ES2954121T3 - Composición bioactiva para mejorar la tolerancia al estrés de las plantas - Google Patents

Composición bioactiva para mejorar la tolerancia al estrés de las plantas Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a una composición para mejorar la tolerancia al estrés de las plantas que comprende al menos un oligómero derivado hidroxicinámico y, opcionalmente, un agente solubilizante en agua. La presente invención también se refiere a un método para mejorar la tolerancia al estrés de una planta que comprende aplicar dicha composición a la planta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición bioactiva para mejorar la tolerancia al estrés de las plantas
Campo de la invención
La presente invención se refiere al uso de una composición bioactiva para mejorar la tolerancia al estrés de las plantas. En particular, la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende al menos un oligómero derivado de hidroxicinámico para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico, aumentar la supervivencia en condiciones ambientales adversas, obtener un mejor crecimiento y proporcionar una ventaja sustancial en el rendimiento.
Antecedentes de la invención
La gestión de los cultivos se lleva a cabo más comúnmente con productos químicos, por ejemplo, fertilizantes o pesticidas, que aseguran una protección vegetal eficaz, pero a menudo interfieren con los demás componentes biológicos del medio ambiente, determinando desequilibrios irreversibles. Además, estos productos pueden causar graves daños a la salud de los consumidores como consecuencia de sus residuos en productos alimenticios. De este escenario, surge la necesidad de una disminución gradual del uso de herramientas químicas en la agricultura. Hoy en día, la agricultura se centra cada vez más en la calidad de los productos y en los aspectos ambientales, higiénicos y sanitarios. Por lo tanto, las prácticas agrícolas avanzan hacia una gestión sostenible de los cultivos agrícolas, con el fin de garantizar las propiedades cuantitativas y cualitativas del producto.
Durante la última década, los estudios sobre tecnologías alternativas respetuosas con el medio ambiente han recibido un fuerte impulso y han propuesto una amplia gama de opciones, incluyendo medios de control agronómico, físico y biológico (Verma et al., Biochem Eng Journal. 2007, 37:1-20; Shoresh et al., Annu Rev Phytopathol. 2000, 48:21-43; Bharti et al., J Sci Food Agric. 2013, 93:2154-2161; Yeoh et al., Mol Biol Rep. 2013, 40:147-158). En este sentido, el uso de biopesticidas bioestimulantes representan algunas de las opciones más prometedoras.
Los biopesticidas son ciertos tipos de pesticidas derivados de materiales naturales como animales, plantas, bacterias y ciertos minerales. Los biopesticidas se dividen en tres clases principales: (1) Los pesticidas microbianos consisten en un microorganismo como ingrediente activo. Por ejemplo, hongos que controlan ciertas malas hierbas; (2) Los protectores incorporados en plantas (PIP) son sustancias pesticidas que las plantas producen a partir de material genético que se ha añadido a la planta y (3) los biopesticidas bioquímicos, compuestos bioactivos naturales o compuestos bioactivos derivados sintéticamente que son estructuralmente similares (y funcionalmente idénticos) a sus contrapartes naturales. Los elicitores que son capaces de desencadenar respuestas de defensa inmune en las plantas son uno de los biopesticidas más utilizados. En general, los biopesticidas bioquímicos se caracterizan por un modo de acción no tóxico que puede afectar el crecimiento y desarrollo de una plaga, su capacidad de reproducción o la ecología de la plaga.
Los bioestimulantes de plantas son sustancias bioactivas y/o microorganismos cuya función, cuando se aplican a las plantas o la rizosfera, es estimular los procesos naturales para mejorar/beneficiar la captación de nutrientes, la eficiencia de los nutrientes, la tolerancia al estrés abiótico y la calidad de los cultivos. Los bioestimulantes son capaces de mejorar las cualidades y el rendimiento de las cosechas a un menor costo, jugando en el metabolismo de la planta mientras reducen los impactos perjudiciales sobre el medio ambiente del uso de compuestos químicos.
Los bioestimulantes no aportan nutrientes directamente a las plantas y no tienen acción directa contra las plagas, pero aumentan la capacidad de las plantas para resistir diferentes estreses abióticos y bióticos: falta de agua, calor fuerte, exceso de humedad, alta salinidad, minerales o compuestos tóxicos, enfermedades o plagas (bacterias, virus, hongos, parásitos o insectos dañinos). Estas condiciones de estrés tienen un impacto negativo en la producción de cultivos. Además, el uso de bioestimulantes, incluso a bajas concentraciones del ingrediente/principio/compuesto activo, puede ayudar a limitar el uso de fertilizantes o pesticidas al mejorar el crecimiento de las plantas y el estado físico global. Es de gran interés en la agricultura mejorar el rendimiento de los cultivos con el objetivo de disminuir las cantidades totales de productos químicos a utilizar.
Los bioestimulantes de plantas generalmente se encuentran dentro de una de tres categorías principales: hormonas de plantas, sustancias amínicas y sustancias húmicas. De acuerdo con lo anterior, los ejemplos de bioestimulantes de plantas incluyen composiciones basadas en extracto de algas marinas, ácido húmico, aminoácidos, ácido salicílico, biosólidos, proteínas hidrolizadas, silicato y/o compuestos sintéticos.
El ácido cinámico y sus derivados sustituidos con hidroxi en 4 (a saber, ácido p-cumárico, ácido cafeico, ácido ferúlico y ácido sinápico), forman una familia de productos naturales abundantes en plantas y generalmente conocidos como cinamatos. En particular, el ácido ferúlico, varios ácidos diferúlicos e incluso los triferulatos son componentes importantes de las paredes celulares de las plantas en ciertas plantas. En la pared celular, estos compuestos se esterifican a los restos de arabinosa de los glucuronoarabinoxilanos, un componente predominante de la matriz de hemicelulosa. Por ejemplo, el ácido ferúlico se considera como el reticulante fenólico predominante en la pared celular de las gramíneas y juega un papel importante en la extensibilidad de la pared celular (Carpita N. C. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996, 47:445-476).
Los oligómeros de ácido cinámico son conocidos como agentes antiinflamatorios, inhibidores de elastasa y antioxidantes. Por ejemplo, WO2010/027594 divulga el uso de dichos oligómeros como anticoagulantes.
El ácido ferúlico también se conoce como antioxidante. Por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. US2004/259732 divulga composiciones para mejorar el rendimiento de una planta que comprende un antioxidante tal como ácido ferúlico y derivados.
La solicitud de patente JP-H-10338603 divulga el ácido cinámico como un compuesto útil para prevenir la muerte de hojas y raíces causada por bacterias patógenas. WO03/000288 también divulga composiciones para inducir una ruta endógena de defensa contra patógenos en una planta, comprendiendo tales composiciones ácido ferúlico. Además, Li et al. (Biologia Plantarum. 2013, 57(4):711-717) han mostrado que las plántulas de pepino regadas durante 2 días con solución nutritiva de Hoagland que contiene ácido ferúlico podrían proteger a las plantas del estrés por deshidratación.
Sin embargo, los ácidos cinámico y ferúlico se reportan desde hace varios años como agentes fitotóxicos (Turner et al., Journal of Chemical Ecology. 1975, 1 (1 ):41 -58; Rasmussen et al., Journal of Chemical Ecology. 1977, 3(2):197-205; Liebl et al., Journal of Chemical Ecology. 1983, 9(8):1027-1043; Blum et al., Journal of Chemical Ecology. 1984, 10(8):1169-1191) y son utilizados por numerosas plantas como agentes inhibidores aleloquímicos (Einhellig et al., Journal of Chemical Ecology. 1984, 10(1):161-170; Dos Santos et al., Journal of Chemical Ecology. 2004, 30(6):1203-1212; Yu et al., Journal of Chemical Ecology. 1994, 20(1 ):21-31; Lehman et al., Journal of Chemical Ecology. 1999, 25(11):2585-2600).
Los solicitantes encontraron inesperadamente que los oligómeros de derivados hidroxicinámicos promueven el crecimiento y desarrollo de las plantas en diversas condiciones de estrés, en particular en condiciones ambientales adversas tales como sequía o estrés mineral. Este efecto de preparación para la sequía mediado por la estimulación del crecimiento mejora el uso efectivo del agua bajo una variedad de estreses de sequía, desde estrés hídrico leve estacional hasta sequía severa y prolongada. Este abanico de situaciones de estrés hídrico suele ir acompañado de estrés por calor.
Por tanto, la presente invención se refiere al uso de una composición para mejorar la tolerancia al estrés de una planta que comprende al menos un oligómero de derivado hidroxicinámico.
Resumen
La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, en donde dicho derivado del ácido hidroxicinámico se selecciona del grupo de ácido ferúlico, ácido pcumárico, ácido cafeico y ácido sinápico, y en donde dicha composición comprende como máximo el 3 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje respecto al total de oligómeros de derivado hidroxicinámico de la composición, preferiblemente como máximo el 2 %, más preferiblemente como máximo el 1%.
En una realización, el al menos un derivado del ácido hidroxicinámico se selecciona del grupo que comprende ácido ferúlico, ácido p-cumárico, ácido cafeico y ácido sinapínico.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende además al menos un agente solubilizante en agua.
La presente invención se refiere al uso de dicha composición para mejorar la tolerancia al estrés de una planta frente al estrés abiótico que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico. En una realización, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la invención tiene un grado de polimerización de al menos 2.
Dicho al menos un derivado de ácido hidroxicinámico se selecciona del grupo que comprende ácido ferúlico, ácido pcumárico, ácido cafeico y ácido sinapínico. En una realización, la composición de la invención comprende al menos un oligómero de ácido ferúlico, preferiblemente ácido diferúlico.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende de 0,0001 a 200 ppm (partes por millón) de dicho al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente de 0,001 a 100 ppm, más preferiblemente de 0,005 a 50 ppm.
