KR20240040125A - A형 혈우병 치료용 변형된 콜로이드 입자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 콜로이드 입자 및 선택적으로 FVIII을 포함하는 조성물, 방법, 키트 및 제형을 제공한다. 또한 FVIII 결핍이 있는 혈우병 환자를 치료하기 위한 조성물, 방법, 키트 및 제형에 관한 것이며, 이들 환자는 FVIII에 대한 저해제를 가지고 있을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
Description
본 발명은 콜로이드 입자를 포함하는 제형에 관한 것이다. 콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질의 혼합물을 포함하며, 여기서 제2 양친매성 지질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기일 수 있다. 본 발명은 또한 콜로이드 입자를 포함하는 용도, 방법, 키트 및 제형에 관한 것이다.
혈액 응고로 이어지는 혈액 응고 과정(The coagulation cascade)은 다양한 단백질과 인자가 관여하는 다단계 과정이며, 부상 시 안전하게 혈전을 형성할 수 있는 조절 피드백 메커니즘과 결합되어 있다. 혈우병과 같은 혈액 질환의 경우 이러한 인자 중 하나 이상이 결함이 있거나 결여되어 결함이 있는 또는 품질이 낮은 혈전을 유발할 수 있다.
A형 혈우병은 혈액 응고(blood clotting) Factor VIII(FVIII)가 없거나(중증 혈우병) 수치가 낮다(중등도 및 경증 혈우병).
FVIII은 '내인성(intrinsic)' 경로의 핵심 단백질로, FVIIIa로 활성화되면 FIXa와 결합하여 내인성 '테나제' 복합체를 형성하여 FX를 FXa로 전환하는 것을 가속화하고, 이는 피브리노겐(fibrinogen)을 혈전을 형성하는 피브린(fibrin)으로 전환하는 프로트롬빈(prothrombin)을 트롬빈(thrombin)으로 전환하는 데 참여한다.
FX가 FXa로 전환되는 것은 '외인성(extrinsic)' 개시 경로(initiation pathway)에 의해서도 매개될 수 있다. 조직 인자(TF)와 FVIIa의 외인성 테나제(tenase) 복합체(TF-FVIIa)의 형성은 혈액 응고 과정을 시작하여 트롬빈의 생성으로 이어지고, 이는 또한 FVIII에서 FVIIIa로 활성화되는 촉매가 된다. 그러나 외인성 경로는 내인성 경로에 비해 효율성이 떨어진다.
FVIII이 없는 경우, 혈액 응고 과정이 FX를 FXa로 전환하는 촉매 역할을 하는 외인성 경로에만 의존해야 하므로 혈액 응고 과정이 훨씬 더 느리게 진행된다.
내인성 FVIII이 없는 경우, 응고 능력(clotting capability)을 회복하기 위해 혈장 유래 또는 재조합 FVIII을 환자에게 대체 투여하는 것이 일반적이다. 환자는 외인성 FVIII(선천성 A형 혈우병 - cHA) 또는 자신의 FVIII(후천성 A형 혈우병 - aHA)에 대한 항체(저해제)를 생성할 수 있다. 저해제의 존재는 단백질이 저해제 항체에 의해 결합되고 중화되어 순환계에서 빠르게 제거되기 때문에 외인성 FVIII 환자의 치료 효과를 감소시켜 대체 인간 FVIII을 사용한 예방적 치료를 매우 어렵게 만들거나 일반적으로 불가능하게 만든다. 최적의 양에 미치지 못하는 FVIII은 혈전이 형성될 수 있다고 하더라도 혈전이 느리게 형성되거나 일단 형성되면 빠르게 분해되는 품질이 좋지 않다는 것을 의미한다.
현재 저해제 생성에 대처하는 두 가지 주요 방법은 저해제 관용 유도(Inhibitor tolerance induction, ITI) 또는 우회 요법(bypass therapies)의 사용이다. ITI는 환자가 정상적인 투여 요법으로 돌아갈 수 있도록 하기 위해 수개월에 걸쳐 FVIII을 대량으로 반복 투여하여 면역 체계에 관용을 유도하는 방법이다. 이 치료법이 항상 효과적인 것은 아니며, 수개월에 걸쳐 고용량의 FVIII을 반복적으로 주사하는 것은 환자에게 불쾌감을 줄 뿐만 아니라 의료 시스템 비용에도 큰 영향을 미친다.
우회 요법은 증폭 단계를 완전히 '우회'하여 저해제 문제를 피한다. 이러한 치료법은 단순히 FVIIa를 추가로 공급하여 외인성 경로를 강화하거나(예: 노보세븐(NovoSeven)), FVIII이 없을 때 응고 과정을 강화하는 활성 및 비활성화 인자를 혼합하여 공급할 수 있다(예: FEIBA(FVIIa, FIX, FX, FXa, 프로트롬빈 및 트롬빈의 혼합제제)를 예로 들 수 있다. 최근에는 이중 특이적 항체를 사용하여 FIXa와 FX를 결합하는 FVIIIa의 역할을 대체하려는 시도가 이루어지고 있다.
선천성 A형 혈우병 또는 후천성 A형 혈우병을 치료하기 위해 대체 Factor VIII를 사용하는 것은 임상에서 잘 확립되어 있다. 그러나 일부 환자에서 외인성 전달 Factor VIII의 효과를 감소시키는 저해 항체(inhibitory antibodies)가 발생하기 때문에 이러한 생성물의 효능은 제한적이다. 선천성 A형 혈우병 환자의 25-35%('저해제 환자(inhibitor patients')')는 외인성 Factor VIII에 대한 반응으로 저해 항체가 발생하며, 후천성 A형 혈우병의 경우 자가 면역으로 인해 환자가 자신의 Factor VIII에 대한 저해 항체를 생성하면서 질환이 발생하게 된다.
야생형 FVIII 분자는 6개의 도메인으로 구성된 2332개의 아미노산으로 구성되어 있다: A1-A2-B-A3-C1-C2. A1-A2-B 도메인은 '중쇄'(Heavy Chain, HC)로, A3-C1-C2 도메인은 '경쇄'(Light Chain, LC)로 구성되며 이 사슬은 비공유로 연결되어 있다. 생체 내에서 FVIII은 일반적으로 순환 과정에서 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand's Factor, VWF)와 관련된다. VWF는 FVIII의 수송을 촉진하고 조기 비활성화 및 제거로부터 보호한다(Mannucci, P.M. et al. (2014) Novel investigations on the protective role of the FVIII/VWF complex in inhibitor development. Haemophilia. 20(suppl. 6), 2-16.) VWF와의 관련성(The association)은 또한 면역원성 감소, 저해제 존재 시 효능 및 면역 관용 치료에서의 유용성과 관련이 있다. SIPPET 시험에서 VWF를 함유한 혈장 유래 FVIII(pdFVIII)의 상용 농축액을 사용하면 재조합 농축액(rFVIII)보다 면역원성이 낮은 것으로 나타났다(Peyvandi, F. et al. (2016) A randomized trial of Factor VIII and neutralizing antibodies in Hemophilia A, N Engl J Med. 374, 2054-64). pdFVIII 농축액의 면역원성 감소는 VWF 샤프론과 관련이 있으며, 이는 FVIII 분자의 중요한 에피토프(epitopes)를 가리거나 그리고/또는 수지상 세포(dendritic cells)에 의한 내세포화를 방지하는 것으로 생각된다(Astermark, J. (2015) FVIII inhibitors: pathogenesis and avoidance. Blood. 125(13), 2045-51). 또한 재조합 FVIII 분자는 대부분 인간화되지 않고 비인간 세포주에서 생산되어 비인간 글리칸 에피토프(non-human glycan epitopes)가 존재하여 잠재적으로 면역원성을 향상시킬 수 있다는 추가적인 합병증을 가지고 있다.
FVIII에서 이러한 에피토프에 대한 저해제의 생성은 혈우병 치료의 가장 빈번한 부작용으로 남아 있다 (Van den Berg et al. (2020). ITI treatment is not a first-choice in children with hemophilia A and low-responding inhibitors: Evidence from a PedNet study. Coagulation and Fibrinolysis. 120, 1166-1172). 이 위험은 이전에 치료받은 적이 없는 환자(PUP)의 경우 전체 생성률이 최대 40%에 달할 정도로 높으며(ibid.), FVIII 활성을 비활성화하여 이러한 환자를 보호하기 위한 대안적이고 비용이 많이 드는 조치가 필요합니다. 일부 환자에서는 면역관용 유도 요법(Immune tolerance induction therapy)이라는 오랜 시간이 걸리고 비용이 많이 드는 기술을 사용하여 저해제를 제거할 수 있지만 이 기술이 모든 환자에게 효과가 있는 것은 아니므로 대체 FVIII 요법을 사용할 수 없다. 저해제 생성의 위험은 대체 FVIII에 처음 노출된 후 처음 20 노출 일(EDs) 동안 가장 높으며, 75 노출 일(EDs)까지 지속된다. (Liesner, R.J. et al. (2021) Simoctocog alfa (NuwiqTM) in previously untreated patients with severe haemophilia A: final results of the NuProtect study. Thromb Haemost. online). 이 기간 동안 환자는 저해제 생성 여부를 모니터링해야 한다.
페길화 리포솜(PEGylated liposomes)과 FVIII의 비공유 결합은 FVIII의 반감기를 연장하여 주사 횟수를 줄이거나 더 적은 용량 또는 이 두 가지를 조합하여 사용할 수 있는 것으로 관찰되었다. 또한 페길화 리포솜은 에피토프 차폐와 반감기 연장의 조합을 통해 FVIII에 대한 저해제 발생 위험을 낮추는 것으로 관찰되었다.
리포솜 표면에 PEG를 추가로 도입하면 후자가 리포솜과 비공유 결합할 때 FVIII의 특성이 향상되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 요약
본 발명은 콜로이드 입자 및 선택적으로 FVIII을 포함하는 조성물, 방법, 키트 및 제형을 제공한다. 또한 FVIII 결핍이 있는 혈우병 환자를 치료하기 위한 조성물, 방법, 키트 및 제형이 제공되며, 이들 환자는 FVIII에 대한 저해제를 가지고 있을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
본 발명의 일 양태에서, 콜로이드 입자를 포함하는 조성물로,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 잔기(moiety)를 포함하는 제 1 양친매성 지질(amphipathic lipid), (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (phosphatidyl ethanolamine, PE), 포스파티딜 세린 (phosphatidyl serine, PS), 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 (phospholipid) 잔기를 포함하는 제 2 양친매성 지질(amphipathic lipid) 및 (iii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 구성된 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 포함하고, 상기 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하는 조성물이 제공된다.
상기 콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 비이온성 계면활성제에 대해 30:1~ 2:1 w/w의 비율로 포함하는 조성물이다({제1 양친매성 지질 + 제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제}).
상기 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬 에테르(polyalkylethers), 폴리락트산(polylactic acids) 및 폴리글리콜산(polyglycolic acids)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 500~약 5000달톤(Daltons), 바람직하게는 약 2000달톤 또는 약 5000달톤의 분자량을 가질 수 있다.
상기 제 2 양친매성 지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG)일 수 있으며, 예를 들어 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG2000) 또는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG5000)일 수 있다.
상기 포스파티딜콜린 (PC)이 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC)일 수 있다.
제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질은 90~110:10~1 또는 90~99:10~1(예: 100:3 또는 97:3)의 몰 비율(molar ratio)일 수 있다.
비이온성 계면활성제(non-ionic surfactant)는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트(polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate)일 수 있다.
제1 양친매성 지질, 제2 양친매성 지질 및 비이온성 계면활성제는 30~40:1:0~4 w/w({제1 양친매성 지질}:{제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제})의 비율로 구성될 수 있다.
상기 조성물은 Factor VIII(FVIII) 분자를 더 포함할 수 있다. 콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자는 10~20:1 또는 5~10:1과 같은 1~90:1의 화학량론적(stoichiometric ratio) 비율을 가질 수 있다.
상기 조성물은 치료 활성 화합물을 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한 부형제, 희석제 및/또는 보조제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 양태에서는, 콜로이드 입자를 포함하는 조성물로,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 잔기(moiety)를 포함하는 제1 양친매성 지질(amphipathic lipid) 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (phosphatidyl ethanolamine, PE), 포스파티딜 세린 (phosphatidyl serine, PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 (phospholipid) 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질(amphipathic lipid)을 포함하는 콜로이드 입자를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 제2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 양친매성 지질 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 분자량(molecular weight)이 약 2500~약 5000달톤인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 폴리에틸렌 글리콜은 약 2500~약 5000달톤, 바람직하게는 약 5000달톤의 분자량을 가질 수 있다.
제2 양친매성 지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG)과 같은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG5000)일 수 있다.
포스파티딜콜린(PC)은 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)일 수 있다.
제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질의 몰 비율은 90~99:10, 예를 들어 97:3일 수 있다.
상기 조성물은 (iii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트일 수 있다. 콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 비이온성 계면활성제에 대해 30:1 ~ 2:1 w/w의 비율로 포함할 수 있다({제1 양친매성 지질 + 제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제}).
상기 조성물은 Factor VIII(FVIII) 분자를 더 포함할 수 있다. 콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자는 10~20:1 또는 5~10:1과 같은 1~90:1의 화학량론적 비율을 가질 수 있다.
상기 조성물은 치료 활성 화합물(therapeutically active compound)을 더 포함할 수 있다. 조성물은 또한 부형제, 희석제 및/또는 보조제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 사용 준비가 완료된 수성 현탁액으로 제형화되거나 동결건조된 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 동결건조 제형은 적절한 희석제, 보조제 또는 부형제(예: 생리적으로 허용되는 완충제)와 함께 별도의 제형으로 제공될 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 이러한 조성물은 별도의 제형으로서 Factor VIII를 추가적으로 포함하거나 본 명세서에 설명된 바와 같이 콜로이드 입자와 함께 제형화될 수 있다.
본 발명의 제3 양태에서는, 피험자의 혈우병 치료에 사용하기 위한 본 발명의 제 1 양태 또는 제 2 양태의 조성물이 제공된다.
혈우병은 선천성 혈우병(congenital haemophilia, cH) 또는 후천성 혈우병(acquired haemophilia, aH)일 수 있다.
피험자는 소아 환자일 수 있다.
본 발명의 제4 양태에서는, 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태의 조성물을 투여하여 피험자에서 혈우병을 치료하는 방법이 제공된다.
혈우병은 선천성 혈우병(cH) 또는 후천성 혈우병(aH)일 수 있다.
피험자는 소아 환자일 수 있다.
