cualquier método, dispositivo y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica de esta descripción.
Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos utilizados con frecuencia en el presente documento y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación.
"Ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria, bicatenaria o múlticatenaria, o complementos de los mismos. El término "polinucleótido" se refiere a una secuencia lineal de nucleótidos. El término "nucleótido" se refiere típicamente a una sola unidad de un polinucleótido, es decir, un monómero. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o versiones modificadas de los mismos. Los ejemplos de polinucleótidos contemplados en este documento incluyen ADN monocatenario y bicatenario, ARN monocatenario y bicatenario (incluido ARNip) y moléculas híbridas que tienen mezclas de ADN y ARN monocatenario y bicatenario. Los ácidos nucleicos pueden ser lineales o ramificados. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser una cadena lineal de nucleótidos o los ácidos nucleicos pueden estar ramificados, por ejemplo, de manera que los ácidos nucleicos comprendan uno o más brazos o ramas de nucleótidos. Opcionalmente, los ácidos nucleicos ramificados se ramifican repetidamente para formar estructuras de orden superior tales como dendrímeros y similares.
Los ácidos nucleicos, incluidos los ácidos nucleicos con una cadena principal de fosfotioato, pueden incluir una o más fracciones reactivas. Como se usa en este documento, el término fracción reactiva incluye cualquier grupo capaz de reaccionar con otra molécula, por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido a través de interacciones covalentes, no covalentes u otras. A modo de ejemplo, el ácido nucleico puede incluir una fracción reactiva de aminoácidos que reacciona con un aminoácido en una proteína o polipéptido a través de una interacción covalente, no covalente o de otro tipo.
Los términos también abarcan ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de la estructura modificada, que son sintéticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, derivados de fosfodiéster que incluyen, por ejemplo, fosforamidato, fosforodiamidato, fosforotioato (también conocido como fosfotioato), fosforoditioato, ácidos fosfonocarboxílicos, fosfonocarboxilatos, ácido fosfonoacético, ácido fosfonofórmico, metilfosfonato, borofosfonato, o enlaces O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press); y cadenas principales y enlaces peptídicos de ácidos nucleicos. Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con cadenas principales positivas; cadenas principales no iónicas, azúcares modificados y cadenas principales no ribosa (por ejemplo, oligos morfolino fosforodiamidato o ácidos nucleicos bloqueados (LNA)), incluidos los descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,235,033 y 5,034,506, y los Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se incluyen dentro de una definición de ácidos nucleicos. Las modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato se pueden realizar por una variedad de razones, por ejemplo, para aumentar la estabilidad y la vida media de dichas moléculas en entornos fisiológicos o como sondas en un biochip. Se pueden preparar mezclas de ácidos nucleicos y análogos de origen natural; alternativamente, pueden prepararse mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos y mezclas de ácidos nucleicos y análogos de origen natural. En realizaciones, los enlaces internucleotídicos en el ADN son fosfodiéster, derivados de fosfodiéster o una combinación de ambos.
Los ácidos nucleicos pueden incluir secuencias no específicas. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia no específica" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene una serie de residuos que no están diseñados para ser complementarios o son solo parcialmente complementarios a cualquier otra secuencia de ácido nucleico. A modo de ejemplo, una secuencia de ácido nucleico no específica es una secuencia de residuos de ácido nucleico que no funciona como un ácido nucleico inhibidor cuando entra en contacto con una célula u organismo. Un "ácido nucleico inhibidor" es un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, polímero de análogos de nucleótidos) que es capaz de unirse a un ácido nucleico diana (por ejemplo, un ARNm traducible a una proteína) y reducir la transcripción del ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm de ADN) o reducir la traducción del ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm) o alterar el empalme del transcrito (por ejemplo, oligo de morfolino monocatenario).
Un "ácido nucleico u oligonucleótido etiquetado" es uno que está unido, ya sea covalentemente, a través de un enlazador o enlace químico, o no covalentemente, a través de enlaces iónicos, van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a una etiqueta de manera que la presencia del ácido nucleico puede detectarse detectando la presencia de la etiqueta detectable unida al ácido nucleico. Alternativamente, un método que usa interacciones de alta afinidad puede lograr los mismos resultados cuando uno de un par de compañeros de unión se une al otro, por ejemplo, biotina, estreptavidina. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye una etiqueta detectable, como se describe en el presente documento y se conoce generalmente en la técnica.
El término "sonda" o "cebador", como se usa en este documento, se define como uno o más fragmentos de ácido nucleico cuya hibridación específica con una muestra puede detectarse. Una sonda o cebador puede tener cualquier longitud dependiendo de la técnica particular para la que se utilizará. Por ejemplo, los cebadores de PCR generalmente tienen entre 10 y 40 nucleótidos de longitud, mientras que las sondas de ácido nucleico para, por ejemplo, una transferencia Southern, pueden tener una longitud de más de cien nucleótidos. La sonda puede no estar etiquetada o etiquetada como se describe a continuación para que se pueda detectar su unión a la diana o muestra. La sonda se puede producir a partir de una fuente de ácidos nucleicos a partir de una o más porciones particulares (preseleccionadas) de un cromosoma, por ejemplo, uno o más clones, un cromosoma completo aislado o un fragmento de cromosoma, o una colección de productos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La longitud y complejidad del ácido nucleico fijado sobre el elemento diana no es crítica para la invención. Un experto en la materia puede ajustar estos factores para proporcionar una hibridación y una producción de señales óptimas para un procedimiento de hibridación dado, y para proporcionar la resolución requerida entre diferentes genes o ubicaciones genómicas.
La sonda también puede ser ácidos nucleicos aislados inmovilizados sobre una superficie sólida (por ejemplo, nitrocelulosa, vidrio, cuarzo, portaobjetos de sílice fundida), como en una matriz. En algunas realizaciones, la sonda puede ser miembro de una matriz de ácidos nucleicos como se describe, por ejemplo, en el documento WO 96/17958. También se pueden utilizar para este propósito técnicas capaces de producir matrices de alta densidad (véase, por ejemplo, Fodor (1991) Science 767-773; Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; patente de los Estados Unidos No. 5,143,854).
Las palabras "complementario" o "complementariedad" se refieren a la capacidad de un ácido nucleico en un polinucleótido para formar un par de bases con otro ácido nucleico en un segundo polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia A-G-T es complementaria a la secuencia T-C-A. La complementariedad puede ser parcial, en la que solo algunos de los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases, o completa, cuando todos los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases.
El ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o líder secretor está operativamente unido al ADN de un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen están próximas entre sí y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se logra mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
El término "gen" significa el segmento de ADN involucrado en la producción de una proteína; incluye regiones que preceden y siguen a la región codificante (líder y cola) así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones). El líder, la cola y los intrones incluyen elementos reguladores que son necesarios durante la transcripción y traducción de un gen. Además, un "producto génico de proteína" es una proteína expresada a partir de un gen particular.
La palabra "expresión" o "expresado" como se usa en este documento en referencia a un gen significa el producto transcripcional y/o traduccional de ese gen. El nivel de expresión de una molécula de ADN en una célula puede determinarse basándose en la cantidad de ARNm correspondiente que está presente dentro de la célula o en la cantidad de proteína codificada por ese ADN producido por la célula. El nivel de expresión de moléculas de ácido nucleico no codificantes (por ejemplo, ARNip) puede detectarse mediante métodos estándar de PCR o transferencia Northern bien conocidos en la técnica. Véase, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1 18.88.
El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heteróloga o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, subexpresan o no expresan en absoluto. Las células y plantas transgénicas son aquellas que expresan un gen o secuencia codificante heteróloga, típicamente como resultado de métodos recombinantes.
El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestos para producir un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una fusión).
El término "exógeno" se refiere a una molécula o sustancia (por ejemplo, un compuesto, ácido nucleico o proteína) que se origina fuera de una determinada célula u organismo. Por ejemplo, un "promotor exógeno" como se denomina en este documento es un promotor que no se origina en la planta por la que se expresa. Por el contrario, el término "endógeno" o "promotor endógeno" se refiere a una molécula o sustancia que es nativa o se origina dentro de una célula u organismo dado.
El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, indica que el ácido nucleico o proteína está esencialmente libre de otros componentes celulares con los que está asociado en el estado natural. Puede estar, por ejemplo, en un estado homogéneo y puede estar en una solución seca o acuosa. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada.
El término "purificado" indica que un ácido nucleico o una proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. En algunas realizaciones, el ácido nucleico o proteína es al menos 50% puro, opcionalmente al menos 65% puro, opcionalmente al menos 75% puro, opcionalmente al menos 85% puro, opcionalmente al menos 95% puro y opcionalmente al menos 99% puro.
El término "aislado" también puede referirse a una célula o células de muestra. Una célula aislada o células de muestra son un solo tipo de célula que está sustancialmente libre de muchos de los componentes que normalmente acompañan a las células cuando se encuentran en su estado nativo o cuando se retiran inicialmente de su estado nativo. En ciertos casos descritos, una muestra de célula aislada retiene aquellos componentes de su estado natural que se requieren para mantener la célula en un estado deseado. En algunas realizaciones, una célula aislada (por ejemplo purificada, separada) o células aisladas, son células que son sustancialmente el único tipo de célula en una muestra. Una muestra de células purificadas puede contener al menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de un tipo de célula. Una muestra de células aisladas puede obtenerse mediante el uso de un marcador e celular o una combinación de marcadores celulares, cualquiera de los cuales es exclusivo de un tipo de célula en una muestra de células sin purificar. En algunos casos descritos, las células se aíslan mediante el uso de un clasificador de células. En algunos casos descritos, se utilizan anticuerpos contra proteínas celulares para aislar células.
Como se usa en este documento, el término "conjugado" se refiere a la asociación entre átomos o moléculas. La asociación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, un conjugado entre un ácido nucleico y una proteína puede ser directo, por ejemplo, por enlace covalente, o indirecto, por ejemplo, por enlace no covalente (por ejemplo, interacciones electrostáticas (por ejemplo, enlace iónico, enlace de hidrógeno, enlace de halógeno), interacciones de van der Waals (por ejemplo, dipolo-dipolo, dipolo inducido por dipolo, dispersión de London), apilamiento de anillos (efectos pi), interacciones hidrófobas y similares). En realizaciones, los conjugados se forman usando química de conjugados que incluyen, pero no se limitan a, sustituciones nucleofílicas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, ésteres activos), sustituciones electrofílicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a carbonocarbono y enlaces múltiples carbono-heteroátomo (por ejemplo, reacción de Michael, adición de Diels-Alder). Estas y otras reacciones útiles se analizan, por ejemplo, en March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3a Ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, DC, 1982. En realizaciones, la micropartícula se une de forma no covalente a un soporte sólido mediante una reacción química no covalente entre un componente de la micropartícula y un componente del soporte sólido. En otras realizaciones, la micropartícula incluye una o más fracciones reactivas, por ejemplo, una fracción reactiva covalente, como se describe en el presente documento (por ejemplo, una fracción reactiva amina). En otras realizaciones, la micropartícula incluye un enlazador con una o más fracciones reactivas, por ejemplo, una fracción reactiva covalente, como se describe en el presente documento (por ejemplo, una fracción reactiva amina).
