ES2945360T3

ES2945360T3 - Sistema de señalización

Info

Publication number: ES2945360T3
Application number: ES17707102T
Authority: ES
Inventors: Martin Pule; Shaun Cordoba; Simon Thomas; Shimobi Onuoha; Maria Stavrou
Original assignee: Autolus Ltd
Current assignee: Autolus Ltd
Priority date: 2016-02-12
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2037-02-10
Also published as: US11466070B2; EP4227317A1; US20190330299A1; EP3414263B1; EP3414263A1; WO2017137758A1; GB201602563D0

Abstract

La presente invención proporciona un sistema de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende; (i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno y un primer dominio de unión; y (ii) un componente de señalización que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de unión que se une al único dominio de unión del primer dominio de unión del componente receptor en el que el primer o el segundo dominio de unión comprenden un único dominio de unión y en el que la unión de los dominios de unión primero y segundo se interrumpen por la presencia de un agente, de modo que, en ausencia del agente, el componente receptor y el componente de señalización se heterodimerizan y la unión del dominio de unión al antígeno da como resultado la señalización a través del dominio de señalización; mientras que en presencia del agente, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema de señalización

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Tradicionalmente, se han generado células T específicas de antígeno mediante expansión selectiva de células T de sangre periférica de manera nativa específicas para el antígeno diana. Sin embargo, resulta difícil, y muy a menudo imposible, seleccionar y expandir grandes números de células T específicas para la mayoría de los antígenos del cáncer. La terapia génica con vectores de integración proporciona una solución a este problema, ya que la expresión transgénica de un receptor de antígeno quimérico (CAR) permite la generación de grandes números de células T específicas para cualquier antígeno de superficie mediante transducción ex vivo de vectores virales de una población a granel de células T de sangre periférica.

Los receptores de antígenos quiméricos son proteínas que injertan la especificidad de un anticuerpo monoclonal (mAb) en la función efectora de una célula T. Su forma habitual es que la de una proteína de dominio transmembrana de tipo I con un antígeno que reconoce el extremo amino terminal, un espaciador, un dominio transmembrana conectados todos a un endodominio compuesto que transmite las señales de activación y supervivencia de células T (véase la figura 1A).

Las formas más comunes de estas moléculas son fusiones de fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales que reconocen un antígeno diana, fusionados por medio de un espaciador y un dominio transmembrana a un endodominio de señalización. Tales moléculas dan como resultado la activación de la célula T en respuesta al reconocimiento por el scFv de su diana. Cuando las células T expresan un CAR de este tipo, reconocen y destruyen células diana que expresan el antígeno diana. Se han desarrollado varios CAR contra antígenos asociados a tumores, y actualmente están en ensayo clínico enfoques de transferencia adoptiva usando tales células T que expresan CAR para el tratamiento de diversos cánceres.

Se han notificado varias toxicidades a partir de estudios de CAR, y existen toxicidades teóricas adicionales. Tales toxicidades incluyen toxicidad inmunológica provocada por la activación intensa y sostenida de las células CAR T dando como resultado un síndrome de activación de macrófagos (MAS) y toxicidad "específica fuera del tumor", es decir, reconocimiento del antígeno diana en tejidos normales.

Se supone que el MAS está provocado por la activación persistente impulsada por el antígeno y la proliferación de células T que, a su vez, liberan abundantes citocinas inflamatorias conduciendo a hiperactivación de macrófagos y un ciclo de prealimentación de activación inmunitaria. Es característico un gran pico en IL-6 sérica y el síndrome puede dar como resultado una enfermedad sistémica grave que requiere ingreso en la UCI.

Se ha notificado toxicidad específica fuera del tumor con otros CAR, por ejemplo, un grupo de pacientes tratados con un CAR contra el antígeno de carcinoma de células renales CAIX desarrollaron toxicidad biliar inesperada y limitante del tratamiento. Se han notificado dos muertes con estudios de CAR: un paciente murió por un síndrome de dificultad respiratoria que se produjo inmediatamente después de la infusión de una dosis grande de células CAR T anti-ERBB2 de tercera generación; un paciente adicional murió en un estudio diferente después de una posible tormenta de citocinas tras el tratamiento de CLL con un CAR anti-CD19 de segunda generación.

Estas toxicidades son muy difíciles de predecir incluso con estudios detallados en animales o trabajo con primates no humanos. De manera crucial, a diferencia de las moléculas pequeñas y los productos biológicos, las células CAR T no tienen una semivida y no puede detenerse la administración y esperar a que el agente se descomponga/se excrete. Las células CAR T son autónomas y pueden injertarse y proliferar. Por tanto, la toxicidad puede ser progresiva y fulminante.

Los genes suicidas son elementos expresados genéticamente que pueden destruir condicionalmente las células que los expresan. Los ejemplos incluyen la timidina cinasa del virus del herpes simple, que hace que las células sean susceptibles a ganciclovir; caspasa 9 inducible, que hace que las células sean susceptibles a un homodimerizador molecular pequeño y CD20 y RQR8, que hacen que las células sean susceptibles a rituximab.

Esta tecnología añade una cierta cantidad de seguridad a la terapia con células CAR T, sin embargo, hay limitaciones. En primer lugar, es un enfoque binario en donde todas las células CAR T se destruyen tras la adición del agente suicida. Además, los productos terapéuticos medicinales tienen a menudo una ventana terapéutica. Con un agente suicida, la potencia del producto no puede ajustarse de manera que pueda lograrse eficacia con una toxicidad tolerable. En segundo lugar, no está claro si un gen suicida ayudaría con algunas de las toxicidades inmunitarias descritas anteriormente: por ejemplo, en el momento en que se desencadenó un síndrome de activación de macrófagos, puede que ya no sea necesario que las células CAR T se perpetúen y el gen suicida ya no sería útil. Los síndromes de liberación de citocinas más agudos probablemente se producen demasiado rápidamente como para que funcione el gen suicida.

El documento PCT/GB2015/052494 describe un sistema de CAR que comprende componentes de reconocimiento de antígenos y señalización separados. En este sistema, la señalización puede inhibirse/terminarse rápidamente a pesar de la unión continua del antígeno a un componente de reconocimiento de antígenos del sistema de c Ar . Esta inhibición de la señalización se produce en presencia de un agente, tal como una molécula pequeña, que inhibe la colocalización e interacción que se producirían de lo contrario entre el componente de unión a antígeno extracelular y el componente de señalización intracelular del CAR.

En particular, el documento PCT/GB2015/052494 describe un sistema de CAR que comprende; (i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión que comprende una proteína represora de tetraciclina (TetR); y (ii) un componente de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de unión que comprende un péptido de interacción con TetR (TiP) que se une específicamente a TetR del componente receptor.

El operón Tet es un operón biológico bien conocido que se ha adaptado para su uso en células de mamífero. La TetR se une a tetraciclina como un homodímero y experimenta un cambio conformacional que, entonces, modula la unión al ADN de las moléculas de TetR. Klotzsche et al. 2007 (J. Biol. Chem. 280, 24591-24599 (2005); Luckner et al.; J. Mol. Biol. 368, 780-790), describieron un péptido derivado de presentación en fago que activa la TetR. Esta proteína (proteína de interacción con TetR/TiP) tiene un sitio de unión en TetR que se superpone, pero no es idéntico a, el sitio de unión a tetraciclina (Luckner et al.; como anteriormente). Por tanto, TiP y tetraciclina compiten por la unión de TetR.

En el sistema de CAR de TetR/TiP descrito en el documento PCT/GB2015/052494, la unión de la TetR sobre el componente receptor y TiP sobre el componente de señalización intracelular se ve alterada por la presencia de tetraciclina, de manera que, en ausencia de tetraciclina, el componente receptor y el componente de señalización se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno da como resultado señalización a través del dominio de señalización, mientras que, en presencia de tetraciclina, el componente receptor y el componente de señalización no se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno no da como resultado señalización a través del dominio de señalización.

Por tanto, en el sistema descrito en el documento PCT/GB2015/052494, la actividad de las células que expresan CAR en un paciente puede atenuarse o apagarse usando un agente de molécula pequeña (tetraciclina), sin eliminar las células que expresan CAR del paciente.

Un posible inconveniente de un sistema de señalización de CAR basado en TetR/TiP es que, debido a que TetR es una proteína procariota, puede ser inmunogénica cuando se expresa en una célula que se introduce en un paciente.

El documento WO 2014/127261 proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) heterodimérico, condicionalmente activo y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el CAR.

El documento WO 2015/150771 se refiere a un sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende; (i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un primer inductor químico intracelular del dominio de unión a dimerización I (CBDI); y (ii) un componente de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización y un segundo inductor químico del dominio de unión a dimerización 2 (CBD2); en donde CBD I y CBD2 son capaces de unirse simultáneamente a un inductor químico de dimerización (CID); en donde, en ausencia del CID, la unión del componente de unión a antígeno al antígeno no da como resultado señalización a través del componente de señalización; mientras que, en presencia del CID, el componente receptor y el componente de señalización se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno da como resultado señalización a través del dominio de señalización.

C.-Y. Wu et al., 2015, Science, 350(6258) se refieren a un CAR de encendido que permite un control dependiente de moléculas pequeñas, titulable y reversible sobre la actividad de células CAR T. El CAR de encendido se construyó dividiendo los módulos de señalización y reconocimiento en polipéptidos distintos unidos a dominios de heterodimerización dependientes de moléculas pequeñas. El diseño del CAR de encendido es modular; pueden intercambiarse diferentes dominios de reconocimientos de antígeno y módulos de dimerización de molécula pequeña.

J Sun et al., 2015, Cell Research, 25(12) se refieren a estrategias dirigidas frenar una actividad excesiva de células T, utilizando un dimerizador químico para agregar dominios coestimuladores y activantes de células T, de unión a antígeno.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 - a) Diagrama esquemático que ilustra un CAR clásico. (b) a (d): Diferentes generaciones y permutaciones de endodominios de CAR: (b) los diseños iniciales transmitían señales de ITAM solo a través del endodominio F^ceR1-^yo CD3Z, mientras que diseños posteriores transmitían (c) una o (d) dos señales coestimuladoras adicionales en el mismo endodominio compuesto.

Figura 2 - Estructuras de TetR y TiP. (a) secuencia de TiP unida al extremo amino-terminal de una proteína arbitraria; (b) estructura derivada por cristalografía de TiP que interacciona con TetR (de PDB 2NS8 y Luckner et al (J. Mol. Biol. 368, 780-790 (2007)). Puede observarse TiP acoplado profundamente dentro del homodímero de TetR asociándose con muchos de los residuos de tetraciclina con los que se asocia.

Figura 3 -Un sistema de señalización de CAR basado en TetR/TiP (a) un componente receptor que abarca la membrana comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un enlazador intracelular a TetR. Una molécula separada, el componente de señalización, comprende una proteína intracelular que se genera mediante fusión de TiP a uno o varios dominios de señalización de células T. En ausencia de tetraciclina o análogos de tetraciclina, los componentes receptor y de señalización interaccionan y, en presencia de un antígeno afín, el sistema señaliza. (b) En presencia de tetraciclina o análogos de tetraciclina, TiP se desplaza de TetR y el receptor no puede transmitir señales incluso en presencia de antígeno afín.

Figura 4 - Dominio enlazador intracelular derivado de CD4.

Figura 5 - Constructo de prueba con eGFP para demostrar la función del sistema, (a) un constructo bicistrónico expresado como un solo transcrito que se autoescinde en el sitio 2A para producir: TiP fusionado a eGFP; y un ^cA ^rcon TetR como su endodominio. (b) Micrografía fluorescente de células SupT1 que expresan este constructo en ausencia de tetraciclina. La fluorescencia de eGFP puede observarse claramente en la membrana celular; (c) micrografía fluorescente de las mismas células pero ahora en presencia de tetraciclina. En este caso, la eGFP es citoplasmática, mostrando que la tetraciclina ha desplazado a TiP.

Figura 6 - Constructo de TetCAR inicial y control (a) un constructo bicistrónico expresado como un solo transcrito que se autoescinde en el sitio 2A para producir: un componente de señalización que comprende TiP fusionado por medio de un enlazador flexible al endodominio de CD3-Zeta; y un componente receptor que comprende un scFv que reconoce a CD33, un espaciador derivado del dominio Fc de IgG1, un dominio intracelular y transmembrana derivado de CD4; y TetR. (b) también se construyó un control que era idéntico excepto porque estaba ausente TiP del componente de señalización. (c) Se muestra la secuencia de aminoácidos anotada del TetCAR básico.