La composición para mejorar la tolerancia al estrés utilizada en la invención comprende como máximo el 3 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto al total de oligómeros del derivado hidroxicinámico de la composición, preferiblemente como máximo el 2 %, más preferiblemente como máximo el 1 %.
En otra realización, la composición de la invención comprende al menos el 10 % de dímero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto al total de oligómeros derivados del ácido hidroxicinámico de la composición, preferiblemente al menos el 20 %, más preferiblemente al menos el 30 %.
En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende al menos el 70 % de dímero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto al total de oligómeros derivados del ácido hidroxicinámico de la composición, preferiblemente al menos el 75 %, más preferiblemente al menos el 80 %.
De acuerdo con el uso de la invención, la composición se usa para mejorar la tolerancia al estrés de una planta, en donde dicho estrés es abiótico. En una realización, dicho estrés abiótico se selecciona del grupo que comprende estrés hídrico, sequía, estrés osmótico, estrés térmico, deficiencia de nutrientes y estrés químico generado por contaminantes metálicos u orgánicos en el suelo para cultivar dicha planta, preferentemente estrés hídrico, sequía u estrés osmótico.
La presente invención también se refiere al uso de una composición para mejorar la tolerancia al estrés de una planta como se describe anteriormente en la presente memoria, que comprende además al menos un agente solubilizante en agua.
En una realización, el al menos un agente solubilizante en agua de la invención se selecciona del grupo que comprende polisacáridos y polioles. En una realización particular, dicho al menos un agente solubilizante en agua es un polisacárido seleccionado del grupo que comprende quitosano, quitina, quitina-glucano, carboximetilcelulosa, pectina, hemicelulosa, preferiblemente quitosano.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, un espray que comprende una composición como se describe anteriormente en la presente memoria.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, una semilla de planta, en donde dicha semilla está recubierta con una composición como se describe anteriormente en la presente memoria.
El objeto de la invención es el uso de una composición que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico para mejorar la tolerancia al estrés de una planta al estrés abiótico, como se refleja en las reivindicaciones.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para mejorar la tolerancia al estrés de una planta que comprende aplicar una composición como se describe anteriormente en la presente memoria.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos utilizados en la divulgación de la invención, incluidos los términos técnicos y científicos, tienen el significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. A modo de orientación adicional, se incluyen definiciones de términos para apreciar mejor las enseñanzas de la presente invención. Cuando se definen términos específicos en relación con un aspecto o realización particular, se pretende que dicha connotación se aplique a lo largo de esta memoria descriptiva, es decir, también en el contexto de otros aspectos o realizaciones, a menos que se defina de otro modo. En la presente invención, los siguientes términos tienen los siguientes significados precisos:
- "Oligómero" se refiere a una macromolécula que consiste en varias unidades monoméricas repetitivas unidas entre sí. En una realización, los oligómeros de la invención están compuestos por dos, tres, cuatro o más monómeros. En una realización de la invención, los oligómeros son dímeros, trímeros, tetrámeros o más.
- "Grado de polimerización" se refiere al número de unidades monoméricas en el oligómero de la invención.
En una realización, el grado de polimerización del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico es al menos 2.
- "Oligoferulato" se refiere a un oligómero de ácido ferúlico, también llamado oligómero de ferulato. Un dímero de ácido ferúlico en particular es un oligómero que consiste en dos monómeros de ácido ferúlico unidos por cualquier enlace. El dímero de ácido ferúlico también puede denominarse ácido diferúlico o diferulato.
- "Mejorando", en el contexto de la presente invención, puede sustituirse por induciendo, aumentando, potenciando y similares.
- "Tolerancia" se refiere a la capacidad de una planta para soportar un estrés sin sufrir una alteración sustancial en el metabolismo, crecimiento, productividad y/o viabilidad. En una realización de la invención, el estrés puede ser un estrés abiótico o un estrés biótico.
- "Estrés abiótico" se refiere a un estrés que se produce como resultado de factores no vivos que influyen en el entorno en el que vive la planta.
- "Estrés biótico" se refiere a un estrés que ocurre como resultado del daño causado a las plantas por otros organismos vivos, como bacterias, virus, hongos, parásitos, insectos beneficiosos y dañinos, malezas y plantas cultivadas o nativas.
- "ppm" se refiere a partes por millón, es decir, una parte por 1.000.000 de partes.
- "Aproximadamente" cuando precede a un valor significa más o menos el 10 % de dicho valor.
Descripción detallada
La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, en donde dicho derivado del ácido hidroxicinámico se selecciona del grupo de ácido ferúlico, ácido pcumárico, ácido cafeico y ácido sinápico, y en donde dicha composición comprende como máximo el 3 % de un monómero de dicho derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto al total de oligómeros derivados de hidroxicinámico de la composición.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "derivado del ácido hidroxicinámico" significa compuestos fenólicos o polifenólicos originados a partir de las vías de biosíntesis de mavolanato-shikimato en plantas. Este grupo de ácido fenólico incluye, por ejemplo, sin limitación, ácido ferúlico, ácido cafeico, ácido p-cumárico, ácido clorgénico, ácido sinápico, curcumina y ácidos rosmarínicos. En una realización, un derivado del ácido hidroxicinámico es un ácido monohidroxicinámico, un ácido dihidroxicinámico, un ácido trihidroxicinámico, un ácido hidroxicinámico metilado o un éster o conjugado de un derivado del ácido hidroxicinámico. En una realización, los derivados del ácido hidroxicinámico según la invención no incluyen compuestos de hidrólisis.
En una realización, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición utilizada en la invención es un oligómero de ácido monohidroxicinámico que es el ácido p-cumárico. Los ejemplos de ácidos monohidroxicinámicos incluyen, pero no se limitan a, ácidos cumáricos tales como, por ejemplo, ácido p-cumárico (ácido 4-hidroxicinámico), ácido o-cumárico (ácido 2-hidroxicinámico) y ácido m-cumárico (ácido 3-hidroxicinámico), o una mezcla de los mismos.
En otra realización, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición utilizada en la invención es un oligómero del ácido dihidroxicinámico que es el ácido cafeico. Los ejemplos de ácidos dihidroxicinámicos incluyen, pero no se limitan a, ácido cafeico (ácido 3,4-dihidroxicinámico), ácido umbélico (ácido 2,4-dihidroxicinámico), ácido 2,3-dihidroxicinámico, ácido 2,5-dihidroxicinámico y ácido 3,5-dihidroxicinámico, o una mezcla de los mismos.
En otra realización, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición divulgada en la presente memoria, pero que no forma parte de la invención, es un oligómero de ácido trihidroxicinámico. Los ejemplos de ácidos trihidroxicinámicos incluyen, pero no se limitan a, ácido 3,4,5-trihidroxicinámico y ácido 3,4,6-trihidroxicinámico, o una mezcla de los mismos.
En otra realización, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición utilizada en la invención es un oligómero de ácido hidroxicinámico metilado que es ácido ferúlico y ácido sinápico. Los ejemplos de ácidos hidroxicinámicos metilados incluyen, pero no se limitan a, ácido ferúlico (ácido 3-metoxi-4-hidroxicinámico), ácido 5-hidroxiferúlico y ácido sinapínico (ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico), o una mezcla de los mismos.
En una realización, la composición divulgada en la presente memoria, pero que no forma parte de la invención, comprende al menos un éster u oligómero conjugado de un derivado del ácido hidroxicinámico. Los ejemplos de ésteres o conjugados de derivados del ácido hidroxicinámico incluyen, pero no se limitan a, ácido caftárico, ácido cicórico, ácido clorogénico y ácido cutárico, o una mezcla de los mismos.
En una realización, el al menos un derivado del ácido hidroxicinámico utilizado en la invención se selecciona del grupo que comprende ácido ferúlico, ácido cumárico, ácido cafeico y ácido sinapínico, o una mezcla de los mismos. En una realización preferida, el al menos un derivado del ácido hidroxicinámico utilizado en la invención es ácido ferúlico o ácido cumárico, o una mezcla de los mismos. En una realización más preferida, el al menos un derivado del ácido hidroxicinámico utilizado en la invención es ácido ferúlico o ácido p-cumárico, o una mezcla de los mismos.
En una realización, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición utilizada en la invención se selecciona del grupo que comprende oligómeros de ácido ferúlico, oligómeros de ácido cumárico, oligómeros de ácido cafeico y oligómeros de ácido sinapínico, o una mezcla de los mismos. En una realización preferida, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición utilizada en la invención es un oligómero de ácido ferúlico o un oligómero de ácido cumárico, o una mezcla de los mismos. En una realización más preferida, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición utilizada en la invención es un oligómero de ácido ferúlico o un oligómero de ácido p-cumárico, o una mezcla de los mismos.
En una realización, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición utilizada en la invención tiene un grado de polimerización de al menos 2.
En una realización, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición utilizada en la invención tiene un grado de polimerización de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. Por consiguiente, en una realización, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición es un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero, un nonámero, un decámero o más. En una realización particular, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición es un dímero.
Según una realización de la invención, la composición comprende dímero de ácido ferúlico (también llamado ácido diferúlico o diferulato). En una realización, la composición no comprende ácido ferúlico.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende una mezcla de oligómeros derivados del ácido hidroxicinámico que tienen diferentes grados de polimerización.
Como ejemplo, sin limitación, la composición puede comprender una mezcla de dímeros, trímeros, tetrámeros, hexámeros y más de ácido ferúlico.
El ácido cinámico y sus derivados, en particular el ácido ferúlico, son productos naturales abundantes en las plantas. Por ejemplo, la concentración en plantas de ácido ferúlico monomérico es de dos a cuatro veces mayor que la concentración total de oligómeros diferúlicos (Phytochemistry. 2014, 102:126-136). Además, se sabe que los oligómeros de ácido cinámico y sus derivados son naturalmente mucho menos abundantes, lo que significa que las paredes celulares de las plantas contienen una gran mayoría de compuestos monoméricos en comparación con otras formas como dímeros o trímeros.
