ES2954134T3 - Formulaciones farmacéuticas de liposomas PEGilados y factores de coagulación de la sangre - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para administración subcutánea que comprende un factor sanguíneo y una partícula coloidal que comprende aproximadamente del 0,5 al 20 por ciento molar de un lípido anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, en la que el factor sanguíneo no está encapsulado en dicha partícula coloidal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones farmacéuticas de liposomas PEGilados y factores de coagulación de la sangre

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas de factores de la sangre para administración subcutánea.

Normalmente, los factores de la sangre se han preparado como composiciones farmacéuticas para administración intravenosa. Las composiciones se ha basado en la proteína activa, frecuentemente conjugada con un polímero, tal como polietilenglicol (PEG), para mejorar la semivida en circulación. Por lo tanto, la administración intravenosa de factores de la sangre PEGilados como agentes terapéuticos es bien entendida y ampliamente aceptada. Por tanto, se conocen formulaciones liposomales de factores de la sangre desnudos (es decir, sin conjugar y sin modificación), tales como las sustancias de factor VIII y factor IX, véase, por ejemplo, el documento de patente WO 95/04524.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden factor VIII y liposomas modificados por la presencia de polietilenglicol se describen en el documento de patente WO 99/55306, en el que el factor de la sangre no está encapsulado en el liposoma. Sin embargo, las formulaciones se preparan para administración intravenosa. Formulaciones adicionales de otras proteínas se describen en el documento de patente WO 2004/091723, donde las proteínas incluyen factores de secreción de factores coagulación de la sangre. Se dice que las proteínas se unen a los liposomas en un modo no covalente mediante la interacción con el polietilenglicol presente sobre la superficie de los liposomas. Sin embargo, las formulaciones de factores de coagulación de la sangre preparadas según los ejemplos de este documento también son para administración intravenosa.

Otros ejemplos de formulaciones de factores de la sangre, factor VIII y factor Vlla, presentes como un conjugado con PEG se muestran en los documentos de patente WO 2011/135307 y WO 2011/135308, respectivamente, donde las formulaciones reales preparadas fueron para administración intravenosa. El documento de patente WO 2013/156488 también describe una forma farmacéutica de agentes terapéuticos modificados, que incluye factores de la sangre, tales como factor VIII (FVIII) y factor VIIa (FVIIa), para administración subcutánea.

También se ha encontrado que el factor VIII es capaz de asociarse con liposomas PEGilados, es decir, el factor de la sangre no está encapsulado en el interior del liposoma (Baru et al., Thromb. Haemost., 93, páginas 1061-1068, (2005)). Sin embargo, las composiciones de FVIII solo se prepararon como formulaciones para administración intravenosa.

Estudios adicionales por Peng et al. en The AAPS Journal, 14(1), páginas 25-42 (2011), desvelan un enfoque alternativo basado en FVIII encapsulado en liposomas que son posteriormente PEGilados añadiendo pasivamente PEG a los liposomas después de la preparación. En un experimento en Peng la formulación liposomal se administra por vía subcutánea (SC) para investigar la inmunogenicidad, pero no hay indicación de un fin terapéutico para esta administración. En Peng también hay una referencia específica al artículo de Baru (2005) y una afirmación de que el enfoque de Baru . "expusieron FVIII a componentes plasmáticos, tales como proteasas e IgG". Los liposomas preparados según el método de Baru (2005) que contienen factor VIII recombinante se han administrado por vía intravenosa a sujetos (Spira et al. Blood, 108 (12), páginas 3668-3673 (2012)).

Las metodologías actuales para formular factores de la sangre para la administración se basan en modos de administración intravenosa. Esto es problemático, puesto que el paciente recibe inevitablemente una gran inyección en embolada del agente activo en varios momentos de tiempo que conducen a un nivel terapéutico desigual del agente en la sangre del paciente.

Por lo tanto, existe la necesidad de una composición farmacéutica de un factor de la sangre que pueda proporcionar una dosis segura y eficaz.

Según la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para administración subcutánea que comprende el factor de la sangre el factor VIII y una partícula coloidal que comprende aproximadamente 0,5 a 20 por ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, en donde el factor de la sangre no está encapsulado en dicha partícula coloidal. La composición se administra por vía subcutánea, llevándose a cabo la administración subcutánea repetida de la composición farmacéutica antes de que la concentración de la composición farmacéutica en la sangre se reduzca a niveles subterapéuticos.

Las partículas coloidales pueden ser sustancialmente neutras y el polímero puede no llevar sustancialmente carga neta. Las partículas coloidales pueden tener un diámetro de partículas medio de entre aproximadamente 0,03 y aproximadamente 0,4 micrómetros (μm), por ejemplo, tener un diámetro de partículas medio de aproximadamente 0,1 micrómetros (μm). Un diámetro de partículas medio en este intervalo puede aumentar el tiempo de circulación de las partículas y prevenir su adsorción por el sistema reticuloendotelial (RES).

El factor de la sangre se puede usar en una forma liofilizada cuando se prepara la composición farmacéutica.

Donde la composición comprenda un fragmento de un factor de la sangre, el factor puede ser adecuadamente un fragmento activo del mismo en el que el fragmento retiene la actividad biológica, o sustancialmente la misma actividad biológica que el factor de la sangre nativo. Por ejemplo, dicho fragmento activo es la secuencia del factor VIII truncado en el dominio B mostrada en la Figura 1.

Es además posible que la composición pueda comprender tanto el factor de la sangre nativo como un fragmento del mismo.

La composición farmacéutica de la invención también puede comprender además otro compuesto o molécula terapéuticamente activo, por ejemplo, un fármaco antiinflamatorio, analgésico o antibiótico, u otro agente farmacéuticamente activo que pueda promover o potenciar la actividad del factor VIIa,

factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor Xa, factor XI, factor V, factor XIII, factor de von Willebrand (vWF), protrombina o proteína C, o un fragmento de los mismos, tal como, por ejemplo, otro factor de coagulación de la sangre.

Los términos factor VIIa (FVlla) y factor VII (FVII) también se usan indistintamente, a menos que el contexto lo especifique de otro modo. FVIII se usa como una abreviatura de factor VIII, FIX se usa como una abreviatura de factor IX, y así para todos los factores de la sangre descritos en el presente documento, cambiando lo que haya que cambiar.

El factor de coagulación (coagulante) de la sangre puede ser de cualquier fuente adecuada y pueden ser una proteína recombinante producida por tecnología de ADN recombinante usando técnicas biológicas moleculares o sintetizada químicamente o producida transgénicamente en la leche de un mamífero, o el factor se puede aislar de fuentes naturales (por ejemplo, purificar de plasma sanguíneo). Adecuadamente, el factor es un de factor de coagulación de la sangre de mamífero, tal como un factor de coagulación de la sangre humano. Referencias a un factor coagulante de la sangre incluyen un factor de coagulación de la sangre.

Como se trata anteriormente, los factores de la sangre se caracterizan todos, entre otras cosas, por la propiedad de adherencia superficial. Esto es una característica necesaria de la cascada de coagulación que requiere que enzimas y cofactores se adhieran a otros participantes en la cascada, a la superficie de plaquetas y a tejido en el sitio de lesión. De hecho, es particularmente importante que un coágulo de sangre siga en el sitio de lesión y no se mueve causando una trombosis peligrosa. Esta propiedad plantea un reto en la formulación de medicamentos, puesto que los factores de la sangre, tales como VIIa, VIII y IX, se adherirán excesivamente a cualquier superficie de vidrio y de plástico. En términos prácticos, esto está mitigado por el amplio uso de polisorbato (por ejemplo, Tween® 80).

Las partículas coloidales de la invención normalmente están en forma de vesículas de lípidos o liposomas como se conoce bien en la técnica. Referencias a partículas coloidales en la presente memoria descriptiva incluyen liposomas y vesículas de lípidos, a menos que el contexto lo especifique de otro modo.

