ES2943567T3 - Solución farmacéutica que comprende clorhidrato de dopamina - Google Patents

Abstract

La presente invención está dirigida a una solución farmacéutica que comprende clorhidrato de dopamina, en la que se disuelve en solución salina y la solución tiene un pH entre 5,5 y 7. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Solución farmacéutica que comprende clorhidrato de dopamina

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a una solución farmacéutica que comprende dopamina para su uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson, en donde dicha solución farmacéutica se mantiene en condiciones anaeróbicas desde su formulación hasta su administración.

Estado de la técnica

La enfermedad de Parkinson (PD) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que afecta al sistema nervioso, en particular el sistema nigroestriatal que comprende neuronas dopaminérgicas. La pérdida de dopamina en el cuerpo estriado, como resultado de la degeneración neuronal progresiva en la parte compacta de la sustancia negra (SNpc), es responsable de los síntomas motores.

El tratamiento farmacológico de la enfermedad de Parkinson puede dividirse en tratamiento neuroprotector y sintomático. El tratamiento neuroprotector de la enfermedad de Parkinson se basa en la protección de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra humana y el cuerpo estriado del complejo proceso degenerativo que provoca la muerte celular prematura y la reducción de dopamina. En la práctica, sin embargo, casi todos los tratamientos disponibles son de naturaleza sintomática y no parecen ralentizar o revertir el curso natural de la enfermedad. De hecho, no hay tratamiento neuroprotector disponible en el mercado de momento.

Los numerosos tratamientos sintomáticos, por tanto, se han centrado en la atenuación de esta deficiencia de dopamina (Chauduri et al., 2009; Devos et al. 2013) (1, 2).

Como la dopamina no cruza la mucosa digestiva o la barrera hematoencefálica, su precursor lipófilo L-dopa (Levodopa) se ha desarrollado como medicamento administrado por vía oral para aliviar los síntomas de la enfermedad de Parkinson.

Sin embargo, numerosos inconvenientes farmacocinéticos están relacionados con el uso de L-dopa, y desencadenan la aparición de complicaciones relacionadas con L-dopa (LDRC). La L-dopa tiene una corta semivida en plasma y provoca estimulación dopaminérica pulsátil. En condiciones normales, las neuronas dopaminérgicas en la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) están continuamente activas y la concentración de dopamina en el cuerpo estriado se mantiene a un nivel relativamente constante (Miler y Abercrombie, 1999; Venton et al., 2003; Olanow et al., 2006) (3-5). En el estado reducido de dopamina, sin embargo, dosis orales intermitentes de levodopa inducen estimulación discontinua de los receptores estriatales de dopamina y después de tratamiento a largo plazo contribuyen a la disfunción de las rutas dopaminérgicas que dan lugar al desarrollo de complicaciones motoras (Fahn y el grupo de estudio de Parkinson, 2005; grupo de estudio de Parkinson, 2009) (6-7). Esta administración oral pulsátil que da lugar a periodos alternativos de subdosis y sobredosis podría contribuir al empeoramiento de la progresión de la enfermedad (Devos et al., 2013) (2). De hecho, la administración oral intermitente de L-dopa no puede restablecer la neurotransmisión dopaminérica nigroestriatal continua.

La administración dopaminérgica continua podría ser más fisiológica y podría evitar las altas fluctuaciones en el nivel de dopamina que inducen consecuencias nocivas.

Algunos tratamientos, por tanto, se han centrado en una administración dopaminérgica continua. Sin embargo, la administración directa de un gel de levodopa al duodeno (Olanow et al., 2014; Devos et al., 2009) (8, 9) o infusiones subcutáneas de apomorfina, un agonista de dopamina (Manson et al., 2002; Drapier et al., 2012) (10-11), han mostrado eficacia moderada para reducir las LDRC y una escasa ergonomía debido a la bomba externa (Syed et al., 1998; Devos et al., 2009) (9, 12). El uso de agonistas de dopamina de acción prolongada (Rascol et al., 2000) (13), o administración de L-dopa con un inhibidor de la catecol-O-metiltransferasa (COMTI) para prolongar la semivida de eliminación de la dopamina (Stocchi et al., 2010) (14) no lograron mejorar significativamente las LDRC graves. También se ha estudiado la distribución espacial de dopamina y metotrexato durante la microperfusión intracerebral continua (Sendelbeck y Urquhart, 1985) (15). La infusión se hizo en los tejidos cerebrales, más particularmente en la región talámica media del diencéfalo, con una minibomba osmótica Alzet 2001 llena de clorhidrato de dopamina y metotrexato de sodio disuelto en líquido cefalorraquídeo artificial desoxigenado que contiene fluoresceína sódica. La minibomba osmótica se llenó de la solución al menos 16 h antes del implante. Sin embargo, en estas condiciones, el oxígeno necesariamente penetrará en la bomba y hará que la dopamina sea tóxica. Además, el estudio se hizo solamente para analizar la difusión de diferentes fármacos de acuerdo con su solubilidad lipídica y polaridad, sin ninguna intención terapéutica.

La liberación continua de dopamina desde una matriz mesoporosa de TiO² se ha divulgado en el documento MX 2012012559. La dopamina se incluye en la matriz que se produce mediante un método de sol-gel. Sin embargo, dicha matriz debe implantarse en el núcleo caudado del cerebro, siendo dicho implante invasivo y no conveniente en absoluto para el paciente. Además, esta liberación continua de dopamina desde la matriz mesoporosa posibilita solamente el control de los síntomas de la enfermedad de Parkinson, sin producir ningún efecto neuroprotector. Otra estrategia terapéutica se refiere a una infusión continua de dopamina directamente al cuerpo estriado o el ventrículo lateral en los animales.

Yebenes et al. (1987) (16) y Yebenes et al. (1988) (25) evaluaron el efecto de la dopamina o agonistas de dopamina mediante infusión intracerebroventricular en ratas con lesiones unilaterales de la ruta nigroestriatal y monos tratados con MPTP. La infusión se hizo en el ventrículo lateral cerebral ipsilateral a la lesión con un catéter conectado a una bomba Alzet 2001 llena de dopamina en diferentes vehículos tales como metabisulfito de sodio. Se usó metabisulfito de sodio para reducir la autooxidación de la dopamina. Se observó que los síntomas motores disminuían y que las concentraciones intracerebrales de dopamina aumentaban.

Sin embargo, se indujo rotación contralateral por infusión de dopamina o agonistas de dopamina con un pico 2 días después del implante y una disminución lenta durante un periodo de 5 días de infusión. Este efecto muestra que la infusión continua induce un efecto de taquifilaxia, respaldado por la reducción en el número de receptores de D^a en animales infundidos. Esto significa que el tratamiento induce un fenómeno de adaptación con una pérdida progresiva de eficacia. Por tanto, se requiere aumentar progresivamente la dosificación de dopamina para mantener una eficacia máxima.

Además, se observó un problema de oxidación. La autooxidación de dopamina induce la formación de quinonas y radicales libres que son muy tóxicos para las células. Esta autooxidación de dopamina induce la oxidación de los tejidos circundantes y las paredes celulares. Se ha mostrado que esta oxidación induce neurotoxicidad y, como consecuencia, podría actuar sobre el empeoramiento de la enfermedad de Parkinson. Este problema de autooxidación se redujo, pero permaneció cuando la dopamina se disolvió en metabisulfito de sodio. Además, el metabisulfito de sodio induce problemas de tolerancia tales como reacción alérgica a los sulfitos. Además, se ha mostrado que se induce un empeoramiento de la degeneración neuronal por el uso de sulfito en neuronas piramidales (Akdogan et al., 2011) (17). Esto sugiere una posible toxicidad de metabisulfito de sodio en modelo de enfermedad de Parkinson.