Por lo tanto, en una realización, la composición divulgada ácido en la presente memoria, pero que no forma parte de la invención, comprende como máximo el 10 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto al total de oligómeros derivados de hidroxicinámico de la composición.
En una realización, la composición divulgada en la presente memoria, pero que no forma parte de la invención, comprende como máximo aproximadamente el 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 % o 4 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto al total de oligómeros derivados de hidroxicinámico de la composición.
En una realización preferida, la composición utilizada en la invención comprende como máximo el 3 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto al total de oligómeros derivados de hidroxicinámico de la composición, preferiblemente como máximo el 2 %, más preferiblemente como máximo el 1 %. En una realización más preferida, la composición utilizada en la invención comprende como máximo aproximadamente el 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o 0,1 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto al total de oligómeros derivados de hidroxicinámico de la composición.
En una realización aún más preferida, la composición utilizada en la invención comprende de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,5 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto al total de oligómeros derivados de hidroxicinámico de la composición, preferiblemente de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,3 %, más preferiblemente de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,1 %, incluso más preferiblemente de aproximadamente el 0,07 % a aproximadamente el 0,09 %.
En una realización, la composición divulgada en la presente memoria, pero que no forma parte de la invención, comprende como máximo el 10 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición.
En una realización, la composición divulgada en la presente memoria, pero que no forma parte de la invención, comprende como máximo aproximadamente el 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 % o 4 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición.
En una realización preferida, la composición utilizada en la invención comprende como máximo el 3 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición, preferiblemente como máximo el 2 %, más preferiblemente como máximo el 1 %.
En una realización más preferida, la composición utilizada en la invención comprende como máximo aproximadamente el 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o 0,1 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto al total de componentes de la composición.
En una realización aún más preferida, la composición utilizada en la invención comprende de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,5% de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición, preferiblemente de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,3 %, más preferiblemente de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,1 %, incluso más preferiblemente de aproximadamente el 0,07 % a aproximadamente el 0,09 %.
En una realización particular, la composición utilizada en la invención no comprende sustancialmente ningún monómero derivado del ácido hidroxicinámico.
En una realización, la composición utilizada en la invención no comprende monómero derivado del ácido hidroxicinámico. Por consiguiente, en una realización particular, la composición utilizada en la invención no comprende ácido ferúlico, ácido cumárico, ácido cafeico o ácido sinapínico.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende al menos el 30 % de oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición.
En una realización preferida, la composición comprende al menos el 35 % de oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición, preferiblemente al menos el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o 65 %.
En otra realización, la composición comprende al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de oligómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición.
En una realización preferida, la composición comprende al menos el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de oligómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico y al menos un monómero derivado del ácido hidroxicinámico, en donde la relación entre el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico y el al menos un monómero derivado del ácido hidroxicinámico es al menos de 2. En otras palabras, en una realización, la composición comprende al menos el doble de oligómero derivado del ácido hidroxicinámico que de monómero derivado del ácido hidroxicinámico.
En una realización particular, la relación entre el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico y el al menos un monómero derivado del ácido hidroxicinámico es al menos de 5 o 10. En una realización, la relación entre el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico y el al menos un monómero derivado del ácido hidroxicinámico es al menos de 15, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32 o más
En una realización, la relación oligómero derivado del ácido hidroxicinámico:monómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición utilizada en la invención es al menos 30:1, preferiblemente al menos 31:1, más preferiblemente al menos 32:1. En una realización, la relación oligómero derivado del ácido hidroxicinámico:monómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición de la invención es de aproximadamente 30:1, aproximadamente 31:1 o 32:1.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende al menos el 30 % de dímero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto al total de oligómeros derivados del ácido hidroxicinámico de la composición, preferiblemente al menos el 35 %, más preferiblemente al menos el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o 65 %.
En otra realización, la composición comprende al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de dímero derivado de ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros derivados de hidroxicinámico totales de la composición.
En una realización preferida, la composición comprende al menos el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de dímero derivado de ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros derivados de hidroxicinámico totales de la composición.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende al menos el 30 % de dímero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición.
En una realización preferida, la composición comprende al menos el 35 % de dímero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición, preferiblemente al menos el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o 65 %.
En otra realización, la composición comprende al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de dímero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición.
En una realización preferida, la composición comprende al menos el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de dímero derivado de ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende como máximo aproximadamente el 3 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición, y al menos el 70 % de oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente dímero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición.
En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende como máximo aproximadamente el 1 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición, y al menos el 75 % de oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente dímero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición.
En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,5 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición, preferiblemente de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,3 %, más preferiblemente de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,1 %, aún más preferiblemente de aproximadamente el 0,07 % a aproximadamente el 0,09 %; y al menos el 80 % de oligómero derivado de ácido hidroxicinámico, preferiblemente dímero derivado de ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición, preferiblemente al menos el 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % o más.
En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende de aproximadamente el 0,07 % a aproximadamente el 0,09 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición; y al menos el 80 % de dímero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los componentes totales de la composición, preferiblemente al menos el 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % o más.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende como máximo aproximadamente el 3 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros derivados de hidroxicinámico totales de la composición, y al menos el 70 % de dímero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros derivados de hidroxicinámico totales de la composición.
En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende como máximo aproximadamente el 1 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros derivados de hidroxicinámico totales de la composición, y al menos el 75% de dímero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros derivados de hidroxicinámico totales de la composición.
En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,5 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros derivados de hidroxicinámico totales de la composición, preferiblemente de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,3 %, más preferiblemente de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,1 %, aún más preferiblemente de aproximadamente el 0,07 % a aproximadamente el 0,09 %; y al menos el 80 % de dímero derivado de ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros derivados de hidroxicinámico totales de la composición, preferiblemente al menos el 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % o más.
En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende de aproximadamente el 0,07 % a aproximadamente el 0,09 % de monómero derivado del ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros derivados de hidroxicinámico totales de la composición; y al menos el 80 % de dímero derivado de ácido hidroxicinámico expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros derivados de hidroxicinámico totales de la composición, preferiblemente al menos el 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % o más.
En una realización, la composición utilizada en la invención es una composición acuosa.
La concentración efectiva del oligómero derivado del ácido hidroxicinámico en la composición utilizada en la invención variará dependiendo del tipo de oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, los cultivos que se tratan, la gravedad del estrés (p. ej., sequía), el resultado deseado y la etapa de vida de los cultivos de plantas, entre otros factores.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende de 0,0001 a 200 ppm (partes por millón) del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente de 0,001 a 100 ppm, más preferiblemente de 0,005 a 50 ppm.
En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende de 1 a 200 ppm del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente de 5 a 100 ppm, más preferiblemente de 10 a 50 ppm. En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende aproximadamente 15 o 16 ppm del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico. En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende aproximadamente 50 ppm del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico.
En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende de 0,0001 a 10 ppm del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente de 0,001 a 5 ppm, más preferiblemente de 0,005 a 2,5 ppm.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende de 0,0001 a 200 mg/L del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente de 0,001 a 100 mg/L, más preferiblemente de 0,005 a 50 mg/L. En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende de 1 a 200 mg/L del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente de 5 a 100 mg/L, más preferiblemente de 10 a 50 mg/L. En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende aproximadamente 15 o 16 mg/L del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico. En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende aproximadamente 50 mg/L del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico. En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende de 0,0001 a 10 mg/L del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente de 0,001 a 5 mg/L, más preferiblemente de 0,005 a 2,5 mg/L.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende de 1.10-8 a 2.10-2 % del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente de 1.10-7 a 1.10-2 %, más preferiblemente de 5.10-7 a 5.10-3 % En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende de 1.10-4 a 2.10-2 % del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje en peso con respecto al peso total de la composición, preferiblemente de 5.10-4 a 1.10-2 %, más preferiblemente de 1.10-3 a 5.10-3 % En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende aproximadamente 1,5.10-3 o 1,6.10-3 % del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje en peso con respecto al peso total de la composición. En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende aproximadamente 5.10-3 % del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje en peso con respecto al peso total de la composición. En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende de 1.10-8 a 1.10-3 % del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje en peso con respecto al peso total de la composición, preferiblemente de 1.10-7 a 5.10-4 %, más preferiblemente de 5.10-7 a 2,5.10-4 %.
La composición utilizada en la invención puede comprender además un coformulante seleccionado del grupo que comprende: agentes diluyentes, agentes tamponadores, tensioactivos (agentes dispersantes, agentes antiespumantes o desespumantes, esparcidores, adyuvantes de deposición, potenciadores de la penetración o humectantes), agentes anticongelantes (urea, etilenglicol, propilenglicol o glicerol), agentes conservantes (sorbato potásico, parabeno y sus derivados, 1,2-bencisotiazol-3(2H)-ona o aceites esenciales), agentes absorbentes (incluyendo tallos de maíz o aserrín), espesantes (incluyendo arcillas o goma xantana), agentes adhesivos (incluyendo látex, silicona o alquilo alcoxilado), adyuvante para la protección de cultivos o una mezcla de los mismos.
Según una realización, la composición utilizada en la invención comprende además un agente diluyente. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "agente diluyente" significa una solución acuosa o no acuosa que se usa para diluir el al menos un oligómero derivado de hidroxicinámico de la composición. Los ejemplos de agentes diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite y similares.
Según una realización, la composición utilizada en la invención comprende además un agente tamponador. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "agente tamponador" significa una solución acuosa que comprende una mezcla de ácidos y bases que se usa para estabilizar el pH de la composición. Los ejemplos de agentes tamponadores incluyen, pero no se limitan a, TRIS, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, tartrato, carcodilato, etanolamina, glicina, imidazol y similares.