Figura 7 - Función del constructo de TetR inicial en comparación con el control. (a) Se expresó TetCAR en células T BW5. Estas células T se expusieron a células SupT1 de tipo natural o células SupT1 modificadas por ingeniería genética para expresar CD33 en ausencia de tetraciclina o en presencia de concentraciones crecientes de tetraciclina. Las células T expuestas a células SupT1 de tipo natural no se activan ni en presencia ni en ausencia de tetraciclina; las células T expuestas a células SupT 1 que expresan CD33 se activan en ausencia de tetraciclina, pero la activación se inhibe rápidamente en presencia de tetraciclina con la activación completamente inhibida en presencia de 100 nM de tetraciclina. (b) Se transdujo TetCAR de control que carece del dominio TiP en BW5. Una vez más, estas células T se expusieron a células SupT1 de tipo natural o células SupT1 modificadas por ingeniería genética para expresar CD33 en ausencia o en presencia de una concentración creciente de tetraciclina. La falta del elemento TiP en el componente de señalización dio como resultado la ausencia de señalización en cualquier condición.

Figura 8 - tetCAR de dominio tetR doble. tetR se expresa como una sola cadena con dos TetR unidas entre sí. Si se usan dominios tetR con afinidad diferente por la tetraciclina (y, por tanto, TiP), la cinética del desplazamiento de TiP mediado por tetraciclina puede modular los niveles de señalización.

Figura 9 - Un sistema de señalización de tetCAR que utiliza una pluralidad de componentes de señalización que contienen endodominios individuales. Se expresa un solo CAR con muchos componentes de señalización diferentes, todos los cuales comprenden TiP en su extremo amino-terminal pero un dominio de señalización individual diferente, en contraposición a un dominio de señalización compuesto. Estos interaccionan aleatoriamente con el componente receptor. La falta de interacción estérica entre los diferentes dominios de señalización y sus segundos mensajeros mejora su función.

Figura 10 - Un sistema de señalización de tetCAR que utiliza una pluralidad de componentes de señalización que contienen endodominios individuales y diferentes dominios TiP. Cada componente de señalización comprende un dominio de señalización individual. Cada componente de señalización también comprende un TiP, sin embargo, cada TiP tiene afinidades diferentes por el dominio TetR. Por tanto, la estequiometría de las interacciones entre el CAR y los dominios de señalización puede variar. En el ejemplo mostrado, el sistema de señalización se construyó de manera que OX40 > CD3Zeta > CD28.

Figura 11 - Un sistema de señalización de tetCAR que utiliza una pluralidad de componentes receptores y una pluralidad de componentes de señalización, conteniendo cada componente de señalización un solo endodominio.

Figura 12 - Señalización de TetCAR en células primarias (a) diferentes constructos sometidos a prueba: (i) CAR clásico; (ii) tetCAR; (iii) tetCAR de control donde se ha delecionado TiP. (b) Células SupT1.CD19 y no transducidas teñidas para CD19; (c) células T no transducidas y células T transducidas con los diferentes constructos de CAR teñidas con anticuerpo anti-Fc.

Figura 13 - Liberación de interferón-gamma de células T no transducidas y células T transducidas con los diferentes constructos de CAR expuestas ((i) CAR clásico de primera generación, (ii) tetCAR y (iii) tetCAR de control), con células SupT 1 (rojo), células SupT 1.CD19 (azul) en diferentes concentraciones de tetraciclina.

Figura 14 - Destrucción de células diana. Se usó un ensayo de liberación de cromo para demostrar la destrucción de células diana (SupT1.CD19) en ausencia de tetraciclina. Leyenda: (i) - CAR regular; (ii) - tetCAR de control (sin TiP en el endodominio); (iii) - tetCAR.

Figure 15 - Sistema de señalización de CAR basado en agente de unión de un solo dominio, (a) un componente receptor que abarca la membrana comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un enlazador intracelular a un anticuerpo de un solo dominio que se une a un antibiótico. Una molécula separada, el componente de señalización, comprende una proteína intracelular que se genera mediante la fusión de un péptido de interacción con anticuerpo de un solo dominio (sdlP) a uno o varios dominios de señalización de células T. En ausencia del antibiótico, los componentes receptor y de señalización interaccionan y, en presencia del antígeno afín, el sistema señaliza. (b) en presencia del antibiótico, el anticuerpo de un solo dominio se desplaza del sdIP y el receptor no puede transmitir señales incluso en presencia de antígeno afín.

Figura 16A - Un constructo para los estudios descritos en los ejemplos 7 y 8 que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un gen suicida (RQR8); un componente de señalización con un dominio de unión a antígeno (scFv) específico de CD19 y un dominio de unión individual (dAb) que se une al hapteno (metotrexato para el ejemplo 7 y cafeína para el ejemplo 8); y un componente de señalización intracelular que comprende un péptido de interacción con dAb y CD3 zeta. Se incorporó una secuencia que codifica un péptido de autoescisión (FMD-2A) entre cada ácido nucleico de modo que los tres polipéptidos se coexpresaran.

Figura 16B - El sistema de CAR usado en los estudios descritos en los ejemplos 7 y 8. El sistema de CAR comprende un componente de señalización con un dominio de unión a antígeno específico de CD19 (aCD19), un dominio espaciador, un dominio transmembrana y un dominio de unión individual (dAb) que se une al hapteno (por ejemplo, metotrexato para el ejemplo 7 y cafeína para el ejemplo 8). El sistema de CAR también comprende un componente de señalización intracelular que comprende un péptido de interacción con dAb y CD3 zeta. La adición del hapteno (metotrexato para el ejemplo 7 y cafeína para el ejemplo 8) altera la heterodimerización entre el componente receptor y el componente de señalización intracelular, de modo que el sistema de CAR ya no es funcional y el ligamiento de CD19 por el dominio de unión a antígeno no conduce a señalización a través del dominio de señalización.

SUMARIO DE ASPECTOS DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han desarrollado un nuevo sistema de señalización de CAR en el que la interacción entre el componente receptor y el componente de señalización intracelular se ve alterada por la presencia de un agente. En este sistema, la heterodimerización se produce por medio de la unión de un agente de unión de un solo dominio a un dominio de unión en el otro componente. El agente de unión de un solo dominio también se une al agente, de modo que, en presencia del agente, el componente receptor y el componente de señalización intracelular se disocian y no puede producirse la señalización.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un sistema de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende;

(i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión que comprende un agente de unión de un solo dominio que se une a un agente; y

(ii) un componente de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de unión que se une al agente de unión de un solo dominio del primer dominio de unión del componente receptor;

en donde, la unión de los dominios de unión primero y segundo se ve alterada por la presencia de un agente, de manera que, en ausencia del agente, el componente receptor y el componente de señalización se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno da como resultado señalización a través del dominio de señalización; mientras que, en presencia del agente, el componente receptor y el componente de señalización no se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno no da como resultado señalización a través del dominio de señalización, en donde el primer dominio de unión no es TetR.

El agente de unión de un solo dominio puede estar situado alternativamente en el componente de señalización intracelular, por tanto en una segunda realización del primer aspecto de la invención se proporciona un sistema de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende;

(ii) un componente de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización y un primer dominio de unión que comprende un agente de unión de un solo dominio;

(i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un segundo dominio de unión que se une al agente de unión de un solo dominio del componente de señalización intracelular; y

en donde, la unión de los dominios de unión primero y segundo se ve alterada por la presencia de un agente, de manera que, en ausencia del agente, el componente receptor y el componente de señalización se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno da como resultado señalización a través del dominio de señalización; mientras que, en presencia del agente, el componente receptor y el componente de señalización no se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno no da como resultado señalización a través del dominio de señalización, en donde el primer dominio no es TetR.

También es posible que el agente de unión de un solo dominio esté situado en el lado extracelular de la membrana celular, lo que significa que son posibles dos configuraciones adicionales: una con el dominio de unión individual en el lado extracelular del componente receptor y otra con el dominio de unión individual en el lado extracelular de un componente de señalización que contiene dominio transmembrana.

Por tanto, en una tercera realización del primer aspecto de la invención, se proporciona un sistema de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende;

(i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno, un primer dominio de unión que comprende un agente de unión de un solo dominio que se une a un agente y un dominio transmembrana; y

(ii) un componente de señalización que comprende un segundo dominio de unión que se une al agente de unión de un solo dominio del primer dominio de unión del componente receptor, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular y;

En una cuarta realización del primer aspecto de la invención, se proporciona un sistema de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende;

(ii) un componente de señalización que comprende un primer dominio de unión que comprende un agente de unión de un solo dominio, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular y;

(i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno, un segundo dominio de unión que se une al agente de unión de un solo dominio del componente de señalización y un dominio transmembrana

El agente puede ser una molécula pequeña tal como: un esteroide, cafeína, cocaína o un antibiótico. El agente puede ser, por ejemplo, un antibiótico tal como tetraciclina, doxiciclina o minociclina.

El agente de unión de un solo dominio puede ser o comprender: un nanocuerpo, un aficuerpo, un armazón de anticuerpo artificial de fibronectina, una anticalina, una afilina, un DARPin, un VNAR, un iBody, un afímero, un finómero, un anticuerpo de dominio (DAb), una abdurina/nanoanticuerpo, una centrina, un alfacuerpo o una nanofitina.

El agente de unión de un solo dominio puede ser o comprender un anticuerpo de dominio (dAb), tal como un dAb de VH o VL.

El segundo dominio de unión puede ser o comprender un péptido que se une al agente de unión de un solo dominio del primer dominio de unión, unión que se inhibe competitivamente mediante el agente. Puede identificarse que el péptido tiene las afinidades de unión requerida, por ejemplo, mediante una matriz peptídica o presentación en fago usando el agente de unión de un solo dominio. El péptido puede eluirse añadiendo el agente particular.

El dominio de señalización del componente de señalización puede comprender uno o más del/de los siguiente(s) endodominio(s): endodominio de CD3 zeta, endodominio de CD28, endodominio de 41BB y endodominio de OX40. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema de señalización de CAR según el primer aspecto de la invención, en donde el componente receptor y componente de señalización se coexpresan por medio de un péptido de autoescisión que se escinde entre el componente receptor y el componente de señalización después de la traducción.

En un tercer aspecto, se proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención.

El vector puede ser, por ejemplo, un vector retroviral o un vector lentiviral o un transposón.

En un cuarto aspecto, se proporciona una célula que expresa un componente receptor y un componente de señalización tal como se define en el primer aspecto de la invención.

La célula acorde puede comprender un ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención o un vector según el tercer aspecto de la invención.

La célula puede ser una célula inmunitaria tal como una célula T o una célula NK.

En un quinto aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células según el cuarto aspecto de la invención.

En un sexto aspecto, se proporciona una composición farmacéutica según el quinto aspecto de la invención para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad.

También se da a conocer un método para tratar y/o prevenir una enfermedad, que comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica según el quinto aspecto de la invención a un sujeto.

El método puede comprender las siguientes etapas:

(i) aislamiento de una muestra que contiene células de un sujeto;

(ii) transducción o transfección de la muestra de células con una secuencia de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención o un vector según el tercer aspecto de la invención; y

(iii) administrar las células de (ii) a un sujeto.

El método puede implicar monitorizar la actividad tóxica en el sujeto y comprende la etapa de administrar un agente para su uso en el sistema de señalización de CAR según el primer aspecto de la invención al sujeto para reducir los efectos tóxicos adversos.

El método puede implicar monitorizar la progresión de la enfermedad y/o monitorizar la actividad tóxica en el sujeto y comprende la etapa de administrar un agente para su uso en el sistema de señalización de CAR según el primer aspecto de la invención al sujeto para proporcionar niveles aceptables de progresión de la enfermedad y/o actividad tóxica. En el uso de una composición farmacéutica según el sexto aspecto de la invención o el método dado a conocer en el presente documento, la enfermedad puede ser cáncer.

También se da a conocer el uso de una composición farmacéutica según el quinto aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad.

En un séptimo aspecto, se proporciona un kit que comprende un primer ácido nucleico o vector que codifica un componente receptor tal como se define en el primer aspecto de la invención y un segundo ácido nucleico o vector que codifica un componente de señalización tal como se define en el primer aspecto de la invención.

En un octavo aspecto, se proporciona un método ex vivo para producir una célula según el cuarto aspecto de la invención, que comprende la etapa de introducir una secuencia de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención, o un vector según el segundo aspecto de la invención, o un kit según el noveno aspecto de la invención en una célula.