Por último, pero no menos importante, el tratamiento estudiado en Yebenes et al. fue solamente un tratamiento sintomático y no pudo conseguir una protección de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra humana y en el cuerpo estriado.

Por tanto, aún hay una necesidad en la técnica de un tratamiento de la enfermedad de Parkinson que no presente los inconvenientes mencionados anteriormente. Más particularmente, hay una necesidad de una composición que permita un tratamiento neuroprotector de la enfermedad de Parkinson y no solamente un tratamiento sintomático. También hay una necesidad de una composición que sea, por un lado, estable y no presente problemas de oxidación que den lugar a neurodegeneración aumentada de la sustancia negra y efectos secundarios relacionados y, por otro lado, que no induzca taquifilaxia. Finalmente, hay una necesidad de una composición terapéutica que no proporcione implante altamente invasivo y complicado.

Objeto de la invención

Los autores de la invención ahora han descubierto que los inconvenientes anteriores pueden superarse cuando la dopamina está comprendida en una solución farmacéutica que se mantiene en condiciones anaeróbicas desde su formulación hasta su administración.

La invención, por tanto, se refiere a una solución farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1. Esta solución farmacéutica es útil en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en donde dicha solución farmacéutica se mantiene en condiciones anaeróbicas desde su formulación hasta su administración.

Por "en condiciones anaeróbicas desde su formulación hasta su administración" se entiende todas las condiciones necesarias para la prevención de la oxidación o autooxidación de la dopamina hasta su administración al sitio deseado de administración, típicamente durante la formulación, acondicionado/almacenamiento (si lo hay) y administración. Esto significa que la formulación, almacenamiento (si lo hay) y uso, incluyendo la administración al sitio deseado de administración, de la solución farmacéutica de la invención se realizan en un entorno esencialmente libre o libre de oxígeno, es decir, que contiene menos de un 5 % de oxígeno, preferiblemente menos de un 2 % de oxígeno, más preferiblemente menos de un 1 % de oxígeno, más preferiblemente menos de un 0,5 % de oxígeno, más preferiblemente aproximadamente un 0 % de oxígeno. Además, la solución farmacéutica de la invención por sí misma está libre de oxígeno, lo que significa que contiene aproximadamente un 0 % de oxígeno.

De hecho, la presente invención se basa en los hallazgos inesperados de que, cuando la dopamina está en una solución farmacéutica que se mantiene en condiciones anaeróbicas desde su formulación hasta su administración, puede tratar la enfermedad de Parkinson restableciendo eficazmente la actividad motora normal sin inducir taquifilaxia. Además, se observa autooxidación solamente ligera cuando se usa dopamina en condiciones anaeróbicas como se describe anteriormente.

Además de estos efectos sintomáticos, se ha descubierto ventajosamente que, en estas condiciones, la dopamina induce de forma eficaz la neuroplasticidad, incluyendo al menos un efecto neuroprotector, a neuronas en el cuerpo estriado y en la SNpc. Dicho efecto neuroprotector a las neuronas en el cuerpo estriado o en la SNpc no puede inducirse cuando la dopamina se formula y/o se administra de forma aeróbica.

Además, estos efectos sorprendentes se pueden obtener cuando la dopamina está en una solución farmacéutica que se mantiene en condiciones anaeróbicas desde su formulación hasta su administración, incluso sin agente conservante. El uso de metabisulfito de sodio, por tanto, no es necesario y se superan los inconvenientes relacionados con este compuesto.

El término "neuroplasticidad" (o plasticidad cerebral) se refiere a la capacidad de cerebro de reorganizarse a sí mismo formando nuevas conexiones neurales. En la presente invención, neuroplasticidad significa que el número de neuronas es mayor cuando se aplica el tratamiento de la invención sin usar tratamiento para la enfermedad de Parkinson. La neuroplasticidad comprende neuroprotección, neurogénesis (es decir, formación de neuronas a partir de células madre), cambio de fenotipo a neuronas dopaminérgicas (es decir, a partir de neuronas no dopaminérgicas) y/o cambios de plasticidad tales como sinaptogénesis y dendritogénesis.

El término "neurogénesis" se refiere a la producción de nuevas neuronas a partir de células madre.

Se ha mostrado previamente que la proliferación de progenitores se altera en la zona subventricular (SVZ) y en la zona subgranular (SGZ) de pacientes afectados por enfermedad de Parkinson, supuestamente como consecuencia de la desnervación dopaminérgica (Hoglinger et al. 2007) (18). De hecho, la reducción experimental de dopamina ha mostrado disminuir la proliferación de progenitores tanto en la SVZ como en la SGZ en roedores. En el modelo de ratón de 6-hidroxidopamina de enfermedad de Parkinson, la proliferación en la SVZ se redujo en aproximadamente un 40 % (Hoglinger et al. 2007) (18).

Por "efecto neuroprotector" o "neuroprotección" se entiende conservación de la estructura y/o función neuronal de pacientes afectados por enfermedad de Parkinson en comparación con pacientes que no están afectados por enfermedad de Parkinson. Preferiblemente, se refiere a la conservación del número de neuronas en el cuerpo estriado y/o en la parte compacta de la sustancia negra de pacientes afectados por enfermedad de Parkinson en comparación con pacientes que no están afectados por enfermedad de Parkinson.

El término "tratamiento", "tratar" y términos derivados significan revertir, aliviar, detener o prevenir la enfermedad de Parkinson y/o al menos un síntoma ligado a la enfermedad de Parkinson. El término "tratamiento" también se refiere a un tratamiento profiláctico que puede retardar la aparición de la enfermedad de Parkinson.

La solución farmacéutica de la invención es farmacéuticamente aceptable, es decir, no produce una reacción adversa, alérgica u otra reacción imprevista cuando se administra a un paciente.

Por "dopamina" se entiende la molécula dopamina en forma de su base libre (4-(2-aminoetil)benceno-1,2-diol), así como sus sales farmacéuticas aceptables, tal como, por ejemplo, su clorhidrato.

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a cualquier sal obtenida de dopamina, teniendo dicha sal una actividad biológica ligeramente similar en comparación con la actividad biológica de dicho compuesto de la invención. La dopamina es una amina y puede formar sales de adición de ácidos. Las sales de adición de ácidos adecuadas se forman a partir de ácidos que forman sales atóxicas. Ejemplos de dichos ácidos son ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido acético, ácido fumárico, ácido succínico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido tartárico y ácido maleico, de los que el ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y ácido acético son particularmente preferidos. En la presente invención, la dopamina está en forma de clorhidrato de dopamina.

La solución farmacéutica de la invención está libre de agente conservante.

Por "agente conservante" se entiende todas las moléculas, péptidos, sales u otros compuestos que tienen un efecto antioxidante o que son esenciales para conservar la dopamina y otros compuestos que constituyen la solución farmacéutica de la invención.

La solución farmacéutica de la invención se formula para administración parenteral.

La solución farmacéutica contiene un vehículo que es farmacéuticamente aceptable para una formulación que puede inyectarse. Estas son soluciones salinas estériles, isotónicas (que consisten en fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y mezclas de dichas sales), o solución salina fisiológica. Cuando se disuelve en solución salina (o solución de cloruro de sodio) el clorhidrato de dopamina obtenido de este modo aporta una solución ácida estable, que tiene preferiblemente un pH comprendido entre 5,5 y 7, dependiendo de la dilución. La solución farmacéutica de la invención está en forma de una solución acuosa.