Las fracciones reactivas útiles o los grupos funcionales reactivos usados para las químicas conjugadas en este documento incluyen, por ejemplo:
(a) grupos carboxilo y diversos derivados de los mismos, incluidos, entre otros, ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxibenzotriazol, haluros de ácido, acilimidazoles, tioésteres, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de alquilo, alquenilo, alquinilo y aromáticos;
(b) grupos hidroxilo que se pueden convertir en ésteres, éteres, aldehídos, etc.
(c) grupos haloalquilo en los que el haluro se puede desplazar posteriormente con un grupo nucleofílico tal como, por ejemplo, una amina, un anión carboxilato, un anión tiol, un carbanión o un ion alcóxido, lo que da como resultado la unión covalente de un nuevo grupo en el sitio del átomo de halógeno;
(d) grupos dienófilos que son capaces de participar en reacciones de Diels-Alder tales como, por ejemplo, grupos maleimido;
(e) grupos aldehído o cetona de manera que la posterior derivatización sea posible mediante la formación de derivados de carbonilo tales como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas, o mediante mecanismos tales como la adición de Grignard o la adición de alquil-litio;
(f) grupos haluro de sulfonilo para la posterior reacción con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas;
(g) grupos tiol, que pueden convertirse en disulfuros, reaccionar con haluros de acilo o unirse a metales tales como el oro;
(h) grupos amina o sulfhidrilo, que pueden estar, por ejemplo, acilados, alquilados u oxidados;
(i) alquenos, que pueden sufrir, por ejemplo, cicloadiciones, acilación, adición de Michael, etc.;
(j) epóxidos, que pueden reaccionar con, por ejemplo, aminas y compuestos hidroxilo;
(k) fosforamiditas y otras fracciones de reactivos estándar útiles en la síntesis de ácidos nucleicos;
(l) unión de óxido de silicio metálico;
(m) unión de metales a grupos de fósforo reactivos (por ejemplo, fosfinas) para formar, por ejemplo, enlaces diéster de fosfato; y
(n) sulfonas, por ejemplo, vinilsulfona.
Las fracciones reactivas se pueden elegir de tal manera que no participen en, o interfieran con, la estabilidad química de las proteínas o ácidos nucleicos descritos en este documento. A modo de ejemplo, los ácidos nucleicos pueden incluir una vinilsulfona u otra fracción reactiva (por ejemplo, maleimida). Opcionalmente, los ácidos nucleicos pueden incluir una fracción reactiva que tiene la fórmula S-S-R. R puede ser, por ejemplo, una fracción protectora. Opcionalmente, R es hexanol. Como se usa en este documento, el término hexanol incluye compuestos con la fórmula C6H13OH e incluye, 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol, 2-metil-1-pentanol, 3-metil-1-pentanol, 4-metil-1-pentanol, 2-metil-2-pentanol, 3-metil-2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-metil-3-pentanol, 3-metil-3-pentanol, 2,2-dimetil-1-butanol, 2,3-dimetil-1-butanol, 3,3-dimetil-1-butanol, 2,3-dimetil-2-butanol, 3,3-dimetil-2-butanol y 2-etil-1-butanol. Opcionalmente, R es 1-hexanol.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" significa un intervalo de valores que incluye el valor especificado, que una persona con experiencia normal en la técnica consideraría razonablemente similar al valor especificado. En realizaciones, el término "aproximadamente" significa dentro de una desviación estándar usando medidas generalmente aceptables en la técnica. En realizaciones, aproximadamente significa un intervalo que se extiende hasta /-10% del valor especificado. En realizaciones, aproximadamente significa el valor especificado.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos, en el que el polímero puede conjugarse con una fracción que no consta de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. Los términos se aplican a péptidos macrocíclicos, péptidos que han sido modificados con funcionalidad no peptídica, peptidomiméticos, poliamidas y macrolactamas. Una "proteína de fusión" se refiere a una proteína quimérica que codifica dos o más secuencias de proteínas separadas que se expresan de forma recombinante como una fracción única.
El término "peptidilo" y "fracción peptidilo" significa un péptido monovalente.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos sintéticos y de origen natural, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos naturales son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que posteriormente se modifican, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales de péptidos modificados, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido natural. Los términos "aminoácido de origen no natural" y "aminoácido no natural" se refieren a análogos de aminoácidos, aminoácidos sintéticos y miméticos de aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza.
Se puede hacer referencia a los aminoácidos en el presente documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Asimismo, se puede hacer referencia a los nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
Las "variantes modificadas de forma conservadora" se aplican tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos
funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que se especifica una alanina mediante un codón, el codón se puede alterar en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en este documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a las secuencias de sonda reales.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, agrega o elimina un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora" en la que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas de forma conservadora son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos usados en la invención.
Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).
El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntico o el residuo de aminoácido en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad sobre una región específica, por ejemplo, de las secuencias polipeptídicas completas usadas en la invención o dominios individuales de los polipéptidos usados en la invención), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineación manual e inspección visual. Entonces se dice que tales secuencias son "sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, o más preferiblemente sobre una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos de longitud.
Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se ingresan en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Se pueden utilizar parámetros de programa predeterminados o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación", como se usa en este documento, incluye referencia a un segmento de cualquiera de las posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en, por ejemplo, una secuencia de longitud completa o de 20 a 600, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 aminoácidos o nucleótidos en los que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alineen de manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Se puede realizar una alineación óptima de secuencias para la comparación, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Apl. Maths. 2: 482c, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85: 2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen una puntuación umbral T con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., citado anteriormente). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N(puntuación de penalización por residuos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada cae en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN(para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como predeterminada una longitud de palabra de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. uU. 89: 10915) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90: 5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0.2, más preferiblemente menos de aproximadamente 0.01 y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 0.001.
Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo de forma cruzada con los anticuerpos producidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por lo tanto, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe a continuación. Otra indicación más de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que se pueden usar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.
"Poner en contacto" se usa de acuerdo con su significado ordinario y se refiere al proceso de permitir que al menos dos especies distintas (por ejemplo, compuestos químicos que incluyen biomoléculas o células) se vuelvan lo suficientemente proximales para reaccionar, interactuar o tocarse físicamente. Debe apreciarse, sin embargo, el producto de reacción resultante se puede producir directamente a partir de una reacción entre los reactivos añadidos o de un compuesto intermedio de uno o más de los reactivos añadidos que se pueden producir en la mezcla de reacción.
El término "poner en contacto" puede incluir permitir que dos especies reaccionen, interactúen o se toquen físicamente, en el que las dos especies pueden ser, por ejemplo, un dominio del ligando como se describe en el presente documento y un enlazador del ligando. En los casos descritos, el contacto incluye, por ejemplo, permitir que un dominio del ligando como se describe en el presente documento interaccione con un aglutinante de ligando.
Una muestra o valor de "control" se refiere a una muestra que sirve como referencia, generalmente una referencia conocida, para compararla con una muestra de prueba. Por ejemplo, se puede tomar una muestra de prueba de una condición de prueba, por ejemplo, en presencia de un compuesto de prueba, y en comparación con muestras de condiciones conocidas, por ejemplo, en ausencia del compuesto de prueba (control negativo), o en presencia de un compuesto conocido (control positivo). Un control también puede representar un valor promedio obtenido de una serie de pruebas o resultados. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden diseñar controles para la evaluación de cualquier número de parámetros. Por ejemplo, se puede diseñar un control para comparar el beneficio terapéutico basado en datos farmacológicos (por ejemplo, vida media) o medidas terapéuticas (por ejemplo, comparación de efectos secundarios). Un experto en la técnica comprenderá qué controles estándar son los más apropiados en una situación dada y podrá analizar los datos basándose en comparaciones con los valores de control estándar. Los controles estándar también son valiosos para determinar la significancia (por ejemplo, significancia estadística) de los datos. Por ejemplo, si los valores de un parámetro dado varían ampliamente en los controles estándar, la variación en las muestras de prueba no se considerará significativa.
Una "etiqueta" o una "fracción detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Por ejemplo, las etiquetas útiles incluyen 32P, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas u otras entidades que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando una radioetiqueta en un péptido o anticuerpo específicamente reactivo con un péptido diana. Puede emplearse cualquier método apropiado conocido en la técnica para conjugar un anticuerpo con la etiqueta, por ejemplo, usando los métodos descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.
Una "proteína o polipéptido etiquetado" es uno que está unido, ya sea covalentemente, a través de un enlazador o un enlace químico, o no covalentemente, a través de enlaces iónicos, de van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a una etiqueta de modo que la presencia de la proteína o el polipéptido etiquetados pueden detectarse detectando la presencia de la etiqueta unida a la proteína o polipéptido etiquetado. Alternativamente, los métodos que utilizan interacciones de alta afinidad pueden lograr los mismos resultados cuando uno de un par de compañeros de unión se une al otro por ejemplo, biotina, estreptavidina.
"Muestra biológica" o "muestra" se refiere a materiales obtenidos o derivados de un sujeto o paciente. Una muestra biológica incluye secciones de tejidos, tales como muestras de biopsia y autopsia, y secciones congeladas tomadas con fines histológicos. Tales muestras incluyen fluidos corporales tales como sangre y fracciones o productos sanguíneos (por ejemplo, suero, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y similares), esputo, tejido, células cultivadas (por ejemplo, cultivos primarios, explantes y células transformadas) heces, orina, líquido sinovial, tejido articular, tejido sinovial, sinoviocitos, sinoviocitos similares a fibroblastos, sinoviocitos similares a macrófagos, células inmunes, células hematopoyéticas, fibroblastos, macrófagos, células T, etc. Una muestra biológica se obtiene típicamente de un organismo eucariota, tal como un mamífero tal como un primate, por ejemplo, un chimpancé o un ser humano; vaca; perro; gato; un roedor, por ejemplo, cobaya, rata, ratón; conejo; o un ave; reptil; o pez.
Una "célula", como se usa en este documento, se refiere a una célula que lleva a cabo una función metabólica o de otro tipo suficiente para preservar o replicar su ADN genómico. Una célula puede identificarse mediante métodos bien conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, la presencia de una membrana intacta, la tinción con un tinte particular, la capacidad de producir progenie o, en el caso de un gameto, la capacidad de combinarse con un segundo gameto para producir una descendencia viable. Las células pueden incluir células procariotas y eucariotas. Las células procariotas incluyen, pero no se limitan a, bacterias. Las células eucariotas incluyen, pero no se limitan a, células de levadura y células derivadas de plantas y animales, por ejemplo, mamíferos, insectos (por ejemplo, spodoptera) y células humanas.
El término "anticuerpo" se usa de acuerdo con su significado comúnmente conocido en la técnica. Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a Vh-Ch1 por un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de bisagra, convirtiendo así el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región de bisagra (véase Fundamental Immunology (Paul ed., 3a ed. 1993). Si bien varios fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que dichos fragmentos se pueden sintetizar de nuevo ya sea químicamente o usando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, como se usa en este documento, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación de anticuerpos completos, o aquellos sintetizados de nuevo usando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de cadena sencilla) o aquellos identificados usando bibliotecas de presentación de fagos (vease, por ejemplo , McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)).
Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, se puede utilizar cualquier técnica conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., páginas 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Los anticuerpos "monoclonales" (mAb) se refieren a anticuerpos derivados de un solo clon. Técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de los Estados Unidos No. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos contra polipéptidos usados en esta invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos tales como otros mamíferos para expresar anticuerpos humanizados. Alternativamente, la tecnología de presentación de fagos se puede utilizar para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10: 779-783 (1992)).
Un "soporte sólido" como se proporciona en este documento se refiere a cualquier material que pueda modificarse para contener sitios individuales discretos apropiados para la unión o asociación de una micropartícula como se proporciona en este documento, incluidas las realizaciones del mismo, y es susceptible de los métodos proporcionados en el presente documento, incluidas las realizaciones del mismo. Los ejemplos de soportes sólidos incluyen, sin limitación, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado (por ejemplo, vidrio funcionalizado con carboximetildextrano), plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, TeflonMR, etc.), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, materiales compuestos, cerámicas y
resinas plásticas, sílice o materiales a base de sílice, incluidos el silicio y el silicio modificado (por ejemplo, silicio modelado), carbono, metales, cuarzo (por ejemplo, cuarzo modelado), vidrios inorgánicos, plásticos, haces de fibras ópticas y una variedad de otros polímeros. En general, los sustratos permiten la detección óptica y no fluorescen de manera apreciable.
El soporte sólido proporcionado en el presente documento, incluidas las realizaciones del mismo, puede formar parte de una micromatriz de transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET). El soporte sólido puede ser plano (por ejemplo, sustratos planos como vidrio, poliestireno y otros plásticos y acrílicos). Aunque un experto en la técnica apreciará que también se pueden usar otras configuraciones de soportes sólidos, por ejemplo, se pueden usar configuraciones tridimensionales. El soporte sólido puede modificarse para contener sitios individuales discretos (también denominados en el presente documento "pocillos") para la unión de micropartículas. Estos sitios generalmente incluyen sitios físicamente alterados, es decir, configuraciones físicas como pocillos o pequeñas depresiones en el sustrato que pueden retener las micropartículas. Los pocillos se pueden formar usando una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, fotolitografía, técnicas de estampación, técnicas de moldeo y técnicas de micrograbado. Un experto en la materia apreciará que la técnica utilizada dependerá de la composición y forma del soporte sólido. En realizaciones, se realizan alteraciones físicas en una superficie del soporte sólido para producir pocillos. La profundidad requerida de los pocillos dependerá del tamaño de la micropartícula que se agregará al pocillo.
Una "micropartícula" como se usa en este documento se refiere a una partícula no plana (por ejemplo, esférica) que tiene un tamaño suficiente para unir moléculas (por ejemplo, se proporciona un primer, segundo o tercer enlazador, un dominio del ligando y un dominio de ácido nucleico), directamente o indirectamente, a través de enlaces covalentes o no covalentes. La micropartícula puede incluir cualquier material que sea capaz de proporcionar soporte físico a las moléculas (por ejemplo, se proporciona un primer, segundo o tercer enlazador, un dominio del ligando y un dominio de ácido nucleico) que están unidas a la superficie. El material generalmente es capaz de soportar condiciones relacionadas con la unión de las moléculas (por ejemplo, se proporciona un primer, segundo o tercer enlazador, un dominio del ligando y un dominio de ácido nucleico) a la superficie y cualquier tratamiento, manipulación o procesamiento posterior encontrado durante la realización de un ensayo. Los materiales pueden ser de origen natural, sintéticos o una modificación de un material de origen natural. Los materiales de micropartículas adecuados pueden incluir silicio, cerámica, plásticos (incluidos polímeros como, por ejemplo, poli(cloruro de vinilo), copolímeros de cicloolefina, agarosa, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno (PTFE o Teflon®), nailon, poli(butirato de vinilo)), germanio, arseniuro de galio, oro o plata, superficies de cobre o aluminio, superficies magnéticas, por ejemplo Fe, Mn, Ni, Co y sus óxidos, puntos cuánticos, por ejemplo, semiconductores III-V (GaN, GaP, GaAs, InP o InAs) o II-VI (ZnO, ZnS, CdS, CdSe o CdTe), o nanocristales de fluoruro dopados con Ln, nanomateriales oxídicos dopados con tierras raras utilizados solos o junto con otros materiales. Se pueden considerar materiales rígidos adicionales, tales como el vidrio, que incluye sílice y además incluye, por ejemplo, vidrio que está disponible como Bioglass. Otros materiales que pueden emplearse incluyen materiales porosos, tales como, por ejemplo, perlas de vidrio de poro controlado, Sepharose® perlada entrecruzada o resinas de agarosa, o copolímeros de bis-acrilamida y azalactona entrecruzadas. Otras perlas incluyen perlas de polímero, perlas de núcleo sólido, perlas paramagnéticas o microperlas. También se contempla cualquier otro material conocido en la técnica que sea capaz de tener una o más fracciones, como cualquiera de una fracción reactiva de amino, carboxilo, tiol o hidroxilo, por ejemplo, incorporado en su superficie. En realizaciones, la micropartícula es una esfera basada en polímero magnético. En realizaciones, la micropartícula es una microesfera ProMagMR. En realizaciones, la dimensión más larga de la micropartícula es menor de 1000 pm.
Composiciones
Las composiciones proporcionadas en este documento son, entre otras, útiles para el ensamblaje de matrices altamente densas adecuadas para una variedad de métodos de cribado de alto rendimiento. Las micropartículas proporcionadas en este documento incluyen un dominio del ligando unido a través de un primer enlazador y un dominio de ácido nucleico unido a través de un segundo enlazador. Al unirse a un soporte sólido, las micropartículas proporcionadas en este documento, incluidas las realizaciones de las mismas, pueden formar parte de una matriz. El dominio del ligando y el dominio de ácido nucleico se sintetizan en la micropartícula usando métodos de química de agrupación dividida codificada. La química de agrupación dividida codificada es un método bien conocido en la técnica y descrito, entre otros, por las siguientes referencias: Furka, A. et al., en t. J. Pept. Protein Res. 1991, 37, 487-493; Kit Lam et al., Nature, 1991; 354: 82-84; patentes de los Estados Unidos Nos.6,060,596; 5,770,358; 6,368,874; 5,565,324; 6,936,477 y 5,573,905. Cada etapa de la síntesis del dominio del ligando (por ejemplo, síntesis de péptidos o compuestos químicos) está codificada en el dominio de ácido nucleico por una secuencia de ácido nucleico corta que sirve como código de barras de identificación. Por lo tanto, cada micropartícula incluye un dominio del ligando único y un dominio de ácido nucleico correspondiente que codifica secuencias de ácido nucleico específicas. Las secuencias de ácido nucleico específicas corresponden a los componentes básicos del dominio del ligando y el orden en el que se incorporaron en el dominio del ligando. Tras la hibridación de un ácido nucleico complementario a dicho dominio de ácido nucleico, se puede determinar (decodificar) la composición del dominio ligando y su ubicación en la matriz. Una vez que se ha determinado la identidad del dominio del ligando y su ubicación en la matriz, se elimina el dominio de ácido nucleico, el dominio del ligando puede modificarse adicionalmente y ponerse en contacto con un aglutinante de ligando (por ejemplo, biomolécula).
En un aspecto, se proporciona una micropartícula inmovilizada sobre un soporte sólido. La micropartícula se une covalentemente a un dominio del ligando a través de un primer enlazador; y un dominio de ácido nucleico a través de un segundo enlazador, en el que el segundo enlazador es escindible y el primer enlazador no es escindible bajo la condición de que el segundo enlazador sea escindible. Dicho dominio de ácido nucleico es una etiqueta codificante que identifica dicho dominio del ligando. Dicho segundo enlazador es escindible y dicho primer enlazador no es escindible bajo la condición de que dicho segundo enlazador sea escindible. Dicho primer enlazador comprende -C(O)NH- o -NHC(O)-, y dicho segundo enlazador comprende -C(O)O- u -OC(O)-.
En realizaciones, la micropartícula es una microperla. Una "microperla", como se denomina en el presente documento, es una micropartícula a base de polímero de forma aproximadamente esférica con un diámetro de aproximadamente 0.5 |jm a aproximadamente 500 jm . El término "basado en polímero" o "polimérico" como se proporciona en el presente documento se refiere a una micropartícula o microperla que incluye al menos un compuesto polimérico (por ejemplo, polietilenglicoles, polietilenimidas, polisacáridos, polipéptidos o polinucleótidos). En realizaciones, la microperla es una microesfera ProMagMR. En realizaciones, la microperla es una microperla magnética basada en polímero.
La micropartícula proporcionada en el presente documento, incluidas las realizaciones de la misma, puede ser inferior a 200 jm . Cuando la micropartícula tiene menos de 200 jm , un experto en la técnica reconocerá inmediatamente que la dimensión más larga (por ejemplo, diámetro o longitud) de una micropartícula es menor de 200 jm . En otras realizaciones, la micropartícula tiene aproximadamente 20 nm. En algunas realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 0.02 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 0.05 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 0.1 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 0.5 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 2 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 5 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 10 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 15 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 20 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 25 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 30 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 35 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 40 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 45 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 50 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 55 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 60 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 65 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 70 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 75 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 80 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 85 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 90 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 95 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 100 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 101 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 102 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 105 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 110 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 115 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 120 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 125 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 130 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 135 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 140 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 145 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 150 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 155 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 160 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 165 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 170 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 175 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 180 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 185 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 190 jm a aproximadamente 200 jm , o de aproximadamente 195 jm a aproximadamente 200 jm .
En algunas realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 0.02 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 0.05 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 0.1 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 0.5 jm a aproximadamente 100 jm . jm , de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 2 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 5 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 10 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 15 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 20 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 25 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 30 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 35 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 40 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 45 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 50 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 55 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 60 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 65 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 70 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 75 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 80 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 85 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 90 jm a aproximadamente 100 jm , o desde aproximadamente 95 jm a aproximadamente 100 jm .
En algunas realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 0.02 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 0.05 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 0.1 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 0.5 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 2 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 5 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 10 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 15 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 20 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 25 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 30 jm a aproximadamente 50 jm , de
aproximadamente 35 |jm a aproximadamente 50 |jm, de aproximadamente 40 |jm a aproximadamente 50 |jm, o de aproximadamente 45 jim a aproximadamente 50 jim.
En algunas realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01 jim a aproximadamente 20 jim, de aproximadamente 0.02 jim a aproximadamente 20 jim, de aproximadamente 0.05 jim a aproximadamente 20 jim, de aproximadamente 0.1 jim a aproximadamente 20 jim, de aproximadamente 0.5 jim a aproximadamente 20 jim. jim, de aproximadamente 1 jim a aproximadamente 20 jim, de aproximadamente 2 jim a aproximadamente 20 jim, de aproximadamente 5 jim a aproximadamente 20 jim, de aproximadamente 10 jim a aproximadamente 20 jim, o de aproximadamente 15 jim a aproximadamente 20 jim.
