KR20240042134A - A형 혈우병 치료용 변형된 콜로이드 입자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제 또는 항체 저해제 생성 병력이 있는 환자에서 A형 혈우병 치료를 위한 콜로이드 입자의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제 또는 항체 저해제 생성 병력이 있는 환자에서 A형 혈우병 치료를 위한 콜로이드 입자를 포함하는 방법, 키트 및 제형에 관한 것이다.
Description
본 발명은 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제 또는 항체 저해제 생성 병력이 있는 환자에서 A형 혈우병 치료를 위한 콜로이드 입자의 사용에 관한 것이다. 콜로이드 입자는 제1 및 제2 양친매성 지질을 포함하며, 여기서 제2 양친매성 지질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기일 수 있다. 본 발명은 또한 콜로이드 입자를 포함하는 방법, 키트 및 제형에 관한 것이다.
혈액 응고에 이르는 혈액 응고 과정(The coagulation cascade)은 다양한 단백질과 인자들이 관여하는 다단계 과정이며, 부상 시 안전한 혈전 형성을 가능하게 하는 조절 피드백 메커니즘과 결합되어 있다. 혈우병과 같은 혈액 질환의 경우 이러한 인자 중 하나 이상이 결함이 있거나 결여되어 결함이 있는 또는 품질이 낮은 혈전을 유발할 수 있다.
혈액 응고 Factor VIII('FVIII')는 혈액 응고 과정의 이차 지혈 과정에서 증폭 단계에 관여하는 혈액 단백질이다. 혈액 응고 과정의 궁극적 목표는 출혈을 멈추기 위한 혈전을 형성하는 피브린을 생성하는 것이다. 부상을 입으면 혈소판은 '활성화'되어 다른 인자가 특정 작용을 하는 곳에 결합하는 반응 표면을 노출시킨다. 인자 FX가 FXa로 활성화되는 '개시' 또는 '외인성' 단계는 조직 인자(TF)에 의해 FVII가 전환된 후 이 반응 표면에서 TF-FVIIa가 전적으로 매개하여 프로트롬빈에서 트롬빈이 생성되고 피브리노겐이 피브린으로 전환된 다음 FXIII의 작용으로 가교되어 혈전을 형성하게 된다. 이 단계가 시작되면 일반적으로 양질의 혈전이 빠르게 형성되는데, 이는 다른 요인들 중에서도 FVIII을 포함하는 추가 '증폭' 또는 '내인성' 단계로 인해 발생한다. 이 단계에서 FVIII은 활성화(FVIIIa)되어 혈소판의 반응 표면에 결합하고 FIXa와 결합하여 내인성 '테나제' 복합체를 형성한 다음 FX를 FXa로 변환한다. FIX에서 FIXa의 형성도 TF-FVIIa 복합체에 의해 촉매화된다(FIX가 없는 혈우병 B의 경우 제외). 개시 단계에서 생성된 트롬빈은 증폭 단계를 촉매화하는 데 도움을 주며, 이는 최적의 혈전 형성을 위해 TF, FVII, FIX 및 FVIII의 존재가 필요하다는 것을 의미한다.
선천성 A형 혈우병과 같이 FVIII이 없는 경우, FX를 FXa로 전환하는 촉매화를 개시 단계에만 의존해야 하기 때문에 반응이 훨씬 더 느리게 진행된다. 이 경로('외인성 테나제' 경로)는 충분한 FVIII이 부족한 A형 혈우병 환자, 특히 외인성 FVIII(FVIII 치료를 받은 선천성 혈우병 환자의 경우) 또는 자신의 FVIII(후천성 혈우병의 경우 - aHA)에 대한 항체('저해제')가 있는 환자에게 FVIIa의 외부 투여를 통해 강화되는 경로이다.
선천성 A형 혈우병(cHA) 또는 후천성 A형 혈우병(aHA) 치료를 위해 기증된 혈장 또는 재조합 공급원으로부터의 대체 FVIII의 사용은 임상 실무에서 매우 잘 확립되어 있다. 그러나 일부 환자에서 외인성 전달 Factor VIII의 효과를 감소시키는 저해 항체('저해제')가 존재하기 때문에 이러한 생성물의 효능은 제한적이다. 저해제는 cHA 환자('저해제 환자')의 25-35%에서 외인성 Factor VIII 투여에 대한 반응으로 생성하며, aHA에서는 자가면역으로 인해 환자가 자신의 Factor VIII에 대한 저해제를 생성하면서 발생한다.
저해제가 존재하면 단백질이 저해제 항체에 의해 결합되어 중화되고 순환계에서 빠르게 제거되기 때문에 외인성 FVIII을 가진 저해제 환자의 치료 효과가 감소하여 대체 인간 FVIII을 사용한 예방 치료가 매우 어렵거나 일반적으로 불가능하게 된다. 최적의 양에 미치지 못하는 FVIII은 혈전이 형성될 수 있다고 하더라도 혈전이 느리게 형성되거나 일단 형성되면 빠르게 분해되는 품질이 좋지 않다는 것을 의미한다.
야생형 FVIII 분자는 6개의 도메인으로 구성된 2332개의 아미노산으로 구성되어 있다: A1-A2-B-A3-C1-C2. A1-A2-B 도메인은 '중쇄'(Heavy Chain, HC)로, A3-C1-C2 도메인은 '경쇄'(Light Chain, LC)로 구성되며 이 사슬은 비공유로 연결되어 있다. 생체 내에서 FVIII은 일반적으로 순환 과정에서 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand's Factor, VWF)와 관련된다. VWF는 FVIII의 수송을 촉진하고 조기 비활성화 및 제거로부터 보호한다(Mannucci, P.M. et al. (2014) Novel investigations on the protective role of the FVIII/VWF complex in inhibitor development. Haemophilia. 20(suppl. 6), 2-16.) VWF와의 관련성(The association)은 또한 면역원성 감소, 저해제 존재 시 효능 및 면역 관용 치료에서의 유용성과 관련이 있다. SIPPET 시험에서 VWF를 함유한 혈장 유래 FVIII(pdFVIII)의 상용 농축액을 사용하면 재조합 농축액(rFVIII)보다 면역원성이 낮은 것으로 나타났다(Peyvandi, F. et al. (2016) A randomized trial of Factor VIII and neutralizing antibodies in Hemophilia A, N Engl J Med. 374, 2054-64). pdFVIII 농축액의 면역원성 감소는 VWF 샤프론과 관련이 있으며, 이는 FVIII 분자의 중요한 에피토프(epitopes)를 가리거나 그리고/또는 수지상 세포(dendritic cells)에 의한 내세포화를 방지하는 것으로 생각된다(Astermark, J. (2015) FVIII inhibitors: pathogenesis and avoidance. Blood. 125(13), 2045-51). 또한 재조합 FVIII 분자는 대부분 인간화되지 않고 비인간 세포주에서 생산되어 비인간 글리칸 에피토프(non-human glycan epitopes)가 존재하여 잠재적으로 면역원성을 향상시킬 수 있다는 추가적인 합병증을 가지고 있다.
FVIII에서 이러한 에피토프에 대한 저해제의 생성은 혈우병 치료의 가장 빈번한 부작용으로 남아 있다 (Van den Berg et al. (2020). ITI treatment is not a first-choice in children with hemophilia A and low-responding inhibitors: Evidence from a PedNet study. Coagulation and Fibrinolysis. 120, 1166-1172). 이 위험은 이전에 치료받은 적이 없는 환자(PUP)의 경우 전체 생성률이 최대 40%에 달할 정도로 높으며(ibid.), FVIII 활성을 비활성화하여 이러한 환자를 보호하기 위한 대안적이고 비용이 많이 드는 조치가 필요합니다. 일부 환자에서는 면역관용 유도 요법(Immune tolerance induction therapy)이라는 오랜 시간이 걸리고 비용이 많이 드는 기술을 사용하여 저해제를 제거할 수 있지만 이 기술이 모든 환자에게 효과가 있는 것은 아니므로 대체 FVIII 요법을 사용할 수 없다. 저해제 생성의 위험은 대체 FVIII에 처음 노출된 후 처음 20 노출 일(EDs) 동안 가장 높으며, 75 노출 일(EDs)까지 지속된다. (Liesner, R.J. et al. (2021) Simoctocog alfa (NuwiqTM) in previously untreated patients with severe haemophilia A: final results of the NuProtect study. Thromb Haemost. online). 이 기간 동안 환자는 저해제 생성 여부를 모니터링해야 한다.
현재 저해제 생성에 대처하는 두 가지 주요 방법은 저해제 관용 유도(Inhibitor tolerance induction, ITI) 또는 우회 요법(bypass therapies)의 사용이다. ITI는 환자가 정상적인 투여 요법으로 돌아갈 수 있도록 하기 위해 수개월에 걸쳐 FVIII을 대량으로 반복 투여하여 면역 체계에 관용을 유도하는 방법이다. 이 치료법이 항상 효과적인 것은 아니며, 수개월에 걸쳐 고용량의 FVIII을 반복적으로 주사하는 것은 환자에게 불쾌감을 줄 뿐만 아니라 의료 시스템 비용에도 큰 영향을 미친다. 따라서 '저해제 환자(inhibitor patient)'는 병력에서 치료용 혈액 인자(선천성 혈우병의 경우)에 대한 반응으로 저해 항체('저해제, inhibitor)가 생성했거나 자신의 FVIII(후천성 혈우병의 경우)에 대한 저해제가 생성한 개인을 말한다. 이들은 현재 저해제가 있든 없든 존재할 수 있지만, 후자의 경우 ITI를 통해 관용화되지 않았을 가능성이 높으며 FVIII을 다시 투여할 경우 저해제를 생성할 수 있는 상태로 남아있을 것이다.
우회 요법은 증폭 단계를 완전히 '우회'하여 저해제의 문제를 피한다. 가장 일반적인 치료법은 위에서 설명한 대로 혈액 응고 과정의 개시 단계를 지원하는 데 도움이 되는 FVIIa 단독(예: 노보세븐, NovoSeven) 또는 프로트롬빈 복합체 농축액(prothrombin complex concentrate, PCC)(예: 활성화된 PCC인 FEIBA)으로 병용하는 것이다. 이러한 전문 치료법도 비용이 많이 들며, 온디맨드 사용(on-demand use)은 ITI 치료와 거의 동일하다. 예방적 사용은 매우 비싸기 때문에 이러한 환자들은 예방적 치료가 약속하는 마음의 평화를 얻지 못할 가능성이 높다. 최근에는 이중특이항체(bi-specific antibody)를 사용하여 FIXa와 FX를 결합하는 데 있어 FVIIIa의 역할을 대체하려는 시도가 이루어지고 있다.
FVIII의 지속적인 부재 속에서 우회 방법만으로는 증폭 단계를 가능하게 하지 않기 때문에, 이는 차선책이며, 다른 치료법에서는 돼지(porcine) FVIII 또는 활성화된 인간 FVIII(FVIIIa)와 유사한 결합 기능을 수행할 수 있는 항체와 같은 다른 분자들 같은 인간 FVIII의 유사체 및 모방체(simulacra and mimetics)의 사용을 통해 내인성 테나제 복합체와의 결합을 시도하고 있다. 이러한 분자들은 정상적인 FVIII 저해제 항체에 의해 인식되지 않을 수 있지만, 체내에 이질적인 단백질 생성물이기 때문에 자신에 대한 항체를 생성할 수 있다는 우려가 남아 있다. 또한 이들의 작용 방식은 일반적인 트롬빈의 과잉 생성을 방지하도록 고도로 적응된 네이티브 Factor VIII의 조절 기능을 완전히 복제하지 못한다. 일부 항체 기반 생성물(antibody-based products)의 반감기가 길다는 점도 우려할 수 있는데, 이는 출혈이 발생했을 때 구조 요법(일반적으로 저해제 환자의 경우 FVIIa 또는 aPCC 복합체)과 준비된 모방체(reserve of the mimetic)를 함께 투여하면 환자가 혈전 발생의 위험에 처할 수 있기 때문이다.
또 다른 종류의 새로운 약제인 "재균형제(rebalancing agents)"는 응고가 이루어진 후 혈액 응고 과정을 늦춤으로써 일반적으로 원치 않는 혈전 발생을 예방하는 피드백 루프를 하향 조절하는 데 초점을 맞추고 있다. 현재 세 가지 접근 방식은 조직 인자 경로 저해제(Tissue Factor Pathway Inhibitor, TFPI), 항트롬빈 또는 활성화된 단백질 C를 공격하는 것이다. 이 명세서를 쓰는 시점에서는 아직 시장에 출시되지 않았으며, 더 진보된 프로그램들은 임상시험 중에 혈전 발생으로 어려움을 겪고 있다.
선천적 A형 혈우병(cHA) 환자들에게는, 이들이 생애 처음으로 자신의 FVIII을 충분한 양으로 생성할 수 있게 하는 유전자 치료에 대한 장기적인 희망이 남아 있다: 이는 충분한 FVIII을 생성하지만 자신의 FVIII에 대한 저해제를 생성한 후천성 A형 혈우병(aHA) 환자들에게는 옵션이 아니다. 이 치료법은 일반적으로 바이러스 벡터를 사용하여 간 세포에 유전 코드를 전달하고 간에서 FVIII 발현을 자극한다. 전달 벡터에 대한 항체가 생성될지 여부는 아직 보이지 않으며 우려되는 사항이다.
몇몇 그룹이 취한 다른 접근법은 거핵세포(골수)에서의 발현을 표적으로 하여 생성된 혈소판 세포가 α-과립(α-granules)에 FVIII을 저장하도록 하는 것이었다. Shi 등(2006)이 처음 제안한 이 접근법(J. Clin. Invest. 116, 1974-1982)은 저해제 및 기타 제거 메커니즘으로부터 FVIII을 숨기고 혈액 응고 과정에 적합한 위치에 분자를 배치할 수 있다는 두 가지 장점이 있다. 같은 그룹의 최근 연구(Baumgartner et al. (2015), J Thromb. Haemost. 13, 2210-2219)에서는 혈소판 유래 FVIII(platelet-derived FVIII, '2bF8')과 혈장 FVIII(rhFVIII - Xyntha, Pfizer)의 상대적 효능을 비교했다. 이 연구에서는 다양한 용량에 따른 트롬빈 생성을 조사한 결과, 두 가지 모두 비슷한 수준의 트롬빈을 생성하지만 혈소판 관련 FVIII은 트롬빈 생성을 상당히 가속화할 뿐만 아니라 트롬빈 생성의 시작과 정점을 자극하는 데 필요한 용량의 1/10만 있으면 된다는 것을 발견했다. 연구팀은 인자 대체 요법에 비해 2bF8의 치료 효과가 더 높은 것은 트롬빈 생성을 가속화하기 때문인 것으로 보인다고 결론지었다.
WO 2009/140598은 Shi 그룹의 유전자 치료 혈소판 유래 연구를 FVIII을 혈소판과 연관시키는 접근법의 예로 설명한다. 본 출원의 명시된 목적은 생체 내(in vivo) 작용 부위 바로 근처에서 치료 단백질을 방출함으로써 면역원성을 감소시키고 부작용을 줄이며 추가적인 이점을 얻는 것이다. 특허 청구된 인자는 상업적으로 이용 가능한 두 가지 핵심적인 외인성 투여 인자인 FVIII과 FIX이다. 표적화 방법은 비교적 구체적이며 혈액 세포의 막 단백질에 특이적으로 결합하는 인자의 구조에 도메인을 설계하는 것을 포함한다. 이 접근 방식은 단백질의 정상적인 구조를 변경하는 것이므로 이물질로 인식되어 항체 생성을 자극할 수 있는 위험을 수반한다.
본 발명은 혈소판 및 기타 세포체와 융합 및/또는 다른 방식으로 결합하여 증폭 단계를 다시 활성화함으로써 외인적으로 적용된 FVIII(A형 혈우병의 경우)을 혈소판에 결합시키고/또는 혈소판으로 포식되도록 함으로써, 이를 필요한 부위에 배치하고 저해 항체 또는 기억 B 또는 T 세포에 의한 인식 및 손상으로부터 보호하는 것을 추구한다. 따라서 본 명세서에 설명된 바와 같이 본 발명과 연관성을 갖도록 하기 위해 FVIII을 더 이상 수정할 필요는 없다.
본 발명은 환자 자신의 FVII(및 FVIIa)를 혈소판에 추가로 연결하고/또는 혈소판에 의해 포식되도록 하여 증폭 단계를 자극하기 위해 트롬빈 버스트(burst)를 제공하는 데 가장 필요한 부위에 배치할 수 있게 한다. 본 발명을 우회제(bypassing agent)로서 외인성 투여하는 경우, 본 발명의 사용은 혈소판 활성화 후 발생하는 혈소판 및 TF 함유 친응고성 미립자(TF-bearing pro-coagulatory microparticles)와 연관되도록 FVIIa를 표적으로 하는 데에도 사용될 수 있다.
본 발명은 환자 자신의 FVIII(결핍될 정도로 부족하지 않은 경우)을 혈소판에 추가로 연결하거나/또는 혈소판에 의해 포식될 수 있게 함으로써, 증폭 단계를 자극하기 위해 트롬빈 버스트를 제공하는 데 가장 필요한 부위에 배치할 수 있게 해준다.
본 발명은 혈소판과 융합하는 다른 세포체를 파괴하여 FVII를 TF-FVIIa로 전환하는 것을 촉매화하는 수명이 긴 TF 함유 친응고성 미립자(TF-bearing pro-coagulant microparticles, TFBPM)를 생성하고, FIX를 FIXa로, FX를 FXa로 전환하는 것도 촉매화하여 외인성 경로의 효능을 장기간 향상시켜 트롬빈 버스트을 더 크게 하고 FVIII 독립 트롬빈 생산을 더 지속할 수 있게 한다.
본 발명의 궁극적인 목적은 혈소판 상 및/또는 혈소판 내에(그리고 활성화된 이후 활성화된 형태) 그리고 TF 함유 친응고성 미립자 (TFBPM)의 우회 작용 생산을 통해 FVIII을 농축 및 고정함으로써, 부상 발생 시 트롬빈 생성의 비정상적으로 빠른 버스트를 활성화하고 유지하여 분해에 저항하는 단단하고 양질의 혈전으로 빠르게 안정화될 수 있는 혈전 형성을 촉진하는 데 있다.
본 발명은 치료하고자 하는 질환에서 정상보다 낮은 수준의 제한된 양의 FVIII의 효과를 농축 및 증폭시킴으로써, 혈우병 환자, 특히 저해 항체가 단백질을 파괴하여 보호되지 않아 일반적으로 FVIII을 투여할 수 없는 저해제 환자의 지혈을 위해 필요한 주사 횟수를 줄이고/또는 더 적은 용량을 투여할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 여러 가지 방식으로 작용하여 제한된 양의 FVIII과 FVIII에 대한 저해제가 모두 존재할 때 FX를 FXa로 전환하는 것을 개선할 수 있다. 첫째, FX의 FXa 전환을 촉매화하기 위해 FIXa와 테나제 복합체를 형성할 수 있는 제한된 양의 FVIII의 잠재력을 보호, 향상 및 극대화함으로써; 둘째, FX와 FXa의 전환을 촉매화하는 대체 테나제 복합체를 제공하기 위해 FVIIIa를 모방하고 FIXa와 결합시킴으로써; 셋째, FX와 FXa의 전환을 촉매화하기 위해 대체 테나제 복합체를 제공함으로써; 셋째, TFBPM의 생성을 통해 외인성 경로를 상향 조절하고, 외인성 테나제 복합체를 통해 FX가 FXa로 전환되는 것을 자극하기 위해 FVII/FVIIa를 농축함으로써; 마지막으로, 상향 조절된 외인성 경로를 통해 FIX가 FIXa로 전환되어 내인성 테나제 복합체의 형성에 공급되도록 강화한다. 이러한 작용을 통해 본 발명은 내인성 경로의 테나제 복합체에서 FVIII의 활성을 보호, 보존 및 극대화하는 동시에 테나제 복합체에서 FVIIIa의 기능을 모방하고 동시에 외재 경로의 상향 조절을 통해 해당 경로를 우회함으로써 다양한 작용 모드를 갖는다.