La célula puede ser de una muestra aislada de un sujeto.

Por tanto, la presente invención proporciona un sistema de CAR en el que la señalización puede inhibirse en presencia de un agente, por ejemplo una molécula pequeña, que impide la colocalización del componente receptor y el componente de señalización. Esto permite que la señalización de CAR y, por tanto, la potencia de células CAR se termine de manera reversible de una manera controlable con el fin de evitar posibles efectos tóxicos asociados con la señalización de CAR constante. Además, el presente sistema también permite que la potencia de células CAR se controle farmacológicamente y se ajuste a un equilibrio aceptable entre lograr el efecto terapéutico deseado y evitar toxicidades no deseadas.

El sistema de la invención usa un agente de unión de un solo dominio, en vez de TetR, y, por tanto, es menos probable que sea inmunogénico cuando se expresa en o se introduce en un paciente que un sistema de CAR basado en TetR/TiP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

RECEPTORES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS (CAR)

Los CAR clásicos, que se muestran esquemáticamente en la figura 1, son proteínas transmembrana quiméricas de tipo I que conectan un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular (agente de unión) a un dominio de señalización intracelular (endodominio). El agente de unión es normalmente un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal (mAb), pero puede basarse en otros formatos que comprenden un sitio de unión a antígeno similar a un anticuerpo. Puede ser necesario un dominio espaciador para aislar el agente de unión de la membrana y permitir que adopte una orientación adecuada. Un dominio espaciador común usado es el Fc de IgG1. Espaciadores más compactos pueden ser suficientes, por ejemplo, el tallo de CD8a e incluso tan solo la bisagra de IgG1, dependiendo del antígeno. Un dominio transmembrana ancla la proteína en la membrana celular y conecta el espaciador al endodominio.

Diseños de CAR tempranos tenían endodominios derivados de las partes intracelulares de cualquier cadena ^ydel F^ceRI o CD3Z. En consecuencia, estos receptores de primera generación transmitían una señal inmunológica 1, que era suficiente para desencadenar la destrucción por células T de células diana afines pero no podía activar completamente la proliferación y supervivencia de células T. Para superar esta limitación, se han construido endodominios compuestos: la fusión de la parte intracelular de una molécula coestimuladora de células T a la de CD3Z da como resultado receptores de segunda generación que pueden transmitir una señal activante y coestimuladora simultáneamente después del reconocimiento del antígeno. El dominio coestimulador más comúnmente usado es el de CD28. Esto suministra la señal coestimuladora más potente, concretamente la señal inmunológica 2, que desencadena la proliferación de células T. También se han descrito algunos receptores que incluyen endodominios de la familia de receptores de TNF, tales como los OX40 y 41BB estrechamente relacionados que transmiten señales de supervivencia. Se han descrito ahora CAR de tercera generación incluso más potentes que tienen endodominios capaces de transmitir señales de activación, proliferación y supervivencia. Pueden transferirse ácidos nucleicos que codifican CAR a células T usando, por ejemplo, vectores retrovirales. De este modo, puede generarse un gran número de células T específicas de antígeno para la transferencia celular adoptiva. Cuando el CAR se une al antígeno diana, esto da como resultado la transmisión de una señal activante a la célula T en la que se expresa. Por tanto, el CAR dirige la especificidad y citotoxicidad de la célula T hacia células que expresan el antígeno seleccionado como diana.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un sistema de CAR en el que el dominio de reconocimiento de antígeno/de unión a antígeno se proporciona en una primera molécula (denomina en el presente documento 'componente receptor'), que se localiza en la membrana celular. El dominio de señalización intracelular se proporciona en una segunda molécula (denominada en el presente documento 'componente de señalización').

De manera importante, el componente receptor comprende un primer dominio de unión y el componente de señalización comprende un segundo dominio de unión que se une específicamente al primer dominio de unión del componente receptor. Por tanto, la unión del primer dominio de unión al segundo dominio de unión provoca la heterodimerización y colocalización del componente receptor y el componente de señalización. Cuando el antígeno se une al dominio de unión a antígeno del componente receptor, se produce señalización a través del componente de señalización.

El primer o segundo dominio de unión también es capaz de unirse a un agente adicional demás del dominio de unión recíproco. El agente adicional puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña. La unión entre el agente y el primer o segundo dominio de unión es de una afinidad mayor que la unión entre el primer dominio de unión y el segundo dominio de unión. Por tanto, cuando está presente el agente, se une preferentemente al primer o segundo dominio de unión e inhibe/altera la heterodimerización entre el componente receptor y el componente de señalización. Cuando el antígeno se une al dominio de unión a antígeno del componente receptor en presencia del agente adicional, no se produce señalización a través del componente de señalización.

Específicamente, en presencia del agente, el componente receptor y componente de señalización se ubican de una manera dispersada estocásticamente y la unión del antígeno por el dominio de unión a antígeno del componente receptor no da como resultado señalización a través del componente de señalización.

En el presente documento, 'colocalización' o 'heterodimerización' de los componentes receptor y de señalización es análogo a ligamiento/reclutamiento del componente de señalización al componente receptor por medio de la unión del primer dominio de unión del componente receptor y el segundo dominio de unión del componente de señalización.

Puede considerarse que la unión del antígeno por el componente receptor en presencia del agente da como resultado una señalización 'no productiva' a través del componente de señalización. Tal señalización no da como resultado activación celular, por ejemplo activación de células T. Puede considerarse que la unión del antígeno por el componente receptor en ausencia del agente da como resultado una señalización 'productiva' a través del componente de señalización. Esta señalización da como resultado la activación de células T, desencadenando, por ejemplo, la destrucción de células diana y la activación de células T.

La unión del antígeno por el componente receptor en ausencia del agente puede dar como resultado señalización a través del componente de señalización que es 2, 5, 10, 50, 100, 1.000 o 10.000 veces mayor que la señalización que se produce cuando el componente receptor se une al antígeno en presencia del agente.

La señalización a través del componente de señalización puede determinarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen someter a ensayo la transducción de señales, por ejemplo, someter a ensayo los niveles de proteína tirosina cinasas (PTK) específicas, la descomposición de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP²), la activación de proteína cinasa C (PKC) y la elevación de la concentración de ión de calcio intracelular. También pueden utilizarse lecturas funcionales, tales como la expansión clonal de células T, la regulación por incremento de marcadores de activación en la superficie celular, la diferenciación en células efectoras y la inducción de citotoxicidad o secreción de citocinas. Como ilustración, en los presentes ejemplos, los inventores determinaron los niveles de interleucina-2 (IL-2) producida por células T que expresan un componente receptor y componente de señalización del sistema de CAR según la presente invención tras la unión del antígeno al componente receptor en presencia de concentraciones variables de un agente.

PRIMER DOMINIO DE UNIÓN, SEGUNDO DOMINIO DE UNIÓN Y AGENTE

El primer dominio de unión y segundo dominio de unión del sistema de señalización de CAR permiten la colocalización y dimerización selectivas del componente receptor y componente de señalización en ausencia del agente. Por tanto, el primer dominio de unión y segundo dominio de unión son capaces de unirse específicamente.

El sistema de señalización de la presente invención no está limitado por la disposición de un sistema de dimerización específico. El componente receptor puede comprender el primer dominio de unión o el segundo dominio de unión de un sistema de dimerización dado siempre que el componente de señalización comprenda el correspondiente dominio de unión complementario que permite que el componente receptor y componente de señalización se colocalicen en ausencia del agente.

El primer dominio de unión y segundo dominio de unión pueden ser o comprender un agente de unión de un solo dominio y un péptido de interacción con agente de unión de un solo dominio respectivamente; o viceversa.

El agente es una molécula, por ejemplo una molécula pequeña, que es capaz de unirse específicamente al primer dominio de unión o al segundo dominio de unión a una afinidad mayor que la unión entre el primer dominio de unión y el segundo dominio de unión.

Por ejemplo, el agente puede unirse al primer dominio de unión o al segundo dominio de unión con al menos 10, 20, 50, 100, 1000 o 10000 veces mayor afinidad que la afinidad entre el primer dominio de unión y el segundo dominio de unión.

El agente puede ser cualquier molécula farmacéuticamente aceptable que se una preferentemente al primer dominio de unión o al segundo dominio de unión con una mayor afinidad que la afinidad entre el primer dominio de unión y el segundo dominio de unión.

Para las realizaciones primera y segunda del sistema de CAR del primer aspecto de la invención, el agente es capaz de suministrarse al citoplasma de una célula diana y de estar disponible para la unión intracelular. Para las realizaciones tercera y cuarta del sistema de señalización de CAR del primer aspecto de la invención, el agente se une al primer o segundo dominio de unión de manera extracelular.

El agente puede ser capaz de cruzar la barrera hematoencefálica.

AGENTE DE UNIÓN DE UN SOLO DOMINIO

El primer o segundo dominio de unión del sistema de CAR de la presente invención comprende un agente de unión de un solo dominio.

Un "agente de unión de un solo dominio" es una entidad que se une a un agente, tal como un agente de molécula pequeña, y tiene un solo dominio. Un dominio proteico tiene una estructura tridimensional compacta. Puede ser derivable de una proteína más grande, pero el propio dominio es estable independientemente y se pliega independientemente.

El agente de unión de un solo dominio puede tener un sitio de unión similar a un anticuerpo que se une al agente. El agente de unión de un solo dominio puede comprender una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR). El agente de unión de un solo dominio puede comprender tres CDR

El agente de unión de un solo dominio puede carecer de enlaces disulfuro. El agente de unión de un solo dominio puede carecer de residuos de cisteína.

Una molécula de IgG convencional está compuesta por dos cadenas pesadas y dos ligeras. Las cadenas pesadas comprenden tres dominios constantes y un dominio variable (VH); las cadenas ligeras comprenden un dominio constante y un dominio variable (VL). La unidad de unión a antígeno funcional de manera natural se forma por la asociación no covalente del dominio VH y el VL. Esta asociación está mediada por regiones de entramado hidrófobas. La IgG puede derivatizarse a agentes de unión de Fab, scFv y VH o VL de un solo dominio. El agente de unión de un solo dominio usado en el sistema de CAR de la invención puede ser o comprender un agente de unión de VH o VL de un solo dominio de este tipo.

Los anticuerpos de cadena pesada (hcAb) se encuentran en camélidos, carecen de la cadena ligera y el dominio CH1. Comprenden un solo dominio de unión a antígeno, el dominio VHH. El agente de unión de un solo dominio usado en el sistema de CAR de la invención puede ser o comprender un dominio VHH de este tipo o derivado del mismo.

También se han diseñado y caracterizado una variedad de agentes de unión de un solo dominio distintos de inmunoglobulina, incluidos los basados en armazones proteicos naturales y de síntesis. Por ejemplo, las adnectinas/monocuerpos derivados de fibronectina se caracterizan por una estructura de sándwich p similar a Ig, las anticalinas se basan en el pliegue de lipocalina, los aficuerpos se derivan de la proteína A y comprenden tres hélices a, y los DARPin son proteínas de diseño compuestas por repeticiones de anquirina. Cada diseño incluye residuos aleatorizados que median en la unión al ligando.

El agente de unión de un solo dominio puede tener un peso molecular (cuando se considera por separado del resto del componente receptor o componente de señalización) de menos de 20 kDa. Puede tener, por ejemplo, un peso molecular de menos de o igual a aproximadamente 15 kDa, tal como entre 12-15 kDa, el peso molecular típico de un anticuerpo de un solo dominio. Los fragmentos variables de cadena sencilla, que comprenden dos dominios variables, VH y VL, tienen normalmente un peso molecular de aproximadamente 25 kDa.

El agente de unión de un solo dominio puede tener menos de 150 aminoácidos de longitud, por ejemplo, menos de 140, 130 o 120 aminoácidos de longitud. El agente de unión de un solo dominio puede tener aproximadamente 110 aminoácidos de longitud, por ejemplo de 105-115 aminoácidos de longitud

El agente de unión de un solo dominio usado en el sistema de CAR de la invención puede ser un anticuerpo de un solo dominio (sdAb, también conocido como nanocuerpo), un aficuerpo, un armazón de anticuerpo artificial de fibronectina, una anticalina, una afilina, un DARPin, un VNAR, un iBody, un afímero, un finómero, un anticuero de dominio (DAb), una abdurina/nanoanticuerpo, una centirina, un alfacuerpo o una nanofitina.

