ES2954292T3 - Compuestos para protección de células - Google Patents

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ES2954292T3 ES18174182T ES18174182T ES2954292T3 ES 2954292 T3 ES2954292 T3 ES 2954292T3 ES 18174182 T ES18174182 T ES 18174182T ES 18174182 T ES18174182 T ES 18174182T ES 2954292 T3 ES2954292 T3 ES 2954292T3
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Der Graaf Adrianus Cornelis Van
Andre Heeres
Johannes Paulus Gerardus Seerden
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Sulfateq BV
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Abstract

Esta invención se refiere a un compuesto para ciertos usos con la fórmula estructural (I) en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y es preferiblemente metilo, etilo, propilo o isopropilo; R3 se selecciona del grupo que consiste en CH2NHR9, C(=O)YR10, -CH2OH. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos para protección de células
Esta invención se refiere a compuestos para la protección de células, en particular células cultivadas, células sanguíneas y de tejido y plaquetas sanguíneas, o trombocitos. Se refiere además a compuestos para su uso como o en medicamentos. Además, se refiere a un receptáculo que comprende los compuestos y las células, en particular células de mamífero y plaquetas sanguíneas de mamífero, para la protección de las células. Además, la invención se refiere a un método para la protección de células, en particular a un método para la protección de células durante el almacenamiento.
Se conocen en la técnica compuestos que protegen las células y que se usan como medicamento para proteger las células contra, por ejemplo, daño celular inducido por estrés oxidativo. Por ejemplo, los derivados de tropolona muestran actividad n euro protectora tal como se describe en Koufaki et al. (Eur J Med Chem. Marzo de 2010; 45(3):1107-12). El estrés oxidativo en las células y el daño celular suelen estar relacionados con el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con el envejecimiento. Estudios recientes revelaron que compuestos tales como las nitronas pueden usarse en el tratamiento del ictus isquémico y como agentes anticancerígenos (revisado en Floyd et al. Free Radic Biol Med. 1 de septiembre de 2011;51(5):931-41).
Otros ejemplos de compuestos que presentan propiedades protectoras de las células, en particular actividad neuroprotectora, son híbridos de restos cromano y catecol tal como se describe en Koufaki et al. (Bioorg Med Chem.
1 de junio de 2010; 18(11):3898-909; Bioorg Med Chem. 1 de septiembre de 2009; 17(17):6432-41), y cromanos sustituidos con isoxazol (Bioorg Med Chem. 15 de agosto de 2011; 19(16):4841-50).
También se requiere protección de las células durante el almacenamiento de las células. Este es especialmente el caso cuando las células se enfrían hasta, por ejemplo, 4 °C o -80 °C y se calientan nuevamente para su uso en ensayos celulares o aplicaciones clínicas.
Las plaquetas sanguíneas son tipos de células que son muy difíciles de almacenar. Actualmente, las plaquetas sanguíneas se almacenan con agitación constante a 20-24 °C. El almacenamiento a temperatura ambiente proporciona un entorno en el que puede proliferar cualquier bacteria, microbiota cutánea u otros microorganismos infecciosos de la sangre o la piel que se introducen en el componente sanguíneo durante el procedimiento de recogida, puesto que el crecimiento a estas temperaturas no está limitado. Estas plaquetas sanguíneas contaminadas ya no pueden usarse para transfusión. Por este motivo, el almacenamiento no puede durar más de cinco días, lo que da como resultado el hecho de que más del 15 % de las plaquetas sanguíneas recogidas mueren antes de que puedan usarse (se usan/puedan usarse o se usaron/pudieron usarse). El almacenamiento a baja temperatura impediría la proliferación bacteriana. Sin embargo, plaquetas muestran lesión por almacenamiento de plaquetas inducida por el frío (PSL), [puesto que esta abreviatura se usa más adelante] cuando se enfrían, incluso brevemente hasta 4 °C. Estas lesiones por almacenamiento en frío de plaquetas comienzan a producirse incluso después de una breve exposición hasta temperaturas de menos de 20 °C y se observan incluso en pacientes que se someten a cirugía durante la cual la temperatura de todo el cuerpo o de partes del cuerpo disminuye hasta menos de 20 °C. La exposición de las plaquetas hasta temperaturas de menos de 20 °C da como resultado una lesión estructural y una activación funcional de las plaquetas normales. Las características clave de la lesión por almacenamiento en frío de plaquetas son (1) cambio morfológico de reversible a irreversible desde una célula discoide hasta esferas especuladas con filopodios sobresalientes, dependiendo de la duración de la exposición hasta temperaturas de menos de 20 °C y (2) microagregación independiente inmunitaria irreversible de plaquetas por interacción célula-célula aumentada, (3) agrupamiento de membrana de la glicoproteína GPIb sobre la superficie de las plaquetas, que es la señal para los macrófagos para eliminar las plaquetas del torrente circulatorio; y (4) el reconocimiento y fagocitosis posterior de plaquetas transfundidas por los macrófagos tras la transfusión a un receptor. Se han estudiado varios compuestos y su efecto sobre el almacenamiento de las plaquetas. Por ejemplo, la patente US 7.964.339 describe el uso de polietilenglicol y derivados para modificar las plaquetas que tiene un efecto sobre el almacenamiento en frío. Además, Amorini (Blood Transfus. Enero de 2007;5(1):24-32) demostró que una disolución de glucosa puede tener un efecto positivo sobre el almacenamiento de las plaquetas sanguíneas. La patente estadounidense n.° 6.833.236 y la patente EP n.° 1221 835 B1 describen el uso de trehalosa para la protección de trombocitos cuando se secan o se secan por congelación en una secadora FTS, para el almacenamiento de las plaquetas sanguíneas.
A pesar de estos conocimientos de compuestos que tienen un efecto sobre el almacenamiento de las plaquetas sanguíneas, existe la necesidad adicional de elaborar nuevos compuestos que tengan un efecto positivo sobre el almacenamiento de las plaquetas sanguíneas. Además, se requiere además hallar nuevos compuestos que protejan las células contra el daño celular in vitro e in vivo, donde el daño celular puede provocarse por estrés oxidativo, entre otros.
Un objeto de esta invención es proporcionar compuestos que puedan usarse para proteger células, tales como células de mamífero, contra la lesión celular.
Otro objeto es proporcionar compuestos que puedan usarse para proteger las plaquetas sanguíneas contra lesión por almacenamiento en frío.
Un objeto adicional es proporcionar compuestos que proporcionan protección de las células contra el daño provocado por diversas indicaciones médicas, tales como indicaciones implicadas por enfermedades debidas al envejecimiento, indicaciones implicadas por estrés oxidativo, y/o indicaciones implicadas por la formación de un coágulo sanguíneo.
Estos objetos y otros objetos se resuelven parcial, si no completamente, por un compuesto tal como se describe en la reivindicación 1 adjunta.
En un aspecto, la invención se refiere al uso, tal como describe en la reivindicación 1 adjunta, de un compuesto, en el que el compuesto tiene la fórmula estructural de (I)
Figure imgf000003_0001
en la que,
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y es preferiblemente metilo, etilo, propilo o isopropilo;
R3 es
Figure imgf000003_0002
en la que * indica el punto de unión de R3 al resto de la molécula;
R11 y R12 forman junto al átomo de N al que están unidos un anillo saturado de 3-8 miembros, incorporando opcionalmente uno o más átomos adicionales, tal como uno, dos o tres átomos de N, O o S, opcionalmente sustituidos con un alquilo, alcohol alquílico;
Los compuestos de general fórmula (I) que contienen un centro asimétrico están en forma isomérica. Las formas racémicas y enantioméricas de estos compuestos también forman parte de esta invención.
Los inventores hallaron sorprendentemente que los compuestos que tienen la fórmula tal como se describió anteriormente protegen las células contra el daño celular. Los inventores desarrollaron varios compuestos nuevos tal como se describió anteriormente, y hallaron que pueden proteger las células contra el daño celular. El daño celular puede tener varias causas y se establece en condiciones de estrés. El daño celular puede conducir eventualmente a necrosis o apoptosis celular. Los inventores realizaron pruebas en varios tipos de células y sorprendentemente hallaron que los compuestos anteriores tienen un efecto sobre las células y protegen la célula contra el daño celular o la lesión celular en condiciones de estrés. Con condiciones de estrés se entiende privación de oxígeno (hipoxia e isquemia); aparición de agentes físicos (tal como traumatismo mecánico, extremos de temperatura, quemaduras y frío intenso, cambios repentinos en la presión atmosférica, radiaciones, descarga eléctrica); aparición de agentes químicos y fármacos; aparición de agentes infecciosos, reacciones inmunológicas; enfermedades genéticas; desequilibrios alimenticios, tales como lesión, infección, cáncer, infarto, venenos, aparición de ROS (especies reactivas del oxígeno) e inflamación. Los compuestos tal como se describieron anteriormente pueden usarse como medicamento para proteger las células contra las causas mencionadas anteriormente de lesión celular.