이 방법은 Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 별도 또는 동시 투여하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 제5 양태에서는 (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질 및 (iii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 포함하며, 상기 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다. 상기 콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질 및 제2 양친매성 지질을 비이온성 계면활성제에 대해 비율이 30:1 ~ 2:1 w/w의 비율을 포함한다({제1 양친매성 지질 + 제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제}).
본 발명의 제6 양태에서는, 피험자에 혈우병을 치료하기 위한 별도, 동시 또는 후속 사용을 위한 키트로, (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질 및 (iii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 포함하며, 상기 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다. 상기 콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질 및 제2 양친매성 지질을 비이온성 계면활성제에 대해 비율이 30:1 ~ 2:1 w/w의 비율을 포함한다({제1 양친매성 지질 + 제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제}).
본 발명의 제7 양태에서는, (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하고, 상기 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 생체 적합성 친수성 폴리머는 분자량이 약 2500~약 5000달톤인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
본 발명의 제8 양태에서는, 피험자에 혈우병을 치료하기 위한 별도, 동시 또는 후속 사용을 위한 키트로, (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하며, 여기서 상기 제2 양친매성 지질은 생체 적합 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 분자량이 약 2500~약 5000달톤인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
본 발명의 제9 양태에서, 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태의 약학 조성물의 제형이 제공된다.
실시예에서, 콜로이드 입자 내의 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 제2 양친매성 지질은 더 큰 분자량의 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 양친매성 지질로 대체될 수 있으며, 예를 들어, DSPE-PEG2000은 DSPE-PEG5000으로 대체될 수 있다.
다른 실시예에서, 콜로이드 입자 내의 제1 양친매성 지질 및 제2 양친매성 지질의 비율은 콜로이드 입자 내의 생체 적합성 친수성 폴리머의 총 분자량을 증가시키기 위해 증가될 수 있다.
실시예에서, 콜로이드 입자 내의 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 제2 양친매성 지질은 더 큰 분자량의 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 양친매성 지질로 대체될 수 있고, 콜로이드 입자의 지질 이중층 막에 페길화된 비이온성 계면활성제(PEGylated non-ionic surfactant)가 첨가될 수 있다.
본 발명의 설명
본 발명은 콜로이드 입자 및 선택적으로 FVIII을 포함하는 조성물, 방법, 키트 및 제형을 제공한다. 또한 FVIII 결핍이 있는 혈우병 환자를 치료하기 위한 조성물, 방법, 키트 및 제형도 제공되며, 이들 환자는 FVIII에 대한 저해제를 가지고 있을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
FVIII에 대한 저해제(Inhibitors) 또는 항체 저해제(antibody inhibitors)는 항체 저해제(antibodies) 또는 중화 항체(neutralising antibodies)라고도 하는 FVIII에 대한 항체를 지칭한다. 항체는 내인성 FVIII에 대한 자가 항체 또는 외인성 FVIII에 대한 항체일 수 있다.
위에서 설명한 제1양태에 따라, 콜로이드 입자는 (i) 제1 양친매성 지질, (ii) 제2 양친매성 지질 및 (iii) 비이온성 계면활성제를 포함한다. 제1 양친매성 지질은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 잔기(moiety)일 수 있다. 포스파티딜콜린(PC) 잔기에의 적절한 예는 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)일 수 있다. 제 2 양친매성 지질은 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜 세린(phosphatidyl serine, PS), 및 포스파티딜 이노시톨(phosphatidyl inositol, PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기이다. 포스파티딜 에탄올아민(PE)의 적절한 예는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올-35아민(DSPE)일 수 있다. 아미노프로판디올 디스테아로일(Aminopropanediol distearoyl, DS) 지질은 양친매성 지질인 카바메이트 연결 비하전성 지질 폴리머(a carbamate-linked uncharged lipopolymer)이다. 포스파티딜 에탄올아민(PE)의 다른 예로는 DPPE, DMPE 및 DOPE가 있다. 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄(polyoxyethylene sorbitans), 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트(polyhydroxyethylene stearates) 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르(polyhydroxyethylene laurylethers)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 비이온성 계면활성제의 적절한 예는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트(폴리소르베이트 80(polysorbate 80 ) 또는 트윈 80이라고도 함)일 수 있다. .
본 발명의 콜로이드 입자는 전형적으로 지질 소포(the form of lipid vesicles) 또는 리포솜(liposomes)의 형태이며 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 콜로이드 입자에 대한 참조는 문맥에 달리 명시되지 않는 한 리포솜 및 지질 소포를 포함한다.
콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질 및 제2 양친매성 지질을 비이온성 계면활성제에 대하여 30:1 ~ 2:1 w/w의 비율로, 적절하게는 25:1, 20:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1 또는 5:1 w/w({제1 양친매성 지질 + 제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제})로 구성할 수 있다. 몰 비율로 표현하면, 예를 들어 10~20:1, 12~18:1, 14~16:1, 적절하게는 14:1, 15:1 또는 16:1이 될 수 있다. 계면활성제 농도는 중량 대비 0.25%에서 5%, 예를 들어 1%~ 3%, 1%~ 2%일 수 있으며, 일부 예시적인 값은 0.47%, 0.85% 또는 3.5%일 수 있다.
비이온성 계면활성제는 페길화(PEGylated)될 수도 있다. 페길화 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트(폴리소르베이트 80 또는 트윈 80이라고도 함)일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 생체 적합성 폴리머는 분자량이 약 100~약 10,000 Da, 적합하게는 약 2000~약 5000 Da일 수 있으며, 바람직한 값은 약 100 Da, 250 Da, 350 Da, 550 Da, 750 Da, 1000 Da, 1500 Da, 2000 Da, 2500 Da, 3000 Da, 3500 Da, 4000 Da, 4500 Da, 5000 Da, 5500 Da, 6000 Da, 6500 Da, 7000 Da, 7500 Da, 8000 Da, 8500 Da, 9500 Da 및 10,000 Da일 수 있다.
비이온성 계면 활성제는 콜로이드 입자와 연관되거나, 콜로이드 입자의 지질 이중층 막(the lipid bilayer membrane)에 통합되거나, 콜로이드 입자의 지질 이중층 막의 외층에 통합되거나, 콜로이드 입자의 내부 층 지질 이중층 막에 통합될 수 있다.
제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기이다.
생체 적합성 친수성 폴리머의 목적은 콜로이드 입자를 입체적으로 안정화하여 시험관 내에서(in vitro) 콜로이드 입자의 융합을 방지하고 생체 내(in vivo) 망상 내피 시스템(reticuloendothelial system)에 의해 콜로이드 입자가 흡착을 피할 수 있도록 하는 것이다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 분지형(branched) 또는 비분지형(unbranched)일 수 있다. 생체 적합성 폴리머는 분자량이 약 100~약 10,000 Da, 적합하게는 약 2000~약 5000 Da일 수 있으며, 바람직한 값은 약 100 Da, 250 Da, 350 Da, 550 Da, 750 Da, 1000 Da, 1500 Da, 2000 Da, 2500 Da, 3000 Da, 3500 Da, 4000 Da, 4500 Da, 5000 Da, 5500 Da, 6000 Da, 6500 Da, 7000 Da, 7500 Da, 8000 Da, 8500 Da, 9500 Da 및 10,000 Da일 수 있다. 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질의 적절한 예로는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG)일 수 있다(예: N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000)) 및 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG5000)).
제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질은 90~110:10~1, 90~100:10~1, 90~99:10~1, 93~99:7~1, 95~99:5~1의 몰비로, 적합하게는 101:3, 100:3, 99:3, 98:3, 97:3, 96:3 또는 95:3의 몰비로 제공될 수 있다. 97.3의 몰 비율은 32.4:1의 몰 비율로 표현할 수도 있고, 마찬가지로 100:3의 몰 비율은 33.2:1의 몰 비율로 표현할 수 있다. 또한 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질의 비율은 예를 들어, 1:1~20:1 w/w, 적합하게는 2:1~12:1 w/w 또는 4:1~9:1 w/w, 예를 들어 4:1, 5:1, 6:1, 9:1 또는 12:1 w/w의 중량/중량비(weight/weight ratio)로 표현될 수 있다. 바람직하게, 상기 조성물은 팔미토일-올레오일 포스파티딜 콜린(POPC)과 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올-아민(DSPE)의 혼합물로 구성된 콜로이드 입자를90~99:10~1, 93~99:7~1, 95~99:5~1의 몰 비율(POPC:DSPE)로서, 적합하게는 97:3에 포함시킬 수 있다. 중량/중량비로 표현하면, 예를 들어 1:1~20:1 w/w, 적합하게는 2:1~12:1 w/w, 예를 들어 4:1, 5:1, 6:1, 9:1 또는 12:1 w/w가 될 수 있다.
일례로, 콜로이드 입자는 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000)을 97:3 몰 비율 또는 9:1 w/w 비율로 구성될 수 있다.
따라서, 제 1 양친매성 지질과 제 2 양친매성 지질과 비이온성 계면 활성제의 비율은 2~10:1:0~2, 3~9:1:0.5~1.5, 4~9:1:0.5~1 w/w, 적합하게는 9:1:0, 9:1:1, 4:1:0 또는 4:1:0.5 w/w로 제공될 수 있다 ({제1 양친매성 지질}:{제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제}). 몰 비율로 표현하면, 예를 들어 30~40:1:0~5, 30~35:1:0~2.5, 30~35:1:0~2.5, 적합하게는 33:1:0, 33:1:2 또는 32:1:3이 될 수 있다.
콜로이드 입자는 직경(diameter) 0.05~0.0.3μm 범위의 평균(mean) 입자 크기(평균 입자 크기, average particle size)를 가질 수 있으며, 적합하게는 0.1, 0.15, 0.2 또는 0.25 microns(μm) 정도이다. 평균 입자 크기(평균 입자 크기)는 100~130 nanometres(nm), 적합하게는 110~120nm, 112~118nm, 150~170nm, 155~165nm, 보다 적합하게는 110, 112, 114, 116, 118, 120, 160, 162, 164, 166, 168 또는 170nm가 될 수 있다.
평균 입자 크기는 Malvern Zetasizer Ultra ZSU 5700을 사용하여 측정할 수 있다. 이 기기는 빛의 산란을 통해 입자 크기를 측정하는데, 레이저 빛을 시료에 비추고 입자에 부딪히는 후방 산란이 173°의 각도에서 감지된다(173°는 거의 자체로 되돌아오는 각도이므로 후방 산란이라는 용어가 사용됨). 입자의 브라운 운동(Brownian motion)으로 인해 빛은 다양한 강도로 산란된다. 브라운 운동의 속도는 입자 크기와 관련이 있기 때문에 스토크스-아인슈타인 관계식(Stokes-Einstein relationship)을 통해 입자 크기를 유추할 수 있다.
평균 입자 크기는 콜로이드 입자의 평균 직경에 해당한다. 입자 크기 측정과 관련하여 인용된 다분산 지수(polydispersity index, PDI)는 콜로이드 입자의 평균 직경 주위의 분포 측정에 해당한다. 예를 들어, 본 발명에서 다분산 지수는 최대 0.2, 적합하게는 0.15, 0.12, 0.1 또는 0.5가 될 수 있다.
PDI는 표준편차/평균의 제곱으로 계산된다(예: PDI = (s/m)2 ).
평균 입자 크기와 다분산 지수를 통해 표준 편차를 계산할 수 있다. 표준 편차의 두 배를 사용하면 입자 크기 주변의 95% 신뢰 구간, 즉 시료에 있는 콜로이드 입자의 95%가 속하는 범위를 계산할 수 있다.
적합하게는, 95% 평균 입자 크기는 50~500nm, 적합하게 50~290nm, 50~285nm, 65~265nm, 65~260nm, 65~180nm, 65~175nm, 65~170nm, 65~165nm, 더 적합하게 65~173nm, 64~161nm, 65~263nm 또는 54~282nm가 될 수 있다.
상기 조성물은 또한 Factor VIII(FVIII) 분자 또는 그 단편(fragment)을 더 포함할 수 있다. 조성물이 Factor VIII 단편을 포함하는 경우, Factor VIII 단편은 생물학적 활성을 유지하는 활성 단편이거나 네이티브 Factor VIII 분자와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 것이 적합할 수 있다. 예를 들어, 그러한 활성 단편 중 하나는 B-도메인이 절단된 Factor VIII 단편이다. 또한, 조성물은 네이티브 혈액 인자 및 그 단편을 모두 포함할 수도 있다. 콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자는 1~ 90:1 화학양론적 비율로 제공될 수 있으며,
바람직하게는 2~ 90:1, 5~ 85:1, 6~ 10:1, 7~ 8:1, 7.5~ 20:1, 10~ 80:1, 10~15:1, 10~ 16:1, 10~ 20:1, 13~ 19:1, 15~ 16:1, 15 ~ 75:1, 20~ 70:1, 25~ 65:1, 30~ 60:1, 35~ 55:1, 40~50:1 등, 예를 들어 10~ 20:1 및 5~10:1과 같은 비율로 제공될 수 있다. 다르게 표현하면, 콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자는 1:1, 2:1, 5:1, 7.5:1, 10:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 22:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 86:1, 90:1 등, 예를 들어 15.5:1, 13:1, 8:1, 7.7:1, 7:1의 화학양론적 비율로 제공될 수 있다. 보다 구체적으로 전체 길이의 FVIII 분자의 경우, 화학양론적 비율은 10:1~ 19:1이며 최적은 10~ 15:1 또는 5~ 10:1이며 최적은 7.5:1일 수 있다. 베타-도메인이 삭제되거나 베타-도메인이 절단된 FVIII 분자의 경우 범위는 13~ 19:1이며 최적은 10~ 16:1 또는 6~ 10:1이며 최적은 8:1일 수 있다.
이론에 얽매이고 싶지 않지만, 조성물에 존재하는 과량의 콜로이드 입자는 유리 콜로이드 입자(free colloidal particles)가 다른 핵심 혈액 응고 인자(예: A형 혈우병의 경우 FVII 및 FIX)와 가역적으로 결합할 수 있는 충분한 양이며, 입자 관련 Factor VIII(FVIII)가 투여 후 혈소판에 포집되어 가역적으로 결합하여 혈소판에 인자를 농축하고 혈액 외 응고 경로를 촉진할 수 있다고 추정된다.
Factor VIII는 적합한 공급원으로부터 얻을 수 있으며 분자생물학적 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술로 생산되거나 화학적으로 합성되거나 포유류의 모유에서 형질전환적으로 생산된 재조합 단백질일 수도 있고 천연 공급원(예: 혈장으로부터 정제된)에서 분리된 Factor VIII일 수도 있다. 적합한 Factor VIII는 인간 Factor VIII와 같은 포유류 Factor VIII이다.