Con respecto a la formulación de la solución de dopamina, la dopamina puede proporcionarse, por ejemplo, directamente en forma de una solución que se administra al paciente. También es posible proporcionar dopamina sólida, por ejemplo, como polvo, que se disuelve en un disolvente adecuado especialmente en disolvente acuoso para formar la solución poco antes de la administración. Preparar la solución de dopamina justo o poco antes de la administración reduce más el riesgo de oxidación y tiene la ventaja de una vida útil más larga de la dopamina sólida en comparación con soluciones de dopamina.

La formulación de la solución farmacéutica que comprende clorhidrato de dopamina que está libre de oxígeno, puede obtenerse por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por desoxigenación con gas inerte tal como nitrógeno, freones, argón, xenón, (36)-criptón o neón. Para este fin, un rociado de una solución acuosa, por ejemplo, en una solución acuosa que porta sal, en que se ha disuelto previamente dopamina, puede realizarse en atmósfera inerte como se describe en el documento FR0114796.

La forma (especialmente la concentración) de la solución farmacéutica, la vía de administración, la dosificación y la pauta dependen evidentemente de la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.

La solución farmacéutica de la presente invención puede usarse para el tratamiento de cualquier organismo vivo, más especialmente un mamífero y más particularmente un ser humano y más particularmente un ser humano de más de 45 años de edad, más preferiblemente más de 65 años de edad.

De forma ventajosa, dicha solución farmacéutica es adecuada para administración cerebral intraventricular. Más específicamente, dicha solución farmacéutica está adaptada para administrarla al ventrículo lateral derecho, preferiblemente cerca del agujero interventricular, de modo que la solución farmacéutica puede administrarse al tercer ventrículo.

De hecho, los autores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que una administración cerca del agujero interventricular, en particular, colocando el catéter en el ventrículo lateral derecho cerca del agujero interventricular, posibilita que la solución farmacéutica se administre directamente al tercer ventrículo y permite la concentración bilateral de dopamina en el cuerpo estriado a través de las paredes del ventrículo y la zona subventricular (SVZ). Esta administración reduce considerablemente las complicaciones motoras, mientras que la dopamina se concentra lateralmente en la región frontal y el núcleo caudado cuando se administra a la región frontal del cerebro, lo que sería menos ventajoso con respecto a las complicaciones motoras y el desarrollo de psicosis. Por tanto, la presente invención también proporciona una solución farmacéutica como se describe anteriormente, en donde dicha solución farmacéutica está adaptada para administrarla en un ventrículo cerebral, preferiblemente en el ventrículo lateral derecho, preferiblemente cerca del agujero interventricular.

Para este fin y para realizar la administración en condiciones anaeróbicas, la solución farmacéutica aceptable de acuerdo con la invención está adaptada para administrarla con una bomba anaeróbica.

La administración de la solución de la invención en condiciones anaeróbicas también puede realizarse por cualquier otro método conocido por los expertos en la materia.

Por "bomba anaeróbica" se entiende cualquier dispositivo que posibilite una liberación controlada de la solución de la invención y que no degrade la anaerobia de dicha solución exponiéndola a oxígeno. Típicamente, dicha bomba debe ser compatible con la presente invención, y en particular puede administrar anaeróbicamente una solución de dopamina al sitio deseado de administración.

Por ejemplo, una bomba SYNCHROMED II (comercializada por Medtronic), una bomba IPRECIO (comercializada por Iprecio) o una bomba ALZET (comercializada por Alzet) puede usarse para este propósito. La bomba SYNCHROMED II (comercializada por Medtronic) es adecuada para seres humanos y, por tanto, puede usarse preferiblemente en un paciente humano. Esta bomba permite condiciones anaeróbicas completas y una estabilidad excelente de la dopamina. De hecho, los autores de la invención han mostrado que la dopamina en condiciones anaeróbicas era estable durante al menos un mes.

Por tanto, el uso de estas bombas reduce extremadamente el riesgo de oxidación o autooxidación de dopamina. El equilibrio de beneficio/riesgo para el uso de dopamina en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson era negativo antes del desarrollo de estas bombas anaeróbicas.

Las dosis usadas para la administración pueden adaptarse como una función de diversos parámetros, y en particular como una función del modo de administración usado, de la patología pertinente, o como alternativa de la duración deseada de tratamiento.

La presente invención también proporciona una solución farmacéutica y su uso como se describe anteriormente, en donde dicha solución farmacéutica se administra continuamente con variaciones de dosis. Preferiblemente, dicha solución farmacéutica se administra con una dosis diurna predominante o con una dosis diurna exclusiva.

De hecho, los autores de la presente invención han descubierto que este protocolo de administración reduce, e incluso evita, la taquifilaxia y permite una eficacia a largo plazo del tratamiento sin aumentar el riesgo de desarrollo de psicosis inducido por una dosis nocturna excesiva.

Dicho protocolo de administración puede realizarse fácilmente usando una bomba anaeróbica como se describe anteriormente, por ejemplo, una bomba SYNCHROMED II. Por "administrada continuamente" se entiende una administración de la solución farmacéutica de la invención en un periodo continuo, el día y la noche completos, es decir, durante 24 horas, o solamente durante unas pocas horas.

"Dosis diurna predominante" significa que la dosis nocturna es menor que la dosis diurna, preferiblemente al menos un 25 % menor que la dosis diurna, más preferiblemente al menos un 50 % menor que la dosis diurna, más preferiblemente al menos un 70 % menor que la dosis diurna, más preferiblemente al menos un 80 % menor que la dosis diurna, más preferiblemente al menos un 90 % menor que la dosis diurna.

Por "una dosis diurna exclusiva" se entiende que no hay dosis nocturna.

En una realización particular, la solución farmacéutica como se describe anteriormente se administra con la siguiente pauta posológica:

- una dosis diurna continua y estable,

- un bolo administrado en la mañana, y

- opcionalmente, al menos un bolo cuando se requiera, y/o

- opcionalmente, una dosis nocturna continua y estable menor que la dosis diurna, preferiblemente al menos un 25 % menor que la dosis diurna, más preferiblemente al menos un 50 % menor que la dosis diurna, más preferiblemente al menos un 70 % menor que la dosis diurna, más preferiblemente al menos un 80 % menor que la dosis diurna, más preferiblemente al menos un 90 % menor que la dosis diurna.

Por "bolo" se entiende una sola dosis relativamente grande de la solución farmacéutica de la invención que se administra para conseguir un efecto inmediato. Preferiblemente, el bolo es de la misma manera que se describe anteriormente. Un bolo se administra en la mañana y opcionalmente cuando se requiera, es decir, cuando el paciente necesita un efecto inmediato del tratamiento.

Los autores de la invención han descubierto que este protocolo de administración permite la determinación de una dosis eficaz mínima que puede variar de un paciente a otro. Los síntomas motores y no motores de la enfermedad de Parkinson se tratan sin ninguno de los efectos secundarios (discinesias, fluctuaciones, psicosis...), que habitualmente se producen con la administración periférica de tratamientos dopaminérgicos (es decir, administración oral pulsátil de L-dopa, administración subcutánea de apomorfina, administración yeyunal de un gel de L-dopa) y los riesgos de autooxidación observados con administración central (intracerebroventricular) de dopamina aeróbica. Estas complicaciones o efectos secundarios pueden detenerse o incluso prevenirse si el tratamiento con dopamina anaeróbica de acuerdo con la invención se administra antes de la aparición de dichas complicaciones. Además, el uso de esta dosis eficaz mínima produce al menos neuroprotección, y finalmente incluso neurorrestitución. Típicamente, el uso de una bomba anaeróbica permite determinar una dosis eficaz mínima que se adapta a cada caso.