En una realización, la composición utilizada en la invención tiene un pH ácido. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "pH ácido" significa un valor de pH inferior o igual a 7. En una realización, la composición de la invención tiene un pH inferior o igual a 6. En una realización particular, la composición utilizada en la invención tiene un pH de aproximadamente 5,5.
Según una realización, la composición utilizada en la invención comprende además un ácido orgánico. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "ácido orgánico" significa un compuesto orgánico con propiedades ácidas. Preferiblemente, el ácido orgánico es un ácido carboxílico. Los ejemplos de ácidos orgánicos incluyen, pero no se limitan a, ácido láctico, ácido succínico, ácido málico y ácido cítrico. En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende ácido láctico.
La invención también se refiere al uso de una composición como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, que comprende además al menos un agente solubilizante, preferiblemente un agente solubilizante en agua.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "agente solubilizante en agua" significa un compuesto que hace soluble o más soluble al el menos un oligómero derivado de hidroxicinámico de la invención en agua.
En una realización, el agente solubilizante, preferiblemente el agente solubilizante en agua, se selecciona del grupo que comprende biopolímero, polisacáridos y polioles cargados positiva o negativamente. En una realización preferida, el agente solubilizante, preferiblemente el agente solubilizante en agua, es un polisacárido o un polisacárido sulfatado. En una realización, el polisacárido o polisacárido sulfatado es catiónico.
En una realización, el agente solubilizante, preferiblemente el agente solubilizante en agua, es un polisacárido seleccionado del grupo que comprende quitosano, quitina, quitina-glucano, carboximetilcelulosa, pectina, hemicelulosa. En una realización particular, el agente solubilizante, preferiblemente el agente solubilizante en agua, es quitosano o quitina-glucano. En una realización, el agente solubilizante, preferiblemente el agente solubilizante en agua, es un poliol seleccionado del grupo que comprende manitol y sorbitol.
Según una realización de la invención, la composición comprende ácido diferúlico (diferulato) y un polisacárido, preferiblemente un polisacárido catiónico. Según una realización preferida de la invención, la composición comprende ácido diferúlico (diferulato) y quitosano.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende del 0,01 al 10 % del al menos un agente solubilizante, expresado en porcentaje en peso con respecto al peso total de la composición, preferiblemente del 0,05 al 5 %, más preferiblemente del 0,1 al 2 %. En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende aproximadamente el 0,4 % del al menos un agente solubilizante. En otra realización particular, la composición utilizada en la invención comprende aproximadamente el 0,5 % del al menos un agente solubilizante.
En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende de 100 a 100.000 ppm del al menos un agente solubilizante, preferiblemente de 500 a 50.000 ppm, más preferiblemente de 1.000 a 20.000 ppm. En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende aproximadamente 4.000 ppm del al menos un agente solubilizante. En otra realización particular, la composición utilizada en la invención comprende aproximadamente 5.000 ppm del al menos un agente solubilizante.
En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende de 1.10-6 a 2.10-3 % del al menos un agente solubilizante, preferiblemente de 5.10-6 a 1.10-3 %, más preferiblemente de 1.10-5 a 5.10-4 % En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende de 5.10-5 a 2,5.10-4 % del al menos un agente solubilizante.
En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende de 0,01 a 20 ppm del al menos un agente solubilizante, preferiblemente de 0,05 a 10 ppm, más preferiblemente de 0,1 a 5 ppm. En una realización particular, la composición utilizada en la invención comprende de 0,5 a 2,5 ppm del al menos un agente solubilizante. Según una realización, los oligómeros derivados del ácido hidroxicinámico de la invención se preparan "in situ" mediante polimerización catalizada por enzimas del oligómero derivado del ácido hidroxicinámico en presencia de un agente solubilizante como se describe anteriormente en la presente memoria. En este caso, el agente solubilizante actúa también como molde que controla la reacción de polimerización. En una realización particular, el agente solubilizante que actúa como molde de polimerización es el quitosano y la enzima es lacasa.
Según una realización, la composición utilizada en la invención puede comprender además cualquier agente bioestimulante, regulador del crecimiento vegetal o productos que contienen hormonas conocidos en la técnica para mejorar la tolerancia al estrés de una planta como, por ejemplo, ácidos húmicos, ácidos fúlvicos, fucoidan, antitranspirantes, oligosacáridos y similares.
Esta invención se refiere además al uso de una composición para mejorar la tolerancia de las plantas en condiciones ambientales adversas que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico como se refleja en las reivindicaciones. En una realización, la condición ambiental adversa también se denomina estrés.
El estrés por el cual la composición utilizada en la invención mejora la tolerancia de las plantas es un estrés abiótico.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "tolerancia" puede ser reemplazado por resistencia o defensa, protección, apoyo, fuerza, tenacidad, resistencia, vigor, resiliencia, lucha y similares.
Según una realización, el estrés abiótico puede ser estrés hídrico, sequía, estrés osmótico, estrés térmico, deficiencia de nutrientes y estrés químico generado por contaminantes metálicos u orgánicos en el suelo para cultivar dicha planta. En una realización preferida, el estrés abiótico se selecciona del grupo que comprende estrés hídrico, sequía y estrés osmótico. La tolerancia a la sequía (resistencia a la sequía) es un concepto general, según los diferentes tipos de reacciones que incluyen la resistencia a la sequía (evitación de la deshidratación), la tolerancia a la sequía y la recuperación (recuperación de la sequía). Aquí el concepto también se extiende a la lluvia errática y la falta temporal de agua (por ejemplo, relacionada con la modificación del medio ambiente por el calentamiento global).
En una realización, la composición que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico es para mejorar la tolerancia de una planta al estrés hídrico. En otra realización, la composición que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico es para mejorar la tolerancia de una planta a la sequía. En otra realización, la composición que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico es para mejorar la tolerancia de una planta al estrés osmótico.
En una realización, la composición para mejorar la tolerancia de una planta al estrés hídrico comprende diferulato. En otra realización, la composición para mejorar la tolerancia de una planta a la sequía comprende diferulato. En otra realización, la composición para mejorar la tolerancia de una planta al estrés osmótico comprende diferulato.
Según otra realización, en la presente memoria se divulga, pero que no forma parte de la invención, que el estrés biótico puede deberse a bacterias, virus, hongos, parásitos, insectos beneficiosos, insectos dañinos, malas hierbas, plantas cultivadas o plantas nativas.
En una realización, el al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico de la composición utilizada en la invención no se utiliza como antioxidante.
En una realización, la planta tratada en el uso de la invención es una planta monocotiledónea. En otra realización, la planta es una planta dicotiledónea.
En una realización, la planta tratada en el uso de la invención se selecciona del grupo que comprende algodón, lino, vid, frutas, hortalizas, cultivos hortícolas y forestales importantes, tales como: Rosaceae sp., Ribesioidae sp., Juglandaceae sp., Betulaceae sp., Anacardiaceae sp., Fagaceae sp., Moraceae sp., Oleaceae sp., Actinidaceae sp., Lauraceae sp., Musaceae sp., Rubiaceae sp., Theaceae sp., Sterculiceae sp., Rutaceae sp., Solanaceae sp., Vitaceae sp. Liliaceae sp., Asteraceae sp., Umbelliferae sp., Cruciferae sp., Chenopodiaceae sp., Cucurbitaceae sp., Papilionaceae sp., tales como Graminae sp., Fabacae sp., así como homólogos modificados genéticamente de estos cultivos.
En una realización, la planta es un cultivo alimentario seleccionado del grupo que comprende trigo, arroz, maíz, soja, patata, cebada, avena, judías rojas y mijo. En otra realización, la planta es un cultivo vegetal seleccionado del grupo que comprende tomate, rábano, berro, pepino, repollo, sandía, melón, repollo, col china, cebollín, cebolla, zanahoria, calabacín y Arabidopsis thaliana. En otra realización, la planta es un cultivo de frutas seleccionado del grupo que comprende manzana, pera, dátil, melocotón, kiwi, uva, naranja, caqui, ciruela, albaricoque, plátano y mandarina. En otra realización, la planta es un cultivo especial seleccionado del grupo que comprende mostaza, ginseng, tabaco, algodón, sésamo, caña de azúcar, remolacha azucarera, cacahuete y colza. En otra realización, la planta es un cultivo de flores seleccionado del grupo que comprende rosa, gerbera, gladiolo, clavel, crisantemo, lirio y tulipán. En otra realización, la planta es un cultivo de alimentación seleccionado del grupo que comprende hierba de centeno, trébol rojo, hierba de huerto, alfalfa y festuca alta.
En una realización, la planta se selecciona del grupo que comprende tomate, rábano, trigo, berro, mostaza, soja y Arabidopsis thaliana. En una realización particular, la planta es tomate. En otra realización, la planta es rábano. En otra realización, la planta es trigo. En otra realización, la planta es berro. En otra realización, la planta es mostaza. En otra realización, la planta es soja. En otra realización, la planta es Arabidopsis thaliana.
Otro objeto de la invención es el uso de una composición que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico según se reivindica para mejorar la tolerancia al estrés de una planta frente al estrés abiótico. En las siguientes realizaciones, la composición divulgada en la presente memoria, pero que no forma parte de la invención, se usa como bioestimulante para mejorar la tolerancia al estrés de una planta. En una realización, la composición es una composición bioestimulante para mejorar la tolerancia al estrés de una planta. En una realización, la composición se usa como biopesticida para mejorar la tolerancia al estrés de una planta. En una realización, la composición es una composición biopesticida para mejorar la tolerancia al estrés de una planta.
La composición utilizada en la invención se puede preparar como una formulación tal como, por ejemplo, emulsión, aceite, hidrato, polvo, gránulo, tableta, aerosol, suspensión y similares. En una realización, si es necesario, se puede incorporar a la formulación un agente emulsionante, un agente de suspensión, un agente de extensión, un agente de penetración, un agente humectante, un agente espesante y/o un estabilizador. En una realización, la formulación utilizada en la invención se puede preparar según un método conocido en la técnica.