En otra realización, la invención se refiere a un compuesto tal como se describió anteriormente para su uso en el tratamiento de lesión por isquemia/reperfusión.
En otra realización, la invención se refiere a un compuesto tal como se describió anteriormente para su uso en el tratamiento de indicaciones implicadas con daño celular inducido por estrés oxidativo.
En un aspecto, los inventores también hallaron que los compuestos tal como se describieron anteriormente protegen las plaquetas sanguíneas e impiden que las plaquetas sanguíneas se adhieran o agreguen, e impide que experimenten el cambio de forma.
En otra realización, la invención se refiere a un compuesto para su uso en el tratamiento o la profilaxis de trastornos que conducen a o provocadas por una disfunción de las plaquetas tal como trombosis arterial, fibrilación arterial, embolia pulmonar (PE), trombosis venosa profunda (DVT) o tromboembolia venosa (VTE), insuficiencia cardiaca congestiva, ictus, infarto de miocardio, hipercoagulabilidad genética o adquirida, o defectos de las plaquetas provocados por fiebres hemorrágicas tales como el ébola, enfermedad de Marburgo y enfermedad de Chagas. En una realización preferida, el compuesto para su uso en el tratamiento o la profilaxis de trastornos que conducen a o provocadas por una disfunción de las plaquetas se elige de Sul 121, Sul 132, Sul 138 (véase la tabla 1 para los nombres de la IUPAC).
En otro aspecto, la invención se refiere a una disolución que comprende los compuestos tal como se describió anteriormente y células. Los inventores hallaron que los compuestos protegen las células contra la lesión celular, lo que puede conducir eventualmente a la muerte celular a través de necrosis o apoptosis. Los compuestos según la invención proporcionan protección contra la lesión celular. La protección puede proporcionarse durante el almacenamiento. Las células almacenadas con compuestos según la invención tienen una muerte celular disminuida en comparación con las células almacenadas sin el compuesto.
En una realización, los compuestos anteriores protegen las células de mamífero, tales como líneas celulares cultivadas (por ejemplo, de origen humano), células madre, células primarias, plaquetas sanguíneas, células sanguíneas y células de tejido. Las líneas celulares pueden ponerse en cultivo para la fabricación de vacunas virales, productos biológicos producidos por tecnología de ADN recombinante en los cultivos celulares, tales como proteínas, hormonas, enzimas, anticuerpos, etc.
En otra realización, la invención se refiere a un medio que comprende uno de los compuestos anteriores, en el que las células se hacen crecer para formar un cultivo celular bi o tridimensional. Además, los compuestos pueden usarse para proteger células que se usan para ingeniería de tejidos.
Los compuestos descritos en el presente documento se proporcionan en la tabla 1.
Tabla 1:
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Los compuestos Sul-95, Sul-108, Sul-109, Sul-112, Sul-121, Sul-132, Sul-134, Sul-135, Sul137 y Sul-138 son según la invención, los otros compuestos sirven como referencia.
A realización preferida según la invención es un medio que comprende plaquetas sanguíneas y uno de los compuestos anteriores.
En una realización preferida, las plaquetas sanguíneas se protegen contra y se impide que se adhieran o agreguen, o que experimenten un cambio de forma mediante la adición de 121, 132, 138.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la protección de células que comprende añadir un compuesto tal como se describió anteriormente a una célula. Preferiblemente, el presente método es un método ex vivo. Por consiguiente, el compuesto puede usarse para la protección durante el almacenamiento de células. El almacenamiento puede producirse a una temperatura que es adecuada para el almacenamiento de la célula particular y puede ser a y por debajo de 37 °C, preferiblemente entre -80 y 37 °C, tal como entre 10-25 °C; 0-10 °C, aproximadamente 4 °C; entre -20 y 0 °C y entre -80 y -20 °C, a temperatura ambiente, - 80 °C, etc. Los inventores hallaron que los compuestos anteriores protegen las células contra la lesión celular durante y después del enfriamiento, y especialmente contra la lesión que se produce durante el calentamiento para volver a la temperatura funcional. Más células sobreviven en estas condiciones de estrés y, por tanto, la capacidad de almacenamiento aumenta cuando las células se almacenan junto con el compuesto según la invención, en comparación con células que se almacenan sin la adición de un compuesto según la invención.
En una realización el medio, que puede ser una disolución de aditivos o tampón de almacenamiento de plaquetas típica, comprende un compuesto según la invención que tiene una concentración que está entre 1, 10-3 - 1,10'10M, de manera preferible aproximadamente 1, 10-6, 1, 10-7, 1, 10-8, 1, 10-9, 1,10'10M.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para el almacenamiento de células, en el que las células son plaquetas sanguíneas que comprende añadir un compuesto según la invención a las plaquetas sanguíneas. Tal como se describió anteriormente, se almacenan plaquetas sanguíneas a temperatura ambiente, antes de que puedan usar para la transfusión. El almacenamiento de plaquetas sanguíneas a 4 °C da como resultado una pérdida rápida de la viabilidad y la función de las plaquetas. Los inventores hallaron que cuando las plaquetas sanguíneas se almacenan a una temperatura por debajo de 20 °C, por ejemplo, a 4 °C con un compuesto según la invención, la capacidad de almacenamiento es mucho mayor y, por tanto, pueden almacenarse más tiempo en comparación con plaquetas sanguíneas almacenadas sin los compuestos. Por tanto, el compuesto según la invención puede usarse para obtener una capacidad de almacenamiento aumentada de plaquetas sanguíneas durante el almacenamiento en frío. Además, cuando se añade un compuesto a las plaquetas sanguíneas, disminuye la agregación y la adhesión de las plaquetas sanguíneas. Además, las plaquetas almacenadas con un compuesto según la invención todavía pueden mostrar una respuesta de agregación tras la estimulación con ADP o epinefrina. Los compuestos según la invención ayudan a mantener la funcionalidad de las plaquetas.
La invención se refiere además a un método para la protección de plaquetas sanguíneas contra lesiones por almacenamiento de las plaquetas. Esto significa que un compuesto según la invención está implicado en el proceso que afecta a cambios morfológicos de las plaquetas cuando se almacenan en frío. El compuesto según la invención proporciona un cambio de forma reducido, una disminución en la coagulación y tiene un efecto sobre la liberación de contenido de gránulos, exocitosis de proteínas citosólicas o sobre los patrones de glicoproteínas en las plaquetas. Los compuestos según la invención tienen una influencia sobre el mecanismo de acción de las plaquetas, y proporcionan una disminución en la PSL (PSL de plaquetas = lesión por almacenamiento de plaquetas), o una disminución de la cantidad de plaquetas activadas, conduciendo posteriormente a una disminución de la apoptosis. Los compuestos anteriores conservan la función plaquetaria de las plaquetas sanguíneas después de haberse almacenado en un entorno frío.
En este aspecto, los compuestos preferidos son Sul 121, Sul 132, Sul 138.
Los compuestos tal como se describieron anteriormente conservan mejor la capacidad de las plaquetas para agregarse o adherirse tras la estimulación, incluso cuando se han almacenado a 4 °C
En una realización, la invención proporciona plaquetas almacenadas con un compuesto tal como se describió anteriormente para su uso como transfusión de plaquetas.
En una realización las plaquetas sanguíneas se derivan de plasma rico en plaquetas (PRP). En otra realización, las plaquetas se derivan de una capa leucoplaquetaria (BC) o el método de aféresis. Las plaquetas para la transfusión pueden prepararse mediante tres métodos diferentes: (a) el método del plasma rico en plaquetas (PRP); (b) el método de la capa leucoplaquetaria (BC); y (c) el método de aféresis. Los estudios que comparan las plaquetas de PRP y BC no han demostrado ninguna diferencia en la calidad in vitro de tales concentrados de plaquetas cuando se almacenan durante hasta 5 días a temperatura ambiente. En la aféresis de plaquetas o trombocitaféresis las plaquetas se derivan de un donante específico. Los tres métodos están bien descritos y se conocen por el experto en la técnica.