Por una "dosis eficaz mínima" se entiende una cantidad suficiente para que sea eficaz, a una relación de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total lo decidirá el médico a cargo dentro del alcance de criterio médico razonable. La dosis eficaz mínima específica para cualquier paciente particular que lo necesite dependerá de una diversidad de factores incluyendo la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente, el tiempo de administración, la vía de administración, la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o coincidentes con el mismo y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, es bien conocido en las habilidades de la técnica que se empieza con dosis del compuesto a niveles menores que los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y que se aumenta gradualmente la dosificación hasta que se consigue el efecto deseado. Las dosis también pueden variar de acuerdo con la dopasensibilidad del paciente. Por ejemplo, se ha observado previamente una relación de 1/100 a 1/300 entre la dosis requerida administrada por vía oral y la dosis administrada con una vía intracerebroventricular (ICV) (por ejemplo, morfina, baclofeno).

En la presente memoria también se proporciona una solución farmacéutica como se define en la reivindicación 1 para su uso en un método para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, que comprende administrar dopamina a un paciente que lo necesita, en donde la dopamina se formula, acondiciona y administra de forma anaeróbica.

Descripción de las figuras

Figura 1: Estabilidad de la solución de la invención a lo largo del tiempo en bombas anaeróbicas (A: SYNCHROMED II, B: ALZET 2001)

Figura 2: Restablecimiento de la deficiencia motora en ratones MPTP después de 7 días de infusión intracerebroventricular de dopamina o tratamiento oral con L-dopa. Las dosis de dopamina se expresan en pg/día y L-dopa en mg/kg/día. Los datos se expresan en medias de porcentaje ± ETM de ratones con solución salina (n = 8­ 15). * frente a ratones con solución salina, # frente a ratones MPT^p sin tratar, p <0,05 (ANOVA unidireccional y ensayos a posteriori de LSD de Fisher).

A: velocidad media

B: distancia cubierta en la pista durante 10 min.

Figura 3: Modificaciones del contenido de neurotransmisor en el cuerpo estriado de ratones MPTP después de 7 días de infusión intracerebroventricular de dopamina o tratamiento oral con L-dopa. Dopamina, acetato de dihidrofenilo (DOPAC) y ácido homovainíllico (HVA) (A, B), serotonina (5HT) y acetaldehído de hidroxiindol (5HIA) (C, D) y noradrenalina (NA) (E, F) en el cuerpo estriado ipsilateral para la infusión con bomba de dopamina (A, C, E) y cuerpo estriado contralateral (B, D, F). Las dosis de tratamiento con dopamina se expresan en pg/día y L-dopa en mg/kg/día. Los datos se expresan en medias de porcentaje ± ETM de ratones con solución salina (n = 8). * frente a ratones con solución salina, # frente a ratones MPTP sin tratar, p <0,05 (ANOVA unidireccional y ensayos a posteriori de LSD de Fisher).

Figura 4: Restablecimiento de la tinción TH-ir en SNpc y cuerpo estriado de ratones MPTP después de 7 días de infusión intracerebroventricular de dopamina con dopamina preparada y administrada en condiciones anaeróbicas, dopamina preparada y administrada en condiciones aeróbicas, o con tratamiento oral con L-dopa. Las dosis de dopamina se expresan en pg/día y L-dopa en mg/kg/día. Los datos se expresan en medias de porcentaje ± DT de ratones con solución salina (n = 10). "A-dopamina" significa dopamina preparada y administrada en condiciones anaeróbicas, "O²-dopamina" significa dopamina preparada y administrada en condiciones aeróbicas. * significa diferencia significativa entre las condiciones designadas y las condiciones de solución salina. # significa diferencia significativa entre las condiciones designadas y las condiciones de MPTP. p <0,05 (ANOVA unidireccional y ensayos a posteriori de LSD de Fisher).

A: Recuento de neuronas TH-ir en SNpc

B: Densidad óptica de TH-ir en el cuerpo estriado dorsal

Descripción detallada de la invención

Ejemplo 1

El solicitante llevó a efecto su invención usando ratones MPTP. Estos ratones se intoxicaron con MPTP para reproducir las mismas complicaciones motoras que las inducidas por enfermedad de Parkinson. MPTP es una neurotoxina (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) que provoca síntomas permanentes de enfermedad de Parkinson al destruir las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del cerebro.

Se produjeron diferentes soluciones de la invención y se infundieron en los ventrículos cerebrales usando una cánula y una bomba ALZET en que se había realizado una desoxigenación previa con gas inerte.

Dichas soluciones se han realizado diluyendo clorhidrato de dopamina en solución salina que se había desoxigenado previamente mediante lavado abundante con nitrógeno en gas inerte. Dichas soluciones tienen un pH comprendido entre 5,58 y 6,84 dependiendo de la dilución. Este pH permite que la solución sea bastante estable, ya que la dopamina está en su forma protonada como se muestra en la figura 1.

Los ratones MPTP obtienen sus funciones motoras "normales" a partir de 0,06 mg/día de dopamina (MPTP DA 0,06) después de 7 días de tratamiento. Por el contrario, los ratones de control (MPTP LD) que se trataron con altas dosis de L-dopa tenían comportamientos anómalos tales como discinesia como se muestra en la figura 2. Se han analizado las "paredes ventriculares" de los grupos de ratones. Las paredes de los ventrículos de los ratones tratados con altas dosis de dopamina aeróbica comprenden numerosas zonas negras a diferencia de las paredes de los ventrículos de los ratones tratados con la solución de la invención.

El color negro se debe a la oxidación en las paredes de los ventrículos de la quinona de la dopamina y a los radicales libres producidos por la oxidación de la dopamina.

Finalmente, los autores de la invención descubrieron que el uso de una solución de la invención produce un efecto neuroprotector sobre las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, como se muestra en la figura 4.

Por tanto, aquí se propone una solución para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en donde dicha solución se administra con variaciones de las dosis mediante infusión en el ventrículo lateral derecho, preferiblemente cerca del agujero interventricular, de modo que la solución pueda administrarse directamente al tercer ventrículo. La invención permite obtener un mayor equilibrio de beneficio/riesgo que los tratamientos conocidos previos.

Ejemplo 2

Materiales y métodos

Modelo de ratón de MPTP y diseño experimental

Los animales se alojaron en grupos (10 por jaula) en una sal de temperatura controlada (22 ± 2 °C) con un ciclo de 12/12-horas de luz/oscuridad. Estuvieron disponibles libremente comida y agua en la jaula de alojamiento. Se respetó un periodo de habituación de 7 días después del transporte antes de cualquier manipulación de los animales.

Se usaron ratones C57B1/6J macho de cinco meses de edad (Elevage Janvier, Le Genest St Isle, Francia) que pesaban 28-30 g. Los ratones recibieron cuatro inyecciones intraperitoneales (con intervalos de 2 h) de solución salina que contenía 0 ("ratones de solución salina") o 20 mg/kg de MPTP ("ratones MPTP") (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.). La solución salina o MPTP se administraron en el día 0 (D0), la infusión continua de dopamina central o el tratamiento con L-dopa periférica se administraron desde el 7.° hasta el 14.° día (D7 a D14), y después se realizó medición locomotora espontánea y sacrificio en D14.