본 발명은 표준 혈장 유래 또는 재조합 생산 형태의 표적 혈액 인자(예: A형 혈우병의 경우 FVIII)의 사용을 가능하게 함으로써 저해제가 있는 A형 혈우병 환자에게 FVIII을 이용한 예방적 치료를 가능하게 하는 비용 효율적인 솔루션을 제공하는 것이 궁극적인 목표이다.
본 발명은 본 발명(다중 특이 지질 소포 (multi-specific lipidic vesicle))을 표적 혈액 인자와 함께 투여하거나 별도로 투여할 수 있으므로, 표준 치료 외인성 인자(A형 혈우병의 경우 FVIII)와 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 별도 투여는 또한 소량이지만 최적의 양이 아닌 표적 혈액 인자가 내인성적으로 존재하는 환자, 예를 들어 중등도 혈우병 환자 또는 유전자 치료 후 자신의 표적 혈액 인자(target blood factor)를 생성하는 능력이 제한적으로 회복된 환자에게도 사용될 수 있다.
본 발명의 요약
본 발명은 항체 저해제를 가진 혈우병 환자 또는 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 이력이 있는 혈우병 환자들을 치료하기 위한 콜로이드 입자를 포함하는 조성물, 방법, 키트 및 제형을 제공한다. 예를 들어, 후천성 혈우병(aHA) 또는 FVIII에 대한 저해제가 있는 선천성 혈우병(cHA) 환자들이 이에 해당한다.
본 발명의 일 양태에서, 피험자에 A형 혈우병 치료용 콜로이드 입자를 포함하는 조성물로서,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 잔기(moiety)를 포함하는 제1 양친매성 지질(amphipathic lipid) 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (phosphatidyl ethanolamine, PE), 포스파티딜 세린 (phosphatidyl serine, PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 (phospholipid) 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질(amphipathic lipid)을 포함하고, 상기 제2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하는 조성물이 제공된다
상기 피험자는 이전에 Factor VIII (FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 피험자이다.
상기 생체적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 상기 생체적합성 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 500~5,000 달톤(Daltons) 범위의 분자량을 가질 수 있다. 바람직하게는 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 2,000 탈톤 또는 약 5,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.
상기 제2 양친매성 지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG)일 수 있으며, 예를 들어 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG2000) 또는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG5000)일 수 있다.
상기 포스파티딜콜린 (PC)이 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC)일 수 있다.
상기 제1 양친매성 지질과 상기 제 2 양친매성 지질을 90~110:10~1 또는 90~99:10~1일 수 있고, 예를 들어 100:3 또는 97:3의 몰 비율일 수 있다.
상기 콜로이드 입자가 비이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄(polyoxyethylene sorbitan), 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트(polyhydroxyethylene stearate) 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르(polyhydroxyethylene laurylether)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트(polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate)일 수 있다. 상기 콜로이드 입자는 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 상기 비이온성 계면활성제에 대해 중량비로 30:1에서 2:1의 비율로 포함할 수 있다 ({제1 양친매성 지질 + 제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제}).
제 1 양친매성 지질 : 제 2 양친매성 지질 : 비이온성 계면활성제가 중량비로 10~40:1:0~4의 비율일 수 있다({제1 양친매성 지질}:{제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제}).
상기 조성물이 추가로 Factor VIII(FVIII) 분자를 포함할 수 있다. 상기 콜로이드 입자 : Factor VIII (FVIII) 분자가 10~20:1 또는 5~10:1 같이 1~90:1의 화학양론적 비율을 가질 수 있다.
상기 A형 혈우병은 선천성 A형 혈우병(cHA) 또는 후천성 A형 혈우병(aHA)일 수 있다.
상기 조성물은 치료적으로 활성인 화합물을 더 포함할 수 있다. 조성물은 또한 부형제, 희석제 및/또는 보조제를 더 포함할 수 있다.
피험자는 소아 환자일 수 있다.
본 발명의 조성물은 사용 준비가 완료된 수성 현탁액으로 제형화되거나 동결 건조된 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 동결건조 제형은 적절한 희석제, 보조제 또는 부형제(예: 생리적으로 허용되는 완충제)와 함께 별도의 제형으로 제공될 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 이러한 조성물은 별도의 제형으로서 Factor VIII를 추가적으로 포함하거나 본 명세서에 설명된 바와 같이 콜로이드 입자와 함께 제형화될 수 있다.
본 발명의 제2 양태에서는, 콜로이드 입자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 피험자에 A형 혈우병을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기(moiety)를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함한다. 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다. 피험자는 이전에 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 적이 있다.
생체 적합성친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 생체 적합성친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 폴리에틸렌 글리콜은 약 500~약 5000달톤, 바람직하게는 약 2000달톤 또는 약 5000달톤의 분자량을 가질 수 있다.
포스파티딜 콜린(PC)은 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)일 수 있다.
제2 양친매성 지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG)일 수 있는데, 예를 들어 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG2000) 또는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG5000)이다.
콜로이드 입자는 (iii) 비이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 Factor VIII(FVIII)를 더 포함할 수 있다. 또는, 이 방법은 Factor VIII(FVIII)를 포함하는 조성물을 별도로 또는 후속적으로 투여하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
혈우병은 선천성 A형 혈우병(cHA) 또는 후천성 A형 혈우병(aHA)일 수 있다.
피험자는 소아 환자일 수 있다.
본 발명의 제3양태에서는, 피험자의 A형 혈우병 치료에 사용하기 위한 (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 피험자는 이전에 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 적이 있다. 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기(moiety)를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질로 구성된다. 제 2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다.
콜로이드 입자는 (iii) 비이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제4양태에서는, (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공하여 피험자의 A형 혈우병 치료에 개별적으로, 동시에 또는 후속적으로 사용할 수 있도록 한다. 피험자는 이전에 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 적이 있다. 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질로 구성된다. 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다.
콜로이드 입자는 (iii) 비이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제5양태에서는 피험자에 A 형 혈우병 치료용 콜로이드 입자를 포함하는 약학 조성물의 제형으로, 상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (PE), 포스파티딜 세린 (PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하며, 상기 제2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하는 제형을 제공한다. 상기 피험자는 Factor VIII (FVIII)에 대한 항체 저해제를 이전에 생성한 적이 있다.
콜로이드 입자는 (iii) 비이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 콜로이드 입자는 비공유적으로 가역적으로 FVIII을 결합할 수 있을 뿐만 아니라 혈소판 및 혈액의 다른 세포 요소와 결합 및 융합할 수 있다. 따라서 제한된 양의 외래적으로 적용된(exogenously applied) Factor VIII (FVIII)이 혈소판의 표면 및/또는 내부에서 내인성 혈액 인자(예를 들어, FVII/FVIIa)와 함께 농축되고, 이러한 연관성이 저해제에 의한 분해 및 정상적인 제거 메커니즘으로부터 (정상보다 낮은 농도로 존재하는) Factor VIII(FVIII)를 보호할 뿐 아니라 조직 인자(TF)를 함유하는 TF 함유 친응고성 미립자 (TFBPM)의 병행 생산으로 인해 부상 시 혈액 응고 과정의 신속한 시작 및 가속을 가능하게 할 수 있도록 한다. 그 결과 혈우병 환자, 특히 보호되지 않는 표적 혈액 인자(예: A형 혈우병의 경우 FVIII)가 빠르게 제거되는 저해제 환자에서 더 나은 품질의 혈전이 더 빨리 형성되어 이러한 환자들에게 훨씬 안전한 치료 옵션을 제공할 수 있다.
본 발명은 저해제 환자로서 혈액 응고 인자가 결핍되어 있고 대체 인자의 사용이 일반적으로 효과가 없는 환자에게 생체 적합성 폴리머로 유도체화된 인지질이 혈액 인자가 결핍되어 있고 해당 혈액 인자에 대한 항체 생성 병력이 있는 환자에게 결핍된 인자와 함께 또는 별도의 주사로 투여될 때 혈액 응고 과정(The coagulation cascade)에 두 가지 유익한 효과가 있다는 놀랍고 뜻밖의 발견에 기초하고 있다. 첫째, 표적 혈액 인자(예: A형 혈우병의 경우 FVIII)에 대한 저해제가 있는 경우 외인성 표적 혈액 인자의 반감기를 연장하여 지혈 범위를 확장할 수 있다. 둘째, 응고 시작 시간("응고 시간(Clotting Time )")과 응고 품질("최대 응고 강도(Maximum Clot Firmness )")을 감소시키는 등 FVIII에 독립적인 방식으로 혈액 응고 과정을 향상시킨다. 이론에 얽매이고 싶지 않지만 후자의 효과는 다양한 원인에 기인할 수 있다: 예를 들어 혈액 응고 과정 내의 여러 개체와 가역적인 비공유 결합 친화력을 가짐으로써 혈소판 및 혈소판 내 기존 내인성 혈액 인자(예: FVII 및 FIX(A형 혈우병의 경우))의 결합 및 이에 따른 농도 증가; 본 발명과 혈액의 세포 성분의 융합에 의해 자극되는 조직 인자를 함유하는 친응고성 미립자의 생산을 통한 외인성 응고 경로의 상향 조절, 이 미립자는 혈액 응고 과정의 성분에 대한 확장된 반응 표면 역할을 할 뿐만 아니라 다른 우회제와 유사한 방식으로 외인성 경로를 강화하는 TF를 제공한다; FX에서 FXa로의 촉매화를 위한 대체 테나제 복합체를 형성하기 위해 FIXa와 협력; 외인성 경로의 상향 조절을 통해 테나제 복합체에 공급하기 위해 FIXa의 생산을 향상시킨다.
실시예에서, 주입되는 PEGLip의 양과 특정 표적 혈액 인자(예를 들어 A형 혈우병인 경우 FVIII)의 특성, 특히 환자의 혈우병 중증도에 적합한 양이어야 하는 특정 활성(IU/mg) 및 분자량(g/mol 또는 kDa)과 관련하여 이상적인 PEGLip 입자의 제형이 제공된다. 주사 전에 코포뮬레이션(co-formulating)을 하면 다수의 PEGLiP 입자가 이러한 표적 혈액 인자 분자에 가역적으로 결합하게 된다. 본 발명의 중요한 측면은 주사 시 충분한 PEGLiP가 표적 혈액 인자에 결합되지 않고 자유 상태로 남아 표적 혈액 인자에 독립적인 작용, 예를 들어 A형 혈우병의 경우 혈류에서 환자의 FVII 및 FIX를 가역적으로 충분히 포집하여 외부 경로를 강화하거나 대체 테나제 복합체를 형성할 수 있게 하는 것; 또는 본 발명의 이점을 극대화하기 위해 혈소판 및 기타 세포 성분과의 적절한 상호 작용을 통해 외인성 경로를 향상시키기에 충분한 TFBPM을 생성하는 것이다.
실시예에서, 따라서 어떤 표적 혈액 인자(예를 들어, 혈우병 A의 경우 FVIII)에 대한 저해제를 가진 환자에게 투여하기 위해, 투여 전에 충분한 비관련 PEGLiP(un-associated PEGLiP)를 남겨두어 FVIII 독립적인 작용이 효과적으로 표적 혈액 인자 단독에서 기대되는 것 이상으로 지혈 커버를 향상 및 확장할 수 있도록 하는 비율로 PEGLip 입자와 FVIII 분자의 혼합이 이루어질 수 있는, Factor VIII와 혼합된 현탁 PEGLip(콜로이드 입자)을 포함하는 조성물이 제공된다.
표적 혈액 인자(예: A형 혈우병의 경우 FVIII)를 별도로 투여하거나 표적 혈액 인자의 내인성 농도가 최적 이하인 환자에게 본 발명을 단독으로 투여하려는 경우, 주입 전에 a) 투여할 표적 혈액 인자의 양 또는 환자의 기존 표적 혈액 인자의 최적 이하 농도에 대한 평가; b) 사용된 특정 단백질의 특정 활성; 및 c) 사용된 특정 단백질의 분자 질량;를 기반으로 혈액 내 PEGLip과 표적 혈액 인자의 최적 비율을 계산할 수 있다.
본 발명의 설명
본 발명은 이전에 중요한 내인성 혈액 인자에 대한 항체 저해제를 생성한 피험자의 A형 혈우병 치료에 사용하기 위한 콜로이드 입자를 포함하는 조성물, 방법, 키트 및 제형을 제공한다. 상기 콜로이드 입자는 혈액 응고 인자와 결합하고 혈소판과 결합 및 융합하여 A형 혈우병 치료에서 혈전 형성을 가속화하고 개선할 수 있다.
FVIII에 대한 저해제(Inhibitors) 또는 항체 저해제(antibody inhibitors)는 항체 저해제(antibodies) 또는 중화 항체(neutralising antibodies)라고도 하는 FVIII에 대한 항체를 지칭한다. 항체는 내인성 FVIII에 대한 자가 항체 또는 외인성 FVIII에 대한 항체일 수 있다.
위에서 설명한 제1양태에 따라, 콜로이드 입자는 (i) 제1 양친매성 지질 및 (ii) 제2 양친매성 지질을 포함한다. 제1 양친매성 지질은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 잔기(moiety)일 수 있다. 포스파티딜콜린(PC) 잔기에의 적절한 예는 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)일 수 있다. 제2 양친매성 지질은 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜 세린(phosphatidyl serine, PS), 포스파티딜 이노시톨(phosphatidyl inositol, PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기이다. 포스파티딜 에탄올아민(PE)의 적절한 예는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올-35아민(DSPE)일 수 있다. 아미노프로판디올 디스테아로일(Aminopropanediol distearoyl, DS) 지질은 양친매성 지질인 카바메이트 연결 비하전성 지질 폴리머(a carbamate-linked uncharged lipopolymer)이다. 포스파티딜 에탄올아민(PE)의 다른 예로는 DPPE, DMPE 및 DOPE가 있다.
본 발명의 콜로이드 입자는 전형적으로 지질 소포(the form of lipid vesicles) 또는 리포솜(liposomes)의 형태이며 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 콜로이드 입자에 대한 참조는 문맥에 달리 명시되지 않는 한 리포솜 및 지질 소포를 포함한다.
제2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기이다.
생체 적합성 친수성 폴리머의 목적은 콜로이드 입자를 입체적으로 안정화하여 시험관 내에서(in vitro) 콜로이드 입자의 융합을 방지하고 생체 내(in vivo) 망상 내피 시스템(reticuloendothelial system)에 의해 콜로이드 입자가 흡착을 피할 수 있도록 하는 것이다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 분지형(branched) 또는 비분지형(unbranched)일 수 있다. 생체 적합성 폴리머는 분자량이 약 100~약 10,000 Da, 적합하게는 약 2000~약 5000 Da일 수 있으며, 바람직한 값은 약 100 Da, 250 Da, 350 Da, 550 Da, 750 Da, 1000 Da, 1500 Da, 2000 Da, 2500 Da, 3000 Da, 3500 Da, 4000 Da, 4500 Da, 5000 Da, 5500 Da, 6000 Da, 6500 Da, 7000 Da, 7500 Da, 8000 Da, 8500 Da, 9500 Da 및 10,000 Da일 수 있다. 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질의 적절한 예로는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG)일 수 있다(예: N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000)) 및 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG5000)).
제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질은 90~110:10~1, 90~100:10~1, 90~99:10~1, 93~99:7~1, 95~99:5~1의 몰비로, 적합하게는 100:3, 100:3, 99:3, 98:3, 97:3, 96:3 또는 95:3의 몰비로 제공될 수 있다. 97.3의 몰 비율은 32.4:1의 몰 비율로 표현할 수도 있고, 마찬가지로 100:3의 몰 비율은 33.2:1의 몰 비율로 표현할 수 있다. 또한 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질의 비율은 예를 들어, 1:1~20:1 w/w, 적합하게는 2:1~12:1 w/w 또는 4:1~9:1 w/w, 예를 들어 4:1, 5:1, 6:1, 9:1 또는 12:1 w/w의 중량/중량비(weight/weight ratio)로 표현될 수 있다. 바람직하게, 상기 조성물은 팔미토일-올레오일 포스파티딜 콜린(POPC)과 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올-아민(DSPE)의 혼합물로 구성된 콜로이드 입자를90~99:10~1, 93~99:7~1, 95~99:5~1의 몰 비율(POPC:DSPE)로서, 적합하게는 97:3에 포함시킬 수 있다. 중량/중량비로 표현하면, 예를 들어 1:1~20:1 w/w, 적합하게는 2:1~12:1 w/w, 예를 들어 4:1, 5:1, 6:1, 9:1 또는 12:1 w/w가 될 수 있다.
일례로, 콜로이드 입자는 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000)을 97:3 몰 비율 또는 9:1 w/w 비율로 구성할 수 있다.
콜로이드 입자는 직경(diameter) 0.05~0.0.3μm 범위의 평균(mean) 입자 크기(평균 입자 크기, average particle size)를 가질 수 있으며, 적합하게는 0.1, 0.15, 0.2 또는 0.25 microns(μm) 정도이다. 평균 입자 크기(평균 입자 크기)는 100~130 nanometres(nm), 적합하게는 110~120nm, 112~118nm, 150~170nm, 155~165nm, 보다 적합하게는 110, 112, 114, 116, 118, 120, 160, 162, 164, 166, 168 또는 170nm가 될 수 있다.
평균 입자 크기는 Malvern Zetasizer Ultra ZSU 5700을 사용하여 측정할 수 있다. 이 기기는 빛의 산란을 통해 입자 크기를 측정하는데, 레이저 빛을 시료에 비추고 입자에 부딪히는 후방 산란이 173°의 각도에서 감지된다(173°는 거의 자체로 되돌아오는 각도이므로 후방 산란이라는 용어가 사용됨). 입자의 브라운 운동(Brownian motion)으로 인해 빛은 다양한 강도로 산란된다. 브라운 운동의 속도는 입자 크기와 관련이 있기 때문에 스토크스-아인슈타인 관계식(Stokes-Einstein relationship)을 통해 입자 크기를 유추할 수 있다.
평균 입자 크기는 콜로이드 입자의 평균 직경에 해당한다. 입자 크기 측정과 관련하여 인용된 다분산 지수(polydispersity index, PDI)는 콜로이드 입자의 평균 직경 주위의 분포 측정에 해당한다. 예를 들어, 본 발명에서 다분산 지수는 최대 0.2, 적합하게는 0.15, 0.12, 0.1 또는 0.5가 될 수 있다.
PDI는 표준편차/평균의 제곱으로 계산된다(예: PDI = (s/m)2 ).
평균 입자 크기와 다분산 지수를 통해 표준 편차를 계산할 수 있다. 표준 편차의 두 배를 사용하면 입자 크기 주변의 95% 신뢰 구간, 즉 시료에 있는 콜로이드 입자의 95%가 속하는 범위를 계산할 수 있다.