En una realización, la presente invención se refiere al uso de los presentes compuestos, preferiblemente Sul 109, para aumentar la tolerancia isquémica al frío de órganos para trasplantes, preferiblemente corazones. Dicho de otro modo, la presente invención se refiere también al uso de los presentes compuestos, preferiblemente Sul 109, para almacenar órganos para trasplantes, tales como corazones.
Los efectos y las ventajas técnicos de las diversas realizaciones y aspectos de los métodos de la invención corresponden mutatis mutandis a los descritos para los productos de la invención y viceversa.
A continuación se describe de forma general la invención, pero para facilitar la comprensión, ahora se hará referencia a los ejemplos y figuras de comparación y no limitativos adjuntos que muestran realizaciones de la invención.
Descripción de las figuras:
Figura 1: Vista general esquemática de prueba que induce una lesión por hipotermia/reperfusión en la que en primer lugar se añade el compuesto de la invención a las células a 37 °C, se incuban durante 1 h, se enfrían a 4 °C durante 24 h, se vuelven a calentar y se someten a prueba a 37 °C.
Figura 2: Ensayo de absorción de azul de tripano. Se usa NOD como control positivo. Sul 112 ((6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)metanona), Sul 121 ((6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(piperazin-1-il)metanona) Sul 127 (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxilato de metilo), Sul 136 (ácido 2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético), Sul 89 (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), Sul 85 (ácido (R)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico), Sul 141 (ácido (S)-2-(4-(6-hidroxi-2.5.7.8- tetrametilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético), Sul 142 (ácido (R)-2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético). Sul 136 es una mezcla racémica. Sul 141 y Sul 142 son respectivamente el isómero S y R. Los compuestos se añadieron a células SMAC a diferentes concentraciones. El ensayo de absorción se realizó después de volver a calentar hasta 37 °C. 4 °C significa que las células se enfriaron en primer lugar hasta 4 °C. C37 °C y C4 °C son pruebas de células SMAC en las que las células se mantienen a 37 °C y en primer lugar se enfrían a 4 °C y luego se vuelven a calentar hasta 37 °C, respectivamente sin la presencia de compuestos.
Ejemplo 1: Conservación de células HEK
Material y método:
Se cultivaron células embrionarias de riñón humano (HEK) 293 en medio de cultivo celular DMEM (Life Technologies, 41965-052) complementado con suero de ternero fetal, penicilina y estreptomicina. Se sembraron células a una densidad de 0,8 - 1,2E6 ml-1 en matraces de poliestireno de 25 cm2, colocados en una incubadora humidificada regulada por CO2 a 37 °C y se dejaron proliferar durante 24 horas antes de comenzar los experimentos. Se sometieron a prueba compuestos SUL-090 (N,6-dihidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-091 (N-butil-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-092 (6-hidroxi-N-isopropil-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-093 ((E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-il)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida) , SUL-095 ((6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(morfolino)metanona), SUL-097 (N-(4-fluorobencil)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-098 (6-hidroxi-N-((S)-2-hidroxi-1-feniletil)-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-100 (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-N-(2-(metilamino)etil)cromano-2-carboxamida), SUL-101 (6-hidroxi-N,2,5,7,8-pentametil-N-(2-(metilamino)etil)cromano-2-carboxamida), SUL-102 (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-N-(3-(piperidin-1-il)propil)cromano-2-carboxamida), SUL-104 (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-N-(3-nitrofenil)cromano-2-carboxamida) , Su L-106 (N-(4-fluorofenil)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-107 (4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamido)benzoato de metilo), SUL-108 ((4-butilpiperazin-1-il)(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)metanona), SUL-109 ((6-hidroxi-2.5.7.8- tetrametilcromano-2-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)metanona), SUL-111 (N-((R)-2-amino-2-oxo-1-feniletil)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), Su L-112 ((6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)metanona), SUL-114 (N-(2-bromoetil)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-117 (2-((butilamino)metil)-2,5,7,8-tetrametilcromano-6-ol), SUL-118 (ácido 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxílico), SUL-120 (6-hidroxi-W-((R)-1-hidroxipropan-2-il)-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-121 ((6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(piperazin-1-il)metanona), SUL-122 ((6-hidroxi-2.5.7.8- tetrametilcromano-2-il)(4-(2-(2-hidroxietoxi)etil)piperazin-1-il)metanona), SUL-123 (N-(2-cianoetil)-6-hidroxi-2.5.7.8- tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-124 (6-hidroxi-N-(2-((2-hidroxietil)(metil)amino)etil)-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-125 ((R)-N,6-dihidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida), SUL-126 ((S)-N,6-dihidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxamida, SUL-128 (2-(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)metil)-2.5.7.8- tetrametilcromano-6-ol), SUL-129 (2-((((S)-2-hidroxi-1-feniletil)amino)metil)-2,5,7,8-tetrametilcromano-6-ol), SUL-130 (2,5,7,8-tetrametil-2-(piperidin-1-ilmetil)cromano-6-ol), Su L-131 (N,6-dihidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxamida), SUL-132 ((6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)metanona), SUL-134 (2-(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)metil)-2,5,7,8-tetrametilcromano-6-ol), SUL-135 (2-(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)metil)-2,5,7,8-tetrametilcromano-6-ol), SUL-136 (ácido 2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético), SUL-137 ((6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2il)(piperazin-1-il)metanona), SUL 138 ((6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)metanona), SUL-139 (ácido 2-(4-(6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético), SUL-140 (2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acetato de etilo), SUl-141 (ácido (S)-2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético), s Ul-142 (ácido (R)-2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético), SUL-143 (ácido (2S)-1-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)pirrolidin-2-carboxílico), SUL-144 (ácido (2S)-1-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)pirrolidin-2-carboxílico), SUL-145 (ácido (2S)-1-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)pirrolidin-2-carboxílico).
Se disolvieron los compuestos en dimeltilsulfóxido (DMSO) hasta varias concentraciones. Antes de comenzar los experimentos, se disolvió esta disolución madre en DMEM calentado previamente y se diluyó adicionalmente para obtener una concentración que oscila entre 10 nM - 1 mM. Se usó el protocolo de lesión por hipotermia/recalentamiento de la siguiente manera y se resumen en la figura 1. Luego se reemplazó el medio de cultivo celular por estas diluciones y se incubaron las células en presencia del compuesto durante 1 hora. Después de la incubación, se cerraron las tapas herméticamente y se colocaron los matraces en una sala a 4 °C y se enfriaron durante 24 horas. Después de este periodo de enfriamiento, se colocaron las células de nuevo en la incubadora a 37 °C con las tapas cerradas y se dejaron que se volvieron a calentar durante otras 24 horas.
Evaluación de la viabilidad
Después de este periodo de recalentamiento, se tomaron imágenes microscópicas para evaluar la morfología celular (Nikon D5100, Nikon Diaphot-TMD). Se recogió el medio de cultivo celular y se centrifugó (4 minutos, 2000 rpm). Se recogió el sobrenadante y se midió inmediatamente el pH para evitar el equilibrio del pH mediante el tampón carbonato en el medio, mientras que las células sedimentadas se resuspendieron en 5 ml de PBS. Se lavaron dos veces las células que quedaron en el matraz con solución salina tamponada con fosfato (PBS) mientras se desechaba el producto de lavado. Posteriormente, se tripsinizaron las células añadiendo 0,5 ml de tripsina y se combinaron con el sedimento resuspendido. Luego se tiñó esta suspensión celular a una concentración final de azul de tripano al 0,2 % (Sigma, T8154), seguido de una evaluación manual de la viabilidad y el número de células en un hemocitómetro Bürker-Türk. Para concluir el ensayo, se midieron los niveles de glucosa en el medio de cultivo celular (Roche Accutrend Plus) como indicación de la actividad metabólica. Todas estas etapas se realizaron con cuidado para evitar que la tensión mecánica influya o altere la viabilidad de las células después del enfriamiento. Resultados
La tabla 2 muestra los resultados de la cantidad de células que sobrevivieron al procedimiento de enfriamiento y calentamiento con la adición del compuesto tal como se describió anteriormente en una concentración diferente. La cantidad representa el % de células que sobrevivieron. El número del compuesto corresponde al compuesto tal como se describió en la tabla 1. En el control, se aplicó el mismo procedimiento a dos distintivos de células HEK. El medio no comprendía ningún compuesto según la invención. La cantidad de células que sobrevivieron depende de la concentración usada y el tipo de compuesto.