Tratamientos

Se establecieron trece grupos diferentes:

- Ratones sin implante de solución salina (tratados con solución salina)

- Ratones MPTP sin implante (tratados con solución salina)

- MPTP con implante de bomba llena en condiciones anaeróbicas de dopamina 40 pg/día

- MPTP con implante de bomba llena en condiciones anaeróbicas de dopamina 60 pg/día

- MPTP con implante de bomba llena en condiciones anaeróbicas de dopamina 80 pg/día

- MPTP con implante de bomba llena en condiciones anaeróbicas de dopamina 120 pg/día

- MPTP con implante de bomba llena en condiciones anaeróbicas de dopamina 240 pg/día

- MPTP con implante de bomba llena en condiciones aeróbicas de dopamina 60 pg/día

- MPTP con implante de bomba llena en condiciones aeróbicas de dopamina 120 pg/día

- MPTP con implante de bomba llena en condiciones aeróbicas de dopamina 240 pg/día

- ratones MPTP tratados con L-dopa 12,5 mpk benserazida 12 mpk, i.p. dos veces al día

- ratones MPTP tratados con L-dopa 25 mpk benserazida 12 mpk, i.p. dos veces al día

- ratones MPTP tratados con L-dopa 50 mpk benserazida 12 mpk, i.p. dos veces al día

Tratamiento con una solución de la invención

Las soluciones de la invención se han preparado diluyendo clorhidrato de dopamina (a veces llamado de forma abreviada "dopamina" a partir de ahora) (referencia H8502, Sigma-Aldrich) en solución salina (NaCl al 0,9 %) que se había desoxigenado previamente por lavado abundante con nitrógeno en gas inerte. Dichas soluciones tienen un pH comprendido entre 5,58 y 6,84 dependiendo de la dilución. Este pH permite que la solución sea bastante estable, ya que la dopamina está en su forma protonada.

La estabilidad de este fármaco en la bomba osmótica ALZET 2001 se ensayó durante 30 días a 37 °C usando ensayo de HPLC de dopamina cada 4 días (véase la figura 1B). La bomba osmótica ALZET 2001 se calibró para infundir a una tasa de 1 pl/hora durante 7 días.

La solución de dopamina se inyectó a la bomba conectada a una cánula de infusión cerebral en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Los experimentos anaeróbicos se procesaron en una atmósfera que contenía un 5 % de hidrógeno, un 5 % de dióxido de nitrógeno y un 90 % de nitrógeno (cámara anaeróbica/ambiental Bactron, Anaerobe System). Si aparecía oxígeno, se combinaba directamente con hidrógeno para dar agua recogida en un frasco. Además, se añadió resazurina a la zona como indicador de oxidorreducción que cambia su color en presencia de oxígeno. Entonces, las bombas se mantuvieron en estas condiciones para el cebado durante 4 horas a 37 °C antes de la cirugía estereotáctica.

Tratamiento con L-DOPA

L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) se coadministró con un inhibidor de DOPA descarboxilasa periférico para evitar la síntesis periférica de dopamina a partir de L-DOPA. El clorhidrato de éster metílico de L-dopa (Sigma-aldrich) se disolvió en solución salina con benserazida 12 mg/kg fuera cual fuera la dosis de L-dopa (Cenci y Lundblad, 2007) (19) y se preparó en el momento de uso antes de cada inyección. Se administró L-dopa por vía intraperitoneal (i.p.) dos veces al día durante 7 días a dosis descritas previamente (Espadas et al., 2012; Fornai et al., 2000; Cenci y Lundblad, 2007) (19, 21).

Preparación de bomba ALZET

La bomba elegida para el presente estudio fue el tipo 2001 con volumen de depósito de 200 pl, que permite infundir 1 pl por hora durante 7 días. El kit de infusión cerebral proporcionaba una cánula cerebral (calibre 30; DI = 0,16 mm; DE = 0,31 mm; longitud bajo el soporte = 3 mm) y un soporte de cánula adaptado a ratones. Se incluía un entubado de catéter en el kit y puede cortarse a la longitud necesaria para conectar la cánula al moderador de flujo de la bomba ALZET. El catéter, que conecta la cánula a la bomba, debe ser un 25 % más largo que la distancia entre el sitio subcutáneo de la bomba y la ubicación de la cánula, para permitir el movimiento libre de la cabeza y el cuello del animal.

En condiciones ambientales adaptadas, un recinto de cámara de bioseguridad anaeróbica con guantes cuando se requiera en el protocolo, se disolvieron las diferentes soluciones de dopamina y las diferentes partes del conjunto de infusión cerebral y la bomba osmótica se llenaron con las soluciones de dopamina con una jeringa y un tubo de llenado específico.

Para eliminar definitivamente la presencia de burbujas de aire e "iniciar" la bomba, se requiere cebado de las bombas prellenadas, que se colocan en un frasco cerrado anaeróbico con un 0,9 % de solución salina estéril a 37 °C durante al menos cuatro horas. Para evitar cualquier mezcla de las soluciones durante el cebado y la exposición a oxígeno durante el implante quirúrgico, se usó Parafilm para envolver el extremo de la cánula. La bomba y el conjunto de infusión cerebral ahora están listos para el implante.

También se controló que la bomba ALZET no tuviera impacto negativo sobre el funcionamiento de actividad motora al comparar el funcionamiento de actividad motora de ratones de solución salina y MPTP sin implante (NI) o con implante de bomba Alzet llena de solución salina (solución salina).

Implante de bomba Alzet por cirugía

Los ratones se anestesiaron con hidrato de cloral (300 mg/kg, Sigma-Aldrich) y se colocaron en una estructura estereotáctica. En resumen, después de la incisión del cuero cabelludo y la limpieza/secado del cráneo, se realizó una perforación a través del cráneo en las coordenadas estereotácticas para el ventrículo lateral derecho, B -0,34 mm, L 1 mm (atlas cerebral de Paxinos y Watson). Entonces, la bomba Alzet llena se insertó subcutáneamente en el lomo del ratón y la cánula de infusión cerebral se fijó a un portacánulas adaptado a la estructura estereotáctica. El portacánulas entonces se colocó en las coordenadas estereotácticas anteroposteriores y laterales requeridas y la cánula hundió lentamente a través del orificio trepanado, hasta el ventrículo lateral. La cánula de soporte entonces se ancló al cráneo con cemento acrílico. Una vez el cemento de inclusión estuvo seco, el cabezal del soporte de cánula se cortó suavemente, el cuero cabelludo se suturó y se permitió que los animales se recuperaran bajo una lámpara caliente hasta que se despertaron. Después de la cirugía, se realizaron cuidados diarios a lo largo del experimento.

Evaluación de la actividad motora

Después de 7 días de tratamiento (L-dopa i.p. o dopamina i.c.v.), se registró la actividad motora espontánea en un actímetro (Panlab, Barcelona, España) durante 10 minutos. El aparato era un recinto de Plexiglás transparente de 45 x 45 x 35 cm equipado con dos estructuras de rayos infrarrojos. Este aparato permitía medir la actividad motora horizontal (distancia recorrida, velocidad, tipo de movimiento) y el comportamiento de elevarse en las patas posteriores en función de las obstrucciones de los rayos infrarrojos. Los parámetros elegidos se recogieron por el programa informático Actitrack (Panlab, Barcelona, España).

Tinción y análisis nigroestriatal de tirosina hidroxilasa

Después de 7 días de tratamiento (L-dopa i.p. o dopamina i.c.v.), los animales se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico y se perfundieron por vía transcardiaca con paraformaldehído al 4 % en tampón fosfato 0,1 M para fijación de los tejidos (pH 7,4). Los cerebros se retiraron y, después de un proceso posfijación, se crioprotegieron y se congelaron.