적합하게는, 95% 평균 입자 크기는 50~500nm, 적합하게 50~290nm, 50~285nm, 65~265nm, 65~260nm, 65~180nm, 65~175nm, 65~170nm, 65~165nm, 더 적합하게 65~173nm, 64~161nm, 65~263nm 또는 54~282nm가 될 수 있다.
콜로이드 입자는 수성 구연산염 완충액(aqueous citrate buffer)에 총 지질 9%(w/v)의 현탁액으로 저장할 수 있으며, 적절하게는 총 지질 7%, 6%, 5%, 4%(w/v)의 현탁액으로 저장할 수 있다.
콜로이드 입자는 (iii) 비이온성 계면활성제와 같은 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 비이온성 계면활성제는 폴리옥시 에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트(폴리소르베이트 80 또는 트윈 80이라고도 함)일 수 있다. 제 1 양친매성 지질과 제 2 양친매성 지질은 비이온성 계면활성제에 대해 30:1~2:1 w/w의 비율로 제공될 수 있으며, 적합하게는 25:1, 20:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1 또는 5:1 w/w({제 1 양친매성 지질 + 제 2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제} )로 제공될 수 있다. 몰 비율로 표현하면, 예를 들어 10~20:1, 12~18:1, 14~16:1, 적합하게는 14:1, 15:1 또는 16:1이 될 수 있다. 계면활성제 농도는 중량 대비 0.25%에서 5%, 예를 들어 1% ~ 3%, 1% ~ 2%일 수 있으며, 일부 예시적인 값은 0.47%, 0.85% 또는 3.5%일 수 있다.
비이온성 계면활성제는 페길화(PEGylated)될 수도 있다. 페길화 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트(폴리소르베이트 80 또는 트윈 80이라고도 함)일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 생체 적합성 폴리머는 분자량이 약 100~약 10,000 Da, 적합하게는 약 2000~약 5000 Da일 수 있으며, 바람직한 값은 약 100 Da, 250 Da, 350 Da, 550 Da, 750 Da, 1000 Da, 1500 Da, 2000 Da, 2500 Da, 3000 Da, 3500 Da, 4000 Da, 4500 Da, 5000 Da, 5500 Da, 6000 Da, 6500 Da, 7000 Da, 7500 Da, 8000 Da, 8500 Da, 9500 Da 및 10,000 Da일 수 있다.
비이온성 계면 활성제는 콜로이드 입자와 연관되거나, 콜로이드 입자의 지질 이중층 막(the lipid bilayer membrane)에 통합되거나, 콜로이드 입자의 지질 이중층 막의 외층에 통합되거나, 콜로이드 입자의 내부 층 지질 이중층 막에 통합될 수 있다.
따라서, 제 1 양친매성 지질과 제 2 양친매성 지질과 비이온성 계면 활성제의 비율은 2~10:1:0~2, 3~9:1:0.5~1.5, 4~9:1:0.5~1 w/w, 적합하게는 9:1:0, 9:1:1, 4:1:0 또는 4:1:0.5 w/w로 제공될 수 있다 ({제1 양친매성 지질}:{제2 양친매성 지질}:{비이온성 계면활성제}). 몰 비율로 표현하면, 예를 들어 30~40:1:0~5, 30~35:1:0~2.5, 30~35:1:0~2.5, 적합하게는 33:1:0, 33:1:2 또는 32:1:3이 될 수 있다.
상기 조성물은 또한 Factor VIII(FVIII) 분자 또는 그 단편(fragment)을 더 포함할 수 있다. 조성물이 Factor VIII 단편을 포함하는 경우, Factor VIII 단편은 생물학적 활성을 유지하는 활성 단편이거나 네이티브 Factor VIII 분자와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 것이 적합할 수 있다. 예를 들어, 그러한 활성 단편 중 하나는 B-도메인이 절단된 Factor VIII 단편이다. 또한, 조성물은 네이티브 혈액 인자 및 그 단편을 모두 포함할 수도 있다. 콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자는 1~90:1, 바람직하게는 2~90:1, 5~85:1, 6~10:1, 7~8:1, 7.5~20:1, 10~80:1, 10~15:1, 10~16:1, 10~20:1, 13~19:1, 15~16:1, 15~75:1, 20~70:1, 25~65:1, 30~60:1, 35~55:1, 40~50:1, 예를 들어 10~20:1 및 5~10:1의 화학양론적 비율(stoichiometric ratio)로 제공될 수 있다. 달리 표현하면, 콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자는 1:1, 2:1, 5:1, 7.5:1, 10:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 22:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 86:1, 90:1, 예를 들어 15.5:1, 13:1, 8:1, 7.7:1, 7:1의 화학양론적 비율로 제공될 수 있다. 보다 구체적으로 전체 길이 FVIII 분자의 경우 화학양론적 비율은 10:1~19:1, 최적은 10~15:1 또는 5~10:1, 최적은 7.5:1일 수 있다. 베타 도메인이 삭제되거나 베타 도메인이 잘린 FVIII 분자의 경우 범위는 13~19:1, 최적은 10~16:1 또는 6~10:1, 최적은 8:1일 수 있다.
이론에 얽매이고 싶지 않지만, 조성물에 존재하는 과량의 콜로이드 입자는 유리 콜로이드 입자(free colloidal particles)가 다른 핵심 혈액 응고 인자(예: A형 혈우병의 경우 FVII 및 FIX)와 가역적으로 결합할 수 있는 충분한 양이며, 입자 관련 Factor VIII(FVIII)가 투여 후 혈소판에 포집되어 가역적으로 결합하여 혈소판에 인자를 농축하고 혈액 외 응고 경로를 촉진할 수 있다고 추정된다.
Factor VIII은 적합한 공급원으로부터 얻을 수 있으며 분자생물학적 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술로 생산되거나 화학적으로 합성되거나 포유류의 모유에서 형질전환적으로 생산된 재조합 단백질일 수도 있고 천연 공급원(예: 혈장으로부터 정제된)에서 분리된 Factor VIII일 수도 있다. 적합한 Factor VIII은 인간 Factor VIII와 같은 포유류 Factor VIII이다.
Factor VIII와 같은 혈액 인자는 표면 부착 특성이 특징이다. 이는 혈액 응고 과정의 필수적인 특징으로, 효소와 보조 인자가 혈액 응고의 다른 참여 물질, 혈소판 표면 및 부상 부위의 조직에 부착되어야 한다. 혈전이 부상 부위에 남아 위험한 혈전증을 유발하기 위해 표류하지 않도록 하는 것이 특히 중요한다. Factor VIII와 같은 혈액 인자는 유리 및 플라스틱 표면에 과도하게 달라붙기 때문에 이러한 특성은 의약품 제형에 어려움을 준다. 실제로 폴리옥시 에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트(Tween®80)와 같은 비이온성 계면활성제를 광범위하게 사용하면 이러한 문제를 완화할 수 있다.
콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자의 화학양론적 비율(stoichiometric ratio)을 결정하려면 다음 계산을 수행해야 한다. 먼저 FVIII IU당 FVIII 분자를 결정해야 한다. FVIII의 질량은 FVIII의 변형(예: 전체 길이와 β-도메인 삭제)에 따라 달라진다는 점에 유의해야 한다. 둘째, 콜로이드 입자 그램당 입자 수를 결정해야 한다. 마지막으로, 이에 따라 화학양론적 비율을 결정할 수 있다. 35 IU/kg FVIII(베타 도메인 삭제 및 전체 길이 모두)과 22 mg/kg 콜로이드(PEGLip)를 사용한 계산의 예는 다음과 같다:
계산 예제 1, 베타 도메인이 삭제된 rFVIII
계산 예제 2, 전체 길이 rFVIII
상기 조성물은 추가적인 치료 활성 화합물 또는 분자, 예를 들어 항염증제, 진통제 또는 항생제 또는 Factor VIII의 활성을 촉진하거나 향상시킬 수 있는 기타 약학 활성제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 표준 관행에 따라 본 명세서에 설명된 바와 같이 투여에 적합한 약학 조성물로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 임의의 적합한 부형제, 희석제 및/또는 보조제를 더 포함할 수 있다. 완충액과 같은 적절한 희석제는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 수용성 염과 적절한 산으로 제형화될 수 있다. 적합한 완충액은 아미노산(예: 히스티딘), 무기산의 염(예: 구연산, 젖산, 숙신산, 구연산 및 인산으로 이루어진 군으로부터 선택된 산) 및 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속(예: 나트륨 염, 마그네슘 염, 칼륨 염, 리튬 염 또는 칼슘 염 - 예: 염화나트륨, 인산염 나트륨 또는 구연산염 나트륨)을 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않다. 이러한 부형제, 완충제 및/또는 보조제의 예로는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS), 인산 칼륨, 인산 나트륨 및/또는 구연산 나트륨 등이 있다. 기타 생물학적 완충제에는 PIPES, MOPS 등이 포함될 수 있다.
적합한 수성 구연산염 완충액은 구연산 나트륨 완충액 또는 구연산 칼륨 완충액(예: 50mM 구연산 나트륨 완충액)일 수 있다. 적합한 인산염 완충액은 인산나트륨 완충액, 예를 들어 25mM 인산나트륨 완충액일 수 있다.
조성물에 적합한 pH 값은 일반적으로 생체 내(in vivo) 투여에 허용되는 모든 pH 값(예: pH 5.0~pH 9.0, 적합하게는 pH 6.7~pH 7.4 또는 pH6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.2)을 포함한다. pH는 적절한 산 또는 알칼리(예: 염산)로 적절히 조정할 수 있다.
본 발명의 조성물은 사용 준비가 완료된 수성 현탁액으로 제형화되거나 동결 건조된 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 동결건조 제형은 적절한 희석제, 보조제 또는 부형제(예: 생리적으로 허용되는 완충제)와 함께 별도의 제형으로 제공될 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 이러한 조성물은 별도의 제형으로서 Factor VIII를 추가로 포함하거나 본 명세서에 설명된 바와 같이 콜로이드 입자로 제형화될 수 있다. 일반적으로 재구성을 위해 동결 건조된 Factor VIII(FVIII) 한 바이알(vial)과 별도의 콜로이드 입자(PEGLip) 용액 한 바이알이 제공된다.
콜로이드 입자는 수성 구연산염 완충액에 총 지질 9%(w/v)의 현탁액으로 저장할 수 있으며, 적절하게는 총 지질 7%, 6%, 5%, 4%(w/v)의 현탁액으로 저장할 수 있다. 환자에게 필요한 외인성 Factor VIII(FVIII)의 농도가 알려지면, 필요한 경우 벌크 용액을 50mM 구연산나트륨 용액으로 희석하여 콜로이드 입자의 농도를 조정하여 Factor VIII(FVIII)가 첨가될 때 원하는 비율의 콜로이드 입자와 Factor VIII(FVIII) 분자의 비율이 얻어질 수 있도록 조정할 수 있다.
Factor VIII은 전적으로 외인성일 수 있으며, 예를 들어 저해제가 있는 중증 혈우병 환자의 경우, 혈장 농축액에서 추출하거나 재조합하여 생산할 수 있다. 또는 환자가 Factor VIII를 자가 제조할 수 있는 능력을 어느 정도 보유하고 있는 경우(예: 경증 또는 중등도 혈우병 환자 또는 후천성 혈우병 환자), 외인성 Factor VIII를 더 적은 양 또는 전혀 투여하지 않을 수 있다.
이론에 얽매이고 싶지 않지만, 조성물에 존재하는 과량의 콜로이드 입자가 유리 콜로이드 입자가 다른 핵심 혈액 응고 인자(예: A형 혈우병의 경우 FVII 및 FIX)와 가역적으로 결합할 수 있을 만큼 충분한 양으로 존재하여 투여 후 혈소판에 포집되어 가역적으로 결합하여 혈소판에 응고 인자를 집중시키고 외인성 혈액 응고 경로를 촉진할 수 있다는 추정이 있다.
주입 시 콜로이드 입자는 혈소판 표면에 가역적으로 결합하여 다른 혈소판의 막과 융합한다. 콜로이드 입자 입자가 이미 외인성 Factor VIII와 결합되어 있는 경우, 이는 혈소판 표면에 Factor VIII를 집중시키고 일부는 혈소판으로 포식되거나 생성되는 TF 함유 친응고성 미립자와 결합하여 단백질을 저해제 및 정상적인 제거 메커니즘(예: LRP-1)으로부터 보호하여 단백질의 반감기가 길어지게 한다. 중등도 또는 경증 혈우병 환자의 경우, 콜로이드 입자는 또한 순환하는 Factor VIII를 포집하여 혈소판 또는 생성되는 TF 함유 친응고성 미립자 내에 농축시킨다. 주입 시 Factor VIII와 관련이 없는 콜로이드 입자는 FVII뿐만 아니라 다른 내인성 혈액 인자(예 FIX)를 혈소판 표면에서 포집하고 이를 생성된 TF 함유 친응고성 미립자와 결합하기 시작한다; 또한 인자가 부착되지 않은 입자도 혈소판 표면에 결합 및 융합하여 TF 함유 친응고성 미립자를 형성하고 혈액 응고 과정의 소용돌이 동안 혈소판 반응 표면에서 활성화된 형태인 FVIIa 및 FIXa를 포함한 추가 인자를 포집 및 집중시키는 기회주의적 함정으로 작용할 수 있다.
일반적으로 내피가 손상되면 조직 인자는 FVII를 FVIIa로 전환하여 결합한다. 그런 다음 TF-FVIIa 복합체는 활성화된 혈소판 표면으로 이동하여 결합한 후 FX를 FXa로 전환하여 프로트롬빈을 절단하여 트롬빈을 생성하기 시작하는데, 이 과정은 FXa가 (활성화된 혈소판에서 방출된) FVIIa와 결합하여 프로트롬비나제 복합체를 형성하고 활성화된 혈소판의 노출된 막 표면과 이로부터 파생된 TF 함유 친응고성 미립자에도 조립될 때 최적화된다. 본 발명은 FVII를 이 반응 표면에 근접하게 배치하여 많은 TF 함유 친응고성 미립자로 부서질 수 있다. 따라서 콜로이드 입자, 즉 혈소판과 미립자에 결합된 상태로 남아있는 FVIIa로의 전환과 TF-FVIIa 복합체의 형성은 혈소판과 그 미립자의 반응 표면에서 두 가지 중요하고 즉각적인 효과와 함께 발생한다:
1)
이러한 혈소판 및 TF 함유 친응고성 미립자 표면에서도 FX가 FXa로 국소적으로 전환되어 FV('프로트롬비나제 복합체(prothrombinase complex)')와 결합하여 고도로 국소화된 트롬빈 버스트를 생성함으로써 피브린의 생산을 시작하고 동시에 증폭 단계를 촉매화하며;
2)
콜로이드 입자를 통해 공동 국소화(co-localised)된 FVIII과 연관될 수 있는 FIX에서 FIXa로의 국소적(localised) 전환은, 동일한 막 표면에 테나제 복합체를 형성하여, 위의 (1)에서 증가된 개시 단계에 의해 촉매된 증폭 단계를 공급하고 최적화한다. 대안적으로, 또한 콜로이드 입자 막은 대체 테나제 복합체를 형성하여 FX를 FXa로 유인하고 전환할 수 있다.
혈액 응고 과정이 시작되고(initiated) 피브린(fibrin)이 생성되면 혈소판은 일반적으로 응고하여 피브린 메시(fibrin mesh)를 채운다. 콜로이드 입자가 혈소판과 결합하고 융합하는 능력은 혈소판이 그물망에서 서로 접착력을 강화하여 혈전을 안정화시키는 최종 역할을 한다.
본 발명은 여러 가지 방식으로 작용하여 제한된 양의 FVIII과 FVIII에 대한 저해제가 모두 존재할 때 FX를 FXa로 전환하는 것을 개선할 수 있다. 첫째, FX의 FXa 전환을 촉매화하기 위해 FIXa와 테나제 복합체를 형성할 수 있는 제한된 양의 FVIII의 잠재력을 보호, 향상 및 극대화함으로써; 둘째, FVIIIa의 작용을 모방하고 FIXa와 결합하여 대체 테나제 복합체를 형성하여 FX를 FXa로 전환하는 촉매화함으로써; 셋째, TF 함유 친응고성 미립자의 생산을 통해 외인성 경로를 상향 조절하고, 외인성 테나제 복합체를 통해 FX를 FXa로 전환하는 것을 자극하기 위해 FVII/FVIIa를 농축함으로써; 마지막으로, 상향 조절된 외인성 경로를 통해 FIX를 FIXa로 전환하여 내인성 테나제 복합체의 형성을 촉진한다. 이러한 작용을 통해 본 발명은 내인성 경로의 테나제 복합체에서 FVIII의 활성을 보호, 보존 및 극대화하는 동시에 테나제 복합체에서 FVIIIa의 기능을 모방하고 동시에 외재 경로의 상향 조절을 통해 해당 경로를 우회함으로써 다양한 작용 모드를 갖는다.
콜로이드 입자는 외인성 경로를 통해 FX에서 FXa로의 전환을 향상시키는 우회제 역할을 할 뿐만 아니라 FVIII을 보호하고 FIX/FIXa를 농축하여 테나제 복합체 형성을 가속화하거나 FIXa와 FVIII 독립적인 테나제 복합체를 형성하여 내인성 경로를 증폭하는 이중 작용을 한다. 강화된 개시(외인성) 및 증폭(내인성) 단계를 함께 사용하면 응고가 더 빨리 시작되고 특히 저해 항체가 있는 경우 일반적으로 감소된 Factor VIII 양으로 가능한 것보다 더 단단한 응고로 결합할 수 있는 섬유소가 더 빨리 생성되어 환자의 출혈을 더 빨리 해결할 수 있다.
따라서 본 발명은 콜로이드 입자의 능력, 특히 혈소판 표면과 혈소판 내부에 정확한 양의 내인성 및 외인성 Factor VIII를 농축하는 콜로이드 입자와 Factor VIII의 특정 배합 비율에 의존할 뿐만 아니라 TF 함유 친응고성 미립자의 생산을 자극하는 능력에 의존한다. 따라서 A형 혈우병의 경우 Factor VIII 저해제가 있는 경우 제한된 양의 Factor VIII로 트롬빈 생성의 시작을 가속화하는 시너지 효과와 함께 TF-FVIIa 중심의 개시 단계(TF-FVIIa-centric initiation phase)와 혈액 응고 과정의 증폭 단계(amplification phase)가 모두 최적화된다.
주입된(injected) 외인성 Factor VIII은 저해제와 정상적인 제거 메커니즘에 의해 분해되지 않고 혈소판에서 인자를 농축하고 TF 함유 친응고성 미립자의 가속화 효과를 통해 더 나은 품질의 혈전이 더 빨리 형성되기 때문에 본 발명은 유전자 치료를 통해 혈소판에서 이소성(ectopic) FVIII을 생성함으로써 발견되는 것처럼 다른 공급 방법보다 Factor VIII를 절약할 수 있는 인자가 될 것이다. 이러한 이점은 환자의 주사 횟수를 줄이거나 주사 횟수를 줄여 처방된 치료의 순응도를 높이고 우발적이고 치명적인 출혈의 가능성을 낮추는 데 도움이 될 것이다.
본 발명은 외인성 Factor VIII 및 내인성 인자(FVII/FVIIa 및 FIX/FIXa)를 혈소판 내외에 집중시키지만, 유전자 치료를 통해 혈소판에서 이소성 FVIII을 생산하려는 성공적인 시도와 달리 장기간의 발생 프로그램, 규제 부담 또는 바이러스 매개 유전자 치료의 비가역적 특성을 필요로 하지 않다.