En las partículas coloidales, el lípido anfipático puede ser un fosfolípido de fuentes naturales o sintéticas. El lípido anfipático puede comprender aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 por ciento en moles (%) de las partículas, por ejemplo, aproximadamente alrededor de 1 a 20 %, o aproximadamente 1 a 6 %, o aproximadamente 3 %.

Ejemplos adecuados de dichos lípidos anfipáticos incluyen fosfatidiletanolamina (PE), un lipopolímero sin carga unido a carbamato o aminopropanodiol diestearoílo (DS), o mezclas de los mismos. Un ejemplo adecuado de fosfatidil etanolamina (PE) puede ser 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina (DSPE). El fin del polímero hidrófilo biocompatible es estabilizar estéricamente los SUV, previniendo así la fusión de las vesículas y permitiendo que las vesículas escapen de la adsorción por el RES

Las partículas coloidales pueden comprender además un segundo lípido anfipático obtenido de fuentes o naturales o sintéticas. El segundo lípido anfipático puede ser fosfatidilcolina (PC). Un ejemplo adecuado de fosfatidil colina (PC) puede ser palmitoil-oleoil fosfatidil colina (POPC).

En dicha realización, la composición farmacéutica se puede componer de partículas coloidales que comprenden palmitoiloleoil fosfatidil colina (POPC) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina (DSPE) en una relación (POPC:DSPE) de desde 85 hasta 99:15 hasta 1. En algunos casos, la relación de POPC:DSPE puede ser desde 90 hasta 99:10 hasta 1. En una realización, la relación de POPC:DSPE puede ser 97:3.

En una realización alternativa, la composición farmacéutica de la invención puede ser complementada con colesterol.

El polímero biocompatible puede tener un peso molecular de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5000 dáltones, por ejemplo aproximadamente 2000 dáltones.

El polímero hidrófilo biocompatible usado según la invención se puede seleccionar del grupo que consiste en polialquiléteres, ácidos polilácticos y ácidos poliglicólicos. El polímero hidrófilo biocompatible puede ser polietilenglicol (PEG). El polietilenglicol como se usa en las composiciones de la invención puede tener un peso molecular de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5000 dáltones, por ejemplo puede tener un peso molecular de aproximadamente 1000, 2000 o 3000 dáltones. En una realización, el peso molecular del PEG puede ser 2000 dáltones. El polietilenglicol puede estar ramificado o sin ramificar.

Un ejemplo de un lípido anfipático derivatizado adecuado puede ser 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina-N-[poli-(etilenglicol)]. Si el PEG tiene un peso molecular de 2000 dáltones, el lípido anfipático derivatizado se puede describir como 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina-N-[poli-(etilenglicol)-2000] (DSPE-PEG 2000).

La composición farmacéutica puede comprender cualquier excipiente, tampón y/o adyuvante adecuado. Los ejemplos de dicho excipiente, tampón y/o adyuvante incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS), fosfato de potasio, fosfato de sodio y/o citrato de sodio. Otros tampones biológicos pueden incluir PIPES, MOPS, etc.

Valores de pH adecuados para la composición farmacéutica incluyen cualquier valor de pH aceptable, en general, para la administración tal como, por ejemplo, pH 5,0 a pH 9,0, adecuadamente desde pH 6,8 hasta pH 7,2, o pH 7,0.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que las formulaciones de factores de la sangre en asociación con partículas coloidales (liposomas) derivatizadas con un polímero biocompatible pueden ser administradas satisfactoriamente por vía subcutánea y lograr una dosis terapéuticamente eficaz de factor de la sangre en un sujeto que padece hemofilia. Adecuadamente, el polímero biocompatible es polietilenglicol.

En los ejemplos de la presente invención, el PEG se incorpora en el liposoma durante la formación de vesículas, antes de la asociación con el factor de la sangre. Se cree que secuencias de aminoácidos específicas del factor de la sangre se pueden unir no covalentemente a funciones de carbamato de las moléculas de PEG en el exterior de los liposomas.

Aunque existe una referencia en Peng (2011) a la administración del FVIII liposomal a ratones por vía subcutánea (SC), es bastante evidente que esto solo se hizo para investigar la inmunogenicidad relativa y no se consideró una opción de tratamiento viable. Para subrayar esto, los autores establecen claramente arriba en la página 41 que "FVIII-PI/PEG se administró por vía intravenosa, la vía de administración clínica para FVIII". En otras palabras, Peng no desvelan ni incluso indican la administración subcutánea como una opción de tratamiento viable. Además, los autores en Peng (2011) también establecen en la página 40 que su enfoque es "distintivamente diferente" al de Baru (2005). Las publicaciones más recientes en el campo presentan, por lo tanto, alternativas mutuamente exclusivas y diferentes a la presente invención.

Como se trata anteriormente, el liposoma no encapsula el (los) factor(es) de la sangre, de manera que, si se desea, se pueden usar liposomas de tamaño más pequeño que tienen una mayor semivida puesto que no fueron retirados por el sistema reticuloendotelial (RES). La actividad de factores de la sangre formulados no se altera como se muestra en los ejemplos con la actividad completa encontrada e inmediatamente después de la inyección

Los factores de la sangre interactúan no covalentemente con las cadenas de polímero sobre la superficie externa de los liposomas, y no se lleva a cabo ninguna reacción química para activar las cadenas de polímero, a diferencia de la composición desvelada en el documento de patente EPA-0689428. La naturaleza de la interacción entre el factor de la sangre y el liposoma derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible puede ser por cualquier mecanismo no covalente, tal como interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno y atracciones de van der Waals (Arakawa, T. y Timasheff, S. N., Biochemistry 24: 6756-6762 (1985); Lee, J. C. y Lee, L. L. Y., J. Biol. Chem. 226: 625-631 (1981)). Un ejemplo de dicho polímero es polietilenglicol (PEG).

Se puede usar una variedad de reacciones de acoplamiento conocidas para preparar lípidos formadores de vesículas derivatizados con polímeros hidrófilos. Por ejemplo, un polímero (tal como PEG) puede ser derivatizado en un lípido, tal como fosfatidiletanolamina (PE), a través de un grupo cloruro cianúrico. Alternativamente, un PEG terminado se puede activar con un reactivo de acoplamiento de carbonildiimidazol, para formar un compuesto de imidazol activado. Se puede preparar un compuesto unido a carbamato haciendo reaccionar el hidroxilo terminal de MPEG (metoxiPEG) con cloroformiato de p-nitrofenilo para dar un carbonato de p-nitrofenilo. Este producto se hace reaccionar entonces con 1-amino-2,3-propanodiol para dar el carbamato intermedio. Los grupos hidroxilo del diol se acilan dando el producto final. Se puede usar una síntesis similar, usando glicerol en lugar de 1-amino-2, 3-propanodiol, para producir un producto unido a carbonato, como se describe en el documento de patente WO 01/05873. Se conocen bien otras reacciones y se describen, por ejemplo, en el documento de patente US 5.013.556.

Las partículas coloidales (liposomas) se pueden clasificar según diversos parámetros. Por ejemplo, cuando el tamaño y el número de laminillas (parámetros estructurales) se usan como parámetros, entonces se pueden describir tres tipos principales de liposomas: Vesículas multilaminares (MLV), vesículas unilaminares pequeñas (SUV) y vesículas unilaminares grandes (LW).

Las MLV son las especies que se forman espontáneamente tras la hidratación de fosfolípidos secados por encima de su temperatura de transición (Tm) de gel a fase líquida/cristalina. El tamaño de las MLV es heterogéneo y su estructura se parece a la piel de una cebolla de capas acuosas y de lípidos alternas concéntricas.

Las SUV se forman a partir de MLV por sonicación u otros métodos, tales como extrusión, homogeneización a alta presión o mezcla a alto cizallamiento y son de una sola capa. Son las especies más pequeñas con una alta relación entre superficie y volumen y, por lo tanto, tienen el volumen de captura más bajo de espacio acuoso con respecto a peso de lípido.