Según una realización, la composición o formulación utilizada en la invención se puede aplicar a las plantas por diversos medios, que incluyen, pero no se limitan a, rociadores, aspersores, goteros, inmersiones, inundaciones, irrigación y aceites.
Según una realización, la composición o formulación utilizada en la invención se aplica en forma líquida. Los ejemplos de formas líquidas incluyen, pero n se limitan a, rociadores foliares, rociadores de césped, rociadores en surcos, inmersiones de plántulas, inundaciones de plántulas, inmersiones de raíces, inundaciones de raíces, inundaciones de tallos, inundaciones de tubérculos, inundaciones de frutas, inundaciones de suelo, inmersiones de suelo e inyecciones de suelo.
Según otra realización, la composición o formulación utilizada en la invención se aplica en forma seca. Los ejemplos de formas secas incluyen, pero no se limitan a, gránulos, microgránulos, polvos, bolitas, barras, escamas, cristales y migajas.
En una realización, la composición utilizada en la invención está adaptada para ser aplicada sobre la planta. En una realización particular, la composición utilizada en la invención está adaptada para ser pulverizada sobre la planta. En otra realización, la composición utilizada en la invención está adaptada para recubrir partes de la planta. En una realización particular, la composición utilizada en la invención es una composición de recubrimiento, preferiblemente una composición de recubrimiento de semillas.
En una realización, la composición utilizada en la invención se aplicará sobre la planta. En una realización, la composición se puede aplicar sobre partes aéreas de la planta, como por ejemplo hojas y tallos. En otra realización, la composición se puede aplicar sobre partes subterráneas de la planta, como por ejemplo sobre las raíces. En otra realización, la composición se puede aplicar sobre semillas.
En una realización, la composición utilizada en la invención se va a recubrir sobre la planta antes de plantarla. En una realización, la composición se utiliza para recubrir semillas de plantas antes de plantarlas.
En una realización, la composición utilizada en la invención se puede aplicar pura o diluida.
En una realización, la concentración de la composición utilizada en la invención depende de su aplicación. En una realización, la composición utilizada en la invención está menos concentrada cuando la composición está adaptada para ser pulverizada sobre la planta que cuando la composición es una composición de recubrimiento, preferiblemente una composición de recubrimiento de semillas. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "menos concentrada" significa que cuando la composición se adapta para ser pulverizada sobre la planta, la composición es al menos 2 veces menos concentrada que cuando la composición es una composición de recubrimiento, en particular una composición de recubrimiento de semillas, preferiblemente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces menos concentrada.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende de 0,0001 a 10 ppm del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente de 0,001 a 5 ppm, más preferiblemente de 0,005 a 2,5 ppm, cuando la composición está adaptada para ser pulverizada sobre la planta. En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende de 1 a 200 ppm del al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente de 5 a 100 ppm, más preferiblemente de 10 a 50 ppm, cuando la composición es una composición de recubrimiento, preferiblemente una composición de recubrimiento de semillas.
En una realización, la composición utilizada en la invención comprende de 0,01 a 20 ppm del al menos un agente solubilizante, preferiblemente de 0,05 a 10 ppm, preferiblemente de 0,1 a 5 ppm, más preferiblemente de 0,5 a 2,5 ppm, cuando la composición está adaptada para ser pulverizada sobre la planta. En otra realización, la composición utilizada en la invención comprende del 0,01 al 10 % del al menos un agente solubilizante, expresado en porcentaje en peso con respecto al peso total de la composición, preferiblemente del 0,05 al 5 %, más preferiblemente del 0,1 al 2 %, cuando la composición es una composición de recubrimiento, preferiblemente una composición de recubrimiento de semillas.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, un aparato para atomizar la composición utilizada en la invención en condiciones de dispersión adecuadas para pulverizar sobre una planta. En una realización, el aparato es un espray que comprende una composición utilizada en la invención como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. En una realización, el espray puede ser un espray de aerosol. Tal y como se usa en la presente memoria, un espray de aerosol es un espray que se usa con un recipiente que puede contener un líquido bajo presión como, por ejemplo, una lata, una botella o un tanque.
En una realización, el espray puede usarse manualmente. Los ejemplos de espray que se usan manualmente incluyen, pero no se limitan a, botellas con un espray de bomba manual y un espray con extremo de manguera. En otra realización, el espray puede usarse mecánicamente. Los ejemplos de espray usado mecánicamente incluyen, pero no se limitan a, espray de cultivos en hileras autopropulsado.
En una realización, el espray utilizado en la invención es un espray foliar. En una realización, la composición utilizada en la invención es una composición en espray.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, una semilla de planta recubierta con una composición utilizada en la invención como se describe anteriormente en la presente memoria. La divulgación abarca semillas de plantas descritas anteriormente en la presente memoria que tienen una tolerancia mejorada al estrés.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para mejorar la tolerancia al estrés de una planta que comprende aplicar una composición como se describe anteriormente en la presente memoria sobre la planta.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para mejorar la tolerancia al estrés de una planta que comprende aplicar sobre la planta una composición que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico, preferiblemente ácido diferúlico.
En una realización, el método comprende aplicar una composición que comprende al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico y al menos un agente solubilizante, preferiblemente quitosano, sobre la planta.
En una realización, el método comprende aplicar la composición utilizada en la invención sobre la planta. En una realización, la composición se aplica sobre las partes aéreas de la planta, preferiblemente hojas y/o tallos. En otra realización, la composición se aplica sobre partes subterráneas de la planta, preferiblemente raíces. En otra realización, el método comprende recubrir las semillas de la planta antes de plantarlas.
Según una realización, la planta puede tratarse adicionalmente para la tolerancia al estrés mediante cualquier método conocido en la técnica.
Otro objeto divulgado en la presente memoria, pero que no forma parte de la invención, es un método para promover el crecimiento de las plantas que comprende aplicar una composición según la invención sobre dicha planta.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, un método que induce la actividad de fenilalanina-amoníaco liasa (PAL) y/o producción de peróxido (H2O2) que comprende aplicar una composición utilizada en la invención sobre dicha planta. PAL es una enzima crucial con actividad reguladora en la ruta de los fenilpropanoides que se ocupa de los precursores de los metabolitos secundarios en las plantas y, por lo tanto, desempeña un papel clave en una variedad de interacciones planta-patógeno (Morrison y Buxton, Crop Sci. 1993, 33:1264-1268). El H2O2 se produce en uno o más estallidos de actividad oxidativa durante la expresión de la resistencia en una amplia gama de interacciones planta huésped/patógeno y se han implicado en la estimulación de la respuesta de hipersensibilidad, un mecanismo utilizado para prevenir la propagación de infecciones por patógenos microbianos (Apel y Hirt, Annu Rev Plant Biol. 2004, 55:373-399). Por lo tanto, el aumento de la actividad PAL y de la producción de H2O2 juegan ambos un papel significativo en la resistencia de las plantas al estrés biótico.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para modular el contenido de Prolina (Pro) de una planta que comprende aplicar una composición según la invención sobre dicha planta. La acumulación de prolina es una respuesta fisiológica común en muchas plantas en respuesta a una amplia gama de estreses. Se cree que la acumulación de prolina juega un papel adaptativo en la tolerancia al estrés de las plantas, los enfoques transgénicos han confirmado el efecto beneficioso de la sobreproducción de prolina durante el estrés. Además, también se cree que el equilibrio entre la biosíntesis y la degradación de Pro es esencial en la determinación de las funciones osmoprotectoras y de desarrollo de la prolina (Verbruggen y Hermans, Amino Acids. 2008, 35:753-759). Por lo tanto, la modulación del contenido de prolina de una planta puede mejorar la resistencia de la planta a una amplia variedad de estreses, ya sean bióticos o abióticos.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para aumentar el contenido de agua de una planta, preferiblemente después de un período de sequía, que comprende aplicar una composición utilizada en la invención sobre dicha planta.
En la presente memoria se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para aumentar la tasa de recuperación de una planta después de volver a regarla, como por ejemplo después de una sequía episódica o una lluvia después de un período prolongado de sequía, que comprende aplicar una composición utilizada en la invención sobre dicha planta.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un cromatograma de HPLC de la solución de oligoferulatos obtenida por reacción enzimática usando lacasa.
La Figura 2 es un gráfico que muestra la cantidad de prolina en hojas de tomate después de 24 horas de una aplicación foliar de oligoferulatos a diferentes concentraciones. Se informan los valores de la media /-SE (n=3).
La Figura 3 es un gráfico que muestra el porcentaje de germinación de semillas de rábano, 72 horas después de un tratamiento con oligoferulatos durante 30 minutos (3 repeticiones, 20 semillas por repetición). Se informan los valores de la media /- SE (n=3).
La Figura 4 es un gráfico que muestra el peso fresco de plántulas de rábano después de 72 horas de germinación de semillas tratadas con oligoferulatos durante 30 minutos (3 repeticiones, 20 semillas por repetición). Se informan los valores de la media /- SE (n=3).
La Figura 5 es un gráfico que muestra el porcentaje de germinación de semillas de rábano, 4 días después de un tratamiento con una solución de oligoferulatos 0,05 mM, una solución de quitosano al 0,1 % o una solución que comprende oligoferulatos 0,05 mM y quitosano al 0,1 % (solución denominada en adelante "composición de oligoferulatos") seguido de dispersión en placas que contienen 50 mL de manitol 125 mM con el fin de simular condiciones de estrés osmótico.
La Figura 6 es una fotografía que muestra plantas de control (izquierda) y de trigo tratadas con una composición de oligoferulatos (tratadas, derecha) después de siete días bajo estrés por sequía simulado (A) y un día después de volver a regar (B).