Un anticuerpo de un solo dominio es un fragmento de anticuerpo que consiste en un solo dominio de anticuerpo variable monomérico. Los primeros anticuerpos de un solo dominio se diseñaron por ingeniería genética a partir de anticuerpos de cadena pesada que se encuentran en camélidos; es decir, fragmentos VHH. Los peces cartilaginosos tienen también anticuerpos de cadena pesada (IgNAR, 'nuevo receptor de antígeno de inmunoglobulina'), a partir de los cuales pueden obtenerse anticuerpos de un solo dominio denominados fragmentos VNAR. Un enfoque alternativo es dividir los dominios variables diméricos de inmunoglobulina G (IgG) común de seres humanos o ratones en monómeros. Aunque la mayor parte de la investigación en anticuerpos de un solo dominio se basa actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha mostrado que nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopos diana.

Puede obtenerse un anticuerpo de un solo dominio mediante inmunización de dromedarios, camellos, llamas, alpacas o tiburones con el antígeno deseado y el aislamiento posterior del ARNm que codifica los anticuerpos de cadena pesada. Mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa, puede producirse una biblioteca génica de anticuerpos de un solo dominio. Técnicas de cribado como presentación en fago y presentación en ribosomas ayudan a identificar los clones que se unen al antígeno. Alternativamente, pueden prepararse anticuerpos de un solo dominio a partir de IgG murina o humana común con cuatro cadenas. El proceso es similar, comprendiendo bibliotecas génicas de donantes inmunizados o sin tratamiento previo y técnicas de presentación para la identificación de los antígenos más específicos. Un problema con este enfoque es que la región de unión de la IgG común consiste en dos dominios (VH y VL), que tienden a dimerizarse o agregarse debido a su lipofilicidad.

Una molécula de aficuerpo consiste en tres alfa hélices con 58 aminoácidos y tiene una masa molar de aproximadamente 6 kDa. El armazón proteico de aficuerpo original se diseñó basándose en el dominio Z (el dominio de unión a inmunoglobulina G) de la proteína A. En contraposición con los anticuerpos, las moléculas de aficuerpo se componen de alfa hélices y carecen de puentes disulfuro.

Se adquieren moléculas de aficuerpo con propiedades de unión únicas mediante aleatorización de 13 aminoácidos ubicados en dos alfa hélices implicadas en la actividad de unión del dominio proteico original. Por último, se han sustituido aminoácidos fuera de la superficie de unión en el armazón para crear una superficie totalmente diferente del dominio de proteína A ancestral.

Moléculas de aficuerpo específicas que se unen a una proteína diana deseada pueden "pescarse" de bibliotecas de variantes, usando presentación en fagos.

Un armazón de anticuerpo artificial de fibronectina son miméticos de anticuerpo basados en el armazón del dominio de fibronectina de tipo III.

Las anticalinas se derivan de lipocalinas humanas, una familia de proteínas de unión de origen natural. Las anticalinas tienen un tamaño de aproximadamente 180 aminoácidos y una masa de aproximadamente 20 kDa.

Las proteínas afilinas se derivan estructuralmente de ubiquitina humana (también históricamente de gamma-B cristalina). Las proteínas afilina se construyen mediante la modificación de aminoácidos expuestos en la superficie de estas proteínas y se aíslan mediante técnicas de presentación tales como presentación en fago y cribado. Como otros miméticos de anticuerpos, se parecen a los anticuerpos en su afinidad y especificidad a antígenos pero no en la estructura.

Las proteínas de repeticiones de anquirina diseñadas (DARPin) son proteínas miméticas de anticuerpos diseñadas genéticamente que presentan normalmente una unión a proteínas diana sumamente específica y de alta afinidad. Se derivan de proteínas anquirina naturales, una de las clases más comunes de proteínas de unión en la naturaleza, que son responsables de diversas funciones tales como señalización celular, regulación e integridad estructural de la célula. Las DARPin consisten en proteínas con al menos tres motivos de repetición, y habitualmente consisten en cuatro o cinco. Su masa molecular es de aproximadamente 14 o 18 kDa (kilodaltons) para DARPin de cuatro o cinco repeticiones, respectivamente.

Los iBodies son miméticos de anticuerpos sintéticos modulares basados en polímeros hidrófilos.

Un afímero es una proteína pequeña y sumamente estable diseñada por ingeniería genética para que presente bucles peptídicos que proporcionan una superficie de unión de alta afinidad por una proteína diana específica. Es una proteína de bajo peso molecular, 12-14 kDa, derivada de la familia de cistatinas de inhibidores de cisteína proteasa.

Los finómeros son proteínas de unión pequeñas derivadas del dominio Fyn SH3 humano. Los finómeros pueden diseñarse por ingeniería genética para que se unan a moléculas diana con la misma afinidad y especificidad que los anticuerpos. Los finómeros no tienen ni residuos de cisteína ni enlaces disulfuro y tienen aproximadamente 7 kDa de tamaño.

Las abdurinas son una nueva clase de armazón similar a anticuerpo derivado de la modificación por ingeniería genética de un solo dominio CH₂aislado de IgG humana. Las abdurinas son proteínas pequeñas (12,5 kDa) que conservan una porción del motivo de unión a receptor de Fc nativo que se une al receptor de Fc neonatal aumentando la semivida proteica y la captación tumoral.

Las centrinas son una nueva clase de proteína de armazón alternativa basada en un dominio de fibronectina consenso. Los alfacuerpos, también conocidos como alfacuerpos de penetración celular o CPAB, son proteínas miméticas de anticuerpos de 10 kDa pequeñas diseñadas por ingeniería genética para unirse a una variedad de antígenos. Los alfacuerpos son diferentes de muchos otros miméticos de anticuerpos en su capacidad para alcanzar y unirse a dianas proteicas intracelulares. Su estructura de alfa-hélice de cadena sencilla está diseñada por modelado por ordenador, inspirado por las estructuras proteicas de superhélice que existen de manera natural.

Las afitinas (o nanofitinas) son miméticos de anticuerpos derivados estructuralmente de la proteína de unión a ADN Sac7d, que se encuentra en Sulfolobus acidocaldarius, un microorganismo que pertenece al dominio Arquea. Al aleatorizar los aminoácidos en la superficie de unión de Sac7d y someter la biblioteca proteica resultante a rondas de presentación en ribosomas, puede dirigirse la afinidad hacia la diana de interés.

AGENTES DE UNIÓN DE UN SOLO DOMINIO A MINOCICLINA

Los presentes inventores han generado varios agentes de unión de un solo dominio que se unen específicamente a minociclina (véase el ejemplo 5 más adelante).

La presente divulgación también proporciona un agente de unión de un solo dominio que se une a minociclina.

El agente de unión de un solo dominio puede comprender una o más de las CDR enumeradas en la tabla 2 a continuación. El agente de unión de un solo dominio puede comprender una de las secuencias de CDR3 enumeradas en la tabla 2 a continuación. El agente de unión de un solo dominio puede comprender una de las combinaciones de CDR1, 2 y 3 enumeradas en la tabla 2 a continuación.

En particular, el agente de unión de un solo dominio puede comprender una de las siguientes:

a) CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos GRTFSSYN (SEQ ID No. 17); CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos ISWSGART (SEQ ID No. 18); y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos AAGRGWGTEAILDY (SEQ ID No. 19);

b) CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos GRSLSSYV (SEQ ID No. 20); CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos ISWSGART (SEQ ID No. 18); y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos AAGRGWGTEAILDY (SEQ ID No. 19);

c) CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos GRTFSSYN (SEQ ID No. 17); CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos ISWSGART (SEQ ID No. 18); y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos VAGRGWGTEAILDY (SEQ ID No. 21);

d) CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos GRTFSNYN (SEQ ID No. 22); CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos INWSGGRT (SEQ ID No. 23); y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos AAGRGWGTEAILDY (SEQ ID No. 19);

e) CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos GRTFSRYN (SEQ ID No. 24); CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos ISWSGART (SEQ ID No. 18); y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos AAGRGWGTEAILDY (SEQ ID No. 19);

f) CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos GRTFSSYN (SEQ ID No. 17); CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos ISRSGGIT (SEQ ID No. 25); y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos AAGRGWGVEAILDY (SEQ ID No. 26);

g) CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos GNIGLVSV (SEQ ID No. 27); CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos ITGGGST (SEQ ID No. 28); y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos RLVNNGRPF (SEQ ID No. 29); o

h) CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos GRLSLSSYV (SEQ ID No. 30); CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos ISWSGART (SEQ ID No. 18); y CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos AAGRGWGTEAILDY (SEQ ID No. 19).

Puede ser posible introducir una o más mutaciones (sustituciones, adiciones o deleciones) en la o cada CDR sin afectar negativamente a la actividad de unión a minociclina. Una, dos o cada CDR puede tener, por ejemplo, ninguna, una, dos o tres mutaciones de aminoácidos.

La presente divulgación también proporciona un componente receptor para su uso en un sistema de CAR según la presente invención que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión que comprende un agente de unión de un solo dominio tal como se definió anteriormente que se une a minociclina. La presente divulgación también proporciona un componente de señalización intracelular para su uso en un sistema de CAR según la presente invención que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de unión que se une que comprende un agente de unión de un solo dominio tal como se definió anteriormente que se une a minociclina. La presente divulgación también proporciona un sistema de CAR que comprende un componente receptor o un componente de señalización intracelular tal como se definió anteriormente.

La presente divulgación también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un agente de unión de un solo dominio, un componente receptor o un componente de señalización intracelular tal como se definió anteriormente. La presente divulgación también proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de este tipo acorde, que puede ser, por ejemplo, un vector retroviral o un vector lentiviral o un transposón.

La presente divulgación también proporciona una célula que expresa un componente receptor o un componente de señalización intracelular tal como se definió anteriormente.

La presente divulgación también proporciona una célula que comprende un ácido nucleico como anteriormente. La célula puede ser, por ejemplo, una célula T o una célula NK.

La presente divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de tales células.

La presente divulgación también proporciona un método para tratar y/o prevenir una enfermedad, que comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica de este tipo a un sujeto.

La presente divulgación también proporciona un método para inhibir un sistema de señalización de CAR tal como se definió anteriormente en un sujeto, método que comprende la etapa de administrar minociclina al sujeto.

AGENTES DE UNIÓN DE UN SOLO DOMINIO A CAFEÍNA

Los presentes inventores han generado un agente de unión de un solo dominio que se une específicamente a cafeína (véase el ejemplo 8 a continuación).

La presente divulgación también proporciona un agente de unión de un solo dominio que se une a cafeína.

El agente de unión de un solo dominio puede comprender una o más de las siguientes CDR

CDR1 de dAb de cafeína

TIYSMA (SEQ ID No. 31)

CDR2 de dAb de cafeína

TVGWSSGITYYMDSVKG (SEQ ID No. 32)

CDR3 de dAb de cafeína

TRAYSVGYDY (SEQ ID No. 33)

Por ejemplo, el agente de unión de un solo dominio puede comprender CDR3 (SEQ ID No. 33)

Puede ser posible introducir una o más mutaciones (sustituciones, adiciones o deleciones) en la o cada CDR sin afectar negativamente a la actividad de unión a cafeína. Una, dos o cada CDR puede tener, por ejemplo, ninguna, una, dos o tres mutaciones de aminoácidos.

El agente de unión de un solo dominio puede comprender la secuencia mostrada como SEQ ID No. 11, o una variante de la misma, que conserva la actividad de unión a cafeína.

SEQ ID No. 11

EVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCTASGRTGTIYSMAWFRQAPGKEREFLATVGWSSGITYY MDSVKGRFTISRDNAKNSAYLQMNSLKPEDTAVYYCTATRAYSVGYDYWGQGTQVTVSS

El agente de unión de un solo dominio de la divulgación puede comprender una variante de la secuencia mostrada como SEQ ID No. 11 que tiene al menos el 80, el 85, el 90, el 95, el 98 o el 99% de identidad de secuencia, siempre que la secuencia de la variante conserve la capacidad de unirse a cafeína. La(s) variación/variaciones de aminoácidos puede(n) estar en las regiones de entramado y no en las CDR.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas puede determinarse fácilmente mediante programas tales como BLAST que está disponible libremente en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.

La presente divulgación también proporciona un componente receptor para su uso en un sistema de CAR según la presente invención que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión que comprende un agente de unión de un solo dominio tal como se definió anteriormente que se une a cafeína. La presente divulgación también proporciona un componente de señalización intracelular para su uso en un sistema de CAR según la presente invención que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de unión que se une que comprende un agente de unión de un solo dominio tal como se definió anteriormente que se une a cafeína.