El tercer tipo de liposoma LUV tiene un gran compartimento acuoso y una única capa lípidica (unilaminar) o solo algunas (oligolaminares). Más detalles se desvelan en D. Lichtenberg y Y. Barenholz, en "Liposomes: Preparation, Characterization, and Preservation, in Methods of Biochemical Analysis", Vol. 33, pp. 337 - 462 (1988).

Como se usa en el presente documento, el término "carga" significa cualquier tipo de interacción de las sustancias biopoliméricas a cargar, por ejemplo, una interacción tal como encapsulación, adherencia (a la pared interna o externa de la vesícula) o incorporación en la pared con o sin extrusión de las sustancias biopoliméricas.

Como se usa en el presente documento y se indica anteriormente, el término "liposoma" se refiere a partículas coloidales y pretende incluir todas las esferas o vesículas de cualquier compuesto anfipático que pueda vesicular espontáneamente o no espontáneamente, por ejemplo fosfolípidos donde al menos un grupo acilo se sustituye por un éster de ácido fosfórico complejo. Los liposomas pueden estar presentes en cualquier estado físico desde el estado vítreo hasta el cristal líquido. La mayoría de los triacilglicéridos son adecuados y los fosfolípidos más comunes adecuados para su uso en la presente invención son las lecitinas (también denominadas fosfatidilcolinas (PC)), que son mezclas de los diglicéridos de ácidos esteárico, palmítico y oleico unidos al éster de colina de ácido fosfórico. Las lecitinas se encuentran en todos los animales y plantas, tales como huevos, sojas y tejidos animales (cerebro, corazón y similares) y también se pueden producir sintéticamente. La fuente del fosfolípido o su método de síntesis no son críticos, se puede usar cualquiera fosfatida que exista de forma natural o sintética.

Ejemplos de fosfatidas específicas son L-a-(diestearoil)lecitina, L-a-(dipalmitoil)lecitina, ácido de L-a-fosfatida, ácido L-a-(dilauroil)-fosfatídico, ácido L-a(dimiristoil)fosfatídico, ácido L-a(dioleoil)fosfatídico, ácido DL-a(di-palmitoil)fosfatídico, ácido L-a(diestearoil)fosfatídico, y los diversos tipos de L-a-fosfatidilcolinas preparadas a partir de cerebro, hígado, yema de huevo, corazón, soja y similares, o sintéticamente, y sales de los mismos. Otras modificaciones adecuadas incluyen la peroxidación controlada de conectores cruzados de residuo de acilo graso en las fosfatidilcolinas (PC) y los anfipatatos de ion bipolar que forman micelas por sí mismos o cuando se mezclan con las PC, tales como análogos de alquilo de PC.

Los fosfolípidos pueden variar en pureza y también se pueden hidrogenar ya sea completa o parcialmente. La hidrogenación reduce el nivel de peroxidación no deseada, y modifica y controla la temperatura de transición (Tm) de gel a fase líquida/cristalina que afecta la estanqueidad y las fugas.

Los liposomas pueden ser "adaptados" a los requisitos de cualquier envase específico, que incluye diversos líquidos biológicos, mantiene su estabilidad sin agregación o separación cromatográfica, y siguen bien dispersos y suspensos en el líquido inyectado. La fluidez cambia debido a la composición, temperatura, salinidad, iones bivalentes y presencia de proteínas. El liposoma se puede usar con o sin cualquier otro disolvente o tensioactivo.

Los lípidos generalmente adecuados pueden tener una composición de cadena de acilo que es característica, al menos con respecto a la temperatura de transición (Tm) de los componentes de la cadena de acilo en PC de huevo o soja, es decir, una cadena saturada y una insaturada o siendo ambas insaturadas. Sin embargo, no se excluye la posibilidad de uso de dos cadenas saturadas.

Los liposomas pueden contener otros componentes de lípido, en tanto que estos no induzcan inestabilidad y/o agregación y/o separación cromatográfica. Esto se puede determinar por experimentación rutinaria.

El polímero hidrófilo biocompatible puede estar físicamente unido a la superficie del liposoma, o insertado en la membrana del liposoma. Por lo tanto, el polímero se puede unir covalentemente al liposoma.

Se conocen una variedad de métodos para producir los liposomas modificados, que son unilaminares o multilaminares, y están disponibles (véase Lichtenberg y Barenholz, (1988)):

1. Una película delgada del fosfolípido se hidrata con un medio acuoso seguido por agitación mecánica y/o irradiación ultrasónica y/o extrusión a través de un filtro adecuado;

2. Disolución del fosfolípido en un disolvente orgánico adecuado, mezcla con un medio acuoso seguido por retirada del disolvente;

3. Uso de gas por encima de su punto crítico (es decir, freones y otros gases, tales como CO² o mezclas de CO² y otros hidrocarburos gaseosos) o

4. Preparación de micelas con mezcla de lípido-detergente, luego reducción de la concentración de los detergentes hasta un nivel inferior a la concentración crítica a la que se forman los liposomas.

En general, dichos métodos producen liposomas con tamaños heterogéneos desde aproximadamente 0,02 hasta 10 μm o mayores. Puesto que se prefieren liposomas que son relativamente pequeños y de tamaño bien definido para su uso en la presente invención, se puede usar una segunda etapa de procesamiento definida como "reducción de tamaño de los liposomas" para reducir el tamaño y la heterogeneidad del tamaño de las suspensiones de liposomas.

La suspensión de liposomas puede ser dimensionada para lograr una distribución de tamaño selectiva de vesículas en un intervalo de tamaño inferior a aproximadamente 5 |jm, por ejemplo < 0,4 |jm. En una realización de la invención, las partículas coloidales tienen un diámetro del tamaño de partículas promedio de desde aproximadamente 0,03 hasta 0,4 micrómetros (jm ), adecuadamente alrededor 0,1 micrómetros (jm ).

Los liposomas en este intervalo se pueden esterilizar fácilmente por filtración a través de un filtro adecuado. Vesículas más pequeñas también muestran menos tendencia a agregarse tras el almacenamiento, reduciéndose así el bloqueo potencialmente grave o los problemas de obstrucción cuando el liposoma se inyecta por vía intravenosa o por vía subcutánea. Finalmente, los liposomas que se han reducido al intervalo de submicrómetros muestran una distribución más uniforme.

Están disponibles varias técnicas para reducir los tamaños y la heterogeneidad de los tamaños de liposomas, de un modo adecuado para la presente invención. La irradiación ultrasónica de una suspensión de liposomas ya sea por baño estándar o sonicación por sonda produce una reducción de tamaño progresiva hasta vesículas unilaminares pequeñas (SUV) de entre 0,02 y 0,08 jm de tamaño.

La homogenización es otro método que se basa en la energía de cizallamiento para fragmentar grandes liposomas en otros más pequeños. En un procedimiento de homogenización típico, la suspensión de liposomas se recircula a través de un homogeneizador de emulsiones estándar hasta que se observan tamaños de liposoma seleccionados, normalmente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 jm . En ambos métodos, la distribución del tamaño de partículas se puede monitorizar por determinación convencional del tamaño de partículas por haz de láser.

La extrusión de liposomas a través de un filtro de policarbonato de poro pequeño o membrana equivalente también es un método eficaz de reducción de los tamaños de liposomas hasta una distribución de tamaños relativamente bien definida cuyo promedio está en el intervalo entre aproximadamente 0,02 y 5 jm , dependiendo del tamaño de poro de la membrana.

Normalmente, la suspensión se hace circular varias veces a través de una o dos membranas apiladas hasta que se logra la distribución de tamaños de liposomas deseada. El liposoma se puede extruir a través de membranas de poro sucesivamente más pequeñas para lograr una reducción gradual en el tamaño de liposomas.