Se prepararon cortes frontales de cuarenta micrómetros de grosor del cuerpo estriado y la parte compacta de la sustancia negra (SNpc)/área ventrotegmentaria (VTA) usando un criostato (Leica, Nussloch, Alemania). Se tomaron cortes en serie desde el bregma 0,98 mm hasta el bregma -0,82 mm para el cuerpo estriado, y desde el bregma -2,92 mm hasta el bregma -3,42 mm para la SNc/VTA.

Esos cortes frontales de flotación libre se usaron para análisis inmunohistoquímico. Los cortes se incubaron sucesivamente con anticuerpo de policlonal de conejo antitirosina hidroxilasa (1:1000, Chemicon International, CA, EE. UU.), anticuerpo policlonal de cabra biotinilado-conjugado anticonejo (1:500, kit Vectastain elite ABC, Vector Laboratories, CA, EE. UU.), y complejo de avidina/biotina conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (kit Vectastain elite ABC, Vector Laboratories, CA, EE. UU.). Los cortes entonces se expusieron a diaminobenzidina para la detección.

Se evaluó el número de neuronas TH-ir ("tirosina hidroxilasa-inmunorreactivas") en la SNpc contando las neuronas TH-ir del hemisferio izquierdo y derecho en cada 4.° corte de la SNpc de todos los grupos experimentales. El programa informático de análisis de estereología Mercator (Explora Nova La Rochelle, Francia) se usó para realizar recuentos estereológicos no sesgados de neuronas TH-ir. Para la cuantificación no sesgada, se dibujó una línea alrededor de la SNpc de cada sección. El observador era desconocedor de los grupos experimentales. Las células se contaron a 40X usando un microscopio Nikon Eclipse E600 (Tokyo, Japón). Se usaron fotogramas de recuento aleatorios y sistemáticos. Se evaluó el número de neuronas TH-ir en la SNpc contando las neuronas TH-ir del hemisferio izquierdo y derecho en cada 4.° corte de la SNpc de todos los grupos experimentales. Como no se encontró diferencia entre la SNps izquierda y derecha, las neuronas TH-ir contadas de ambos lados se combinaron y, para cada animal, se calculó la suma de neuronas contadas en cada sección. Para el cuerpo estriado dorsal, se evaluó la tinción TH como la densidad óptica en cada corte, se calculó un valor medio de densidad óptica para cada animal.

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento

Catorce días después de las inyecciones de MPTP o solución salina para ratones o 7 días después del implante de la bomba, los animales se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico y se perfundieron por vía transcardiaca con solución salina fresca. Los cerebros se retiraron rápidamente y se diseccionaron para recoger el cuerpo estriado izquierdo y derecho, que se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Se determinaron la dopamina, los metabolitos y la 5-cisteinil-dopamina por HPLC usando una columna Chromsystems 6100 y una fase móvil Chromsystems mediante detección culombimétrica (Coulochem III, ThermoFisher).

Análisis estadístico

Todos los datos se expresaron como la media ± ETM (o DT en la tabla). Para todos los parámetros, se usó un ANOVA unidireccional para evaluar el efecto de grupo, seguido de ensayo a posteriori de LSD de Fisher (STATISTICA 6.1, Stat soft, Francia). Si los datos no seguían una distribución gausiana, se realizaba un análisis de la varianza de Kruskal-Wallis, seguida de ensayo a posteriori de Mann-Whitney (STATISTICA 6.1, Stat soft, Francia). La significación se estableció en p <0,05.

Resultados

Experimento 1: Determinación de la eficacia de la infusión de dopamina en ratones MPTP con deficiencia motora (registrada por actimetría)

En el experimento siguiente, el uso del término "dopamina" significa "dopamina anaeróbica".

Para evaluar la eficacia de la infusión de dopamina central (es decir infusión intracerebroventricular de dopamina) frente a L-dopa periférica en ratones MPTP, se realizó medición de la sintomatología y actividad locomotora después de cada tratamiento. Como se muestra en la figura 2 y como se presenta previamente (Laloux et al., 2012) (22), los ratones MPTP presentaban reducción en la velocidad media y la distancia cubierta en la pista de ensayo.

Siete días de infusión intracerebroventricular de dopamina restablecieron la velocidad media y la distancia cubierta independientemente de las cinco dosis ensayadas en ratones tratados con MPTP. Por el contrario, la actividad locomotora espontánea en ratones tratados con MPTP se restableció solamente para 50 mg/kg/día de tratamiento con L-dopa periférica, mientras que 25 y 100 mg/día no tuvieron efecto (figura 2).

La mejora motora descrita en nuestro estudio demostró que la dopamina administrada por infusión intraventricular puede penetrar en el cuerpo estriado e inducir mejora motora en modelos de roedor que padecen enfermedad de Parkinson.

Además, se observó que la dosis eficaz mínima de dopamina anaeróbica es la dosis de 0,06 mg/día, que permitió un restablecimiento significativo y completo de la actividad motora normal. También se observó el efecto de dosis clásico de dopamina de 0,04 (con menor eficacia en la función motora) a 0,12 mg/día (sobredosificación sobre la función motora). Esto refleja perfectamente la situación bien conocida de pacientes que tienen enfermedad de Parkinson. La dosis más alta de 0,24 mg/día se vuelve menos eficaz según avanza la situación de sobredosificación. Por último, pero no menos importante, se observó restablecimiento de la actividad motora normal después de siete días de infusión intracerebroventricular de dopamina en condiciones anaeróbicas. Contrario a los estudios previos donde no se administraba dopamina en condiciones anaeróbicas (Yebenes et al.) (16) y en que la actividad motora disminuía después de dos o tres días de tratamiento (lo que es un signo de taquifilaxia), siete días de tratamiento de la invención no inducen taquifilaxia.

Experimento 2: La infusión cerebral de dopamina y el tratamiento periférico con L-dopa modificaban de manera diferencial los contenidos de dopamina, noradrenalina y serotonina en el cuerpo estriado de ratones

En el experimento siguiente, el uso del término "dopamina" significa "dopamina anaeróbica".

Después de haber mostrado un restablecimiento de los parámetros motores en ratones MPTP tratados con la solución de la invención, se han analizado las modificaciones de neurotransmisión inducidas por ambos tratamientos, es decir, solución de la invención y L-dopa, sobre la estructura cerebral diana, es decir, el cuerpo estriado dorsal.

Como se muestra en la figura 3, la intoxicación por MPTP indujo aproximadamente un 85-90 % de reducción en el contenido de dopamina (también un 70-80 % para DOPAC y un 60-70 % para HVA), un 35-50 % de noradrenalina y un 40-40 % de serotonina (también un 20-50 % de HIA) en cada cuerpo estriado.

La infusión cerebral de dopamina y el tratamiento periférico con L-dopa indujeron modificaciones significativas de los contenidos estriatales de dopamina, noradrenalina y serotonina en ratones MPTP.

Además, puede observarse un efecto de dosis paralelo entre la dosis de dopamina administrada a través de infusión intracerebroventricular y la dosificación de dopamina dentro del cuerpo estriado. Esto muestra que la dopamina puede cruzar la barrera ventricular y alcanza la zona diana del cuerpo estriado con un efecto de dosis lógico. Hay un efecto máximo alcanzado a 0,12 mg/día. De hecho, aumentar la dosis hasta 0,24 mg/día no permitió aumentar la dosis de dopamina. Esto se correlaciona perfectamente con los resultados de función motora medida por actimetría. En el lado infundido (cuerpo estriado ipsilateral), la dopamina a 60 y 80 pg/día aumento HVA sin efecto sobre el contenido estriatal de DA o DOPAC y sin modificación de los sistemas de neurotransmisión de NA o 5HT en comparación con ratones MPTP sin tratar. Dosis mayores de dopamina, 120 y 240 pg/día, pudieron aumentar DA y metabolitos y la dosis de 240 pg/día aumentó también HIA y NA (figura 3, A, C, E).