Tabla 2
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Los compuestos Sul-94, Sul-95, Sul-108, Sul-109, Sul-112, Sul-121, Sul-132, Sul-134, Sul-135, Sul-137 y Sul-138 son según la invención, los otros compuestos sirven como referencia.
Ejemplo 2: Conservación de células SMAC
Se cultivaron células de músculo liso aórtico de rata (células SMAC) en medio de cultivo celular DMEM (Life Technologies, 41965-052) complementado con suero de ternero fetal, penicilina y estreptomicina. Se colocaron las células en una incubadora humidificada regulada por CO2 a 37 °C y se dejaron proliferar durante 24 horas antes de comenzar los experimentos. Se disolvieron los compuestos según la invención (Sul 112 y Sul 121) y otros compuestos como referencia (Sul 84, Sul 85, Sul 89, Sul 127, Sul 136) en DMSO hasta una concentración final de 100 mM. Luego se disolvió esta disolución en medio de cultivo celular DMEM y se añadió a las células en diferentes concentraciones, se preincubó durante 1 hora a 37 °C, se enfrió hasta 4 °C y se mantuvo a 4 °C durante 24 h. Se volvieron a calentar las células durante 1 h hasta 37 °C y se sometieron a prueba. Se realizó una prueba con azul de tripano, tal como se describió anteriormente para las células HEK. Además de este ensayo de exclusión con azul de tripano, se realizó un ensayo de absorción. El grado de absorción del azul de tripano se usó como indicación del número de células no viables. Se añadió azul de tripano a una placa de 6 pocillos hasta una concentración final del 0,05 % y se incubaron las células a 37 °C durante 5 minutos. Posteriormente, se eliminó el exceso de tinte lavando cuidadosamente los pocillos tres veces con PBS frío. Después del lavado, se añadieron 150 pl de SDS al 1 % a los pocillos para lisar las células y liberar el azul de tripano de cualquier célula no viable. Se centrifugaron los lisados celulares y posteriormente se transfirió el sobrenadante a una placa de 96 pocillos. Se usó SDS al 1 % como blanco y se midió la absorción a 595 nm. La muerte celular se expresó como porcentaje de los controles a 4°C no tratados (100 %).
La figura 2 muestra los resultados de un ensayo de absorción con azul de tripano para evaluar la cantidad de células que sobrevivieron al procedimiento de hipotermia y recalentamiento. La viabilidad de las células SMAC era de hasta el 90 %.
Sul 136 es una mezcla racémica. Sul 141 y Sul 142 son el isómero R y S, respectivamente. El enantiómero S tiene un mejor efecto que el enantiómero R o la mezcla racémica, incluso a menor concentración.
Ejemplo 3: Conservación de plaquetas sanguíneas
Recogida a través de PRP
Se recogieron las plaquetas mediante PRP y se suspendieron 2,1 ml en tubos de polipropileno de 5 ml, y se cerraron con un tapón.
Se añadieron los compuestos según la invención y los compuestos de referencia a las plaquetas sanguíneas directamente después de preparar el plasma PRP y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C o 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se almacenaron las plaquetas sanguíneas con el compuesto a 4 °C.
Se almacenó un control en condiciones de agitación a temperatura ambiente. Se almacenó otro control a 4 °C sin la adición de un compuesto. Los compuestos que se añadieron son los enumerados en la tabla 3.
Se tomó una muestra de cada tubo después de 264 horas después de la adición del compuesto y se sometieron a prueba de la siguiente manera:
• Se analizaron visualmente el color y las propiedades de coagulación.
• Se contaron los trombocitos que sobrevivieron y se evaluaron si se agregaron los trombocitos.
• Se evaluó si los trombocitos todavía podían funcionar después de la estimulación por la adición de ADP o bajo la influencia de colágeno en una place de 96 pocillos.
• Se evaluó la adhesión, lo que significa la capacidad de las plaquetas para unirse al colágeno en una placa de 6 pocillos preincubada con colágeno.
• A través de un ensayo de ELISA, se evaluó si se secretó tromboxano a partir de las plaquetas. El tromboxano facilita la agregación y se produce por las plaquetas sanguíneas activadas.
La tabla 3 proporciona una visión general de los resultados de la adición de los compuestos a las plaquetas sanguíneas y evalúa la agregación de los trombocitos después de la adición del compuesto y el enfriamiento hasta 4 °C.
Tabla 3
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Los compuestos Sul-121, Sul-132 y Sul-138 son según la invención, los otros compuestos sirven como referencia. Recogida a través del método de aféresis y PRP
Se obtuvieron las plaquetas mediante procedimientos de trombocitaféresis convencionales, ya sea en Haemonetics (donante 2611811 y donante 2611855) o en instrumentos Cobe (donante 2611770). Según el protocolo todas las unidades se obtendrían mediante procedimiento de trombocitaféresis con el instrumento Cobe, pero de las tres donaciones dos no pasaban los criterios de control de calidad del banco de sangre. Sin embargo, todas las donaciones de plaquetas tienen una concentración similar y una calidad de plaquetas similar. En ninguno de los concentrados de plaquetas se hallaron coágulos.
Se pesan las plaquetas recién recogidas en una balanza y para tomar muestras del concentrado de plaquetas se selló una pequeña bolsa de PVC a la bolsa principal de concentrado de plaquetas. La homogeneización convencional del concentrado de plaquetas debe realizarse con un rodillo antes del muestreo.
Se añade una suspensión 300 pM de Sul 136 con un procedimiento que mantiene estéril el contenido de la bolsa y el Sul 136 se mantiene en suspensión mediante agitación frecuente y se almacena a 37 °C antes de añadirlo a las plaquetas recién recogidas. Se añade la suspensión de Sul 136 a tres bolsas de plaquetas directamente desde la bolsa. Después de la adición, se mezcla suavemente el contenido de la bolsa de plaquetas. Después de 2 horas, se extrae la primera muestra con una bolsa de muestras sellada. La bolsa de muestras se desconecta mediante soldadura y de esta bolsa de muestras se toman las muestras para análisis hematológicos, pruebas con agregómetro y pruebas de citometría de flujo. Los remolinos en la bolsa son informados por la experiencia del trabajador de laboratorio en el formato convencional. Como control se usaron plaquetas sin Sul 136 colocadas en un agitador de plataforma y se almacenaron a temperatura ambiente. Otro control se almacena a 4 °C. Las muestras de plaquetas a las que se añade Sul 136 se almacenan sin agitación en un frigorífico a 4 °C.
Se toman muestras después de 2, 24, 48, 96, 168, 216, 264 horas y se almacenan durante 7 semanas.
Las muestras se miden de la siguiente manera:
Prueba con anexina V:
En un citómetro de flujo FC 500 de Beckman Coulter usando el kit de tinción de anexina V FLUOS de Roche Procedimiento:
Se realizó una mezcla de 20 pl de anexina V y fluoresceína del kit de Roche kit en 1 ml de tampón de incubación y se añadieron 20 pl de yoduro de propidio. Se centrifugaron 2 ml de concentrado de plaquetas en una centrífuga Eppendorf convencional y se descartó el sobrenadante.
Se añadió 1 ml de tampón PBS y se comprobó la concentración celular para ver estaba alrededor de 1.000.000. Esto se diluyó 100 veces con la mezcla de anexina V/fluoresceína y yoduro de propidio preparada y se incubó durante 15 minutos. Se añadieron 500 pl del tampón de incubación del kit y se realizó el análisis celular en un citómetro de flujo.
Activación de plaquetas con ADP y TRAP
Se realizó la activación de plaquetas en un citómetro de flujo FC 500 de Beckman Coulter usando anticuerpos CD 41 PE, CD 62p FITC, IgG1 FITC/IgG1 PE de un kit de Beckman Coulter.
Tubo de ensayo 1:
Se llevaron 40 pl de tampón de dilución en aproximadamente 15 minutos hasta 37 °C; se añadieron 10 pl de IgG FITC/IgG PE 10 pl de CD41 PE y se mezclaron con vórtex, se incubaron 5 min a temperatura ambiente; se añadieron 1000 pl de tampón HBSS frío; se realizó la medición en el citómetro de flujo.
Tubo de ensayo 2:
Se llevaron 40 pl de tampón de dilución en aproximadamente 15 minutos hasta 37 °C.; se añadieron 10 pl de CD41 PE 5 pl de CD62 FITC y se mezclaron con vórtex, se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente; se añadieron 1000 pl de tampón HBSS frío; se realizó la medición en el citómetro de flujo.