En algunas realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.02 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.05 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.1 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.2 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.3 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.4 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.5 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.6 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.7 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.8 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 0.9 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 1 jim a aproximadamente 10 jim, de aproximadamente 2 jim a aproximadamente 10 jim o de aproximadamente 5 jim a aproximadamente 10 jim.
En realizaciones, la micropartícula tiene aproximadamente 0.9 jim. En realizaciones, la micropartícula tiene un diámetro de aproximadamente 0.9 jim. En realizaciones, la micropartícula es de aproximadamente 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5,6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 o 200 jim. En otras realizaciones, la micropartícula tiene un diámetro de aproximadamente 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 , 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 o 200 jim. Los valores numéricos anteriores representan el tamaño de la micropartícula en jim.
En realizaciones, la micropartícula es una microperla funcionalizada. Cuando la micropartícula es una microperla funcionalizada, la micropartícula puede incluir cualquier fracción reactiva adecuada para las químicas conjugadas descritas en el presente documento. El término "funcionalizado" como se proporciona en este documento se refiere a un compuesto o dominio (por ejemplo, micropartícula, enlazador, dominio del ligando, dominio de ácido nucleico, secuencia de ácido nucleico) que incluye una fracción reactiva o grupos funcionales reactivos usados para químicas conjugadas como se describe en este documento. Por ejemplo, una microperla funcionalizada puede incluir una o más fracciones reactivas, tal como cualquiera de una fracción reactiva de amino, carboxilo, tiol o hidroxilo, incorporada en su superficie. En realizaciones, un primer grupo funcionalizado permite la unión del dominio ligando a través de un primer enlazador. En realizaciones, un segundo grupo funcionalizado permite la unión del dominio de ácido nucleico a través de un segundo enlazador. En realizaciones, el primer y el segundo grupo funcionalizado son independientemente diferentes. Por lo tanto, el dominio del ligando puede unirse a la micropartícula a través de un primer enlazador por conjugación a un grupo funcionalizado diferente al del dominio de ácido nucleico. En realizaciones, un tercer grupo funcionalizado conecta la micropartícula a un soporte sólido. Por lo tanto, en realizaciones, la micropartícula está unida covalentemente a un soporte sólido.
La micropartícula proporcionada en este documento puede incluir un polímero. En tal caso, los polímeros llevarán las fracciones reactivas para ser activadas. El polímero puede seleccionarse de cualquier clase adecuada de compuestos, por ejemplo, polietilenglicoles, polietilenimidas, polisacáridos, polipéptidos o polinucleótidos. En realizaciones, la micropartícula incluye bis-amino polietilenglicol 3000 e hidroxil-polietilenglicol 3000. En realizaciones, la micropartícula incluye una capa de polímero. La unión de los polímeros a la micropartícula puede efectuarse mediante una variedad de métodos que son fácilmente evidentes para una persona experta en la técnica. Por ejemplo, los polímeros que portan grupos triclorosililo o trisalcoxi se pueden hacer reaccionar con grupos hidroxilo en la micropartícula para formar enlaces siloxano. La unión a una micropartícula de oro o plata puede tener lugar a través de grupos tiol en el polímero. Alternativamente, el polímero se puede unir a través de una especie intermedia, tal como una monocapa autoensamblada de alcanotioles. El tipo de polímeros seleccionados y el método seleccionado para unir los polímeros a la micropartícula dependerán, por lo tanto, de que el polímero tenga la reactividad adecuada para unirse a la superficie de la micropartícula y de las propiedades de los polímeros con respecto a la adsorción inespecífica a, especialmente, ADN o péptidos. Las fracciones reactivas pueden estar presentes en el polímero o pueden añadirse al polímero mediante la adición de fracciones reactivas únicas o múltiples. Opcionalmente, se puede usar un brazo espaciador (por ejemplo, un enlazador) para proporcionar flexibilidad a la unión del dominio de ácido nucleico o dominio del ligando, lo que le permite interactuar con su entorno de una manera que minimiza el impedimento estérico con la micropartícula.
En realizaciones, la microperla funcionalizada es una microperla (polimérica) basada en polímero magnético. En realizaciones, la microperla es una microesfera ProMagMR. En realizaciones, la microperla incluye más de un polímero. En realizaciones, la microperla incluye un primer polímero y un segundo polímero, en el que el primer polímero y el segundo polímero son químicamente diferentes. En realizaciones, el primer polímero es bis-amino polietilenglicol 3000 y el segundo polímero es hidroxil-polietilenglicol 3000. En realizaciones, el primer polímero incluye una primer fracción
reactiva y el segundo polímero incluye una segunda fracción reactiva. Una fracción reactiva como se menciona en el presente documento incluye cualquiera de las fracciones funcionales útiles para la química de conjugados como se describe en el presente documento. En realizaciones, la primera fracción reactiva es un grupo funcional amino y la segunda fracción reactiva es un grupo funcional hidroxilo. En realizaciones, el grupo funcional hidroxilo se hace reaccionar para formar una fracción azidoacetato. En realizaciones, la primera fracción reactiva (por ejemplo, grupo funcional amino) se hace reaccionar con una fracción reactivo (por ejemplo, Un grupo funcional carboxilo) del primer enlazador. En realizaciones, la fracción azidoacetato se hace reaccionar con una fracción reactiva (por ejemplo, un grupo funcional alquinilo) del segundo enlazador.
En realizaciones, la micropartícula es una microperla polimérica. En realizaciones, la micropartícula es un dendrímero. Un "dendrímero" como se denomina en este documento es una molécula polimérica esférica hecha de dos monómeros (por ejemplo, ácido acrílico y una diamina). Los dendrímeros son estructuras químicas definidas con precisión que consisten en una serie de capas químicas construidas sobre una pequeña molécula nuclear. Cada capa se compone de dos productos químicos, siempre en el mismo orden. En realizaciones, la micropartícula es un polímero ramificado. En realizaciones, la micropartícula es una microperla polimérica magnética. En realizaciones, la micropartícula es una microperla funcionalizada con carboximetildextrano. En realizaciones, la micropartícula es una microperla funcionalizada con polietilenglicol. En realizaciones adicionales, la microperla funcionalizada con polietilenglicol incluye aminas protegidas ortogonalmente. En realizaciones, la micropartícula es una microperla magnética. En realizaciones, la micropartícula es una microperla metálica. En realizaciones, la micropartícula es una microperla de sílice.
Como se muestra en la Figura 1, las micropartículas proporcionadas en el presente documento que incluyen realizaciones de las mismas pueden incluir una pluralidad de puntos de unión para la unión de una pluralidad de un primer, segundo y tercer enlazador. La micropartícula puede incluir una pluralidad de primeros puntos de unión para el primer enlazador que une el dominio del ligando, una pluralidad de segundos puntos de unión para el segundo enlazador que une el dominio de ácido nucleico y una pluralidad de terceros puntos de unión para el tercer enlazador que une la micropartícula a un soporte sólido. El número total de puntos de unión por micropartícula puede ser de aproximadamente 25 a 50 atomoles. Cuando el número total de puntos de unión corresponde al 100%, el número de primeros puntos de unión puede ser más de aproximadamente el 1% y menos de aproximadamente el 20%. Cuando el número total de puntos de unión corresponde al 100%, el número de segundos puntos de unión puede ser más de aproximadamente el 40% y menos de aproximadamente el 90%. Cuando el número total de puntos de unión corresponde al 100%, el número de terceros puntos de unión puede ser más de aproximadamente 0% y menos de aproximadamente 50%.
Un "dominio del ligando" como se proporciona en el presente documento es un dominio capaz de unirse a un enlazador del ligando (por ejemplo, analito, biomolécula). En realizaciones, el dominio del ligando es un péptido. En realizaciones, el dominio del ligando es un polipéptido. En realizaciones, el dominio del ligando incluye una glicoproteína de superficie o fragmentos de la misma. En realizaciones, el dominio del ligando tiene una secuencia de proteína correspondiente a la posición de aminoácidos 98-106 de la proteína hemaglutinina (HA) de influenza humana. En realizaciones, el dominio del ligando incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 17 o la s Eq ID NO: 18.
En realizaciones, el dominio del ligando incluye una fracción protectora unida a una fracción reactiva (por ejemplo, un grupo funcional carboxilo) del dominio del ligando. Como se usa en el presente documento, una fracción protectora es una fracción química unida covalentemente a un dominio del ligando que evita que el dominio del ligando se una a un aglutinante de ligando, en el que la fracción de protección puede eliminarse, por ejemplo, por medios químicos cuando se desee. En realizaciones, la fracción protectora es fluorenilmetiloxicarbonilo. En realizaciones, la fracción protectora es terc-butilo o carboxibencilo. Cuando el dominio del ligando incluye una fracción protectora, el dominio del ligando puede ser una poliamida protegida de cadena lateral. Cuando el dominio del ligando incluye una fracción protectora, también se puede denominar en el presente documento "intermedio sintético" o "precursor sintético". En realizaciones, la fracción protectora incluye una cadena lateral de aminoácidos. En realizaciones, la fracción protectora incluye un extremo amino (por ejemplo, un grupo terminal -NH2) o un extremo carboxi (por ejemplo, un grupo terminal -COOH). En realizaciones, la fracción protectora está unida a una cadena lateral de aminoácidos. En realizaciones, la fracción protectora se une a un extremo amino (por ejemplo, un grupo terminal -NH2) o un extremo carboxi (por ejemplo, un grupo terminal -COOH). En presencia de la fracción protectora, el dominio del ligando no es capaz de unirse a un enlazador del ligando. Por lo tanto, en realizaciones, el dominio del ligando incluye una fracción protectora y no está unida a un enlazador del ligando. Tras la eliminación de la fracción protectora y la reacción de la fracción reactiva se un dominio del ligando capaz de unirse se forma un enlazador del ligando.
El dominio del ligando proporcionado en este documento puede formarse usando cualquier síntesis unida a soporte de múltiples etapas compatible con la composición de la micropartícula y con la química de síntesis del dominio de ácido nucleico proporcionado en este documento. El dominio del ligando y el dominio de ácido nucleico pueden sintetizarse simultáneamente en la micropartícula. Alternativamente, el dominio de ácido nucleico se sintetiza en la micropartícula después de la síntesis del dominio del ligando. En los casos descritos, la unión del dominio del ligando a través del primer enlazador se realiza antes de la unión del dominio nucleico a través del segundo enlazador. En los casos descritos, la unión del dominio del ligando a través del primer enlazador se realiza simultáneamente con la unión del dominio nucleico a través del segundo enlazador. En realizaciones, el dominio del ligando es un péptido. En realizaciones, el dominio del ligando es una molécula pequeña. En realizaciones, el dominio del ligando es una proteína. En realizaciones, el dominio del ligando se une a un enlazador del ligando. El dominio del ligando puede
estar unido a una fracción detectable (por ejemplo, una fracción fluorescente, una fracción luminiscente, una fracción colorimétrica, una fracción fosforescente, una fracción radiactiva o una fracción electroactiva).