La centrifugación y la cromatografía en tamiz molecular son otros métodos que están disponibles para producir una suspensión de liposomas con tamaños de partículas por debajo de un umbral seleccionado inferior a 1 jm . Estos dos métodos respectivos implican la retirada preferencial de grandes liposomas, en vez de la conversión de grandes partículas en más pequeñas. Los rendimientos de liposomas se reducen correspondientemente.

La suspensión de liposomas procesada por tamaño puede ser fácilmente esterilizada por paso a través de una membrana esterilizante que tiene un tamaño de discriminación de partículas de aproximadamente 0,4 jm , tal como un filtro de membrana convencional de 0,45 jm de profundidad. Los liposomas son estables en forma liofilizada y se pueden reconstituir poco antes de uso por absorción en agua.

Lípidos adecuados para formar liposomas son como se han descrito anteriormente. Ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos tales como dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y/o dimiristoil - fosfatidilglicerol (DMPG), fosfolípidos derivados de huevo y soja como se obtuvieron después de la purificación parcial o completa, directamente o seguido de hidrogenación parcial o completa.

Los cuatro métodos siguientes se describen en el documento de patente WO 95/04524 y, en general, son adecuados para la preparación de partículas coloidales (liposomas) usadas según la presente invención.

Método A

• a) mezclar sustancias anfipáticas, tales como lípidos adecuados para formar vesículas en disolventes orgánicos inmiscibles en agua

• b) retirar el disolvente en presencia de un soporte sólido, alternativamente, se pueden usar directamente sustancias anfipáticas secadas o mezclas de las mismas en cualquier forma (polvo, granular, etc.),

• c) recoger el producto de la etapa b) en una disolución de las sustancias biopoliméricas en una disolución fisiológicamente compatible

• d) añadir un disolvente orgánico que tiene propiedades solubilizantes o dispersantes, así como

• e) secar la fracción obtenida en la etapa d) en condiciones que retengan la función de las sustancias biopoliméricas.

Según la etapa a) del método A, sustancias anfipáticas adecuadas para formar las vesículas que se han mencionado anteriormente se mezclan en un disolvente orgánico inmiscible en agua. El disolvente orgánico inmiscible en agua puede ser un disolvente prótico polar, tal como hidrocarburos fluorados, hidrocarburos clorados y similares.

En la etapa b) del método de la invención, el disolvente se retira en presencia de un soporte sólido. El soporte sólido puede ser un material orgánico o inorgánico inerte que tiene una estructura de tipo perla. El material del material de soporte inorgánico puede ser vidrio y el material orgánico puede ser Teflon™ u otros polímeros similares.

La etapa c) de método A de la invención es para llevar el producto de la etapa b) a una disolución de las sustancias a encapsular en una disolución fisiológicamente compatible.

La disolución fisiológica compatible puede ser equivalente a una disolución de cloruro sódico de hasta aproximadamente 1,5 en peso. También es posible usar otras sales, en tanto que sean fisiológicamente compatibles, por ejemplo, como un crioprotector, por ejemplo, azúcares y/o aminoácidos. Por ejemplo, se puede usar lactosa, sacarosa o trehalosa como un crioprotector.

Opcionalmente, entre la etapa a) y b) se puede proporcionar una etapa de inactivación de virus, esterilización, despirogenación, filtrado de la fracción o similares de la etapa a). Esto podría ser ventajoso para tener una disolución farmacéuticamente aceptable en una etapa temprana de la preparación.

La etapa d) del método A es añadir un disolvente orgánico que tiene propiedades solubilizantes o dispersantes.

El disolvente orgánico puede ser un disolvente prótico polar orgánico miscible en agua. También se pueden usar alcoholes alifáticos inferiores que tienen 1 a 5 átomos de carbono en la cadena de alquilo, tales como butanol terciario (terc-butanol). La cantidad de disolvente prótico polar orgánico miscible en agua depende fuertemente de su interferencia con la sustancia a cargar en los liposomas. Por ejemplo, si una proteína se va a cargar, el límite superior se establece por la cantidad de disolvente por la que la actividad de la proteína se afecta. Esto puede variar fuertemente con la naturaleza de la sustancia a cargar. Por ejemplo, si el factor de coagulación de la sangre comprende factor IX, entonces la cantidad de aproximadamente el terc-butanol es alrededor de 30 %, mientras que para el factor VIII una cantidad inferior a 10 % de terc-butanol es adecuada (el factor VIII es mucho más sensible al impacto del terc-butanol). El porcentaje de terc-butanol en estos ejemplos se basa en el porcentaje en volumen calculado para la concentración final.

Opcionalmente, posterior a la etapa d), se puede llevar a cabo la inactivación de virus esterilizando y/o dividiendo la fracción dada después de la etapa d).

La etapa e) de la presente invención es secar la fracción obtenida en la etapa d) en condiciones que retengan la función de la sustancia a cargar. Un método de secado de la mezcla es la liofilización. La liofilización se puede llevar a cabo en presencia de un crioprotector, por ejemplo, lactosa u otros sacáridos o aminoácidos. Alternativamente, se puede usar evaporación o secado por pulverización.

El residuo secado se puede recoger entonces en un medio acuoso antes de uso. Después de recoger el sólido, forma una dispersión de los liposomas respectivos. El medio acuoso puede contener una solución salina y la dispersión formada se puede pasar opcionalmente a través de un filtro adecuado para reducir los liposomas, si fuera necesario. Adecuadamente, los liposomas pueden tener un tamaño de 0,02 a 5 μm, por ejemplo, en el intervalo de < 0,4 μm.

Los liposomas obtenibles por el método A muestran alta carga de los factores de la sangre.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden ser un producto intermedio obtenible por aislamiento de cualquier fracción de la etapa c) o d) del método A. Por consiguiente, la formulación de la invención también comprende una dispersión acuosa obtenible después de recoger el producto de la etapa e) del método A en agua en forma de una dispersión (liposomas en medio acuoso).

Alternativamente, las composiciones farmacéuticas de la invención también son obtenibles por los siguientes métodos que se denominan los métodos B, C, D y E.

Método B

Este método comprende también las etapas a), b) y c) del método A. Sin embargo, se omiten la etapa d) y e) del método A.

Método C

En el método C, la etapa d) del método A se sustituye por un ciclo de congelación y descongelación que se tiene que repetir al menos dos veces. Esta etapa es bien conocida en el estado de la técnica para producir liposomas.

Método D

El método D excluye el uso de cualquier componente osmótico. En el método D intervienen las etapas de preparación de vesículas, mezcla y disolución sustancialmente libre de sal de las sustancias a cargar y secado conjunto de las fracciones así obtenidas.

Método E

El método E es más simple que los métodos A - D descritos anteriormente. Requiere disolver los compuestos usados para la preparación de liposomas (lípidos antioxidantes, etc.) en un disolvente polar-prótico miscible en agua como tercbutanol. Esta disolución se mezcla entonces con una disolución o dispersión acuosa que contiene el factor de la sangre. La mezcla se realiza en la relación de volumen óptima requerida para mantener la actividad biológica y farmacológica del agente.

La mezcla se liofiliza entonces en presencia o ausencia de un crioprotector. Se requiere rehidratación antes del uso de la formulación liposomal. Estos liposomas son multilaminares, su reducción se puede lograr por uno de los métodos descritos en el documento de patente WO 95/04524.

La invención también incluye métodos de tratamiento de hemofilia A en un sujeto que comprende administrar por vía subcutánea una composición farmacéutica o dosis como se define en el presente documento a un sujeto en necesidad del mismo. Dichos métodos pueden incluir un método de tratamiento de la hemofilia A en un sujeto en donde el paciente ha desarrollado anticuerpos (es decir, inhibidores) a un factor de la sangre.

Las enfermedades o trastornos de la coagulación de la sangre se pueden caracterizar por una pérdida de función de un factor de coagulación de la sangre, o la generación de autoanticuerpos. Los ejemplos de enfermedades de coagulación de la sangre incluyen hemofilia, tal como hemofilia A y hemofilia B.