본 발명은 치료하고자 하는 질환에서 정상보다 낮은 수준의 제한된 양의 Factor VIII(예를 들어 A형 혈우병(HA)의 경우 FVIII)의 효과를 농축 및 증폭함으로써 Factor VIII를 절약할 수 있을 것으로 기대된다, 혈우병 환자, 특히 저해 항체가 단백질을 파괴하여 보호되지 않기 때문에 일반적으로 Factor VIII를 투여할 수 없는 저해제 환자의 경우 지혈을 위해 일반적으로 필요한 주사 횟수를 줄이고/또는 더 적은 용량을 투여할 수 있게 해줄 수 있다.
본 발명은 새로 엔지니어링된 Factor VIII 분자 또는 이러한 분자 또는 활성화된 형태의 모방체(mimetics)를 만드는 접근 방식과 달리, 재조합 인간(recombinant human) FVIII(rhFVIII)과 같이 분자에 외부 서열을 엔지니어링할 필요 없이 현재의 모든 혈장 유래 또는 재조합 Factor VIII 분자와 함께 사용할 수 있다. 따라서 인식되지 않은 새로운 단백질에 대한 면역 조절 반응이 발생할 위험이 줄어든다.
이 두 가지 접근법, 즉 혈소판에서 FVIII을 생산하거나 모방체(mimetics)을 사용하는 것과 달리, 본 발명은 외인성, 촉진 경로의 외인성 성분을 농축할 뿐만 아니라 내인성 인자를 농축하고 TF 함유 친응고성 미립자의 생성을 자극하여 빠른 트롬빈 버스트로 내인성 경로를 증폭시키고, 외인성 경로의 다른 주요 성분(FIXa)의 국소 생성을 촉진하여 새롭고 매우 필요한 이중 작용을 가지고 있다. 이는 Factor VIII 수준이 다시 떨어지면 트롬빈 생성으로 가는 일반적인 경로(the common pathway)를 계속 유도할 수 있게 한다.
본 발명의 사용은 유리 Factor VIII보다 Factor VIII를 절약한다. 이는 환자의 편의성(주사 횟수 감소), 순응도 개선(예방 주사 누락 감소), 의료 경제성 개선(Factor VIII 비용 감소, 혈우병 환자의 순응도가 떨어지고 출혈이 발생했을 때 응급 주입 횟수 감소)을 의미한다.
본 발명은 표준 혈장 유래 또는 재조합 생산 형태의 Factor VIII를 사용할 수 있게 함으로써 저해제가 있는 A형 혈우병 환자에게 Factor VIII 예방 치료를 가능하게 하는 비용 효율적인 솔루션을 제공하는 것이 궁극적인 목표이다.
본 발명의 사용은 저해제를 사용하는 혈우병 환자에서 우회제로서 외인성 FVIIa를 사용하는 것보다 절약된다. 본 발명은 환자 자신의 FVII를 사용할 뿐만 아니라 혈소판에서 이를 농축하고 TF 함유 친응고성 미립자의 생성을 자극하여 FVII의 효과를 극대화함으로써 외인성 FVIIa의 비용과 단백질 과다 투여로 인한 혈전 반응의 우려를 피할 수 있다.
조성물은 주사 또는 주입, 바람직하게는 정맥, 피하, 피내 또는 근육 내 투여로 투여할 수 있다. 주사는 단일 용량의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 주입은 장기간에 걸쳐 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 적어도 하루에 1회, 적어도 하루에 2회, 일주일에 약 1회, 주당 약 2회, 2주에 약 1회 또는 한 달에 약 1회 투여할 수 있다. 또한, 본 조성물은 FVIII의 혈중 농도가 일정한 수준으로 유지되도록 간격을 두고 투여 및/또는 재투여될 수 있으며, 환자의 혈중 FVIII 농도가 치료 이하 또는 치료와 무관한 수준에 도달할 때까지 재투여를 기다릴 필요 없이 지속적이고 일정하며 예측 가능한 치료 효과를 제공할 수 있다. 기존의 관행에서는 일반적으로 혈류에 "건강한 수준(healthy levels)" 또는 치료 효과/관련성 있는 수준의 FVIII이 여전히 존재하는 동안에는 환자에게 후속 용량의 FVIII을 투여하지 않았다. 따라서, 본 발명은 예방에 보다 이상적으로 적합한 혈류 내 FVIII의 치료적 수준을 보다 일관되게 제공한다.
환자의 혈액에서 치료 이하 또는 치료와 무관한 수준의 FVIII은 환자가 전혈 응고 시간을 20분 이하, 15분 이하 또는 12분 이하로 유지할 수 없는 경우로 특징지을 수 있다.
본 발명은 환자가 20분 이하, 15분 이하 또는 12분 이하의 전혈 응고 시간을 유지할 수 있는 조성물을 제공한다.
놀랍게도 생체 적합성 폴리머로 유도된 콜로이드 입자(리포좀)와 결합된 혈액 인자 제제가 피하 투여에 성공하여 혈우병 환자에게 치료적으로 효과적인 용량의 혈액 인자를 투여할 수 있다는 사실이 밝혀졌다.
본 발명의 실시예에서, PEG는 혈액 인자와 결합하기 전에 소포 형성 중에 콜로이드 입자에 통합된다. 혈액 인자의 특정 아미노산 서열은 리포솜 외부에 있는 PEG 분자의 카바메이트(carbamate) 기능에 비공유 결합할 수 있는 것으로 여겨진다.
콜로이드 입자는 혈액 인자를 캡슐화 하지 않는다. 혈액 인자는 리포솜 외부 표면의 폴리머 사슬과 비공유적으로 상호작용하며 폴리머 사슬을 활성화하기 위한 화학 반응은 수행되지 않았다. 혈액 인자와 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 리포솜 사이의 상호작용의 특성은 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 수소 결합 및 반데르발스 인력과 같은 비공유 메커니즘에 의해 이루어질 수 있다(Arakawa, T. and Timasheff, S. N., Biochemistry 24: 6756- 6762 (1985; Lee, J. C. and Lee, L. L. Y., J. Biol. Chem. 226: 625-631 (1981)). 이러한 폴리머의 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다.
친수성 폴리머로 유도체화된 소포 형성 지질을 제조하기 위해 다양한 알려진 결합 반응이 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리머(예: PEG)는 시아누릭 염화물기(cyanuric chloride group)를 통해 포스파티딜 에탄올아민(PE)과 같은 지질로 유도체화될 수 있다. 또는, 캡핑된 PEG를 카르보닐 디이미다졸 결합 시약으로 활성화하여 활성화된 이미다졸 화합물을 형성할 수도 있다. 카르바메이트 연결 화합물(carbamate-linked compound)은 MPEG(메톡시PEG)의 말단 수산기를 p-니트로페닐 클로로포메이트(p-nitrophenyl chloroformate)와 반응시켜 p-니트로페닐 탄산염(p-nitrophenyl carbonate)을 생성하여 제조할 수 있다. 이 생성물을 1- 아미노-2,3- 프로판디올과 반응시켜 중간 카르바메이트를 생성한다. 디올(diol)의 수산기를 아실화하여 최종 생성물을 얻는다. 1- 아미노-2, 3- 프로판디올 대신 글리세롤을 사용하는 유사한 합성을 사용하여 WO 01/05873에 설명된 대로 탄산염 연결 생성물을 생산할 수 있다. 다른 반응은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 US 5,013,556에 설명되어 있다.
콜로이드 입자(리포솜)는 다양한 파라미터에 따라 분류할 수 있다. 예를 들어 라멜라(lamellae)의 크기와 개수(구조적 파라미터)를 파라미터로 사용할 경우 리포솜(liposomes)은 크게 세 가지 유형으로 설명할 수 있다: 다라멜라 소포(Multilamellar vesicles, MLV), 작은 단라멜라 소포(small unilamellar vesicles, SUV), 큰 단라멜라 소포(large unilamellar vesicles, LW).
MLV는 건조 인지질이 겔에서 액정 상전이 온도(Tm) 이상으로 수화될 때 자연적으로 형성되는 종이다. MLV의 크기는 이질적이며 그 구조는 동심원의 수성층과 지질층이 번갈아 가며 있는 양파 껍질과 유사하다.
SUV는 초음파 처리(sonication) 또는 압출(extrusion), 고압 균질화(high pressure homogenisation) 또는 고전단 혼합(high shear mixing)과 같은 기타 방법으로 MLV에서 형성되며 단층이다. 표면 대 부피 비율이 높은 가장 작은 종으로, 지질 무게 대비 수성 공간의 포집 부피가 가장 낮다.
세 번째 유형의 리포솜 LUV는 큰 수성 구획과 단일(단라멜라) 또는 소수(올리고라멜라(oligolamellar)) 지질층을 가지고 있다. 자세한 내용은 D. Lichtenberg and Y. Barenholz, in "Liposomes: Preparation, Characterization, and Preservation, in Methods of Biochemical Analysis", Vol. 33, pp. 337 - 462 (1988)에 공지되어 있다.
여기서 사용되는 "로딩"이라는 용어는 로딩될 생체 폴리머 물질의 모든 종류의 상호작용, 예를 들어 캡슐화, (소포의 내부 또는 외부 벽에 대한) 접착 또는 생체 폴리머 물질의 압출 유무에 관계없이 벽에 매립하는 것과 같은 상호작용을 의미한다.
본 명세서 및 상기에서 사용된 바와 같이, "리포솜(liposome)"이라는 용어는 콜로이드 입자를 의미하며, 자발적 또는 비 자발적으로 소포화될 수 있는 양친매성 화합물의 모든 구 또는 소포, 예를 들어 적어도 하나의 아실기가 복합 인산 에스테르로 대체된 인지질을 포함하도록 의도되었다. 리포솜은 유리 상태부터 액정까지 모든 물리적 상태로 존재할 수 있다. 대부분의 트리아실글리세라이드(triacylglycerides)가 적합하며, 본 발명에 사용하기에 적합한 가장 일반적인 인지질은 인산의 콜린 에스테르에 연결된 스테아르산, 팔미트산 및 올레산의 디글리세라이드의 혼합물인 레시틴(포스파티딜콜린(PC)이라고도 함)이다. 레시틴은 달걀, 콩, 동물 조직(뇌, 심장 등)과 같은 모든 동식물에 존재하며 합성적으로도 생산할 수 있다. 인지질의 공급원이나 합성 방법은 중요하지 않으며, 자연적으로 발생하거나 합성된 인지질은 모두 사용할 수 있다.
구체적인 인지질류(phosphatides)의 예로는 L-a-(디스테아로일) 레시틴(L-a-(distearoyl) lecithin), L-a-(디팔미토일) 레시틴(L-a-(dipalmitoyl) lecithin), L-a-포스파티드산(L-a-phosphatide acid), L-a-(딜라우로일)-포스파티드산(L-a-(dilauroyl)-phosphatidic acid), L-a(디미리스토일) 포스파티드산(L-a(dimyristoyl) phosphatidic acid), L-a(디올레오일)포스파티드산(L-a(dioleoyl)phosphatidic acid), DL-a(디팔미토일) 포스파티딘산(DL-a (di- palmitoyl) phosphatidic acid), L-a(디스테아로일) 포스파티딘산(, L-a(distearoyl) phosphatidic acid) 및 뇌, 간, 난황, 심장, 대두 등으로부터 추출 또는 합성으로 제조된 다양한 유형의 L-a-포스파티딜콜린(L-a-phosphatidylcholines) 및 이들의 염이 있다. 다른 적절한 변형으로는 포스파티딜콜린(PC)의 지방 아실 잔기 가교제의 과산화 제어 및 미셀을 단독으로 형성하거나 PC의 알킬 유사체와 같은 PC와 혼합할 때 형성되는 양성자-음성자 양친매성 물질(zwitterionic amphipathates)을 들 수 있다.
인지질은 순도가 다양할 수 있으며 전체 또는 부분적으로 수소화할 수도 있다. 수소화는 원치 않는 과산화 수준을 낮추고 패킹 및 누출에 영향을 미치는 액체/결정 상 전이 온도(Tm)로 젤을 수정 및 제어한다.
리포솜은 다양한 생물학적 유체를 포함한 특정 저장소의 요구 사항에 맞게 "맞춤화 (tailored)"할 수 있으며, 응집이나 크로마토그래피 분리 없이 안정성을 유지하고 주입된 유체에서 잘 분산되어 현탁 상태를 유지한다. 현장 유동성은 구성, 온도, 염도, 2가 이온 및 단백질의 존재 여부에 따라 달라진다. 리포솜은 다른 용매나 계면활성제와 함께 또는 없이 사용할 수 있다.
일반적으로 적합한 지질은 적어도 계란 또는 대두 PC의 아실 사슬 성분의 전이 온도(Tm )와 관련하여 특징적인 아실 사슬 조성, 즉 하나의 사슬은 포화되고 하나는 불포화되거나 둘 다 불포화되는 사슬을 가질 수 있다. 그러나 두 개의 포화 사슬을 사용할 가능성도 배제할 수 없다.
리포솜은 불안정성 및/또는 응집 및/또는 크로마토그래피 분리를 유발하지 않는 한 다른 지질 성분을 포함할 수 있다. 이는 일상적인 실험을 통해 확인할 수 있다.
페길화 인지질은 콜로이드 입자의 표면에 물리적으로 부착되거나 콜로이드 입자의 막에 삽입될 수 있다. 따라서 폴리머는 콜로이드 입자에 공유 결합될 수 있다.
단라멜라(unilamellar) 또는 다라멜라(multilamellar)로 변형된 콜로이드 입자를 생산하는 다양한 방법이 알려져 있고 이용 가능하다(Lichtenberg and Barenholz, (1988) 참조):
1. 인지질의 박막을 수성 매질로 수화시킨 다음 기계적 흔들기 및/또는 초음파 조사 및/또는 적절한 필터를 통해 압출한다;
2. 인지질을 적절한 유기 용매에 녹여 수성 매질과 혼합한 후 용매를 제거한다;
3. 임계점 이상의 가스 사용(예: 프레온 및 CO2 또는 CO2 및 기타 기체 탄화수소의 혼합물과 같은 기타 가스) 또는
4. 지질 세제 혼합 미셀(lipid detergent mixed micelles)을 준비한 다음 세제의 농도를 리포솜이 형성되는 임계 농도 이하로 낮춘다.
일반적으로, 이러한 방법은 약 0.02~10㎛ 이상의 이질적인 크기를 갖는 콜로이드 입자를 생성한다. 상대적으로 작고 크기가 잘 정의된 콜로이드 입자가 본 발명에서 사용하기에 바람직하기 때문에, " 콜로이드 입자 다운사이징(colloidal particle down-sizing)”으로 정의되는 제2 처리 단계는 콜로이드 입자 현탁액의 크기 및 크기 이질성을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
콜로이드 입자 현탁액은 약 5㎛ 미만의 크기 범위, 예를 들어 0.4㎛ 미만의 크기 범위에서 소포의 선택적 크기 분포를 달성하도록 크기가 조정될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 콜로이드 입자는 평균 입자 크기 직경이 약 0.03~0.4 microns(μm), 적합하게는 약 0.1 μm이다.
이 범위의 콜로이드 입자는 적절한 필터를 통해 여과하여 쉽게 멸균할 수 있다. 또한 소포가 작을수록 보관 시 응집되는 경향이 적어 리포솜을 정맥 또는 피하 주사할 때 발생할 수 있는 심각한 막힘이나 막힘 문제를 줄일 수 있다. 마지막으로, 크기가 서브미크론(submicron) 범위로 줄어든 리포솜은 더 균일한 분포를 보인다.
본 발명에 적합한 방식으로 콜로이드 입자의 크기 및 크기 이질성을 줄이기 위한 몇 가지 기술을 사용할 수 있다. 표준 수조 또는 프로브 초음파 처리를 통해 콜로이드 입자 현탁액에 초음파를 조사하면 크기가 0.02~0.08 μm 사이의 작은 단층 소포(small unilamellar vesicles, SUV)까지 점진적으로 크기가 감소한다.
균질화(Homogenization)는 전단 에너지를 사용하여 큰 콜로이드 입자를 작은 입자로 쪼개는 또 다른 방법이다. 일반적인 균질화 절차에서는 콜로이드 입자 현탁액을 표준 에멀젼 균질화기를 통해 일반적으로 약 0.1~0.5 μm 사이의 선택된 리포솜 크기가 관찰될 때까지 재순환시킨다. 두 방법 모두에서 입자 크기 분포는 기존의 레이저 빔 입자 크기 측정으로 모니터링할 수 있다.
작은 기공의 폴리카보네이트 필터(small-pore polycarbonate filter) 또는 이와 동등한 멤브레인을 통해 콜로이드 입자를 압출하는 것도 멤브레인의 기공 크기에 따라 평균 약 0.02~5μm 범위의 비교적 잘 정의된 크기 분포로 콜로이드 입자 크기를 줄이는 데 효과적인 방법이다.
일반적으로 현탁액은 원하는 콜로이드 입자 크기 분포에 도달할 때까지 하나 또는 두 개의 적층 막을 여러 번 순환한다. 콜로이드 입자는 리포솜 크기를 점진적으로 감소시키기 위해 연속적으로 더 작은 기공 막을 통해 압출될 수 있다.
원심분리 및 분자체 크로마토그래피(molecular sieve chromatography)는 입자 크기가 1μm 미만인 리포솜 현탁액을 생성하는 데 사용할 수 있는 다른 방법이다. 이 두 가지 방법은 큰 입자를 작은 입자로 변환하는 것이 아니라 큰 리포솜을 우선적으로 제거한다. 콜로이드 입자 수율은 그에 따라 감소한다.
크기 처리된(size-processed) 콜로이드 입자 현탁액은 기존의 0.45 μm 깊이 막 필터와 같이 입자 구별 크기가 약 0.4 μm인 멸균 멤브레인을 통과하여 쉽게 멸균할 수 있다. 리포솜은 동결 건조된 형태로 안정적이며 사용 직전에 물에 흡수하여 재구성할 수 있다.
콜로이드 입자를 형성하는 데 적합한 지질은 상기에 설명되어 있다. 적절한 예로는 디미리스토일포스파티딜콜린(dimirystoylphosphatidylcholine, DMPC) 및/또는 디미리스토일-포스파티딜글리세롤(dimirystoyl - phosphatidylglycerol, DMPG)과 같은 인지질, 부분 또는 완전 정제 후 직접 또는 부분 또는 완전 수소화 후 얻은 계란 및 대두 유래 인지질이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
다음 네 가지 방법은 WO 95/04524에 설명되어 있으며, 일반적으로 본 발명에 따라 사용되는 콜로이드 입자(리포솜)의 제조에 적합한다.
방법 A
a) 물과 섞이지 않는 유기 용매에 소포를 형성하기에 적합한 지질과 같은 양친매성 물질 혼합
b) 고체 지지체(solid support)가 존재하는 상태에서 용매 제거, 대안적으로, 건조된 양친매성 물질 또는 그 혼합물을 직접 어떤 형태(분말, 입상 등)로든 직접 사용 가능
c) 단계 b)의 생성물을 생리적으로 호환 가능한 용액에서 생체 폴리머 물질의 용액으로 흡수(taking up)
d) 용해 또는 분산 특성을 갖는 유기 용매를 첨가, 뿐만 아니라
e) 생체 폴리머 물질의 기능을 유지하는 조건에서 단계 d) 에서 얻은 분획을 건조시킨다.