Tubo de ensayo 3:
Se llevaron 36 pl de tampón de dilución 4 pl de ADP en aproximadamente 15 minutos hasta 37 °C; se añadieron 10 pl de CD41 PE 5 pl de CD62 FITC y se mezclaron con vórtex, se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente; se añadieron 1000 pl de tampón HBSS frío; se realizó la medición en el citómetro de flujo.
Tubo de ensayo 4:
Se llevaron 36 pl de tampón de dilución 4 pl de TRAP en aproximadamente 15 minutos hasta 37 °C; se añadieron 10 pl de CD41 PE 5 pl de CD62 FITC y se mezclaron con vórtex; se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente; se añadieron 1000 pl de tampón HBSS frío; se realizó la medición en el citómetro de flujo.
Se midió la agregación de las plaquetas según el perfilador de agregación de plaquetas PAP 8 (Molab) usando todos los reactivos de Molab.
Preparación de muestras:
Se centrifugaron 3 ml de concentrado de plaquetas a 3000 RPM para obtener PPP. Se mezclaron 1800 pl de PPP y 600 pl de PRP.
Prueba:
Se llevaron 225 pl de PRP a un tubo de ensayo con un agitador magnético. Se llevaron 225 pl de PPP 25 pl de agua destilada a un tubo de ensayo sin agitador magnético. Se usó PPP como base. Se puso PRP durante 2 min a 37 °C en un rodillo. Se comenzó la medición con PRP en un agregómetro después de 30 segundos con 25 pl de inductor. Se realizó la medición durante 6 min.
Se realizó la determinación visual de remolinos según Bertolini, F. y Murphy, S. (1994) (A multicenter evaluation of reproducibility of swirling in platelet concentrates., Transfusion 34, 796-801).
Resultados de pruebas de con plaquetas recogidas de PRP
Se sometieron a prueba plaquetas de PRP con la adición de Sul 136. La tabla 4 muestra los resultados del número de células que sobrevivieron 24, 48, 72 y 216 horas después del almacenamiento a 4 °C. El número de células se proporciona en % en relación con el número de células en el tiempo 0. El 66 % de las plaquetas almacenadas a temperatura ambiente sobrevivieron después de 216 horas. Sólo el 42,3 % de las células almacenadas a 4 °C sobrevivieron después de 216 horas. La adición de Sul 136 dio como resultado que sustancialmente sobrevivieron más plaquetas después del almacenamiento de 72 y 216 horas a 4 °C.
Tabla 4
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La tabla 5 muestra la posibilidad de agregación de las plaquetas recogidas con PRP y donde se añadió Sul 136, después de la estimulación con ADP. Cuando se añadió Sul 136 10 mM, las plaquetas todavía mostraban actividad después de la estimulación con ADP. (+ significa que las células muestran agregación y, por tanto, pueden activarse tras la estimulación, - significa sin agregación tras la estimulación)
Tabla 5
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La tabla 6 muestra la posibilidad de agregación de las plaquetas de PRP con Sul 136 después de la estimulación con colágeno. Cuando se añadió Sul 136 10 mM, las plaquetas mostraban todavía actividad después de la estimulación con colágeno. (+ significa que las células muestran agregación, + significa agregación fuerte, estas plaquetas pueden activarse así tras la estimulación, - significa sin agregación tras la estimulación)
Tabla 6
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Resultados con plaquetas recogidas a través de aféresis
La tabla 7 muestra los resultados de la prueba de las plaquetas sanguíneas de aféresis almacenadas del donante 1 (2611770) almacenadas a temperatura ambiente en un agitador de plataforma sin Sul 136. El pH en el día 12 era 6,3. El pH en el día 19 era 5,7
La tabla 8 muestra los resultados de las pruebas de las plaquetas sanguíneas de aféresis almacenadas del donante 1, almacenadas a 4 °C con la adición de Sul 136. El pH en el día 12 era 6,2, el pH en el día 19 era 5,9.
Tabla 7
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Tabla 8
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Las pruebas de citometría de flujo eran similares para las plaquetas almacenadas a temperatura ambiente y las plaquetas almacenadas a 4 °C con compuesto Sul 136. Además, la agregación de plaquetas tras la estimulación con colágeno y ADP se restableció el día 12 y el día 19 para las plaquetas almacenadas con compuesto Sul 136. Este resultado es comparable con las plaquetas almacenadas a temperatura ambiente en el día 1 - 3.
Las tablas 9 y 10 muestran los resultados de la prueba realizada con plaquetas del donante 2. Las plaquetas de la tabla 9 se almacenaron a 4 °C sin Sul 136. Las plaquetas de la tabla 10 se almacenaron a 4 °C con Sul 136.
Tabla 9
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Tabla 10
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Las tablas 11 y 12 muestran los resultados de la prueba realizad con plaquetas del donante 3. Las plaquetas de la tabla 9 se almacenaron a temperatura ambiente sin Sul 136. Las plaquetas de la tabla 10 se almacenaron a 4 °C con Sul 136.
Tabla 11
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Tabla 12
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Prueba de remolinos
Todavía después de 7 semanas se observan remolinos en las plaquetas almacenadas con los compuestos a 4 °C No se observan remolinos en las plaquetas sin compuestos añadidos almacenadas a 4 °C, medidos después de 24 horas.
Ejemplo 4: Síntesis de los compuestos
Los compuestos según la invención y los compuestos de referencia se sintetizan según los métodos de síntesis convencionales que son bien conocidos por un experto en la técnica. SUL-0083, SUL-0084 y SUL-0085 están disponibles comercialmente.
Síntesis de SUL 089-112, 114-117, 120-126, 128-130, 132, 134-135, 138 y 140.
Se logró la amidación de trolox mediante la reacción con la amina adecuada en presencia de reactivos de acoplamiento convencionales para la formación de amidas, por ejemplo, HATU y CDI. Se prepararon las aminas correspondientes mediante reducción de las amidas formadas con BH3.
Se prepararon derivados de ácido hidroxámico mediante reacción con hidroxilamina/CDI. La síntesis de carbohidrazida análogos de trolox se logró mediante reacción con hidrazinas (sustituidas). Se prepararon compuestos enantioméricos/diastereoméricos partiendo de (R)- o (S)-Trolox enantioméricamente puro o por medio de cromatografía quiral.
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Síntesis de SUL-118, SUL-119 en SUL-146
La oxidación de propofol disponible comercialmente con salcomina, un complejo de coordinación del ligando de salida con cobalto, seguido de reducción con NaBH4 proporcionó 2,6-diisopropilbenceno-1,4-diol. La metilación posterior con HCO/SnCh/HCl y la reacción con metacrilato de metilo suministró SUL-146 (6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxilato de metilo). La hidrólisis con LiOH proporcionó el ácido carboxílico SUL-118 (ácido 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxílico). El alcohol SUL-119 (2-(hidroximetil)-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-6-ol) se obtuvo mediante la reducción de SUL-146 con LiAlH4.
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Propofol
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Síntesis de SUL-131, SUL-133, SUL 137 en SUL-146
Partiendo del ácido carboxílico SUL-118 (ácido 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxílico), se obtuvo la hidroxilamina mediante reacción con hidroxilamina usando CDI como reactivo de acoplamiento. Se prepararon los compuestos SUL 133 ((6-hidroxi-5, 7-diisopropil-2, 8-dimetilcromano-2-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)metanona) y SUL 137 ((6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-il)(piperazin-1-il)metanona) mediante reacción de SUL-118 con el derivado de piperazina adecuado. Ambos reactivos de acoplamiento HATU y CDI dieron como resultado rendimientos satisfactorios. SUL 139 (ácido 2-(4-(6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético) se preparó mediante una aminación reductora de SUL 137 ((6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-il)(piperazin-1-il)metanona) con ácido glioxálico.
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La hidrólisis de SUL-140 (2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acetato de etilo) bajo atmósfera de N2 suministró SUL-136 (ácido 2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético) con alto rendimiento. Los enantiómeros Su L-141 y SUL-142 se prepararon según las condiciones descritas anteriormente.
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Síntesis de SUL 143, 144 en 145
La amidación de trolox con (S)-pirrolidin-2-carboxilato de metilo (éster metílico de L-prolina) proporcionó, después de la cromatografía en columna, dos diastereoisómeros. La hidrólisis posterior de los diastereoisómeros individuales proporcionó SUL-144 (ácido (2S)-1-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)pirrolidin-2-carboxílico, diastereómero 1) y SUL-145 (ácido (2S)-1-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)pirrolidin-2-carboxílico, diastereómero 2). El análogo racémico SUL-143 (ácido (2S)-1-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)pirrolidin-2-carboxílico) se obtuvo mezclando los ésteres de los diastereoisómeros individuales seguido de hidrólisis del resto éster usando LiOH.