Factor VIII와 같은 혈액 인자는 표면 부착 특성을 가지고 있다. 이는 혈액 응고 과정의 필수적인 특징으로, 효소와 보조 인자가 다른 응고 참여 물질, 혈소판 표면 및 부상 부위의 조직에 부착되어야 한다. 혈전이 부상 부위에 남아 위험한 혈전증을 유발하기 위해 표류하지 않도록 하는 것이 특히 중요한다. Factor VIII와 같은 혈액 인자는 유리 및 플라스틱 표면에 과도하게 달라붙기 때문에 이러한 특성은 의약품 제형에 어려움을 준다. 실제로 폴리옥시 에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트 폴리소르베이트(Tween®80)와 같은 비이온성 계면활성제를 광범위하게 사용하면 이러한 문제를 완화할 수 있다.
콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자의 화학량론적 비율(stoichiometric ratio)을 결정하려면 다음 계산을 수행해야 한다. 먼저 FVIII IU당 FVIII 분자를 결정해야 한다. FVIII의 질량은 FVIII의 변형(예: 전체 길이와 β-도메인 삭제)에 따라 달라진다는 점에 유의해야 한다. 두번째로 콜로이드 입자 그램당 입자 수를 결정해야 한다. 마지막으로, 이에 따라 화학량론적 비율을 결정할 수 있다. 35 IU/kg FVIII(베타 도메인 삭제 및 전장 모두)과 22 mg/kg PEGLip을 사용한 계산의 예는 다음과 같다:
계산 예제 1, 베타 도메인이 삭제된 rFVIII
계산 예제 2, 전체 길이 rFVIII
상기 조성물은 추가적인 치료 활성 화합물 또는 분자, 예를 들어 항염증제, 진통제 또는 항생제, 또는 Factor VIII의 활성을 촉진하거나 향상시킬 수 있는 기타 약학 활성제를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 임의의 적합한 부형제, 희석제 및/또는 보조제를 더 포함할 수 있다. 완충액과 같은 적절한 희석제는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 수용성 염과 적절한 산으로 제형화될 수 있다. 적합한 완충액은 아미노산(예: 히스티딘), 무기산의 염(예: 구연산, 젖산, 숙신산, 구연산 및 인산으로 이루어진 군으로부터 선택된 산) 및 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속(예: 나트륨 염, 마그네슘 염, 칼륨 염, 리튬 염 또는 칼슘 염 - 예: 염화나트륨, 인산염 나트륨 또는 구연산 나트륨)을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 부형제, 완충제 및/또는 보조제의 예로는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS), 인산 칼륨, 인산 나트륨 및/또는 구연산 나트륨 등이 있다. 기타 생물학적 완충제에는 PIPES, MOPS 등이 포함될 수 있다.
적합한 수성 구연산염 완충액(aqueous citrate buffer)은 구연산 나트륨 완충액 또는 구연산 칼륨 완충액(예: 50mM 구연산 나트륨 완충액)일 수 있다. 적합한 인산염 완충액은 인산나트륨 완충액, 예를 들어 25mM 인산나트륨 완충액일 수 있다.
조성물에 적합한 pH 값은 일반적으로 생체 내(in vivo) 투여에 허용되는 모든 pH 값(예: pH 5.0~pH 9.0, 적합하게는 pH 6.7~pH 7.4 또는 pH6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.2)을 포함한다. pH는 적절한 산 또는 알칼리(예: 염산)로 적절히 조정할 수 있다.
본 발명의 조성물은 사용 준비가 완료된 수성 현탁액으로 제형화되거나 동결건조된 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 동결건조 제형은 적절한 희석제, 보조제 또는 부형제(예: 생리적으로 허용되는 완충제)와 함께 별도의 제형으로 제공될 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 이러한 조성물은 별도의 제형으로서 Factor VIII를 추가로 포함하거나 본 명세서에 설명된 바와 같이 콜로이드 입자와 함께 제형화될 수 있다. 일반적으로 재구성을 위해 동결건조된 Factor VIII(FVIII) 한 바이알(vial)과 별도의 콜로이드 입자(PEGLip) 용액 한 바이알이 제공된다.
콜로이드 입자는 수성 구연산염 완충액에 총 지질 9%(w/v)의 현탁액으로 저장할 수 있으며, 적절하게는 총 지질 7%, 6%, 5%, 4%(w/v)의 현탁액으로 저장할 수 있다. 환자에게 필요한 외인성 Factor VIII(FVIII)의 농도가 알려지면, 필요한 경우 벌크 용액을 50mM 구연산나트륨 용액으로 희석하여 콜로이드 입자의 농도를 조정하여 Factor VIII(FVIII)가 첨가될 때 원하는 비율의 콜로이드 입자 대 Factor VIII(FVIII) 분자를 얻을 수 있도록 할 수 있다.
Factor VIII는 전적으로 외인성일 수 있으며, 예를 들어 저해제가 있는 중증 혈우병 환자의 경우, 혈장 농축액에서 추출하거나 재조합하여 생산할 수 있다. 또는 환자가 Factor VIII를 자가 제조할 수 있는 능력을 어느 정도 보유하고 있는 경우(예: 경증 또는 중등도 혈우병 환자 또는 후천성 혈우병 환자), 외인성 Factor VIII를 더 적은 양 또는 전혀 투여하지 않을 수 있다.
이론에 얽매이고 싶지 않지만, 조성물에 존재하는 과량의 콜로이드 입자가 유리 콜로이드 입자가 다른 핵심 혈액 응고 인자(예: A형 혈우병의 경우 FVII 및 FIX)와 가역적으로 결합할 수 있을 만큼 충분한 양으로 존재하여 투여 후 혈소판에 포집되어 가역적으로 결합하여 혈소판에 응고 인자를 집중시키고 외인성 혈액 응고 경로를 촉진할 수 있다는 추정이 있다.
주입(injection) 시 콜로이드 입자는 혈소판 표면에 가역적으로 결합하여 다른 혈소판의 막과 융합한다. 콜로이드 입자 입자가 이미 외인성 Factor VIII와 결합되어 있는 경우, 이는 혈소판 표면에 Factor VIII를 집중시키고 일부는 혈소판으로 포식되거나 생성되는 TF 함유 친응고성 미립자와 결합하여 단백질을 저해제 및 정상적인 제거 메커니즘(예: LRP-1)으로부터 보호하여 단백질의 반감기가 길어지게 한다. 중등도 또는 경증 혈우병 환자의 경우, 콜로이드 입자는 또한 순환하는 Factor VIII를 포집하여 혈소판 또는 생성되는 TF 함유 친응고성 미립자 내에 농축시킨다. 주사 시(injection) Factor VIII와 관련이 없는 콜로이드 입자는 FVII뿐만 아니라 다른 내인성 혈액 인자(예 FIX)를 혈소판 표면에서 포집하고 이를 생성된 TF 함유 친응고성 미립자와 결합하기 시작한다; 또한 인자가 부착되지 않은 입자도 혈소판 표면에 결합 및 융합하여 TF 함유 친응고성 미립자를 형성하고 혈액 응고 과정의 소용돌이 동안 혈소판 반응 표면에서 활성화된 형태인 FVIIa 및 FIXa를 포함한 추가 인자를 포집 및 집중시키는 기회주의적 함정으로 작용할 수 있다.
일반적으로 내피가 손상되면 조직 인자는 FVII를 FVIIa로 전환하여 결합한다. 그런 다음 TF-FVIIa 복합체는 활성화된 혈소판 표면으로 이동하여 결합한 후 FX를 FXa로 전환하여 프로트롬빈을 절단하여 트롬빈을 생성하기 시작하는데, 이 과정은 FXa가 (활성화된 혈소판에서 방출된) FVIIa와 결합하여 프로트롬비나제 복합체를 형성하고 활성화된 혈소판의 노출된 막 표면과 이로부터 파생된 TF 함유 친응고성 미립자에도 조립될 때 최적화된다. 본 발명은 FVII를 이 반응 표면에 근접하게 배치하여 많은 TF 함유 친응고성 미립자로 조각이 났을 수 있다. 따라서 콜로이드 입자, 즉 혈소판과 미립자에 결합된 상태로 남아있는 FVIIa로의 전환과 TF-FVIIa 복합체의 형성은 혈소판과 그 미립자의 반응 표면에서 두 가지 중요하고 즉각적인 효과와 함께 발생한다:
1)
이러한 혈소판 및 TF 함유 친응고성 미립자 표면에서도 FX가 FXa로 국소적으로 전환되어 FV('프로트롬비나제 복합체(prothrombinase complex)')와 결합하여 고도로 국소화된 트롬빈 버스트를 생성함으로써 피브린의 생산을 시작하고 동시에 증폭 단계를 촉매화하며;
2)
콜로이드 입자를 통해 공동 국소화(co-localised)된 FVIII과 연관될 수 있는 FIX에서 FIXa로의 국소적(localised) 전환은, 동일한 막 표면에 테나제 복합체를 형성하여, 위의 (1)에서 증가된 개시 단계에 의해 촉매된 증폭 단계를 공급하고 최적화한다. 대안적으로, 또한 콜로이드 입자 막은 대체 테나제 복합체를 형성하여 FX를 FXa로 유인하고 전환할 수 있다.
혈액 응고 과정이 시작되고(initiated) 피브린(fibrin)이 생성되면 혈소판은 일반적으로 응고하여 피브린 메시(fibrin mesh)를 채운다. 콜로이드 입자가 혈소판과 결합하고 융합하는 능력은 혈소판이 그물망에서 서로 접착력을 강화하여 혈전을 안정화시키는 최종 역할을 한다.
본 발명은 여러 가지 방식으로 작용하여 제한된 양의 FVIII과 FVIII에 대한 저해제가 모두 존재할 때 FX를 FXa로 전환하는 것을 개선할 수 있다. 첫째, FX의 FXa 전환을 촉매화하기 위해 FIXa와 테나제 복합체(tenase complex)를 형성할 수 있는 제한된 양의 FVIII의 잠재력을 보호, 향상 및 극대화함으로써; 둘째, FVIIIa의 작용을 모방하고 FIXa와 결합하여 대체 테나제 복합체를 형성하여 FX를 FXa로 전환하는 촉매화함으로써; 셋째, TF 함유 친응고성 미립자의 생산을 통해 외인성 경로를 상향 조절하고, 외인성 테나제 복합체를 통해 FX를 FXa로 전환하는 것을 자극하기 위해 FVII/FVIIa를 농축함으로써; 마지막으로, 상향 조절된 외인성 경로를 통해 FIX를 FIXa로 전환하여 내인성 테나제 복합체의 형성을 촉진한다. 이러한 작용을 통해 본 발명은 내인성 경로의 테나제 복합체에서 FVIII의 활성을 보호, 보존 및 극대화하는 동시에 테나제 복합체에서 FVIIIa의 기능을 모방하고 동시에 외재 경로의 상향 조절을 통해 해당 경로를 우회함으로써 다양한 작용 모드를 갖는다.
콜로이드 입자는 외인성 경로를 통해 FX에서 FXa로의 전환을 향상시키는 우회제 역할을 할 뿐만 아니라, FVIII을 보호하고 FIX/FIXa를 농축하여 테나제 복합체 형성을 가속화하거나 FIXa와 FVIII 독립적인 테나제 복합체를 형성함으로써 내인성 경로를 증폭하는 이중 작용을 한다. 강화된 개시(외인성) 및 증폭(내인성) 단계를 함께 사용하면 응고가 더 빨리 시작되고 특히 저해 항체가 있는 경우 일반적으로 감소된 Factor VIII 양으로 가능한 것보다 더 단단한 응고로 결합할 수 있는 섬유소가 더 빨리 생성되어 환자의 출혈을 더 빨리 해결할 수 있다.
따라서 본 발명은 콜로이드 입자의 능력, 특히 혈소판 표면과 혈소판 내부에 정확한 양의 내인성 및 외인성 Factor VIII를 농축하는 콜로이드 입자와 Factor VIII의 특정 배합 비율에 의존할 뿐만 아니라 TF 함유 친응고성 미립자의 생산을 자극하는 능력에 의존한다. 따라서 A형 혈우병의 경우 Factor VIII 저해제가 있는 경우 제한된 양의 Factor VIII로 트롬빈 생성의 시작을 가속화하는 시너지 효과와 함께 TF-FVIIa 중심의 개시 단계(TF-FVIIa-centric initiation phase)와 혈액 응고 과정의 증폭 단계(amplification phase)가 모두 최적화된다).
주입된(injected) 외인성 Factor VIII은 저해제와 정상적인 제거 메커니즘에 의해 분해되지 않고 혈소판에서 인자를 농축하고 TF 함유 친응고성 미립자의 가속화 효과를 통해 더 나은 품질의 혈전이 더 빨리 형성되기 때문에 본 발명은 유전자 치료를 통해 혈소판에서 이소성(ectopic) FVIII을 생성함으로써 발견되는 것처럼 다른 공급 방법보다 Factor VIII를 절약할 수 있는 인자가 될 것이다. 이러한 이점은 환자의 주사 횟수를 줄이거나 주사 횟수를 줄여 처방된 치료의 순응도를 높이고 우발적이고 치명적인 출혈의 가능성을 낮추는 데 도움이 될 것이다.
본 발명은 외인성 Factor VIII 및 내인성 인자(FVII/FVIIa 및 FIX/FIXa)를 혈소판 내외에 집중시키지만, 유전자 치료를 통해 혈소판에서 이소성 FVIII을 생산하려는 성공적인 시도와 달리 장기간의 생성 프로그램, 규제 부담 또는 바이러스 매개 유전자 치료의 비가역적 특성을 필요로 하지 않는다.
본 발명은 치료하고자 하는 질환에서 정상보다 낮은 수준의 제한된 양의 Factor VIII(예를 들어 A형 혈우병(HA)의 경우 FVIII)의 효과를 농축 및 증폭함으로써 Factor VIII를 절약할 수 있을 것으로 기대된다, 혈우병 환자, 특히 저해 항체가 단백질을 파괴하여 보호되지 않기 때문에 일반적으로 Factor VIII를 투여할 수 없는 저해제 환자의 경우 지혈을 위해 일반적으로 필요한 주사 횟수를 줄이거나 더 적은 용량을 투여할 수 있게 해줄 수 있다.
본 발명은 새로 엔지니어링된 Factor VIII 분자 또는 이러한 분자 또는 활성화된 형태의 모방체(mimetic)를 만드는 접근 방식과 달리, 재조합 인간(recombinant human) FVIII(rhFVIII)과 같이 분자에 외부 서열을 엔지니어링할 필요 없이 현재의 모든 혈장 유래 또는 재조합 Factor VIII 분자와 함께 사용할 수 있다. 따라서 인식되지 않은 새로운 단백질에 대한 면역 조절 반응이 발생할 위험이 줄어든다.