방법 A의 단계 a)에 따르면, 위에서 언급한 바와 같이 소포 형성에 적합한 양친매성 물질을 물과 섞이지 않는 유기 용매에 혼합한다. 물과 섞이지 않는 유기 용매는 불소화 탄화수소, 염소화 탄화수소 등과 같은 극성 친수성 용매일 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 b)에서 용매는 고체 지지체가 있는 상태에서 제거된다. 고체 지지체는 비드형 구조를 갖는 불활성 유기 또는 무기 물질일 수 있다. 무기 지지체의 재료는 유리일 수 있고 유기 재료는 테플론(TeflonTM ) 또는 기타 유사한 폴리머일 수 있다.
본 발명의 방법 A의 단계 c)는 단계 b)의 생성물을 생리적으로 호환되는 용액에 캡슐화할 물질의 용액으로 취하는 단계이다.
생리적으로 호환되는 용액은 최대 약 1.5 중량 %의 염화나트륨 용액과 동일할 수 있다. 예를 들어 당류 및/또는 아미노산과 같이 생리적으로 호환되는 다른 염을 냉동 보호제로 사용할 수도 있다. 예를 들어 유당(lactose), 자당(sucrose) 또는 트레할로스(trehalose)를 동결 보호제로 사용할 수 있다.
선택적으로, 가) 단계와 나) 단계 사이에 가) 단계의 바이러스 비활성화, 멸균, 탈원자화, 분획 여과 등의 단계가 제공될 수 있다. 이는 조제 초기 단계에서 약학적으로 허용되는 용액을 얻기 위해 유리할 수 있다.
방법 A의 단계 d)는 용해성 또는 분산성을 갖는 유기 용매를 첨가하는 단계이다.
유기 용매는 물과 섞일 수 있는 유기 극성 용매일 수 있다. 알킬 사슬에 1~5개의 탄소 원자가 있는 저지방족 알코올(예: 3차 부탄올(tertiary butanol, t-부탄올))도 사용할 수 있다. 물과 혼화 가능한 유기 극성 용매의 양은 리포솜에 적재할 물질과의 간섭에 따라 크게 달라진다. 예를 들어, 단백질이 로드되는 경우 단백질의 활성에 영향을 미치는 용매의 양에 따라 상한이 설정된다. 이는 로드할 물질의 특성에 따라 크게 달라질 수 있다. 예를 들어 혈액 응고 인자가 Factor IX 로 구성된 경우 약 30%의 t-부탄올이 필요한 반면, Factor VIII의 경우 10% 미만의 t-부탄올이 적합한다(Factor VIII은 t-부탄올의 영향에 훨씬 더 민감한다). 이 예에서 t 부탄올의 비율은 최종 농도에 대해 계산된 부피 대비 백분율을 기준으로 한다.
선택적으로, d) 단계 이후에 바이러스 비활성화 멸균 및/또는 d) 단계 이후에 산출된 분획의 분할을 수행할 수 있다.
본 발명의 단계 e)는 적재될 물질의 기능을 유지하는 조건 하에서 단계 d)에서 얻은 분획을 건조하는 것이다. 혼합물을 건조하는 한 가지 방법은 동결 건조이다. 동결 건조는 동결 보호제, 예를 들어 유당 또는 기타 당류 또는 아미노산의 존재 하에서 수행될 수 있다. 또는 증발 또는 분무 건조를 사용할 수도 있다.
건조된 잔류물은 사용하기 전에 수성 매질에서 흡수할 수 있다. 고체를 흡수한 후 각 리포솜의 분산액을 형성한다. 수성 매질은 식염수를 포함할 수 있으며, 형성된 분산액은 필요한 경우 리포솜의 크기를 줄이기 위해 선택적으로 적절한 필터를 통과할 수 있다. 적합하게, 리포솜은 0.02~5 μm의 크기, 예를 들어 0.4 μm 미만의 범위를 가질 수 있다.
방법 A로 얻을 수 있는 리포솜은 혈액 인자의 높은 로딩을 보여준다.
따라서, 본 발명의 조성물은 또한 방법 A의 단계 c) 또는 d)의 분획을 분리하여 얻을 수 있는 중간 생성물일 수 있다. 따라서, 본 발명의 제제는 방법 A의 단계 e)의 생성물을 분산액(수성 매질 내 리포좀(liposomes in aqueous medium)) 형태로 물에 취한 후 얻을 수 있는 수성 분산액을 포함할 수도 있다.
또는, 본 발명의 약학 조성물은 방법 B, C, D 및 E로 지칭되는 다음의 방법에 의해서도 얻을 수 있다.
방법 B
이 방법은 방법 A의 a), b), c) 단계도 포함하지만, 방법 A의 d), e) 단계는 생략한다.
방법 C
방법 C에서는 방법 A의 d) 단계를 최소 2회 반복해야 하는 동결 및 해동 주기로 대체한다. 이 단계는 리포솜을 생산하기 위해 선행 기술에서 잘 알려져 있다.
방법 D
방법 D는 삼투성 성분의 사용을 배제한다. 방법 D에서는 소포의 준비, 로드할 물질의 혼합 및 실질적으로 무염 용액, 이렇게 얻은 분획의 공동 건조 단계가 포함된다.
방법 E
방법 E는 위에서 설명한 방법 A - D보다 간단한다. 이 방법은 리포솜 제조에 사용되는 화합물(지질 항산화제 등)을 t-부탄올과 같은 극성 물 혼화 용매에 용해시켜야 한다. 그런 다음 이 용액을 혈액 인자를 포함하는 수용액 또는 분산액과 혼합한다. 혼합은 약제의 생물학적 및 약리학적 활성을 유지하는 데 필요한 최적의 부피 비율로 수행된다.
그런 다음 혼합물을 동결보호제의 유무에 관계없이 동결건조한다. 리포솜 제형을 사용하기 전에 재수화가 필요한다. 이러한 리포솜은 다층 구조이며, WO 95/04524에 설명된 방법 중 하나를 사용하여 크기를 줄일 수 있다.
본 발명의 제1양태의 피험자에 A형 혈우병 치료에 사용하기 위한 조성물은 이전에 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 피험자에 대해 사용될 수 있다. 본 발명의 제1양태의 피험자에 A형 혈우병 치료에 사용하기 위한 조성물은 외인성 투여된 Factor VIII(FVIII)에 대한 면역 반응을 개시하거나 생성하는 피험자에 사용될 수 있다. 본 발명의 제1양태의 피험자에 A형 혈우병 치료에 사용하기 위한 조성물은 외인성 Factor VIII(FVIII) 치료, 즉 Factor VIII 치료에 내성이 있는 피험자에 사용될 수 있다. 다른 방식으로 표현하면, 본 발명의 제1양태의 피험자에 A형 혈우병 치료에 사용하기 위한 조성물은 FVIII에 대한 저해제(항체)에 대해 양성 반응을 보인 피험자에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 환자는 본 발명에 따른 치료 전에 FVIII 저해제(FVIII에 대한 항체)의 존재 여부를 검사받을 수 있다. 따라서 선택적으로, 본 발명에 따른 치료 방법은 본 발명에 정의된 조성물로 피험자를 치료하는 단계에 앞서 피험자에 대해 Factor VIII에 대한 항체가 생성되는지 검사하는 단계를 포함할 수 있다.
적합하게, 피험자는 면역 챌린지 분석에서 피험자가 외인성 투여된 Factor VIII(FVIII)에 대해 면역 반응을 개시하는지를 확인하기 위해 검사될 수 있다. 피험자가 외인성 투여된 Factor VIII(FVIII)에 대한 면역 반응을 개시하는지 여부를 결정하기 위해 정의된 노출 횟수에 걸쳐 피험자에게 외인성 Factor VIII(FVIII)의 양을 증가시켜 투여할 수 있으며, 예를 들어 외인성 Factor VIII(FVIII) 노출 횟수는 50회 또는 그 이하일 수 있다. 외인성 Factor VIII(FVIII)의 증가량은 적정 곡선의 일부로, 즉 50회 노출에 걸쳐 투여된 Factor VIII(FVIII)의 양으로 계산할 수 있다.
본 발명의 제1양태의 피험자에 A형 혈우병 치료용 조성물은 소아 피험자에 사용될 수 있다. 소아 환자는 유럽연합(EU)에서 출생부터 18세 사이의 인구의 일부로 정의된다. 소아 인구는 여러 하위 집합을 포함한다. 소아 환자의 적용 연령 분류는 다음과 같다:
·
0~27일 미만의 미숙아 및 신생아;
·
1개월에서 23개월 사이의 영아(또는 유아);
·
2세부터 11세까지의 어린이; 그리고
·
12세 이상 18세 미만의 청소년.
(참조: http://ec.europa.eu/health/sites/health/files/files/eudralex/vol-1/2014_c338_01/2014_c338_01_en.pdf)
혈우병은 선천성 A형 혈우병(cHA) 또는 후천성 A형 혈우병(aHA)일 수 있다. 선천성 혈우병은 응고 Factor VIII 결핍 또는 감소를 특징으로 하는 유전성 출혈 질환이다. 후천성 혈우병은 출혈의 개인적 또는 가족력이 없는 개인에게 자가항체 저해제가 갑자기 생성되는 자가면역 질환이다. 우리 몸은 A형 혈우병의 내인성 Factor VIII에 대한 자가항체를 생산한다.
'저해제 환자(inhibitor patient)'는 병력에서 외인성 치료 혈액 인자(선천성 혈우병의 경우)의 적용에 반응하여 저해 항체('저해제')가 생성했거나 내인성 FVIII(후천성 혈우병의 경우)에 대한 저해제가 생성한 환자로 정의할 수 있다. 이들은 현재 저해제가 있거나 없을 수 있지만, 후자의 경우 ITI를 통해 관용화되지 않았을 가능성이 높으며 FVIII을 다시 투여할 경우 저해제를 생성할 수 있는 상태로 남아있을 것이다. 이러한 피험자는 또한 FVIII 치료 경험이 있는 환자로 간주될 수 있다.
저해제 환자는 5베데스다(Bethesda) 단위 미만의 FVIII 저해제(항체) 활성도를 가질 수 있다. 환자의 혈액 내 항체 저해제는 베데스다 방법을 사용하여 정량화되며, 환자의 저해제 수준을 이야기할 때 '베데스다 단위'를 사용하는 것이 일반적인 용어이다. 5베데스다 단위 이상의 FVIII 저해제 수치는 높은 역가의 저해제로 간주된다(참조: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-clinical-investigation-recombinant-human-plasma-derived-factor-viii-products-revision-2_en.pdf).
본 발명의 제1양태의 피험자에서 A형 혈우병 치료에 사용하기 위한 조성물은 5 베데스다 단위 이상의 FVIII 저해제(항체) 활성을 갖는 피험자에도 사용될 수 있다. 본 발명의 제1양태의 피험자에 A형 혈우병 치료에 사용하기 위한 조성물은 또한 5 베데스다 단위의 FVIII 저해제(항체) 활성을 갖는 피험자에도 사용될 수 있다.
베데스다 단위(BU)는 혈액 응고 저해제 활성도를 측정하는 단위이다. 실용 지혈학에 따르면, "1베데스다 단위(Bu)는 37°C에서 2시간 배양 후 정상 혈장 내 Factor VIII 1단위의 50%를 중화시키는 혈장 샘플 내 저해제의 양으로 정의된다."라고 설명한다. (Schumacher, Harold Robert (2000). Handbook of Hematologic Pathology. Informa Health Care, p. 583). Factor VIII 1 단위는 Factor VIII 1 IU/mL와 같다.
베데스다 분석법은 검사 혈장을 희석한 후 남은 잔류 FVIII 활성을 측정하는 것을 기반으로 한다. 이 분석은 테스트 혈장과 정상 혈장의 테스트 혼합물과 37°C에서 2시간 동안 배양한 정상 혈장과 버퍼(완충액)의 대조 혼합물을 비교해야 한다. 테스트 혼합물의 잔류 활성 백분율은 베데스다 단위(BU)로 변환된다.
베데스다 분석(Bethesda assay)은 다음과 같이 수행된다:
1. 검사(환자) 혈장의 2배 희석[보통 1/2 - 1/1024]은 이마다졸 완충 식염수로 만들고 37°C에서 동일한 부피의 정상 혈장 풀과 함께 배양한다. 니메겐 변형(Nijmegen modification)에서는 환자 혈장을 Factor VIII 결핍 혈장으로 희석한다.
2. 동일한 양의 정상 혈장과 이마다졸 완충 식염수(또는 니메겐 변형에서는 면역 제거된 Factor VIII 결핍 혈장의 경우)를 혼합한 대조군 혼합물을 준비한다. 정상 혈장 풀에는~100% [100 IU/dL] Factor VIII가 포함되어 있다. 이 혼합물의 시작 농도는 실제로 50%[50 IU/dL] Factor VIII이지만(완충액으로 50:50 희석했기 때문에) 모든 배양 혼합물에 동일한 공급원과 부피가 추가되므로 이는 중요하지 않는다. 대조군의 사용은 인큐베이션 기간 동안 Factor VIII 및 V의 저하를 보완한다.
3. 배양 기간(incubation period)이 끝나면 배양된 대조군을 100% [100 IU/dL] 표준으로 사용하여 표준 1단계 APTT 기반 분석법을 사용하여 잔류 Factor VIII VIII을 분석한다.
4. 저해제 농도는 잔류 Factor VIII 활성도 대 저해제 단위 그래프로부터 계산한다. 50%에 가장 가깝지만 30-60% 범위 내에서 잔류 Factor VIII VIII을 제공하는 검사 혈장 희석이 저해제 계산을 위해 선택된다. 각 희석에 대한 저해제 역가를 계산하여 평균을 구하는 것도 가능한다. 잔류 Factor VIII <25% [25 IU/dL] 또는 >75% [75 IU/dL]는 저해제 레벨 계산에 사용해서는 안 된다.
5. 잔류 Factor VIII 활성도가 80-100%[80-100 IU/dL]인 경우, 검체에는 저해제가 포함되어 있지 않은 것이다.
6. 그래프에서 저해제 역가를 도출하고 희석량을 곱하여 최종 역가를 구한다. 알려진 저해제 역가의 양성 대조 혈장을 포함해야 한다.
혈액 응고 과정의 활성 수준은 전혈 응고 시간(Whole Blood Clotting Time, WBCT) 검사, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(Activated Partial Thromboplastin Time, APTT) 또는 ROTEM과 같은 적절한 분석법을 통해 측정할 수 있다. 1단계 및 2단계/발색성 분석(Chromogenic assays)에서는 대부분 분광광도법(spectrophotometry)을 사용하기 때문에 혈액 샘플을 원심분리하여 세포 단편을 제거해야 하는데, 이는 분석 방법이 분광광도법을 포함하므로 샘플이 깨끗해야 하기 때문이다. 아래의 글로벌 응고 분석은 혈전이 물리적으로 형성되는 시간 경과를 평가하므로 혈소판과 같이 혈전을 구성하는 모든 성분이 포함되므로 '실제(real life)'에 더 가깝다.
전혈 응고 시간(WBCT) 검사는 전혈이 외부 환경(일반적으로 유리관이나 접시)에서 혈전을 형성하는 데 걸리는 시간을 측정한다. WBCT는 채혈 직후 전혈 2ml를 채취하여 두 개의 유리관으로 나누어 평가할 수 있다. 그런 다음 이 두 개의 튜브를 37°C 수조에 넣고 약 20~30초마다 부드럽게 기울여 확인한다. 튜브를 수평으로 뒤집었을 때 혈장이 흘러내리지 않고 단단한 응고가 유지되면 혈전으로 판정한다.
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 검사는 혈액 응고 경로의 일부 매개 변수를 측정한다. 혈우병과 정맥 내 헤파린 치료로 인해 비정상적으로 상승한다. APTT에는 정맥에서 몇 밀리리터의 혈액이 필요하다. APTT 시간은 "내인성 경로(intrinsic pathway)"로 알려진 응고 시스템의 한 부분을 측정한 것이다. APTT 값은 실험실 테스트에서 특정 응고 과정이 발생하는 데 걸리는 시간(초)이다. 이 결과는 항상 정상 혈액의 "대조(control)" 샘플과 비교된다. 검사 샘플이 대조 샘플보다 오래 걸리면 내인성 경로의 응고 능력이 저하되었음을 나타낸다. 일반적인 의학적 치료는 일반적으로 45~70초 정도의 APTT 범위를 목표로 하지만 이 수치는 정상 대비 검사 비율(예: 정상 대비 1.5배)로도 표현할 수 있다. 헤파린 치료가 없는 상태에서 높은 APTT는 혈우병으로 인한 것일 수 있으므로 추가 검사가 필요할 수 있다.
ROTEM(회전 혈전 탄성 측정법(rotational thromboelastometry))은 ROTEM Delta 2.7.2 시스템을 사용하여 NATEM 분석법을 통해 혈액 샘플의 응고성을 평가한다(재석회화에 의해서만 활성화됨). 측정을 위해 20uL의 CaCl2와 340uL의 구연산화된 전혈 샘플을 장치에 넣는다. 분석은 신선한 혈액 샘플을 채취한 후 15분 이내에 수행된다. 이 분석은 응고 시간(CT - 혈액이 응고되기 시작하는 시간), 응고 형성 시간(CFT - 응고가 최대로 단단해지는 시간) 등 응고가 형성되는 동안의 다양한 통계를 제공한다.
본 발명은 20분 미만, 15분 미만 또는 적절하게는 12분 미만의 전혈 응고 시간을 유지할 수 있도록 하는 조성물을 제공한다.
다음은 FVIII 농도를 평가하기 위한 발색 분석법(Chromogenic assay)("2단계 분석법"이라고도 함)에 대해 설명한다.
제공된 방법을 다음과 같이 수정하여 크로모제닉스 코아매틱 Factor VIII 색소 생성 분석법(Chromogenix Coamatic Factor VIII chromogenic assay, Diapharma, K822585)을 사용하여 FVIII 혈장 활성을 측정할 수 있다:
i.
혈장 샘플 희석액과의 비교 가능성을 달성하기 위해 FVIII 표준 준비에 소량의 순혈(na
ve) 혈장을 포함시킨다,
ii.
각 테스트 항목에 특정한 FVIII 표준 사용(NuwiqTM 또는 FactaneTM),
iii. 두 가지 표준 곡선 범위 내에 추가 FVIII 활성도 값 포함.
NuwiqTM and FactaneTM FVIII 표준 스톡 용액 준비:
각 검사 물품의 바이알을 정제수와 함께 100 IU/ml로 재구성하여 -70°C에서 소량으로 냉동 보관하고 분석 당일에 37°C에서 해동할 수 있다. 해당 혈장 시료의 분석에는 연구 테스트 물품에 적합한 스톡 용액을 사용한다.
개략적인 분석 방법은 다음과 같다:
1. 테크노클론 Factor VIII 결핍 혈장(native; Diapharma 5154007) 1바이알을 정제수 1ml에 새로 용해하였다.