La presente divulgación también proporciona un sistema de CAR que comprende un componente receptor o un componente de señalización intracelular tal como se definió anteriormente.

La presente divulgación también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un agente de unión de un solo dominio, un componente receptor o un componente de señalización intracelular tal como se definió anteriormente.

La presente divulgación también proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de este tipo acorde, que puede ser, por ejemplo, un vector retroviral o un vector lentiviral o un transposón.

La presente divulgación también proporciona un método para inhibir un sistema de señalización de CAR tal como se definió anteriormente en un sujeto, método que comprende la etapa de administrar cafeína al sujeto.

PÉPTIDO DE INTERACCIÓN CON AGENTE DE UNIÓN DE UN SOLO DOMINIO

En el sistema de CAR de la presente invención, la heterodimerización del componente receptor y de señalización puede producirse a través de la unión del agente de unión de un solo dominio con un péptido de interacción con agente de unión de un solo dominio (sdbiP).

El sdbiP puede tener, por ejemplo, entre 8-30, por ejemplo 10-20 aminoácidos de longitud.

Pueden generarse e identificarse sdbiP adecuados usando métodos de presentación de péptidos tales como presentación en fago, presentación en CIS, presentación en ribosomas y presentación en ARNm (Ullman et al (2011) Briefings in Functional Genomics 10:125-134).

Pueden seleccionarse péptidos en una biblioteca peptídica de presentación en fago usando técnicas tales como biocribado (Miura et al (2004) Biochim. Et Biophys. Acta 1673:131-138).

El propio agente puede usarse para eluir los péptidos, por ejemplo, en una matriz pepídica, de modo que el método de selección refleja las propiedades del sdbiP en el sistema de señalización de CAR, concretamente, que se une al agente de unión de un solo dominio, pero la unión se inhibe competitivamente por la presencia del agente.

Una vez identificado, el sdbiP puede incorporarse en la molécula receptora (realizaciones primera y tercera) o la molécula de señalización (realizaciones segunda y cuarta) y someterse a prueba para asegurarse de que se conservan las propiedades de unión del sdbiP.

PÉPTIDO DE INTERACCIÓN CON AGENTE DE UNIÓN DE UN SOLO DOMINIO PARA AGENTE DE UNIÓN DE UN SOLO DOMINIO A METOTREXATO

Los presentes inventores han generado varios sdbiP que se unen específicamente a dAb de metotrexato (véase el ejemplo 7 más adelante).

La presente divulgación también proporciona un sdbiP que se une a dAb de metotrexato.

El sdbiP puede comprender o consistir en una de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID No. 6 a 10.

SEQ ID No. 6 - ACNAGHLSQC

SEQ ID No. 7 - ASLAITH

SEQ ID No. 8 - ACISLTLNRC

SEQ ID No. 9 - QTEKNPL

SEQ ID No. 10 - ACNAGHLSQC

La presente divulgación también proporciona un componente receptor para su uso en un sistema de CAR según la presente invención que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión que comprende un sdbiP tal como se definió anteriormente que se une a dAb de metotrexato.

La presente divulgación también proporciona un componente de señalización intracelular para su uso en un sistema de CAR según la presente invención que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de unión que se une que comprende un sdbiP tal como se definió anteriormente que se une a dAb de metotrexato.

La presente divulgación también proporciona un método para inhibir un sistema de señalización de CAR tal como se definió anteriormente en un sujeto, método que comprende la etapa de administrar metotrexato al sujeto.

PÉPTIDO DE INTERACCIÓN CON AGENTE DE UNIÓN DE UN SOLO DOMINIO PARA AGENTE DE UNIÓN DE UN SOLO DOMINIO A CAFEÍNA

Los presentes inventores han generado varios sdbiP que se unen específicamente a dAb de cafeína (véase el ejemplo 8 a continuación).

La presente divulgación también proporciona un sdbiP que se une a dAb de cafeína.

El sdbiP puede comprender o consistir en una de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID No. 12 a 16.

SEQ ID No. 12 - HTLNKPP

SEQ ID No. 13 - DLSIGNH

SEQ ID No. 14 - HDSPTAA

SEQ ID No. 15 - YPDVPLA

SEQ ID No. 16 - ACTYLNSAKC

La presente divulgación también proporciona un componente receptor para su uso en un sistema de CAR según la presente invención que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión que comprende un sdbiP tal como se definió anteriormente que se une a dAb de cafeína.

La presente divulgación también proporciona un componente de señalización intracelular para su uso en un sistema de CAR según la presente invención que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de unión que se une que comprende un sdbiP tal como se definió anteriormente que se une a dAb de cafeína.

AGENTE

El agente puede ser una molécula pequeña tal como: un esteroide, metotrexato, cafeína, cocaína o un antibiótico. Un esteroide es un compuesto orgánico con cuatro anillos de carbono "condensados". Los ejemplos de esteroides incluyen el lípido de la dieta colesterol, las hormonas sexuales estradiol y testosterona y el fármaco antiinflamatorio dexametasona. La estructura central del esteroide se compone de diecisiete átomos, unidos en cuatro anillos "condensados": tres anillos de ciclohexano de seis miembros (anillos A, B y C en la primera ilustración) y un anillo de ciclopentano de cinco miembros (el anillo D). Los esteroides varían según los grupos funcionales unidos a su núcleo de cuatro anillos y según el estado de oxidación de los anillos. Los esteroles son formas de esteroides con un grupo hidroxilo en la posición tres y un esqueleto derivado de colestano.

El metotrexato (MTX), anteriormente conocido como ametopterina, es un fármaco antimetabolito y antifolato.

La cafeína es una purina, un alcaloide de metilxantina. Es un estimulante del sistema nervioso central, pero reconocido generalmente como seguro (GRAS) por la Food and Drug Administration. Las dosis tóxicas, por encima de 10 gramos al día para un adulto, son mucho más altas que la dosis típica de menos de 500 miligramos al día. Una taza de café contiene 80-175 mg de cafeína.

La cocaína, también conocida como benzoilmetilecgonina o coca, es un estimulante fuerte. Se conocen diversos análogos de la cocaína ((1R,2R,3S,5S)-3-(benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxilato de metilo) incluidos estereoisómeros; análogos sustituidos con anillo de 3p-fenilo; análogos sustituidos en 2p; análogos de cocaína N-modificados; análogos de 3p-carbamαlo; 3p-alquil-3-benciltropanos; cocaínas sustituídas en 6/7; 6-alquil-3-benciltropanos; y homólogos de piperidina.

Los antibióticos o antibacterianos son un tipo de antimicrobiano usado en el tratamiento y la prevención de la infección bacteriana. Los antibióticos antibacterianos se clasifican comúnmente basándose en su mecanismo de acción, estructura química o espectro de actividad. La mayoría seleccionan como diana funciones bacterianas o procesos del crecimiento. Los que seleccionan como diana la pared celular bacteriana (penicilinas y cefalosporinas) o la membrana celular (polimixinas), o interfieren con enzimas bacterianas esenciales (rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas y sulfonamidas) tienen actividades bactericidas. Los que seleccionan como diana la síntesis de proteínas (macrólidos, lincosamidas y tetraciclinas) son habitualmente bacteriostáticos (con la excepción de aminoglucósidos bactericidas). Una clasificación adicional se basa en su especificidad de diana. Los antibióticos antibacterianos de "espectro estrecho" seleccionan como diana tipos específicos de bacterias, tales como bacterias Gram-negativas o Gram-positivas, mientras que los antibióticos de amplio espectro afectan a una amplia gama de bacterias. Cuatro nuevas clases de antibióticos antibacterianos han alcanzado el uso clínico en los últimos diez años: lipopéptidos cíclicos (tales como daptomicina), glicilciclinas (tales como tigeciclina), oxazolidinonas (tales como linezolid), y lipiarmicinas (tales como fidaxomicina).

El agente puede ser, por ejemplo, un antibiótico tal como tetraciclina, o un derivado del mismo tal como doxiciclina o minociclina.

MÉTODO

La presente divulgación también se refiere a un método para inhibir el sistema de CAR del primer aspecto de la invención, método que comprende la etapa de administrar el agente. Tal como se describió anteriormente, la administración del agente da como resultado una alteración de la colocalización entre el componente receptor y el componente de señalización, de manera que se inhibe la señalización a través del componente de señalización incluso tras la unión del antígeno al dominio de unión a antígeno.

Los dominios de unión primero y segundo pueden facilitar una señalización a través del sistema de CAR que es proporcional a la concentración del agente que está presente. Por tanto, mientras que el agente se une al primer dominio de unión o al segundo dominio de unión con una mayor afinidad que la afinidad de unión entre los dominios de unión primero y segundo, la colocalización de los componentes receptor y de señalización puede no suprimirse completamente en presencia de bajas concentraciones del agente. Por ejemplo, bajas concentraciones del agente pueden disminuir el nivel total de señalización en respuesta al antígeno sin inhibirla completamente. Las concentraciones específicas del agente diferirán dependiendo del nivel de señalización requerido y el agente y los dominios de unión específicos. Los niveles de señalización y la correlación con la concentración de agente pueden determinarse usando métodos conocidos en la técnica, tal como se describió anteriormente.

COMPONENTE RECEPTOR

La presente divulgación proporciona un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio espaciador opcional, un dominio transmembrana y un primer dominio de unión que comprende un agente de unión de un solo dominio. Cuando se expresa en una célula, el componente receptor se localiza en la membrana celular. En este caso, el dominio de unión a antígeno de la molécula está orientado en el lado extracelular de la membrana. El primer dominio de unión puede localizarse en el lado intracelular o extracelular de la membrana.

El componente receptor, por tanto, proporciona la función de unión a antígeno del sistema de CAR de la presente invención.

DOMINIO DE UNIÓN A ANTÍGENO

El dominio de unión a antígeno es la porción de un CAR clásico que reconoce al antígeno. En el sistema de señalización de la presente invención, la unión a antígeno se ubica dentro del componente receptor.

En la técnica se conocen numerosos dominios de unión a antígeno, incluidos los basados en el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, miméticos de anticuerpo y receptores de células T. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede comprender: un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal; un ligando natural del antígeno diana; un péptido con suficiente afinidad por la diana; un agente de unión de un solo dominio tal como un camélido; un agente de unión artificial único como un Darpin; o una cadena sencilla derivada de un receptor de células T.

Se conocen diversos antígenos asociados a tumores (TAA), tal como se muestra en la siguiente tabla 1. El dominio de unión a antígeno usado en la presente invención puede ser un dominio que es capaz de unirse a un TAA tal como se indica en la misma.

Tabla 1

DOMINIO TRANSMEMBRANA

El dominio transmembrana es la secuencia de un CAR clásico que abarca la membrana. En el sistema de señalización de la presente invención, el dominio transmembrana está ubicado en el componente receptor. Puede comprender una alfa hélice hidrófoba. El dominio transmembrana puede derivarse de CD28, que proporciona una buena estabilidad del receptor.

PÉPTIDO SEÑAL

El componente receptor del sistema de CAR de la presente invención puede comprender un péptido señal de modo que, cuando el componente receptor se expresa en una célula, tal como una célula T, la proteína naciente se dirige al retículo endoplasmático y posteriormente a la superficie celular, donde se expresa.

El núcleo del péptido señal puede contener un tramo largo de aminoácidos hidrófobos que tiene una tendencia a formar una sola alfa hélice. El péptido señal puede comenzar con un tramo de aminoácidos corto cargado positivamente, lo que ayuda a imponer la topología apropiada del polipéptido durante la translocación. Al final del péptido señal hay normalmente un tramo de aminoácidos que reconoce y escinde una peptidasa señal. La peptidasa señal puede escindir o bien durante o bien después de la finalización de la translocación para generar un péptido señal libre y una proteína madura. Los péptidos señal libres se digieren entonces por proteasas específicas.

DOMINIO ESPACIADOR

El sistema de CAR descrito en el presente documento puede comprender una secuencia espaciadora para conectar el dominio de unión a antígeno con el dominio transmembrana en el componente receptor. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a antígeno se oriente en diferentes direcciones para facilitar la unión.

La secuencia espaciadora puede comprender, por ejemplo, una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8 humano o el tallo de CD8 de ratón. El espaciador puede comprender alternativamente una secuencia enlazadora alternativa que tiene similar longitud y/o propiedades de espaciado de dominios que una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8. Un espaciador de IgG1 humana puede alterarse para eliminar los motivos de unión a Fc.