이 두 가지 접근법, 즉 혈소판에서 FVIII을 생산하거나 모방체(mimetic)을 사용하는 것과 달리, 본 발명은 외인성, 촉진 경로의 외인성 성분을 농축할 뿐만 아니라 내인성 인자를 농축하고 TF 함유 친응고성 미립자의 생성을 자극하여 빠른 트롬빈 버스트로 내인성 경로를 증폭시키고, 외인성 경로의 다른 주요 성분(FIXa)의 국소 생성을 촉진하여 새롭고 매우 필요한 이중 작용을 가지고 있다. 이는 Factor VIII 수준이 다시 떨어지면 트롬빈 생성으로 가는 일반적인 경로(the common pathway)를 계속 유도할 수 있게 한다.
본 발명의 사용은 유리 Factor VIII보다 Factor VIII를 절약한다. 이는 환자의 편의성(주사 횟수 감소), 순응도 개선(예방 주사 누락 감소), 의료 경제성 개선(Factor VIII 비용 절감, 혈우병 환자의 순응도가 떨어지고 출혈이 발생했을 때 응급 주입 횟수 감소)을 의미한다.
본 발명은 표준 혈장 유래 또는 재조합 생산 형태의 Factor VIII를 사용할 수 있게 함으로써 저해제가 있는 A형 혈우병 환자에게 Factor VIII 예방 치료를 가능하게 하는 비용 효율적인 솔루션을 제공하는 것이 궁극적인 목표이다.
본 발명의 사용은 저해제를 사용하는 혈우병 환자에서 우회제로서 외인성 FVIIa를 사용하는 것보다 절약된다. 본 발명은 환자 자신의 FVII를 사용할 뿐만 아니라 혈소판에서 이를 농축하고 TF 함유 친응고성 미립자의 생성을 자극하여 FVII의 효과를 극대화함으로써 외인성 FVIIa의 비용과 단백질 과다 투여로 인한 혈전 반응의 우려를 피할 수 있다.
조성물은 주사 또는 주입, 바람직하게는 정맥, 피하, 피내 또는 근육 내 투여로 투여할 수 있다. 주사는 단일 용량의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 주입은 장기간에 걸쳐 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 적어도 하루에 1회, 적어도 하루에 2회, 일주일에 약 1회, 주당 약 2회, 2주에 약 1회 또는 한 달에 약 1회 투여할 수 있다. 또한, 본 조성물은 FVIII의 혈중 농도가 일정한 수준으로 유지되도록 간격을 두고 투여 및/또는 재투여될 수 있으며, 환자의 혈중 FVIII 농도가 치료 이하 또는 치료와 무관한 수준에 도달할 때까지 재투여를 기다릴 필요 없이 지속적이고 일정하며 예측 가능한 치료 효과를 제공할 수 있다. 기존의 관행에서는 일반적으로 피험자에게 "건강한 수준(healthy levels)" 또는 치료 효과/관련성 있는 수준의 FVIII이 혈류에 여전히 존재하는 동안에는 후속 용량의 FVIII을 투여하지 않는다. 따라서, 본 발명은 예방에 보다 이상적으로 적합한 혈류 내 FVIII의 치료적 수준을 보다 일관되게 제공한다.
피험자의 혈액에서 치료 이하 또는 치료와 무관한 수준의 FVIII은 환자가 전혈 응고 시간을 20분 이하, 15분 이하 또는 12분 이하로 유지할 수 없는 경우로 특징지을 수 있다.
본 발명은 환자가 20분 이하, 15분 이하 또는 12분 이하의 전혈 응고 시간을 유지할 수 있는 조성물을 제공한다.
놀랍게도 생체 적합성 폴리머로 유도된 콜로이드 입자(리포좀)와 결합된 혈액 인자 제제가 피하 투여에 성공하여 혈우병 환자에게 치료적으로 효과적인 용량의 혈액 인자를 투여할 수 있다는 사실이 밝혀졌다.
본 발명의 실시예에서, PEG는 혈액 인자와 결합하기 전에 소포 형성 중에 콜로이드 입자에 통합된다. 혈액 인자의 특정 아미노산 서열은 리포솜 외부에 있는 PEG 분자의 카바메이트(carbamate) 기능에 비공유 결합할 수 있는 것으로 여겨진다.
콜로이드 입자는 혈액 인자를 캡슐화하지 않는다. 혈액 인자는 리포솜 외부 표면의 폴리머 사슬과 비공유적으로 상호 작용하며 폴리머 사슬을 활성화하기 위한 화학 반응은 수행되지 않는다. 혈액 인자와 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 리포솜 사이의 상호작용의 특성은 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 수소 결합 및 반데르발스 인력과 같은 비공유 메커니즘에 의해 이루어질 수 있다(Arakawa, T. and Timasheff, S. N., Biochemistry 24: 6756- 6762 (1985; Lee, J. C. and Lee, L. L. Y., J. Biol. Chem. 226: 625-631 (1981)). 이러한 폴리머의 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다.
친수성 폴리머로 유도체화된 소포 형성 지질을 제조하기 위해 다양한 알려진 결합 반응이 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리머(예: PEG)는 시아누릭 염화물기(cyanuric chloride group)를 통해 포스파티딜 에탄올아민(PE)과 같은 지질로 유도체화될 수 있다. 또는, 캡핑된 PEG를 카르보닐 디이미다졸 결합 시약으로 활성화하여 활성화된 이미다졸 화합물을 형성할 수도 있다. 카르바메이트 연결 화합물(carbamate-linked compound)은 MPEG(메톡시PEG)의 말단 수산기를 p-니트로페닐 클로로포메이트(p-nitrophenyl chloroformate)와 반응시켜 p-니트로페닐 탄산염(p-nitrophenyl carbonate)을 생성하여 제조할 수 있다. 이 생성물을 1- 아미노-2,3- 프로판디올과 반응시켜 중간 카르바메이트를 생성한다. 디올(diol)의 수산기를 아실화하여 최종 생성물을 얻는다. 1- 아미노-2, 3- 프로판디올 대신 글리세롤을 사용하는 유사한 합성을 사용하여 WO 01/05873에 설명된 대로 탄산염 연결 생성물을 생산할 수 있다. 다른 반응은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 US 5,013,556에 설명되어 있다.
콜로이드 입자(리포솜)는 다양한 파라미터에 따라 분류할 수 있다. 예를 들어 라멜라(lamellae)의 크기와 개수(구조적 파라미터)를 파라미터로 사용할 경우 리포솜(liposomes)은 크게 세 가지 유형으로 설명할 수 있다: 다라멜라 소포(Multilamellar vesicles, MLV), 작은 단라멜라 소포(small unilamellar vesicles, SUV), 큰 단라멜라 소포(large unilamellar vesicles, LW).
MLV는 건조 인지질이 겔에서 액정 상전이 온도(Tm) 이상으로 수화될 때 자연적으로 형성되는 종이다. MLV의 크기는 이질적이며 그 구조는 동심원의 수성층과 지질층이 번갈아 가며 있는 양파 껍질과 유사하다.
SUV는 초음파 처리(sonication) 또는 압출(extrusion), 고압 균질화(high pressure homogenisation) 또는 고전단 혼합(high shear mixing)과 같은 기타 방법으로 MLV에서 형성되며 단층이다. 표면 대 부피 비율이 높은 가장 작은 종으로, 지질 무게 대비 수성 공간의 포집 부피가 가장 낮다.
세 번째 유형의 리포솜 LUV는 큰 수성 구획과 단일(단라멜라) 또는 소수(올리고라멜라(oligolamellar)) 지질층을 가지고 있다. 자세한 내용은 D. Lichtenberg and Y. Barenholz, in “Liposomes: Preparation, Characterization, and Preservation, in Methods of Biochemical Analysis”, Vol. 33, pp. 337 - 462 (1988)에 공지되어 있다.
여기서 사용되는 "로딩"이라는 용어는 로딩될 생체 폴리머 물질의 모든 종류의 상호작용, 예를 들어 캡슐화, (소포의 내부 또는 외부 벽에 대한) 접착 또는 생체 폴리머 물질의 압출 유무에 관계없이 벽에 매립하는 것과 같은 상호작용을 의미한다.
본 명세서 및 상기에서 사용된 바와 같이, "리포솜(liposome)"이라는 용어는 콜로이드 입자를 의미하며, 자발적 또는 비 자발적으로 소포화될 수 있는 양친매성 화합물의 모든 구 또는 소포, 예를 들어 적어도 하나의 아실기가 복합 인산 에스테르로 대체된 인지질을 포함하도록 의도되었다. 리포솜은 유리 상태부터 액정까지 모든 물리적 상태로 존재할 수 있다. 대부분의 트리아실글리세라이드(triacylglycerides)가 적합하며, 본 발명에 사용하기에 적합한 가장 일반적인 인지질은 인산의 콜린 에스테르에 연결된 스테아르산, 팔미트산 및 올레산의 디글리세라이드의 혼합물인 레시틴(포스파티딜콜린(PC)이라고도 함)이다. 레시틴은 달걀, 콩, 동물 조직(뇌, 심장 등)과 같은 모든 동식물에 존재하며 합성적으로도 생산할 수 있다. 인지질의 공급원이나 합성 방법은 중요하지 않으며, 자연적으로 발생하거나 합성된 인지질은 모두 사용할 수 있다.
구체적인 인지질류(phosphatides)의 예로는 L-a-(디스테아로일) 레시틴(L-a-(distearoyl) lecithin), L-a-(디팔미토일) 레시틴(L-a-(dipalmitoyl) lecithin), L-a-포스파티드산(L-a-phosphatide acid), L-a-(딜라우로일)-포스파티드산(L-a-(dilauroyl)-phosphatidic acid), L-a(디미리스토일) 포스파티드산(L-a(dimyristoyl) phosphatidic acid), L-a(디올레오일)포스파티드산(L-a(dioleoyl)phosphatidic acid), DL-a(디팔미토일) 포스파티딘산(DL-a (di- palmitoyl) phosphatidic acid), L-a(디스테아로일) 포스파티딘산(, L-a(distearoyl) phosphatidic acid) 및 뇌, 간, 난황, 심장, 대두 등으로부터 추출 또는 합성으로 제조된 다양한 유형의 L-a-포스파티딜콜린(L-a-phosphatidylcholines) 및 이들의 염이 있다. 다른 적절한 변형으로는 포스파티딜콜린(PC)의 지방 아실 잔기 가교제의 과산화 제어 및 미셀을 단독으로 형성하거나 PC의 알킬 유사체와 같은 PC와 혼합할 때 형성되는 양성자-음성자 양친매성 물질(zwitterionic amphipathates)을 들 수 있다.
인지질은 순도가 다양할 수 있으며 전체 또는 부분적으로 수소화할 수도 있다. 수소화는 원치 않는 과산화 수준을 낮추고 패킹 및 누출에 영향을 미치는 액체/결정 상 전이 온도(Tm)로 젤을 수정 및 제어한다.
리포솜은 다양한 생물학적 유체를 포함한 특정 저장소의 요구 사항에 맞게 "맞춤화 (tailored)"할 수 있으며, 응집이나 크로마토그래피 분리 없이 안정성을 유지하고 주입된 유체에서 잘 분산되어 현탁 상태를 유지한다. 현장 유동성은 구성, 온도, 염도, 2가 이온 및 단백질의 존재 여부에 따라 달라진다. 리포솜은 다른 용매나 계면활성제와 함께 또는 없이 사용할 수 있다.
일반적으로 적합한 지질은 적어도 계란 또는 대두 PC의 아실 사슬 성분의 전이 온도(Tm )와 관련하여 특징적인 아실 사슬 조성, 즉 하나의 사슬은 포화되고 하나는 불포화되거나 둘 다 불포화되는 사슬을 가질 수 있다. 그러나 두 개의 포화 사슬을 사용할 가능성도 배제할 수 없다.
리포솜은 불안정성 및/또는 응집 및/또는 크로마토그래피 분리를 유발하지 않는 한 다른 지질 성분을 포함할 수 있다. 이는 일상적인 실험을 통해 확인할 수 있다.
페길화 인지질 잔기는 콜로이드 입자의 표면에 물리적으로 부착되거나 콜로이드 입자의 막에 삽입될 수 있다. 따라서 폴리머는 콜로이드 입자에 공유 결합될 수 있다.
단라멜라(unilamellar) 또는 다라멜라(multilamellar)로 변형된 콜로이드 입자를 생산하는 다양한 방법이 알려져 있고 이용 가능하다(Lichtenberg and Barenholz, (1988) 참조):
1. 인지질의 박막을 수성 매질로 수화시킨 다음 기계적 흔들기 및/또는 초음파 조사 및/또는 적절한 필터를 통해 압출한다;
2. 인지질을 적절한 유기 용매에 용해하고 수성 매질과 혼합한 후 용매를 제거한다;
3. 임계점 이상의 가스(예: 프레온 및 CO2 또는 CO2 및 기타 기체 탄화수소의 혼합물과 같은 기타 가스)를 사용한다; 또는
4. 지질 세제 혼합 미셀(lipid detergent mixed micelles)을 준비한 다음 세제의 농도를 리포솜이 형성되는 임계 농도 이하로 낮춘다.
일반적으로, 이러한 방법은 약 0.02 ~ 10㎛ 이상의 이질적인 크기를 갖는 콜로이드 입자를 생성한다. 상대적으로 작고 크기가 잘 정의된 콜로이드 입자가 본 발명에서 사용하기에 바람직하기 때문에, "콜로이드 입자 다운사이징(colloidal particle down-sizing)"으로 정의되는 제2 처리 단계는 콜로이드 입자 현탁액의 크기 및 크기 이질성을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
콜로이드 입자 현탁액은 약 5㎛ 미만의 크기 범위, 예를 들어 0.4㎛ 미만의 크기 범위에서 소포의 선택적 크기 분포를 달성하도록 크기가 조정될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 콜로이드 입자는 평균 입자 크기 직경이 약 0.03~0.4 microns(μm), 적합하게는 약 0.1 μm이다.
이 범위의 콜로이드 입자는 적절한 필터를 통해 여과하여 쉽게 멸균할 수 있다. 또한 소포가 작을수록 보관 시 응집되는 경향이 적어 리포솜을 정맥 또는 피하 주사할 때 발생할 수 있는 심각한 막힘이나 막힘 문제를 줄일 수 있다. 마지막으로, 크기가 서브미크론(submicron) 범위로 줄어든 리포솜은 더 균일한 분포를 보인다.