Por lo tanto, la presente invención se extiende a una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento de hemofilia A. Dichas composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de hemofilia A se pueden usar donde el paciente ha desarrollado anticuerpos a dicho factor de la sangre. Los usos de la invención según este aspecto también incluyen el uso de un factor de la sangre en la fabricación de un medicamento como se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento de hemofilia A.

El factor VIIa se puede usar en el tratamiento de episodios hemorrágicos en hemofilia A o B, o en el tratamiento de pacientes que han desarrollado anticuerpos inhibidores contra FVIII o IX, respectivamente. El factor VIII se puede usar en el tratamiento de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia A y el factor IX se puede usar en el tratamiento de pacientes con hemofilia B.

Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" incluye cualquier pauta que pueda beneficiar a un ser humano o mamífero no humano. El tratamiento de "mamíferos no humanos" se extiende al tratamiento de mamíferos domésticos, que incluye caballos y animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros) y animales de granja/agrícolas que incluyen miembros de las familias ovinas, caprinas, porcinas, bovinas y equinas. El tratamiento puede ser con respeto a cualquier afección o trastorno existente, o puede ser profiláctico (tratamiento preventivo). El tratamiento puede ser de una enfermedad hereditaria o adquirida. El tratamiento puede ser de una afección aguda o crónica.

Los niveles de actividad en la cascada de coagulación de la sangre se pueden medir por cualquier ensayo adecuado, por ejemplo, el ensayo del tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) o el tiempo activado de tromboplastina parcial (APTT).

El ensayo del tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) mide el tiempo necesario para que la sangre completa forme un coágulo en un entorno externo, normalmente un tubo o placa de vidrio.

La prueba del tiempo activado de tromboplastina parcial (APTT) mide un parámetro de parte de la vía de coagulación de la sangre. Es anormalmente elevada en hemofilia y por terapia con heparina intravenosa. La APTT requiere algunos mililitros de sangre de una vena. El tiempo APTT es una medida de una parte del sistema de coagulación conocido como la "vía intrínseca". El valor de APTT es el tiempo en segundos para que un proceso de coagulación específico ocurra en la prueba de laboratorio. Este resultado es siempre en comparación con una muestra de "control" de sangre normal. Si la muestra de prueba dura más que la muestra de control, indica reducción de la función de coagulación en la vía intrínseca. La terapia médica general normalmente tiene como objetivo un intervalo de APTT del orden de 45 a 70 segundos, pero el valor también se puede expresar como una relación entre la prueba y la normalidad, por ejemplo 1,5 veces la normalidad. Un APTT alto en ausencia de tratamiento con heparina puede ser debido a hemofilia, que puede requerir una prueba adicional.

La invención también proporciona un kit de partes que comprende una composición farmacéutica de la invención, y un vehículo de administración que incluye una disolución inyectable para administración subcutánea, comprendiendo adecuadamente dicho kit instrucciones para el uso del mismo.

Por lo tanto, la invención también puede ser adecuada para proporcionar una forma farmacéutica de una composición farmacéutica de la invención. Dichas formas farmacéuticas se pueden proporcionar como envases o viales adecuados que contienen la dosis apropiada para un paciente.

Las composiciones farmacéuticas para administración subcutánea o las formas farmacéuticas de la invención se pueden administrar solas o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos o moléculas, por ejemplo fármacos antiinflamatorios, analgésicos o antibióticos, u otros agentes farmacéuticamente activos que pueden promover o potenciar la actividad del factor VIIa, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor Xa, factor XI, factor V, factor XIII, factor de von Willebrand (vWF), protrombina o proteína C, o un fragmento de los mismos, tales como, por ejemplo, otro factor de coagulación de la sangre. Dicha administración con otros compuestos puede ser simultánea, separada o secuencial. Los componentes se pueden preparar en forma de un kit que puede comprender instrucciones según convenga.

Las composiciones farmacéuticas de la invención permiten un tratamiento mejorado de las enfermedades, donde un factor de la sangre se administra para tratar un paciente que padece hemofilia A.

En una realización de la invención se proporciona una composición farmacéutica para administración subcutánea que comprende un factor de la sangre y una partícula coloidal que comprende aproximadamente 1-20 por ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, un tampón farmacéuticamente aceptable, ajustado a pH fisiológico adecuado para administración subcutánea, en donde el factor de la sangre no está encapsulado en dicha partícula coloidal.

Se entiende por el experto que la dosis de medicamento de la invención depende de la concentración de las sustancias biopoliméricas eficaces, así como de su eficiencia.

Se puede administrar una dosis de hasta 2.000 mg/liposomas de lípido por kg de peso corporal a pacientes en donde los factores activos en los liposomas se cargan con una eficiencia superior a 50 % basado en la actividad total usada para preparar los liposomas cargados.

Por consiguiente, en otro aspecto de la presente invención, el volumen de formulación para la administración en un paciente puede ser no superior a 2 ml. Adecuadamente, el volumen de administración puede ser 5 μl, 10 μl, 25 μl, 50 μl, 100 μl, 250 μl, 500 μl, 750 μl o 1 ml. En realizaciones alternativas, el volumen de formulación para la administración puede ser no superior a 1,5 ml, 2 ml, 2,5 ml, 3,0 ml o 3,5 ml.

Es importante tener en cuenta que la presente invención permite administrar mayor concentración de un agente activo en una única inyección subcutánea de forma más segura que por inyección intravenosa, puesto que no se administra directamente en la circulación sanguínea del paciente. Esto es particularmente importante cuando se trata con factores de coagulación de la sangre, puesto que la alta concentración de factores de coagulación de la sangre administrados por vía intravenosa puede dar como resultado coágulos de sangre no deseables y peligrosos en el paciente.

La administración subcutánea permite la infusión continua del agente activo en la corriente sanguínea por el sistema linfático, evitándose así el efecto de niveles peligrosos de un agente activo que se administra directamente en el aparato circulatorio. Por lo tanto, puesto que la concentración de administración del agente en la corriente sanguínea está regulada por el sistema linfático del paciente, se puede administrar una mayor concentración en una dosis de administración subcutánea, que permite que se usen volúmenes más pequeños de los tradicionalmente usados con la administración intravenosa.

Las formulaciones de la invención pueden ser para administración al menos una vez al día, al menos dos veces al día, aproximadamente una vez por semana, aproximadamente dos veces por semana, aproximadamente una vez cada dos semanas, o aproximadamente una vez al mes.

Para ciertas sustancias terapéuticas, una pauta de administración de una vez al día será suficiente, pero para otras una pauta de administración más frecuente puede ser más apropiada o deseable, donde la cantidad suministrada en cada dosis administrada por vía subcutánea se puede reducir con respecto a una administración intravenosa convencional. Así, por ejemplo, una formulación de la invención se puede administrar una vez al día, dos veces al día (o más si se requiere).

La presente invención permite la prevención del rápido aumento y posterior caída (es decir, un "diente de sierra") en la concentración de un agente terapéutico en la sangre. La presente invención proporciona una concentración predecible más coherente del agente en la sangre de un paciente durante un periodo de tiempo más largo que el tradicionalmente observado con formulaciones farmacéuticas convencionales del mismo agente cuando se suministra repetidamente por vía intravenosa.

Un beneficio adicional de la presente invención es que permite una mayor dosis del agente a administrar por vía subcutánea que la que se puede administrar de forma segura por vía intravenosa. Esto da como resultado la provisión de una mayor duración del beneficio terapéutico de la que se podría lograr generalmente y de forma segura por una mayor dosis o una dosis más frecuente por administración intravenosa. Por ejemplo, en el caso de factores de la sangre, debido a que los productos están siendo administrados por el conducto torácico en la vena subclavia, el método permite administrar una mayor cantidad de producto en un único momento de tiempo como una dosis única por vía subcutánea de la que se podría administrar en un único momento de tiempo por vía intravenosa en una vena. La administración de un bolo de alta dosis en una vena puede causar un acontecimiento trombótico no deseable.