2. 0.990mL의 FVIII 결핍 혈장에 0.010mL의 적절한 FVIII 표준 스톡 용액(100 IU/ml)을 첨가하여 신선하게 준비한 FVIII 표준 작업 스톡 용액(1 IU/mL ),
3. Coamatic 키트 팩터 시약, S-2765 + I-2581 기질(substrate) 및 버퍼(buffer) 작업 용액은 키트 지침에 따라 준비되고 37°C로 예열하였다,
4. 20% 아세트산 정지 용액을 준비했다,
5. 연구 샘플에 적합한 FVIII 범위를 사용하여 FVIII 작동 스톡 용액(1 IU/ml)으로 표준 곡선을 준비했다. (표 1 및 표2 참조),
6. 37°C에서 각 테스트 혈장 샘플의 한 시료 분량을 빠르게 해동하였다.
7. 25μl의 해동된 테스트 혈장 샘플을 2000μl의 버퍼 작업 용액으로 희석했다.
8. 희석된 FVIII 표준 및 희석된 테스트 혈장 샘플 50μl을 플레이트 맵에 따라 96웰 플레이트의 웰에 추가하고 37°C에서 4분간 배양하였다.
9. 각 웰에 인자 시약 50μl을 추가하고 37°C에서 2분간 (고범위 표준 곡선) 또는 4분간 (저범위 표준 곡선) 배양하였다.
10. 각 웰에 S-2765 + I-2581 기질(substrate) 50μl을 추가하고 37°C에서 2분간 (고범위 표준 곡선) 또는 10분간 (저범위 표준 곡선) 배양하였다.
11. 각 웰에 20% 아세트산 정지 용액 50μl을 추가하였다. 웰의 색상이 노란색 계열로 변하고 흡광도 405nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 광밀도(optical density)를 측정하였다.
12. FVIII 표준 활성(IU/ml)을 405nm에서의 흡광도에 대해 최적의 선형 곡선을 사용하여 그래프에 표시하였다.
13. 테스트 혈장 샘플의 흡광도를 표준 곡선에 대해 읽고 FVIII 활성을 IU/ml로 보고하였다.
14. 각 시간대별 3개의 마우스 테스트 혈장 샘플에서 계산된 FVIII 활성 결과의 평균(그리고 개별 연구에서 지시된 경우 중앙값)이 계산되고 데이터는 약동학 분석에 적용되었다
FVIII 농도를 평가하기 위한 추가 테스트에는 다음이 포함된다:
발색성 FVIII 활성 분석(Chromogenic FVIII Activity Assay)
Biophen FVIII:C 분석 키트 Ref#221406은 분석 버퍼에 1:10으로 희석한 혈장 샘플과 함께 사용되었으며 NuwiqTM 및 인간 혈장 참조 표준 곡선과 비교하여 실행되었다. 각 곡선은 개 FVIII 결핍 혈장에서 FVIII을 연속적으로 희석한 다음 분석 버퍼에서 1:10으로 희석하여 생성되었다. 두 곡선의 표준 범위는 0.003-0.4U/mL, 선형 범위는 0.13-1.00U/mL였다. 분석은 키트 프로토콜에 따라 수행되었다.
원스테이지 Factor VIII 분석 - 지멘스 BCS-XP 시스템 (One-Stage Factor VIII Assay - Siemens BCS-XP System)
샘플은 정상적인 개의 혼합 혈장을 2.5% 개 FVIII 결핍 혈장이 포함된 Owren’s Veronal Buffer로 희석하여 생성된 개 FVIII 참조 곡선에 대해 측정되었다. 곡선의 범위는 5-200%이다. 혈장 샘플은 Owren’s Veronal Buffer에서 1:10으로 희석되었고, FVIII 결핍 혈장과 혼합된 후 Actin FS가 추가되었다. 3분의 배양 후, CaCl2로 활성화가 시작되었고 405nm에서 응고 시간이 측정되었다.
상술한 제2 양태에 따라, 피험자에서 A형 혈우병을 치료하는 방법은 콜로이드 입자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함한다. 제 2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다. 피험자는 이전에 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 적이 있다.
생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 생체 적합성 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 폴리에틸렌 글리콜은 약 500~약 5000달톤, 바람직하게는 약 2000달톤 또는 5000달톤의 분자량을 가질 수 있다.
포스파티딜 콜린(PC)은 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, POPC)일 수 있다.
제2 양친매성 지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG)일 수 있는데, 예를 들어 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG2000) 또는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG5000)일 수 있다.
콜로이드 입자는 (iii) 비이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 Factor VIII(FVIII) 분자를 더 포함할 수 있다. 또는, 이 방법은 Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 개별적으로 또는 후속적으로 투여하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
콜로이드 입자 및 Factor VIII를 포함하는 조성물은 치료 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 콜로이드 입자와 Factor VIII를 포함하는 조성물은 환자의 혈액 내 Factor VIII의 농도가 치료 이하 또는 치료와 무관한 수준에 도달할 때까지 재투여를 기다릴 필요 없이 지속적이고 일정하며 예측 가능한 치료 효과를 제공하기 위해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21일 간격으로, 예컨대 2-21일, 4-14일, 4-7일마다 적당히 투여하거나 재투여할 수 있다.
이러한 치료 요법은 A형 혈우병 환자를 치료하는 데 필요한 Factor VIII의 양을 줄여준다.
혈우병은 선천성 A형 혈우병(cHA) 또는 후천성 A형 혈우병(aHA)일 수 있다.
피험자는 소아 환자일 수 있다.
본 발명은 또한 피험자가 이전에 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 적이 있는 피험자의 A형 혈우병 치료를 위한 의약품 제조에 콜로이드 입자를 포함하는 조성물을 사용하는 것도 포함한다.
위에서 설명한 제3양태에 따라, 키트는 피험자에 A 형 혈우병 치료용 키트로, (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII (FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 피험자는 이전에 중요한 내인성 혈액 인자(critical intrinsic blood factor)에 대한 항체 저해제를 생성한 적이 있다.
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (PE), 포스파티딜 세린 (PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질로 구성된다. 상기 제 2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체와 인지질 잔기를 포함한다.,
본 발명의 동결건조 제형은 적절한 희석제, 보조제 또는 부형제(예: 생리적으로 허용되는 완충제)와 함께 별도의 제형으로 제공될 수 있다. 키트의 콜로이드 입자 및/또는 Factor VIII(FVIII)는 동결 건조된 제형으로 제공될 수 있다. 또는, 키트의 Factor VIII(FVIII)는 동결건조된 제형으로 제공될 수 있고, 콜로이드 입자는 Factor VIII(FVIII)의 재구성을 위한 용액으로 제공될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 이러한 조성물은 별도의 제형으로서 Factor VIII를 추가적으로 포함하거나 본 명세서에 기술된 바와 같이 콜로이드 입자와 함께 제형화될 수 있다. 동결건조된 형태는 500 IU 바이알에 제공될 수 있다. 키트의 콜로이드 입자 및/또는 Factor VIII(FVIII)는 바로 사용할 수 있는 수성 형태로 제공될 수 있다.
콜로이드 입자는 (iii) 비이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트에는 선택적으로 사용 설명서도 포함되어 있다.
상술한 제4양태에 따라, 키트는 피험자의 A형 혈우병 치료에 별도, 동시 또는 후속적으로 사용하기 위한 (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII(FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 피험자는 이전에 중요한 내인성 혈액 인자에 대한 항체 저해제를 생성한 적이 있다. 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질로 구성된다. 제2 양친매성 지질은 생체 적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함한다.
본 발명의 동결건조 제형은 적절한 희석제, 보조제 또는 부형제(예: 생리적으로 허용되는 완충제)와 함께 별도의 제형으로 제공될 수 있다. 키트의 콜로이드 입자 및/또는 Factor VIII(FVIII)는 동결 건조된 제형으로 제공될 수 있다. 또는, 키트의 Factor VIII(FVIII)는 동결건조된 제형으로 제공될 수 있고, 콜로이드 입자는 Factor VIII(FVIII)의 재구성을 위한 용액으로 제공될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 이러한 조성물은 별도의 제형으로서 Factor VIII를 추가적으로 포함하거나 본 명세서에 기술된 바와 같이 콜로이드 입자와 함께 제형화될 수 있다. 동결건조된 형태는 500 IU 바이알에 제공될 수 있다. 키트의 콜로이드 입자 및/또는 Factor VIII(FVIII)는 바로 사용할 수 있는 수성 형태로 제공될 수 있다.
콜로이드 입자는 (iii) 비이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트에는 선택적으로 사용 설명서도 포함되어 있다.
상술한 제5 양태에 따라, 약학 조성물의 제형은 (i) 포스파티딜콜린(PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민(PE)으로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하는 콜로이드 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제형, 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI), 여기서 상기 제2 양친매성 지질은 피험자의 혈우병 치료에 사용하기 위해 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하는 단계; 상기 제2 양친매성 지질은 피험자의 혈우병 치료에서 혈우병의 발생을 저해하기 위해 상기 포스파티딜 세린 및 포스파티딜 이노시톨을 포함한다. 피험자는 이전에 Factor VIII(FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 적이 있다.
콜로이드 입자는 비이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
제형은 환자에게 적합한 용량이 들어 있는 적절한 용기 또는 바이알(예: 250 IU, 500 IU, 750 IU 또는 1000 IU 바이알)로 제공될 수 있다. 제형은 정제 또는 액체 형태로 제공될 수도 있다. 제형은 동결 건조된 형태일 수도 있다.
본 발명에 의해 입증된 놀라운 기술적 효과는 일반적으로 면역 반응을 유발할 수 있는 FVIII의 에피토프를 마스킹하고 그에 따른 항-FVIII 항체(anti-FVIII antibodies)를 생성함으로써 달성된다.
이론에 얽매이고 싶지 않지만, 이러한 이점은 PEGLip이 FVIII의 A3 도메인에 비공유 결합하여 FVIII 경쇄 도메인의 에피토프를 신체 면역 체계에서 인식하지 못하도록 보호하거나 수지상 세포에 의한 FVIII의 내세포화를 방지하는 데서 비롯된 것으로 생각된다.
이러한 효과는 재조합 FVIII 분자에서 더 두드러지게 나타나는데, 일반적으로 야생형 FVIII(wild-type FVIII)에서 이러한 에피토프를 자연적으로 보호하는 VWF를 투여하지 않는다.
에피토프를 보호하는 것 외에도 PEGLip과의 연관성은 정상적인 단백질 분해 제거 메커니즘으로부터 FVIII을 보호하고 투약 간격을 연장하며 시간이 지남에 따라 환자가 FVIII에 노출되는 총량을 줄임으로써 FVIII의 반감기를 연장할 수 있다.
놀라운 관찰 결과를 다음과 같이 설명한다:
저해제가 있는 환자에게 PEGLip + FVIII을 사용하는 것을 검토하기 위해 고안된 임상시험은 이 조합이 기존 항체가 FVIII을 공격하는 것을 방지할 수 있을 것으로 기대되었다. 기존 항체가 있는 환자뿐만 아니라 FVIII을 투여받았을 때 항체가 생긴 이력이 있지만 현재 항체가 나타나지 않는 환자도 일부 포함되었다.
놀랍게도 이 환자들에게 콜로이드 입자와 FVIII 분자 비율이 15:1~16:1인 PEGLip + FVIII 조합을 투여했을 때 새로운 항체가 발생하지 않았으며, 이는 PEGLip이 수지상 / B 세포(dendritic / B-cells)로부터 에피토프를 보호 및/또는 FVIII의 내세포화를 막을 수 있음을 시사한다.
또한 A형 혈우병 개를 피험체로 콜로이드 입자와 FVIII 분자 비율이 15:1~16:1인 대조군으로 PEGLip + 인간 FVIII을 정맥 투여하는 실험도 실시했다. 이러한 실험은 동물의 면역 체계가 항체를 생성하여 외부(인간) 단백질에 자연적으로 반응하기 때문에 일반적으로 어려운 실험이다. 놀랍게도 이 실험에서 동물은 PEGLip을 투여했을 때 인간 단백질에 대한 항체를 생성하지 않았다.
다음 샘플은 본 발명에 따라 제작 및 테스트되었다:
1.
DSPE-PEG 대 POPC의 높은 비율로 구성된 콜로이드 입자(PEGLip) 시리즈로, 상기 PEG는 PEG-2000이다.
2.
DSPE-PEG 대 POPC의 비율로 구성된 콜로이드 입자(PEGLip) 시리즈로, 상기 PEG는 PEG-5000이다.
3.
1번 및 2번 항목에 따른 콜로이드 입자로, 폴리소르베이트 80을 추가로 포함한다.
4.
DSPE-PEG 대 POPC 및/또는 고분자량 PEG의 높은 비율로 구성된 콜로이드 입자(F-PEGLip) 시리즈.
특정 실시예에서, 다음과 같은 제형이 제공된다:
15~16:1 제형(
15 to 16:1 formulation)
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000))을 97:3 몰 비율로, 50mM 구연산나트륨 완충액에서 9% 현탁액으로 FVIII(NuwiqTM, Octapharma AG)과 함께 15에서 16:1의 PEGLip 입자 대 FVIII 분자 비율로 제조된다.
7~8:1 제형
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000))을 97:3 몰 비율로, 50mM 구연산나트륨 완충액에서 제조된 9% 현탁액으로 FVIII(NuwiqTM, Octapharma AG)과 함께 7~ 8:1의 PEGLip 입자 대 FVIII 분자 비율로 제조된다.
다른 실시예에서, 다음과 같은 제형이 제공된다:
15~16:1 제형
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000))으로 구성된 PEGLip 입자가 97:3 몰 비율로, 그리고 폴리소르베이트 80이 9:1 w/w 비율(POPC + DSPE-PEG(2000):폴리소르베이트 80)로 50mM 구연산나트륨 완충액에서 9% 현탁액으로 제형화되며, FVIII(NuwiqTM, Octapharma AG)이 PEGLip 입자 대 FVIII 분자의 15에서 16:1 비율로 혼합된다.
7~8:1 제형
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG(2000))으로 구성된 PEGLip 입자가 97:3 몰 비율로, 그리고 폴리소르베이트 80이 9:1 w/w 비율(POPC + DSPE-PEG(2000):폴리소르베이트 80)로 50mM 구연산나트륨 완충액에서 제형화된 9% 현탁액으로, FVIII(NuwiqTM, Octapharma AG)과 함께 PEGLip 입자 대 FVIII 분자의 7~ 8:1 비율로 혼합된다.
본 발명의 특정 실시예에서, Factor VIII에 대한 항체 저해제를 이전에 생성한 적이 있는 피험자 A형 혈우병 치료에 사용하기 위한 조성물이 다음과 같이 제공된다:
·
포스파티딜콜린 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질과 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 97:3 몰 비율(9:1 w/w)로 포함하는 콜로이드 입자, 예를 들어 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린 (POPC)과 N-(카르복실-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG2000)의 몰 비율 97:3 또는 더 무거운 페길화된 지질을 사용하는 경우 동등한 몰 비율을 적용한 중량 보정 비율 (예: 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG5000)의 중량 비율 4:1~5:1 사이)을 사용한다.
·
희석제(적합하게는 생리적으로 허용되는 pH, 예를 들어 pH 6.7), 예를 들어 구연산염 완충액과 같은 희석제(선택적으로 50mM 농도)이다.
다른 실시예에서, Factor VIII에 대한 항체 저해제를 이전에 생성한 적이 있는 피험자의 A형 혈우병 치료에 사용하기 위한 조성물이 다음과 같이 제공된다:
·
포스파티딜 콜린 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질과 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS) 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 97:3 몰 비율(9:1 w/w)로 포함하는 콜로이드 입자, 예를 들어, 97:1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG2000) 또는 더 무거운 페길화된 지질의 동일한 몰 비율을 사용하는 경우 중량 보정 비율(예: 4 사이의 w/w 비율)로 97:3 몰 비율(예: 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)과 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG5000)의 4:1~5:1 사이)을 사용한다. 상기 콜로이드 입자는 폴리옥시 에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르, 예를 들어 폴리옥시 에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 더 포함한다.
·
완충액(적합하게는 생리적으로 허용되는 pH, 예를 들어 pH 6.5 ~ 7.2)과 같은 희석제, 예를 들어 구연산염 완충액(선택적으로 50mM 농도)을 포함한다.
본 발명의 제2 양태 및 후속 양태에 대한 바람직한 특징은 제1양태와과 동일하게 적용된다.
이제 본 발명은 설명의 목적으로만 제공되는 다음의 실시예를 참조하여 설명될 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한 다음 도면을 참조하여 설명한다:
도 1은 저해제를 사용하는 중증 혈우병 환자의 생체 외(ex-vivo) 혈액 응고에 대한 PEGLip 및 F-PEGLip의 효과를 보여준다.
도 2는 저해제가 있는 중증 혈우병 환자의 생체 외(ex-vivo) 혈액에서 응고에 대한 PEGLip-FVIII의 효과를 보여준다.
도 3은 저해제가 있는 중증 혈우병 환자의 생체 외(ex-vivo) 혈액에서 응고에 대한 PEGLip-FVIII의 효과를 보여준다.
실시예
다음 예에서는 회전 혈전 탄성계측법(rotational thromboelastometry, ROTEM)이라는 기술을 사용하여 혈액 응고 과정 및 혈전 형성의 다양한 매개변수를 평가한다. 다음 약어가 사용된다.
| 성분(g per 100g) | PEGLip (PLP-00) | F-PEGLip (PLP-01) |
| POPC | 8.333 | 6.68 |
| mPEG-2000-DSPE | 0.926 | 0.76 |
| Polysorbate 80 | 0 | 0.85 |
| Sodium Citrate Dihydrate | 1.47 | 1.47 |
| Water | 89.271 | 90.24 |
| Total | 100 | 100 |
| pH | 6.5 - 7.2 | 6.5 - 7.2 |
| POPC:mPEG-2000-DSPE (molar) | 97:3 | 97:3 |
| POPC:mPEG-2000-DSPE (w/w) | 9:1 | 9:1 |
| Total lipid:non-ionic surfactant (w/w) | n/a | 9:1 |
실시예 1:
혈우병성 혈소판이 풍부한 인간 혈장(PRP) 함유 저해제에서 rFVIII 단독 및 PEGLip(PLP-00)과의 병용 투여 시 혈전 형성 능력 비교.
PRP 모델 준비
:
혈장 풀 준비( Preparation of plasma pool)
중증 혈우병 환자('SHP' 단일 기증자, 2ml/알리쿼트)의 혈장 알리쿼트(Plasma aliquots)를 37o C에서 4분간 해동하여 풀링(pooled)했다. 저해제 혈장을 SHP 풀에 첨가하여 최종 저해제 농도가 10 베데스다 단위(BU)/ml인 저해제 SHP(I-SHP)를 제조했다. 일부 실험에서는 7 BU/ml를 함유한 기증자 저해제 혈장을 SHP에 추가 희석하지 않고 사용했다.
혈소판 세척
혈소판 농축액(0.5ml/튜브)에 혈소판 활성화 저해제(PGE1- 50ng/ml, 구연산 5mM)를 보충하고 롤링으로 1분 배양한 후 실온(15-25o C)에서 추가로 7분간 안정시킨 다음 실온에서 800g으로 5분간 원심분리했다. 혈소판 펠릿을 혈소판 활성화 저해제를 첨가한 4ml 인산 완충 식염수(PBS)에 다시 현탁시킨 후 위와 같이 재원심분리했다.
저해제-PRP(I-PRP) 모델 준비
세척된 혈소판 펠릿(pellet)을 저해제-SHP(I-SHP)에 생리학적 수(250 혈소판/nL)까지 다시 현탁하여 저해제 혈소판 풍부 혈장(I-PRP)을 생성했다. I-PRP 시료를 풀링했다. 생성물을 I-PRP와 함께 10분간 배양한 실험에서는 한 개인의 저해제 혈장(148 BU/ml)을 사용했다. 30분간 I-PRP에 노출시킨 후 ROTEG 분석을 진행한 실험에서는 세 명의 다른 기증자(148 BU/ml, 106 BU/ml, 7 BU/ml)의 저해제 혈장을 사용했다.