본 발명에 적합한 방식으로 콜로이드 입자의 크기 및 크기 이질성을 줄이기 위한 몇 가지 기술을 사용할 수 있다. 표준 수조 또는 프로브 초음파 처리를 통해 콜로이드 입자 현탁액에 초음파를 조사하면 크기가 0.02~0.08 μm 사이의 작은 단층 소포(small unilamellar vesicles, SUV)까지 점진적으로 크기가 감소한다.
균질화(Homogenization)는 전단 에너지를 사용하여 큰 콜로이드 입자를 작은 입자로 쪼개는 또 다른 방법이다. 일반적인 균질화 절차에서는 콜로이드 입자 현탁액을 표준 에멀젼 균질화기를 통해 일반적으로 약 0.1~0.5 μm 사이의 선택된 리포솜 크기가 관찰될 때까지 재순환시킨다. 두 방법 모두에서 입자 크기 분포는 기존의 레이저 빔 입자 크기 측정으로 모니터링할 수 있다.
작은 기공의 폴리카보네이트 필터(small-pore polycarbonate filter) 또는 이와 동등한 멤브레인을 통해 콜로이드 입자를 압출하는 것도 멤브레인의 기공 크기에 따라 평균이 약 0.02~5μm 범위인 비교적 잘 정의된 크기 분포로 콜로이드 입자 크기를 줄이는 효과적인 방법이다.
일반적으로 현탁액은 원하는 콜로이드 입자 크기 분포에 도달할 때까지 하나 또는 두 개의 적층 막을 여러 번 순환한다. 콜로이드 입자는 리포솜 크기를 점진적으로 감소시키기 위해 연속적으로 더 작은 기공 막을 통해 압출될 수 있다.
원심분리 및 분자체 크로마토그래피(molecular sieve chromatography)는 입자 크기가 1μm 미만인 리포솜 현탁액을 생성하는 데 사용할 수 있는 다른 방법이다. 이 두 가지 방법은 큰 입자를 작은 입자로 변환하는 것이 아니라 큰 리포솜을 우선적으로 제거한다. 콜로이드 입자 수율은 그에 따라 감소한다.
크기 처리된(size-processed) 콜로이드 입자 현탁액은 기존의 0.45 μm 깊이 막 필터와 같은 약 0.4 μm의 입자 구별 크기를 갖는 멸균막을 통과하여 쉽게 멸균할 수 있다. 리포솜은 동결건조된 형태로 안정적이며 사용 직전에 물에 흡수하여 재구성할 수 있다.
콜로이드 입자를 형성하는 데 적합한 지질은 상기에 설명되어 있다. 적절한 예로는 디미리스토일포스파티딜콜린(dimirystoylphosphatidylcholine, DMPC) 및/또는 디미리스토일-포스파티딜글리세롤(dimirystoyl - phosphatidylglycerol, DMPG)과 같은 인지질, 부분 또는 완전 정제 후 직접 또는 부분 또는 완전 수소화 후 얻은 계란 및 대두 유래 인지질이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
다음 네 가지 방법은 WO 95/04524에 설명되어 있으며, 일반적으로 본 발명에 따라 사용되는 콜로이드 입자(리포솜)의 제조에 적합한다.
방법 A
a) 물과 섞이지 않는 유기 용매에 소포를 형성하기에 적합한 지질과 같은 양친매성 물질 혼합
b) 고체 지지체(solid support)가 존재하는 상태에서 용매 제거, 대안적으로, 건조된 양친매성 물질 또는 그 혼합물을 직접 어떤 형태(분말, 입상 등)로든 직접 사용 가능
c) 단계 b)의 생성물을 생리적으로 호환 가능한 용액에서 생체 폴리머 물질의 용액으로 흡수(taking up)
d) 용해 또는 분산 특성을 갖는 유기 용매를 첨가, 뿐만 아니라
e) 생체 폴리머 물질의 기능을 유지하는 조건에서 단계 d) 에서 얻은 분획을 건조시킨다.
방법 A의 단계 a)에 따르면, 위에서 언급한 바와 같이 소포 형성에 적합한 양친매성 물질을 물과 섞이지 않는 유기 용매에 혼합한다. 물과 섞이지 않는 유기 용매는 불소화 탄화수소, 염소화 탄화수소 등과 같은 극성 친수성 용매일 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 b)에서 용매는 고체 지지체가 있는 상태에서 제거된다. 고체 지지체는 비드형 구조를 갖는 불활성 유기 또는 무기 물질일 수 있다. 무기 지지체의 재료는 유리일 수 있고 유기 재료는 테플론(TeflonTM ) 또는 기타 유사한 폴리머일 수 있다.
본 발명의 방법 A의 단계 c)는 단계 b)의 생성물을 생리적으로 호환되는 용액에 캡슐화할 물질의 용액으로 취하는 단계이다.
생리적으로 호환되는 용액은 최대 약 1.5 중량 %의 염화나트륨 용액과 동일할 수 있다. 예를 들어 당류 및/또는 아미노산과 같이 생리적으로 호환되는 다른 염을 냉동 보호제로 사용할 수도 있다. 예를 들어 유당(lactose), 자당(sucrose) 또는 트레할로스(trehalose)를 동결 보호제로 사용할 수 있다.
선택적으로, 가) 단계와 나) 단계 사이에 가) 단계의 바이러스 비활성화, 멸균, 탈원자화, 분획 여과 등의 단계가 제공될 수 있다. 이는 조제 초기 단계에서 약학적으로 허용되는 용액을 얻기 위해 유리할 수 있다.
방법 A의 단계 d)는 용해성 또는 분산성을 갖는 유기 용매를 첨가하는 단계이다.
유기 용매는 물과 섞일 수 있는 유기 극성 용매일 수 있다. 알킬 사슬에 1~5개의 탄소 원자가 있는 저지방족 알코올(예: 3차 부탄올(tertiary butanol, t-부탄올))도 사용할 수 있다. 물과 혼화 가능한 유기 극성 용매의 양은 리포솜에 적재할 물질과의 간섭에 따라 크게 달라진다. 예를 들어, 단백질이 로드되는 경우 단백질의 활성에 영향을 미치는 용매의 양에 따라 상한이 설정된다. 이는 로드할 물질의 특성에 따라 크게 달라질 수 있다. 예를 들어 혈액 응고 인자가 Factor IX 로 구성된 경우 약 30%의 t-부탄올이 필요한 반면, Factor VIII의 경우 10% 미만의 t-부탄올이 적합한다(Factor VIII은 t-부탄올의 영향에 훨씬 더 민감한다). 이 예에서 t 부탄올의 비율은 최종 농도에 대해 계산된 부피 대비 백분율을 기준으로 한다.
선택적으로, d) 단계 이후에 바이러스 비활성화 멸균 및/또는 d) 단계 이후에 산출된 분획의 분할을 수행할 수 있다.
본 발명의 단계 e)는 적재될 물질의 기능을 유지하는 조건 하에서 단계 d)에서 얻은 분획을 건조하는 것이다. 혼합물을 건조하는 한 가지 방법은 동결건조이다. 동결건조는 동결 보호제, 예를 들어 유당 또는 기타 당류 또는 아미노산의 존재 하에서 수행될 수 있다. 또는 증발 또는 분무 건조를 사용할 수도 있다.
건조된 잔류물은 사용하기 전에 수성 매질에서 흡수할 수 있다. 고체를 흡수한 후 각 리포솜의 분산액을 형성한다. 수성 매질은 식염수를 포함할 수 있으며, 형성된 분산액은 필요한 경우 리포솜의 크기를 줄이기 위해 선택적으로 적절한 필터를 통과할 수 있다. 적합하게, 리포솜은 0.02 내지 5 μm의 크기, 예를 들어 0.4 μm 미만의 범위를 가질 수 있다.
방법 A로 얻을 수 있는 리포솜은 혈액 인자의 높은 로딩을 보여준다.
따라서, 본 발명의 조성물은 또한 방법 A의 단계 c) 또는 d)의 분획을 분리하여 얻을 수 있는 중간 생성물일 수 있다. 따라서, 본 발명의 제제는 방법 A의 단계 e)의 생성물을 분산액(수성 매질 내 리포좀(liposomes in aqueous medium)) 형태로 물에 취한 후 얻을 수 있는 수성 분산액을 포함할 수도 있다.
또는, 본 발명의 조성물은 방법 B, C, D 및 E로 지칭되는 다음의 방법에 의해서도 얻을 수 있다.
방법 B
이 방법은 방법 A의 a), b), c) 단계도 포함하지만, 방법 A의 d), e) 단계는 생략한다.
방법 C
방법 C에서는 방법 A의 d) 단계를 최소 2회 반복해야 하는 동결 및 해동 주기로 대체한다. 이 단계는 리포솜을 생산하기 위해 선행 기술에서 잘 알려져 있다.
방법 D
방법 D는 삼투성 성분의 사용을 배제한다. 방법 D에서는 소포의 준비, 로드할 물질의 혼합 및 실질적으로 무염 용액, 이렇게 얻은 분획의 공동 건조 단계가 포함된다.
방법 E
방법 E는 위에서 설명한 방법 A - D보다 간단한다. 이 방법은 리포솜 제조에 사용되는 화합물(지질 항산화제 등)을 t-부탄올과 같은 극성 물 혼화 용매에 용해시켜야 한다. 그런 다음 이 용액을 혈액 인자를 포함하는 수용액 또는 분산액과 혼합한다. 혼합은 약제의 생물학적 및 약리학적 활성을 유지하는 데 필요한 최적의 부피 비율로 수행된다.
그런 다음 혼합물을 동결보호제의 유무에 관계없이 동결건조한다. 리포솜 제형을 사용하기 전에 재수화가 필요한다. 이러한 리포솜은 다층 구조(multilamellar)이며, WO 95/04524에 설명된 방법 중 하나를 사용하여 크기를 줄일 수 있다.
혈액 응고 과정의 활성 수준은 전혈 응고 시간(WBCT) 검사, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 또는 ROTEM과 같은 적절한 분석법을 통해 측정할 수 있다. 1단계 및 2단계/발색성 분석에서는 대부분 분광광도법을 사용하기 때문에 혈액 샘플을 원심분리하여 세포 단편을 제거해야 하는데, 이는 분석 방법이 분광광도법을 포함하므로 샘플이 깨끗해야 하기 때문이다. 아래의 글로벌 응고 분석은 혈전이 물리적으로 형성되는 시간 경과를 평가하므로 혈소판과 같이 혈전을 구성하는 모든 성분이 포함되므로 '실제'에 더 가깝다.
전혈 응고 시간(Whole Blood Clotting Time, WBCT) 검사는 전혈이 외부 환경(일반적으로 유리관이나 접시)에서 혈전을 형성하는 데 걸리는 시간을 측정한다. WBCT는 채혈 직후 2ml의 전혈을 채취하여 두 개의 유리관으로 나누어 평가할 수 있다. 그런 다음 이 두 개의 튜브를 37°C 수조에 넣고 약 20~30초마다 부드럽게 기울여 확인한다. 튜브를 수평으로 뒤집었을 때 혈장이 흘러내리지 않고 단단한 응고가 유지되면 혈전으로 판정한다.
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(Activated Partial Thromboplastin Time, APTT) 검사는 혈액 응고 경로의 일부 매개 변수를 측정한다. 혈우병과 정맥 내 헤파린 치료로 인해 비정상적으로 상승한다. APTT에는 정맥에서 몇 밀리리터의 혈액이 필요하다. APTT 시간은 "내인성 경로(intrinsic pathway)"로 알려진 응고 시스템의 한 부분을 측정한 것이다. APTT 값은 실험실 테스트에서 특정 응고 과정이 발생하는 데 걸리는 시간(초)이다. 이 결과는 항상 정상 혈액의 "대조(control)" 샘플과 비교된다. 검사 샘플이 대조 샘플보다 오래 걸리면 내인성 경로의 응고 기능이 저하되었음을 나타낸다. 일반적인 의학적 치료는 일반적으로 45~70초 정도의 APTT 범위를 목표로 하지만 이 수치는 정상 대비 검사 비율(예: 정상 대비 1.5배)로도 표현할 수 있다. 헤파린 치료가 없는 상태에서 높은 APTT는 혈우병으로 인한 것일 수 있으므로 추가 검사가 필요할 수 있다.
ROTEM(회전 혈전 탄성 측정법(rotational thromboelastometry))은 ROTEM Delta 2.7.2 시스템을 사용하여 NATEM 분석법(재석회화에 의해서만 활성화됨)을 통해 혈액 샘플의 응고성을 평가한다. 측정을 위해 20uL의 CaCl2 과 340uL의 구연산화된 전혈 샘플을 장치에 넣는다. 분석은 신선한 혈액 샘플을 채취한 후 15분 이내에 수행된다. 이 분석은 응고 시간(CT - 혈액이 응고되기 시작하는 시간), 응고 형성 시간(CFT - 응고가 최대로 단단해지는 시간) 등 응고가 형성되는 동안의 다양한 통계를 제공한다.
다음은 FVIII 농도를 평가하기 위한 발색 분석법(Chromogenic assay)("2단계 분석법"이라고도 함)에 대해 설명한다.
제공된 방법을 다음과 같이 수정하여 크로모제닉스 코아매틱 인자 VIII 색소 생성 분석법(Chromogenix Coamatic Factor VIII chromogenic assay, Diapharma, K822585)을 사용하여 FVIII 혈장 활성을 측정할 수 있다:
i.
혈장 샘플 희석액과의 비교 가능성을 달성하기 위해 FVIII 표준 준비에 소량의 순혈(na
ve) 혈장을 포함시킨다,
ii.
각 테스트 항목에 특정한 FVIII 표준 사용(NuwiqTM 또는 FactaneTM),
iii.
두 가지 표준 곡선 범위 내에 추가 FVIII 활동량 값을 포함한다.
NuwiqTM and FactaneTM FVIII 표준 스톡 용액 준비:
각 검사 물품의 바이알을 정제수와 함께 100 IU/ml로 재구성하여 -70°C에서 소량으로 냉동 보관하고 분석 당일에 37°C에서 해동할 수 있다. 해당 혈장 시료의 분석에는 연구 테스트 물품에 적합한 스톡 용액을 사용한다.
개략적인 분석 방법은 다음과 같다:
1.
테크노클론 Factor VIII 결핍 혈장(native; Diapharma 5154007) 1바이알을 정제수 1ml에 새로 용해하였다.
2.
0.990 mL의 FVIII 결핍 혈장에 적절한 FVIII 표준 스톡 용액(100 IU/ml)을 0.010mL 첨가하여 신선하게 FVIII 표준 작업 스톡 용액(1 IU/mL )제조하였다.
3.