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Amidación de trolox (ejemplo general)
SUL-108 ((4-butilpiperazin-1-il)(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)metanona). HCl. Se suspendió trolox (11 g, 0,044 mol, 1 eq.) en acetonitrilo (100-150 ml). Se añadió CDI (8,6 g, 0,053 mol, 1,2 eq.) en porciones. Se agitó la mezcla de reacción durante 0,5-1 horas a temperatura ambiente. Después de la adición de 1-butilpiperazina (6,9 g, 0,048 mol, 1,1 eq.) se agitó la mezcla de reacción a 25-30 °C a lo largo de un fin de semana. Se concentró la mezcla de reacción, se añadió H2O (200 ml) y se extrajo la fase acuosa con EtOAc (4X). Se secaron las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron. Se purificó el producto en bruto obtenido mediante cromatografía en columna (DCM/10 % de MeOH) logrando el compuesto objetivo (9 g de producto, 82 % puro). La cristalización de EtOAc/heptanos proporcionó SUL-108 (6 g, 0,016 mol, rendimiento del 36 %, 90 % puro) como un sólido blanco. Se disolvió el material obtenido en DCM (50-100 ml). Se añadió HCl (4 M en dioxano, 8,8 ml, 0,0035 mol, 2,2 eq.) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente a lo largo de un fin de semana. Se filtró la mezcla, se aclaró con DCM, y se secó para proporcionar la sal de HCl de SUL-108 (6,3 g, 97-98 % puro) como un sólido blanco.
1H-RMN (CDCb , en ppm): 0,93 (t, 3H), 1,38 (m, 2H), 1,58 (s, 3H), 1,67 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,50-3,20 (m, 14H). M+ = 375,3
Reducción de amidas de trolox (ejemplo general)
SUL-128. (2-(((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)metil)-2,5,7,8-tetrametilcromano-6-ol). HCl. Se enfrió BH3.THF en THF (16 ml, 0,0156 mol, 2 eq.) hasta T = 0 °C. Se añadió gota a gota una disolución de SUL-112 ((6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il)metanona; 2,6 g, 0,0078 mol, 1 eq.) en THF (50 ml) y se sometió a reflujo la mezcla de reacción durante 1 hora y se enfrió hasta temperatura ambiente durante la noche. Se enfrió la mezcla de reacción en un baño de hielo y se añadió gota a gota HCl (6 M, 25 ml). Se añadió DCM (100 ml) y se separaron las fases. Se extrajo la fase acuosa con DCM (3X). Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre K2CO3 hasta que dejó de notarse la formación de gas. Se filtró la fase orgánica y se concentró. Se enfrió el producto en bruto en un baño de hielo, y se añadió gota a gota NaOH (6 M, 50 ml). Después de la adición se agitó la mezcla de reacción durante 1 hora y se extrajo con DCM (4X). Se secaron las fases de DCM combinadas, se filtraron y se concentraron para dar 1,6 g de producto en bruto (20-40 % puro). Se purificó el material mediante cromatografía en columna proporcionando SUL-128 (300 mg, 0,94 mmol, rendimiento del 12 %, 90 % puro). Esto se disolvió en DCM (10 ml) y se enfrió hasta T =0 °C (baño de hielo). Se añadió HCl (4 M en dioxano, 0,3 ml, 0,94 mmol, 1,2 eq.) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se filtró el sólido formado, se lavó con Et2O y se secó para proporcionar la sal de HCl de SUL-128 (300 mg, 90 % puro) como sólido blanco (mezcla de diastereómeros).
1H-RMN (CDCla, en ppm): 1,20-1,90 (m, 7H), 2,12 (s, 6H), 2,17 (s, 3H), 2,20-2,90 (m, 9H), 3,4-3,65 (m, 2H). M+ = 320,1
Síntesis de SUL-118 (ácido 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxílico).
Síntesis de 2,6-diisopropilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona.
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Se disolvió propofol (100 g, 561 mmol) en DMF (250 ml). Se enfrió la disolución hasta 0 °C mientras se agitaba. Se añadió salcomina (16,6 g, 51 mmol; 9 % en moles) y se agitó la mezcla de reacción resultante 112 h durante la noche mientras se calentaba hasta temperatura ambiente. Se vertió la mezcla de reacción en agua (7 l). Se extrajo la suspensión resultante con heptanos (5 x 1 l). Se secaron los extractos orgánicos combinados con Na2SÜ4. La concentración de la disolución a vacío proporcionó la 2,6-diisopropilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona en bruto (62,5 g; 325 mmol; rendimiento del 58 %) como un aceite. El producto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis de 2,6-diisopropilbenceno-1,4-diol.
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Se disolvió 2,6-diisopropilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona (62,5 g, 325 mmol) en diclorometano (300 ml) y metanol (100 ml). Se enfrió la disolución hasta 0 °C con un baño de hielo. Se añadió borohidruro de sodio (4,5 g, 182 mmol) en porciones. Después de completarse la adición, se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió acetona (150 ml) para extinguir el exceso de borohidruro de sodio. Después de 30 minutos de agitación, se añadió HCl 2 N ac. (200 ml). Después de agitar durante 45 minutos, se extrajo la mezcla con acetato de etilo (4 x 400 ml). Se secaron las fases orgánicas combinadas con Na2SÜ4. La concentración de la disolución a vacío proporcionó 2,6-diisopropilbenceno-1,4-diol en bruto (64 g, 330 mmol) como un aceite rojo en un rendimiento cuantitativo. El producto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis de 3,5-diisopropil-2-metilbenceno-1,4-diol.
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Se calentó a reflujo una mezcla de 2,6-diisopropilbenceno-1,4-diol (64 g, 0,33 mol), paraformaldehído (9,8 g, 0,327 mol), SnCl2 (217,9 g, 1,15 mol), HCl al 37 % ac. concentrado (0,6 l) y diisopropil éter (2,5 l) durante 4 horas. Después de enfriar hasta temperatura ambiente durante la noche, se separó la mezcla bifásica. Se extrajo la fase acuosa con TBME (2000 ml). Se lavaron las fracciones orgánicas combinadas con HCl 1 N ac. (1000 ml), agua (1000 ml) y salmuera (1000 ml). Se secaron las fracciones orgánicas con Na2SÜ4 y se concentraron a vacío para dar una mezcla 50 : 35 de 3,5-diisopropil-2-metilbenceno-1,4-diol y 2,6-diisopropil-3,5-dimetilbenceno-1,4-diol (61 g de aceite) según el análisis de Cg Em . La purificación mediante cromatografía sobre gel de sílice (1200 ml) eluyendo con acetato de etilo/heptanos = 97,5:2,5 (4000 ml), 95:5 (4000 ml) proporcionó 3,5-diisopropil-2-metilbenceno-1,4-diol 6 (16,6 g, 79,8 mmol; 24 %: 83 % puro) como un aceite.
Síntesis de 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxilato de metilo.
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Se disolvió 3,5-diisopropil-2-metilbenceno-1,4-diol (10,6 g, 50,9 mmol; 83 % puro) en metacrilato de metilo (20 ml, 186 mmol). Se transfirió la disolución a un tubo de Teflon en un reactor Berghof. Se añadió formaldehído acuoso (10 ml; disolución al 37 % en peso, estabilizada con MeÜH al 10-15 %) y se calentó la mezcla de reacción hasta 180 °C (temperatura interna) en el reactor cerrado durante 5 horas mientras se agitaba. Después de enfriar hasta aprox. 40 °C se vertió la mezcla de reacción en MeÜH (200 ml) y se concentró la mezcla a vacío. La purificación mediante cromatografía sobre gel de sílice (600 ml) eluyendo con acetato de etilo/heptanos = 95:5 (5000 ml; CCF: Rf ~ 0,2; punto teñido con vapor de yodo) proporcionó el producto puro deseado 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxilato de metilo (10,0 g, 31,3 mmol, 61 %).
Síntesis de ácido 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxílico (SUL-118).