La Figura 7 es un histograma que muestra el control de peso fresco y las plántulas de trigo tratadas con una composición de oligoferulatos (tratadas) siete días bajo estrés por sequía simulado seguido de un día de volver a regar. Se informan los valores de la media /- SE (n=3). Las pruebas de ANOVA indican diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre las plantas tratadas con una composición de oligoferulatos y una solución de control.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la curva dosis-respuesta de la actividad de PAL en suspensiones celulares de Arabidopsis thaliana 24 h después de la aplicación de una composición que comprende oligoferulatos. Los datos se expresaron como la respuesta de cada muestra dividida por la respuesta inducida por un tratamiento de control (agua) en ese experimento (control R/R).
La Figura 9 es un gráfico que muestra la curva dosis-respuesta de la acumulación de H2O2 en suspensiones celulares de Arabidopsis thaliana 24 h después de la aplicación de una composición que comprende oligoferulatos.
La Figura 10 es un histograma que muestra la cantidad de prolina en hojas de tomate después de 24 horas de una aplicación foliar de las diferentes formulaciones. Se informan los valores de la media /- SE (n=3). Las pruebas de ANOVA indican diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre las plantas tratadas con la formulación y la solución de control que contiene Tween 80.
La Figura 11 es un gráfico que muestra la dinámica del contenido de prolina en hojas de trigo después de la pulverización foliar de una formulación de oligoferulatos.
Ejemplos
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. En ningún caso el alcance de la presente invención está limitado por estos ejemplos.
Ejemplo 1: Preparación de oligómeros de ácido ferúlico utilizando una lacasa como enzima
Se añadió una solución de ácido ferúlico 5 mM en metanol (50 mL) a 180 mL de acetato de etilo. Después de mezclar, se añadieron 200 mL de solución de lacasa 1 U/mL (Sigma-38429, Lacasa de Trametes versicolor) en tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5,0), y se llevó a cabo la reacción a 25 °C durante 24 horas mediante agitación en un agitador orbital a 150 rpm. Al terminar la reacción, la fase orgánica se separó utilizando un embudo de separación y la fase acuosa se lavó dos veces con acetato de etilo. Todos los extractos de acetato de etilo se evaporaron a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
Análisis por HPLC
El análisis por RP-HPLC se llevó a cabo usando una columna Waters Symmetry C-18 (46 x 250 mm) en un módulo de separación Waters Alliance 2695 acoplado con un detector UV Waters a 320 nm. La fase móvil consistió en una mezcla de acetonitrilo/ácido acético al 1 % (30:70) y el caudal fue de 1 mL/min y la separación se llevó a cabo a temperatura ambiente. Antes de la inyección, las muestras se filtraron a través de filtros Sartorious (0,45 gm).
El cromatograma de HPLC de la muestra, muestra un pico de ácido ferúlico (FA) muy pequeño en comparación con los picos correspondientes a los oligoferulatos (oligoFA) (Figura 1).
Para fines cuantitativos, se prepararon soluciones estándar de ácido ferúlico (W518301 Aldrich) a diferentes concentraciones usando metanol como disolvente y se inyectaron por triplicado, se midieron las respuestas del detector para construir la curva de calibración. Se obtuvo una buena relación lineal cuando se trazó un gráfico para la concentración frente al área del pico de ácido ferúlico (en el tiempo de retención = 4 min) con un coeficiente de correlación r2=0,9991 en el rango de concentración de 0,005 a 0,1 mg/L. La ecuación de la ecuación de regresión lineal fue y=2E+08x-113942.
Asumiendo un factor de respuesta similar para los oligoferulatos detectados (oligoFA) y el ácido ferúlico monomérico (FA), la relación de oligoferulatos:ácido ferúlico en el producto de reacción es de 32:1. Sin embargo, el factor de respuesta para los oligoferulatos normalmente debería ser más bajo que el factor de respuesta para el ácido ferúlico. Por lo tanto, la relación oligoferulatos:ácido ferúlico en el producto de reacción debería ser incluso superior a 32:1.
Análisis por espectrometría de masas
Con el fin de determinar con precisión el peso molecular de los oligoferulatos obtenidos, se llevó a cabo un análisis por espectrometría de masas de la siguiente manera: se dejó caer 1 gL de la solución de muestra sobre el objetivo del espectrómetro y después del secado, 1 gL de una solución matriz DHB/CH3CN se puso en el lugar de la muestra y, después del secado, los espectros se registraron en un espectrómetro de masas Bruker Ultraflex (Bruker Daltonik, Bremen, Alemania) en el modo reflector usando calibración externa y trabajando en el modo de iones positivos. La composición de los oligoferulatos obtenidos se presenta en la Tabla 1.
Tabla 1: Composición iónica asignada de espectros MALDI-TOF-MS de oligoferulatos obtenidos por reacción enzimática usando lacasa
Figure imgf000014_0001
*m/z representa la masa dividida por el número de carga de iones.
Ejemplo 2: Preparación de oligómeros de ácido ferúlico utilizando una peroxidasa como enzima
Se añadió una solución de ácido ferúlico 50 mM en metanol (200 mL) a una mezcla de 400 mL de metanol, 80 mL de peróxido de hidrógeno al 0,3 % y 600 mL de tampón fosfato 50 mM (pH 7,0). Después de mezclar, se añadieron 10 mL de solución de peroxidasa de rábano picante al 1 % (245,7 U/mg, AMRESCO INC) en tampón fosfato 50 mM (pH 7,0) y se llevó a cabo la reacción a 25 °C durante 24 horas mediante agitación en un agitador orbital a 150 rpm. Al terminar la reacción, la mezcla de reacción se filtró y el precipitado se lavó dos veces con metanol. El filtrado de metanol y la fase soluble de la reacción se evaporaron a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
Los productos de reacción se volvieron a disolver en metanol y se realizó un análisis por TLC en placas de gel de sílice (MERCK 60. GF-254) utilizando benceno:dioxano:ácido acético (25:7:1, v/v/v) como fase móvil. Además, se llevó a cabo un análisis por RP-HPLC usando una columna Waters Symmetry C-18 (46 x 250 mm) en un módulo de separación Waters Alliance 2695 acoplado con un detector de UV Waters a 320 nm. La fase móvil consistió en una mezcla de acetonitrilo:ácido acético al 1% (30:70) y el caudal fue de 1 mL/min. Antes de la inyección, las muestras se filtraron a través de filtros Sartorious (0,45 gm).
Ejemplo 3: La pulverización foliar de oligómeros de diferulato aumenta el contenido de prolina en las plantas de tomate en un patrón de respuesta a la dosis (no forma parte de la invención)
Materiales y métodos
Se cultivaron plantas de tomate de la variedad "moneymaker" durante 3 semanas en suelo bajo condiciones controladas (régimen de luz/oscuridad de 16 h/8 h respectivamente, a 24 °C). Las formulaciones que contenían diferulato a concentraciones crecientes y Tween 80 (Polisorbato 80) al 0,01 % como emulsionante se rociaron sobre las hojas de tomate hasta que escurrieron. Como control se utilizó una solución de Tween 80 al 0,01 %. Después de 24 horas, las hojas verdaderas de las plantas tratadas por pulverización se recogieron y se trituraron en nitrógeno líquido.
La prolina (Pro) se estimó en hojas de tomate según Bates et al. (Plant and Soil. 1973, 39:205-207) basado en la reacción de prolina con ninhidrina. Se homogeneizaron muestras de hojas frescas de 500 mg en 5 mL de ácido sulfosalicílico acuoso al 3 % y se centrifugaron a 22.000 g durante 5 min. El sobrenadante se filtró a través de filtros Sartorious (0,45 gm). A 1 mL del filtrado se le añadió 1 mL de reactivo de ninhidrina (2,5 g de ninhidrina/100 mL de una solución que contenía ácido acético glacial, agua destilada y ácido ortofosfórico al 85 % en una relación de 6:3:1) y se hirvió en baño de agua a 100 °C durante 1 h. Las lecturas se tomaron inmediatamente a una longitud de onda de 546 nm. La concentración de prolina se determinó a partir de una curva estándar usando prolina (sigma) y se calculó sobre la base del peso fresco (mmol de prolina. g FW-1).
Resultados
Los resultados presentados en la Figura 2 muestran que, a baja concentración, los oligómeros de diferulato permiten el control del contenido de Pro en la planta y que sigue una correlación lineal positiva en relación con las dosis aplicadas (dosis-respuesta).
Las pruebas de ANOVA indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre las plantas tratadas con la formulación y la solución de control que contiene Tween 80.
Dado que se sabe que la acumulación de prolina en las plantas tiene funciones osmoprotectoras y antioxidantes, los resultados muestran que los oligómeros de diferulato mejoran la osmoprotección y la protección contra el daño oxidativo de la planta.
Ejemplo 4: El tratamiento de semillas de rábano con oligoferulatos aumenta la tasa de germinación y el crecimiento de las plántulas (no forma parte de la invención)
Materiales y métodos
Las semillas de rábano (Raphanus sativus) de la variedad Ronde rode se incubaron durante 30 min en una solución de 15 ppm de oligoferulatos o agua (Control). La prueba se repitió 3 veces para cada tratamiento, 20 semillas por repetición. Luego, las semillas se secaron y se colocaron en una incubadora a 30 °C para una germinación óptima en agua, sin estrés. Después de 3 días, se contaron las semillas germinadas y se recolectaron y pesaron las plántulas de rábano.
Resultados
Los resultados muestran que las semillas de rábano tratadas con oligoferulatos tienen un porcentaje de germinación aproximadamente un 15 % más alto que en el control donde las semillas se incubaron con agua (62 % de germinación para el control, 77 % para las semillas tratadas con oligoferulatos; Figura 3). De manera similar, las plántulas de rábano de semillas tratadas con oligoferulatos presentan un crecimiento más rápido de aproximadamente el 14 % en comparación con las semillas no tratadas (0,49 g de peso fresco para el control, 0,56 g para las semillas tratadas con oligoferulatos; Figura 4).