Coamatic 키트 Factor 시약, S-2765 + I-2581 기질 및 버퍼 작업 용액은 키트 지침에 따라 준비되고 37°C로 예열하였다.
4.
20% 아세트산 정지 용액을 준비한다,
5.
연구 샘플에 적합한 FVIII 범위를 사용하여 FVIII 작동 스톡 용액(1 IU/ml)으로부터 표준 곡선(표 1 및 2 참조)을 준비했다.
6. 37°C에서 각 테스트 혈장 샘플의 한 시료 분량을 빠르게 해동하였다.
7. 해동된 테스트 혈장 샘플 25μl을 버퍼 작업 용액 2000μl로 희석하였다.
8. 희석된 FVIII 표준 및 희석된 테스트 혈장 샘플 50μl을 플레이트 맵에 따라 96웰 플레이트의 웰에 추가하고 37°C에서 4분간 배양하였다.
9. 각 웰에 인자 시약 50μl을 추가하고 37°C에서 2분간 (고범위 표준 곡선) 또는 4분간 (저범위 표준 곡선) 배양하였다.
10. 각 웰에 S-2765 + I-2581 기질(substrate) 50μl을 추가하고 37°C에서 2분간 (고범위 표준 곡선) 또는 10분간 (저범위 표준 곡선) 배양하였다.
11. 각 웰에 20% 아세트산 정지 용액 50μl을 추가하였다. 웰의 색상이 노란색 계열로 변하고 흡광도 405nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 광밀도(optical density)를 측정하였다.
12. FVIII 표준 활성(IU/ml)을 405nm에서의 흡광도에 대해 최적의 선형 곡선을 사용하여 그래프에 표시하였다.
13. 테스트 혈장 샘플의 흡광도를 표준 곡선에 대해 읽고 FVIII 활성을 IU/ml로 보고하였다.
14. 각 시간대별 3개의 마우스 테스트 혈장 샘플에서 계산된 FVIII 활성 결과의 평균(그리고 개별 연구에서 지시된 경우 중앙값)이 계산되고 데이터는 약동학 분석에 적용되었다.
FVIII 농도를 평가하기 위한 추가 테스트에는 다음이 포함된다:
발색성 FVIII 활성 분석(Chromogenic FVIII Activity Assay)
Biophen FVIII:C 분석 키트 Ref#221406은 분석 버퍼에 1:10으로 희석한 혈장 샘플과 함께 사용되었으며 NuwiqTM 및 인간 혈장 참조 표준 곡선과 비교하여 실행되었다. 각 곡선은 개 FVIII 결핍 혈장에서 FVIII을 연속적으로 희석한 다음 분석 버퍼에서 1:10으로 희석하여 생성되었다. 두 곡선의 표준 범위는 0.003-0.4U/mL, 선형 범위는 0.13-1.00U/mL이었다. 분석은 키트 프로토콜에 따라 수행되었다.
원스테이지 인자 VIII 분석 - 지멘스 BCS-XP 시스템 (One-Stage Factor VIII Assay - Siemens BCS-XP System)
샘플은 정상적인 개의 혼합 혈장을 2.5% 개 FVIII 결핍 혈장이 포함된 Owren’s Veronal Buffer로 희석하여 생성된 개 FVIII 참조 곡선에 대해 측정되었다. 곡선의 범위는 5-200%이다. 혈장 샘플은 Owren’s Veronal Buffer에서 1:10으로 희석되었고, FVIII 결핍 혈장과 혼합된 후 Actin FS가 추가되었다. 3분의 배양 후, CaCl2로 활성화가 시작되었고 405nm에서 응고 시간이 측정되었다.
전술한 제2 양태에 따라, 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)으로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하며, 여기서 상기 제2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하는 양친매성 지질을 포함한다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 분자량이 약 2500~약 5000달톤인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
상술한 제3 양태에 따라, 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태의 조성물은 피험자의 혈우병 치료용이다.
혈우병은 A형 혈우병, B형 혈우병 및/또는 C형 혈우병일 수 있다.
피험자의 혈우병 치료용 조성물은 소아 피험자에게 사용될 수 있다. 소아 환자는 유럽연합(EU)에서 출생부터 18세 사이의 인구 중 일부로 정의된다. 소아 인구는 여러 하위 집합을 포함한다. 소아 환자의 적용 연령 분류는 다음과 같다:
·
0~27일 미만의 미숙아 및 신생아를 피험자로 한다;
·
1개월에서 23개월 사이의 영아(또는 유아)를 피험자로 한다;
·
2세부터 11세까지의 어린이
·
12세 이상 18세 미만의 청소년.
(참조: http://ec.europa.eu/health/sites/health/files/files/eudralex/vol-1/2014_c338_01/2014_c338_01_en.pdf)
혈우병은 선천성 혈우병(cH) 또는 후천성 혈우병(aH)일 수 있다. 선천성 혈우병은 응고 Factor VIII 결핍 또는 감소를 특징으로 하는 유전성 출혈 질환이다. 후천성 혈우병은 출혈의 개인적 또는 가족력이 없는 개인에게 자가항체 저해제가 갑자기 생성되는 자가면역 질환이다. 우리 몸은 A형 혈우병에서 Factor VIII에 대한 자가항체를 생산한다.
전술한 제4 양태에 따라, 피험자에서 혈우병을 치료하는 방법은 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
이 방법은 Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 별도 또는 동시 투여하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 Factor VIII를 포함하는 조성물은 치료 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 적합하게, Factor VIII를 포함하는 조성물은 환자에게 투여되고, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 15~120, 15~60, 15~30분 후에 콜로이드 입자를 포함하는 조성물이 환자에게 투여될 수 있다. 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및/또는 Factor VIII를 포함하는 조성물은 환자의 혈액 내 Factor VIII의 농도가 치료 이하 또는 치료와 무관한 수준에 도달할 때까지 재투여를 기다릴 필요 없이 지속적이고 일정하며 예측 가능한 치료 효과를 제공하기 위해, 예를 들어 2~21일, 4~14일, 4~7일과 같이 적절하게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21일 간격으로 FVIII의 혈중 농도가 일정 수준으로 유지될 수 있도록 투여 및/또는 재투여할 수 있다. 예를 들어, Factor VIII를 포함하는 조성물은 콜로이드 입자를 포함하는 조성물이 환자에게 투여되기 15분 전에 환자에게 투여될 수 있으며, 4~5일마다 두 단계의 투여가 반복될 수 있다.
또는, 콜로이드 입자와 Factor VIII를 포함하는 조성물은 환자의 혈액 내 Factor VIII의 농도가 치료 이하 또는 치료와 무관한 수준에 도달할 때까지 재투여를 기다릴 필요 없이 지속적이고 일정하며 예측 가능한 치료 효과를 제공하기 위해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21일 간격으로, 예컨대 2-21일, 4-14일, 4-7일마다 적당히 투여하거나 재투여할 수 있다.
이러한 치료 요법은 A형 혈우병 환자를 치료하는 데 필요한 Factor VIII의 양을 줄여준다.
본 발명은 또한 피험자의 혈우병 치료를 위한 의약품 제조에 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태의 조성물을 사용하는 것을 포함한다.
상술한 제5 양태에 따라, 키트는 (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질 및 (iii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르의 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 포함한다. 상기 제2 양친화성 지질이 생체 친화적인 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하는 제 2 양친화성 인지질을 포함한다. 상기 콜로이드 입자는 비이온성 계면활성제에 대한 제1 양친매성 지질 및 제2 양친매성 지질을 30:1 내지 2:1 w/w의 비율로, 적합하게는 25:1, 20:1, 16:1, 15:1, 10:1, 8:1 또는 5:1 w/w({제1 양친매성 지질 + 제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제}) 비율로 구성한다.
본 발명의 동결건조 제형은 적절한 희석제, 보조제 또는 부형제(예: 생리적으로 허용되는 완충제)와 함께 별도의 제형으로 제공될 수 있다. 키트의 콜로이드 입자 및/또는 Factor VIII(FVIII)는 동결건조된 제형으로 제공될 수 있다. 또는, 키트의 Factor VIII(FVIII)는 동결건조된 제형으로 제공될 수 있고, 콜로이드 입자는 Factor VIII(FVIII)의 재구성을 위한 용액으로 제공될 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 이러한 조성물은 별도의 제형으로서 Factor VIII를 추가적으로 포함하거나 본 명세서에 설명된 바와 같이 콜로이드 입자와 함께 제형화될 수 있다. 동결건조된 형태의 Factor VIII 제제는 500 IU 바이알로 제공될 수 있다. 키트의 콜로이드 입자 및/또는 Factor VIII(FVIII)는 바로 사용할 수 있는 수성 형태로도 제공될 수 있다.
키트에는 선택적으로 사용 설명서도 포함되어 있다.
상술한 제6 양태에 따라, 키트는 피험자의 혈우병 치료에서 분리, 후속 또는 동시 사용하기 위한 키트로, (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질 및, (iii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 포함한다. 상기 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다. 콜로이드 입자는 비이온성 계면활성제에 대한 제1 양친매성 지질 및 제2 양친매성 지질을 30:1 ~ 2:1 w/w의 비율로, 적합하게는 25:1, 20:1, 16:1, 15:1, 10:1, 8:1 또는 5:1 w/w({제1 양친매성 지질 + 제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제}) 비율로 구성한다.
상술한 제7 양태에 따라, 키트는 (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하고, 상기 제2 양친매성 지질은 생체 친화성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 분자량이 약 2500~약 5000달톤인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
상술한 제8 양태에 따라, 키트는 혈우병 치료에 별도, 후속적으로 또는 동시 사용하기 위한 (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) 피험자의 Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하며, 상기 제2 양친매성 지질은 생체 적합 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 분자량이 약 2500~약 5000달톤인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
상술한 제9 양태에 따라, 제형은 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태의 약학 조성물을 포함한다.
제형은 환자에게 적합한 용량이 들어 있는 적절한 용기 또는 바이알(예: 250 IU, 500 IU, 750 IU 또는 1000 IU 바이알)로 제공될 수 있다. 제형은 정제 또는 액체 형태로 제공될 수도 있다. 제형은 동결건조된 형태일 수도 있다.
본 발명은 환자가 이미 외인성 FVIII 표준 치료를 받고 있거나 환자가 내인성으로 중간 수준의 FVIII을 생성하는 경우와 같이 외인성 FVIII 용량과 함께 투여하거나 FVIII과 별도 투여할 수 있다.
본 발명의 놀라운 기술적 효과로는 부상 발생 시 응고 시작이 가속화되어 더 짧은 시간에 더 나은 품질의 (더 강한) 응고가 형성되는 것을 들 수 있다. 이론에 얽매이고 싶지 않지만, 이는 본 발명의 여러 기술적 측면에 기인할 수 있다. FVIII뿐만 아니라 FIX 및 FVIIa도 PEG와 관련된 부위에서 콜로이드 입자에 결합할 수 있으므로, PEG의 양을 늘리면 FVIII뿐만 아니라 순환 중에 존재하는 혈액 응고 과정의 다른 성분을 청소하고 농축하여 이들 모두가 혈소판 근처에 집중되도록 하여 혈소판 활성화에 대한 혈액 응고의 빠른 촉진을 가능하게 할 수 있다. 또한, 계면활성제에 의해 추가 PEG가 제공된 경우, 후자는 혈소판의 활성화를 유도하거나 더 쉽게 활성화된 상태로 만들 수 있다. 또한, 지혈 조절 기간이 연장되고 면역원성이 감소하며 FVIII 저해제가 있는 경우 응고 능력(clotting capability)을 회복하기 위해 FVIII을 사용할 수 있는 능력이 제공될 수 있다. 이는 일반적으로 면역 반응을 유발하는 FVIII의 에피토프를 마스킹하고 그에 따른 항-FVIII 항체를 생성함으로써 달성할 수 있다.
본 발명에 의해 입증된 놀라운 기술적 효과는 일반적으로 면역 반응을 유발할 수 있는 FVIII의 에피토프를 마스킹하고 그에 따른 항-FVIII 항체(anti-FVIII antibodies)를 생성함으로써 달성된다.
이론에 얽매이고 싶지 않지만, 이러한 이점은 PEGLip이 FVIII의 A3 도메인에 비공유 결합하여 FVIII 경쇄 도메인의 에피토프를 신체 면역 체계에서 인식하지 못하도록 보호하거나 수지상 세포에 의한 FVIII의 내세포화를 방지하는 데서 비롯된 것으로 생각된다. 추가적인 PEG의 도입은 추가적인 결합 부위를 제공하여 잠재적으로 리포솜에 FVIII을 농축시킬 수 있다.
추가 PEG는 더 큰 수화 구체를 제공하여 정상적인 제거 메커니즘으로부터 관련 FVIII을 더 잘 보호하여 FVIII의 순환 반감기를 증가시켜 지혈 조절 기간을 연장한다. 또한 더 큰 차폐막(shielding)은 항체 저해제로부터 FVIII의 에피토프를 더 잘 보호하여 FVIII에 대한 저해제(항체)가 있는 환자에서 생성물(product) 사용을 용이하게 할 수 있다.
리포솜이 FVIII의 A3 도메인 영역에 결합하면 FVIII의 C1 및 C2 도메인이 VWF와 결합할 수 있게 되며, 이로 인해 추가적인 보호 기능이 제공된다.
FVIII을 함유하는 페길화 리포솜의 융합은 혈소판과 융합하거나 혈소판에 의해 섭취되어 후자의 활성화에 역할을 하여 조직 인자를 함유하는 친응고성 미립자를 생성하여 외인성 경로를 상향 조절하고 응고 형성을 가속화할 수 있다고 믿어진다. 리포솜에 PEG 함유 지질 또는 계면활성제를 추가로 도입하면 혈소판 막이 불안정해지고 이러한 활성화가 더욱 빨라질 수 있다.
이러한 효과는 재조합 FVIII 분자에서 더 두드러지게 나타나는데, 일반적으로 야생형 FVIII에서 이러한 에피토프를 자연적으로 보호하는 VWF를 투여하지 않는다.
에피토프를 보호하는 것 외에도 PEGLip과의 연관성은 정상적인 단백질 분해 제거 메커니즘으로부터 FVIII을 보호하고 투약 간격을 연장하며 시간이 지남에 따라 환자가 FVIII에 노출되는 총량을 줄임으로써 FVIII의 반감기를 연장할 수 있다.
놀라운 관찰 결과를 다음과 같이 설명한다:
전임상 및 임상 실험에서 리포솜과 FVIII의 결합은 혈전 형성 시간(Clot Formation Time, CFT, FVIII 매개)을 향상시키는 것으로 나타났으며, FVIII이 아닌 외부 경로에 의해 매개되는 응고 시작(Clotting Time, CT)도 향상되는 것으로 관찰되었다.