COMPONENTE RECEPTOR QUE COMPRENDE UNA PLURALIDAD DE PRIMEROS DOMINIOS DE UNIÓN

El componente receptor puede comprender una pluralidad de primeros dominios de unión y, por tanto, puede ser capaz de reclutar más de un componente de señalización.

La pluralidad de primeros dominios de unión puede estar presente en un solo dominio intracelular del componente receptor.

El componente receptor puede comprender un número apropiado de dominios transmembrana de manera que cada primer dominio de unión esté orientado en el lado intracelular de la membrana celular. Por ejemplo, el componente receptor puede comprender 3, 5, 7, 9, 11 o más dominios transmembrana. De este modo, un solo componente receptor puede reclutar múltiples componentes de señalización amplificando la señalización en respuesta al antígeno.

Los primeros dominios de unión pueden ser cada uno variantes que tienen una afinidad diferente por el segundo dominio de unión del componente de señalización.

MÚLTIPLES COMPONENTES RECEPTORES

En otra realización de la invención, el sistema de CAR puede comprender dos o más componentes receptores que reconocen cada uno antígenos diferentes pero que comprenden el mismo primer dominio de unión intracelular. Un sistema de CAR de este tipo sería capaz de reconocer múltiples antígenos (figura 11). Esto podría ser útil, por ejemplo, para evitar el escape tumoral. En un aspecto relacionado adicional de la invención, los primeros dominios de unión de los componentes receptores difieren en residuos que dictan su afinidad por el segundo dominio de unión del componente de señalización. De este modo, un sistema de CAR puede ajustarse de manera que la señalización en respuesta a un antígeno sea mayor o menor que la respuesta a otro (figura 11). Esto podría ser útil, por ejemplo, cuando se seleccionan como diana dos antígenos tumorales simultáneamente pero uno se expresa a una densidad mayor que el otro. La respuesta a este antígeno podría reducirse para evitar la toxicidad provocada por la sobreestimulación.

En la técnica se conocen métodos adecuados para alterar los residuos de aminoácido del primer o segundo dominio de unión de manera que la afinidad de unión entre los dos dominios se altere e incluyen sustitución, adición y eliminación de aminoácidos usando tanto mutagénesis dirigida como al azar. En la técnica también se conocen bien métodos para determinar la afinidad de unión entre un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión e incluyen predicción por bioinformática de interacciones de proteína-proteína, electroforesis de afinidad, resonancia de plasmón superficial, interferometría de biocapa, interferometría de doble polarización, dispersión de luz estática y dispersión de luz dinámica.

COMPONENTE DE SEÑALIZACIÓN

La presente divulgación también proporciona un componente de señalización que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de unión que comprende un agente de unión de un solo dominio. El componente de señalización puede ser una molécula soluble que se localiza en el citoplasma cuando se expresa en una célula, por ejemplo una célula T (segunda realización del primer aspecto de la invención). Alternativamente, el componente de señalización puede comprender también un dominio transmembrana, de manera que se localiza en la superficie celular cuando se expresa en una célula (cuarta realización del primer aspecto de la invención).

No se produce señalización a través del dominio de señalización del componente de señalización a menos que se colocalice con el componente receptor proporcionado por la presente divulgación. Tal colocalización se produce solo en ausencia del agente, tal como se describió anteriormente.

DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR

El dominio de señalización intracelular es la porción de transmisión de señales de un CAR clásico. En el sistema de señalización de la presente invención, el dominio de señalización intracelular (dominio de señalización) está ubicado en el componente de señalización. En ausencia del agente, el componente receptor y el componente de señalización intracelular, unidos a la membrana, se aproximan. Después del reconocimiento del antígeno, los receptores se agrupan, se excluyen CD45 y CD148 nativos de la sinapsis y se transmite una señal a la célula.

Como tal, el dominio de señalización del componente de señalización es análogo al endodominio de una molécula de CAR clásica.

El componente de dominio de señalización más comúnmente usado es el de endodominio de CD3-zeta, que contiene 3 ITAM. Esto transmite una señal de activación a la célula T después de que se una al antígeno. CD3-zeta puede no proporcionar una señal de activación completamente competente y puede ser necesaria una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, pueden usarse c D28 y OX40 quiméricos con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa / de supervivencia, o pueden usarse los tres conjuntamente (ilustrado en la figura 1B).

El componente de señalización descrito en el presente documento comprende un dominio de señalización, puede comprender el endodominio de CD3-Zeta solo, el endodominio de CD3-Zeta con el de o bien CD28 o bien OX40 o el endodominio de CD28 y el endodominio de OX40 y CD3-Zeta (figura 3A).

El componente de señalización de un sistema de CAR según la presente invención puede comprender la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 1, 2 o 3 o una variante de la misma que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia.

SEQ ID NO: 1 - endodominio de CD3 Z

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL

YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 2 - endodominios de CD28 y CD3 Zeta

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ

LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKG

ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 3 - endodominios de CD28, OX40 y CD3 Zeta

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFR

TPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP

EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD

ALHMQALPPR

Una secuencia variante puede tener al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98% o el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, 2 o 3, siempre que la secuencia proporcione un dominio de señalización intracelular eficaz.

MÚLTIPLES COMPONENTES DE SEÑALIZACIÓN

El sistema de señalización según el primer aspecto de la presente invención puede comprender una pluralidad de componentes de señalización, comprendiendo cada uno un dominio de señalización y un segundo dominio de unión, en donde a cada segundo dominio de unión se une el mismo primer dominio de unión del componente receptor pero los dominios de señalización comprenden endodominios diferentes (figura 9). De este modo, pueden activarse múltiples endodominios diferentes simultáneamente. Esto es ventajoso respecto a un dominio de señalización compuesto, ya que cada dominio de señalización permanece sin trabas de otros dominios de señalización.

Si cada componente de señalización comprende un segundo dominio de unión que difiere en residuos que alteran su afinidad por el primer dominio de unión del componente receptor, los componentes de señalización que comprenden dominios de señalización diferentes se ligan al primer dominio de unión con cinética diferente (figura 10). Esto permite un mayor control sobre la señalización en respuesta a la unión al antígeno por el componente receptor ya que se reclutan componentes de señalización diferentes al componente receptor al variar la cinética/dinámica. Esto es ventajoso puesto que, en vez de una razón igual fija de señal transmitida por un endodominio compuesto, una señal de activación óptima de células T puede requerir proporciones diferentes de señales inmunológicas diferentes.

ÁCIDO NUCLEICO

La presente divulgación proporciona además un ácido nucleico que codifica el componente receptor del primer aspecto y un ácido nucleico que codifica un componente de señalización del primer aspecto.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "polinucleótido", "nucleótido" y "ácido nucleico" pretenden ser sinónimos entre sí.

El experto en la técnica entenderá que numerosos polinucleótidos y ácidos nucleicos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, ha de entenderse que los expertos en la técnica pueden hacer, usando técnicas de rutina, sustituciones de nucleótidos que no afectan a la secuencia polipeptídica codificada por los polinucleótidos descritos en el presente documento para reflejar el uso de codones de cualquier organismo huésped particular en el que van a expresarse los polipéptidos.

Los ácidos nucleicos según la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Pueden ser también polinucleótidos que incluyen dentro de los mismos nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conocen varios tipos diferentes de modificación en oligonucleótidos. Estos incluyen estructuras principales de metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de polilisina o acridina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines del uso tal como se describe en el presente documento, ha de entenderse que los polinucleótidos pueden modificarse mediante cualquier método disponible en la técnica. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo con el fin de potenciar la actividad in vivo o la vida útil de los polinucleótidos de interés.

Los términos "variante", "homólogo" o "derivado" en relación con una secuencia de nucleotidos incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más) ácido nucleico de o a la secuencia.

El ácido nucleico de la invención es un ácido nucleico que codifica tanto el componente receptor como el componente de señalización.

El ácido nucleico produce un polipéptido que comprende el componente receptor y el componente de señalización unidos mediante un sitio de escisión. El sitio de escisión es autoescindible, de manera que, cuando se produce el polipéptido, se escinde inmediatamente en el componente receptor y el componente de señalización sin la necesidad de ninguna actividad de escisión externa.

Se conocen diversos sitios de autoescisión, incluido el péptido de autoescisión 2a del virus de la fiebra aftosa (FMDV), que tiene la secuencia mostrada:

SEQ ID NO: 4

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP.

o

SEQ ID NO: 5

QCTNYALLKLAGDVESNPGP

La secuencia de coexpresión puede ser un sitio de entrada interna al ribosoma (IRES). La secuencia de coexpresión puede ser un promotor interno.

La presente invención también proporciona un kit que comprende un ácido nucleico que codifica el componente receptor del primer aspecto y un ácido nucleico que codifica un componente de señalización intracelular del primer aspecto. VECTOR

La presente invención también proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención, o kit de vectores que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un componente receptor del primer aspecto y un componente de señalización del primer aspecto de la invención. Un vector de este tipo puede usarse para introducir la(s) secuencia(s) de ácido nucleico en una célula huésped de modo que exprese el componente receptor y componente de señalización del sistema de CAR según el primer aspecto de la invención.

El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral, o un vector basado en transposón o ARNm sintético.

El vector puede ser capaz de transfectar o transducir una célula T o una célula NK.

CÉLULA

La presente invención también se refiere a una célula que comprende el sistema de CAR según el primer aspecto de la invención.

La célula puede comprender un ácido nucleico o un vector de la presente invención.

La célula puede expresar un componente receptor y un componente de señalización de la presente invención.

La célula puede comprender al menos un componente de señalización de la presente divulgación. Por ejemplo, la célula puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o más componentes de señalización de la presente divulgación.

La célula puede comprender al menos un componente receptor de la presente divulgación. Por ejemplo, la célula puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o más componentes receptores de la presente divulgación.

La célula puede ser una célula inmunitaria, tal como una célula inmunitaria citolítica. Las células inmunitarias citolíticas pueden ser células T o linfocitos T que son un tipo de linfocito que desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Pueden distinguirse de otros linfocitos, tales como células B y células citotóxicas naturales (células NK), por la presencia de un receptor de células T (TCR) en la superficie celular. Hay diversos tipos de células T, tal como se resume a continuación.

Las células T auxiliares (células TH) ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluida la maduración de células B en células plasmáticas y células B de memoria, y la activación de células T citotóxicas y macrófagos. Las células TH expresan CD4 en su superficie. Las células TH se activan cuando las moléculas de MHC de clase II les presentan antígenos peptídicos en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Estas células pueden diferenciarse en uno de varios subtipos, incluidos TH1, TH₂, TH3, TH17, Th9 o TFH, que secretan diferentes citocinas para facilitar diferentes tipos de respuestas inmunitarias.

Las células T citolíticas (células TC o CTL) destruyen células infectadas por virus y células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Las CTL expresan el CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse al antígeno asociado con MHC de clase I, que está presente en la superficie de todas las células nucleadas. A través de IL-10, adenosina y otras moléculas secretadas por células T reguladoras, las células CD8+ pueden inactivarse hasta un estado anérgico, lo que previene enfermedades autoinmununitarias tales como encefalomielitis autoinmunitaria experimental.

Las células T de memoria son un subconjunto de células T específicas de antígeno que persisten a largo plazo después de que se ha resuelto una infección. Se expanden rápidamente hasta un gran número de células T efectoras tras reexponerse a su antígeno afín, dotando así al sistema inmunitario de "memoria" contra infecciones pasadas. Las células T de memoria comprenden tres subtipos: células T de memoria central (células TCM) y dos tipos de células T de memoria efectoras (células TEM y células TEMRA). Las células de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Las células T de memoria normalmente expresan la proteína de superficie celular CD45RO.

Las células T reguladoras (células Treg), anteriormente conocidas como células T supresoras, son cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. Su papel principal es apagar la inmunidad mediada por células T hacia el final de una reacción inmunitaria y suprimir las células T autorreactivas que escaparon del proceso de selección negativa en el timo.

Se han descrito dos clases principales de células Treg CD4+: células Treg de origen natural y células Treg adaptativas.

Las células Treg de origen natural (también conocidas como células Treg CD4+CD25+FoxP3+) surgen en el timo y se han vinculado con interacciones entre células T en desarrollo con células dendríticas tanto mieloides (CD11c+) como plasmocitoides (CD123+) que se han activado con TSLP. Las células Treg de origen natural pueden distinguirse de otras células T por la presencia de una molécula intracelular denominada FoxP3. Las mutaciones del gen FOXP3 pueden prevenir el desarrollo de células T reguladoras, provocando la enfermedad autoinmununitaria mortal IPEX.