Un "enlazador del ligando" como se usa en el presente documento se refiere a un agente (por ejemplo, átomo, molécula, ión, ión molecular, compuesto o partícula) capaz de unirse a un dominio del ligando proporcionado en el presente documento que incluye realizaciones del mismo. Los enlazadores del ligando incluyen, sin limitación, biomoléculas (por ejemplo, hormonas, citocinas, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, antígenos de la membrana celular y receptores (receptores neurales, hormonales, de nutrientes y de superficie celular o sus ligandos); células completas o lisados de las mismas (por ejemplo, células procariotas (por ejemplo, bacterias patógenas), eucariotas (por ejemplo, células tumorales de mamíferos); virus (por ejemplo, retrovirus, herpesvirus, adenovirus, lentivirus y esporas); productos químicos (por ejemplo, disolventes, polímeros, materiales orgánicos); moléculas terapéuticas (por ejemplo, medicamentos terapéuticos, drogas de abuso, antibióticos) o contaminantes ambientales (por ejemplo, pesticidas, insecticidas, toxinas). El enlazador del ligando puede ser una proteína, una mezcla de proteínas, un ácido nucleico, una mezcla de ácidos nucleicos, una molécula pequeña, una mezcla de moléculas pequeñas, un elemento, una mezcla de elementos, un polímero sintético, una mezcla de polímeros sintéticos, lisado celular. En realizaciones, el enlazador del ligando es una biomolécula. En realizaciones, la biomolécula es un ácido nucleico. En realizaciones, la biomolécula es una proteína (por ejemplo, un anticuerpo). En realizaciones, el enlazador del ligando es un anticuerpo. En realizaciones, el enlazador del ligando es un anticuerpo anti-HA. En realizaciones, el enlazador del ligando es un anticuerpo anti-Myc. En realizaciones, el dominio del ligando se une a un péptido de la SEQ ID NO: 17. En realizaciones, el dominio del ligando se une a un péptido de la SEQ ID NO: 18. En realizaciones, el enlazador del ligando se une a una fracción detectable. En realizaciones, la fracción detectable es una fracción fluorescente. En realizaciones, el enlazador del ligando es una molécula pequeña. En realizaciones, el dominio del ligando no está unido a un enlazador del ligando. Cuando el dominio del ligando no está unido a un enlazador del ligando, el dominio del ligando puede incluir una fracción protectora o cualquier otra modificación aplicable que haga inerte el dominio del ligando. El enlazador del ligando puede unirse a una fracción detectable (por ejemplo, una fracción fluorescente, una fracción luminiscente, una fracción colorimétrica, una fracción fosforescente, una fracción radiactiva o una fracción electroactiva).
Como se describió anteriormente, un "dominio de ácido nucleico" como se proporciona en este documento incluye una secuencia de ácido nucleico correspondiente a los bloques de construcción individuales del dominio del ligando y el orden en el que estos bloques de construcción se incorporan en dicho dominio del ligando. Por tanto, cada micropartícula incluye un dominio del ligando único y un dominio de ácido nucleico correspondiente que codifica secuencias de ácido nucleico específicas correspondientes a los bloques de construcción del dominio del ligando y el orden en el que se incorporaron en el dominio del ligando. Los dominios de ácido nucleico proporcionados en el presente documento también se denominan "etiqueta" o "etiqueta codificante". En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye una secuencia de ácido nucleico. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico tiene una longitud de aproximadamente 18 pares de bases. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico tiene una longitud de aproximadamente 20 pares de bases. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico es de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 79, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 pares de bases de longitud. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico no incluye citosina.
En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico incluye un enlazador covalente. En realizaciones, el enlazador covalente conecta dos secuencias de ácido nucleico dentro de un dominio de ácido nucleico. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye al menos dos secuencias de ácido nucleico conectadas a través de un enlazador covalente. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye al menos cuatro secuencias de ácido nucleico conectadas a través de enlazadores covalentes. Por tanto, en realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye una primera secuencia de ácido nucleico, una segunda secuencia de ácido nucleico, una tercera secuencia de ácido nucleico y una cuarta secuencia de ácido nucleico, en la que la primera secuencia de ácido nucleico está conectada a la segunda secuencia de ácido nucleico a través de un primer enlazador covalente, la segunda secuencia de ácido nucleico está conectada a la tercera secuencia de ácido nucleico a través de un segundo enlazador covalente y la tercera secuencia de ácido nucleico está conectada a la cuarta secuencia de ácido nucleico a través de un tercer enlazador covalente. En realizaciones, el enlazador covalente (por ejemplo, el primer, segundo, tercer enlazador covalente) es un enlace, -S(O)-, -S(O)2NH-, -NHS(O)2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-, -C(O)NH-, -NH-, - NHC(O)-, -O-, -S- , alquileno sustituido o no sustituido, heteroalquileno sustituido o no sustituido, cicloalquileno sustituido o no sustituido, heterocicloalquileno sustituido o no sustituido, arileno sustituido o no sustituido o heteroarileno sustituido o no sustituido. En realizaciones, el enlazador covalente es un enlazador 1,3-triazoleno. En realizaciones, el enlazador covalente tiene la estructura:
(I). En realizaciones, el enlazador covalente incluye la estructura:
(I). En la fórmula (I), el punto de unión marcado por * indica la unión del enlazador covalente a una primera secuencia de ácido nucleico y la unión marcada por ** indica el punto de unión del enlazador covalente a una segunda secuencia de ácido nucleico.
En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye una secuencia de ácido nucleico funcionalizada. Un ácido nucleico funcionalizado como se proporciona en este documento incluye grupos funcionales reactivos usados para químicas conjugadas como se describe en este documento. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye una pluralidad de secuencias de ácido nucleico funcionalizadas. Cuando el dominio de ácido nucleico incluye una pluralidad de secuencias de ácido nucleico funcionalizadas, las secuencias de ácido nucleico funcionalizadas están conectadas a través de una pluralidad de enlazadores covalentes. En realizaciones, cada uno de la pluralidad de enlazadores covalentes es químicamente diferente. Las ilustraciones esquemáticas de la síntesis del dominio nucleico y el dominio ligando en una micropartícula se muestran en las Figuras 4, 5 y 6. Como se muestra en las Figuras 5 y 6, los dominios de ácido nucleico unidos a una micropartícula pueden ser independientemente diferentes dependiendo de la síntesis utilizada y pueden incluir dos o más secuencias de ácido nucleico conectadas a través de un enlazador covalente.
Los dominios de ácido nucleico proporcionados en este documento, incluidas las realizaciones de los mismos, son compatibles con (i) los métodos de síntesis unida a soporte de múltiples etapas aplicados para formar un dominio del ligando como se proporciona en este documento, (ii) la composición de la micropartícula y (iii) los procedimientos de decodificación proporcionados en el presente documento (es decir, identificar la composición del dominio del ligando y su ubicación en una matriz). Los procedimientos de decodificación útiles incluyen, sin limitación, secuenciación mediante hibridación o procedimientos de secuenciación basados en enzimas (por ejemplo, secuenciación por síntesis, secuenciación por ligación). Por lo tanto, en realizaciones, la secuencia de ácido nucleico se une a una secuencia de ácido nucleico complementaria. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico complementaria incluye una fracción detectable. En realizaciones, la fracción detectable es una fracción fluorescente. Tras la hibridación de un ácido nucleico complementario con dicho dominio de ácido nucleico, se puede determinar la composición del dominio del ligando y su ubicación en la matriz. Después de que se haya determinado la identidad del dominio del ligando y su ubicación en la matriz, el dominio de ácido nucleico puede eliminarse (por ejemplo, mediante la escisión del segundo enlazador), el dominio del ligando puede modificarse adicionalmente (por ejemplo, haciendo reaccionar una fracción reactiva del dominio del ligando) y poniendo en contacto con un enlazador del ligando (por ejemplo, biomolécula).
Los enlazadores proporcionados en este documento unen químicamente la micropartícula y el dominio del ligando (primer enlazador), la micropartícula y el dominio de ácido nucleico (segundo enlazador) o la micropartícula y el soporte sólido (tercer enlazador). Como se describió anteriormente, el dominio de ácido nucleico proporcionado en este documento que incluye realizaciones del mismo puede incluir dos o más secuencias de ácido nucleico conectadas a través de enlazadores covalentes (por ejemplo, un enlazador 1,3-triazoleno). Por tanto, en realizaciones, el dominio de ácido nucleico incluye dos o más enlazadores de 1,3-triazoleno. Los enlazadores proporcionados en el presente documento (por ejemplo, primer enlazador, segundo enlazador, tercer enlazador) pueden unirse covalentemente a los métodos de aplicación de micropartículas bien conocidos en la técnica y compatibles con la composición del enlazador y la micropartícula. Los enlazadores proporcionados en el presente documento pueden incluir el producto conjugado de fracciones reactivas en el punto de unión a la micropartícula, en el punto de unión al dominio del ligando, en el punto de unión al dominio de ácido nucleico o en el punto de unión al soporte sólido. Por tanto, los enlazadores proporcionados en el presente documento pueden ser polivalentes y pueden formarse mediante técnicas de química conjugada.
En la presente invención, el primer enlazador comprende -C(O)NH- o -NHC(O)-. En la presente invención, el segundo enlazador comprende -C(O)O- u -OC(O)-. En realizaciones, el primer enlazador incluye la estructura -N(H)-C(O)-. Cuando el primer enlazador tiene la estructura -N(H)-C(O)-, el nitrógeno se une al soporte sólido funcionalizado (por ejemplo, funcionalizado con bis-amino PEG 3000) y el carbono se une al dominio del ligando. Como se describió anteriormente, después de que se hayan determinado la identidad del dominio del ligando y su ubicación en la matriz, el dominio de ácido nucleico puede eliminarse mediante la escisión del segundo enlazador. En realizaciones, el segundo enlazador es un enlazador lábil a los ácidos. En la presente invención, el segundo enlazador incluye un éster. En realizaciones, el segundo enlazador es un enlazador lábil a los álcalis. En realizaciones, el segundo enlazador tiene la estructura:
(II). En realizaciones, el segundo enlazador incluye la estructura:
(II). En la fórmula (II), el punto de unión marcado por * indica el punto de unión al soporte sólido funcionalizado (por ejemplo, funcionalizado con hidroxilamina PEG 3000) y el punto de unión marcado por ** indica el punto de unión al dominio de ácido nucleico. En realizaciones, el segundo enlazador tiene la estructura:
(IIA). En la fórmula (IIA), X es un número entero de 20 a 300. En realizaciones, x es 68. En la fórmula (IIA), el punto de unión marcado por * indica el punto de unión al soporte sólido y el punto de unión marcado por ** indica el punto de unión al dominio de ácido nucleico. En realizaciones, el segundo enlazador tiene la estructura
(IIB). En la fórmula (IIB), L1 es -C(O)O-, u -OC(O)-. En la fórmula (IIB), el punto de unión marcado por * indica el punto de unión al soporte sólido y el punto de unión marcado por ** indica el punto de unión al dominio de ácido nucleico.