En el lado no infundido (cuerpo estriado contralateral), la dopamina a 60 y 80 pg/día no tuvo efecto, mientras que dosis mayores aumentaron los metabolitos de dopamina y serotonina (DOPAC, HVA, HIA) sin efecto sobre NA (figura 3, B, D, F).

La inyección periférica de 25 mg/día de L-dopa no tuvo efecto sobre la neurotransmisión dopaminérgica, pero indujo un aumento en la serotonina y noradrenalina en ambos cuerpos estriados, sobrepasando el contenido estriatal de los ratones de control, mientras que dosis mayores, es decir, 50 y 100 mg/día, indujeron un aumento significativo en la dopamina y metabolitos en ambos cuerpos estriados sin efecto complementario sobre el contenido de serotonina y noradrenalina (figura 3C a F).

Sorprendentemente, la L-dopa periférica y la dopamina central tuvieron efectos opuestos dependientes de la dosis. Dosis bajas de L-dopa indujeron un aumento en NA y 5HT y solamente dosis mayores pudieron modificar la dopamina, mientras que la infusión de dopamina central indujo primero un aumento de dopamina y la dosis más latas aumentaron NA y 5HT. En otra parte, la dopamina central indujo un aumento en la dopamina y metabolitos, mientras que L-dopa aumenta en primer lugar la dopamina con poco efecto sobre los metabolitos, lo que sugiere que la dopamina inducía además un aumento en el recambio de dopamina. L-dopa por vía oral indujo un alto nivel de dopamina extracelular con un menor recambio de dopamina, lo que sugiere una infrautilización de dopamina y riesgo de toxicidad por dopamina. A la inversa, la dopamina administrada ICV se usa con un nivel bajo de dopamina extracelular y un menor riesgo de toxicidad relacionada con administración exógena de dopamina/L-dopa. La toxicidad de L-dopa también podría ser mayor con respecto al menor nivel de almacenamiento (es decir, menor nivel de neuronas dopaminérgicas restantes: neuronas TH+).

Experimento 3: Determinación del impacto de la infusión de dopamina en las lesiones de las rutas nigroestriatales en ratones MPTP.

Como se muestra en la figura 4, en primer lugar, se observa que el modelo de MPTP es eficaz, ya que la administración de MPTP provocó una pérdida de un 44,3 % de neuronas que expresan TH en la SNpc en comparación con ratones a los que se ha inyectado solución salina y una pérdida de un 38,2 % de neuronas que expresan TH en el cuerpo estriado en comparación con ratones a los que se ha inyectado solución salina.

De forma interesante, la infusión de dopamina anaeróbica a 60 y 80 pg/día indujo un aumento significativo en las neuronas TH-ir en SNpc, de respectivamente un 30,65 % y un 25,19 %, en comparación con ratones tratados con MPTP, mientras que el tratamiento con L-dopa o difusión de dopamina aeróbica (3 h de aerobia) no tuvo efecto significativo (figura 4A). Además, si se mantienen las condiciones aeróbicas durante 12 h, una dosis de 240 pg/día induce muerte en todos los animales.

El efecto neuroprotector observado de infusión intracerebroventricular de dopamina anaeróbica fue sorprendente y reveló una gran ventaja en comparación con L-dopa periférica o infusión intracerebroventricular de dopamina aeróbica, que no pudieron reproducir este efecto.

En el cuerpo estriado, la infusión i.c.v. de dopamina anaeróbica a dosis de 40, 60 y 80 pg/día revierte la pérdida de terminales TH-ir en ratones MPTP, mientras que el tratamiento oral con L-dopa o la difusión de dopamina aeróbica no.

Esos resultados proporcionaron evidencia de una recuperación de TH-ir después de infusión i.c.v. continua de dopamina anaeróbica en el cuerpo estriado, pero también en la SNpc (dependiendo de la dosis administrada), mientras que la infusión i.c.v. continua de dopamina aeróbica o L-dopa periférica intermitente no. Esta recuperación funcional puede ser representativa de diferentes fenómenos, brote sinóptico desde neuronas dopaminérgicas supervivientes o células locales que cambian a fenotipo dopaminérgico o células recién reclutadas de un nicho de neurogénesis.

Por tanto, se demostró que se conseguía un número significativamente mayor de células dopaminérgicas dentro de la sustancia negra con una dosis eficaz mínima de 60 pg/día de dopamina anaeróbica. De forma interesante, el efecto de la dosis sobre la neuroprotección se correlaciona con resultados previos sobre la función motora (véase el experimento 1) y la neurotransmisión nigroestriatal dopaminérgica (véase el experimento 2).

Finalmente, se observó un buen índice terapéutico (hasta 6 veces la dosis eficaz mínima) ya que no se observaba empeoramiento de la degeneración. De hecho, el intervalo entre la dosis eficaz más baja y la primera dosis tóxica fue amplio, ya que la dosis de 240 (6 veces la primera dosis eficaz de 40) fue atóxica.

Experimento 4: Evaluación de la dopamina autooxidada relacionada con la dosis en el cuerpo estriado para las diferentes dosis (5-cisteinil-dopamina)

En el experimento siguiente, "dopamina" significa "dopamina anaeróbica".

Incluso si no se alteraba el fenotipo TH de las neuronas nigroestriatales, permanece el posible efecto tóxico de un exceso de dopamina extracelular. De hecho, el tratamiento con L-dopa o dopamina ha mostrado ser tóxico para las neuronas supervivientes al provocar agresión oxidativa adicional debido a los productos de autooxidación del contenido aumentado de dopamina y su recambio. Tanto la dopamina como su precursor L-dopa pueden autooxidarse produciendo un radical de semiquinona y posteriormente una quinona más estable que reacciona con cisteína libre, glutatión o cisteína encontrada en proteínas (Hastings y Zigmond, 1994; Pattison et al., 2002) (23, 24). La reacción entre la quinona de dopamina y la cisteína provoca la formación de 5-cisteinil-dopamina, un metabolito oxidativo estable de dopamina que es tóxico para las células. Esto podría inducir un aumento en las especies oxidativas reactivas que tienen consecuencias nocivas en los tejidos.

Por lo tanto, se analizó si la infusión de dopamina central inducía la autooxidación de dopamina mediante la determinación de la concentración del derivado 5-cisteinil-dopamina en el cuerpo estriado inyectado.

Los resultados se muestran en la tabla 1 siguiente.

Tabla 1: Concentración de S-cisteinil-dopamina en el cuerpo estriado (los datos se expresan en media ± ETM. Las dosis de dopamina (DA) se expresan en pg/día. La significación estadística se evaluó con análisis de la varianza de Kruskall Wallis y ensayo a posteriori de LSD de Fisher. El umbral significativo se estableció en p <0,05; * frente a l i n lin fr n MPTP.

Un ligero aumento en 5-cisteinil-dopamina muestra un ligero aumento en la autooxidación de dopamina. Sin embargo, como se muestra previamente, esta ligera autooxidación no indujo un empeoramiento de la neurodegeneración dentro del cuerpo estriado y dentro de la sustancia negra e incluso se observó efecto neuroprotector.

La coloración de las paredes ventriculares es un buen indicador de la oxidación realizada. En oposición a las experimentaciones previas hechas con dopamina sin preparación anaeróbica (Yebenes et al., 1987) (16), la dopamina preparada en anaerobia y preparada con dosis adaptadas, indujo nada o muy ligera oxidación de las paredes ventriculares (es decir, coloración negra de la pared correspondiente a oxidación intensa).