Las células Treg adaptativas (también conocidas como células Tr1 o células Th3) pueden originarse durante una respuesta inmunitaria normal.

Las células citotóxicas naturales (o células NK) son un tipo de células citolíticas que forman parte del sistema inmunitario innato. Las células NK proporcionan respuestas rápidas a las señales innatas de células infectadas por virus de manera independiente del MHC.

Las células NK (pertenecientes al grupo de las células linfoides innatas) se definen como linfocitos granulares grandes (LGL) y constituyen la tercera clase de células diferenciadas del progenitor linfoide común que genera los linfocitos B y T. Se sabe que las células NK se diferencian y maduran en la médula ósea, los ganglios linfáticos, el bazo, las amígdalas y el timo, donde luego ingresan a la circulación.

Las células CAR de la invención pueden ser cualquiera de los tipos de células mencionados anteriormente.

Las células T o NK que expresan las moléculas del sistema de CAR según el primer aspecto de la invención pueden crearse ex vivo o bien a partir de la sangre periférica del propio paciente (primera parte) o bien en el entorno de un trasplante de células madre hematopoyéticas de la sangre periférica de un donante (segunda parte), o sangre periférica de un donante no relacionado (tercera parte).

Alternativamente, las células T o NK que expresan las moléculas del sistema de CAR según el primer aspecto de la invención pueden derivarse de la diferenciación ex vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias a células T. Alternativamente, puede usarse una línea de células T inmortalizadas que conserva su función lítica y podría actuar como agente terapéutico.

En todas estas realizaciones, las células CAR se generan introduciendo ADN o ARN que codifica el componente receptor y el componente de señalización por uno de muchos medios incluida la transducción con un vector viral, la transfección con ADN o ARN.

La célula CAR de la invención puede ser una célula T o NK ex vivo de un sujeto. La célula T o NK puede ser de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las células T o NK pueden activarse y/o expandirse antes de transducirse con ácido nucleico que codifica las moléculas que proporcionan el sistema de CAR según el primer aspecto de la invención, por ejemplo mediante tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD3.

La célula T o NK de la divulgación puede prepararse mediante:

(i) aislamiento de una muestra que contiene células T o NK de un sujeto u otras fuentes enumeradas anteriormente;

y

(ii) transducción o transfección de las células T o NK con una o más secuencias de ácido nucleico que codifican el componente receptor y/o componente de señalización del sistema de CAR según los aspectos segundo y tercero de la invención.

Las células T o NK pueden entonces purificarse, por ejemplo, seleccionarse basándose en la expresión del dominio de unión a antígeno del polipéptido de unión a antígeno.

La presente divulgación también proporciona un kit que comprende una célula T o NK que comprende el sistema de CAR según el primer aspecto de la invención.

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene una pluralidad de células que expresan los componentes del sistema de CAR del primer aspecto de la invención. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Una formulación de este tipo puede estar, por ejemplo, en una forma adecuada para infusión intravenosa.

MÉTODO DE TRATAMIENTO

La presente divulgación proporciona un método para tratar y/o prevenir una enfermedad que comprende la etapa de administrar las células de la presente invención (por ejemplo, en una composición farmacéutica tal como se describió anteriormente) a un sujeto.

Un método para tratar una enfermedad se refiere al uso terapéutico de las células de la presente invención. En el presente documento, las células pueden administrarse a un sujeto que tiene una enfermedad o afección existente con el fin de disminuir, reducir o mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad y/o ralentizar, reducir o bloquear la progresión de la enfermedad.

El método para prevenir una enfermedad se refiere al uso profiláctico de las células de la presente invención. En el presente documento, tales células pueden administrarse a un sujeto que aún no ha contraído la enfermedad y/o que no muestra ningún síntoma de la enfermedad para prevenir o alterar la causa de la enfermedad o para reducir o prevenir el desarrollo de al menos un síntoma asociado con la enfermedad. El sujeto puede tener una predisposición a, o se cree que está en riesgo de desarrollar, la enfermedad.

El método puede implicar las etapas de:

(i) aislar una muestra que contiene células T o NK;

(ii) transducir o transfectar tales células con una secuencia de ácido nucleico o un vector proporcionado por la presente invención;

(iii) administrar las células de (ii) a un sujeto.

La muestra que contiene células T o NK puede aislarse de un sujeto o de otras fuentes, por ejemplo, tal como se describió anteriormente. Las células T o NK pueden aislarse de la propia sangre periférica de un sujeto (primera parte), o en el entorno de un trasplante de células madre hematopoyéticas de la sangre periférica de un donante (segunda parte) o sangre periférica de un donante no relacionado (tercera parte).

Los métodos proporcionados por la presente divulgación para tratar una enfermedad pueden implicar la monitorización de la progresión de la enfermedad y cualquier actividad tóxica y la administración de un agente adecuado para su uso en el sistema de CAR según el primer aspecto de la invención para inhibir la señalización de CAR y, de ese modo, reducir o disminuir cualquier efecto tóxico adverso.

Los métodos proporcionados por la presente divulgación para tratar una enfermedad pueden implicar la monitorización de la progresión de la enfermedad y la monitorización de cualquier actividad tóxica y el ajuste de la dosis del agente administrado al sujeto para proporcionar niveles aceptables de progresión de la enfermedad y actividad tóxica.

Monitorizar la progresión de la enfermedad significa evaluar los síntomas asociados con la enfermedad a lo largo del tiempo para determinar si se están reduciendo/mejorando o aumentando/empeorando.

Las actividades tóxicas se refieren a los efectos adversos provocados por las células CAR de la invención después de su administración a un sujeto. Las actividades tóxicas pueden incluir, por ejemplo, toxicidad inmunológica, toxicidad biliar y síndrome de dificultad respiratoria.

El nivel de señalización a través del sistema de señalización del primer aspecto de la invención y, por tanto, el nivel de activación de las células CAR que expresan el sistema de señalización, puede ajustarse alterando la cantidad de agente presente o la cantidad de tiempo que el agente está presente. En el presente método, el nivel de activación de las células CAR puede aumentarse disminuyendo la dosis de agente administrada al sujeto o disminuyendo la frecuencia de su administración. A la inversa, el nivel de activación de las células CAR puede reducirse aumentando la dosis del agente o la frecuencia de administración al sujeto.

Es probable que niveles más altos de activación de las células CAR estén asociados con una progresión reducida de la enfermedad pero con un aumento de las actividades tóxicas, mientras que es probable que niveles más bajos de activación de las células CAR estén asociados con un aumento de la progresión de la enfermedad pero con una reducción de las actividades tóxicas.

La presente divulgación también proporciona un método para tratar y/o prevenir una enfermedad en un sujeto, sujeto que comprende las células de la invención, método que comprende la etapa de administrar un agente adecuado para su uso en el sistema de CAR según el primer aspecto al sujeto. Como tal, este método implica administrar un agente adecuado a un sujeto que ya comprende células CAR de la presente invención.

Como tal, la dosis de agente administrada a un sujeto, o la frecuencia de administración, puede alterarse con el fin de proporcionar un nivel aceptable tanto de progresión de la enfermedad como de actividad tóxica. El nivel específico de progresión de la enfermedad y actividades tóxicas que se determina que son 'aceptables' variará según las circunstancias específicas y debe evaluarse sobre esa base. La presente divulgación proporciona un método para alterar el nivel de activación de las células CAR con el fin de lograr este nivel apropiado.

El agente puede administrarse en forma de una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Una formulación de este tipo puede estar, por ejemplo, en una forma adecuada para infusión intravenosa.

La presente divulgación proporciona una célula CAR de la presente invención para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad.

La divulgación también se refiere al uso de una célula CAR de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad.

La enfermedad que va a tratarse y/o prevenirse mediante los métodos de la presente divulgación puede ser una infección, tal como una infección viral.

La divulgación de la invención puede ser también para el control de respuestas inmunitarias patógenas, por ejemplo en enfermedades autoinmununitarias, alergias y rechazo de injerto frente a huésped.

La divulgación puede ser para el tratamiento de una enfermedad cancerosa, tal como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (células renales), leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de tiroides.

Las células CAR de la presente invención pueden ser capaces de destruir células diana, tales como células cancerosas. La célula diana puede ser reconocible por la expresión de un TAA, por ejemplo, la expresión de un TAA proporcionado anteriormente en la tabla 1.

Las células CAR y las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser para su uso en el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades descritas anteriormente.

Las células CAR y las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser para su uso en cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

La invención se describirá ahora con más detalle por medio de ejemplos, que pretenden ayudar a los expertos en la técnica a llevar a cabo la invención y no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Funcionalidad del sistema de señalización de TetCAR original

Se expresó un constructo bicistrónico como un solo transcrito que se autoescinde en el sitio 2A para producir TiP fusionado a eGFP y un CAR con TetR como su endodominio (figura 5a).

La microscopía fluorescente de células SupTI que expresan este constructo en ausencia de tetraciclina demostró que la fluoresencia de eGFP puede observarse claramente en la membrana celular (figura 5b); mientras que, en presencia de tetraciclina, la eGFP era citoplasmática (figura 5c). Estos datos demuestran que la tetraciclina ha desplazado a TiP del TetR CAR.

Ejemplo 2 - Señalización a través del sistema de TetCAR original

Se expresó un constructo bicistrónico en células BW5 T como un solo transcrito que se autoescinde en el sitio 2A para producir un componente de señalización que comprende TiP fusionado por medio de un enlazador flexible al endodominio de CD3-Zeta; y un componente receptor que comprende un scFv que reconoce a CD33, un espaciador derivado del dominio Fc de IgG1, un domino transmembrana e intracelular derivado de CD4; y TetR (figura 6a). También se expresó un control que era idéntico excepto porque estaba ausente TiP del componente de señalización (figura 6b).

Las células BW5 T se expusieron a células SupTI de tipo natural o células SupTI modificadas por ingeniería genética para expresar CD33 en ausencia de tetraciclina o en presencia de concentraciones crecientes de tetraciclina. Las células T expuestas a células SupTI de tipo natural no se activaron ni en presencia ni en ausencia de tetraciclina; las células T expuestas a células SupTl que expresan CD33 se activaron en ausencia de tetraciclina, pero la activación se inhibe rápidamente en presencia de tetraciclina con la activación completamente inhibida en presencia de 100 nM de tetraciclina (figura 7a).

Se transdujo también TetCAR de control que carece del dominio TiP en BW5. Una vez más, estas células T se expusieron a células SupTI de tipo natural o células SupTI modificadas por ingeniería genética para expresar CD33 en ausencia o en presencia de una concentración creciente de tetraciclina. La falta del elemento TiP en el componente de señalización dio como resultado la ausencia de señalización en cualquier condición (figura 7b).

Ejemplo 3 - Señalización del sistema de TetCAR original en células T primarias

Se modificaron por ingeniería genética células SupTI (que son negativas para CD19) para que fueran positivas para CD19 proporcionando líneas celulares negativas y positivas para la diana que eran lo más similares posible. Se transdujeron células T humanas primarias de 3 donantes con tres constructos de CAR: (i) CAR anti-CD19 de primera generación "clásico"; (ii) tetCAR anti-CD19 de primera generación; (iii) tetCAR anti-CD19 de control donde falta TiP del endodominio. Células T no transducidas y células T transducidas con los diferentes constructos de CAR se expusieron 1:1 a o bien células SupTI o bien células SupT1.CD19 en presencia de diferentes concentraciones de tetraciclina. Se tomaron muestras del sobrenadante 48 horas después de la exposición. También se tomaron muestras del sobrenadante de fondo (células T solas) y máximo (células T estimuladas con PMNionomicina). Se midió el interferón-gamma en los sobrenadantes mediante ELISA (figura 13). Las células CAR T "clásicas" se activaron por SupT1.CD19 independientemente de la tetraciclina. Las células T TetCAR se activaron por células SupT1.CD19 pero la activación se inhibió por la tetraciclina. Las células T NT y TetCAR de control respondieron a las células SupT1.CD19.