Un beneficio adicional de la presente invención es que permite que el agente terapéutico sea readministrado en intervalos para permitir que la concentración en sangre del agente se mantenga en un nivel coherente, proporcionando un efecto terapéutico constante y predecible sostenido sin la necesidad de esperar a la readministración hasta que la concentración del agente en la sangre disminuya hasta niveles terapéuticamente irrelevantes. En la práctica tradicional, la readministración de factores de coagulación de la sangre, con su Cmáx. inmediata y aparición de acción, se retrasa hasta que se ha estimado que el nivel del terapéutico ha disminuido hasta un nivel al que la adición de Cmáx. desde la nueva inyección no alcanzará un nivel potencialmente trombogénico (es decir, reducir el riesgo de un acontecimiento adverso), pero que significa que el paciente ha alcanzado un intervalo "poco saludable" de un nivel de un agente en su circulación sanguínea. En otras palabras, dosis posteriores de un agente no se administran normalmente al paciente mientras que "niveles saludables", o niveles terapéuticamente eficaces, del agente están todavía presentes en la circulación sanguínea. Sin embargo, la presente invención permite que ocurra volver a administrar el agente mientras que los niveles en sangre del agente están todavía en un intervalo terapéutico eficaz. Por lo tanto, la invención proporciona un nivel terapéutico más coherente de proteína en la circulación sanguínea que es idealmente más apto para la profilaxis. Debido a la coherente administración del agente en la circulación sanguínea por el conducto torácico, se evita el problema de aumentar el agente en la circulación sanguínea hasta niveles no deseablemente altos.

La invención proporciona una formulación para la administración subcutánea a un sujeto que permite al sujeto recibir una forma farmacéutica de un factor de coagulación de la sangre suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa en dicho sujeto de no más de 20 minutos, en otras palabras, para la administración de no más de una vez al mes. También se proporciona una formulación de factor de coagulación de la sangre para administración subcutánea no más de una vez al mes, en donde la forma farmacéutica tiene una Cmáx. de al menos 10 % y no más de 90 % en comparación con una forma farmacéutica de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa, para su uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre. Adecuadamente, Cmáx. es desde 20 % hasta 80 %, o desde 30 % hasta 70 %, o desde 40 % hasta 60 %.

Por "no más de" se indica que la forma farmacéutica se puede administrar más frecuentemente que el periodo de tiempo especificado, pero no es necesario que sea así; el efecto de la administración subcutánea de dicha forma farmacéutica significa que los efectos se observan durante la duración del periodo de tiempo. Sin embargo, debido a la Cmáx. más baja y coherente, puede ocurrir una administración más frecuente sin efectos adversos al paciente.

Adecuadamente, la forma farmacéutica de un factor de coagulación de la sangre puede ser suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa en dicho sujeto de menos de 15 minutos, o adecuadamente, menos de 12 minutos. En una realización, la forma farmacéutica de un factor de coagulación de la sangre es una forma farmacéutica de al menos una vez a la semana, o forma farmacéutica de al menos una vez al mes, al menos una vez cada dos semanas, al menos una vez cada media semana.

También se proporciona una formulación de administración según la invención, en la que la administración del factor de coagulación de la sangre es desde 1 hasta 1000 UI/kg, o desde 5 hasta 500 UI/kg, o desde 100 hasta 250 UI/kg, o desde 25 hasta 50 UI/kg, o desde 5 hasta 50 UI/kg.

La forma farmacéutica de la presente invención que comprende un factor de coagulación de la sangre permite una administración menos frecuente de la forma farmacéutica, que es todavía suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa en un sujeto de no más de 20 minutos, o no más de 15 minutos, o no más de 10 minutos. En una realización, la forma farmacéutica es suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa de menos de 12 minutos. La forma farmacéutica puede proporcionar una forma farmacéutica no más de una vez cada quince días, no más de una vez a la semana, no más de dos veces a la semana, no más de una vez cada tres días, no más de una vez cada 2 días, no más de una vez al día o una forma farmacéutica más o menos frecuente.

Es importante tener en cuenta que un beneficio de la presente invención es que la forma farmacéutica, cuando el agente es un factor de coagulación de la sangre, no necesita ser administrada al paciente más frecuentemente que estos intervalos para continuar manteniendo el tiempo de coagulación de sangre completa en un intervalo sano, pero se puede administrar más frecuentemente para ayudar a proporcionar un "estado estacionario" similar al de una formulación de liberación controlada. Un experto en la técnica considera que un tiempo de coagulación de sangre completa "normal" es, en general, 10 a 12 minutos, y por debajo de 15 minutos se considera que es saludable en un humano no hemofílico. Una vez que el tiempo de coagulación de sangre completa es superior a 20 minutos, se considera que está en un intervalo no saludable. Entre 15 y 20 minutos se considera que indica que aunque la hemorragia está bajo control, no es normal.

En otra realización, la forma farmacéutica se administra menos frecuentemente de lo que se predeciría por la semivida plasmática de una inyección intravenosa en embolada. Por ejemplo, una inyección en embolada de factor IX modificado se puede requerir una vez a semana, mientras que el mismo agente suministrado por vía subcutánea según la invención se puede solo requerir una vez cada diez días, o menos.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona una forma farmacéutica de una composición farmacéutica de 25 a 50 UI/kg de un factor de coagulación de la sangre para administración subcutánea a la misma frecuencia o con menos frecuencia que el factor de coagulación de la sangre administrado por vía intravenosa.

Las formulaciones de la presente invención son, por lo tanto, capaces de mantener un valor normal de la hemostasia de hasta siete días en los que un valor normal se define como un tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) inferior a 15 minutos, adecuadamente, aproximadamente 12 minutos o menos.

Las formulaciones de realizaciones específicas de la invención en donde la formulación comprende un factor de la sangre pueden comprender una dosis de desde 25 hasta 50 UI/kg. En algunas realizaciones, la dosis puede ser 25, 30, 35, 40, 45 o 50 UI/kg. La dosis puede ser desde 25 UI/kg hasta 30 UI/kg, 35 UI/kg hasta 40 UI/kg, o 40 UI/kg hasta 50 UI/kg.

Las formulaciones de realizaciones específicas de la invención en donde la formulación comprende un factor de la sangre pueden comprender alternativamente una dosis de desde 5 hasta 50 UI/kg. En algunas realizaciones, la dosis puede ser 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 UI/kg. La dosis puede ser de desde 5 UI/kg hasta 10 UI/kg, 25 UI/kg hasta 30 UI/kg, 35 UI/kg hasta 40 UI/kg, o 40 UI/kg hasta 50 UI/kg.

En una realización, cuando la forma farmacéutica se prepara como una dosis de 150 UI/kg, la formulación puede ser adecuada para administración una vez cada dos semanas a un sujeto en necesidad de la misma. Adecuadamente, la formulación puede ser para administración no más de una vez cada dos semanas. Alternativamente, la dosis se puede preparar como una dosis de 100 UI/kg

Según una realización de la invención, una formulación de la invención que comprende un factor de coagulación de la sangre puede dar como resultado hemostasia normal que se mantiene durante al menos la mitad de una semana.

Las formas farmacéuticas según la invención, cuando se administran por vía subcutánea, dan como resultado que se requiere menores cantidades del factor de coagulación (coagulante) de la sangre para lograr el mismo criterio de valoración terapéutico, proporcionando así productos más seguros para sujetos en necesidad de tratamiento. En una realización, la mitad de la dosis ajustada del factor de coagulación de la sangre modificado administrado por vía intravenosa es suficiente para lograr la hemostasia normal durante al menos una semana en sujetos, particularmente en donde el factor de coagulación de la sangre es el factor VIII. Un valor adecuado para la hemostasia normal es un tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) de aproximadamente 12 minutos, como se ha descrito anteriormente.