De acuerdo con las realizaciones proporcionadas en este documento, las micropartículas proporcionadas en este documento pueden incluir una pluralidad de dominios de ligando y una pluralidad de dominios de ácido nucleico unidos a través de una pluralidad de primeros enlazadores y una pluralidad de segundos enlazadores, respectivamente (véanse las Figuras 3, 4 o 5). Por lo tanto, en realizaciones, el dominio del ligando es una pluralidad de dominios de ligando unidos a través de una pluralidad de primeros enlazadores. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico es una pluralidad de dominios de ácido nucleico unidos a través de una pluralidad de segundos enlazadores. En realizaciones, la pluralidad de dominios de ácido nucleico unidos a una única micropartícula puede ser igual o independientemente diferente (vease la Figura 5 o 6).
Las micropartículas proporcionadas en el presente documento, incluidas las realizaciones de las mismas, están unidas a un soporte sólido. En realizaciones, el soporte sólido es un soporte plano. En realizaciones, la micropartícula está conectada a través de un tercer enlazador al soporte sólido. En realizaciones, la micropartícula está unida no covalentemente al soporte sólido (por ejemplo, a través de interacciones electrostáticas (por ejemplo, enlace iónico, enlace de hidrógeno, enlace de halógeno), interacciones de van der Waals (por ejemplo, dipolo-dipolo, dipolo inducido por dipolo, dispersión de London), apilamiento de anillos (efectos pi), interacciones hidrófobas y similares). En realizaciones, la micropartícula se une mecánicamente al soporte sólido. Cuando una micropartícula se une mecánicamente al soporte sólido, se mantiene físicamente en su lugar sobre el soporte mediante medios mecánicos (por ejemplo, un pocillo). En realizaciones, una pluralidad de micropartículas se unen covalentemente al soporte sólido. En realizaciones, la micropartícula se une al soporte sólido a través de un enlazador de amida. Por lo tanto, en realizaciones, el tercer enlazador tiene la estructura -N(H)-C(O)-. En realizaciones, el soporte sólido incluye carboximetildextrano. En realizaciones, el soporte sólido incluye vidrio funcionalizado con carboximetildextrano. En realizaciones, el soporte sólido es una oblea de silicio.
En realizaciones, la pluralidad de micropartículas forma una matriz desordenada. Una "matriz desordenada" como se denomina en este documento es una matriz de micropartículas, en la que las micropartículas se ensamblan
aleatoriamente o se unen a un soporte sólido y no forman una estructura ordenada bidimensional o tridimensional. En realizaciones, la pluralidad de micropartículas forman una matriz ordenada. En una matriz ordenada, las micropartículas se ensamblan o se unen a un soporte sólido de acuerdo con un orden bidimensional o tridimensional. Por ejemplo, una matriz hexagonal consta de una pluralidad de micropartículas ensambladas o unidas a un soporte sólido de manera que cada micropartícula forma parte de un hexágono, en el que cada micropartícula ocupa un ángulo del hexágono, y en el que el centro del hexágono está ocupado por una séptima micropartícula. En realizaciones, la pluralidad de micropartículas forma una matriz hexagonal. En realizaciones, la pluralidad de micropartículas forma una matriz empaquetada cuadrada. Una matriz empaquetada cuadrada consta de una pluralidad de micropartículas ensambladas o unidas a un soporte sólido de manera que cada micropartícula forma parte de un cuadrado o rectángulo que consta de al menos cuatro micropartículas. La formación de matrices es un método bien conocido y utilizado en la técnica y se describe, entre otras cosas, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,110.426; 7,615,368; 7,932,213; 6,824,987; 5,143,854; 8,795,967 y Hughes TR et al., (2001) Nat. Biotech. 4, 342-347. En realizaciones, al menos aproximadamente 106 de las micropartículas se unen al soporte sólido. En realizaciones, cada una de las micropartículas es diferente. En realizaciones, aproximadamente 106 a 109 de las micropartículas se unen al soporte sólido. En realizaciones, aproximadamente de 109 de las micropartículas se unen al soporte sólido. En realizaciones, aproximadamente 105, 106, 107, 108, 109, 1010o 1011 de las micropartículas se unen al soporte sólido. En realizaciones, la matriz incluye 106 micropartículas por milímetro cuadrado.
En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 10,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 20,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 30,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 40,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 50,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 60,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 70,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 80,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 90,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 100,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 200,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 300,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 400,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 500,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 600,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 700,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 800,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye al menos aproximadamente 900,000 micropartículas por milímetro cuadrado.
En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente 200,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente 789,000 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente 591,715 micropartículas por milímetro cuadrado. En realizaciones, la matriz incluye de aproximadamente 200,000 a aproximadamente 800,000 micropartículas por milímetro cuadrado.
En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente una micropartícula por 4.99 micrómetros cuadrados. En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente una micropartícula por 1.46 micrómetros cuadrados. En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente una micropartícula por 1.69 micrómetros cuadrados. En realizaciones, la matriz incluye aproximadamente una micropartícula por micrómetro cuadrado.
En realizaciones, el soporte sólido incluye una pluralidad de pocillos, cada uno de los cuales captura una de las micropartículas como se define en las reivindicaciones. En realizaciones, el dominio de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico como se describe en este documento. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico se une a una secuencia de ácido nucleico complementaria. En realizaciones, la secuencia de ácido nucleico complementaria incluye una fracción detectable. En realizaciones, la fracción detectable es una fracción fluorescente.
Métodos
En otro ejemplo que no pertenece a la presente invención, se proporciona un método para formar una micropartícula escindida. El método incluye (i) unir una micropartícula como se proporciona en el presente documento, incluidas las realizaciones de la misma, a un soporte sólido, formando así una micropartícula inmovilizada. (ii) El segundo enlazador de la micropartícula inmovilizada se escinde, formando así una micropartícula escindida. En un ejemplo (que no es de la presente invención), el método incluye antes de la escisión de la etapa (ii) y después de la unión de la etapa (i), unir una secuencia de ácido nucleico complementaria al dominio de ácido nucleico. En un ejemplo (no de la presente invención), la escisión incluye poner en contacto la micropartícula inmovilizada con un agente de escisión. En un ejemplo (no de la presente invención), el agente de escisión es un ácido. En un ejemplo (no de la presente invención), el agente de escisión es ácido trifluoroacético. En un ejemplo (no de la presente invención), el agente de escisión es un agente alcalino. En realizaciones, el agente de escisión es hidróxido de amonio. En un ejemplo (no de la presente invención), el agente de escisión es amoniaco. En un ejemplo (no de la presente invención), el agente de escisión es metilamina. En un ejemplo (no de la presente invención), el agente de escisión es una mezcla de hidróxido de amonio
y metilamina. En un ejemplo (no de la presente invención), la escisión se realiza a temperatura ambiente. En un ejemplo (no de la presente invención), el agente de escisión es la irradiación UV. En un ejemplo (no de la presente invención), el agente de escisión es una irradiación de luz. En un ejemplo (no de la presente invención), la escisión no incluye la escisión del primer enlazador.
En un ejemplo que no es de la presente invención, el método incluye después de la escisión de la etapa (ii), un etapa (iii) de hacer reaccionar una fracción reactiva del dominio del ligando, formando así un dominio del ligando reactivo y (iv) unir un enlazador del ligando al dominio del ligando reactivo. En un ejemplo (que no es de la presente invención), el método incluye después de la escisión de la etapa (ii), un etapa (iii) de unión de un enlazador del ligando al dominio del ligando. En un ejemplo (que no es de la presente invención), la etapa (ii) de escisión incluye la unión de un enlazador del ligando al dominio del ligando. Por lo tanto, la escisión del segundo enlazador puede ocurrir simultáneamente con la unión de un enlazador de ligando al dominio del ligando. Alternativamente, la unión de un enlazador del ligando al dominio del ligando puede ocurrir después de la escisión del segundo enlazador. En un ejemplo (no de la presente invención), la unión de un enlazador del ligando al dominio del ligando incluye hacer reaccionar una fracción reactiva del dominio del ligando.
En otro ejemplo que no pertenece a la presente invención, se proporciona un método para detectar un enlazador del ligando. El método incluye (i) unir una micropartícula como se proporciona en el presente documento, incluidas las realizaciones de la misma, a un soporte sólido, formando así una micropartícula inmovilizada. (ii) Se une un ácido nucleico complementario al dominio de ácido nucleico de la micropartícula inmovilizada y se determina una ubicación del dominio de ácido nucleico en el soporte sólido, formando así una micropartícula decodificada y mapeada. (iii) El segundo enlazador de la micropartícula decodificada y mapeada se escinde, formando así una micropartícula mapeada y escindida. (iv) Se une un enlazador del ligando al dominio del ligando de la micropartícula mapeada y escindida; y (v) se identifica una ubicación del enlazador del ligando unido sobre el soporte sólido, detectando así el enlazador del ligando. En un ejemplo (no de la presente invención), la escisión de la etapa (iii) y la unión de la etapa (iv) ocurren simultáneamente. En un ejemplo (no de la presente invención), la unión de un enlazador del ligando al dominio del ligando incluye hacer reaccionar una fracción reactiva del dominio del ligando.
En otro ejemplo que no pertenece a la presente invención, se proporciona un método para detectar un enlazador del ligando. El método (que no es de la presente invención) incluye (i) poner en contacto un enlazador del ligando con una micropartícula como se proporciona en el presente documento incluyendo ejemplos de las mismas formando así un enlazador unido al ligando. (ii) Se identifica una ubicación del enlazador unido al ligando en el soporte sólido, detectando así el enlazador del ligando.
Ejemplos
Utilizando la síntesis de bibliotecas de grupos divididos, los solicitantes pudieron aumentar el número de compuestos mostrados en al menos 1,000 veces con respecto a los métodos actuales. Las composiciones proporcionadas en el presente documento son una colección muy diversa de moléculas inmovilizadas en una matriz extremadamente densa sobre un soporte sólido. Para preparar el sistema de los solicitantes, la biblioteca de precursores ensamblada se inmoviliza en una matriz plana. Se decodifica toda la matriz inmovilizada, ya que cada miembro de la biblioteca ocupa ahora un espacio permanente y discreto en una matriz plana, la decodificación convierte lo que era una biblioteca codificada químicamente en una biblioteca direccionada espacialmente. Las unidades de codificación química se eliminan y las transformaciones sintéticas posteriores se realizan a través de la biblioteca inmovilizada, completando la síntesis de la biblioteca. A continuación, la biblioteca se puede cribar para identificar moléculas que demuestren una función útil.