Estos resultados muestran que los oligoferulatos son capaces de modificar el comportamiento de la planta, incluso en condiciones no estresadas.
Ejemplo 5: Tratamiento de semillas de rábano con oligoferulatos o una composición que comprende oligoferulatos y quitosano para potenciar la germinación de plantas en condiciones de estrés
Materiales y métodos
Las semillas de rábano (Raphanus sativus) de la variedad Ronde rode se incubaron 5 min en agua (como control), solución de oligoferulatos 0,05 mM, solución de quitosano al 0,1 % o una solución que comprendía quitosano al 0,1 % y oligoferulatos 0,05 mM (solución denominada además "composición de oligoferulatos"). Después de secarse, las semillas recubiertas se dispersaron en placas que contenían 50 mL de manitol 125 mM con el fin de inducir condiciones de estrés osmótico. Las placas se sellaron con Parafilm M® para evitar la deshidratación y se dejó en incubación a 30 °C. Después de 4 días, se contaron las semillas germinadas y se calculó el porcentaje de germinación.
Resultados
Los resultados muestran que las semillas de rábano pretratadas con una solución que comprende solo oligoferulatos aumentan significativamente el porcentaje de germinación de semillas de rábano en condiciones de estrés (52 % de semillas germinadas para las semillas tratadas con oligoferulatos y 23 % de semillas germinadas para el control) (Figura 5).
Por el contrario, las semillas de rábano tratadas exclusivamente con quitosano muestran un porcentaje de germinación comparable al de las semillas control (21 % de semillas germinadas para las semillas tratadas con quitosano) (Figura 5).
Por otro lado, las semillas de rábano pretratadas con una solución que comprende oligoferulatos y quitosano (composición de oligoferulatos) muestran un aumento muy significativo del porcentaje de germinación en comparación con el control, con un 68 % de semillas germinadas (Figura 5).
Estos resultados revelan que la aplicación de oligoferulatos, o incluso mejor una composición de oligoferulatos (oligoferulatos y quitosano), muestra una mayor germinación de las plantas con respecto al control o al quitosano solo.
Ejemplo 6: El recubrimiento de semillas con una composición de oligoferulatos induce tolerancia en plantas de trigo al estrés por sequía
Materiales y métodos
Se recubrieron semillas de planta de trigo con una composición que comprendía 0,005 % de diferulato y 0,5 % de quitosano (denominada en lo sucesivo en la presente memoria "composición de oligoferulatos"), y agua (como control). Después del secado, se plantaron seis semillas de trigo por maceta (3 macetas por tratamiento) y las plantas de trigo crecieron durante 3 semanas en suelo bajo condiciones controladas (régimen de luz/oscuridad de 16 h/8 h respectivamente, a 24 °C). En ese momento se suspendió el riego y no se añadió más agua con el fin de simular una situación de estrés por sequía. Después de siete días en esta condición, se restableció el riego, simulando una sequía episódica o una lluvia después de un período prolongado de sequía. La capacidad de recuperación de la planta se estimó al día siguiente, con base en el peso fresco total de las plantas de trigo.
Resultados
Los resultados muestran que este severo estrés por sequía ha dañado irreversiblemente el aparato tisular de las plantas no tratadas (control, Figuras 6A y 6B a la izquierda y Figura 7), mientras que las plantas tratadas con la composición de oligoferulatos muestran una recuperación interesantemente alta (tratadas, Figuras 6A y 6B a la derecha y Figura 7).
Por lo tanto, la composición de oligoferulatos puede ayudar a las plantas a responder mejor a sequías episódicas o pulsos de riego escasos, lo que es notablemente útil para implementar prácticas de gestión de la vegetación en condiciones climáticas cambiantes.
Ejemplo 7: El recubrimiento de semillas con una composición que comprende oligómeros de ácido hidroxicinámico y quitosano induce tolerancia en las plantas de trigo al estrés por sequía
Materiales y métodos
Se prepararon oligómeros de ácido ferúlico, ácido cafeico y ácido cumárico usando quitosano como molde de polimerización y lacasa de T rametes versicolor (Sigma-38429) como catalizador. Cada mezcla de reacción comprende 50 mL de ácido hidroxicinámico 50 mM en metanol, 10 g de quitosano, 15 U de lacasa y 450 mL de tampón fosfato (50 mM, pH 7,0). Las reacciones se llevaron a cabo a 30 °C durante 4 h en un reactor con agitación magnética en condiciones atmosféricas. Los oligómeros injertados sobre quitosano se recuperaron filtrando el medio de reacción al vacío y lavando con abundante cantidad de tampón fosfato (50 mM, pH 7,0) para eliminar todas las trazas de enzima adsorbida.
Las semillas de la planta de rábano se recubrieron con una solución que comprendía 0,35 % de cada oligómero hidroxicinámico injertado en quitosano. Después del secado, las semillas se plantaron y las plantas de rábano se cultivaron durante 3 semanas en suelo bajo condiciones controladas (régimen de luz/oscuridad de 16 h/8 h respectivamente, a 24 °C). En ese momento, se suspendió el riego y no se añadió más agua con el fin de simular una situación de estrés por sequía. Después de una semana bajo esta condición de estrés por sequía, se restableció el riego y se estimó la capacidad de recuperación de la planta en base al peso fresco de las plantas de rábano.
Resultados
Los resultados se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2: Peso fresco de las plantas de rábano después de restaurar el riego
Figure imgf000017_0001
*se informan los valores de la media /- SE
Los resultados muestran que el recubrimiento de las semillas con una composición que comprende oligómeros de ácido ferúlico, ácido cafeico y ácido cumárico aumenta significativamente el peso fresco de la planta en condiciones que simulan estrés por sequía. Las plantas pretratadas mediante recubrimiento de semillas con dichas composiciones han sido, por lo tanto, más resistentes al estrés por sequía que las plantas no tratadas. Por lo tanto, estos resultados demuestran que las composiciones que comprenden oligómeros derivados del ácido hidroxicinámico pueden usarse para mejorar la tolerancia de las plantas a un estrés abiótico.
Ejemplo 8: La mezcla de oligoferulato y quitosano induce reacción de defensa de la planta en células de Arabidopsis thaliana cultivadas in vitro (no es parte de la invención)
Los cultivos en suspensión de células de plantas se utilizan ampliamente en patología vegetal como una herramienta útil para el cribado de moléculas que actúan como inductores de una amplia gama de respuestas de defensa de las plantas contra la infección por patógenos. Entre ellos, la activación de PAL y la acumulación de H2O2 son dos marcadores bioquímicos ampliamente utilizados de la activación de la resistencia de las plantas a los estreses bióticos.
Materiales y métodos
La suspensión celular de Arabidopsis thaliana cepa L-MM1 se cultivaron en medio Murashige y Skoog (4,43 g/L) con sacarosa (30 g/L) y 0,5 μg/mL de ácido alfa-naftalenoacético (NAA) y 0,05 μg/mL de Kinetina, pH 5,7. Los cultivos se mantuvieron bajo un fotoperíodo de 16 h/8 h luz/oscuridad, a 25 °C, en un agitador rotatorio a 100 rpm. Las células se diluyeron 10 veces en medio fresco cada 7 días. En este bioensayo, se preparó la composición que comprendía 0,005 % de oligoferulatos y 0,5 % de quitosano (en adelante en la presente memoria denominada “composición de oligoferulatos”) a diferentes concentraciones, se filtró a través de un filtro de membrana de 0,22 μm (Millipore) y se añadió asépticamente a 5 mL de células cultivadas en suspensión de 3 días de edad y se dejó incubar 24 horas a 24 °C con agitación suave. Se usó agua como control. La mezcla de reacción se centrifugó a 4 °C durante 5 min a una RCF máxima de 100 g a 4 °C para recoger las células (para medir la actividad de PAL) y el sobrenadante (para medir H2O2).
Actividad de PAL
Después de la centrifugación, las células se homogeneizaron a 4 °C en 1 ml de tampón de borato 0,1 M (pH 8,8) que contenía mercaptoetanol 2 mM. El homogeneizado se centrifugó a 4.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. La actividad PAL (EC 4.3.1.5) se determinó en 0,125 ml de sobrenadante en presencia de 1,37 ml de tampón de borato 0,1 M (pH 8,8) suplementado con L-fenilalanina 60 mM como se describe por Beaudoin-Eagan y Thorpe (Plant Physiol. 1985; 78(3):438-41). La concentración de proteínas de los extractos se determinó mediante el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad).
Medición de H2O2
La concentración de H2O2 se midió en el sobrenadante usando el kit de ensayo de peróxido de hidrógeno/peroxidasa Amplex Red (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Resultados
Actividad de PAL
Los resultados muestran que la actividad de PAL aumenta de manera dependiente de la dosis según la concentración de oligoferulatos en la composición (Figura 8). Por lo tanto, los oligoferulatos de la composición inducen la activación de PAL de la planta, que es un marcador de activación de la resistencia de la planta. Estos resultados demuestran así la activación de la resistencia de las plantas por los oligoferulatos.
Medición de H2O2
Los resultados muestran que el H2O2 se acumula en la planta de manera dependiente de la dosis según la concentración de oligoferulatos en la composición (Figura 9). Los oligoferulatos de la composición inducen así la acumulación de H2O2 en la planta. Como la acumulación de H2O2 es un marcador de la activación de la resistencia de la planta, estos resultados demuestran la estimulación de la resistencia de la planta por los oligoferulatos de la invención.
La actividad de PAL y la acumulación de H2O2 son marcadores del mecanismo común de defensa de la resistencia de las plantas a una amplia gama de condiciones de estrés inducidas por un patógeno. Por lo tanto, estos resultados muestran que las composiciones utilizadas en la invención mejoran la tolerancia de una planta frente a un estrés biótico.