Se observó coloración parda solamente muy escasa en una parte muy pequeña de la pared ventricular cerca de la cánula de infusión (véase la primera columna de la tabla: tres ratones de ocho mostraron coloración parda parcial solamente escasa). Esto se explica por la ligera autooxidación de la dopamina como se demuestra con el aumento paralelo en 5-cisteinil-dopamina.

Referencias

(1) Chaudhuri KR1, Schapira AH. Non-motor symptoms of Parkinson's disease: dopaminergic pathophysiology and treatment. Lancet Neurol. 2009; 8:464-74.

(2) Devos D, Lejeune S, Cormier-Dequaire F, Tahiri K, Charbonnier-Beaupel F, Rouaix N, Duhamel A, Sablonniére B, Bonnet AM, Bonnet C, Zahr N, Costentin J, Vidailhet M, Corvol JC. Dopa-decarboxylase gene polymorphisms affect the motor response to L-dopa in Parkinson's disease. Parkinsonism Relat Disord. 2014; 20:170-5.

(3) Miller DW, Abercrombie ED.; Role of high-affinity dopamine uptake and impulse activity in the appearance of extracellular dopamine in striatum after administration of exogenous L-DOPA: studies in intact and 6-hydroxydopamine-treated rats. J Neurochem. 1999; 72:1516-22.

(4) Venton BJ, Zhang H, Garris PA, Phillips PE, Sulzer D, Wightman RM. Real-time decoding of dopamine concentration changes in the caudate-putamen during tonic and phasic firing. J Neurochem. 2003; 87:1284-95. (5) Olanow CW, Obeso JA, Stocchi F. Continuous dopamine-receptor treatment of Parkinson's disease: scientific rationale and clinical implications. Lancet Neurol. 2006; 5:677-87.

(6) Fahn S; Parkinson Study Group. Does levodopa slow or hasten the rate of progression of Parkinson's disease? J Neurol. 2005; 252 Supl. 4:IV37-IV42.

(7) Parkinson Study Group CALM Cohort Investigators. Long-term effect of initiating pramipexole vs levodopa in early Parkinson disease. Arch Neurol. 2009; 66:563-70.

(8) Olanow CW, Kieburtz K, Odin P, Espay AJ, Standaert DG, Fernandez HH, Vanagunas A, Othman AA, Widnell KL, Robieson WZ, Pritchett Y, Chatamra K, Benesh J, Lenz RA, Antonini A; LCIG Horizon Study Group. Continuous intrajejunal infusion of levodopa-carbidopa intestinal gel for patients with advanced Parkinson's disease: a randomised, controlled, double-blind, double-dummy study. Lancet Neurol. 2014; 13:141-9.

(9) Devos D; French DUODOPA Study Group. Patient profile, indications, efficacy and safety of duodenal levodopa infusion in advanced Parkinson's disease. Mov Disord. 2009; 24:993-1000.

(10) Manson AJ, Turner K, Lees AJ. Apomorphine monotherapy in the treatment of refractory motor complications of Parkinson's disease: long-term follow-up study of 64 patients. Mov Disord. 2002; 17:1235-41.

(11) Drapier S, Gillioz AS, Leray E, Péron J, Rouaud T, Marchand A, Vérin M. Apomorphine infusion in advanced Parkinson's patients with subthalamic stimulation contraindications. Parkinsonism Relat Disord. 2012; 18:40-4.

(12) Syed N, Murphy J, Zimmerman T Jr, Mark MH, Sage JI. Ten years' experience with enteral levodopa infusions for motor fluctuations in Parkinson's disease. Mov Disord. 1998; 13:336-8.

(13) Rascol O, Brooks DJ, Korczyn AD, De Deyn PP, Clarke CE, Lang AE. A five-year study of the incidence of dyskinesia in patients with early Parkinson's disease who were treated with ropinirole or levodopa. N Engl J Med.

2000; 342:1484-91.

(14) Stocchi F, Rascol O, Kieburtz K, Poewe W, Jankovic J, Tolosa E, Barone P, Lang AE, Olanow CW. Initiating levodopa/carbidopa therapy with and without entacapone in early Parkinson disease: the STRIDE-PD study. Ann Neurol. 2010; 68:18-27.

(15) Sendelbeck SL and Urquhart J. Spatial Distribution of Dopamine, Methotrexate and Antipyrine During Continuous Intracerebral Microperfusion. Brain Research 1985; 328:251-258.

(16) de Yebenes JG1, Fahn S, Lovelle S, Jackson-Lewis V, Jorge P, Mena MA, Reiriz J, Bustos JC, Magariños C, Martinez A. Continuous intracerebroventricular infusion of dopamine and dopamine agonists through a totally implanted drug delivery system in animal models of Parkinson's disease. Mov Disord. 1987; 2:143-58.

(17) Akdogan I, Kocamaz E, Kucukatay V, Yonguc NG, Ozdemir MB, Murk W. Hippocampal neuron number loss in rats exposed to ingested sulfite. Toxicol Ind Health. 2011; 27:771-8.

(18) Borta A, Hoglinger GU. Dopamine and adult neurogenesis. J Neurochem. 2007; 100:587-95.

(19) Cenci MA, Lundblad M. Ratings of L-DOPA-induced dyskinesia in the unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease in rats and mice. Curr Protoc Neurosci. 2007 Oct; Capítulo 9: Unidad 9.25.

(20) Espadas I, Darmopil S, Vergaño-Vera E, Ortiz O, Oliva I, Vicario-Abejón C, Martin ED, Moratalla R. L-DOPA-induced increase in TH-immunoreactive striatal neurons in parkinsonian mice: insights into regulation and function. Neurobiol Dis. 2012; 48:271-81.

(21) Fornai F, Battaglia G, Gesi M, Giorgi FS, Orzi F, Nicoletti F, Ruggieri S. Timecourse and dose-response study on the effects of chronic L-DOPA administration on striatal dopamine levels and dopamine transporter following MPTP toxicity. Brain Res. 2000; 887:110-7.

(22) Laloux C, Petrault M, Lecointe C, Devos D, Bordet R. Differential susceptibility to the PPAR-^y agonist pioglitazone in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 6-hydroxydopamine rodent models of Parkinson's disease. Pharmacol Res. 2012; 65:514-22.

(23) Hastings TG, Zigmond MJ. Identification of catechol-protein conjugates in neostriatal slices incubated with [3H]dopamine: impact of ascorbic acid and glutathione. J Neurochem. 1994; 63:1126-32.

(24) Pattison DI, Dean RT, Davies MJ. Oxidation of DNA, proteins and lipids by DOPA, protein-bound DOPA, and related catechol(amine)s. Toxicology. 2002; 177:23-37.

(25) DE YEBENES J G ET AL.: "Continuous intracerebroventricular infusion of dopamine and dopamine agonists through a totally implanted drug delivery system in animal models of Parkinson's disease", JOURNAL OF NEURAL TRANSMISSION. SUPPLEMENTUM, SPRINGER, AUSTRIA, vol. 27, n.° supl., 1 de enero de 1988 (01-01-1988), páginas 141-160.

Claims (1)

REIVINDICACIONES

1. Una solución farmacéutica que consiste en clorhidrato de dopamina disuelto en solución salina, en donde la solución tiene un pH entre 5,5 y 7 y en donde la solución es inyectable, libre de oxígeno y libre de agente conservante, en donde la solución salina consiste en agua y fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio o mezclas de dichas sales.