Cuando la síntesis de agrupación dividida codificada se combina con métodos establecidos de inmovilización de perlas de alta densidad y secuenciación de oligonucleótidos, el sistema permite cribados de bibliotecas de agrupación dividida completamente decodificadas en una escala que antes no era posible. Por analogía con la tecnología de secuenciación de próxima generación, deberían lograrse conjuntos de cribado completamente decodificados de hasta 108 a 1010 en un formato de microarreglos. En el presente documento se proporcionan bibliotecas "sin etiquetas" para química adicional. Al decodificar antes del cribado, las etiquetas de oligonucleótidos se pueden eliminar, lo que logra dos cosas: (i) se puede realizar una química adicional que sería incompatible con la etiqueta de oligonucleótidos en la biblioteca inmovilizada (la incompatibilidad química es uno de los desafíos establecidos de la química combinatoria codificada); (ii) la eliminación de las etiquetas elimina la posibilidad de que las etiquetas interfieran con los ensayos de interés. La química de codificación permite a los solicitantes aprovechar el poder de la síntesis de grupo dividido para la generación de bibliotecas químicas, pero permite que las bibliotecas se evalúen en cribados relativamente ricos en información, en lugar de selecciones. Se evalúa el rendimiento relativo de todos los miembros de la biblioteca en un ensayo determinado, no solo los "aciertos" seleccionados. Los compuestos que resultan problemáticos en uno o más ensayos se pueden identificar y marcar fácilmente, lo que reduce el número de posibles falsos positivos en los cribados posteriores. Esto facilita el desarrollo de relaciones estructura-actividad.
Los compuestos bioactivos finales que se criban para determinar su actividad se forman después de la decodificación y eliminación de las etiquetas. Lo que está inmovilizado y decodificado son productos intermedios sintéticos protegidos. Para los métodos descritos proporcionados en el presente documento, se realiza al menos un etapa química adicional
después de decodificar y eliminar el dominio de ácido nucleico para terminar de preparar los "agentes bioactivos" (esto podría incluir: desprotección, macrociclización, etc.).
Los beneficios potenciales de codificar la síntesis de una biblioteca de grupo dividido utilizando ácidos nucleicos son bien conocidos, al igual que los desafíos sintéticos. La estrategia de codificación específica de los solicitantes permite la creación de bibliotecas codificadas de ADN cribables en menos transformaciones químicas lineales por etapa que las demostradas anteriormente, siendo cada etapa de codificación decodificable de forma independiente.
La micropartícula también denominada en el presente documento "núcleo" podría ser un dendrímero, un polímero hiperramificado, una partícula de sílice funcionalizada, una partícula de polímero funcionalizada. El núcleo puede ser magnético. El núcleo podría variar en tamaño desde 20 nm hasta 200 micrómetros de diámetro. El núcleo está funcionalizado con una fracción reactivo que permite la unión de bloques de construcción para elaborar las moléculas de la biblioteca, una fracción reactiva diferente que permite la unión de etiquetas de ADN para codificar y, en algunos casos, una tercera fracción reactiva diferente que ayuda en la inmovilización covalente del núcleo a una superficie.
El núcleo multidentado puede ser una perla polimérica magnética de 0.9 micras funcionalizada con una superficie de polietilenglicol terminada con aminas protegidas ortogonalmente.
El precursor sintético (dominio del ligando que incluye una fracción protectora) podría ser cualquier producto de síntesis unida al soporte de múltiples etapas, con la restricción de que cualquier transformación sintética utilizada para crear el precursor sintético, una vez unida a la partícula del núcleo, debe ser compatible con la estructura química del núcleo y son ortogonales/compatibles con la química de codificación descrita o se realizan antes de la incorporación de las primeras etiquetas de codificación. Los precursores sintéticos pueden ser poliamidas protegidas de cadena lateral.
Las etiquetas de codificación (dominios de ácido nucleico) consisten en derivados de ácido nucleico funcionalizados, pre-sintetizados y únicos unidos covalentemente directamente a la partícula del núcleo a través de un enlazador escindible o indirectamente a través de otras etiquetas de codificación. Las secuencias de etiquetas tienen una longitud y composición suficientes y codifican la biblioteca completa. Para habilitar la decodificación de etapas de síntesis codificadas específicas, independientemente de otros etapas de síntesis codificadas. Por ejemplo: la decodificación de las etiquetas utilizadas para codificar la segunda etapa de una síntesis debe ser completamente independiente de la capacidad de decodificar las etiquetas utilizadas para codificar la primer o tercera etapa de una síntesis. La incorporación fallida de etiquetas en la etapa uno tiene un impacto adverso en la incorporación de etiquetas en la etapa dos. La incapacidad de "decodificar" la etapa uno afectará la capacidad de "decodificar" la etapa dos para un miembro de biblioteca codificado dado. El enfoque de los solicitantes puede requerir secuencias de ácido nucleico más largas pero proporciona un proceso de codificación/decodificación más robusto. Las etiquetas son compatibles con el método elegido de decodificación o secuenciación. Por ejemplo, si la secuenciación de etiquetas se va a realizar mediante un proceso de hibridaciones secuenciales, las etiquetas deberían ser relativamente isotérmicas entre sí y contener suficientes diferencias de secuencia de modo que se minimice la hibridación cruzada no deseada. Si la secuenciación de etiquetas se va a realizar a través de cualquiera de las secuencias basadas en enzimas mediante síntesis o secuenciación mediante enfoques de ligación, las etiquetas pueden requerir sitios de unión de cebadores comunes.
Etiquetar estructuras químicas: (i) estables y no reactivas a las transformaciones sintéticas utilizadas para construir la biblioteca precursora; (ii) extraíble de la partícula del núcleo después de secuenciarla; (iii) compatible con el método de decodificación/secuenciación. Por ejemplo, la secuenciación por hibridación podría realizarse con ADN, PNA, LNA, ARN, ARN modificado, análogos de a Dn modificado o algunas combinaciones de los mismos. Para cualquier enfoque de secuenciación basado en enzimas, se prefiere el ADN. Las estructuras de oligonucleótidos protegidas podrían usarse para mejorar la ortogonalidad química, en las que las fracciones protectoras de la etiqueta se eliminan antes de la decodificación (por ejemplo, las aminas exocíclicas de las nucleobases pueden protegerse antes o inmediatamente después de la incorporación de la etiqueta).
Etiquetar estructuras de sitios de escisión: (i) las etiquetas se pueden unir directamente a la partícula del núcleo o indirectamente al núcleo a través de otras etiquetas, todos los puntos de unión de las partículas del núcleo para las etiquetas contienen en última instancia un sitio de escisión. (ii) las estructuras escindibles preferidas, después de la escisión, dejan la superficie de la partícula del núcleo libre de fracciones reactivas que puedan interferir con la química o los ensayos posteriores (por ejemplo, el sitio de escisión del éster que deja un alcohol libre; el sitio de escisión del éter trietílico que deja un alcohol libre).
Estructuras de enlace de etiquetas: las etiquetas codificantes pueden ser oligonucleótidos basados en ADN de 20 mer con contenido de C cero y contenido de G del 25%. Las etiquetas se diferencian entre sí por al menos un desajuste de seis pares de bases. Las etiquetas están unidas al soporte y/o entre sí a través de enlaces 1,3-triazol, todas finalmente conectadas a la partícula del núcleo a través de un enlace éster escindible. Cualquier método de unión y cualquier superficie utilizada debe ser compatible con las condiciones de decodificación y las condiciones del ensayo de micromatrices, así como las condiciones de eliminación de etiquetas y cualquier condición de reacción sintética aplicada a la matriz. Los solicitantes han demostrado inmovilización sobre cuarzo modelado, silicio modelado y vidrio funcionalizado con carboximetildextrano.
Eliminación de etiquetas de ADN: Las condiciones dependen de la estructura en el sitio de escisión de la etiqueta. Con enlace éster, los solicitantes han utilizado hidróxido de amonio y metilamina. Desprotección de ligandos y modificaciones sintéticas adicionales. Los solicitantes han eliminado todos las fracciones protectores de la cadena lateral de las estructuras de poliamida. Se realizará una desprotección selectiva de la cadena lateral seguida de macrolactamización. Se llevará a cabo la incorporación de pares inactivadores de fluoróforo o fracciones solvatocrómicas. Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden ser útiles, entre otras cosas, para cribado de micromatrices, ensayos de unión a lecturas de fluorescencia, colorimétricas o electroquímicas, en los que se incuban proteínas de interés marcadas con fluorescencia sobre la matriz para identificar los enlazadores.
En realizaciones, los chips prototipo están a un espaciado C-C (centro a centro) de 2,4 micrómetros en una matriz hexagonal. Eso da como resultado 4.99 micrómetros cuadrados por perla (menos de 5.76 micrómetros cuadrados por perla esperados porque las perlas están empaquetadas de forma hexagonal), o 20 millones de perlas por centímetro cuadrado, o 200,000 perlas por milímetro cuadrado, o ~ 376 millones de partículas dentro del área equivalente de un portaobjetos de microscopio estándar de 25 mm por 75 mm.
En realizaciones, las partículas se han inmovilizado en una matriz hexagonal con espaciamiento C-C de 1.3 micrómetros. Eso da como resultado 1.46 micrómetros cuadrados por perla, o 78.9 millones de perlas por centímetro cuadrado, o 789,000 perlas por milímetro cuadrado, o 1.28 mil millones de perlas dentro del área equivalente a un portaobjetos de microscopio de 25 mm por 75 mm.
En realizaciones, las partículas se han inmovilizado en una matriz empaquetada cuadrada con espaciamiento C-C de 1.3 micrómetros. Eso da como resultado 1.69 micrómetros cuadrados por perla, o 59 millones de perlas por centímetro cuadrado, o 591,715 perlas por milímetro cuadrado, o 1.11 mil millones de perlas dentro del área equivalente a un portaobjetos de microscopio de 25 mm por 75 mm.
En realizaciones, una matriz se empaqueta de forma hexagonal con una densidad de 1 perla por micra cuadrada (espaciamiento de C-C de ~ 1.075 micrómetros).
Materiales y métodos
Reactivos
Trietilamina (TEA), diisopropiletilamina (DIPEA), diisopropilcarbodiimida (DIC), dimetilaminopiridina (DMAP), dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (Dm SO), Triton X-100 (TX100), ácido azidoacético (Aza), hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido (HATU), hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PYAOP), Tris(3-hidroxipropilmetil)amina (THPTA), complejo de dimetilsulfuro de bromuro de cobre (I) (CuBrDMS), Boc-Glicina y Fmoc-Glicina se adquirieron de Sigma-Aldrich y se utilizaron tal como se recibieron. Todos los demás aminoácidos protegidos con Fmoc se adquirieron a través de Novabiochem o Advanced Chemtech. El agua utilizada en todos los lavados y tampones de reacción se obtuvieron a través de un sistema de purificación Millipore MilliQ. Los reactivos Peg usados para la funcionalización inicial de micropartículas se adquirieron a través de Rapp Polymere o Quanta Biodesign. Las perlas ProMag son proporcionadas por Bangs Laboratories como una solución al 2.6% p/v en agua y tienen las siguientes características: 880 nm de diámetro promedio. Compuesto por óxido de hierro incrustado en una matriz de polímero altamente entrecruzada. La superficie de las partículas muestra fracciones reactivas de ácido carboxílico libre a razón de 440 nmoles equivalentes por miligramo. Aproximadamente 2 mil millones de micropartículas están contenidas dentro de un miligramo de partículas patrón. Todas las etiquetas de ácido nucleico y las secuencias del complemento marcadas con fluorescencia se adquirieron a través de IDT.