결과:
실험 (a): 이 실험은 주입 후 짧은 시간 동안 저해제 양성 혈장에서 FVIII 의존적 응고 활성을 연구했다. I-PRP에 각각 1.0 또는 1.5IU FVIII/ml, 26:1 및 17:1의 FVIII 분자에 대한 PEGLiP 입자 비율로 유리 rFVIII(Kogenate, Bayer) 또는 PEGLiP:rFVIII을 첨가했다. ROTEM 분석은 10분 후에 시작되었다. 결과는 표 2에 나와 있다:
| 기질(Substrate) | I-PRP | I-PRP | ||
| 기증자 저해제 수준 | 148 BU/ml | 148 BU/ml | ||
| 실험용 저해제 수준 | 10 BU/ml | 10 BU/ml | ||
| rFVIII conc. | 1.0 IU/ml | 1.5 IU/ml | ||
| PEGLiP:FVIII* | n/a | 26:1 | n/a | 17:1 |
| CT (s) | 2955 ± 916 | 1769 ± 279 | 1331 ± 121 | 888 ± 47 |
| CFT (s) | 2203 ± 201 | 1443 ± 224 | 840 ± 444 | 540 ± 197 |
| CT+CFT (s) | 5158 ± 1117 | 3211 ± 503 | 2171 ± 323 | 1428 ± 149 |
| MCF (mm) | 24 ± 1 | 40 ± 4 | 47 ± 1 | 52 ± 0 |
*PEGLiP 입자: FVIII 분자
| 기질 | I-PRP | I-PRP | I-PRP | |||
| 저해제 기증자 | 기증자 1 | 기증자 2 | 기증자 3 | |||
| 반복 | 14회 반복 | 3번 반복 | 3번 반복 | |||
| 기증자 저해제 레벨 | 148 BU/ml | 106 BU/ml | 7 BU/ml | |||
| 실험의 저해제 수준 | 10 BU/ml | 10 BU/ml | 7 BU/ml | |||
| rFVIII conc. | 2.0IU/ml | 2.0IU/ml | 1.5IU/ml | |||
| mLiP:FVIII* | n/a | 13:1 | n/a | 13:1 | n/a | 17:1 |
| 테스트 솔루션 | 유리 rFVIII | PEGLiP: rFVIII | 유리 rFVIII | PEGLiP: rFVIII | 유리 rFVIII | PEGLiP: rFVIII |
| CT(s) | 1889 ±796 | 1642 ±496 | 1681 ±548 | 1319 ±336 | 1914 ±470 | 1568 ±203 |
| CFT(s) | 1076 ±604 | 707 ±342 | 1327 ±685 | 580 ±191 | 670 ±233 | 415 ±54 |
| CT+CFT(s) | 2878 ±1157 | 2349 ±794 | 3009 ±1094 | 1899 ±487 | 2584 ±665 | 1983 ±235 |
| MCF(mm) | 49 ±14 | 53 ±7 | 47 ±12 | 53 ±14 | 50 ±1 | 55 ±2 |
| 알파(도) | 15 ±16 | 27 ±9 | 8 ±14 | 30 ±7 | 20 ±18 | 38 ±5 |
*PEGLiP 입자: FVIII 분자
실험 (b): 이 실험은 주입된 FVIII이 저해 항체에 장기간 노출되었을 때 FVIII 의존적 응고 활성을 연구했다. I-PRP에 각각 1.5 또는 2.0IU FVIII/ml, 17:1 및 13:1의 FVIII 분자에 대한 PEGLiP 입자 비율로 유리 rFVIII(Kogenate, Bayer) 또는 PEGLiP:rFVIII(PLP-00)을 스파이크했다. 세 명의 다른 기증자의 저해 혈장을 사용했다.
토의:
10분 후 평가한 결과, PEGLiP:rFVIII 제형은 rFVIII 단독 제형보다 더 빠른 응고 개시(CT, 33~40% 감소), 더 빠른 증폭(CFT, 34~35% 감소), 더 단단하고 질 좋은 응고(MCF, 11~67% 증가)를 보여주었다. 30분 후 평가했을 때, PEGLiP:rFVIII 제형은 rFVIII 단독 제형보다 응고 시작이 더 빠르고(CT, 13-22% 감소), 증폭이 더 빠르며(CFT, 34-56% 감소), 더 단단하고 질 좋은 응고(MCF, 8~13% 증가)를 보여주었다. 특히 혈전 형성률(알파, 80~275% 증가)이 크게 증가한 것이 인상적이었다.
더 긴 배양 실험에서 PEGLiP는 여러 소스의 저해에 대한 rFVIII의 효능을 증가시켰다.
결론:
PEGLiP와 rFVIII의 조합을 사용하면 다음과 같이 FVIII 저해 항체가 있는 경우 FVIII 단독보다 더 효율적으로 혈전을 형성할 수 있다:
-
혈전 형성의 빠른 시작
-
혈액 응고 과정의 보다 신속한 증폭
-
더 나은 품질, 더 강한 응고
-
이러한 개선 사항은 30분이 지난 후에도 여전히 뚜렷하게 나타난다.
-
이러한 개선 효과는 세 가지 다른 출처의 저해제에 대해 관찰되었으며, 이는 PEGLiP이 다양한 에피토프 특이성을 가진 항체에 효과적이며 광범위한 환자 집단에서 잠재적인 유용성을 가지고 있음을 의미한다.
실시예 2:
항-FVIII 항체를 함유한 전혈에서 PEGLiP-rFVIII과 유리 rFVIII의 전혈 응고 시간 비교.
이 연구는 세 가지 개별 실험에서 전혈을 사용하여 저해제가 포함된 전혈에서 응고 효능을 향상시키는 PEGLiP 생성물(PLP-00)의 효과를 조사했다. 이를 통해 혈액 응고 과정의 구성 요소를 더 많이 추가하고 후천성 혈우병 모델도 시뮬레이션했다. 세 가지 실험은 다음과 같다:
a)
저해제를 함유한 전혈에 첨가된 FVIII의 응고 능력을 향상시키는 PEGLiP의 능력에 대한 검사
b)
PEGLip을 추가하여 달성한 효과 크기의 정량화 및 FVIII 투여에 대한 시사점
c)
응고 개선의 정도에 대한 PEGLiP 입자와 FVIII 분자의 비율을 변경하는 것이 미치는 영향을 조사.
혈액 샘플링:
건강한 기증자로부터 구연산 튜브에 혈액 샘플을 채취했다. 혈액은 사용하기 전에 실온에서 15분 동안 방치한 다음 채취 후 4시간 이내에 분석했다.
전혈('Whole blood, WB', 250μl)을 중증 혈우병 환자 혈장(SHP) 또는 저해제 혈장(50μl)과 혼합하여 최종 저해제 농도를~15 BU/ml로 하여 전혈(WB) 또는 저해제-전혈(I-WB) 기질을 만들고 37o C에서 10분 동안 배양했다. 그런 다음 테스트 물품(rFVIII(Kogenate, Bayer) 또는 PEGLiP:rFVIII)과 CaCl2 용액을 추가하고 즉시 ROTEM 분석을 시작하였다.
결과:
실험 (a) : 이 실험에서는 전혈(WB) 또는 저해제-전혈(I-WB)의 응고 매개변수와 rFVIII 단독(Kogenate, 바이엘) 또는 rFVIII과 PEGLiP를 13:1의 비율(13:1 PEGLiP-FVIII)로 투여하여 얻은 응고 개선 효과를 비교했다(PEGLiP 입자 대 rFVIII 분자 비율). 실험은 두 번 반복되었으며 두 번의 반복 평균 결과는 표 4에 나와 있다:
|
기질
(Substrate) |
WB + SHP | WB + 저해제 혈장(I-WB) | WB + 저해제 혈장(I-WB) | WB + 저해제 혈장(I-WB) |
| 실험의 저해제 수준 | n/a | 15 BU/ml | 15 BU/ml | 15 BU/ml |
| rFVIII 콘서트 | n/a | n/a | 1.0 IU/ml | 1.0 IU/ml |
| PEGLiP:FVIII* | n/a | n/a | n/a | 13:1 |
| CT | 691± 36 | 4751 / >5603 | 1223 ± 30 | 1128 ± 238 |
| CFT | 249 ± 122 | >990 / NA | 1793 ± 247 | 843 ± 217 |
| CT+CFT | 940 ± 158 | NA | 3016 ± 277 | 1970 ± 21 |
| MCF | 59 ± 2 | 4 / NA | 42 ± 2 | 53 ± 7 |
*PEGLiP 입자: FVIII 분자
토의:
결과는 전혈에 저해제를 추가하면 혈액 응고 과정이 심각하게 지연된다는 것을 보여준다. 이는 rFVIII을 추가하면 어느 정도 해결된다. 13:1의 비율로 PEGLiP 입자와 rFVIII 분자의 비율로 rFVIII을 PEGLiP과 함께 공급하면 FVIII 단독보다 응고 시간이 훨씬 더 단축되고 더 나은 품질의 응고(MCF 증가)가 생성된다.
실험 (b): 이 실험에서는 1IU/ml의 13:1 PEGLiP:rFVIII 조합의 저해제-전혈(I-WB)에서의 상대적 응고 효능을 1.0 IU/ml 및 4.0 IU/ml의 농도에서 유리 rFVIII과 비교했다.
| 기질 | WB + 저해제 혈장(I-WB) | WB + 저해제 혈장(I-WB) | WB + 저해제 혈장(I-WB) | WB + 저해제 혈장(I-WB) |
| 실험의 저해제 수준 | 15 BU/ml | 15 BU/ml | 15 BU/ml | 15 BU/ml |
| rFVIII 콘서트 | n/a | 1.0 IU/ml | 4.0 IU/ml | 1.0 IU/ml |
| PEGLiP:FVIII* | n/a | n/a | n/a | 13:1 |
| CT | >5880 | 1745 | 641 | 841 |
| CFT | NA | 1663 | 343 | 377 |
| CT+CFT | NA | 3408 | 984 | 1218 |
| MCF | NA | 39 | 53 | 62 |
| 알파(도) | NA | NA | 42 | 38 |
PEGLiP 입자: FVIII 분자
토의: 연구 결과에 따르면, 13:1 비율로 PEGLiP와 rFVIII을 투여하면 1IU/ml 농도의 rFVIII의 효능이 4배 농도의 효능에 근접할 정도로 개선되는 것으로 나타났다. 이는 HA 저해제 환자에게 이러한 비율로 PEGLiP와 rFVIII을 병용 투여하면 FVIII을 절약할 수 있어 주사 횟수를 줄이거나 더 적은 양의 주사를 맞을 수 있음을 의미한다.
실험 (c): 두 번의 실험이 수행되었으며, PEGLiP 입자와 rFVIII의 비율은 13:1 또는 1:1이었다. 결과는 아래 표 6에 나와 있다.
| 기질 | WB + 저해제 혈장(I-WB) | WB + 저해제 혈장(I-WB) | WB + 저해제 혈장(I-WB) | WB + 저해제 혈장(I-WB) |
| 실험의 저해제 수준 | 15 BU/ml | 15 BU/ml | 15 BU/ml | 15 BU/ml |
| rFVIII concn | n/a | 1.0 IU/ml | 1.0 IU/ml | 1.0 IU/ml |
| PEGLiP:FVIII* | n/a | n/a | 13:1 | 1:1 |
| CT | >3971 | 1719 | 431 | 824 |
| CFT | NA | 655 | 328 | 507 |
| CT+CFT | NA | 2374 | 759 | 1331 |
| MCF | NA | 47 | 57 | 53 |
| Alpha (deg) | NA | NA | 43 | 30 |
*PEGLiP 입자: FVIII 분자
토의:
PEGLiP를 함유한 두 제형 모두 rFVIII만 함유한 제형에 비해 응고 과정이 개선된 것으로 나타났다. PEGLiP의 비율이 더 높은 제형(13:1)이 1:1 제형에 비해 더 개선된 것으로 나타났다. 특히 응고 과정 시작 시 트롬빈 버스트를 나타내는 알파 파라미터는 1:1 제형에 비해 13:1 제형에서 개선된 것으로 나타났다.
결론:
(a)
전혈 내 저해제가 있는 경우 PEGLiP는 rFVIII의 효능을 향상시킬 수 있다. 이는 선천성 혈우병뿐만 아니라 후천성 혈우병에서도 잠재적인 유용성을 시사한다.
(b)
이 개선의 규모는 거의 4배에 달하는 rFVIII 용량의 증가에 해당하며, 이는 rFVIII 투여의 규모와 빈도에 중요한 영향을 미친다.
(c)
PEGLiP는 네이티브 FVII(그리고 나중에 FVIIa)에 추가로 결합하고 이를 혈소판과 연결하기 때문에 PEGLiP 입자의 농도를 FVIII 분자로 줄이면 이 기능이 감소하여 응고 개시 시간과 트롬빈 버스트 시간이 모두 감소하여 혈액 응고의 증폭이 줄어든다.
실시예 3:
저해제가 있는 중증 혈우병 혈액 모델에서 PEGLip + FVIII이 응고에 미치는 영향에 대한 생체 외(Ex-vivo) 연구.
이 연구는 전혈을 사용하여 저해제를 함유한 전혈에서 응고 효능을 향상시키는 F-PEGLiP 생성물(PLP-01)의 효과를 조사했다.
방법:
건강한 지원자로부터 채취한 정상 전혈(Whole Blood, WB) 샘플에 저해제(70BU/ml, George King Biomedical)가 함유된 70BU/ml의 FVIII 결핍 혈장을 주입하여 중증 A형 혈우병 혈액의 모의 저해제 용액을 만들었다. 충분한 양의 저해제 혈장을 첨가하고 혼합 배양하여 FVIII의 혈액을 고갈시키고 저해제 혈액(IB)의 시뮬레이션으로 15베데스다 단위/ml를 남겼다.
테스트 물품(표 7 참조)으로 스파이크된 WB, IB 또는 IB 샘플을 저량의 조직 인자 활성화제를 사용하여 ROTEM으로 분석했다.
결과:
| 시험물질 | FVIII IU/ml | F-PEGLip mg/ml |
비율
리포솜: FVIII |
CT | CFT | CT+CFT |
| 전혈(Whole blood , WB) | N/A | 507 | 137 | 644 | ||
| 저해제 혈액(IB) | N/A | 1,234 | 943 | 2,177 | ||
| IB + FVIII 제어 | 91 | 0 | N/A | 1,129 | 740 | 1,869 |
| IB + PLP-00 제어 | 0 | 90 | N/A | 1,415 | 922 | 2,337 |
| IB + PLP-00 + FVIII | 91 | 35 | 10:1 | 1,274 | 950 | 2,224 |
| IB + PLP-00 + FVIII | 72 | 84 | 29:1 | 1,487 | 1,153 | 2,640 |
| IB + PLP-00 + FVIII | 25 | 88 | 86:1 | 1,111 | 1,214 | 2,325 |
| IB + PLP-01 + FVIII | 81 | 62 | 19:1 | 1217 | 687 | 1,904 |
| IB + PLP-01 + FVIII | 72 | 63 | 22:1 | 855 | 377 | 1,232 |
저해제 혈액 모델을 만들기 위해 전혈에 저해제를 첨가하여 저해제 전혈(inhibitor whole blood, I-WB)의 응고 시간을 연장한 결과 저해제 전혈의 응고 시간이 연장되었다. 응고 시간은 FVIII 또는 PEGLip 단독으로는 회복되지 않았다. FVIII과 F-PEGLip(PLP-01)을 병용 투여한 경우 응고 시간이 단축되어 응고가 회복되었다. FVIII + F-PEGLip(PLP-01)을 사용한 저해제 투여 모델에서 응고 시간이 감소하는 것이 관찰되었다. 1도 참조.
결론:
PLP-00과 PLP-01은 모두 더 높은 PEGLiP:FVIII 비율에서 저해제 혈액의 응고가 더 효과적으로 회복되는 경향을 보여준다.
실시예 4:
저해제를 사용하는 중증 혈우병 환자의 혈액 응고에 대한 PEGLip:FVIII의 효과에 대한 생체 외(Ex-vivo) 연구.
이 실험에서는 인간(5.6 BU) 및 개(3.2 BU) FVIII에 대한 저역가 항-FVIII 항체를 가진 A형 혈우병 개의 구연산염 항응고 전혈 샘플에 FVIII, PEGLip(PLP-00), 다양한 비율(10:1, 29:1, 86:1) 또는 28:1의 F-PEGLip:FVIII(PLP-01) 혼합물의 첨가 효과를 평가했다. 테스트 생성물의 샘플을 저해제 혈액에 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 ROTEM 컵에 넣은 다음 10 l CaCl2를 추가했다. NATEM 프로그램을 사용하여 60분 동안 응고를 추적했다.
시험물질 :
FVIII: 1000IU/ml FVIII: Nuwiq (Octapharma, 0.5ml 멸균수로 재구성된 500IU 바이알)
PLP-00: 90mg/ml PEGLip: 50mM 구연산염 완충액 pH 6.7(배치 19-740)의 9% 페길화 리포솜(9% PEGylated liposomes)
PLP-01: 68mg/ml F-PEGLip: 6.8% 트위닐화된 페길화 리포좀(50mM 구연산염 완충액 pH 6.7)(배치 09-01-2020)
대조군: 구연산나트륨 완충액 50mM pH 6.7
결과:
| 시험물질 | FVIII IU/ml | F-PEGLip mg/ml |
비율
리포솜: FVIII |
CT | CFT | CT+CFT |
| 저해제 혈액(IB) | #N/A | #N/A | N/A | 5333 | n/c | 5333 |
| IB + FVIII 제어 | 91 | 0 | N/A | 4343 | n/c | 4343 |
| IB + PLP-00 제어 | 0 | 90 | N/A | 4376 | n/c | 4376 |
| IB + PLP-00 + FVIII | 91 | 35 | 10:1 | 4984 | n/c | 4984 |
| IB + PLP-00 + FVIII | 72 | 84 | 29:1 | 638 | 338.5 | 976.5 |
| IB + PLP-00 + FVIII | 25 | 88 | 86:1 | 647 | 334 | 981 |
| IB + PLP-01 + FVIII | 48 | 55 | 28:1 | 669 | 437 | 1106 |
N/C 응고 없음
치료 전 피험자의 저해제 혈액은 필요한 시간 내에 응고되지 않았다. 이는 저해제 혈액에 FVIII 단독 또는 PLP-00 단독으로 스파이크했을 때 해결되지 않았다. 마찬가지로 저해제 혈액에 10:1의 혼합물인 PLP-00 + FVIII을 주입했을 때도 응고 시간이 보정되지 않았다.
그러나 29:1 및 86:1 PLP-00 + FVIII과 28:1 PLP-01 + FVIII의 혼합물은 모두 저해제 혈액의 응고 시간을 현저히 감소시켰다. 도 2 참조.
결론적으로, 29:1 이상의 비율로 FVIII에 PLP-00을 추가하면 혈액 내 저해제에 의한 FVIII의 작용 저해를 방지할 수 있었다. 그러나 낮은 수준의 PLP-00(10:1)은 FVIII의 저해 작용을 보호하지 못했다. 이는 PEGLip이 항체 저해제에 대한 보호를 제공하는 임계 비율인 10:1에서 29:1 사이에는 PEGLip:FVIII의 비율이 존재한다는 것을 의미한다.