Las formulaciones de la invención pueden comprender adecuadamente menos de la mitad de la cantidad terapéuticamente eficaz ajustada a la dosis de una formulación de referencia formulada para administración intravenosa que comprende el mismo factor de coagulación de la sangre modificado para lograr el mismo efecto terapéutico.

Por lo tanto, la invención también proporciona una forma farmacéutica de un factor de coagulación de la sangre modificado para administración subcutánea en el que la forma farmacéutica comprende 50 % de la cantidad ajustada a la dosis requerida para administración intravenosa para lograr la misma duración de acción eficaz.

Una formulación adecuada para administración subcutánea se puede preparar adecuadamente como una formulación acuosa o sustancialmente acuosa. La formulación puede comprender dichas sales, conservantes y estabilizadores y/o excipientes o adyuvantes adicionales, según se requiera. Las formas farmacéuticas de la invención se pueden proporcionar como polvos anhidros listos para formulación extemporánea en un medio acuoso adecuado.

Adecuadamente, dichas formas farmacéuticas se pueden formular como formulaciones acuosas tamponadas. Las disoluciones de tampón adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, aminoácidos (por ejemplo, histidina), sales de ácidos inorgánicos y metales alcalinos o metales alcalinotérreos (por ejemplo, sales de sodio, sales de magnesio, sales de potasio, sales de litio o sales de calcio - ejemplificadas como cloruro sódico, fosfato de sodio o citrato de sodio). Pueden estar presentes otros componentes, tales como detergentes o emulsionantes (por ejemplo, Tween 80® o cualquier otra forma de Tween®) y estabilizadores (por ejemplo, benzamidina o un derivado de benzamidina). Excipientes tales como azúcares (por ejemplo, sacarosa) también pueden estar presentes. Valores adecuados para el pH son pH fisiológico, por ejemplo pH 6,8 a 7,4 o pH 7,0. Se pueden preparar formas farmacéuticas líquidas listas para su uso en dichos vehículos de administración.

En una realización particular de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para administración subcutánea del siguiente modo:

• citrato de sodio 50 mM

• pH 7,0

• fosfolípidos 100 mM - relación molar 97:3 de palmitoil-oleoil fosfatidil colina (POPC) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina-N-[poli-(etilenglicol)-2000] (DSPE-PEG 2000).

• rFVIII liofilizado (Helixate NexGen)

La invención se describirá ahora adicionalmente a modo de referencia en los siguientes ejemplos que están presentes a efectos de ilustración solo y que no se deben considerar como limitaciones de la invención.

Ejemplo 1: Síntesis de liposomas

Se prepararon lípidos mixtos a partir de palmitoil-oleoil fosfatidil colina (POPC) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli-(etilenglicol)-2000] derivatizado con PEG-2000 (PEG con peso molecular 2000 dáltones) (DSPE-PEG 2000), del siguiente modo:

Peso molecular de POPC: 760,08 g/mol

Peso molecular de DSPE-2kPEG: 2789,5 g/mol

La preparación final tuvo una concentración de fosfolípidos 100 mM. Se preparó una mezcla de lípidos de 15 % p/v con una relación molar 97:3 de POPC:DSPE-2kPEG. Se pesó y mezcló lo siguiente:

2,04 g de POPC

0,232 g de DSPE-2kPEG

14,9 ml de terc-butanol (fundido en un baño de agua a 35 °C), todos dispuestos en una botella de 100 ml de Schott.

La mezcla se mantuvo a 35 °C en un baño de agua y se agitó intermitentemente hasta que todos los sólidos se habían disuelto/dispersado. El material fue una mezcla incolora clara. La mezcla se congeló a -80 °C durante la noche.

La operación se mantuvo en una campana de flujo laminar para permitir la contención durante la limpieza después del uso del disolvente secado / condensado. Se calentaron el liofilizador Christ Alpha 1-2 LD y la bomba de vacío durante 20 minutos, y la mezcla congelada de lípidos/disolvente se sacó del almacenamiento a -80 °C y se secó durante la noche. Los lípidos secados se recuperaron de la secadora a la mañana siguiente. Tuvieron el aspecto de una torta cristalina seca. Se requirió una disolución 100 mM de lípido para procesamiento posterior. Las cantidades de lípido presentes se calculan en alrededor 82 μmoles de DSPE-2kPEG y 2,69 mmoles de POPC; por lo tanto, alrededor de 2,77 mmoles de lípidos. Así, se requirieron 27,7 ml de diluyente. Se añadieron 27,7 ml de tampón citrato de sodio 50 mM a los lípidos secados, y la mezcla resultante se agitó y se calentó a alrededor 35 °C. Después de alrededor 120 minutos, resultó una emulsión blanca sin sólidos grandes obvios. Esto se sometió a extrusión como sigue.

Se ensambló una carcasa de filtración a presión de acero inoxidable de Sartorius de 47 mm y se envolvió por una camisa de agua (tubería envuelta alimentada por un termocirculador) mantenida a 35 °C. La carcasa se ajustó con una membrana de policarbonato con surcos grabados (detalles a continuación), se cubrió por un prefiltro de fibra de vidrio (Whatman GF/D). La emulsión se vertió en la carcasa y se extruyó bajo 4 bares de gas nitrógeno, el filtrado se recogió en tubos de 50 ml. Se cronometró y se anotó la duración de cada extrusión.

La secuencia de filtración fue: 0,8 μm, 0,4 μm, 0,2 μm, 0,2 μm, 0,1 μm y 0,1 μm (es decir, pases únicos a través de los filtros más grandes y dos pases a través de los filtros más pequeños de 0,2 y 0,1 μm), con el filtrado calentado de nuevo a 35 °C entre pases. Los liposomas se extruyeron, con los datos tabulados que siguen:

Tabla 1

Los lípidos extruídos resultantes se almacenaron a 5 °C. Se retiraron 15 ml de 'Liposomas extruídos' del caldo enfriado y se dispensaron en un tubo estéril de 50 ml dentro de una cabina de seguridad microbiológica. El tamaño de los liposomas extruidos se analizó usando un espectrómetro de correlación de fotones ALV5000. Se determinó que el radio promedio era 75,40 ± 0,86 nm y la anchura de pico promedio 22,21 ± 3,86 nm, dando un diámetro promedio de 150,80 nm e índice de polidispersidad de 0,087.

Ejemplo 2: Farmacocinética/Farmacodinámica de FVIII humano recombinante reconstituido con liposomas PEGilados en perros con hemofilia A tras la administración subcutánea

Un perro con hemofilia A (identificado como el perro número "1") recibió una dosis subcutánea de liposomas PEGilados asociados al factor VIII (PEGLip FVIII SC), del siguiente modo:

Los objetivos de este estudio fueron determinar la FC y FD en un perro con hemofilia A de rFVIII de longitud completa reconstituido en liposomas PEGilados administrados por vía subcutánea (SC).

rFVIII de longitud completa

Se usó rFVlll liofilizado de longitud completa (Helixate NexGen, Lote 270LR8WB) como producto experimental.

Formulación de liposomas PEGilados

Los liposomas PEGilados en tampón citrato se produjeron según el Ejemplo 1 anteriormente según el método de Baru (2005). La formulación de liposomas tuvo la siguiente composición; citrato de sodio 50 mM a pH 7,0 que contenía fosfolípidos 100 mM; que comprende una mezcla de relación molar 97:3 de palmitoil-oleoilfosfatidilcolina (POPC) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina-N-[poli-(etilenglicol)-2000] (DSPE-PEG 2000).

El perro sometido a la prueba experimental fue de la colonia con hemofilia A alojado en la Escuela de Medicina de la Universidad de Alabama. Todos los perros tienen hemofilia A congénita grave. El sujeto de prueba pesó 16,4 kg y no había recibido previamente proteínas humanas.