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Se calentó una mezcla de 6-hidroxi-5,7 d¡¡soprop¡l-2,8-d¡met¡lcromano-2-carbox¡lato de metilo purificado (8,3 g, 25,9 mmol) e hidróxido de litio monohidratado (4,3 g, 102,5 mmol; 4 eq.) en MeOH (100 ml), THF (100 ml) y agua (25 ml) durante 30 minutos a presión ambiental mientras se hacía rotar con un evaporador rotatorio en un baño de agua caliente a 60 °C. Se evaporaron los disolventes orgánicos a vacío. Se añadió agua (150 ml) al residuo, seguido de ácido acético (10 ml). Se obtuvo una mezcla naranja claro. La extracción con acetato de etilo (3 x 100 ml), el secado de las fracciones orgánicas combinadas con Na2SO4 y la concentración a vacío dio el producto en bruto como un sólido naranja. Se agitaron los sólidos con tBME (150 ml). Se obtuvo un precipitado sólido beis y una disolución naranja. Se añadió heptano (250 ml) y se agitó la mezcla durante 15 minutos. Se filtró la mezcla sobre un filtro de vidrio. Se lavaron los sólidos residuales con heptanos (2 x 50 ml) sobre el filtro bajo succión. El secado de los sólidos a vacío a 60 °C proporcionó ácido 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxílico puro (SUL-118) como un sólido blanquecino (3,1 g, 10,13 mmol; 39 %, 100 % puro). 1H-RMN (CDCb, en ppm): 1,38 (t, 12 H), 1,52 (s, 3H), 1,87 (m, 1H), 2,20 (s, 3H), 2,30 (m, 1H), 3,20 (m, 1H), 3,38 (m, 1H). M+ = 307,10
Ejemplo 5. Síntesis de SUL 119 (2-(hidroximetil)-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-6-ol). Se añadió una disolución de 6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carboxilato de metilo (500 mg, 1,56 mmol) en THF (12 ml) a lo largo de 5 minutos con una jeringa a través de una membrana de caucho a L¡AlH4 (238 mg, 6,26 mmol; 4 eq.), se pesó previamente en un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 100 ml seco bajo atmósfera de nitrógeno inerte mientras se agitaba a temperatura ambiente. La adición exotérmica del éster se acompañó con evolución de gas. Después de completarse la adición, se calentó a reflujo la suspensión gris resultante. Después de 3 horas se detuvo el calentamiento y se extinguió la reacción mediante adición gota a gota de EtOAc (6 ml; exotérmica). Se añadió agua (5 ml) en porciones pequeñas, seguido de HCl 2 N (2 ml) seguido de EtOAc (25 ml). Se vertió la mezcla en Na2SO4 (aprox. 50 g) y se separó la fase orgánica amarilla claro de la mezcla de dos fases. Se lavó la fase acuosa con EtOAc (50 ml) y se concentraron las fracciones orgánicas combinadas a vacío para proporcionar el alcohol en bruto (530 mg) como un aceite transparente. Se añadió heptano (100 ml) y después de la concentración a vacío se obtuvo el 2-(hidroximetil)-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-6-ol (248 mg, 0,85 mmol, 54 %, CLEM: 95,5 % puro).
M+ = 293,2
Ejemplo 6. Síntesis de SUL 139 (ácido 2-(4-(6-hidroxi-5,7-diisopropil-2,8-dimetilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético). Se disolvió SUL-137 (440 mg, 1,17 mmol, 1 eq.,) en MeOH (50 ml) y se añadió ácido glioxálico (216 mg, 2,35 mmol, 2 eq.). Se agitó la mezcla resultante durante 1 hora a temperatura ambiente y, posteriormente, se añadió NaBHaCN (183 mg, 2,94 mmol, 2,5 eq.). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió ácido acético (unos ml) y después de agitar a temperatura ambiente durante 0,5-1 horas, se concentró la mezcla de reacción. Se disolvió el residuo obtenido en EtOAc, se lavó con H2O (2X), se secó, se filtró y se concentró para proporcionar SUL-139 (500 mg, 1,16 mmol, 98 %, 91-92 % puro) como un sólido amarillo claro.
1H-RMN (CD3OD, en ppm): 1,33 (dd, 12H), 1,59 (s, 3H), 1,62 (m, 1H), 2,09 (s, 3H), 2-5-3,0 (m, 7H), 3,1-3,6 (m, 4H), 3,81 (sa, 2H), 4,28 (sa, 2H). M+ = 433,2.
Ejemplo 7. Síntesis de SUL 136 (ácido 2-(4-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)piperazin-1-il)acético). Se cargó un matraz de tres bocas de 250 ml equipado con dos membranas de goma (izquierda y derecha) y una llave de paso con SUL-136 (15,5 g, 38,4 mmol) y THF/agua (240 ml de THF 80 ml de agua). Se agitó la disolución transparente y se desgasificó durante al menos 30 minutos mediante burbujeo de argón, usando un tubo de entrado equipado con una aguja de jeringa larga a través de la membrana de goma izquierda; la membrana de goma derecha se equipó con una aguja corta y funcionaba como salida. Se enfrió la disolución desgasificada (que se mantuvo bajo argón) hasta 0 °C en un baño de hielo y se añadió LiOH anhidro sólido (2,3 g,96 mmol, 2,5 eq.) en una porción. Se agitó la mezcla de reacción resultante durante 2 horas a 0 °C después de lo cual se neutralizó mediante adición de una suspensión de MeOH/agua (3/1, v/v) de una resina de intercambio iónico Dowex-50WX8-200; el pH final era aprox. 6. Se separó por filtración la resina Dowex con succión y se aclaró con 3 porciones de MeOH/agua (3/1, v/v). Se redujo el filtrado a vacío y se le añadió al producto húmedo aproximadamente 100 ml agua. Se secó por congelación la suspensión acuosa blanca resultante durante la noche para proporcionar SUL-136 (13,48 g, 93 %. CLEM: 99,6 %) como un sólido blanco.
1H-RMN (CD3OD, en ppm)): 1,60 (s, 3H), 1,65 (m, 1H), 2,05 (s, 3H), 2,10 (s, 6H), 2,55 (m, 2H), 2,62 (m, 1H), 3,0, (sa, 4H), 3,40 (sa, 2H), 3,65 (sa, 2H), 4,25 (sa, 2H). M+ = 377,1
Ejemplo 8. Síntesis de SUL 144 (ácido (2S)-1-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)pirrolidin-2-carboxílico). Se disolvió (2S)-1-(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carbonil)pirrolidin-2-carboxilato de metilo (diastereómero 1, 3,5 g, 9,7 mmol) en THF/H2O (60/20 ml). Se burbujeó N2 a través de la disolución durante 1 h. Se enfrió la mezcla en un baño de hielo y se añadió L¡OH.H2O (1,01 g, 24,2 mmol, 2,5 eq.). Se agitó la mezcla de reacción bajo N2 a TA durante la noche. Se añadió Dowex-50WX8-200 (lavada 4x con MeOH/H2O 3:1) como una suspensión en MeOH/H2O (3:1) hasta pH=6. Se filtró la mezcla, se lavó con MeOH/H2O (3:1) y se concentró a vacío. Se añadió H2O desmineralizada (50 ml) al concentrado y se secó por congelación la disolución proporcionando SUL-144 (3,4 g, 9,7 mmol, cuant., 99,7 % puro) como una espuma blanquecina.
1H-RMN (CDCb): 1,60 (s, 3H), 1,65-2,30 (m, 14H), 2,60 (m, 2H), 2,81 (m, 1H), 3,49 (m, 1H), 4,01 (t, 1H), 4,50 (d, 1H). M+ = 348,1
Ejemplo 9: SUL 109 para tolerancia isquémica al frío de corazones porcinos
Este ejemplo estudia si SUL 109 como aditivo para los protocolos convencionales de trasplantes de corazón ayudará a prolongar la protección isquémica al frío máxima de corazones porcinos. Para una parada de larga duración, por ejemplo, en el caso de un trasplante, una disolución usada habitualmente es CUSTODIOL®. Con una disolución de CUSTODIOL® es posible mantener un corazón en un estado isquémico en frío durante hasta seis horas antes de la reperfusión con sangre oxigenada caliente si es necesario.