임상 시험에서 이러한 효과는 회수 가능한 FVIII이 검출되지 않는 수준까지 떨어졌을 때에도 여전히 나타나 투여된 FVIII의 반감기가 '명백하게' 연장되는 것으로 나타났다.
생체 외(in vitro) 사람의 혈액을 사용한 시험관 내 실험(예 1 참조)에서 놀랍게도 원래 경피 적용을 위한 시험 제형(표 1 참조)에 PEG 함유 막 연화제가 포함된 경우 표준 PEGylated 리포솜보다 저해제 혈액에서 더 나은 혈전 형성을 유발한다는 사실이 밝혀졌다.
다음 샘플은 본 발명에 따라 제작 및 테스트되었다:
1.
DSPE-PEG대 POPC의 비율로 구성된 일련의 콜로이드 입자(PEGLip)로, 상기 PEG는 PEG-2000이고 입자는 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80)을 추가로 포함한다.
2.
DSPE-PEG대 POPC의 비율로 구성된 일련의 콜로이드 입자(PEGLip)로, 상기 PEG는 PEG-5000이다.
3.
2번에 따른 콜로이드 입자는 폴리소르베이트 80을 추가로 포함한다.
특정 실시예에서, 다음과 같은 제형이 제공된다:
15~16:1 제형(
15 to 16:1 formulation)
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000))을 97:3 몰 비율로, 50mM 구연산나트륨 완충액에서 9% 현탁액으로 FVIII(NuwiqTM, Octapharma AG)과 함께 15에서 16:1의 PEGLip 입자 대 FVIII 분자 비율로 제조된다.
7~8:1 제형
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000))을 97:3 몰 비율로, 50mM 구연산나트륨 완충액에서 제조된 9% 현탁액으로 FVIII(NuwiqTM, Octapharma AG)과 함께 7~ 8:1의 PEGLip 입자 대 FVIII 분자 비율로 제조된다.
다른 실시예에서, 다음과 같은 제형이 제공된다:
15~16:1 제형
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000))으로 구성된 PEGLip 입자가 97:3 몰 비율로, 그리고 폴리소르베이트 80이 9:1 w/w 비율(POPC + DSPE-PEG(2000):폴리소르베이트 80)로 50mM 구연산나트륨 완충액에서 9% 현탁액으로 제형화되며, FVIII(NuwiqTM, Octapharma AG)이 PEGLip 입자 대 FVIII 분자의 15에서 16:1 비율로 혼합된다.
7~8:1 제형
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000))으로 구성된 PEGLip 입자가 97:3 몰 비율로, 그리고 폴리소르베이트 80이 9:1 w/w 비율(POPC + DSPE-PEG(2000):폴리소르베이트 80)로 50mM 구연산나트륨 완충액에서 제형화된 9% 현탁액으로, FVIII(NuwiqTM, Octapharma AG)과 함께 PEGLip 입자 대 FVIII 분자의 7~ 8:1 비율로 혼합된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 다음과 같은 구성이 제공된다:
·
포스파티딜콜린 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 97:3 몰 비율(9:1 w/w)로 포함하는 콜로이드 입자, 예를 들어 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린 (POPC)과 N-(카르복실-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG2000)의 몰 비율 97:3 또는 더 무거운 페길화된 지질을 사용하는 경우 동등한 몰 비율을 적용한 중량 보정 비율 (예: 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG5000)의 중량 비율 4:1~5:1 사이)을 사용한다.
·
완충액(적합하게 생리적으로 허용되는 pH, 예를 들어 pH 6.5 ~ 7.2)과 같은 희석제, 예를 들어 구연산염 완충액(선택적으로 50mM 농도)을 포함한다.
다른 실시예에서는, 다음과 같은 구성이 제공된다:
·
포스파티딜콜린 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 97:3 몰 비율(9:1 w/w)로 포함하는 콜로이드 입자, 예를 들어 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린 (POPC)과 N-(카르복실-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG2000)의 몰 비율 97:3 또는 더 무거운 페길화된 지질을 사용하는 경우 동등한 몰 비율을 적용한 중량 보정 비율 (예: 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG5000)의 중량 비율 4:1~5:1 사이)을 사용한다. 상기 콜로이드 입자는 폴리옥시 에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르, 예를 들어 폴리옥시 에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트로 구성된 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 더 포함한다.
·
완충액(적합하게 생리적으로 허용되는 pH, 예를 들어 pH 6.5 ~ 7.2)과 같은 희석제, 예를 들어 구연산염 완충액(선택적으로 50mM 농도)을 포함한다.
본 발명의 제2 양태 및 후속 양태에 대한 바람직한 특징은 제1양태와과 동일하게 적용된다.
이제 본 발명은 설명의 목적으로만 제공되는 다음의 실시예를 참조하여 설명될 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한 다음 도면을 참조하여 설명한다:
도 1은 인간 저해제 모델을 보여준다. 응고 시간(CT)과 응고 형성 시간(CFT)에 대한 PEGLip 및 F-PEGLip의 효과를 보여준다.
도 2는 혈우병 개 저해제 모델을 보여준다. 응고 시간(CT)과 응고 형성 시간(CFT)에 대한 PEGLip과 F-PEGLip의 효과를 보여준다.
도 3은 마우스 응고 연구를 보여준다. PEGLip과 F-PEGLip이 FVIII의 활성에 미치는 영향을 보여준다.
도 4는 혈우병 개 저해제 모델을 보여준다. 응고 시간(CT)과 응고 형성 시간(CFT)에 대한 PEGLip과 F-PEGLip의 효과를 보여준다.
실시예
다음 예에서는 회전 혈전 탄성계측법(rotational thromboelastometry. ROTEM)이라는 기술을 사용하여 혈액 응고 과정 및 혈전 형성의 다양한 매개변수를 평가한다. 다음 약어가 사용된다.
| 성분(g per 100g) | PEGLip (PLP-00) | F-PEGLip (PLP-01) |
| POPC | 8.333 | 6.68 |
| mPEG-2000-DSPE | 0.926 | 0.76 |
| Polysorbate 80 | 0 | 0.85 |
| Sodium Citrate Dihydrate | 1.47 | 1.47 |
| Water | 89.271 | 90.24 |
| Total | 100 | 100 |
| pH | 6.5 - 7.2 | 6.5 - 7.2 |
| POPC:mPEG-2000-DSPE (molar) | 97:3 | 97:3 |
| POPC:mPEG-2000-DSPE (w/w) | 9:1 | 9:1 |
| Total lipid:non-ionic surfactant (w/w) | n/a | 9:1 |
실시예 1:
저해제가 있는 중증 혈우병 혈액 모델에서 F-PEGLip-FVIII이 응고에 미치는 영향에 대한 생체 외(Ex-vivo) 연구.
방법:
건강한 지원자로부터 채취한 정상 전혈(WB) 샘플에 저해제(70BU/ml, George King Biomedical)가 함유된 70BU/ml의 FVIII 결핍 혈장을 주입하여 중증 A형 혈우병 혈액의 모의 저해제 용액을 만들었다. 충분한 양의 저해제 혈장을 첨가하고 혼합 배양하여 FVIII의 혈액을 고갈시키고 저해제 혈액(IB)의 시뮬레이션으로 15베데스다 단위/ml를 남겼다.
시험물질로 스파이크된 WB, IB 또는 IB 샘플을 저량의 조직 인자 활성화제를 사용하여 ROTEM으로 분석했다(표 2 참조).
결과:
| 시험 물질 | FVIII IU/ml |
F-PEGLip mg/ml
(PLP-01) |
비율
Liposomes:FVIII |
CT | CFT | CT+CFT |
| Whole blood (WB) | N/A | 507 | 137 | 644 | ||
| Inhibitor Blood (IB) | N/A | 1,234 | 943 | 2,177 | ||
| IB + FVIII control | 91 | 0 | N/A | 1,129 | 740 | 1,869 |
| IB + PEGLip control | 0 | 90 | N/A | 1,415 | 922 | 2,337 |
| IB+PEGLip-FVIII | 91 | 35 | 10:1 | 1,274 | 950 | 2,224 |
| IB+PEGLip-FVIII | 72 | 84 | 29:1 | 1,487 | 1,153 | 2,640 |
| IB+PEGLip-FVIII | 25 | 88 | 86:1 | 1,111 | 1,214 | 2,325 |
| IB + F-PEGLip-FVIII | 81 | 62 | 19:1 | 1,217 | 687 | 1,904 |
| IB + F-PEGLip-FVIII | 72 | 63 | 22:1 | 855 | 377 | 1,232 |
저해제 혈액 모델을 만들기 위해 전혈에 저해제를 첨가하여 저해제 전혈(I-WB)의 응고 시간을 연장한 결과 저해제 전혈의 응고 시간이 연장되었다. 응고 시간은 FVIII 또는 PEGLip 단독으로는 회복되지 않았다. FVIII과 F-PEGLip(PLP-01)을 병용 투여한 경우 응고 시간이 단축되어 응고가 회복되었다. 도 1 참조.
실시예 2:
저해제를 사용하는 중증 혈우병 환자의 혈액 응고에 대한 PEGLip-FVIII의 효과에 대한 생체 외(Ex-vivo) 연구.
이 실험은 사람(5. 6 BU)과 개(3. 6 BU) 모두에 대해 낮은 역가의 항-FVIII 항체를 가진 A형 혈우병 개의 구연산염 항응고 전혈 샘플에 다양한 비율(10:1, 29:1, 86:1)의 FVIII, PEGLip (PLP-00) 또는 트위닐화된 PEGLip (Tweenylated PEGLip, PLP-01)-FVIII의 28:1 혼합물(F-PEGLip/PLP-01) 첨가 효과를 평가했다. 시험 물질의 샘플을 저해제 혈액에 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 ROTEM 컵에 넣은 다음 10 μl CaCl2를 추가했다. NATEM 프로그램을 사용하여 60분 동안 응고를 추적했다.
시험 물질:
FVIII: 1000IU/ml FVIII: Nuwiq (Octapharma, 0.5ml 멸균수로 재구성된 500IU 바이알)
PEGLip: 90mg/ml PEGLip(PLP-00): 9% 페길화 리포솜(50mM 구연산염 완충액 pH 6.7)(배치 19-740)
F-PEGLip: 68mg/ml F-PEGLip(PLP-01): 6.8% 트위닐화(Tweenylated) 페길화 리포좀(50mM 구연산염 완충액 pH 6.7)(배치 09-01-2020)
대조군: 구연산나트륨 완충액 50mM pH 6.7
결과:
| 시험 물질 | FVIII IU/ml |
F-PEGLip mg/ml
(PLP-00/PLP-01) |
비율
Liposomes:FVIII |
CT | CFT | CT+CFT |
| Inhibitor Blood (IB) | #N/A | #N/A | N/A | 5333 | n/c | 5333 |
| IB + FVIII control | 91 | 0 | N/A | 4343 | n/c | 4343 |
| IB + PEGLip control | 0 | 90 | N/A | 4376 | n/c | 4376 |
| IB + PEGLip-FVIII | 91 | 35 | 10:1 | 4984 | n/c | 4984 |
| IB + PEGLip-FVIII | 72 | 84 | 29:1 | 638 | 338.5 | 976.5 |
| IB + PEGLip-FVIII | 25 | 88 | 86:1 | 647 | 334 | 981 |
| IB + F-PEGLip-FVIII | 48 | 55 | 28:1 | 669 | 437 | 1106 |
n/c no clotting
치료 전 피험자의 저해제 혈액은 필요한 시간 내에 응고되지 않았다. 이는 저해제 혈액에 FVIII 단독 또는 PEGLip 단독으로 스파이크했을 때 해결되지 않았다. 마찬가지로 저해제 혈액에 10:1의 PEGLip-FVIII 혼합물을 주입했을 때에도 응고 시간은 보정되지 않았다.
그러나 29:1 및 86:1 PEGLip(PLP-00)-FVIII과 28:1 F-PEGLip(PLP-01)-FVIII의 혼합물은 모두 저해제 혈액의 응고 시간을 현저히 감소시켰다. 도 2 참조.
결론적으로, 29:1 이상의 비율로 FVIII에 PEGLip을 추가하면 혈액 내 저해제에 의한 FVIII의 작용 저해를 방지할 수 있었다. 그러나 낮은 수준의 PEGLip(10:1)은 FVIII을 저해제로부터 보호하지 못했다. 이는 PEGLip이 항체 저해제에 대한 보호를 제공하는 임계 비율인 10:1에서 29:1 사이에는 PEGLip:FVIII의 비율이 존재한다는 것을 의미한다.
추가 PEG가 포함된 두 번째 페길화 리포솜 제형(F-PEGLip/(PLP-01)도 28:1의 F-PEGLip-FVIII 비율로 저해제 항체 분해로부터 FVIII을 보호하는 것으로 나타났다.
실시예 3:
혈우병 마우스에 PEGLip을 정맥 투여한 후 FVIII을 정맥 주사한 연구 결과
예방적 유전자재조합 Factor VIII(Nuwiq)로 표준 치료를 받는 중증 혈우병 환자에게 보조제로서 PEGLip 변이체를 사용하는 모델링.
F-PEGLip(PEGLip과 폴리소르베이트 80/PLP-01)은 FVIII과 별도 주사(injected)할 경우 FVIII의 활성을 향상시킨다.
시험 물질:
FVIII: Nuwiq( Octapharma, 250/500IU 바이알), β-도메인 삭제, 재조합 인간화 FVIII(rhFVIII), Factane(LFB, 1000IU 바이알), 인간 혈장 유래, 전체 길이 FVIII(pdFVIII)
F-PEGLip: PLP-01에 따름
대조군: 구연산나트륨 완충액(buffer) 50mM, pH 6.7
동물 테스트:
수컷 FVIII 녹아웃 A형 혈우병(B6; 129S-F8tm1Kaz/J, F8tm1Kaz에 대해 혈우병성) 마우스
FVIII 분석:
크로모제닉스 코아매틱(Chromogenix Coamatic) 인자 VIII 색소 생성 분석법(Diapharma, K822585)을 사용하여 FVIII 혈장 활성을 측정했다.
방법:
실험 동물에게 35IU/kg의 Nuwiq를 정맥(꼬리 정맥)으로 주사하여 일반적인 예방 용량의 FVIII을 투여받는 환자를 시뮬레이션했다. 15분 후, 동물들은 22mg/kg의 F-PEGLip 또는 2.5ml/kg의 구연산나트륨 완충액을 정맥 주사받았다. 이 두 가지를 함께 주사했다면 소포:FVIII의 비율은 15:1에서 16:1 사이가 되었을 것이다.