Antes de la administración, el perro se probó para verificar el estado de salud normal, que incluye análisis bioquímico completo de la sangre, fibrinógeno en el perfil de bioquímica sérica, péptidos derivados de fibrinógeno (FDP), tiempo de trombina y análisis de orina.

El diseño de este estudio fue un ensayo de factibilidad de una única dosis SC en un único individuo.

Se reconstituyó FVIII humano recombinante de longitud completa (Helixate NexGen, 2.000 UI) con 13,3 ml de diluyente liposomal PEGilado. El rFVIII reconstituido se mezcló suavemente a temperatura ambiente durante 5-10 min para permitir que la proteína se adsorbiera a los liposomas antes de uso. Una vez reconstituida, la suspensión tuvo una actividad de FVIII de 150 IU/ml.

Se administró SC al individuo de la prueba 100 UI/kg. El cálculo del volumen de fármaco a administrar se llevó a cabo según la siguiente ecuación:

Volumen de dosis (ml) = (a x b)/c

Donde:

1. a es la dosis objetivo (100 UI/kg)

2. b es el peso del perro (kg)

3. c es la actividad de rFVIII (150 UI/ml)

Tras la administración, el animal de prueba se observó para signos clínicos. Se examinaron toxicidades inesperadas realizando pruebas de CBC y bioquímica sérica 48 h y 5 días después de la dosis. Se evaluaron el fibrinógeno, FDP y el tiempo de trombina (TT) para probar el elevado riesgo de trombosis.

Se tomaron muestras de sangre (5 ml) del perro administrado SC en los siguientes momentos de tiempo después de la administración:

Administración previa al fármaco y 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 y 120 horas después de la dosis. Se usó sangre completa (no citrada; 1 ml) para el ensayo de coagulación de sangre completa y el ensayo de tiempo de coagulación activado. Las muestras de sangre de 4 ml restantes se transfirieron a tubos que contenían el anticoagulante citrato de trisodio 0,109 M (9:1 v/v) sobre hielo.

Se realizaron ensayos de tiempo activado de tromboplastina parcial (aPTT), tiempo de coagulación activado (ACT) y tromboelastograma (TEG) en la sangre completa citrada.

Se preparó por centrifugación el plasma de la sangre citrada restante y las muestras de plasma resultantes se almacenaron en alícuotas de aproximadamente 100 μl a -80 °C.

Ensayos

(i) Sangre completa no citrada: Ensayo de coagulación de sangre completa

Se dividieron muestras de sangre entre 2 tubos de vacío (2 * 0,5 ml) y se observaron cuidadosamente con nivelado periódico y acertado del tubo hasta que se determinó un coágulo por interrupción de flujo en la posición completamente horizontal. La calidad del coágulo se observó manteniendo el tubo en la posición completamente invertida. El tiempo de coagulación de sangre completa se registró como la media del tiempo total desde la extracción de la muestra hasta que se observó la observación visual del coágulo de sangre para ambas muestras y la calidad del coágulo en la posición invertida.

(ii) Sangre completa citrada: Ensayo de tromboelastograma (TEG)

Se realizó TEG con sangre completa citrada recalcificada usando un tromboelastógrafo Hemostasis Analyzer modelo 5000 (Haemoscope Corporation) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se dispuso 1 ml de sangre completa citrada en un vial comercialmente disponible (Teg®Hemostasis System Kaolin, Haemonetics) que contiene caolín. La mezcla se garantizó por la inversión suave de los viales que contenían caolín 5 veces. Se dispusieron pasadores y copas en el analizador de TEG según el procedimiento convencional recomendado por el fabricante. Cada copa de TEG estándar se dispuso en el soporte del instrumento precalentado a 37 °C y se llenó con 20 μl de cloruro de calcio (0,2 M). Entonces, se añadieron 340 μl de sangre completa citrada activada con caolín para un volumen total de 360 μl.

(iii) Tiempo de coagulación activado (ACT) y tiempo activado de tromboplastina parcial (aPTT)

Se llevaron a cabo pruebas de ACT y aPTT usando un analizador de la coagulación Haemachron Jr (International Technidyne Corps.) según las instrucciones del fabricante.

(iv) Plasma: Ensayo de actividad de FVIII (cromogénico)

Se determinó la actividad en plasma de FVIII usando el ensayo Coatest (Dia Pharma, West Chester, OH). Se diluyeron muestras de plasma 1:20 a 1:80 con diluyente de ensayo y se ensayaron según las instrucciones del fabricante. Se establecieron curvas patrón usando plasma de referencia de hemostasia normal (american diagnostica inc, Stamford, CT) y la proteína PEG-FVIII purificada.

(v) Plasma: ELISA de FVIII

La concentración de antígeno de FVIII en muestras de plasma será determinada por ELISA usando el kit de antígenos Visulize FVIII de Affinity Biologicals (Ancaster, Ontario, Canadá) según las instrucciones del fabricante.

(vi) Plasma: Inmunogenicidad

Se realizaron ensayos de Bethesda en diluciones 1:4, 1:10 y 1:20 de plasma de prueba en plasma humano deficiente en FVIII. Volúmenes iguales del plasma de prueba diluido y plasma de referencia humano normal se incubaron a 37 °C durante 2 horas y el título de Bethesda se determinó usando el ensayo de aPTT y una curva patrón de plasma humano normal como se ha descrito anteriormente.

Tabla 2

Los resultados del estudio se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un paciente que padece hemofilia A que comprende el factor de la sangre el factor VIII y una partícula coloidal, en donde la partícula coloidal comprende aproximadamente 0,5 a 20 por ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, en donde la partícula coloidal es sustancialmente neutra y el polímero no lleva sustancialmente carga neta, en donde el factor de la sangre no está encapsulado en dicha partícula coloidal, en donde la composición se administra por vía subcutánea y en donde la administración subcutánea repetida de la composición farmacéutica se lleva a cabo antes de que la concentración de la composición farmacéutica en la sangre se reduzca a niveles subterapéuticos.

2. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde la partícula coloidal tiene un diámetro de partículas medio de entre aproximadamente 0,03 y aproximadamente 0,4 micrómetros (μm); opcionalmente en donde la partícula coloidal tiene un diámetro de partículas medio de aproximadamente 0,1 micrómetros (μm).

3. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho lípido anfipático es un fosfolípido de fuentes naturales o sintéticas; opcionalmente en donde dicho lípido anfipático es fosfatidiletanolamina (PE).

4. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho lípido anfipático es un lipopolímero sin carga asociado a carbamato; opcionalmente en donde dicho lípido anfipático es aminopropanodiol diestearoílo (DS).

5. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde dichas partículas coloidales comprenden además un segundo lípido anfipático obtenido a partir de cualquier fuente natural o sintética; opcionalmente en donde dicho segundo lípido anfipático es fosfatidilcolina.

6. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 5, en donde la partícula coloidal comprende palmitoiloleoil fosfatidil colina (POPC) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina (DSPE) en una relación (Po PC:DSPE) de desde 85 hasta 99:15 hasta 1; opcionalmente en donde la relación de POPC:DSPE es desde 90 hasta 99:10 hasta 1; opcionalmente en donde la relación de POPC:DSPE es 97:3.

7. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 5, en donde se complementa colesterol a la composición.

8. La composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho polímero hidrófilo biocompatible se selecciona del grupo que consiste en polialquiléteres, ácidos polilácticos y ácidos poliglicólicos; opcionalmente en donde dicho polímero hidrófilo biocompatible es polietilenglicol.

9. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8, en donde el polietilenglicol tiene un peso molecular de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5000 dáltones; opcionalmente en donde el polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 2000 dáltones.

10. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde el lípido anfipático derivatizado es 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina-N-[poli-(etilenglicol)]; opcionalmente en donde el lípido anfipático derivatizado es 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina-N-[poli-(etilenglicol)-2000] (DSPE-PEG 2000).

11. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la composición comprende además otro compuesto terapéuticamente activo.

12. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho paciente ha desarrollado anticuerpos a un factor de la sangre.