Ejemplo 9: La pulverización foliar de oligoferulatos en plantas de tomate induce la acumulación de prolina, mientras que otros antioxidantes no pueden hacerlo
Materiales y métodos
Prueba antioxidante
La actividad antioxidante de los oligoferulatos preparados como se describe en el ejemplo 1, ácido ferúlico (W518301, Sigma-Aldrich), ácido gálico (27645, Sigma-Aldrich) y ácido ascórbico (A0278, Sigma-Aldrich) se determinó utilizando un método basado en el secuestro del radical estable 2,2-difenil-1 -picrilhidrazilo (DPPH) (Brand Williams et al, Food Sci Technol-Lebens Wissens Technol. 1995; 28:25-30) y los resultados se expresaron como CI50 (concentración de antioxidante que reduce el radical libre DPPH^ aproximadamente el 50 %). Este método se usa frecuentemente para predecir las actividades antioxidantes de diferentes moléculas.
Actividad biológica
Se cultivaron plantas de tomate de la variedad "moneymaker" durante 3 semanas en suelo bajo condiciones controladas (régimen de luz/oscuridad de 16 h/8 h respectivamente, a 24,5 °C). Después de 24 horas, las hojas verdaderas de las plantas tratadas por pulverización se recogieron y se trituraron en nitrógeno líquido. Las formulaciones que contenían ácido gálico, ácido ascórbico, ácido ferúlico u oligoferulatos en las mismas concentraciones (5 ppm) y Tween 80 (Polisorbato 80) al 0,01 % como emulsionante se pulverizaron sobre las hojas de tomate hasta que escurrieron. Como control se utilizó una solución de Tween 80 al 0,01 %.
La prolina (Pro) se estimó en hojas de tomate según Bates et al. (Plant and Soil. 1973, 39:205-207) basado en la reacción de prolina con ninhidrina. Se homogeneizaron muestras de hojas frescas de 500 mg en 5 mL de ácido sulfosalicílico acuoso al 3 % y se centrifugaron a 22.000 g durante 5 min. El sobrenadante se filtró a través de filtros Sartorious (0,45 gm). A 1 mL del filtrado, se le añadió 1 mL de reactivo de ninhidrina (2,5 g de ninhidrina/100 mL de una solución 15 que contenía ácido acético glacial, agua destilada y ácido ortofosfórico al 85 % a una relación de 6:3:1) y se hirvió en un baño de agua a 100 °C durante 1 h. Las lecturas se tomaron inmediatamente a una longitud de onda de 546 nm. La concentración de prolina se determinó a partir de una curva estándar utilizando prolina (sigma) y se expresó como valores relativos respecto al contenido en el tratamiento control como control R/R.
Resultados
Prueba antioxidante
El ácido gálico mostró la mayor actividad antioxidante (CI50 de 2 gg/mL) seguido del ácido ascórbico (CI50 de 5 gg/mL) mientras que el ácido ferúlico (CI50 de 25 gg/mL) y oligoferulatos (CI50 de 35 gg/mL) mostraron una menor actividad antioxidante.
Actividad biológica
Los resultados muestran que, entre las moléculas asperjadas sobre las plantas de tomate, solo la formulación que comprendía oligoferulatos mostró la capacidad de inducir la acumulación de prolina en las plantas (Figura 10).
Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la actividad biológica de los oligómeros de ácido ferúlico en las plantas no está relacionada con su actividad antioxidante.
Ejemplo 10: La pulverización foliar de una composición que contiene oligoferulatos en plantas de trigo induce la acumulación de osmoprotectores (prolina)
Materiales y métodos
Se cultivaron plantas de trigo de la variedad "Homero" durante 2 semanas en suelo bajo condiciones controladas (régimen de luz/oscuridad de 16 h/8 h respectivamente, a 24,5 °C). Una formulación que contenía tween 80 (Polisorbato 80) al 0,01 % como emulsionante y una composición de quitosano (5 mg/L) y oligoferulatos (0,15 mg/L) se pulverizó sobre las hojas de trigo hasta escurrimiento. Se usó como control una solución que contenía solo tween 80 (Polisorbato 80) al 0,01 %.
Cada 24 horas, se recogieron hojas verdaderas de plantas tratadas (y control) por pulverización y se molieron en nitrógeno líquido. De esta forma, se estableció una curva de tiempo-respuesta para la acumulación de prolina inducida por pulverización foliar de la formulación de oligoferulatos en plantas de trigo.
La prolina (Pro) se estimó en hojas de trigo según Bates et al. (Plant and Soil. 1973, 39:205-207) basado en la reacción de prolina con ninhidrina. La concentración de prolina se determinó a partir de una curva estándar utilizando prolina (sigma) y se expresó como valores relativos respecto al contenido en el tratamiento control como control R/R.
Resultados
Los resultados muestran que la acumulación de prolina en las hojas de trigo dependía en gran medida del tiempo posterior a la aplicación foliar (Figura 11). Se observó una acumulación de prolina a la mitad del máximo el día 5 después de la aplicación. La prolina alcanzó un máximo en el día 7 y disminuyó justo después.
Estos resultados demuestran que la aplicación de oligoferulatos en una planta induce un aumento del contenido de prolina de la planta. La acumulación de prolina es una respuesta fisiológica común en muchas plantas en respuesta a una amplia gama de estreses, incluidos los estreses bióticos y abióticos. Por lo tanto, la aplicación de oligoferulatos según la invención conduce a la acumulación de prolina en la planta, mejorando así la tolerancia al estrés de la planta.
Ejemplo 11: La pulverización foliar de oligómeros de ácido ferúlico, ácido cumárico y ácido cafeico en plantas de tomate induce la acumulación de prolina
Materiales y métodos
Se prepararon oligómeros de ácido cafeico y ácido cumárico mediante el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 1 para la preparación de oligómeros de ácido ferúlico. En resumen, se añadió una solución de 5 mM de cada ácido hidroxicinámico en metanol (50 mL) a 180 mL de acetato de etilo. Después de mezclar, se añadieron 200 mL de solución de lacasa 1 U/mL (Sigma-38429, Lacasa de Trametes versicolor) en tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5,0), y se llevó a cabo la reacción a 25 °C durante 24 horas mediante agitación en un agitador orbital a 150 rpm. Al final, la fase orgánica se separó utilizando un embudo de separación y la fase acuosa se lavó dos veces con acetato de etilo. Todos los extractos de acetato de etilo se evaporaron a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio para recuperar los oligómeros del derivado hidroxicinámico en forma de polvo.
Se cultivaron plantas de tomate de la variedad "moneymaker" durante 3 semanas en suelo bajo condiciones controladas (régimen de luz/oscuridad de 16 h/8 h respectivamente, a 24,5 °C). Después de 24 horas, las hojas verdaderas de las plantas tratadas por pulverización se recogieron y se trituraron en nitrógeno líquido. Las formulaciones que comprendían oligómeros de ácido ferúlico, cumárico o cafeico en las mismas concentraciones (5 ppm) y Tween 80 (Polisorbato 80) al 0,01 % como emulsionante se pulverizaron sobre las hojas de tomate hasta que escurrieron. Como control se utilizó una solución de Tween 80 al 0,01 %. La prolina (Pro) se estimó en hojas de tomate según Bates et al. (Plant and Soil. 1973, 39:205-207) basado en la reacción de prolina con ninhidrina. La concentración de prolina se determinó a partir de una curva estándar usando prolina (sigma) y se expresó como μmoles de prolina por peso fresco (g).
Resultados
Los resultados se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3: Contenido de prolina en plantas de tomate siete días después de la pulverización foliar de diferentes oligómeros de hidroxicinámico
Figure imgf000020_0001
Como se muestra en el Ejemplo 10, los oligómeros de ácido ferúlico (oligoferulatos) inducen un aumento del contenido de prolina en la planta. Además, los oligómeros de otros derivados hidroxicinámicos, a saber, oligómeros de ácido cumárico y oligómeros de ácido cafeico, también conducen a una acumulación de prolina en la planta.
Por lo tanto, estos resultados demuestran que los oligómeros derivados de hidroxicinámicos son capaces de modular el contenido de prolina de una planta, mejorando así la tolerancia al estrés de la planta.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Uso de una composición para mejorar la tolerancia al estrés de una planta frente al estrés abiótico, comprendiendo dicha composición al menos un oligómero de un derivado del ácido hidroxicinámico, en donde dicho derivado del ácido hidroxicinámico se selecciona del grupo de ácido ferúlico, ácido p-cumárico, ácido cafeico y ácido sinápico, y en donde dicha composición comprende como máximo el 3 % de un monómero de dicho derivado del ácido hidroxicinámico, expresado en porcentaje con respecto a los oligómeros del derivado hidroxicinámico totales de la composición.
2. El uso según la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende además al menos un agente solubilizante, dicho agente solubilizante se elige del grupo que comprende polisacáridos y polioles.
3. El uso según la reivindicación 1 o 2, en donde dicha composición comprende al menos un oligómero de ácido ferúlico.
4. El uso según la reivindicación 3, en donde dicho oligómero de ácido ferúlico es ácido diferúlico.
5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde dicha composición comprende de 0,0001 a 200 ppm de dicho al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico.
6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho estrés abiótico se selecciona del grupo que comprende estrés hídrico, sequía, estrés osmótico, estrés térmico, deficiencia de nutrientes y estrés químico generado por contaminantes metálicos u orgánicos en el suelo para cultivar dicha planta.
7. El uso según la reivindicación 6, en donde dicho estrés abiótico se selecciona del grupo que comprende estrés hídrico, sequía u estrés osmótico.
8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha composición es una composición de pulverización, comprendiendo dicha composición de 0,0001 a 10 ppm de dicho al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico.
9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha composición es una composición para el recubrimiento de semillas, dicha composición comprende de 1 a 200 ppm de dicho al menos un oligómero derivado del ácido hidroxicinámico.
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