Material y métodos
Se extrajeron dos corazones de cerdos del matadero y se trataron de la siguiente manera. Se aturdió a los cerdos mediante una descarga eléctrica en la cabeza y se desangraron seccionando la vena cava superior. Después del desangrado, se abrió rápidamente el esternón y se retiraron el corazón y los pulmones como un todo. El corazón se sumergió inmediatamente en un baño frío con hielo y se cortó la aorta proximal a las ramas laterales bracocefálicas. Se insertó una cánula de 19 mm en la aorta y se ató. Se usó una cánula cuidadosamente desaireada para administrar de manera retrógrada una disolución cardioplégica fría. En el primer corazón, se administraron 2 litros de CUSTODIOL® convencional con 5000 UI/l de heparina añadida. Se le administraron al segundo corazón 2 litros de CUSTODIOL® con 5000 UI/l de heparina y 10 ml/l de SUL 109 en NaCl al 0,9 % a 75 uM. Se almacenaron ambos corazones en bolsas de plástico llenadas con las mismas disoluciones y transportadas al laboratorio en hielo a aproximadamente 4 °C. Antes de la preparación, se almacenaron los corazones a 4 °C durante 24 horas. El día siguiente se prepararon ambos corazones para montarlos en la plataforma PhysioHeart tal como se describió en DeHart et al 2011. Después de desairear los corazones, se comenzó la reperfusión retrógrada de la aorta con sangre oxigenada caliente a 38 °C. Tanto el flujo de sangre como la presión en la raíz aórtica se registraron durante el experimento.
Resultados y hallazgos
En primer lugar, se sometió a reperfusión con sangre el corazón no tratado con SUL109. Este corazón mostró una resistencia vascular alta en la reperfusión dando como resultado un flujo sanguíneo coronario total de 0,5 litros por minuto a una presión aórtica fijada de 80 mmHg. Apenas era visible ninguna actividad contráctil del miocardio después de 5 minutos, sólo un ligero movimiento del tejido que se parecía a la fibrilación. Después de algo de desfibrilación mediante descarga eléctrica y ayudando al corazón con un marcapaso, fue visible una vaga contracción de la parte lateral y anterior del ventrículo izquierdo.
El segundo corazón, que se trató con SUL109, también se sometió a reperfusión con sangre. Inmediatamente después del comienzo de la reperfusión, se produjo la primera diferencia notable con el corazón no tratado. El tejido muscular del corazón tratado inicialmente era duro y rígido como el corazón no tratado, pero en la reperfusión y el calentamiento, el corazón se volvió gradualmente menos duro y rígido y casi se sentía como un corazón normal en la reperfusión en un plazo de 6 horas. Esto dio como resultado una menor resistencia vascular, tal como se observa mediante un flujo coronario de 1 lpm a una presión de perfusión de 80 mmHg. El corazón tratado presentaba inmediatamente más actividad contráctil en comparación con el no tratado y después de algunas descargas de desfibrilación se observó un patrón contractivo débil sin ritmo.
Análisis
En el procedimiento de recogida normal de los experimentos en PhysioHeart, se pararon los corazones en una disolución cardioplégica fría y se transportaron a los laboratorios de LifeTec Group para una preparación e intervenciones quirúrgicas adicionales. Las preparaciones pueden durar hasta 4 horas después de lo cual se reactiva el corazón mediante reperfusión con sangre oxigenada caliente. Para aumentar el tiempo de preparación, o para permitir un tiempo de transporte más largo antes de la reperfusión, sería muy útil poder proteger los tejidos miocárdicos durante el tiempo isquémico en frío. Este ejemplo muestra una diferencia evidente observada entre el corazón tratado con SUL109 y el corazón no tratado, ya que el primero mostró una activad contractiva regular mejorada del tejido miocárdico. Por consiguiente, usando SUL 109 como aditivo para protocolos convencionales de trasplantes de corazón se prolonga la protección isquémica al frío.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Compuestos para su uso en el tratamiento o la profilaxis de la lesión por isquemia/reperfusión, o para trombosis arterial, fibrilación arterial, embolia pulmonar (PE), trombosis venosa profunda (Dv T) o tromboembolia venosa (VTE), insuficiencia cardiaca congestiva, ictus, infarto de miocardio, hipercoagulabilidad genética o adquirida, ateroesclerosis, arteriopatía coronaria, enfermedad cerebrovascular, accidente cerebrovascular, arteriopatía periférica oclusiva (PAOD), en los que el compuesto tiene la fórmula estructural de (I)
Figure imgf000024_0001
en la que,
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y es preferiblemente metilo, etilo, propilo o isopropilo;
R3 es
Figure imgf000024_0002
en la que * indica el punto de unión de R3 al resto de la molécula;
R11 y R12 forman junto al átomo de N al que están unidos un anillo saturado de 3-8 miembros, incorporando opcionalmente uno o más átomos adicionales, tal como uno, dos o tres átomos de N, O o S, opcionalmente sustituidos con un alquilo, alcohol alquílico;
en los que los compuestos de fórmula I que contienen un centro asimétrico están en forma racémica o enantiomérica.
2. Compuestos para su uso según la reivindicación 1, en los que el uso es en el tratamiento o la profilaxis de lesión por isquemia/reperfusión.
3. Compuestos para su uso según la reivindicación 1, en los que el uso es para prevenir la agregación de plaquetas en el tratamiento o la profilaxis de trombosis arterial, fibrilación arterial, embolia pulmonar (PE), trombosis venosa profunda (DVT) o tromboembolia venosa (VTE), insuficiencia cardiaca congestiva, ictus, infarto de miocardio, hipercoagulabilidad genética o adquirida, ateroesclerosis, arteriopatía coronaria, enfermedad cerebrovascular, accidente cerebrovascular, arteriopatía periférica oclusiva (PAOD).
4. Compuestos para su uso según la reivindicación 3, en los que el compuesto se elige de (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(piperazin-1-il)metanona, (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)metanona y (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)metanona.
5. Medio que comprende células y un compuesto, en el que el compuesto tiene la fórmula estructural de (I)
Figure imgf000024_0003
en la que,
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y es preferiblemente metilo, etilo, propilo o isopropilo;
R3 es
Figure imgf000025_0001
en la que * indica el punto de unión de R3 al resto de la molécula;
R11 y R12 forman junto al átomo de N al que están unidos un anillo saturado de 3-8 miembros, incorporando opcionalmente uno o más átomos adicionales, tal como uno, dos o tres átomos de N, O o S, opcionalmente sustituidos con un alquilo, alcohol alquílico;
en los que los compuestos de fórmula I que contienen un centro asimétrico están en forma racémica o enantiomérica, en los que las células son plaquetas sanguíneas, células cultivadas de mamífero o células primarias de mamífero.
6. Medio según la reivindicación 5, en el que las células son un tejido.
7. Método para la protección in vitro de células que comprende añadir un compuesto a una célula, en el que el compuesto tiene la fórmula estructural de (I)
Figure imgf000025_0002
en la que,
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y es preferiblemente metilo, etilo, propilo o isopropilo;
R3 es
Figure imgf000025_0003
en la que * indica el punto de unión de R3 al resto de la molécula;
R11 y R12 forman junto al átomo de N al que están unidos un anillo saturado de 3-8 miembros, incorporando opcionalmente uno o más átomos adicionales, tal como uno, dos o tres átomos de N, O o S, opcionalmente sustituidos con un alquilo, alcohol alquílico;
en los que los compuestos de fórmula I que contienen un centro asimétrico están en forma racémica o enantiomérica.
8. Método según la reivindicación 7, en el que la protección de células se produce durante el almacenamiento.
9. Método según la reivindicación 8, en el que el almacenamiento se produce a una temperatura por debajo de 37 °C, en particular a temperatura ambiente, a aproximadamente 4 °C, a aproximadamente -20 °C o a aproximadamente -80 °C.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la adición del compuesto se produce antes de enfriar las células.
11. Método según las reivindicaciones 7-10, en el que las células son células cultivadas de mamífero, células primarias de mamífero o plaquetas sanguíneas.
12. Método según las reivindicaciones 7-10, en el que las células son plaquetas sanguíneas y los compuestos son (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(piperazin-1-il)metanona, (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)metanona, (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)metanona.
13. Uso de un compuesto para aumentar la tolerancia isquémica al frío de órganos para trasplantes in vitro, en el que el compuesto tiene la fórmula estructural de (I)
Figure imgf000026_0001
en la que,
R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y es preferiblemente metilo, etilo, propilo o isopropilo;
R3 es
Figure imgf000026_0002
en la que * indica el punto de unión de R3 al resto de la molécula;
R11 y R12 forman junto al átomo de N al que están unidos un anillo saturado de 3-8 miembros, incorporando opcionalmente uno o más átomos adicionales, tal como uno, dos o tres átomos de N, O o S, opcionalmente sustituidos con un alquilo, alcohol alquílico;
en los que los compuestos de fórmula I que contienen un centro asimétrico están en forma racémica o enantiomérica.
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