결과:
| Time (hours) | FVIII 활성 (IU/ml) | |||||||
| Group 1: FVIII followed by F-PEGLip (PLP-01) | Group 2: FVIII followed by Citrate | |||||||
| Subject | Data | mean | median | Subject | Data | mean | median | |
| M0101 | 0.221 | M0201 | 0.200 | |||||
| 0.083 | M0112 | 0.400 | 0.320 | 0.338 | M0204 | 0.374 | 0.226 | 0.200 |
| M0108 | 0.338 | M0208 | 0.105 | |||||
| M0102 | 0.054 | M0202 | 0.445 | |||||
| 0.5 | M0105 | 0.381 | 0.270 | 0.375 | M0205 | 0.181 | 0.272 | 0.188 |
| M0109 | 0.375 | M0209 | 0.188 | |||||
| M0103 | 0.308 | |||||||
| 2 | M0106 | 0.111 | 0.152 | 0.111 | M0206 | 0.160 | 0.202 | 0.202 |
| M0110 | 0.037 | M0210 | 0.244 | |||||
| M0112 | 0.179 | M0204 | 0.182 | |||||
| 4 | M0111 | 0.267 | 0.220 | 0.212 | M0211 | 0.242 | 0.197 | 0.182 |
| M0107 | 0.212 | M0207 | 0.168 | |||||
| M0105 | 0.119 | M0205 | 0.114 | |||||
| 8 | M0101 | 0.135 | 0.121 | 0.119 | M0201 | 0.105 | 0.106 | 0.105 |
| M0108 | 0.111 | M0208 | 0.101 | |||||
| M0102 | 0.004 | M0206 | 0.108 | |||||
| 12 | M0106 | 0.024 | 0.031 | 0.024 | M0202 | 0.063 | 0.092 | 0.103 |
| M0109 | 0.066 | M0209 | 0.103 | |||||
| M0107 | 0.061 | M0210 | 0.038 | |||||
| 18 | M0103 | 0.050 | 0.055 | 0.054 | M0207 | 0.032 | 0.035 | 0.035 |
| M0110 | 0.054 | |||||||
| 군 | 시험물질 |
Dose
(mg/kg) |
Stat-istic |
C
0
(IU/mL) |
C
max
(IU/mL) |
T
max
(h) |
AUC
0-t
(h*IU/mL) |
AUC
0-18
(h*IU/mL) |
AUC
0-inf
(h*IU/mL) |
t
1/2
(h) |
| 1 | F-PEGLip (PLP-01) | 22 | mean | 0.331 | 0.320 | 0.083 | 2.08 | 2.08 | NR | NR |
| median | 0.338 | 0.375 | 0.5 | 2.05 | 2.05 | NR | NR | |||
| 2 | Citrate Control | N/A | mean | 0.226 | 0.272 | 0.5 | 2.26 | 2.26 | 2.56 | 6.03 |
| median | 0.202 | 0.202 | 2.0 | 2.18 | 2.18 | 2.48 | 6.01 |
N/A = 해당 없음
NR = 제거 단계를 특성화할 수 없어 보고되지 않음
| PK 파라미터 | PEGLip: 구연산염 대조군 비교 비율 | F-PEGLip(PLP-01: 구연산염 대조군 비교 비율 | ||
| mean | median | mean | median | |
| C max (IU/ml) | 1.50 | 1.98 | 1.18 | 1.86 |
| AUC (0-t) (h*IU/ml) | 1.08 | 1.17 | 0.922 | 0.942 |
| AUC (0-Δ (h*IU/ml) | 1.12 | 1.18 | NR | NR |
N/A = 해당 없음
NR = 제거 단계를 특성화할 수 없어 보고되지 않음
구연산염 대조군과 FVIII 활성 데이터의 평균 또는 중앙값을 비교했을 때, 예방적 rFVIII(35 IU/kg) 주사 후 F-PEGLip(PLP-01)(22mg/kg)을 주사하면 관찰된 최대 FVIII 활성도가 증가했다(Cmax 비교 비율 > 1). 도 3 참조.
실시예 4:
저해제를 사용하는 중증 혈우병 환자의 혈액 응고에 대한 PEGLip-FVIII의 효과에 대한 생체 외 연구.
실시예 2를 기반으로, 이 실험들은 FVIII, PEGLip (PLP-00), 다양한 비율의 PEGLip (PLP-00)-FVIII (10:1, 15:1, 30:1, 25:1, 30:1, 90:1) 및 다양한 비율의 Tweenylated PEGLip(PLP-01)-FVIII (F-PEGLip/PLP-01)을 인간 (5.6 BU) 및 개 (3.2 BU) FVIII에 대해 낮은 역가의 항-FVIII 항체를 가진 혈우병 A 형 개의 구연산염 항응고 처리된 전혈 샘플에 첨가하는 효과를 평가하였다. 시험 생성물의 샘플들이 저해제가 있는 혈액에 추가되어 부드럽게 혼합된 후, ROTEM 컵에 추가되고 이어서 10μl의 CaCl2가 추가되었다. 응고는 NATEM 프로그램을 사용하여 60분 동안 추적되었다.
시험 물질:
FVIII: 1000IU/ml FVIII: Nuwiq ( Octapharma, 0.5ml 멸균수로 재구성된 500IU 바이알)
PEGLip: 90mg/ml PEGLip(PLP-00): 9% 페길화 리포솜(50mM 구연산염 완충액 pH 6.7)(배치 19-740)
F-PEGLip: 68mg/ml F-PEGLip(PLP-01): 6.8% 트위닐화 페길화 리포좀(50mM 구연산염 완충액 pH 6.7)(배치 09-01-2020)
대조군: 구연산나트륨 완충액 50mM pH 6.7
결과:
| 시험 물질 | FVIII IU/ml | PLP-00/PLP-01 mg/ml | Liposomes:FVIII | CT as % IB Control |
| Control - Inhibitor Blood (IB) | #N/A | #N/A | N/A | 100% |
| IB + FVIII control | 91 | 0 | N/A | 96% |
| IB + PEGLip control | 0 | 90 | N/A | 82% |
| IB+PEGLip-FVIII | 91 | 36 | 10:1 | 96% |
| IB+PEGLip-FVIII | 91 | 56 | 15:1 | 39% |
| IB+PEGLip-FVIII | 91 | 74 | 20:1 | 29% |
| IB+PEGLip-FVIII | 81 | 83 | 25:1 | 25% |
| IB+PEGLip-FVIII | 70 | 84 | 30:1 | 18% |
| IB+PEGLip-FVIII | 25 | 88 | 90:1 | 12% |
| IB+FlexPEGLip-FVIII | 48 | 19 | 10:1 | 100% |
| IB+FlexPEGLip-FVIII | 48 | 39 | 20:1 | 100% |
| IB+FlexPEGLip-FVIII | 48 | 57 | 30:1 | 38% |
치료 전 피험자의 저해제 혈액은 필요한 시간 내에 응고되지 않았다. 이는 저해제 혈액에 FVIII 단독 또는 PEGLip 단독으로 스파이크했을 때 해결되지 않았다. 마찬가지로 저해제 혈액에 10:1의 PEGLip-FVIII 혼합물을 주입했을 때에도 응고 시간은 보정되지 않았다.
그러나 15:1 이상의 PLP-00:FVIII과 30:1 이상의 PLP-01:FVIII의 혼합물은 모두 저해제 혈액의 응고 시간을 현저히 감소시켰다. 도 4 참조.
결론적으로, 15:1 이상의 비율로 FVIII에 PEGLip(PLP-00)을 첨가하면 혈액 내 저해제에 의한 FVIII의 작용이 저해되는 것을 방지할 수 있었다. 그러나 낮은 수준의 PEGLip(PLP-00)(10:1)은 FVIII의 저해 작용을 보호하지 못했다. 이는 10:1에서 15:1 사이의 PEGLip(PLP-00):FVIII의 임계 비율이 존재하며, 이 비율에서 PEGLip이 항체 저해제에 대한 보호를 제공하기 시작한다는 것을 의미한다. 90:1의 비율은 30:1의 비율에 비해 거의 이점을 제공하지 않으며, 이는 15:1에서 30:1 사이에 최적의 PEGLip 보존 비율이 있음을 의미한다.
비이온성 계면활성제를 포함하는 두 번째 제형의 페길화 리포솜(F-PEGLip/PLP-01)도 30:1의 F-PEGLip(PLP-01):FVIII 비율에서 저해제 항체 분해로부터 FVIII을 보호했지만, 이 제형의 효과 하한은 20:1보다 높았지만 여전히 PLP-00의 효능을 어느 정도 제공하는 비율이다.
제형의 예시:
| 성분 (g per 100g) | PEGLip | FlexPEGLip |
PEGLip
5kDa |
FlexPEGLip
5kDa |
| PLP-00 | PLP-01 | PLP-02 | PLP-03 | |
| POPC | 8.33 | 6.68 | 8.33 | 8.33 |
| mPEG-2000-DSPE | 0.93 | 0.76 | 0.00 | 0.00 |
| mPEG-5000-DSPE | 0.00 | 0.00 | 1.92 | 1.92 |
| Polysorbate 80 | 0.00 | 0.85 | 0.00 | 0.85 |
| Sodium Citrate Dihydrate | 1.47 | 1.47 | 1.47 | 1.47 |
| Water | 89.27 | 90.24 | 88.29 | 87.44 |
| Total | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 |
| pH | 6.9 | 6.9 | 6.9 | 6.9 |
| Particle size (diameter (nm)) | 118.9 | 112.6 | 164 | 168 |
| Polydispersity index | 0.05 | 0.05 | 0.09 | 0.12 |
Claims (47)
- 콜로이드 입자를 포함하는 조성물로,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 잔기(moiety)를 포함하는 제 1 양친매성 지질(amphipathic lipid) 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (phosphatidyl ethanolamine, PE), 포스파티딜 세린 (phosphatidyl serine, PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 (phospholipid) 잔기를 포함하는 제 2 양친매성 지질(amphipathic lipid) 및
(iii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 이루어진 군에서 선택된 비이온성 계면활성제를 포함하고,
상기 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하고,
상기 콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 비이온성 계면활성제에 대해 30:1~ 2:1 w/w의 비율로 포함하는 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬 에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 500~5,000 달톤(Dalton) 범위의 분자량을 가지는 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 2,000 달톤 또는 약 5,000 달톤의 분자량을 가지는 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 양친매성 지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE- PEG)인 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 양친매성 지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG2000) 또는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-glycero-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG5000)인 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린(PC) 잔기는 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)인 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 90~99:10~1의 몰 비율로 포함하는 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 조성물은 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 97:3의 몰 비율로 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트(polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate)인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 제 1 양친매성 지질, 제 2 양친매성 지질 및 비이온성 계면활성제가 중량비로 10~40:1:0~4의 비율로 포함하는 조성물
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 Factor VIII(FVIII) 분자를 더 포함하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 조성물이 상기 콜로이드 입자와 상기 Factor VIII (FVIII) 분자를 1~90:1의 화학양론적 비율(stoichiometric ratio)로 포함하는 조성물 .
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 조성물은 콜로이드 입자 : Factor VIII (FVIII) 분자가 10~20:1 또는 5~10:1의 화학양론적 비율로 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 치료 활성 화합물(therapeutically active compound)을 더 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 부형제, 희석제 및/또는 보조제를 더 포함하는 조성물.
- 콜로이드 입자를 포함하는 조성물로,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 잔기(moiety)를 포함하는 제 1 양친매성 지질(amphipathic lipid) 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (phosphatidyl ethanolamine, PE), 포스파티딜 세린 (phosphatidyl serine, PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 (phospholipid) 잔기를 포함하는 제 2 양친매성 지질(amphipathic lipid) 을 포함하며,
상기 제2 양친매성 지질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하고, 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 약 2500~약 5000 달톤의 분자량을 가지는 조성물. - 제18항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 5000 달톤의 분자량을 갖는 조성물.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 제2 양친매성 지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE- PEG)인 조성물.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 양친매성 지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG5000)인 조성물.
- 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린(PC) 잔기는 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)인 조성물.
- 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 90~99:10~1의 몰 비율로 포함하는 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 조성물은 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 97:3의 몰 비율로 포함하는 조성물.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 (iii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제25항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트(polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate)인 조성물.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 비이온성 계면활성제에 대해 30:1 ~ 2:1 w/w의 비율로 포함하는 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 조성물은 제 1 양친매성 지질, 제 2 양친매성 지질 및 비이온성 계면활성제를 10 ~ 40: 1 : 0~4 w/w의 비율로 포함하는 조성물.
- 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 Factor VIII(FVIII) 분자를 더 포함하는 조성물.
- 제29항에 있어서, 상기 조성물은 콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자를 1~90:1의 화학량론적 비율로 포함하는 조성물.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 조성물은 콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자를 10~20:1 또는 5~10:1의 화학량론적 비율로 포함하는 조성물.
- 제18항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 치료 활성 화합물을 더 포함하는 조성물.
- 제18항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 부형제, 희석제 및/또는 보조제를 더 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자의 혈우병 치료용인, 조성물.
- 제34항에 있어서, 상기 혈우병은 선천성 혈우병(cH)인 조성물.
- 제34항에 있어서, 상기 혈우병은 후천성 혈우병(aH)인 조성물.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 소아 피험자인 조성물.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 해당하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 피험자에 혈우병을 치료하는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 방법은 Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 개별적으로 또는 동시에 투여하는 추가 단계를 포함하는 방법.
- 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 혈우병은 선천성 혈우병(cH)인 방법.
- 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 혈우병은 후천성 혈우병(aH)인 방법.
- 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 소아 피험자인 방법.
- (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하며,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질 및 (iii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 포함하며, 상기 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하고, 상기 콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질 및 제2 양친매성 지질을 비이온성 계면활성제에 대해 비율이 30:1 ~ 2:1 w/w의 비율을 포함하는, 키트. - 피험자에 혈우병을 치료하기 위한 별도, 동시 또는 후속 사용을 위한 키트로,
(i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하며,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질 및 (iii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 포함하며, 상기 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하고, 상기 콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 비이온성 계면활성제에 대해 30:1~ 2:1 w/w의 비율로 포함하는, 키트. - (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하며,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하며, 상기 제2 양친매성 지질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하고, 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 분자량이 약 2500~약 5000 달톤인, 키트. - 피험자에 혈우병을 치료하기 위한 별도, 동시 또는 후속 사용을 위한 키트로,
(i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하며,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하며, 상기 제2 양친매성 지질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하고, 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 분자량이 약 2500~약 5000 달톤인, 키트 - 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 약학 조성물의 제형.
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