추가 PEG가 포함된 두 번째 페길화 리포솜 제형(F-PEGLip/PLP-01)도 28:1 PLP-01:FVIII 비율로 저해제 항체 분해로부터 FVIII을 보호하는 것으로 나타났다.
실시예 5:
저해제 사용 환자를 피험자로 한 PEGLiP + FVIII 임상 연구
특정 비율의 PEGLip-FVIII이 저해제 환자의 혈액 응고를 회복시킨다는 것을 입증하기 위한 연구가 진행 중이다.
저해제가 생성하기 쉬운 A형 혈우병 환자들은 PEGLiP+FVIII (PLP-00) 을 주사했을 때 저해제가 생성되지 않았으며 응고 교정(coagulation correction)을 보였다.
이번 임상시험에는 FVIII에 대한 항체 저해제 생성 병력이 있는 중증 혈우병 환자 4명이 참여했다. 이 환자들은 병력 때문에 저해제 생성 위험으로 인해 예방 요법으로 대체 FVIII을 투여받을 수 없다. 임상시험에서 이들 환자 중 3명은 처음에 저해제가 없었고 1명은 낮은 역가(<5BU)를 나타냈다. 모든 환자에게는 22mg/kg의 PEGLip과 35IU/kg의 재조합 인간화 FVIII(콜로이드 입자:FVIII 비율 15:1~16:1)이 포함된 PEGLip + FVIII을 투여했다. 평가 첫 주에 모든 환자들은 상당한 응고 교정을 경험했으며, 이후 6주 동안 평균 6일마다(범위는 4~7일) 투여할 수 있었다. 6주 동안 매주 1회씩 재투여했음에도 불구하고 저해제 없이 나타난 3명의 저해제 감수성 환자 중 치료제에 대한 저해제가 생성된 환자는 없었다. 역가가 낮은 저해제를 보인 한 명의 환자는 첫 번째 단계에서 임상적으로 미미한 수준의 작은 상승을 경험했으며, 두 번째 단계에서 반복 투여하는 동안 실제로 감소했다. 저해제 생성에 취약한 환자에서 저해제 생성을 자극하지 않는 PEGLip-FVIII의 특성으로 인해 이 생성물은 치료 경험이 없거나 최소한의 치료를 받은 환자에서 저해제 생성을 예방하는 데 매우 적합할 것으로 제안된다.
| 저해제가 있는 중증 A형 혈우병 환자(N=4) |
평균
(SD) |
중앙값
(최소, 최대) |
| A단계에서 결정된 PEGLip-FVIII 주사 빈도(일) | 6.0 (1.4) |
6.5 (4.0; 7.0) |
| B단계 동안 투여된 PEGLip-FVIII 주사 빈도(일) | 5.1 (1.2) |
5.2 (3.6; 6.3) |
| 등록 전 24주 동안의 자연 출혈 병력(에피소드/월) | 0.9 (0.4) |
0.8 (0.5; 1.3) |
| B단계 동안 평가된 자연 출혈 에피소드(에피소드/월)- 환자 4명 중 3명은 자연 출혈을 경험하지 않았다. | 0.5 (0.9) |
0. 0 (0.0; 0.9) |
| 항-FVIII 항체(베데스다 유닛) - 선별 검사 | 1.1 (2.2) |
0. 0 (0.0; 4.4) |
| 항-FVIII 항체(베데스다 유닛) - A 단계 종료 | 2.0 (4.0) |
0.0 (0.0; 8.0) |
| 항-FVIII 항체(베데스다 유닛) - B단계 종료 | 1.7 (3.4) |
0. 0 (0.0; 6.8) |
결론:
15:1에서 16:1 사이의 PEGLiP와 FVIII의 비율은 더 많은 양의 저해제 생성을 자극하지 않으면서 FVIII에 대한 저해제가 있는 환자뿐만 아니라 FVIII에 대한 저해제가 생성하기 쉬운 환자의 출혈 위험을 낮춘다.
실시예 요약
10:1 이하(실시예 1, 실시예 2 - 실험 c, 실시예 3 및 실시예 4)의 PEGLip:FVIII 비율은 더 높은 비율(13:1 이상)보다 응고 개선에 덜 효과적이다. 임상 실험에 따르면 15:1에서 16:1의 비율은 저해제가 있는 A형 혈우병 환자의 출혈을 예방할 뿐만 아니라 이 제제는 저해제가 있을 때 효과적이며 저해제가 생성하기 쉬운 환자의 저해제 생성도 예방하는 것으로 나타났다.
실시예 6:
저해제를 사용하는 중증 혈우병 환자의 혈액 응고에 대한 PEGLip:FVIII의 효과에 대한 생체 외(Ex-vivo) 연구.
이 실험들은 혈우병 A를 가진 개로부터 채취한 낮은 역가 항-FVIII 항체(인간 FVIII에 대해 5.6 BU, 개 FVIII에 대해 3.2 BU)를 가진 구연산염 항응고 전혈 샘플에 FVIII, PEGLip(PLP-00), 다양한 비율의 PEGLip:FVIII(PLP-00; 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 90:1) 및 다양한 비율의 F-PEGLip:FVIII(PLP-01; 10:1, 20:1, 30:1)을 추가한 효과를 평가했다. 테스트 제품의 샘플들이 저해제 혈액에 추가되어 부드럽게 혼합된 후, ROTEM 컵에 추가되고 이어서 10μl의 CaCl2가 추가되었다. 응고는 NATEM 프로그램을 사용하여 60분 동안 추적되었다. 효과는 치료하지 않은 혈우병 저해제 혈액의 백분율로 각 치료에서 달성된 응고 시간으로 판단했다.
시험물질 :
FVIII: 1000IU/ml FVIII: Nuwiq (Octapharma, 0.5ml 멸균수로 재구성된 500IU 바이알)
PLP-00: 90mg/ml PEGLip: 50mM 구연산염 완충액 pH 6.7(배치 19-740)의 9% 페길화 리포솜(9% PEGylated liposomes)
PLP-01: 68mg/ml F-PEGLip: 6.8% 트위닐화된 페길화 리포좀(50mM 구연산염 완충액 pH 6.7)(배치 09-01-2020)
대조군: 구연산나트륨 완충액 50mM pH 6.7
결과:
| 시험물질 | FVIII IU/ml | PLP-00/PLP-01 mg/ml | 리포솜: FVIII | CT를 % IB 대조군 |
| 대조군 - 저해제 혈액(IB) | #N/A | #N/A | N/A | 100% |
| IB + FVIII 제어 | 91 | 0 | N/A | 96% |
| IB + PEGLip 제어 | 0 | 90 | N/A | 82% |
| IB+PEGLip-FVIII | 91 | 36 | 10:1 | 96% |
| IB+PEGLip-FVIII | 91 | 56 | 15:1 | 39% |
| IB+PEGLip-FVIII | 91 | 74 | 20:1 | 29% |
| IB+PEGLip-FVIII | 81 | 83 | 25:1 | 25% |
| IB+PEGLip-FVIII | 70 | 84 | 30:1 | 18% |
| IB+PEGLip-FVIII | 25 | 88 | 90:1 | 12% |
| IB+FlexPEGLip-FVIII | 48 | 19 | 10:1 | 100% |
| IB+FlexPEGLip-FVIII | 48 | 39 | 20:1 | 100% |
| IB+FlexPEGLip-FVIII | 48 | 57 | 30:1 | 38% |
치료 전 피험자의 저해제 혈액은 필요한 시간 내에 응고되지 않았다. 이는 저해제 혈액에 FVIII 단독 또는 PLP-00 단독으로 첨가했을 때 해결되지 않았다. 마찬가지로 저해제 혈액에 10:1의 혼합물인 PLP-00 + FVIII을 첨가했을 때도 응고 시간이 보정되지 않았다.
그러나 15:1 PLP-00 + FVIII 및 30:1 PLP-01 + FVIII 이상의 혼합물은 모두 저해제 혈액의 응고 시간을 현저히 감소시켰다. 도 3도 참조.
결론적으로, 15:1 이상의 비율로 FVIII에 PLP-00을 추가하면 혈액 내 저해제에 의한 FVIII의 작용 저해를 방지할 수 있었다. 그러나 낮은 수준의 PLP-00(10:1)은 FVIII의 저해 작용을 보호하지 못했다. 이는 PEGLip이 항체 저해제에 대한 보호를 제공하기 시작하는 임계 PEGLip:FVIII 비율이 10:1에서 15:1 사이라는 것을 의미한다. 90:1의 비율은 30:1의 비율에 비해 작은 이점이 있으며, 이는 15:1에서 30:1 사이가 최적의 PEGLip 보존 비율임을 의미한다.
PEG를 추가한 두 번째 페길화 리포솜 제형(F-PEGLip/PLP-01)도 30:1 PLP-01:FVIII 비율에서 저해제 항체 분해로부터 FVIII을 보호했지만, 이 제형의 효과 하한은 20:1보다 높지만 여전히 PLP-00의 효능이 어느 정도 있는 비율이다.
실시예 7:
저해제 사용 환자를 피험자로 한 PEGLiP + FVIII 임상 연구
2상 임상시험은 특정 비율의 PEGLip-FVIII이 저해제 환자의 응고를 회복시킨다는 것을 입증하기 위해 수행되었다. 이 연구는 실시예 5에 설명된 결과를 바탕으로 진행되었다.
선별 검사 시 저해제가 있었거나 임상 기록상 FVIII 노출 시 저해제가 생성하기 쉬운 것으로 나타난 중증 A형 혈우병 환자들은 PEGLiP+FVIII (PLP-00+시모옥토코그 알파(simoctocog alfa))를 주사했을 때 각각 저해제 역가가 증가하거나 저해제가 생성되지 않았으며 응고 교정 및 출혈 빈도 감소를 보여주었다.
이번 임상시험에는 FVIII에 대한 항체 저해제 생성 병력이 있는 중증 혈우병 환자 13명이 참여했다. 이 중 8명의 환자는 병력 때문에 저해제 생성 위험으로 인해 예방 요법으로 대체 FVIII을 투여받을 수 없었다. 나머지 5명의 환자는 선별 검사에서 활성 저해제 역가(평균 2.4베데스다 유닛)가 나타났다. 모든 환자들은 22mg/kg의 PEGLip과 35IU/kg의 재조합 인간화 FVIII(콜로이드 입자:FVIII 비율 15:1~16:1)의 PEGLip + FVIII(시모옥토코그 알파 (simoctoctog alfa))을 투여받았다. 평가 첫 주에 모든 환자들은 상당한 응고 교정을 경험했으며, 이후 6주 동안 평균 5.5일마다(범위 3.0~7.4일) 투여할 수 있어 투여 간격이 크게 연장되었다(시모옥토코그 알파 의 일반적인 투여 간격은 격일 또는 주 2~3회이다). 이렇게 투여 빈도를 줄였음에도 불구하고 환자들의 월 평균 출혈 횟수는 월 평균 1건(연간 12.3건)에서 월 평균 0.3건(연간 3.2건)으로 감소하여 출혈이 현저히 감소했다.
6주 동안 매주 1회씩 재투여했음에도 불구하고 저해제가 없는 8명의 저해제 감수성(inhibitor-prone) 환자 중 치료제에 대한 저해제가 생성된 환자는 없었다. 또한, 저해제가 나타난 5명의 환자들은 해당 임상시험의 6주 예방 단계 동안 저해제 역가(inhibitor titre)가 크게 상승하지 않았다. 저해제 발현 및 저해제 취약 환자를 위한 치료제로서뿐만 아니라 저해제 취약 환자의 저해제 생성을 자극하지 않는 PEGLip-FVIII의 특성은 이 생성물이 이전에 치료를 받지 않은 환자 또는 최소한의 치료를 받은 환자의 치료에도 매우 적합하여 이러한 취약 환자의 저해제 생성을 예방할 수 있을 것으로 제안된다.
| 저해제 환자 활성 저해제 없음 |
저해제 환자 선별 검사 시 활성 저해제 |
총 저해제 환자 수 | |
| n = | 8 | 5 | 13 |
| 베데스다 역가(단위 | |||
| 심사 시 평균(SD) 단위 중앙값[최소, 최대] 단위 |
0.0 (0) 0.0 [0; 0] |
2.4 (1.3) 2.0 [1.3; 4.4] |
0.9 (1.4) 0.0 [0.0; 4.4] |
| A 단계 종료 시 평균(SD) 단위 중앙값[최소, 최대] 단위 |
0.0 (0) 0.0 [0; 0] |
2.5 (3.1) 1.1 [1.0; 8.0] |
1.0 (2.2) 0.0 [0.0; 8.0] |
| B 단계 종료 시 평균(SD) 단위 중앙값[최소, 최대] 단위 |
0.0 (0) 0.0 [0; 0] |
2.4 (2.5) 1.3 [0.9; 6.8] |
0.9 (1.9) 0.0 [0.0; 6.8] |
| 변경(B단계 심사) (p-값) |
0 n/a |
0 P=0.975 |
0.0 p>0.999 |
|
B단계 동안 투여된 PEGLip-FVIII 주사 빈도(일) |
|||
| 평균(SD) 중앙값 [최소, 최대] |
5.5 (1.3) 5.5 [3.0; 7.4] |
||
| 월별 출혈 에피소드 | |||
| 등록 24주 전 평균(SD) 중앙값 [최소, 최대] |
0.9 (0.3) 1.0 [0.5; 1.3] |
1.2(0.2) 1.3 [0.8;1.3] |
1.0 (0.3) 1.0 [0.5; 1.3] |
| B단계 중 평균(SD) 중앙값 [최소, 최대] |
0.2 (0.7) 0.0 [0.0; 1.9] |
0.3 (0.4) 0.0 [0.0; 0.8] |
0.3 (0.6) 0.0 [0.0; 1.9] |
| 평균(B단계 - 심사) (p-값) |
-0.7 | -0.9 | -0.8 p<0.005 |
Claims (42)
- 피험자에 A형 혈우병 치료용 콜로이드 입자를 포함하는 조성물로서,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 잔기(moiety)를 포함하는 제 1 양친매성 지질(amphipathic lipid) 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (phosphatidyl ethanolamine, PE), 포스파티딜 세린 (phosphatidyl serine, PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제 2 양친매성 지질(amphipathic lipid)을 포함하고, 상기 제 2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하며,
상기 피험자는 이전에 Factor VIII (FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 피험자인, 조성물 - 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬 에테르, 폴리락트산, 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체적합성 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 500~5,000 달톤(Dalton)의 분자량을 가지는 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 2,000 달톤 또는 약 5,000 달톤의 분자량을 가지는 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG)인 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG2000) 또는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG5000)인 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린 (PC)이 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC)인 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 90~99:10~1의 몰 비율로 포함하는 조성물
- 제9항에 있어서, 상기 조성물은 제1 양친매성 지질과 제 2 양친매성 지질을 97:3의 몰 비율로 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜로이드 입자는 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 폴리하이드록시에틸렌 스테아레이트 및 폴리하이드록시에틸렌 라우릴에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 비이온성 계면활성제를 더 포함하는 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트인 조성물.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 콜로이드가 제1 양친매성 지질과 제2 양친매성 지질을 상기 비이온성 계면활성제에 대해 중량비로 30:1~2:1의 비율로 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 제1 양친매성 지질, 제 2 양친매성 지질 및 비이온성 계면활성제를 중량비로 10~40:1:0~4의 비율로 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 Factor VIII (FVIII) 분자를 더 포함하는 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 조성물은 상기 콜로이드 입자와 상기 Factor VIII (FVIII) 분자를 1~90:1의 화학양론적 비율(stoichiometric ratio)로 포함하는 조성물.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 조성물은 콜로이드 입자 : Factor VIII (FVIII) 분자가 10~20:1 또는 5~10:1의 화학양론적 비율로 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A형 혈우병은 선천성 A 형 혈우병 (cHA)인 조성물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A 형 혈우병은 후천성 A 형 혈우병 (aHA)인 조성물.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 치료 활성 화합물을 더 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 부형제, 희석제 또는 보조제를 더 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자가 소아 피험자인 조성물.
- 콜로이드 입자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 피험자에 A형 혈우병을 치료하는 방법으로, 상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (PC) 잔기를 포함하는 제 1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (PE), 포스파티딜 세린 (PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제 2 양친매성 지질을 포함하고, 상기 제 2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하고,
상기 피험자는 이전에 Factor VIII (FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 피험자인, 치료 방법. - 제23항에 있어서, 상기 생체적합성 친수성 폴리머는 폴리알킬 에테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 생체적합성 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 500~5,000 달톤 범위의 분자량을 가지는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 2000~5,000 달톤 범위의 분자량을 가지는 방법
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린 (PC)이 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC)인 방법.
- 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질이 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG)인 방법.
- 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인지질이 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG2000) 또는 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-5000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE-PEG5000)인 방법
- 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜로이드 입자가 (iii) 비이온성 계면활성제를 더 포함하는 방법.
- 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 Factor VIII (FVIII) 분자를 더 포함하는 방법
- 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 별도 또는 후속으로 Factor VIII (FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 추가 단계를 포함하는 방법
- 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A형 혈우병이 선천성 A 형 혈우병 (cHA)인 방법.
- 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A 형 혈우병이 후천성 A 형 혈우병 (aHA)인 방법.
- 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자가 소아 피험자인 방법.
- 피험자에 A 형 혈우병 치료용 키트로,
상기 키트는 (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및
(ii) Factor VIII (FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하며,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (PE), 포스파티딜 세린 (PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하고, 상기 제 2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체와 인지질 잔기를 포함하며,
상기 피험자는 이전에 Factor VIII (FVIII)에 대한 항체 저해제를 생성한 피험자인, 키트. - 제37항에 있어서, 상기 콜로이드 입자가 (iii) 비이온성 계면활성제를 더 포함하는 키트.
- 피험자에 A 형 혈우병을 치료하기 위한 별도, 동시 또는 후속 사용을 위한 키트로,
상기 키트는 (i) 콜로이드 입자를 포함하는 조성물 및 (ii) Factor VIII (FVIII) 분자를 포함하는 조성물을 포함하며, 상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질과 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (PE), 포스파티딜 세린 (PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하고, 상기 제2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하며,
상기 피험자는 이전에 Factor VIII (FVIII)에 대한 항체 억제제를 생성한 피험자인, 키트 - 제39항에 있어서, 상기 콜로이드 입자가 (iii) 비이온성 계면활성제를 더 포함하는 키트.
- 피험자에 A 형 혈우병 치료용 콜로이드 입자를 포함하는 약학 조성물의 제형으로,
상기 콜로이드 입자는 (i) 포스파티딜콜린 (PC) 잔기를 포함하는 제1 양친매성 지질 및 (ii) 포스파티딜 에탄올아민 (PE), 포스파티딜 세린 (PS) 및 포스파티딜 이노시톨 (PI)로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 잔기를 포함하는 제2 양친매성 지질을 포함하며,
상기 제2 양친매성 지질은 생체적합성 친수성 폴리머로 유도체화된 인지질 잔기를 포함하며,
상기 피험자는 Factor VIII (FVIII)에 대한 항체 저해제를 이전에 생성한 피험자인, 제형. - 제41항에 있어서, 상기 콜로이드 입자 (iii) 비이온성 계면활성제를 더 포함하는 제형.
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