Tabla 1.
Secuencias del dominio del ligando
SEQ ID NO: 17: YPYDVPDYA. (etiqueta de HA)
SEQ ID NO: 18: EQKLISEEDL (etiqueta de Myc)
Abreviaturas de reactivos adicionales
DITx agua MilliQ que contiene Triton X-100 al 1%
DMSOTx DMSO que contiene Triton X-100 al 1%
PBT tampón de fosfato 100 mM, pH 7,0 que contiene Triton X-100 al 1%
AMA 1:1 mezcla de hidróxido de amonio y metilamina al 30% en etanol
Procedimientos generales de manipulación de micropartículas
De manera similar a la mayoría de los procedimientos de síntesis en fase sólida, una reacción típica implica 1) dispersar las micropartículas en una solución de reacción, 2) agregar solventes o reactivos adicionales según sea necesario para la reacción, 3) proporcionar agitación ocasional o constante a una temperatura de reacción específica durante un período de tiempo y 4) después de la reacción, los reactivos y los subproductos solubles de la reacción se separan de las micropartículas mediante una serie de lavados. Las etapas de separación y lavado de las micropartículas de los solicitantes consisten en múltiples rondas de 1) sedimentación asistida magnéticamente de las micropartículas y aspiración del sobrenadante seguido de 2) resuspensión del sedimento de micropartículas en una solución de lavado adecuada.
Funcionalización de micropartículas ProMag
PEGilación inicial:
9 partes H2N -P EG -O H (3000 PM)
1 parte H2N -P E G -N H 2 (3000 PM)
para proteger grupos
carboxilo sin reaccionar
Se realiza una funcionalización a gran escala para crear perlas pegiladas (con una relación de grupos hidroxilo a grupos amina de 4.5:1) con el fin de eliminar cualquier variación de un lote a otro. Se lavan 250 pl de perlas ProMag patrón con DMFTx (1 ml, x3) y se suspenden en 150 pl de DMFTx. Se pesan amino hidroxi PEG 3000 (270 mg) y bis amina PEG 3000 (30 mg) en un tubo cónico de 1,5 ml y se funden en un baño de aceite a 65 °C. Las perlas se añaden al PEG fundido y se mezclan completamente/calientan. Se añaden 55 pl de DIPEA a la mezcla de reacción y se someten a agitación tipo vórtice seguido de la adición de PyAOP sólido (160 mg). La reacción se desarrolló a 65 °C durante 45 minutos mientras se calentaba en un baño de aceite. Las concentraciones finales en la reacción terminan siendo (PEG 200 mM, PyAOP 600 mM, DIPEA 600 mM). Después de 45 minutos, los ácidos carboxílicos restantes en la superficie se protegen con 2-metoxietil amina (250 pl), se dejan incubar a la misma temperatura durante 10 minutos, luego se lavan las perlas con DMFTx (1 ml, x3), luego se resuspenden con 250 pl de DMFTx. Se extrajo una alícuota de 50 pl y se lavó con agua MilliQ (400 pl, x3) y se cargó en la bandeja limpia/tarada calcinada, se coloca en el horno a 95 °C y se lleva a cabo el siguiente método. Salto a 95 °C, isoterma durante 10 min, rampa de 20 °C/min hasta 500 °C, isoterma durante 30 minutos [masa inicial: 1.5940 mg. A 100 °C 98.86%. A 500 °C 31.30%]. Esto corresponde a un 25.4% de funcionalidad añadida, en comparación con el último lote grande que tenía un 24.3% de funcionalización añadida (1.704 mg, 99.81% a 100 °C y 32.08% a 500 °C) en comparación con los dos primeros lotes grandes preparados por el mismo protocolo que tuvo una función añadida del 25.6%.
Protección con BOC (x2)
El resto de las perlas se protegen con Boc mediante lavado en DMSOTx (1 ml, x3), suspendido en 170 |jl de DMFTx, añadiendo 14 mg de Boc-Gly OH, seguido de 22.3 j l de TEA y 30.4 mg de HATU, en ese orden. La reacción se desarrolló a 65 °C durante 30 min en un baño de aceite, después de lo cual las perlas se lavaron con DMFTx (500 ml, x3) y se sometieron a las mismas condiciones una vez más. A continuación, las perlas se sometieron a AMA (200 jl, 65 °C, 5 min) y luego se lavaron en DMFTx a una concentración patrón.
DIC/DMAP con azida de cadena larga (x3)
Las perlas se resuspenden en 400 j l de DMFTx, a esto se añaden 80 j l de ácido azido de cadena larga 500 mM (11.66 mg/100 jl), seguido de 6.7 j l de DIC, luego 10 j l de DMAP (80 mg/ml de patrón en DMF). Estas condiciones de acoplamiento se repitieron un total de tres veces, lavando con DMFTx (200 jl, x3) entre cada uno. A continuación, se elimina el grupo Boc mediante tratamiento con TFA durante 15 minutos. A continuación, este lote grande se lava en PBT (400 jl, x3) y se suspende en 400 j l (dilución x4 del patrón). El protocolo para unir ácido azidoacético en una forma escindible con álcali (conectado a la micropartícula a través de un enlace éster) se realiza de manera similar.
Condiciones de acoplamiento estándar de aminoácidos con HATU
HATU 400 mM, aminoácido con FMOC 400 mM, TEA 800 mM en 10% de DITx, 90% de DMSOTx, 65 °C, 30 minutos.
Las perlas se lavan en DITx (100 jl, x3) y se suspenden en 10 j l de DITx. A esto se le agrega el aminoácido con FMOC en 80 j l de DMSOTx (400 mM para un volumen de reacción de 200 jl), seguido de TEA (10 jl, 101.19 g/mol, 0.726 g/ml), y finalmente se añade HATU (15 mg, 380.23 g/mol) como un sólido y el tubo se coloca en el bloque de calentamiento rojo a 65 °C durante 30 minutos. Se realizan acoplamientos dobles (sin lavar entre ellos) con todos los aminoácidos para asegurar una conversión del 100%.
Acoplamiento estándar con HATU de azida a la fracción reactiva de amina en las etiquetas de ácido nucleico HATU 400 mM, ácido 2-azidoacético 400 mM, TEA 800 mM en 10% de DITx, 90% de DMSOTx, 65 °C, 30 minutos.
Las perlas se lavan en PBT (100 jl, x3) y se suspenden en 10 j l de DITx. A esto se le agrega DMSOTx (80 jl), seguido de ácido 2-azidoacético (3 jl, 101.06 g/mol, 1.35 g/ml), seguido de TEA (22.3 jl, 101.19 g/mol, 0.726 g/ml) y finalmente se añade HATU (15 mg, 380.23 g/mol) como un sólido y el tubo se coloca en el bloque de calentamiento rojo fijado a 65 °C durante 30 minutos. Se realizan acoplamientos dobles (sin lavar entre ellos) con todos los ácidos para asegurar una conversión del 100%.
Condiciones de cicloadición de alquino azida catalizada por cobre (Huisgen) (etapa de codificación)
Preparación de la solución patrón de catalizador: previamente se había pesado DMS con Cu(I)Br (205.58 g/mol) en la caja de guantes en viales de centelleo de 20 ml. Se agrega DMSO (que se mantiene en la caja de guantes) al vial de manera que se logre una concentración de 4.5 mg/ml (22 mM). Se pesa THPTA (tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina) (434.5 g/mol) fuera de la campana y se disuelve a una concentración de 2.8 mg/125 j l (52 mM). Las soluciones de Cu (I) y ligando se combinan en una relación 1:2 v:v de Cu(I) a ligando, produciendo las siguientes concentraciones: THPTA 35 mM y DMS Cu(I)Br 7.3 mM en 50% de DMSO y agua 50% de MilliQ.
Claims (14)
1. Una micropartícula inmovilizada sobre un soporte sólido, en el que dicha micropartícula se une además covalentemente a:
(i) un dominio del ligando a través de un primer enlazador; y
(ii) un dominio de ácido nucleico a través de un segundo enlazador;
en el que dicho dominio de ácido nucleico es una etiqueta codificante que identifica dicho dominio del ligando; en el que dicho segundo enlazador es escindible y dicho primer enlazador no es escindible bajo una condición de que dicho segundo enlazador sea escindible; y dicho primer enlazador comprende -C(O)NH- o -NHC(O)-, y dicho segundo enlazador comprende -C(O)O- u -OC(O)-.
2. La micropartícula de la reivindicación 1, en la que dicha micropartícula es una microperla, una microperla funcionalizada, una microperla magnética, una microperla metálica, una microperla de sílice, una microperla polimérica, un dendrímero o un polímero ramificado.
3. La micropartícula de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicho dominio del ligando es una molécula pequeña.
4. La micropartícula de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicho dominio del ligando es un péptido o una proteína.
5. La micropartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho dominio del ligando comprende una fracción reactiva unida covalentemente a una fracción protectora removible.
6. La micropartícula de la reivindicación 5, en la que dicha fracción reactiva se selecciona de una cadena lateral de aminoácidos, un terminal amino o un terminal carboxilo.
7. La micropartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho dominio de ácido nucleico está unido a una secuencia de ácido nucleico complementaria, en la que dicha secuencia de ácido nucleico complementaria comprende una fracción detectable.
8. La micropartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho dominio del ligando se une a un enlazador del ligando.
9. Un soporte sólido que comprende una pluralidad de pocillos, en el que cada uno de dicha pluralidad de pocillos comprende una micropartícula capturada, en la que dicha micropartícula está unida covalentemente a:
(i) un dominio del ligando a través de un primer enlazador; y
(ii) un dominio de ácido nucleico a través de un segundo enlazador;
en el que dicho dominio de ácido nucleico dicho dominio de ácido nucleico es una etiqueta codificante que identifica dicho dominio del ligando;
en el que dicho segundo enlazador es escindible y dicho primer enlazador no es escindible bajo una condición de que dicho segundo enlazador sea escindible; y dicho primer enlazador comprende -C(O)NH- o -NHC(O)-, y dicho segundo enlazador comprende -C(O)O- u -OC(O)-;
y
en el que dicho dominio del ligando es capaz de unirse a un enlazador del ligando seleccionado de una proteína, una mezcla de proteínas, una molécula pequeña, una mezcla de moléculas pequeñas, un elemento, una mezcla de elementos, un polímero sintético, una mezcla de polímeros sintéticos, o un lisado celular.
10. El soporte sólido de la reivindicación 9, en el que el dominio del ligando es un péptido, molécula pequeña o proteína.
11. El soporte sólido de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que dicho dominio del ligando comprende una fracción reactiva unida covalentemente a una fracción protectora removible.
12. El soporte sólido de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho dominio de ácido nucleico está unido a un ácido nucleico complementario que comprende una fracción detectable.
13. El soporte sólido de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que dicho dominio del ligando se une a dicho enlazador del ligando.
14. El soporte sólido de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que las micropartículas que incluyen dicha micropartícula se ensamblan sobre el soporte sólido ordenado para formar una matriz ordenada que incluye al menos 10,000 micropartículas por milímetro cuadrado.
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