Ejemplo 4 - Destrucción de células diana

Después del estudio de liberación de interferón-gamma descrito en el ejemplo 3, se demostró la destrucción de células diana usando un ensayo de liberación de cromo. Se cargaron células SupT1 y SupT1.CD19 con 51Cr y se incubaron con células T de control y TetCAR durante 4 horas en presencia o ausencia de tetraciclina. Se determinó la lisis de células diana contando 51Cr en el sobrenadante. Los resultados se muestran en la figura 14. Se mostró que las células T Tet CAR lisaron las células diana SupT1.CD19 solo en ausencia de tetraciclina.

Ejemplo 5 - Producción de un anticuerpo de un solo dominio que se une a minociclina

Se funcionalizó la minociclina mediante la adición de un grupo SH unido a un espaciador de hexilo. La funcionalización se produjo en el grupo ácido ubicado en la posición 10 de la molécula de minociclina. Se conjugó 10-(6-mercaptohexil)-minociclina a KLH y BSA usando química de acoplamiento de maleimida convencional. Se inmunizaron llamas los días 0, 7, 14 y 21 con 25 mg de conjugado de KLH - minociclina. Se recogió suero antes de cada inyección para seguir la respuesta inmunitaria contra el inmunógeno. El día 31, se recogió sangre anticoagulada para el aislamiento de linfocitos. El aislamiento de IgG3 del suero del día 31 se dializó frente a NH4HCO₃0,1 M, pH 8,0, antes de que se añadiera Staphylococcus aureus a una proporción de 1/50 (p/p). Después de la incubación durante 2 h y la diálisis frente a PBS, se recuperó VHH policlonal monomérico en la fracción no retenida de una columna de proteína A HiTrap. La concentración de anticuerpo de un solo dominio (sdAb) se determinó espectrofotométricamente.

Placas de 96 pocillos Maxisorb (Nunc) se recubrieron durante la noche a 4°C con una concentración de BSA-minociclina 3 |jg/ml en ^pB^sy BSA 3 ug/ml sola en PBS. Se bloquearon las placas con caseína al 1% (p/v) en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. Después de la incubación con o bien el suero total diluido o bien las subclases de IgG purificadas, se detectó sdAB unido con anticuerpo policlonal IgG-HRP de camélido frente a conejo.

Se tomó una muestra de sangre de aproximadamente 200 ml de una llama inmunizada con KLH-(10-6 mercaptohexil)minociclina. Se obtuvo una población de linfocitos enriquecida por medio de centrifugación en gradiente discontinuo de Ficoll. A partir de estas células, se aisló el ARN total mediante extracción con tiocianato de guanidio. Después de la síntesis de ADNc de primera hebra, se amplificaron mediante PCR fragmentos de ADN que codifican fragmentos de HC-V y parte de la región de bisagra larga o corta. El conjunto amplificado de secuencias de anticuerpos dAb se digirió usando las enzimas de restricción Pstl y Notl, y se ligaron en el vector de fagémido pSOS11.

Tras la construcción de la biblioteca de fagémidos de dAb, se determinó que tenían un tamaño estimado de 5x108 clones únicos.

Se expresaron anticuerpos de un solo dominio en fago después de la infección con M13K07. La biblioteca de fagos se sometió a cribado para determinar la presencia de agentes de unión respectivamente en BSA-(10-6 mercaptohexil)minociclina en fase sólida (10 jg/pocillo) en los pocillos de placas de microtitulación o en disolución con BSA-(10-6-mercaptohexil)minociclina biotinilada 100 nM en combinación con perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina.

Tras dos rondas de cribado, se sometió a ensayo el enriquecimiento de la biblioteca de fagos completa frente a la BSA-minociclina y BSA sola mediante ELISA de fagos. Se observó enriquecimiento positivo después del cribado 1 que se mantuvo después de un segundo cribado. Se secuenciaron 40 clones de fagos individuales aislados de las selecciones para determinar secuencias de sdAB específicas.

Las secuencias de CDR de 14 dAb específicos de minociclina se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

Los genes de sdAB secuenciados se subclonaron en un vector que codifica una etiqueta de H6 doble seguida por un codón de terminación. Se usó un cultivo durante la noche de células BL21 recién transformadas con el plásmido apropiado para inocular 1 I de medio Terrific Broth que contenía ampicilina 100 |jg/ml y glucosa al 0,1%. Después del crecimiento a 37°C, hasta que la densidad óptica alcanzó 0,75-1,0, se indujo la expresión mediante la adición de IPTG 1 mM. El crecimiento continuó durante 16 h adicionales a 28°C. Después de recoger las células mediante centrifugación, se preparó la fracción periplásmica que contenía el sdAb. Se purificaron las proteínas de fusión que contenían etiqueta de His mediante cromatografía en Ni-NTA y Superdex-75. Se determinó la concentración de proteína del sdAb espectrofotométricamente usando sus coeficientes de extinción calculados.

El análisis cinético de las interacciones entre la minociclina y los sdAb se midió mediante BIAcore. Los fragmentos de VHH individuales se inmovilizaron sobre una capa de dextrano carboximetilado usando química de ECD/NHS. Para la determinación de las constantes cinéticas, se aplicaron disoluciones diluidas de BSA-minociclina (10-150 nM en PBS) sobre la superficie del sensor. Se registraron las trazas de unión para al menos cinco concentraciones diferentes por duplicado. Se calcularon las constantes de velocidad de asociación y disociación usando un modelo de unión de Langmuir o cinética de estado estacionario.

Ejemplo 6 - Selección de un péptido para su uso en el componente de señalización intracelular.

Con el fin de identificar un péptido que se une al sdAb específico de minociclina, y que elimina por competición la minociclina, se criba una biblioteca de fagos peptídica (Ph.D 12 New England biolabs) para determinar la presencia de agentes de unión peptídicos en sdAb específico de minociclina biotinilada sobre perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Se usa minociclina conjugada con BSA en concentraciones crecientes para eluir el fago que contiene péptidos y, así, enriquecer las poblaciones que compiten con la minociclina.

Ejemplo 7 - Generación de un sistema de señalización de CAR alterable por metotrexato.

Se ha descrito previamente un anticuerpo de un solo dominio contra metotrexato (Fanning y Horn (2011) Protein Science 20:1196-1207). Las secuencias del agente de unión se usan para la presentación en fago de péptidos para generar un péptido de interacción tal como se describe en el ejemplo 6.

Se desarrolló un sistema de señalización de CAR usando el agente de unión de sdAb anti-metotrexato en el componente receptor y un péptido de interacción en el componente de señalización intracelular y expresado en una célula.

Se generó una población de péptidos específicos para el agente de unión de sdAb anti-metotrexato usando presentación en fago de péptidos. En resumen, se capturó dAb anti-metotrexato purificado con una etiqueta de His6 sobre Dynabeads para el aislamiento y la extracción de la etiqueta His. Se capturaron perlas con dAb y se transfirieron a tampón de bloqueo (BSA al 2%). También se bloquearon las perlas no conjugadas. Se añadió una representación de 100 veces de la biblioteca de presentación en fago a perlas bloqueadas en tampón de bloqueo para eliminar el fago no específico. Las perlas bloqueadas se capturaron por medio de un imán y el sobrenadante se transfirió a perlas conjugadas con dAb para la selección.

Se eluyeron fagos específicos de CDR mediante adición de metotrexato a una concentración de 10 veces la afinidad estimada del respectivo dAb por su diana. Se amplificaron fagos específicos mediante infección de E. coli ER2738 antes de la precipitación. El número de fagos eluidos y amplificados se tituló usando siembra en placa de diluciones en serie de E. coli infectada y recuento posterior.

El protocolo se repitió 3-4 veces para enriquecer la población de péptidos específicos para dAb-CDR.

Las secuencias de aminoácidos de cinco péptidos que compiten con metotrexato se muestran como SEQ ID No. 6 a 10 en la tabla 3.

Tabla 3

Luego se generó un constructo para la coexpresión de un gen suicida (RQR8); un componente de señalización con un dominio de unión a antígeno específico de CD19y un dAb anti-metotrexato; y un componente de señalización intracelular que comprende un péptido de interacción con dAb y CD3 zeta (figura 16A).

El sistema de CAR expresado por el constructo se muestra en la figura 16B

Entonces se investigó la supresión de señales y la perdurabilidad con metotrexato.

Se transdujeron células BW5 con controles o constructos basados en dAb de metotrexato. Se tiñeron las células con 7-AAD y anti-h-Fc para evaluar la eficiencia de la transducción.

Las células se separaron en una población de células individuales y luego la población negativa para 7-AAD (células vivas). Las células teñidas positivamente para Fc humano, dentro de las células vivas, corresponden a las células transducidas que expresan los constructos de metotrexato.

Se cocultivaron células BW5 con constructos de CAR divididos con células SupT1 que expresan CD19 o células SupT1 no transducidas a una proporción de 1:1. La secreción de la citocina IL-2 se midió después de 48 horas en presencia o ausencia de metotrexato.

Ejemplo 8 - Generación de un sistema de señalización de CAR alterable por cafeína.

Se generó un anticuerpo de un solo dominio que se une específicamente a cafeína mediante inmunización de llamas, usando una metodología similar a la descrita en el ejemplo 5.

La secuencia de aminoácidos de dAb frente a cafeína se muestra a continuación como SEQ ID No. 11. Las tres CDR están subrayadas y en negrita.

Secuencia ID No. 11 EVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCTASGRTGTIYSMAWFRQAPGKEREFLATVGWSSGITYY MDSVKGRFTISRDNAKNSAYLQMNSLKPEDTAVYYCTATRAYSVGYDYWGQGTQVTVSS

Se generó una población de péptidos específicos para el agente de unión de sdAb anti-cafeína usando presentación en fago de péptidos, usando el método descrito en el ejemplo 6.

Las secuencias de aminoácidos de cinco péptidos que compiten con cafeína se muestran como SEQ ID No. 12 a 16 en la tabla 4.

Tabla 4

Entonces se investigó la supresión de señales y la perdurabilidad con cafeína.

Se transdujeron células BW5 con controles o constructos basados en dAb de cafeína. Se tiñeron las células con 7-AAD y anti-h-Fc para evaluar la eficiencia de la transducción.

Las células se separaron en una población de células individuales y luego la población negativa para 7-AAD (células vivas). Las células teñidas positivamente para Fc humano, dentro de las células vivas, corresponden a las células transducidas que expresan los constructos de cafeína.

Se cocultivaron células BW5 con constructos de CAR divididos con células SupT1 que expresan CD19 o células SupT1 no transducidas a una proporción de 1:1. La secreción de la citocina IL-2 se midió después de 48 horas en presencia o ausencia de cafeína.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende;

2. Un sistema de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende;

(i) un componente receptor que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un segundo dominio de unión que se une al agente de unión de un solo dominio del componente de señalización intracelular; y en donde, la unión de los dominios de unión primero y segundo se ve alterada por la presencia de un agente, de manera que, en ausencia del agente, el componente receptor y el componente de señalización se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno da como resultado señalización a través del dominio de señalización; mientras que, en presencia del agente, el componente receptor y el componente de señalización no se heterodimerizan y la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno no da como resultado señalización a través del dominio de señalización, en donde el primer dominio de unión no es TetR.

3. Un sistema de CAR según la reivindicación 1 o 2, en donde el agente es tetraciclina, doxiciclina o minociclina.

4. Un sistema de CAR según cualquier reivindicación anterior, en donde el agente de unión de un solo dominio comprende un anticuerpo de dominio.

5. Un sistema de CAR según cualquier reivindicación anterior, en donde el segundo dominio de unión comprende un péptido que se une al agente de unión de un solo dominio del primer dominio de unión, unión que se inhibe competitivamente por el agente.

6. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un sistema de señalización de CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el componente receptor y componente de señalización se coexpresan por medio de un péptido de autoescisión que se escinde entre el componente receptor y el componente de señalización después de la traducción.

7. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 6.

8. Una célula que expresa un componente receptor y un componente de señalización tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Una célula según la reivindicación 8, que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 6 o un vector según la reivindicación 7.

10. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células según la reivindicación 8 o 9.

11. Una composición farmacéutica según la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad.

12. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 11, que implica monitorizar la actividad tóxica en el sujeto y comprende la etapa de administrar un agente para su uso en el sistema de señalización de CAR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 al sujeto para reducir los efectos tóxicos adversos.

13. Un kit que comprende un primer ácido nucleico o vector que codifica un componente receptor tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un segundo ácido nucleico o vector que codifica un componente de señalización intracelular tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

14. Un método ex vivo para preparar una célula según la reivindicación 8 o 9, que comprende la etapa de introducir una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 6, o un vector según la reivindicación 7, o un kit según la reivindicación 13 en una célula.